CN102621329B

CN102621329B - 燕窝酶联免疫试剂盒的检测方法

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Publication number: CN102621329B
Application number: CN201210069741.6A
Authority: CN
Inventors: 张世伟; 杨国武; 赖心田; 刘小青; 李芸; 陈血剑; 严琼英; 陈薇; 陈国培; 陈雁; 叶秀玲
Original assignee: Shenzhen Academy Of Metrology & Quality Inspection
Current assignee: Shenzhen Academy Of Metrology & Quality Inspection
Priority date: 2012-03-16
Filing date: 2012-03-16
Publication date: 2014-09-17
Anticipated expiration: 2032-03-16
Also published as: CN102621329A

Abstract

本发明提供一种燕窝酶联免疫试剂盒，包括唾液酸糖蛋白标准液、抗唾液酸糖蛋白抗体、酶标二抗、酶标板和底物显色液。本发明可对燕窝及其相关产品进行定量检测，适用范围广，特异性好，灵敏度高，抗基质干扰效果好，检测结果准确性好，重复性好，可方便地进行现场检测和大量样本的筛查，检测成本低。

Description

燕窝酶联免疫试剂盒的检测方法

技术领域

本发明涉及燕窝及其相关产品的检测，尤其涉及一种燕窝酶联免疫试剂盒及其检测方法。

背景技术

燕窝是由雨燕科金丝燕及同属类的唾液或者绒羽等混唾液凝结而成的巢窝，其产地分布于东南亚一带，如中国、印尼、泰国、越南和马来西亚等。燕窝是一种名贵中药，具有养阴润燥，补中益气，入胃补脾，化痰止咳等功能；燕窝含有丰富的活性糖蛋白，钙、铁、磷、碘及维生素等天然营养物和矿物质，还具有的防止流感病毒，促进细胞生长和加强免疫系统功能等作用。由于燕窝的营养价值和经济价值均较高，而且消费者对其需求日益增长，因此一些商贩通过染色、漂白，或以银耳、猪皮、琼脂、果胶等掺假伪造。假冒伪劣的燕窝及其制品频繁被曝光，而检测燕窝及其相关产品的标准方法尚属空白，因此，为保障消费者的合法权益和生命健康，完善市场秩序，完善燕窝及其相关产品的检测方法迫在眉睫。

现有的燕窝及其相关产品检测方法主要有：

（1）PCR方法：利用燕窝中特定基因片段进行PCR检测，该方法特异性好；但无法做到定量检测，而且燕窝制成品往往需要热加工，容易导致样品中DNA降解，从而使检测结果出现假阴性；

（2）电泳方法：基于燕窝蛋白质图谱进行分析，但抗基质干扰能力差，灵敏度低，仅限于对燕盏进行检测，无法用于燕窝制成品的检测；

（3）特定组份分析法：利用色谱、光谱等手段，通过分析燕窝中各种化学组份如特定元素、氨基酸、唾液酸、糖类等的含量鉴定其真假，但其特异性不高，易于被人为添加物干扰。

因此，现有的检测技术存在特异性不强，容易受人为添加物的干扰，无法进行定量分析，适用范围窄，无法对燕窝含量不高、需高温加工且基质干扰较大的燕窝制成品进行有效的检测，检测操作繁琐，检测时间长，需要配备大型分析仪器且要求专业的操作人员等缺点。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，发明人预料不到地发现，通过提取唾液酸糖蛋白作为抗原，制备高度特异的抗燕窝唾液酸糖蛋白抗体，构建的酶联免疫试剂盒可广泛应用于燕窝及其相关产品的检测，且具有特异性好，灵敏度高，抗基质干扰效果好，可进行定量检测，检测结果准确性好，操作简单、快捷，检测成本低等优点。

本发明提供一种燕窝酶联免疫试剂盒，包括唾液酸糖蛋白标准液、抗唾液酸糖蛋白抗体、酶标二抗、酶标板和底物显色液。上述试剂均以工作液的形式提供，其中唾液酸糖蛋白标准液包括系列梯度浓度的唾液酸糖蛋白标准液，有利于减少使用者的实验步骤，从而减小误差。

采用上述技术方案，可对燕窝及其相关产品进行高通量的定量检测，使用方便，特异性好，灵敏度高，抗基质干扰效果好，检测成本低。

作为本发明的进一步改进，所述酶标二抗采用羊抗鼠IgG-HRP，购自武汉博士德，使用0.01M pH7.4的PBS以1:10000稀释配成酶标二抗工作液。

作为本发明的进一步改进，所述酶标板包被了唾液酸糖蛋白抗原。所述酶标板通过将唾液酸糖蛋白抗原加入高吸附酶标板，包被过夜，5%脱脂奶粉封闭后真空干燥获得。此外，也可将抗唾液酸糖蛋白抗体加入高吸附酶标板，包被过夜，5%脱脂奶粉封闭后真空干燥获得包被了抗唾液酸糖蛋白抗体的酶标板。

作为本发明的进一步改进，所述底物显色液由显色剂A和显色剂B组成，所述显色剂A采用双氧水，所述显色剂B采用四甲基联苯胺。

作为本发明的进一步改进，燕窝酶联免疫试剂盒还包括洗涤液、稀释液和终止液，所述洗涤液为pH7.4 的PBST（由PBS中加入吐温-20获得），所述稀释液为pH7.4 的PBS，所述终止液采用硫酸，上述试剂均以工作液的形式提供，可方便地进行现场检测和大量样本的筛查，也利于提供检测结果的准确性。

本发明还提供燕窝酶联免疫试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

A）样品前处理：将样品均质，加入PBS超声提取，离心，取上清液稀释后得到样品溶液；

B）往包被了唾液酸糖蛋白抗原的酶标板的相应微孔中加入系列梯度浓度的唾液酸糖蛋白标准液或样品溶液，加入抗唾液酸糖蛋白抗体，孵育后洗涤、拍干，加入酶标二抗，孵育后洗涤、拍干，加入底物显色液，孵育后加入终止液，用酶标仪测定OD值；

C）建立标准曲线，对样品溶液的检测结果进行分析。

本发明的检测原理为：利用各类燕窝共有的唾液酸糖蛋白作为抗原，运用免疫学竞争法的原理进行检测。检测时，往预包被燕窝唾液酸糖蛋白的酶标板微孔中加入唾液酸糖蛋白标准液或样品溶液，再加入特异性的抗唾液酸糖蛋白抗体，包被在酶标板中的燕窝唾液酸糖蛋白和唾液酸糖蛋白标准液或样品溶液中的特征蛋白竞争性地与抗体结合，孵育后洗涤拍干；再加入酶标二抗，形成抗原抗体复合物孵育后洗涤拍干；加入底物显色液，孵育后加入终止液，在450nm波长下使用酶标仪进行检测，样品中的燕窝唾液酸糖蛋白浓度与OD值成反比。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：抗唾液酸糖蛋白抗体针对的抗原决定簇耐热，可对燕窝及其相关产品进行定量检测，适用范围广，有利于消费者合法权益的保障；特异性好，灵敏度高，抗基质干扰效果好，检测结果准确性好，重复性好；样品的前处理简单，检测操作简单，试剂均以工作液的形式提供，仅需普通的酶标仪即可方便地进行大量样本的筛查，无需配备大型分析仪器，检测成本低。

附图说明

图1为燕窝唾液酸糖蛋白电泳图；图1-a为燕窝唾液酸糖蛋白SDS-PAGE图，其中，1泳道为Marker，2泳道为纯化的燕窝唾液酸糖蛋白，3泳道为燕窝总蛋白；图1-b为纯化的燕窝唾液酸糖蛋白2-D PAGE图。

图2为燕窝唾液酸糖蛋白与抗燕窝唾液酸糖蛋白单克隆抗体Western-Blotting图；其中，1泳道为Marker，2泳道为纯化的燕窝唾液酸糖蛋白，3泳道为燕窝总蛋白。

图3为燕窝酶联免疫试剂盒的标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例一目标抗原的分离纯化。

目标抗原为燕窝唾液酸糖蛋白，该蛋白由具有相同抗原决定簇但糖基化修饰程度不同的分子量分别为106kDa和128kDa的两个蛋白组成，等电点≤3.0。

将燕窝经过7M尿素超声提取10min，离心取上清，使用液相等点聚焦仪进行分离纯化，目标蛋白在正极沉淀，经过去离子水洗涤后得到目标蛋白。该目标蛋白通过SDS-PAGE和2-D PAGE验证，结果如图1所示，未见其他杂蛋白条带，纯度满足免疫要求。

实施例二抗唾液酸糖蛋白抗体的制备和纯化。

用燕窝唾液酸糖蛋白分别免疫6周雌性balb/c鼠，每组3只。首次免疫注射时，分别100μg/mL的免疫抗原100μL，与等量弗氏完全佐剂充分乳化，腹腔直接注射。间隔两周后，取用样的抗原，与100μL不完全佐剂乳化，同样方法注射。

在细胞融合前1d或当天拉颈处死昆明鼠，浸泡在70％酒精中，体表消毒；用大头针固定昆明鼠在蜡板上，超净工作台上剪开腹部，用小镊子挑起腹膜，注入5mL RPMI-1640完全培养液（由GIBICO RPMI-1640基础培养液加入15%胎牛血清而得），用手轻轻揉动腹腔，将其体内液体用无菌吸管移入75mL HAT完全培养液（由74.25mL RPMI-1640完全培养液加入0.75mL 100×HAT液而得）中，用吸管混匀，铺24孔板，每孔加0.5mL，置于37℃ CO2培养箱中。

小鼠眼眶放血，收集血清，拉颈处死，70％酒精浸泡消毒体表，无菌取出脾脏，放入RPMI-1640基础培养液（购自GIBICO，货号为A10491-01）中，并小心剔除筋膜及脂肪，剪碎，置于100目的不锈钢筛内，无菌研磨，释放出单个脾细胞，吸取含有脾细胞的液体置于50mL无菌离心管中，离心。

将骨髓瘤细胞和上述制备好的脾细胞以个数5：1的比例加入同一50mL的离心管中，加入37℃温浴的RPMI-1640不完全培养液（购自GIBICO，货号为61870-036）20mL，混合均匀，1500r/min离心6min，弃去上清，用手指轻击离心管底部，使沉淀混匀如糊状；用移液管取37℃预热的PEG 1mL，滴入离心管，静置1min后，于37℃水浴中在2min内滴加RPMI-1640完全培养液10mL，1000r/min离心6min，弃去上清，加75mL HAT培养液，轻轻混匀，将混匀悬液分装于有饲养细胞的24孔板中，每孔0.5mL，于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中孵育。

融合后6~9d，用HAT培养液半量换液1次，在12~14d后根据增殖情况改用RPMI-1640完全培养液；待细胞贴壁至占板孔1/3时，计杂交瘤细胞生长的孔数及细胞总数，取上清液，间接ELISA选择效价高和间接竞争ELISA选择药物抑制强的阳性杂交瘤细胞。

采用间接ELISA和间接竞争ELISA法进行阳性杂交瘤细胞筛选，显示阳性并出现竞争抑制反应的孔为产燕窝唾液酸糖蛋白抗体的孔，并可用于进一步的亚克隆。

无菌条件下，洗脱阳性孔内的细胞，用弯头吸管将细胞转移至预先以饲养细胞铺板的96孔培养板中，每个原始孔克隆成8孔，待细胞贴壁长满1/2~1/3孔底后，取上清液，间接ELISA检测；取呈阳性强的亚克隆，如此反复2~5次，待所克隆的8个孔上清液中抗体阳性率为100％时，挑取单细胞克隆，检测为全阳性者转移至24孔细胞培养板或25mL细胞培养瓶扩大培养，建株并以分装、冻存。提前一周注射0.5mL降植烷至Balb/c小鼠腹腔。取冻存细胞株，复苏后，经大量培养繁殖，收集细胞，用不完全培养基洗涤二次后，再用10mL不完全培养基悬浮，计数；将细胞（每只小鼠1mL，含3.1×10⁷个细胞）腹腔注射小鼠腹部，10~15d后，待小鼠腹部明显膨大时用16号注射器无菌采集腹水；2000r/min离心10min，去除上层脂肪和下层纤维蛋白及细胞，收集中层，分装-70℃冻存备用。

取腹水离心后的中层部分3mL，加入2倍体积的0.06mol/L、pH 4.5醋酸钠缓冲液。将正辛酸逐滴慢慢加入样品中，至终浓度33μg/mL腹水，边加边搅拌，加完后继续搅拌30min，4℃下10000r/min离心30min，去沉淀（白蛋白和其它非IgG蛋白）。取上清经0.45 μm微孔膜过滤，与1/10体积10×PBS混合（10×PBS由80gNaCl、2g KCl、11.5g Na₂HPO4、2g KH₂PO4、0.5845g EDTA用950mL蒸馏水溶解后，调pH至7.4并定容至1000mL而得），用1mol/L NaOH溶液调pH值到7.4。上清冷却到4℃，加硫酸铵至终浓度为0.277g/mL。搅拌30min，4℃下10000 r/min离心30min，弃上清。用少量PBS溶液溶解沉淀，用50~100倍体积的PBS透析过夜，换液3次。得到纯化后的抗唾液酸糖蛋白抗体，4℃下贮藏备用。纯化后的抗唾液酸糖蛋白抗体经Western-Blotting检测，结果如图2所示，该抗体和燕窝唾液酸糖蛋白特异性结合，未和燕窝其他蛋白产生交叉反应。

实施例三燕窝酶联免疫试剂盒的构建。

酶标板的包被：将0.1mL 1mg/L的目标抗原（燕窝唾液酸糖蛋白）加入高吸附酶标板，包被过夜，采用5%脱脂奶粉封闭2h，真空干燥。

抗唾液酸糖蛋白抗体采用PBS 以1:10000稀释得到抗体工作液。

酶标二抗采用PBS以1:10000稀释得到酶标二抗工作液。

底物显色液：由显色剂A和显色剂B等体积混匀而得；称取17.2mg四甲基联苯胺，加1 mL DMSO溶解，然后加0.1 M pH5.5乙酸-醋酸钠缓冲液66 mL，得到显色剂A；取双蒸水100 mL，加30%双氧水17μL，得到显色剂B。

本发明提供的燕窝酶联免疫试剂盒包括：唾液酸糖蛋白标准液7瓶，浓度分别为0μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL；抗唾液酸糖蛋白抗体；羊抗鼠IgG-HRP；包被了燕窝唾液酸糖蛋白的酶标板和由显色剂A和显色剂B组成的底物显色液。

为进一步方便燕窝及其相关产品的检测，本发明提供的燕窝酶联免疫试剂盒包括：唾液酸糖蛋白标准液7瓶，浓度分别为0μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL；抗唾液酸糖蛋白抗体；羊抗鼠IgG-HRP；包被了燕窝唾液酸糖蛋白的酶标板；由显色剂A和显色剂B组成的底物显色液；洗涤液；稀释液和终止液。

本发明提供的燕窝酶联免疫试剂盒在4℃环境下贮藏，可保质1年以上。

实施例四燕窝酶联免疫试剂盒对燕窝及其相关产品进行检测。

样品前处理：

1、燕盏：将燕盏研磨至粉状，称取0.1g，加入10mL 0.01M pH7.4的PBS超声连续提取2min，离心，取上清液稀释1000倍后，得到样品检测溶液；

2、燕窝制成品：将燕窝制成品均质，称取1g，加入20mL 0.01M pH7.4的PBS超声连续提取2min，离心，取上清液为样品检测溶液，如果样品检测溶液的检测结果超过线性范围上限，需再酌情稀释。

燕窝酶联免疫试剂盒进行检测：

1、将所需试剂从冷藏环境中取出，在室温下平衡30min以上，各种试剂使用前均须摇匀；

2、加系列浓度的唾液酸糖蛋白标准液或样品检测溶液50ul到相应的微孔中，标准液均需做2个平行试验，然后加50μl抗体工作液，37℃下避光反应30分钟；

3、小心揭开盖板膜，弃去微孔中液体，并将微孔中剩余残液在吸水纸上拍干，往微孔中注满洗涤液，轻轻振荡，放置2分钟，弃去微孔中液体，并在吸水纸上拍干，重复洗涤4次或机洗5次；

4、加100μl酶标二抗工作液到相应的微孔中，37℃下避光反应30分钟，重复步骤3进行洗涤；

5、加100μl底物显色液到相应的微孔中，并在37℃下避光反应15分钟；

6、加50μl终止液到相应的微孔中，使用酶标仪于450nm波长下测定OD值。

根据唾液酸糖蛋白标准液的实验数据建立标准曲线，结果如图3所示。标准曲线的回归方程R²>0.99，说明OD值与唾液酸糖蛋白浓度具有很好的线性关系。根据标准曲线的线性回归方程，计算出燕窝样品中的唾液酸糖蛋白含量，结果如表1所示。

实施例五燕窝酶联免疫试剂盒的特异性。

使用燕窝酶联免疫试剂盒对牛血清白蛋白、卵清蛋白和银耳提取物等常见掺假物进行检测，结果如表2所示。从表2可知，燕窝酶联免疫试剂盒与牛血清白蛋白、卵清蛋白、溶菌酶、明胶、海藻酸钠、银耳提取物、卡拉胶和琼脂均无交叉反应，特异性好，检测结果不会受常见掺假物的影响。

实施例六燕窝酶联免疫试剂盒的重复性。

使用燕窝酶联免疫试剂盒对燕窝样品（包括阴性样品和阳性样品）分别进行不同微孔和不同酶标板间重复检测，结果如表3和表4所示。从表3和表4可知，燕窝酶联免疫试剂盒进行燕窝样品检测的微孔间差异<5%，酶标板间差异<10%，重复性好。

实施例七燕窝酶联免疫试剂盒的基质效应。

使用燕窝酶联免疫试剂盒对燕窝样品（包括阴性样品和阳性样品）中NaCl、葡萄糖和果糖等一些常见干扰物进行基质效应的检测，结果如表5所示。由表5可知，在对阴性样品和阳性样品的检测中，质量浓度1%的葡萄糖、1%的果糖、1%的淀粉、1%的氯化钠对检测结果的影响均无显著差异（p>0.05），说明本发明提供的燕窝酶联免疫试剂盒抗基质干扰效果好，只需对样品进行超声提取和稀释，即可完成样品前处理。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种燕窝酶联免疫试剂盒的检测方法，其特征在于，燕窝酶联免疫试剂盒包括唾液酸糖蛋白标准液、抗唾液酸糖蛋白抗体、酶标二抗、酶标板和底物显色液，所述酶标二抗采用羊抗鼠IgG-HRP，所述酶标板包被了唾液酸糖蛋白抗原，所述方法包括如下步骤：

A) 样品前处理：目标抗原为燕窝唾液酸糖蛋白，该蛋白由具有相同抗原决定簇但糖基化修饰程度不同的分子量分别为106kDa和128kDa的两个蛋白组成，等电点≤3.0;将燕窝经过7M尿素超声提取10min，离心取上清，使用液相等点聚焦仪进行分离纯化，目标蛋白在正极沉淀，经过去离子水洗涤后得到目标蛋白;

B)往包被了唾液酸糖蛋白抗原的酶标板的相应微孔中加入系列梯度浓度的唾液酸糖蛋白标准液或样品溶液，加入抗唾液酸糖蛋白抗体，孵育后洗涤、拍干，加入酶标二抗，孵育后洗涤、拍干，加入底物显色液，孵育后加入终止液，用酶标仪测定OD值；

C)建立标准曲线，对样品溶液的检测结果进行分析；

所述底物显色液由显色剂A和显色剂B组成，所述显色剂A采用双氧水，所述显色剂B采用四甲基联苯胺；

所述燕窝酶联免疫试剂盒还包括洗涤液、稀释液和终止液；

所述洗涤液为pH7.4 的PBST，所述稀释液为pH7.4 的PBS；所述终止液采用硫酸；

其中，抗唾液酸糖蛋白抗体的制备和纯化方法如下：

用燕窝唾液酸糖蛋白分别免疫6周雌性balb/c鼠，每组3只，首次免疫注射时，分别100μg/mL的免疫抗原100μL，与等量弗氏完全佐剂充分乳化，腹腔直接注射，间隔两周后，取同样的抗原，与100μL不完全佐剂乳化，同样方法注射；

在细胞融合前1d或当天拉颈处死昆明鼠，浸泡在70％酒精中，体表消毒；用大头针固定昆明鼠在蜡板上，超净工作台上剪开腹部，用小镊子挑起腹膜，注入5mL RPMI-1640完全培养液，用手轻轻揉动腹腔，将其体内液体用无菌吸管移入75mL HAT完全培养液中，用吸管混匀，铺24孔板，每孔加0.5mL，置于37℃ CO₂培养箱中；

小鼠眼眶放血，收集血清，拉颈处死，70%酒精浸泡消毒体表，无菌取出脾脏，放入RPMI-1640基础培养液中，并小心剔除筋膜及脂肪，剪碎，置于100目的不锈钢筛内，无菌研磨，释放出单个脾细胞，吸取含有脾细胞的液体置于50mL无菌离心管中，离心；

将骨髓瘤细胞和上述制备好的脾细胞以个数5：1的比例加入同一50mL的离心管中，加入37℃温浴的RPMI-1640不完全培养液20mL，混合均匀，1500r/min离心6min，弃去上清，用手指轻击离心管底部，使沉淀混匀如糊状；用移液管取37℃预热的PEG 1mL，滴入离心管，静置1min后，于37℃水浴中在2min内滴加RPMI-1640完全培养液10mL，1000r/min离心6min，弃去上清，加75mL HAT培养液，轻轻混匀，将混匀悬液分装于有饲养细胞的24孔板中，每孔0.5mL，于37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中孵育；

融合后6~9d，用HAT培养液半量换液1次，在12~14d后根据增殖情况改用RPMI-1640完全培养液；待细胞贴壁至占板孔1/3时，计杂交瘤细胞生长的孔数及细胞总数，取上清液，间接ELISA选择效价高和间接竞争ELISA选择药物抑制强的阳性杂交瘤细胞；

采用间接ELISA和间接竞争ELISA法进行阳性杂交瘤细胞筛选，显示阳性并出现竞争抑制反应的孔为产燕窝唾液酸糖蛋白抗体的孔，并可用于进一步的亚克隆；

无菌条件下，洗脱阳性孔内的细胞，用弯头吸管将细胞转移至预先以饲养细胞铺板的96孔培养板中，每个原始孔克隆成8孔，待细胞贴壁长满1/2~1/3孔底后，取上清液，间接ELISA检测；取呈阳性强的亚克隆，如此反复2~5次，待所克隆的8个孔上清液中抗体阳性率为100％时，挑取单细胞克隆，检测为全阳性者转移至24孔细胞培养板或25mL细胞培养瓶扩大培养，建株并以分装、冻存，提前一周注射0.5mL降植烷至Balb/c小鼠腹腔，取冻存细胞株，复苏后，经大量培养繁殖，收集细胞，用不完全培养基洗涤二次后，再用10mL不完全培养基悬浮，计数；将细胞腹腔注射小鼠腹部，10~15d后，待小鼠腹部明显膨大时用16号注射器无菌采集腹水；2000r/min离心10min，去除上层脂肪和下层纤维蛋白及细胞，收集中层，分装-70℃冻存备用；

取腹水离心后的中层部分3mL，加入2倍体积的0.06mol/L、pH 4.5醋酸钠缓冲液，将正辛酸逐滴慢慢加入样品中，至终浓度33μg/mL腹水，边加边搅拌，加完后继续搅拌30min，4℃下10000r/min离心30min，去沉淀，取上清经0.45 μm微孔膜过滤，与1/10体积10×PBS混合，用1mol/L NaOH溶液调pH值到7.4，上清冷却到4℃，加硫酸铵至终浓度为0.277g/mL，搅拌30min，4℃下10000 r/min离心30min，弃上清，用少量PBS溶液溶解沉淀，用50~100倍体积的PBS透析过夜，换液3次，得到纯化后的抗唾液酸糖蛋白抗体，4℃下贮藏备用。