CN102617516A - 一种沙丁胺醇人工抗原及其制备的抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种沙丁胺醇人工抗原及其制备的抗体。本发明提供了一种化合物，即式(I)所示化合物。式(I)所示化合物为将沙丁胺醇进行结构改造得到的化合物，在沙丁胺醇的苯酚基上引入活性官能团结构，既最大程度保留了沙丁胺醇的特征结构，又具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团。本发明还保护一种沙丁胺醇人工抗原，为将式(I)所示化合物与载体蛋白欧联得到的偶联物。将所述沙丁胺醇人工抗原免疫动物，可获得高特异性的单克隆抗体和多克隆抗体，方法简便、易行。所述人工抗原可用于检测沙丁胺醇。所述抗体可用于检测沙丁胺醇。

Description

一种沙丁胺醇人工抗原及其制备的抗体

技术领域

本发明涉及一种沙丁胺醇人工抗原及其制备的抗体。

背景技术

沙丁胺醇(Salbutamol)，是一种选择性β2-受体激动剂(β-兴奋剂)，医疗中用于治疗喘息型支气管炎、支气管哮喘、肺气肿所致的支气管痉挛。该药物不是兽药，也不是饲料添加剂。由于沙丁胺醇检测手段的相对滞后，但又与克伦特罗具有同样促生长效果，因而逐步取代克伦特罗成为新一代“瘦肉精”，用于非法谋取经济利益。沙丁胺醇作为营养重分配剂添加到饲料中，可以促进动物瘦肉生长、减少脂肪产生、提升单位经济价值，但同时也会造成药物蓄积、残留在动物机体中。沙丁胺醇一次性摄入量较多时对人体存在多种毒副作用，可导致体内聚集浓度升高而继发心脏肥大，并造成心脏跳动过速，严重时会出现心肌梗死，长期摄入过量沙丁胺醇，可能产生生殖内分泌毒性。世界卫生组织、美国、欧盟及一些发达国家等都先后立法禁止在畜禽生产中使用β-兴奋剂作为促动物生长饲料添加剂。我国在农业部第235号公告中明确规定了禁止使用沙丁胺醇，并不得在所有动物性食品中检出。

目前，国家标准和行业标准中对饲料及动物源性食品中沙丁胺醇残留的检测常采用液相色谱-质谱/质谱法。虽然此方法特异性强、灵敏度高，但是样品前处理操作步骤繁琐，成本较高，也不适用于大批量样品的筛选检测。免疫分析，由于在抗原抗体的定性定量方面独特的优势和操作简便快速、成本低、灵敏度较高、分析样本量大的优点弥补了理化分析的不足，在β-兴奋剂的残留检测中起着越来越重要的作用。

影响免疫化学分析质量的根本因素是抗体的特异性与亲和性，这些性质又决定于免疫半抗原分子的结构，因此免疫半抗原的分子设计与合成就是产生特异性抗体和建立小分子兽药残留快速检测技术最基础和最关键的步骤。

发明内容

本发明的目的是提供一种沙丁胺醇人工抗原及其制备的抗体。

本发明提供了一种化合物，即式(I)所示化合物。式(I)所示化合物为将沙丁胺醇进行结构改造得到的化合物，在沙丁胺醇的苯酚基上引入活性官能团结构，既最大程度保留了沙丁胺醇的特征结构，又具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团。

本发明还保护式(I)所示化合物的制备方法，包括如下步骤：将沙丁胺醇与乙二醇二缩水甘油醚反应，获得所述化合物。所述反应具体可在碳酸氢钠水溶液中进行。优选浓度为3％(质量比)的碳酸氢钠水溶液。所述沙丁胺醇与乙二醇二缩水甘油醚的物质的量比具体可为1∶1。

式(I)

本发明还保护一种沙丁胺醇人工抗原，为将式(I)所示化合物与载体蛋白偶联得到的偶联物。所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清白蛋白。式(I)所示化合物与载体蛋白的偶联比具体可为(8-11)∶1。所述偶联比指的是摩尔比。式(I)所示化合物与所述载体蛋白可以以碳氮键偶联。沙丁胺醇的人工抗原在沙丁胺醇与载体蛋白间含有一个间隔臂。所述沙丁胺醇人工抗原可以作为免疫原也可以作为包被原。将所述沙丁胺醇人工抗原免疫动物，可获得高特异性的单克隆抗体和多克隆抗体，方法简便、易行。将所述沙丁胺醇人工抗原包被酶标板，也可以用于沙丁胺醇抗血清的检测。包被原与免疫原结构上的差异可以进一步提高检测的灵敏度和特异性。沙丁胺醇人工抗原如式(II)所示。

式(II)。

所述沙丁胺醇人工抗原可用于制备沙丁胺醇特异性抗体。所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

以所述沙丁胺醇人工抗原为免疫原制备得到的抗体也属于本发明的保护范围。所述抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克隆抗体具体可为抗沙丁胺醇单克隆抗体杂交瘤细胞2E9分泌的单克隆抗体。

本发明还保护一种杂交瘤细胞，命名为抗沙丁胺醇单克隆抗体杂交瘤细胞2E9，简称杂交瘤细胞2E9，已于2012年2月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.5791。

所述杂交瘤细胞2E9分泌的单克隆抗体也属于本发明的保护范围。

所述人工抗原可用于检测沙丁胺醇。

所述抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)可用于检测沙丁胺醇。

本发明对于沙丁胺醇的检测具有重大价值。

附图说明

图1为沙丁胺醇人工抗原的紫外光谱图。

图2为沙丁胺醇的标准曲线图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中所用的PBS缓冲液均为pH7.4、0.01M的PBS缓冲液。实施例中所用的碳酸盐缓冲液均为pH9.6、0.05mol/L的碳酸钠缓冲液。牛血清白蛋白简称BSA。卵清蛋白简称OVA。

沙丁胺醇购自Sigma-Aldrich公司，产品目录号为S8260。

乙二醇二缩水甘油醚如式(III)所示，比重为1.08，分子量为158.20。

式(III)

沙丁胺醇如式(IV)所示，分子量为239.31。

式(IV)

实施例1、制备沙丁胺醇半抗原

一、沙丁胺醇半抗原的制备

1、称取沙丁胺醇10mg(42μmol)，置于10mL三角烧瓶中，加入5mL浓度为3％(质量比)的碳酸氢钠水溶液，充分搅拌使其完全溶解，加入6.2μL(42μmol)乙二醇二缩水甘油醚，室温搅拌反应4h，得到溶液I。

2、将步骤1的混合液真空干燥，得到的固体即为产物。

二、沙丁胺醇半抗原的表征

对步骤一制备的产物进行元素分析，结果如下：

C：63.88；H：8.58；N：3.26；O：24.57。

结果表明，步骤一制备的产物为式(I)所示化合物。

式(I)。

实施例2、制备沙丁胺醇人工抗原

一、沙丁胺醇免疫原的制备和表征

1、沙丁胺醇免疫原的制备

取10mg实施例1制备得到的式(I)所示化合物，向其中逐滴加入牛血清白蛋白溶液(50mg牛血清白蛋白溶于5mL PBS缓冲液)，继续搅拌8小时后装入透析袋，在PBS缓冲液中4℃透析72小时(中间换水6次)，然后于8000rmp离心30min，取上清(沙丁胺醇免疫原溶液)，分装于安培瓶中，-20℃保存。沙丁胺醇免疫原简称SAL-BSA。沙丁胺醇免疫原溶液简称SAL-BSA溶液。

将SAL-BSA溶液用PBS缓冲液稀释后，测定280nm和260nm的分光光度值，按公式计算稀释液中的蛋白的浓度，乘以稀释倍数后即为SAL-BSA溶液中的SAL-BSA浓度。蛋白质浓度(mg/ml)＝1.45×OD₂₈₀-0.74×OD₂₆₀。SAL-BSA溶液中的SAL-BSA浓度为8.7mg/ml。

2、沙丁胺醇免疫原的表征

将SAL-BSA溶液用PBS缓冲液稀释(使SAL-BSA的浓度为5mg/mL)，作为溶液甲；将含5mg/mL沙丁胺醇的PBS缓冲液作为溶液乙；将含5mg/mL BSA的PBS缓冲液作为溶液丙。分别将溶液甲、溶液乙和溶液丙进行紫外(200-380nm)光谱扫描，紫外光谱扫描结果见图1。与溶液丙相比溶液甲的紫外图谱发生了明显变化，说明化合物与BSA成功偶联。

溶液乙的最大吸收波长值为282nm，溶液丙的最大吸收波长值为280nm。根据公式K＝A/CL(A为最大吸收波长值下的吸光度，C为溶液浓度，L为液层的厚度)计算各个化合物的消光系数(K)。

分别采用溶液乙和溶液丙的最大吸收波长值对溶液甲进行紫外光谱扫描，并根据已经计算出的该化合物的消光系数反向计算该化合物在溶液甲中的浓度，用浓度值除以分子量得到该化合物的摩尔浓度，计算偶联比，式(I)所示化合物和BSA的偶联比为11∶1，即11个式(I)所示化合物结合1个BSA。

二、沙丁胺醇包被原的制备

1、沙丁胺醇包被原的制备

用卵清蛋白代替牛血清白蛋白，其它同步骤一的1。

沙丁胺醇包被原简称SAL-OVA。沙丁胺醇包被原溶液简称SAL-OVA溶液。

SAL-OVA溶液中的SAL-OVA浓度为5.6mg/ml。

2、沙丁胺醇包被抗原的表征

用SAL-OVA代替SAL-BSA，用OVA代替BSA，其它同步骤一的2。

与OVA溶液和SAL溶液相比SAL-OVA溶液的稀释液的紫外图谱发生了明显变化，说明化合物与OVA成功偶联。

式(I)所示化合物和OVA的偶联比为8∶1，即8个式(I)所示化合物结合1个OVA。

实施例3、沙丁胺醇单克隆抗体的制备

Balb/c小鼠：购于北京维通利华实验动物技术有限公司；

SP2/0骨髓瘤细胞：购自Sigma-Aldrich公司，产品目录号为08060101。

一、动物免疫

将实施例2制备的SAL-BSA溶液免疫Balb/c小鼠，每只小鼠单次免疫100μgSAL-BSA，共免疫4次，每次间隔两周，前三次的免疫方式为颈背部皮下多点注射，最后一次的免疫方式为腹膜内注射。

二、细胞融合与克隆化

1、第四次免疫3天后，取脾细胞，按5∶1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。

2、利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到一株可以分泌沙丁胺醇单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为抗沙丁胺醇单克隆抗体杂交瘤细胞2E9(简称杂交瘤细胞2E9)。杂交瘤细胞2E9已于2012年2月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.5791。

三、细胞冻存和复苏

用冻存液将杂交瘤细胞2E9制成1×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时，取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后移入培养瓶内培养。

四、单克隆抗体的制备与纯化

1、增量培养法

细胞培养基(7.4)的制备方法：向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，小牛血清的终浓度为20％(质量百分含量)，碳酸氢钠的终浓度为0.2％(质量百分含量)。

将杂交瘤细胞2E9置于细胞培养基中，37℃培养2天，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体(-20℃保存)。

单克隆抗体中的蛋白质浓度(mg/ml)＝1.45×OD₂₈₀-0.74×OD₂₆₀。

采用以上公式计算单克隆抗体中的蛋白质浓度，为24.6mg/ml。

2、腹水制备

Balb/c小鼠腹腔注射灭菌石蜡油(0.4mL/只)。7天后腹腔注射杂交瘤细胞2E9(5×10⁵个/只)。7天后采集腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水-20℃保存。

五、单克隆抗体的鉴定

将步骤四的1得到的单克隆抗体溶液分别进行如下鉴定：

1、采用ELISA单克隆抗体亚型检测试剂盒(Sigma公司产品，产品目录号为19285)检测单克隆抗体的亚型，单克隆抗体的免疫球蛋白亚类为IgG1。

2、利用非竞争性ELISA法测定单克隆抗体的亲和力

(1)用SAL-OVA作为包被原包被酶标板

采用实施例2制备的SAL-OVA溶液(用碳酸盐缓冲液稀释)进行包被，100μL/孔；分别设置以下SAL-OVA包被浓度：1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL。

(2)4℃孵育16小时。

(3)封闭并洗板。

(4)每孔加入100μL单克隆抗体溶液的稀释液(用PBS缓冲液进行稀释)；稀释液中的蛋白质浓度分别为1.25、0.625、0.3125、1.5625×10^-1、7.8×10^-2、3.9×10^-2、1.95×10^-2、9.75×10^-3、4.88×10^-3、2.44×10^-3、1.22×10^-3、6.1×10^-4mg/L；每种稀释液设置三个复孔。

(5)室温孵育2h，洗板。

(6)每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，室温孵育2h。

(7)洗板。

(8)加入TMB显色液，避光显色15min。

(9)每孔加入100μL 2mol/L硫酸中止反应；读OD₄₅₀值。

以单克隆抗体中的蛋白质浓度(mol/L)的自然对数值为横坐标，以其对应的吸光度为纵坐标制作曲线。

每个抗原包被浓度得到1条S型曲线，共得到4条S型曲线。找出S曲线的顶部，对应的OD₄₅₀值设定为ODMAX。分别找出各条曲线50％ODMAX对应的抗体浓度。采用1μg/mL包被浓度，50％ODMAX对应的抗体浓度为3.4×10^-12mol/L。采用0.5μg/mL包被浓度，50％ODMAX对应的抗体浓度为25.6×10^-12mol/L。采用0.25μg/mL包被浓度，50％ODMAX对应的抗体浓度为170.6×10^-12mol/L。采用0.125μg/mL包被浓度，50％ODMAX对应的抗体浓度为390.1×10^-12mol/L。

将4个浓度两两一组，根据公式计算单克隆抗体的亲和常数

Ka＝(n-1)/2(n[Ab]t₁-[Ab]t₂)

公式中，n为每组中两个包被浓度的倍数，[Ab]t₁、[Ab]t₂分别为每组中两个50％ODMAX对应的抗体浓度(mol/L)。例如：1μg/mL包被浓度、50％OD₄₅₀对应的抗体浓度为3.4×10^-12mol/L，0.5μg/mL包被浓度、50％OD₄₅₀对应的抗体浓度为25.6×10^-12mol/L，Ka＝(2-1)/2(2×25.6×10^-12-3.4×10^-12)＝10.4×10⁹M^-1。依次类推，得到其余5个Ka值，分别为1.58×10⁹M^-1、0.82×10⁹M^-1、2.21×10⁹M^-1、0.97×10⁹M^-1、1.12×10⁹M^-1，取平均值计算得出单克隆抗体的亲和常数为2.84×10⁹M^-1。

3、单克隆抗体灵敏度的计算

(1)采用实施例2制备的SAL-OVA溶液(用碳酸盐缓冲液进行稀释)进行包被，100μL/孔；SAL-OVA的包被浓度为1.0μg/mL。

(2)4℃孵育16小时。

(3)封闭并洗板。

(4)每孔加入50μL沙丁胺醇标准品溶液(由沙丁胺醇和PBS缓冲液组成；沙丁胺醇的浓度分别为0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L；将只加入PBS缓冲液的孔作为对照孔)，每个浓度设置3个复孔。

(5)每孔加入50μL步骤四的1得到的单克隆抗体溶液。

(6)室温孵育2h，洗板。

(7)每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，室温孵育2h。

(8)洗板。

(9)加入TMB显色液，避光显色15min。

(10)每孔加入100μL 2mol/L硫酸中止反应；读OD₄₅₀值。

将采用各个浓度的标准品溶液得到的吸光值(三个复孔的平均值)除以对照孔的吸光值再乘以100作为纵坐标，以各个标准品溶液中的沙丁胺醇浓度(μg/L)的自然对数值为横坐标绘制曲线图，见图2。

对照图2，得到纵坐标数值等于50％时对应的沙丁胺醇浓度即为IC₅₀值。单克隆抗体检测沙丁胺醇的灵敏度(IC₅₀值)为2.5μg/mL。

4、交叉反应率的计算

(1)至(3)同步骤3的(1)至(3)。

(4)每孔加入50μL结构类似物标准品溶液(由结构类似物和PBS缓冲液组成；结构类似物的浓度分别为0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L；将只加入PBS缓冲液的孔作为对照孔)，每个浓度设置3个复孔。

结构类似物为：克伦特罗、莱克多巴胺、特布他林、西玛特罗、维多洛尔、普萘洛尔或阿替洛尔。

克伦特罗：sigma公司产品，货号54969。莱克多巴胺：sigma公司产品，货号34198。特布他林：sigma公司产品，货号T2528。西玛特罗：sigma公司产品，货号32568。维多洛尔：sigma公司产品，货号N1892。普萘洛尔：sigma公司产品，货号P0884。阿替洛尔：sigma公司产品，货号330884。

(5)至(10)同步骤3的(5)至(10)。

将采用各个浓度的结构类似物得到的吸光值(三个复孔的平均值)除以对照孔的吸光值再乘以100作为纵坐标，以各个标准品溶液中的结构类似物浓度(μg/L)的自然对数值为横坐标绘制曲线图。对照曲线图，得到纵坐标数值等于50％时对应的结构类似物浓度(μg/L)，即结构类似物的IC₅₀值。

用下式计算单克隆抗体对其它结构类似物的交叉反应率。

应用单克隆抗体检测克伦特罗的IC₅₀值为4.5μg/L，交叉反应率为22％。应用单克隆抗体检测莱克多巴胺的IC₅₀值为5.0μg/L，交叉反应率为20％。应用单克隆抗体检测特布他林的IC₅₀值为5.5μg/L，交叉反应率为18％。应用单克隆抗体检测西玛特罗的IC₅₀值为5.9μg/L，交叉反应率为17％。应用单克隆抗体检测维多洛尔的IC₅₀值为8.3μg/L，交叉反应率为12％。单克隆抗体对普萘洛尔、阿替洛尔的交叉反应均＜0.1％。

实施例4、沙丁胺醇多克隆抗体制备及ELISA竞争抑制实验

新西兰大白兔：购于北京维通利华实验动物技术有限公司。

将新西兰大白兔以实施例2制备的SAL-BSA溶液进行免疫(免疫方式为颈背部皮下多点注射)。每只兔子每次免疫1mg(以BSA量计)，每两周免疫一次，共免疫7次，第三次免疫开始，每次免疫之后的第7天，耳缘静脉采血，取血清，即多克隆抗体，放于-20℃环境保存。

建立间接ELISA方法(见实施例3的步骤五的3；采用100ng/mL的沙丁胺醇标准品溶液，将只加入PBS缓冲液的孔作为对照孔)，用倍比稀释的血清代替单克隆抗体溶液。

分析结果表明，与对照孔相比，加入沙丁胺醇标准品溶液的各孔的吸光值明显下降，随着血清稀释倍数的增加，吸光值呈明显的递减梯度。说明获得的兔血清能够特异性地识别沙丁胺醇。

Claims (10)

1.式(I)所示化合物；

式(I)。

2.权利要求1所述化合物的制备方法，包括如下步骤：将沙丁胺醇与乙二醇二缩水甘油醚反应，获得所述化合物。

3.权利要求1所述化合物与载体蛋白的偶联物。

4.如权利要求3所述的偶联物，其特征在于：所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清白蛋白。

5.权利要求3或4所述偶联物在制备沙丁胺醇特异性抗体中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

7.以权利要求3或4所述偶联物为免疫原制备得到的单克隆抗体。

8.抗沙丁胺醇单克隆抗体杂交瘤细胞2E9，它的保藏编号为CGMCC No.5791。

9.权利要求8所述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。

10.权利要求3或4所述偶联物，或，权利要求7或9所述单克隆抗体在检测沙丁胺醇中的应用。

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