CN102617589B - 一种黄曲霉素m1人工抗原及其制备的抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄曲霉素M₁人工抗原及其制备的抗体。本发明提供了一种化合物，即式(I)所示化合物。式(I)所示化合物为将黄曲霉素M₁进行结构改造得到的化合物，既最大程度保留了黄曲霉素M₁的特征结构，又具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团。本发明还保护一种黄曲霉素人工抗原，为将式(I)所示化合物与载体蛋白偶联得到的偶联物。将所述黄曲霉素人工抗原免疫动物，可获得高特异性的单克隆抗体和多克隆抗体，方法简便、易行。所述人工抗原可用于检测黄曲霉素。所述抗体可用于检测黄曲霉素。

Description

一种黄曲霉素M1人工抗原及其制备的抗体

技术领域

本发明涉及一种黄曲霉素M₁人工抗原及其制备的抗体。 

背景技术

黄曲霉素是一类化学结构类似的化合物，为二氢呋喃香豆素的衍生物，是由黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生的代谢物。天然污染的食品中以黄曲霉素B₁(AFB₁)最为多见，其毒性和致癌性也最强。哺乳动物摄入被AFB₁污染的饲料或者食品后，一部分蓄积于动物的可食部位，另一部分经过体内一系列代谢，末端呋喃环C-10被羟化(即黄曲霉素M₁，又称AMF₁)，存于动物分泌的乳汁和产生的尿液中。已有的研究表明，反刍动物对大多数霉菌毒素的敏感性较弱，但是一次性摄入大量的霉菌毒素或长期小剂量摄入也会给奶牛带来营养不良、生产缓慢、免疫力下降等危害。AMF₁的毒性主要表现在致癌性和致突变性，能够造成DNA的某些损伤，引起DNA结构和功能的改变，因此动物乳中AMF₁的存在会对人类的健康造成危害。 

AMF₁相对稳定，缺乏行之有效的防治和去毒方法，所以必须对食品中特别是乳及乳制品制定严格的限量标准，一方面能控制人体对AMF₁的摄入量，另一方面也能加强对乳及乳制品生产企业品质的管理，从而向消费者提供放心食品。1995年，世界卫生组织制定的食品黄曲霉素最高允许浓度为15μg/kg。我国今年发布的《GB 2761-2011食品中真菌毒素限量》国家标准中规定食品中AMF₁在乳及乳制品中的限量为0.5μg/kg。美国联邦政府有关法律规定人类消费的牛奶中的含量不能超过0.5μg/kg，其他动物饲料中的含量不能300μg/kg。而欧盟国家规定更加严格，原奶、热处理奶及加工奶产品中AMF₁限量为0.05μg/kg，婴儿食品(包括婴幼儿奶)中AMF₁限量为0.025μg/kg。因此建立特异、敏感的黄曲霉素M₁的检测方法是当务之急。 

现行的标准和文献中对AMF₁的检测方法约有四种，分别为免疫亲和柱法、HPLC法、TLC法和ELISA法。前三种方法需要提取净化的前处理操作烦琐，复杂，费时费力。迫切需要灵敏度高、特异性强、亲和力好的单克隆抗体，以建立灵敏、准确、快速的ELISA检测方法，为鲜奶及奶粉中黄曲霉素污染的快速筛选提供技术支持。 

发明内容

本发明的目的是提供一种黄曲霉素M₁人工抗原及其制备的抗体。 

本发明提供了一种化合物，即式(I)所示化合物。式(I)所示化合物为将黄曲霉素M₁进行结构改造得到的化合物，既最大程度保留了黄曲霉素M₁的特征结构，又 具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团。 

本发明还保护式(I)所示化合物的制备方法，包括如下步骤：将黄曲霉素M₁和对肼基苯甲酸反应，获得所述化合物。所述反应具体可在无水吡啶中进行。所述黄曲霉素M₁和所述对肼基苯甲酸的质量比具体可为1∶1。所述制备方法还包括如下步骤：将完成所述反应的体系旋蒸除去吡啶，将残留物用甲醇溶解，以二氯甲烷∶甲醇(体积比9∶1)为展开剂，通过薄层层析分离纯化，收集比移值(R_f值)为0.35的样本，即为式(I)所示化合物。 

本发明还保护一种黄曲霉素M₁人工抗原，为将式(I)所示化合物与载体蛋白偶联得到的偶联物。所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清白蛋白。式(I)所示化合物与载体蛋白的偶联比具体可为(8-10)∶1。所述偶联比指的是摩尔比。式(I)所示化合物与所述载体蛋白具体可通过活性酯法偶联。所述黄曲霉素M₁人工抗原如式(II)所示。所述黄曲霉素M₁人工抗原可以作为免疫原也可以作为包被原。将所述黄曲霉素人工抗原免疫动物，可获得高特异性的单克隆抗体和多克隆抗体，方法简便、易行。将所述黄曲霉素M₁人工抗原包被酶标板，也可以用于黄曲霉素抗血清的检测。包被原与免疫原结构上的差异可以进一步提高检测的灵敏度和特异性。 

式(I)。 

式(II)。 

所述黄曲霉素M₁人工抗原可用于制备黄曲霉素特异性抗体。所述抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。 

以所述黄曲霉素M₁人工抗原为免疫原制备得到的抗体也属于本发明的保护范围。所述抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克隆抗体具体可为抗黄曲霉毒素单克 隆抗体杂交瘤细胞2A1分泌的单克隆抗体。 

本发明还保护一种杂交瘤细胞，命名为抗黄曲霉毒素单克隆抗体杂交瘤细胞2A1，简称杂交瘤细胞2A1，已于2012年2月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.5779。 

杂交瘤细胞2A1分泌的单克隆抗体也属于本发明的保护范围。 

所述所述黄曲霉素M₁人工抗原可用于检测黄曲霉素。 

所述抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)可用于检测黄曲霉素。 

以上任一所述黄曲霉素可为黄曲霉素M₁或黄曲霉素M₂。 

本发明对于黄曲霉素的检测具有重大价值。 

附图说明

图1为黄曲霉素M₁人工抗原的紫外光谱图。 

图2为采用黄曲霉素M₁制作的标准曲线图。 

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中所用的PBS缓冲液均为pH7.4、0.01M的PBS缓冲液。实施例中所用的碳酸盐缓冲液均为pH9.6、0.05mol/L的碳酸钠缓冲液。牛血清白蛋白简称BSA。卵清蛋白简称OVA。 

黄曲霉素M₁如式(III)所示，分子量为328.27。 

式(III) 

对肼基苯甲酸如式(IV)所示，分子量为152.15。 

式(IV) 

N，N-二甲基甲酰胺(DMF)如式(V)所示。 

式(V) 

N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)如式(VI)所示。 

式(VI) 

1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)如式(VII)所示。 

式(VII) 

实施例1、制备黄曲霉素M₁半抗原 

一、黄曲霉素M₁半抗原的制备 

将10mg黄曲霉素M₁溶于5ml无水吡啶，加入对肼基苯甲酸10mg，70℃加热回流搅拌反应5h，旋蒸除去吡啶，将残留物用1mL甲醇溶解，以二氯甲烷∶甲醇(体积比9∶1)为展开剂，通过薄层层析(TLC)分离纯化，收集比移值(R_f值)为0.35的样本，即为黄曲霉素M₁半抗原(得到8mg)。 

二、黄曲霉素M₁半抗原的表征 

对步骤一制备的产物进行元素分析，结果如下： 

C：62.32；H：3.94；N：6.08；O：27.66。 

结果表明，步骤一制备的产物为式(I)所示化合物，又称为M1-HBA。 

式(I)。 

实施例2、黄曲霉素M₁人工抗原的制备和表征 

一、黄曲霉素M₁免疫原的合成和表征 

1、黄曲霉素M₁免疫原的合成 

(1)将5mg实施例1制备得到的式(I)所示化合物溶于1mL N，N’-二甲基酰胺中，加入4mg N-羟基琥珀酰亚胺和4mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，室温下磁力搅拌2h，得到溶液I。 

(2)将30mg牛血清白蛋白加入3mL PBS缓冲液中，充分溶解，即为溶液II。 

(3)将溶液I加至溶液II中，缓慢搅拌24h后入透析袋，在生理盐水中4℃透析72h(中间换水6次)，然后于4℃条件下，8000rmp离心30min，取上清，即黄曲霉素M₁免疫原溶液，分装于安培瓶中，-20℃保存，黄曲霉素M₁免疫原简称M1-BSA，黄曲霉素M₁免疫原溶液简称M1-BSA溶液。 

(4)将M1-BSA溶液用PBS缓冲液稀释后，测定280nm和260nm的分光光度值，按公式计算稀释液中的蛋白浓度，将测得的蛋白浓度值乘以其稀释倍数后即为原M1-BSA溶液中的M1-BSA浓度。蛋白质浓度(mg/ml)＝1.45×OD₂₈₀-0.74×OD₂₆₀。M1-BSA溶液中的M1-BSA浓度为6.1mg/ml。 

2、黄曲霉素M₁免疫原的表征 

将M1-BSA溶液用PBS缓冲液稀释(使M1-BSA的浓度为5mg/mL)，作为溶液甲；将含5mg/mL M1-HBA的PBS缓冲液作为溶液乙；将含5mg/mL BSA的PBS缓冲液作为溶液丙。分别将溶液甲、溶液乙和溶液丙进行紫外(200-380nm)光谱扫描，紫外光谱扫描结果见图1。与溶液丙相比溶液甲的紫外图谱发生了明显变化，说明化合物与BSA成功偶联。 

溶液乙的最大吸收波长值为262nm，溶液丙的最大吸收波长值为280nm。根据公式K＝A/CL(A为最大吸收波长值下的吸光度，C为溶液浓度，L为液层的厚度)计算各个化合物的消光系数(K)。 

分别采用溶液乙和溶液丙的最大吸收波长值对溶液甲进行紫外光谱扫描，并根据已经计算出的该化合物的消光系数反向计算该化合物在溶液甲中的浓度，用浓度值除以分子量得到该化合物的摩尔浓度，计算偶联比，式(I)所示化合物和BSA的偶联比为8∶1，即8个式(I)所示化合物结合1个BSA。 

二、黄曲霉素M₁包被原的制备和表征 

1、黄曲霉素M₁包被原的制备 

用卵清蛋白代替牛血清白蛋白，其它同步骤一的1。 

黄曲霉素M₁包被原简称M1-OVA，黄曲霉素M₁包被原溶液简称M1-OVA溶液。 

M1-OVA溶液中的M1-OVA浓度为3.8mg/ml。 

2、黄曲霉素M₁包被原的表征 

用M1-OVA代替M1-BSA，用OVA代替BSA，其它同步骤一的2。 

式(I)所示化合物和OVA的偶联比为10∶1，即10个式(I)所示化合物结合1个OVA。 

实施例3、黄曲霉素单克隆抗体的制备 

Balb/c小鼠：购于北京维通利华实验动物技术有限公司； 

SP2/0骨髓瘤细胞：购自Sigma-Aldrich公司，产品目录号为08060101。 

一、动物免疫 

将实施例2制备的M1-BSA溶液免疫Balb/c小鼠，每只小鼠单次免疫100μgM1-BSA，共免疫4次，每次间隔两周，前三次的免疫方式为颈背部皮下多点注射，后三次的免疫方式为腹膜内注射。 

二、细胞融合与克隆化 

1、第四次免疫3天后，取脾细胞，按5∶1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。 

2、利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到一株可以分泌黄曲霉素M₁单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为抗黄曲霉毒素单克隆抗体杂交瘤细胞2A1(简称杂交瘤细胞2A1)。杂交瘤细胞2A1已于2012年2月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.5779。 

三、细胞冻存和复苏 

用冻存液将杂交瘤细胞2A1制成1×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时，取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后移入培养瓶内培养。 

四、单克隆抗体的制备与纯化 

1、增量培养法 

细胞培养基(7.4)的制备方法：向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，小牛血清的终浓度为20％(质量百分含量)，碳酸氢钠的终浓度为0.2％(质量百 分含量)。 

将杂交瘤细胞2A1置于细胞培养基中，37℃培养2天，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体溶液(-20℃保存)。 

单克隆抗体中的蛋白质浓度(mg/ml)＝1.45×OD₂₈₀-0.74×OD₂₆₀。 

采用以上公式计算单克隆抗体中的蛋白质浓度，为18.9mg/ml。 

2、腹水制备 

Balb/c小鼠腹腔注射灭菌石蜡油(0.4mL/只)。7天后腹腔注射杂交瘤细胞株(5×10⁵个/只)。7天后采集腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水-20℃保存。 

五、单克隆抗体的鉴定 

将步骤四的1得到的单克隆抗体溶液分别进行如下鉴定： 

1、抗体效价的测定 

(1)采用实施例2制备的M1-OVA溶液(采用碳酸盐缓冲液调节浓度)进行包被，100μL/孔；M1-OVA的包被浓度为1.0μg/mL。 

(2)4℃孵育16小时。 

(3)封闭并洗板。 

(4)每孔加入100μL步骤四的1得到的单克隆抗体溶液或其稀释液(采用PBS缓冲液进行梯度稀释)。 

(5)室温孵育2h，洗板。 

(6)每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，室温孵育2h。 

(7)洗板。 

(8)加入TMB显色液，避光显色15min。 

(9)每孔加入100μL 2mol/L硫酸中止反应；读OD₄₅₀值。 

以OD值达到1.0左右时判定为阳性。抗体效价为1∶320000。 

2、单克隆抗体灵敏度的计算 

(1)至(3)同步骤1的(1)至(3)。 

(4)每孔加入50μL黄曲霉素M₁标准品溶液(由黄曲霉素M₁和PBS缓冲液组成；黄曲霉素M₁的浓度分别为0.03μg/L、0.09μg/L、0.18μg/L、0.36μg/L、0.72μg/L；将只加入PBS缓冲液的孔作为对照孔)；每个浓度设置3个复孔。 

(5)每孔加入50μL步骤四的1得到的单克隆抗体溶液。 

(6)室温孵育2h，洗板。 

(7)每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，室温孵育2h。 

(8)洗板。 

(9)加入TMB显色液，避光显色15min。 

(10)每孔加入100μL 2mol/L硫酸中止反应；读OD₄₅₀值。 

将采用各个浓度的标准品溶液得到的吸光值(三个复孔的平均值)除以对照孔的吸光值再乘以100作为纵坐标，以各个标准品溶液中的黄曲霉素M1浓度(μg/L)的自然对数值为横坐标绘制曲线图，见图2。 

对照图2，得到纵坐标数值等于50％对应的黄曲霉素M1浓度(μg/L)，即为IC₅₀值。单克隆抗体检测黄曲霉素M1的灵敏度(IC50值)为0.05μg/L。 

3、交叉反应率的计算 

(1)至(3)同步骤1的(1)至(3)。 

(4)每孔加入50μL结构类似物标准品溶液(由结构类似物和PBS缓冲液组成；结构类似物的浓度分别为0.03μg/L、0.09μg/L、0.18μg/L、0.36μg/L、0.72μg/L；将只加入PBS缓冲液的孔作为对照孔)，每个浓度设置3个复孔。 

(5)至(10)同步骤2的(5)至(10)。 

将采用各个浓度的结构类似物得到的吸光值(三个复孔的平均值)除以对照孔的吸光值再乘以100作为纵坐标，以各个标准品溶液中的结构类似物浓度(μg/L)的自然对数值为横坐标绘制曲线图。对照曲线图，得到纵坐标数值等于50％时对应的结构类似物浓度(μg/L)，即结构类似物的IC₅₀值。结果见表1。 

用下式计算单克隆抗体对其它结构类似物的交叉反应率。 

表1单克隆抗体特异性 

结构类似物名称	购自的公司名称及其产品目录号	交叉反应率
			黄曲霉素M1	FERMENTEK公司；产品目录号为FER005	100％
黄曲霉素M2	FERMENTEK公司；产品目录号为FER006	约94％
			黄曲霉素B1	FERMENTEK公司；产品目录号为FER001	约18.7％
黄曲霉素B2	FERMENTEK公司；产品目录号为FER002	约5.4％
			黄曲霉素G1	FERMENTEK公司；产品目录号为FER003	＜1％
黄曲霉素G2	FERMENTEK公司；产品目录号为FER004	＜1％
			牛血清白蛋白	Fluorochem Limi ted公司；产品目录号为S02375	＜1％
脱氧雪腐镰刀菌烯醇	FERMENTEK公司；产品目录号为FER008	＜1％

单克隆抗体与黄曲霉素M₂的交叉反应率为94％、与黄曲霉素B₁、黄曲霉素B₂分别 有18.7％和5.4％的交叉反应，与其他结构结构类似物无交叉反应。 

4、亲和常数测定 

(1)用M1-OVA作为包被原包被酶标板 

采用实施例2制备的M1-OVA溶液(采用碳酸盐缓冲液调节浓度)进行包被，100μL/孔；分别设置以下OVA-SAL包被浓度：1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL。 

(2)4℃孵育16小时。 

(3)封闭并洗板。 

(4)每孔加入100μL单克隆抗体溶液的稀释液(用PBS缓冲液进行稀释)；稀释液中的蛋白质浓度分别为1.25、0.625、0.3125、1.5625×10^-1、7.8×10^-2、3.9×10^-2、1.95×10^-2、9.75×10^-3、4.88×10^-3、2.44×10^-3.、1.22×10^-3、6.1×10^-4mg/L。 

(5)室温孵育2h，洗板。 

(6)每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，室温孵育2h。 

(7)洗板。 

(8)加入TMB显色液，避光显色15min。 

(9)每孔加入100μL 2mol/L硫酸中止反应；读OD₄₅₀值。 

以单克隆抗体中的蛋白质浓度(mol/L)的自然对数值为横坐标，以其对应的吸光度为纵坐标制作曲线。 

每个抗原包被浓度得到1条S型曲线，共得到4条S型曲线。找出S曲线的顶部，对应的OD₄₅₀值设定为ODMAX。分别找出各条曲线50％ODMAX对应的抗体浓度。采用1μg/mL包被浓度，50％ODMAX对应的抗体浓度为2.8×10^-12mol/L。采用0.5μg/mL包被浓度，50％ODMAX对应的抗体浓度为27.7×10^-12mol/L。采用0.25μg/mL包被浓度，50％ODMAX对应的抗体浓度为190.4×10^-12mol/L。采用0.125μg/mL包被浓度，50％ODMAX对应的抗体浓度为368.2×10^-12mol/L。 

将4个浓度两两一组，根据公式计算单克隆抗体的亲和常数 

Ka＝(n-1)/2(n[Ab]t₁-[Ab]t₂) 

公式中，n为每组中两个包被浓度的倍数，[Ab]t₁、[Ab]t₂分别为每组中两个50％ODMAX对应的抗体浓度(mol/L)。例如：1μg/mL包被浓度50％OD₄₅₀对应的抗体浓度为2.8×10^-12mol/L，包被0.5μg/mL包被浓度50％OD₄₅₀对应的抗体浓度为27.7×10^-12mol/L，Ka＝(2-1)/2(2×27.7×10^-12-2.8×10^-12)＝9.5×10⁹M^-1。依次类推，得到其余5个Ka值，分别为1.41×10⁹M^-1、0.91×10⁹M^-1、1.97×10⁹M^-1、1.03×10⁹M^-1、 1.18×10⁹M^-1，取平均值计算得出单克隆抗体的亲和常数为2.67×10⁹M^-1。 

六、杂交瘤细胞株的稳定性 

将杂交瘤细胞2A1体外连续传30代，每隔5代取培养上清进行ELISA测定(方法同步骤五的1)。结果显示连续30代的效价无显著差异，杂交瘤细胞2A1能稳定传代。 

Claims (3)

1.抗黄曲霉毒素单克隆抗体杂交瘤细胞2A1，它的保藏编号为CGMCC No.5779。

2.权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

3.权利要求2所述单克隆抗体在检测黄曲霉素中的应用。

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