CN112759649B - 一种黄曲霉毒素m1单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种黄曲霉毒素m1单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种黄曲霉毒素M1单克隆抗体，编码抗体的基因序列包括轻链可变区的序列和重链可变区的序列，轻链可变区的序列如SEQ ID NO:1所示，重链可变区的序列如SEQ ID NO:2所示。本发明采用上述的一种黄曲霉毒素M1单克隆抗体，对黄曲霉毒素M1具有较高亲和力、检测灵敏度高，为间接竞争ELISA试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定基础。

Description

一种黄曲霉毒素M1单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及黄曲霉毒素M1检测技术领域，尤其是涉及一种黄曲霉毒素M1单克隆抗体。
背景技术
黄曲霉毒素M1（Aflatoxin M1，AFM1）是黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）的羟基化代谢产物，属于黄曲霉毒素类化合物，AFM1基本结构为一个羟基取代基的二呋喃环与一个氧杂萘邻酮。动物摄入AFB1后，经体内代谢成AFM1，AFM1主要存在于动物的乳汁、肾脏、肝脏、蛋、肉和尿中。人食用含有AFM1的食物后，会引起机体DNA结构和功能的改变，产生癌变。
《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》GB 2761-2017规定食品（乳及乳制品，婴儿配方食品，较大婴儿和幼儿配方食品，特殊医学用途婴儿配方食品，辅食营养补充品，运动营养食品，孕妇及乳母营养补充食品）中AFM1限量要求≤0.5ug/kg。
目前，黄曲霉毒素M1检测多采用高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱与质谱联用法（LCMS）、气质联用法（GC-MS）等。但是，仪器法进行定量分析具有较低的检测限，并且，仪器操作复杂，费用昂贵，无法达到现场规模快速检测的要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种黄曲霉毒素M1单克隆抗体，对黄曲霉毒素M1具有较高亲和力、检测灵敏度高，为间接竞争ELISA试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定基础。
为实现上述目的，本发明提供了一种黄曲霉毒素M1单克隆抗体，编码抗体的基因序列包括轻链可变区的序列和重链可变区的序列，轻链可变区的序列如SEQ ID NO:1所示，重链可变区的序列如SEQ ID NO:2所示。
优选的，抗体包含抗体轻链CDR区和抗体重链CDR区，其中：
抗体轻链CDR区包括CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，抗体重链CDR区包括CDR4、CDR5、CDR6的氨基酸序列。
优选的，轻链CDR1具有SEQ ID NO:3所示的序列，轻链CDR2具有SEQ ID NO:4所示的序列，轻链CDR3具有SEQ ID NO:5所示的序列。
优选的，重链CDR4具有SEQ ID NO:6所示的序列，重链CDR5具有SEQ ID NO:7所示的序列，重链CDR6具有SEQ ID NO:8所示的序列。
优选的，黄曲霉毒素M1单克隆抗体用于制备黄曲霉毒素M1胶体金试纸条。
因此，本发明采用上述一种黄曲霉毒素M1单克隆抗体，对黄曲霉毒素M1具有较高亲和力、检测灵敏度高，为间接竞争ELISA试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定基础。免疫分析方法具有成本低、效率高、灵敏度高、对技术人员相对要求低等优点，适用于大量样品的快速检测。并且，单克隆抗体特异性强、灵敏度高，可作为酶联免疫检测和胶体金免疫检测的原料。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1是单克隆抗体H-8E6轻链基因序列同源性比对；
图2是单克隆抗体H-8E6重链基因序列同源性比对；
图3单克隆抗体H-8E6轻链氨基酸序列同源性比对；
图4是单克隆抗体H-8E6重链氨基酸序列同源性比对；
图5是采用间接Elisa方法检测单克隆灵敏度及特异性的RIDA SOFT四参数法曲线图；
图6是采用间接Elisa方法检测单克隆灵敏度及特异性的RIDA SOFT四参数法曲线图中局部放大图；
图7是胶体金试纸条示意图。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例一
单克隆抗体的制备
（1）初次免疫
将黄曲霉毒素M1人工抗原弗氏完全佐剂1:1乳化，皮下注射6周龄的BALB/C小鼠，免疫剂量为300μg/只。从首次免疫开始，每4周加强免疫一次，共加强免疫2次，用弗式不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，方法与剂量同首次免疫。
第2次加强免疫一周后眼底静脉采血测效价和抑制，有抑制且效价达到1:10000以上时，进行1次冲击免疫，即腹腔注射免疫原溶液0.5mL，三天后取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆，得到并建立稳定分泌将黄曲霉毒素M1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
（2）细胞复苏
取出黄曲霉毒素M1单克隆抗体杂交瘤细胞株冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
制备腹水与抗体纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠（8周龄）腹腔注入灭菌石蜡油0.8 mL/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞8*105个/只，10天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到黄曲霉毒素M1单克隆抗体。
（3）黄曲霉霉毒素M1单克隆抗体的特异性及亚类鉴定
采用间接Elisa方法检测单克隆灵敏度及特异性，结果见下表。以将黄曲霉毒素M1各浓度(0，0.1，0.3，0.9，2.7，8.1ppb)横坐标，以将黄曲霉毒素M1各浓度对应的OD值为纵坐标，使用RIDA SOFT四参数法绘制标准曲线，计算半数抑制浓度（IC50）。结果表明，曲线R2=0.9990，IC50=28.7pg/ml，相对于专利CN 102220286 B报道的将黄曲霉毒素M1单抗IC50=67pg/ml更灵敏。
Figure 162258DEST_PATH_IMAGE002
使用IgG亚类检测试剂盒（美国 Sigma公司）检测将黄曲霉毒素M1单克隆抗体的亚类，结果显示黄曲霉毒素M1单克隆抗体为IgG1（λ）。
实施例二
轻链和重链可变区基因克隆
（1）杂交瘤细胞培养及总RNA提取
用RPMI 1640完全培养基在37℃、5%二氧化碳培养杂交瘤细胞1*107。培养细胞总RNA提取试剂盒试剂盒（天根）提取细胞总RNA。
（2）cDNA第一链的合成
Takara翻转录试剂盒（日本）合成cDNA。
（3）基因扩增
设计Lambda链，Kappa链，Heavy链下游引物及上游通用引物。
引物：F:AAGCAGTCGTATCAAGCAAGA
Rκ:AACATTGAACTCTTTGGTAGAA
Rλ:AATCGTACACTCAGTGTGTCGG
RH:AGCGATCCAGAGTATCCAGTT
以cDNA第一链为模板进行PCR，反应体系50ul。
降落PCR反应体系：模板 3ul，dNTPs 1ul，引物（10uM）2.5ul，5×PCR buffer10ul，ddH2O 30.5ul，Taq酶（5u/ul） 0.5ul水。
降落PCR反应条件为：98℃ 30s；98℃ 15s，64℃-58℃ 30s，每次下降0.5℃，直到58℃，循环10次；72℃ 30s；98℃ 15s，56℃ 30s，72℃30s，循环15次；72℃ 7min。
（4）PCR扩增产物的克隆和筛选
PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，用PCR产物回收试剂盒（北京天根）回收抗体Kappa链，lambda链和heavy链片段，用pLB零背景快速克隆试剂盒（北京天根）将该片段插入pLB载体中，转化至DH5α感受态细胞（氨苄抗性）中，筛选重组阳性克隆测序。
PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，结果显示Kappa链未见条带，lambda链和heavy链测序结果如下：
（5）可变区氨基酸序列及同源性分析
在NCBI数据库中进行比对分析，分析结果表明：单克隆抗体H-8E6轻链可变区基因与小鼠免疫球蛋白Lambda链可变区（Sequence ID:BC119451.2）同源性最高，同源性为457/463，同源性百分比为99%，见图1。
单克隆抗体H-8E6重链可变区基因与小鼠免疫球蛋白重链可变区（Sequence ID:AY172008.1）同源性最高，同源性为266/270，同源性百分比为99%，见图2。
单克隆抗体H-8E6轻链可变区氨基酸与小鼠IgG（λ）（Sequence ID:AAA39092.1）同源性最高，同源性为94/96，同源性百分比为98%，见图3。单克隆抗体H-8E6重链链可变区氨基酸与鼠源黄曲霉毒素B1抗体免疫球蛋白重链（Sequence ID:QCF41905.1）同源性最高，同源性为140/161，同源性百分比为87%，见图4。编码单克隆抗体H-8E6的轻链和重链可变区的基因序列和氨基酸序列同源性分析结果表明，未发现与本发明相同的序列。此结果与使用IgG亚类检测试剂盒（美国Sigma公司）鉴定黄曲霉毒素M1单克隆抗体为IgG1（λ）相一致。
将轻链可变区和重链可变区序列，在纽普生物（NovoPro）分析，得出其CDR区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3-8所示。
试验测试
一、制备黄曲霉毒素M1胶体金试纸条
试纸条结构，如图7所示，试纸条是由底板1、吸水垫2、硝酸纤维素膜3、结合物释放垫4、样品吸收垫5组成；样品吸收垫5、结合物释放垫4、硝酸纤维素膜3、吸水垫2依次按顺序粘贴在底板1上；结合物释放垫4从起始端有1/4区域被样品吸收垫5覆盖，结合物释放垫4的末端与硝酸纤维素膜3的始端连接，硝酸纤维素膜3的末端与吸水垫2的始端相连，样品吸收垫5的始端与底板1的始端对齐，吸水垫2的末端与底板1的末端对齐；
硝酸纤维素膜3上有检测线7和质控线6，检测线T和质控线C均呈与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测线7位于靠近结合物释放垫(4)的末端的一侧；质控线6位于远离结合物释放垫4的末端的一侧。将试纸条用机器切成4.05mm宽的小条，以铝箔袋密封，2～30℃条件下可保存12个月。
二、试纸条的制备方法及步骤
该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：
1)制备具有黄曲霉毒素M1人工抗原的检测线和包被有羊抗鼠抗体的质控线的硝酸纤维素膜；
2)制备喷涂有胶体金标记的黄曲霉毒素M1单克隆抗体的结合物释放垫；
3)将样品吸收垫、结合物释放垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次固定在底板上。
三、检测牛奶粉中黄曲霉毒素M1的含量
称取1g（精确到0.01g）奶粉，倒入离心管中加入8 mL纯净水混匀后，配制待测样本1（黄曲霉毒素M1 0.02ppb），待测样本2（黄曲霉毒素M1 0.01ppb），待测样本3（黄曲霉毒素M1 0ppb），备用。待测样本必须为均匀液体，不能有结块、发酵变质的沉淀块，否则会影响检测结果。将上述制备好的试纸条插入待测样本溶液中，室温反应10分钟后即可判读结果，不超过20分钟。
结果判定
（1）阴性(－)：C线和T线均显色，T线显色远比C线强，表示样本中不含黄曲霉毒素M1或远低于检出限。
（2）阳性(＋)：C线显色；T线显色与C线相同、T线显色比C线弱或者T线不显色，均表示样本中黄曲霉素毒素M1浓度等于或高于检出限。
（3）无效：未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸条已变质失效。
结果发现，待测样本1（黄曲霉毒素M1 0.02ppb）为阳性，待测样本2（黄曲霉毒素M10.01ppb）为阴性，待测样本3（黄曲霉毒素M1 0ppb）为阴性。此结果表明试纸条检测限为0.02ppb。
因此，本发明采用上述一种黄曲霉毒素M1单克隆抗体，对黄曲霉毒素M1具有较高亲和力、检测灵敏度高，为间接竞争ELISA试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定基础。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 北京纳百生物科技有限公司
<120> 一种黄曲霉毒素M1单克隆抗体及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 496
<212> DNA
<213> 黄曲霉毒素M1抗体(Aflatoxin M1 antibody)
<400> 1
tacatggggg accaatattg aaaagaatag acctggtttg tgaattatgg cctggatttc 60
acttatactc tctctcctgg ctctcagctc aggggccatt tcccaggctg ttgtgactca 120
ggaatctgca ctcaccacat cacctggtga aacagtcaca ctcacttgtc gctcaagtgc 180
tggggctgtt acaactagta actatgccaa ctgggtccaa gaaaaaccag atcatttatt 240
cactggtcta ataggtggta caaacaaccg agctccaggt gttcctgcca gattctcagg 300
ctccctgatt ggagacaagg ctgccctcac catcacaggg gcacagactg aggatgagtc 360
aatatatttc tgtgctctat ggtacagcaa ccatttcggt gttcggtgga ggaaccaaac 420
tgactgtcct aggccagccc aagtcttcgc catcagtcac cctgtttcca ccttcctctg 480
aagagctcga gactaa 496
<210> 2
<211> 579
<212> DNA
<213> 黄曲霉毒素M1抗体(Aflatoxin M1 antibody)
<400> 2
tacatgggga cagtcactga aaacattgac tctaatcatg gaatgtaact ggatacttcc 60
ttttattctg tcggtaactt caggggtcta ctcagaggtt cagctccagc agtctgggac 120
tgtgctggca aggcctgggg cttcagtgaa gatgtcctgc aaggcttctg actacacctt 180
ttccagctat tggatgcact gggtaaaaca gaggcctgga cagggtctgg aatggattgg 240
cgctatttct cctggaaata gtgatactag ctacaaccag aagttcaagg gcaaggccaa 300
actgactgca gtcacatcca ccagcactgc ctacatggag ctcagcagcc tgacaaatga 360
ggactctgcg gtctattact gtacaagaac aggggtatat gttaactacc tttactggta 420
cttcgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc tcagccaaaa cgacaccccc 480
atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact aactccatgg tgaccctggg 540
atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagt 579
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 黄曲霉毒素M1抗体(Aflatoxin M1 antibody)
<400> 3
Ala Ser Ser Ala Gly Ala Val Thr Thr Ser Ala Thr Ala Ala
1 5 10
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 黄曲霉毒素M1抗体(Aflatoxin M1 antibody)
<400> 4
Gly Thr Ala Ala Ala Ala Pro
1 5
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 黄曲霉毒素M1抗体(Aflatoxin M1 antibody)
<400> 5
Ala Leu Thr Thr Ser Ala His Pro Gly Val
1 5 10
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 黄曲霉毒素M1抗体(Aflatoxin M1 antibody)
<400> 6
Ser Thr Thr Met His
1 5
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 黄曲霉毒素M1抗体(Aflatoxin M1 antibody)
<400> 7
Ala Ile Ser Pro Gly Ala Ser Ala Thr Ser Thr Ala Gly Leu Pro Leu
1 5 10 15
Gly
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> 黄曲霉毒素M1抗体(Aflatoxin M1 antibody)
<400> 8
Thr Gly Val Thr Val Ala Thr Leu Thr Thr Thr Pro Ala Val
1 5 10

Claims (5)

1.一种黄曲霉毒素M1单克隆抗体，其特征在于：编码抗体的基因序列包括轻链可变区的序列和重链可变区的序列，轻链可变区的序列如SEQ ID NO:1所示，重链可变区的序列如SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的一种黄曲霉毒素M1单克隆抗体，其特征在于：抗体包含抗体轻链CDR区和抗体重链CDR区，其中：
抗体轻链CDR区包括CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，抗体重链CDR区包括CDR4、CDR5、CDR6的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的一种黄曲霉毒素M1单克隆抗体，其特征在于：轻链CDR1如SEQID NO:3所示的序列，轻链CDR2如SEQ ID NO:4所示的序列，轻链CDR3如SEQ ID NO:5所示的序列。
4.根据权利要求2所述的一种黄曲霉毒素M1单克隆抗体，其特征在于：重链CDR4如SEQID NO:6所示的序列，重链CDR5如SEQ ID NO:7所示的序列，重链CDR6如SEQ ID NO:8所示的序列。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的黄曲霉毒素M1单克隆抗体在胶体金试纸条或ELISA试剂盒的应用。
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