CN103333862B

CN103333862B - 抗β-伴大豆球蛋白的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN103333862B
Application number: CN201310228263.3A
Authority: CN
Inventors: 谯仕彦; 付巍; 魏寒冰; 李悦; 张学; 何涛
Original assignee: BEIJING LONGKE FANGZHOU BIOLOGICAL ENGINEERING TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING LONGKE FANGZHOU BIOLOGICAL ENGINEERING TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-06-08
Filing date: 2013-06-08
Publication date: 2014-12-03
Anticipated expiration: 2033-06-08
Also published as: CN103333862A

Abstract

本发明公开了一种抗β-伴大豆球蛋白的单克隆抗体及其应用。所述单克隆抗体是由杂交瘤细胞株2C4CGMCC No.7109分泌产生的。实验证明，该β-伴大豆球蛋白单克隆抗体的亲和常数达6.2×10¹¹L/mol。以该β-伴大豆球蛋白单克隆抗体为检测抗体建立的竞争性酶联免疫方法检测β-伴大豆球蛋白，检测限为0.1ng/ml—8.1ng/mL。本发明所提供的β-伴大豆球蛋白单克隆抗体及其检测方法和试剂盒具有检测限低，检测范围广，且高效、准确的优点，可广泛应用于大豆、大豆制品中β-伴大豆球蛋白的定性和定量检测。

Description

抗β-伴大豆球蛋白的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一种抗β-伴大豆球蛋白的单克隆抗体及其应用。

背景技术

大豆中含有丰富的蛋白质，由于其必需氨基酸（如赖氨酸、苏氨酸和色氨酸）组成比例适宜，是畜禽优质的植物性蛋白源。但大豆中含有的大豆抗原蛋白所导致的动物过敏反应越来越受到人们的关注。在幼龄动物饲料中添加豆粕作为蛋白质来源会导致仔猪、犊牛等的腹泻、生长性能下降、肠黏膜细胞增生以及免疫功能失调等一系列不良反应，严重的甚至导致死亡。

β-伴大豆球蛋白是大豆中主要的致敏蛋白质，占大豆籽实总蛋白的10.0%-12.7%，占总球蛋白的30.0%，其分子量为140—180kDa，是一类糖基化蛋白质，由分子量大小分别为58—77、58—83和42—53kDa的三种亚基组成。β-伴大豆球蛋白具有含量丰富、热稳定性强、具有较强免疫原性的特点，经常能够引起过敏反应，如能引起婴幼儿、5-6%的儿童和2-4%的成年人腹泻，严重的伴有颤抖、咽喉水肿和急性哮喘等症状，在畜牧业，β-伴大豆球蛋白能导致断奶仔猪和妊娠母猪、犊牛、大鼠等幼龄动物的过敏反应，表现为腹泻、生长性能下降直至死亡。定量检测不同大豆制品中的β-伴大豆球蛋白的含量具有重要的理论意义及应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗β-伴大豆球蛋白的单克隆抗体及其应用。

本发明所提供的抗β-伴大豆球蛋白的单克隆抗体，是由杂交瘤细胞株2C4分泌产生的；所述杂交瘤细胞株2C4，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.7109。

所述抗β-伴大豆球蛋白的单克隆抗体可用于检测或辅助检测β-伴大豆球蛋白。

所述杂交瘤细胞株2C4或所述抗β-伴大豆球蛋白的单克隆抗体可用于制备检测或辅助检测β-伴大豆球蛋白的试剂或试剂盒。

本发明还提供了一种检测或辅助检测β-伴大豆球蛋白的试剂盒，该试剂盒中含有独立包装的所述抗β-伴大豆球蛋白的单克隆抗体。

所述试剂盒中还可含有独立包装的如下1）—9）试剂中的至少一种：

1）包被缓冲液：溶剂为水，溶质为Na₂HPO₄和NaH₂PO₄，所述溶质Na₂HPO₄和NaH₂PO₄在所述包被缓冲液中的浓度分别为2.3g/L和0.45g/L，pH值为7.4；

2）封闭液：溶剂为水，溶质为牛血清白蛋白（BSA）、小牛血清、吐温-20和蔗糖，所述溶质BSA、小牛血清、吐温-20和蔗糖在所述封闭液中的浓度分别为10g/L、100ml/L、0.5ml/L和100g/L；

3）PBS缓冲液：溶剂为水，溶质为NaCl、KCl、KH₂PO₄和Na₂HPO₄，所述溶质NaCl、KCl、KH₂PO₄和Na₂HPO₄在所述PBS缓冲液中的浓度为8g/L、0.2g/L、0.2g/L和0.46g/L，pH值为7.4；

4）洗涤液：溶剂为所述PBS缓冲液，溶质为吐温-20，所述溶质吐温-20在所述洗涤液中的浓度为50ml/L；

5）抗体稀释液：溶剂为所述PBS缓冲液，溶质为吐温-20和明胶，所述溶质吐温20和明胶在所述抗体稀释液中的浓度分别为10ml/L和0.01M；

6）终止液：2M的硫酸水溶液；

7）底物液A和底物液B；

所述底物液A：溶剂为水，溶质为过氧化氢脲、Na₂HPO₄、柠檬酸和吐温-20，所述过氧化氢脲、Na₂HPO₄、柠檬酸和吐温-20在所述底物液A浓度分别为1g/L、14.2g/L、9.42g/L和0.1ml/L；

所述底物液B：溶剂为水，溶质为四甲基联苯胺、柠檬酸和硫代硫酸钠，所述四甲基联苯胺、柠檬酸和硫代硫酸钠在所述底物液B中的浓度分别为0.4g/L、1.83g/L和0.1g/L；

8）30×样品提取液：溶剂为水，溶质为Tris、HCl和β-巯基乙醇，所述Tris、HCl和β-巯基乙醇在所述30×样品提取液中的浓度分别为Tris181.7mg/L、73ml/L、21ml/L。

9）样品稀释液：溶剂为所述PBS缓冲液，溶质为巯基乙醇和明胶，所述巯基乙醇在所述样品稀释液中的浓度为0.2M，所述明胶在所述样品稀释液中的浓度为0.01M。

本发明还提供了一种检测或辅助检测β-伴大豆球蛋白的方法，包括使用所述试剂盒对待测样品进行检测的步骤。

所述试剂盒可用于定量检测β-伴大豆球蛋白含量。

本发明还保护将所述抗β-伴大豆球蛋白的单克隆抗体和固相载体相偶联得到的免疫亲和吸附剂、或以所述免疫亲和吸附剂为填料的免疫亲和色谱柱、或含有所述免疫亲和吸附剂、所述免疫亲和色谱柱的试剂盒及其在分离纯化β-伴大豆球蛋白中的应用。

实验证明，以纯度为97%的β-伴大豆球蛋白为免疫原免疫小鼠，取脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合获得杂交瘤细胞株2C4CGMCC No.7109，该杂交瘤细胞株2C4所稳定分泌的β-伴大豆球蛋白单克隆抗体，亲和常数达6.2×10¹¹L/mol。以该β-伴大豆球蛋白单克隆抗体为检测抗体建立竞争性酶联免疫方法检测β-伴大豆球蛋白，检测限为0.1ng/ml—8.1ng/mL。本发明所提供的β-伴大豆球蛋白单克隆抗体及其检测方法和试剂盒具有检测限低，检测范围广，且高效、准确的优点，可广泛应用于大豆、大豆制品中β-伴大豆球蛋白的定性和定量检测。

保藏说明

分类命名：杂交瘤细胞

株号：2C4

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所

保藏日期：2013年1月24日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.7109

附图说明

图1为竞争性ELISA试剂盒检测β-伴大豆球蛋白的标准曲线。其中，横坐标为各标准品溶液中β-伴大豆球蛋白浓度（ng/mL）的Lg值，纵坐标为百分吸光度值（%）。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的实验结果如无特殊说明，均为三次重复的平均值。

下述实施例中所用的β-伴大豆球蛋白购自SIGMA公司，产品目录编号为G3171；雌性BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；SP2/0细胞购自上海佳和生物科技有限公司。

下述实施例中蛋白质浓度测定使用的试剂盒为BCA蛋白定量试剂盒，购自pierce公司，产品目录编号为23227。

下述实施例中所用的溶液如无特殊说明，配方如下：

包被缓冲液：溶剂为水，溶质为Na₂HPO₄和NaH₂PO₄，所述溶质Na₂HPO₄和NaH₂PO₄在所述包被缓冲液中的浓度分别为2.3g/L和0.45g/L，pH值为7.4。

封闭液：溶剂为水，溶质为牛血清白蛋白（BSA）、小牛血清、吐温-20和蔗糖，所述溶质BSA、小牛血清、吐温-20和蔗糖在所述封闭液中的浓度分别为10g/L、100ml/L、0.5ml/L和100g/L。

PBS缓冲液（PBS）：溶剂为水，溶质为NaCl、KCl、KH₂PO₄和Na₂HPO₄，所述溶质NaCl、KCl、KH₂PO₄和Na₂HPO₄在所述PBS缓冲液中的浓度为8g/L、0.2g/L、0.2g/L和0.46g/L，pH值为7.4。

洗涤液：溶剂为所述PBS缓冲液，溶质及其浓度为吐温-2050ml/L。

抗体稀释液：溶剂为所述PBS缓冲液，溶质为吐温-20和明胶，所述溶质吐温20和明胶在所述抗体稀释液中的浓度为10ml/L和0.01M。

终止液：2M的硫酸水溶液。

底物液A：溶剂为水，溶质及其浓度分别为过氧化氢脲1g/L、Na₂HPO₄14.2g/L、柠檬酸（C₆H₈O₇）9.42g/L和吐温-200.1ml/L。

底物液B：溶剂为水，溶质及其浓度分别为四甲基联苯胺0.4g/L、柠檬酸（C₆H₈O₇）1.83g/L和硫代硫酸钠0.1g/L。

实施例1、杂交瘤细胞株的获得及抗β-伴大豆球蛋白单克隆抗体的制备

一、杂交瘤细胞株的获得

1、动物免疫

将β-伴大豆球蛋白（即免疫原）溶于0.5ml生理盐水中，加入等体积佐剂制成乳化剂，免疫雌性BALB/c小鼠（体重18～22g）。第三次免疫后7～10天测定血清效价。免疫步骤见表1。

表1、动物免疫步骤

2、细胞融合及克隆化

将步骤1第三次免疫后的小鼠尾部采血测定抗体效价，选择血清效价最高的小鼠，取脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞融合；采用有限稀释法筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；采用间接非竞争ELISA的方法筛选出稳定分泌抗β-伴大豆球蛋白单克隆抗体效价最高（效价为1:7.4×10⁵）的杂交瘤细胞株，命名为2C4，于2013年1月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCCNo.7109。

上述杂交瘤细胞株的抗体效价测定方法如下：

1）包被抗原：用包被缓冲液将包被抗原β-伴大豆球蛋白稀释至2μg/ml；加入到酶标板中，每孔100μl，4℃包被16小时；弃液体；

2）封闭：每孔加封闭液200μl，37℃湿盒孵育1h；弃液体，加洗涤液洗3次，每次90s，拍干。

3）加待测样品：将融合7天后的杂交瘤细胞培养液倍比稀释后，加入酶标板中，每孔100μl；同时设阴性对照（不含杂交瘤细胞的培养液）2孔，37℃孵育0.5h；弃液体，加洗涤液洗3次，每次90s，拍干。

4）加酶标二抗：每孔加入100μL用抗体稀释液稀释5000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗（购自北京中杉金桥生物技术有限公司，产品目录编号为GRBT-044），37℃中孵育0.5h；弃液体，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，拍干。

5）显色：各孔加现配的底物液A、底物液B各100μl，37℃孵育15min。

6）终止：每孔加终止液50μl。

判定结果：用酶标仪测定450nm下的OD值，以空白对照调零，待测孔OD值大于或等于阴性对照孔的2.1倍（即为阳性）时的待测样品的最大稀释倍数即为抗体效价。

3、细胞冻存和复苏

用冻存液（即含10％DMSO的完全培养液）将步骤2的杂交瘤细胞株2C4CGMCC No.7109制成1×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时，取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后移入培养瓶内培养。

二、单克隆抗体的制备和纯化

1、腹水的制备

取健康BALB/c雌性小鼠，每只腹腔注射液体石蜡0.5ml，1～2周后每只腹腔注射1ml浓度为1×10⁶个/ml的杂交瘤细胞株2C4CGMCC No.7109细胞悬液；7～9天后收集腹水，3000rpm离心10min，弃脂肪层和细胞层，收集中间澄清层，分装，-70℃冻存。

2、单克隆抗体的纯化

取步骤1的腹水加等体积巴比妥缓冲盐水稀释，再加适量二氧化硅粉末，室温30min，不时摇动，2000g离心20min，得到澄清的腹水；将所述澄清的腹水再进行辛酸－硫酸铵沉淀法纯化和亲和层析纯化，最后用5mM PBS缓冲液透析，获得抗β-伴大豆球蛋白的单克隆抗体溶液。

三、单克隆抗体的鉴定

1、类及亚型

取杂交瘤细胞株2C4CGMCC No.7109的培养液，2000rpm离心8min后去除细胞及其碎片，使用单克隆抗体类及亚型检测试剂盒（ImmunoPure Monoclonal AntibodyIsotyping KitI，Pierce）按照说明书检测该细胞株2C4分泌的单克隆抗体属IgG1亚类，其轻链为κ亚型。

2、测定单克隆抗体的亲和常数

1）包被：将β-伴大豆球蛋白用包被缓冲液配成如下三种浓度：0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL；分别按100μL/孔的量添加于酶标板中，4℃包被16h；弃液体。

2）封闭：加封闭液200μL/孔，在37℃湿盒中封闭1h；弃液体，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，拍干。

3）加抗体：每孔加入系列稀释的β-伴大豆球蛋白单克隆抗体浓度分别为3.3×10^-12mol/l、26.7×10^-12mol/l、208.7×10^-12mol/l和630×10^-12mol/l的杂交瘤细胞株2C4CGMCC No.7109的培养液（被检样品）100μL，每种抗体浓度设置三个复孔，37℃中孵育1h；弃液体，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，拍干。

4）加酶标二抗：每孔加入100μL用抗体稀释液稀释5000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗（购自北京中杉金桥生物技术有限公司，产品目录编号为GRBT-044）。37℃中孵育0.5h；弃液体，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，拍干。

5）显色：取底物溶液（将底物液A、B按照1：1的比例混合），每孔加入100μL，37℃避光显色20min。

6）终止：每孔加入终止液50μL，用酶标仪测定各孔492nm处的OD值。

以被检样品中的单克隆抗体浓度（mol/L）为横坐标，以其对应的吸光度OD值为纵坐标，绘制3条曲线，以各曲线上部趋于平坦的OD值为100%，计算OD值为50%时单克隆抗体的浓度[Ab]t，这样每份被检样品可得[Ab]t﹑[Ab]′t﹑[Ab]″t三个值，然后根据文献（徐志凯，实用单克隆抗体技术，1992，第27-102页）中的方法，计算杂交瘤细胞株2C4CGMCC No.7109分泌的单克隆抗体的亲和常数为6.2×10¹¹L/mol。

上述步骤3）中被检样品中抗体含量的测定方法如下（夹心ELISA法）：

A）取1ug/ml的羊抗鼠IgG抗体包被酶标板，0.1ml/孔，4℃反应16小时；弃液体。

B）加封闭液200μL/孔，在37℃湿盒中封闭1h；弃液体，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，拍干。

C）按0.1ml/孔的量加入被检样品（即杂交瘤细胞培养液）或系列稀释的小鼠IgG纯品（溶剂0.02M PBS溶液，溶质为小鼠IgG纯品（购自西化仪（北京）科技有限公司，商品目录编号为M349194，单位mol/L），37℃孵育1h；弃液体，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，拍干。

D）每孔加入100μL用抗体稀释液稀释5000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗（购自北京中杉金桥生物技术有限公司，产品目录编号为GRBT-044），37℃中孵育1h；弃液体，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，拍干。

E）显色：取底物溶液（将底物液A、B按照1：1的比例混合），每孔加入100μL，37℃避光显色20min。

F）终止：每孔加入终止液50μL，用酶标仪测定各孔450nm处的OD值。

以小鼠IgG纯品不同浓度（mol/L）的溶液为横坐标，以其相应的OD值为纵坐标，绘制标准曲线，再根据检测各株杂交瘤细胞培养液的OD值，计算其中单克隆抗体的准确浓度。

实施例2、检测β-伴大豆球蛋白的竞争性ELISA方法及其专用试剂盒

一、棋盘法筛选最适的抗原包被浓度和抗体工作浓度

1、包被抗原：取β-伴大豆球蛋白，用包被缓冲液配制成浓度为1000ng/mL的溶液，再进行2倍逐级稀释，获得β-伴大豆球蛋白浓度依次为1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.2ng/mL、15.6ng/mL、7.8ng/mL、3.9ng/mL、1.95ng/mL、0.98ng/mL、0.49ng/mL的12种包被液；将这12种包被液按0.1ml/孔的量由高到底依次加入酶标板1—12列中，每列一种包被液，4℃包被16h；弃液体。

2、封闭：加封闭液200μL/孔，在37℃湿盒中封闭1h；弃液体，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，拍干。

3、竞争抗原的加入：在酶标板的B、D、F、H行中每孔加入50μL浓度为50ng/mL的β-伴大豆球蛋白标准品溶液（SIGMA，产品目录编号为G3171）作为阳性对照；在酶标板的A、C、E、G行中每孔加入50μL浓度为0ng/mL的β-伴大豆球蛋白标准品溶液作为阴性对照；

4、单抗的加入：按0.1ml/孔的量每相邻的两行加入浓度相同的单抗工作液，37℃孵育0.5h；弃液体，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，拍干。

所述单抗工作液的制备方法如下：用抗体稀释液将实施例1步骤三中2获得的抗β-伴大豆球蛋白的单克隆抗体溶液稀释成抗体浓度（测定方法与实施例1步骤二的4中3）的相同）分别为630×10^-12mol/l、208.7×10^-12mol/l、26.7×10^-12mol/l和3.3×10^-12mol/l。

5、酶标二抗的加入：每孔加入100μL用抗体稀释液稀释5000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗（购自北京中杉金桥生物技术有限公司，产品目录编号为GRBT-044），37℃中孵育0.5h；弃液体，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，拍干。

6、显色：取底物溶液（将底物液A、B按照1：1的比例混合），每孔加入100μL，37℃避光显色15min。

7、终止：每孔加入2M的硫酸溶液50μL，用酶标仪测定各孔492nm处的OD值，结果如表2所示。选择阳性对照与阴性对照比值最大的孔所使用的包被浓度和抗体工作浓度作为最适浓度(与其它点比较该值抑制最好)。选择6E/6F对应的包被抗原浓度和抗体工作浓度分别为31.2ng/mL和26.7×10^-12mol/l作为最适浓度。

表2、棋盘法筛选合适的包被抗原浓度和抗体工作浓度的OD值

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	3.491	2.960	2.009	1.479	1.013	1.115
B（+）	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	3.018	2.263	1.710	1.004	0.731	0.726
													C	3.100	3.319	3.258	3.288	3.287	3.490	2.283	1.587	0.963	0.656	0.472	0.637
D（+）	3.180	3.194	3.320	3.268	3.031	2.771	1.954	1.230	0.845	0.534	0.383	0.403
													E	2.165	2.260	2.396	2.143	2.260	1.934	1.288	0.779	0.554	0.363	0.251	0.355
F（+）	2.054	2.163	2.203	2.163	2.011	1.619	1.045	0.690	0.457	0.324	0.210	0.323
													G	1.291	1.347	1.494	1.458	1.325	1.226	0.636	0.447	0.319	0.203	0.144	0.253
H（+）	1.385	1.396	1.510	1.445	1.294	0.967	0.679	0.418	0.313	0.214	0.157	0.269

注：表2中1—12各列间的包被抗原浓度不同，依次为1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.2ng/mL、15.6ng/mL、7.8ng/mL、3.9ng/mL、1.95ng/mL、0.98ng/mL、0.49ng/mL；A和B、C和D、E和F、G和H每两行为一组，每组间的抗体工作浓度不同，依次为630×10^-12mol/l、208.7×10^-12mol/l、26.7×10^-12mol/l和3.3×10^-12mol/l。

二、用实施例1的单克隆抗体检测β-伴大豆球蛋白

（一）检测β-伴大豆球蛋白的标准曲线

1、包被抗原：取步骤一中1配制的含β-伴大豆球蛋白31.2ng/mL的包被液；将该包被液按0.1ml/孔的量加入酶标板中，4℃包被16h；弃液体。

2、封闭：与步骤一中的2相同。

3、竞争抗原的加入：每孔加入50μLβ-伴大豆球蛋白浓度为0（阴性对照）、0.1ng/ml、0.3ng/ml、0.9ng/ml、2.7ng/ml和8.1ng/ml标准品溶液，以加入样品稀释液溶液作为空白对照，每个标准品各做2孔平行。

4、单抗的加入：按0.1ml/孔的量加入步骤一中4制备的26.7×10^-12mol/l的单抗工作液，37℃孵育0.5h；弃液体，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，拍干。

5、酶标二抗的加入：与步骤一中的5相同。

6、显色：取底物溶液（将底物液A、B按照1：1的比例混合），每孔加入100μL，37℃避光反应15min。

7、终止：每孔加入终止液50μL，以空白对照调零，用酶标仪测定各孔450nm处的OD值（即吸光度值）。

8、结果计算

以β-伴大豆球蛋白标准品溶液的浓度（ng/ml）的lg值为横坐标，以相应的百分吸光度值（%）为纵坐标，制作标准曲线，结果如图1所示，线性方程为Y=-0.315X+0.562（R²=0.995）。

百分吸光度值（%）=标准品溶液孔的吸光度值（B）/阴性对照孔的吸光度值（B₀）×100%。

图1中，蛋白浓度为0（阴性对照）、0.1ng/ml、0.3ng/ml、0.9ng/ml、2.7ng/ml和8.1ng/ml的β-伴大豆球蛋白标准品溶液所对应的OD值分别为：2.186、1.878、1.646、1.256、0.930和0.590，百分吸光度值分别为100%、85.93%、75.29%、57.45%、42.55%和27%。竞争性ELISA的IC50为1.6ng/ml，最低检测限可达0.1ng/ml，检测线性范围为0.1—8.1ng/ml。

（二）样品添加回收实验

1、待测样品的制备

将豆粕、发酵豆粕和膨化大豆三种样品分别粉碎成粒径为60目以上的颗粒，分别添加β-伴大豆球蛋白纯品，每种样品添加量分别为0（即添加β-伴大豆球蛋白纯品前）、20mg/g、50mg/g、80mg/g，获得混合样品，按照每0.1g混合样品中添加10ml1×样品提取液(将30×样品提取液用水稀释30倍)的比例混合，25℃振荡提取1小时，静置10—20分钟，取上清液用样品稀释液稀释10⁶倍（取上清液每次稀释100倍逐级稀释3次），获得待测样品。

所述30×样品提取液：溶剂为水，溶质及其浓度分别为Tris181.7mg/L、HCl73ml/L、β-巯基乙醇21ml/L。

所述样品稀释液：溶剂为所述PBS缓冲液，溶质为巯基乙醇和明胶，所述巯基乙醇在所述样品稀释液中的浓度为0.2M，所述明胶在所述样品稀释液中的浓度为0.01M。

2、β-伴大豆球蛋白含量的测定

1）、包被抗原：与（一）中的步骤1相同。

2）、封闭：与（一）中的步骤2相同。

3）、待测样品的加入：每孔加入50μL步骤1获得的待测样品，以加入样品稀释液溶液作为空白对照，每个待测样品各做2孔平行。

4）、单抗的加入：按0.1ml/孔的量加入步骤一中4制备的26.7×10^-12mol/l的单抗工作液，37℃孵育0.5h；弃液体，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，拍干。

5）、酶标二抗的加入：与（一）中的步骤5相同。

6）、显色：与（一）中的步骤6相同。

7）、终止：与（一）中的步骤7相同。

8）、结果

根据公式：百分吸光度值（%）=待测样品溶液孔的吸光度值（B）/阴性对照孔的吸光度值（B₀）×100%，获得各待测样品添加β-伴大豆球蛋白纯品前后的百分吸光度值，代入（一）中的线性方程Y=-0.315X+0.562（R²=0.995），得到各待测样品添加β-伴大豆球蛋白纯品前后β-伴大豆球蛋白的浓度（ng/ml），再根据稀释倍数计算得到样品添加β-伴大豆球蛋白纯品前后β-伴大豆球蛋白的含量（mg/g）,计算回收率，回收率=添加后样品中β-伴大豆球蛋白的含量/（添加前样品中β-伴大豆球蛋白的含量+添加β-伴大豆球蛋白的量）×100%，结果如表3所示。结果表明，三种样品的回收率在85.19—105.65%，说明本发明提供的单克隆抗体及试剂盒检测β-伴大豆球蛋白具有良好的准确性。

表3、β-伴大豆球蛋白的回收率测定

Claims

1.杂交瘤细胞株2C4，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.7109。

2.抗β-伴大豆球蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体是由权利要求1所述的杂交瘤细胞株2C4分泌产生的。

3.权利要求2所述的单克隆抗体在检测或辅助检测β-伴大豆球蛋白中的应用。

4.权利要求1所述的杂交瘤细胞株2C4或权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测或辅助检测β-伴大豆球蛋白的试剂或试剂盒中的应用。

5.一种检测或辅助检测β-伴大豆球蛋白的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有独立包装的权利要求2所述的抗β-伴大豆球蛋白的单克隆抗体。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有独立包装的如下1)—9)试剂中的至少一种：

1)包被缓冲液：溶剂为水，溶质为Na₂HPO₄和NaH₂PO₄，所述溶质Na₂HPO₄和NaH₂PO₄在所述包被缓冲液中的浓度分别为2.3g/L和0.45g/L，pH值为7.4；

2)封闭液：溶剂为水，溶质为牛血清白蛋白(BSA)、小牛血清、吐温-20和蔗糖，所述溶质BSA、小牛血清、吐温-20和蔗糖在所述封闭液中的浓度分别为10g/L、100ml/L、0.5ml/L和100g/L；

3)PBS缓冲液：溶剂为水，溶质为NaCl、KCl、KH₂PO₄和Na₂HPO₄，所述溶质NaCl、KCl、KH₂PO₄和Na₂HPO₄在所述PBS缓冲液中的浓度为8g/L、0.2g/L、0.2g/L和0.46g/L，pH值为7.4；

4)洗涤液：溶剂为所述PBS缓冲液，溶质为吐温-20，所述溶质吐温-20在所述洗涤液中的浓度为50ml/L；

5)抗体稀释液：溶剂为所述PBS缓冲液，溶质为吐温-20和明胶，所述溶质吐温20和明胶在所述抗体稀释液中的浓度分别为10ml/L和0.01M；

6)终止液：2M的硫酸水溶液；

7)底物液A和底物液B；

8)30×样品提取液：溶剂为水，溶质为Tris、HCl和β-巯基乙醇，所述Tris、HCl和β-巯基乙醇在所述30×样品提取液中的浓度分别为Tris181.7mg/L、73ml/L、21ml/L ；

9)样品稀释液：溶剂为所述PBS缓冲液，溶质为巯基乙醇和明胶，所述巯基乙醇在所述样品稀释液中的浓度为0.2M，所述明胶在所述样品稀释液中的浓度为0.01M。

7.一种检测或辅助检测β-伴大豆球蛋白的方法，包括使用权利要求5或6所述试剂盒对待测样品进行检测的步骤。

8.权利要求5或6所述试剂盒在定性或定量检测β-伴大豆球蛋白中的应用。

9.将权利要求2所述抗β-伴大豆球蛋白的单克隆抗体和固相载体相偶联得到的免疫亲和吸附剂、或以所述免疫亲和吸附剂为填料的免疫亲和色谱柱、或含有所述免疫亲和吸附剂或所述免疫亲和色谱柱的试剂盒。

10.权利要求9所述的免疫亲和吸附剂、免疫亲和色谱柱、所述试剂盒在分离纯化β-伴大豆球蛋白中的应用。