CN104422771B - 检测蜱传脑炎病毒的单克隆抗体及其试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测蜱传脑炎病毒的单克隆抗体及其试剂盒。本发明所提供的检测蜱传脑炎病毒的单克隆抗体2B5由保藏号为CGMCC？No.8059的杂交瘤细胞株2B5产生,单克隆抗体2A10由保藏号为CGMCC？No.8060的杂交瘤细胞株2A10产生。实验证明，以单克隆抗体2B5为捕获抗体，以生物素标记的单克隆抗体2A10为检测抗体建立的双抗夹心酶联免疫方法，检测蜱传脑炎病毒的最低检测限为4×103PFU/mL，且单克隆抗体2B5与乙型脑炎病毒、登革病毒4型、黄热病毒无交叉反应，具有特异、灵敏、准确的优点，可广泛用于实验室研究中蜱传脑炎病毒的检测。

Description

检测蜱传脑炎病毒的单克隆抗体及其试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测蜱传脑炎病毒的单克隆抗体及其试剂盒。
背景技术
蜱传脑炎病毒(Tick-borneencephalitisvirus，TBEV)，也称俄罗斯春夏脑炎病毒(RussianSpring-Summerencephalitisvirus),国内称之为森林脑炎病毒。该病毒属黄病毒科黄病毒属，为单股正链RNA病毒。该病毒致病力强，病死率高，可通过气溶胶传播，并可大量培养，低温下能长期保存，目前尚无特效治疗药物，被列为经典的生物战剂。我国的东北、西北、西南都是蜱传脑炎流行的高危地区，而又以东北的黑龙江省最为严重。由于蜱传脑炎临床症状的非特异性,该病的确诊必须依赖于实验室检测手段，目前针对蜱传脑炎的检测方法主要包括血清学方法检测病毒特异性IgM和IgG抗体以及RT-PCR方法检测病毒核酸。
蜱传脑炎病毒特异的IgM在病后一周内出现，两周左右达到高峰，然后迅速下降，适用于蜱传脑炎病毒的早期诊断，但是，由于人接种蜱传脑炎疫苗或自然感染蜱传脑炎病毒产生的IgM存在的时间可长达10个月，对IgM阳性样本还需进行蜱传脑炎特异的IgG检测，以确认病原。黄病毒属的登革病毒、黄热病毒和日本脑炎病毒特异的IgG与蜱传脑炎病毒有交叉反应，检测IgG抗体的方法假阳性较高。
因此，筛选出针对蜱传脑炎病毒特异的IgG单克隆抗体、建立一种特异性好的蜱传脑炎病毒检测方法显得尤为重要。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测蜱传脑炎病毒的单克隆抗体及其应用。
本发明所提供的检测蜱传脑炎病毒的单克隆抗体2B5，由保藏号为CGMCCNo.8059的杂交瘤细胞株2B5产生。
保藏号为CGMCCNo.8059的杂交瘤细胞株2B5是本发明需要保护的内容。
本发明所提供的单克隆抗体2B5和杂交瘤细胞株2B5在制备检测或辅助检测蜱传脑炎病毒的试剂或试剂盒中，能够得到广泛应用。
本发明的另一个目的是提供一种检测或辅助检测蜱传脑炎病毒的酶联免疫试剂盒。
本发明所提供的试剂盒中，含有独立包装的单克隆抗体2B5。
进一步的，该试剂盒中还含有独立包装的单克隆抗体2A10或生物素标记的单克隆抗体2A10；所述单克隆抗体2A10是由保藏号为CGMCCNo.8060的杂交瘤细胞株2A10产生的。
更进一步的，试剂盒中还含有如下1）—5）溶液中的至少一种：
1）包被缓冲液：0.05mol/L、pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液；
2）封闭液：溶剂为PBS溶液，溶质及其浓度为：胎牛血清，10%的体积百分含量；
3）抗体稀释液：溶剂为PBS溶液，溶质及其浓度为：胎牛血清，5%的体积百分含量；
4）洗涤液：溶剂为PBS溶液，溶质及其浓度为：吐温，0.05%的体积百分含量；
5）终止液：2mol/L的硫酸溶液。
所述PBS溶液：溶剂为水，溶质及其浓度分别为：Na2HPO412H2O,2.86g/L,NaH2PO42H2O,0.312g/L,NaCl,8.5g/L；pH值为7.2。
实验证明，以单克隆抗体2B5为捕获抗体，以生物素标记的单克隆抗体2A10为检测抗体建立的双抗夹心酶联免疫方法，检测蜱传脑炎病毒的最低检测限为4×103PFU/mL，且单克隆抗体2B5与乙型脑炎病毒、登革病毒4型、黄热病毒无交叉反应，具有特异、灵敏、准确的优点，可广泛用于实验室研究中蜱传脑炎病毒的检测。
附图说明
图1为间接免疫荧光法鉴定单克隆抗体2B5特异性的结果。其中，左图为阴性对照，右图为单克隆抗体2B5。
图2为间接免疫荧光法鉴定单克隆抗体2A10特异性的结果。其中，左图为阴性对照，右图为单克隆抗体2A10。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用病毒的毒株及其相关信息如下：
蜱传脑炎病毒（Tick-borneencephalitisvirus）：毒株为Senzhang（病毒属黄病毒科黄病毒属；ZhangY,SiBY,LiuBH,ChangGH,YangYH,HuoQB,ZhengYC,ZhuQY.Completegenomiccharacterizationoftwotick-borneencephalitisvirusesisolatedfromChina.VirusRes.2012Aug;167(2):310-3）。
乙型脑炎病毒（Japaneseencephalitisvirus）：毒株为Beijing-1，（病毒属黄病毒科黄病毒属；HashimotoH,NomotoA,WatanabeK,MoriT,TakezawaT,AizawaC,TakegamiT,HiramatsuK.MolecularcloningandcompletenucleotidesequenceofthegenomeofJapaneseencephalitisvirusBeijing-1strain.VirusGenes.1988Jun;1(3):305-17）。
登革病毒4型（DenguevirustypeDenguevirustype1）：毒株为D4-B5株（病毒属黄病毒科黄病毒属；王鹏程,秦鄂德,于曼,耿丽卿,赵卫,胡志君,苑锡同,杨佩英.我国登革4型病毒B5株基因组全序列的测定及分析.中国生物化学与分子生物学报,2001,17(2):148-154）。
黄热病毒（Yellowfevervirus）：毒株为疫苗株17D（病毒属黄病毒科黄病毒属；彭文明，邓永强，于曼，范宝昌，祝庆余，秦鄂德等黄热病毒的一步RT-PCR法检测，微生物杂志2003，23（4）：8-10）。
上述病毒毒株公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。
下述实施例中所用的试剂信息如下：
PBS溶液：溶剂为水，溶质及其浓度分别为Na2HPO412H2O,2.86g/L,NaH2PO42H2O,0.312g/L,NaCl,8.5g/L；pH值为7.2。
包被缓冲液：为0.05mol/L、pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液；
封闭液：溶剂为PBS溶液，溶质及其浓度为胎牛血清（FBS）10%（体积百分含量）；
抗体稀释液：溶剂为PBS溶液，溶质及其浓度为FBS5%（体积百分含量）；
洗涤液：溶剂为PBS溶液，溶质及其浓度为吐温0.05%（体积百分含量）；
底物显色液：TMB单组分显色液，购自Solarbio公司，产品目录编号为Cat.No.PR1200；
终止液：2mol/L硫酸溶液；
辣根过氧化酶标记的亲和素：购自索莱宝公司；
FITC标记羊抗小鼠IgG：购自北京博奥森生物技术有限公司，
FBS：购自北京朗坤生物科技有限公司；
DMEM培养液：用去离子水将培养基干粉（Gbico公司生产，Cat.No.12100-046）溶解（13.5克干粉定容至1升），使用前用7.5%NaHCO3溶液调pH值至7.0。
下述实施例所用的病毒抗原片的制备方法如下：
1）待25cm2方瓶的BHK21细胞（幼仓鼠肾传代细胞）生长至80%左右时，用病毒毒株1ml感染细胞，1小时后，吸出吸附液，补加细胞维持液（含2%FBS的DMEM培养液），放入37℃培养箱中培养；
2）当25%—50%的细胞刚出现细胞病变时，按照细胞传代的方法消化细胞，用适量体积的细胞培养液（含10%FBS的DMEM培养液）悬浮细胞，每个抗原孔加入40ul细胞悬液，放入培养箱中继续培养8小时；
3）取一容器内盛PBS溶液，将上一步中培养8小时的抗原片缓缓放入，浸泡1min，取出抗原片后放在工作台内晾干；
4）将抗原片放入盛有丙酮的溶液中，-20℃过夜；
5）取出晾干即获得抗原片，保存于低温（-40℃以下）冰箱中备用。
实施例1、检测蜱传脑炎病毒的单克隆抗体的筛选和制备
一、免疫原的制备和纯化-
取蜱传脑炎病毒毒株Senzhang接种BHK-21细胞，置于37℃、5%CO2孵箱中培养，待75%以上细胞出现病变时，将培养液于4℃、10000rpm离心30min，取上清；用β-丙内酯（购自Seebio公司，货号168-21011）灭活病毒，获得免疫原，置于-70℃冰箱中备用。
二、动物免疫
1、将步骤一获得的免疫原检测总蛋白含量，并用抗体稀释液将其蛋白浓度调整为0.5mg/mL。
2、基础免疫：将步骤1获得的0.5mg/mL的免疫原溶液用等体积弗氏完全佐剂乳化后，采用背部皮下多点注射12周的雌性Balb/C健康小鼠（购自军事医学科学院实验动物中心），注射剂量为每只小鼠注射0.4mL免疫原。
3、加强免疫：3周后，将步骤1获得的0.5mg/mL的免疫原用等体积弗氏不完全佐剂乳化后，采用腹腔及背部皮下多点注射Balb/C小鼠，注射剂量为每只小鼠注射0.4mL免疫原。
三、细胞融合和克隆化
从第2次加强免疫开始，每次免疫后第3天，从小鼠眼眶采血，测定抗体效价，选择血清效价最佳的小鼠，取脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞融合；采用有限稀释法筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；采用间接非竞争ELISA的方法筛选出稳定分泌抗步骤一获得的免疫原的单克隆抗体效价最高（效价为1:20480）的单克隆杂交瘤细胞株，命名为2B5，该杂交瘤细胞株已于2013年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCCNo.8059。
上述间接非竞争ELISA测定抗体效价的方法如下：
1）包被抗原：用包被缓冲液将包被抗原（步骤一获得的免疫原）稀释至500μg/ml；加入到酶标板中，每孔200μl，4℃包被12h；弃液体,加洗涤液洗3次，每次90s，拍干；
2）封闭：每孔加封闭液200μl，37℃湿盒孵育2h；弃液体，加洗涤液洗3次，每次90s，拍干。
3）加待测样品：将杂交瘤细胞培养液倍比稀释后，加入酶标板中，每孔100μl；同时设空白对照（即加入抗体稀释液）、阴性对照（不含杂交瘤细胞的培养液）各2孔，37℃孵育0.5h；弃液体，加洗涤液洗3次，每次90s，拍干。
4）加酶标二抗：每孔加入100μL用抗体稀释液溶液稀释50倍的辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG（购自北京中杉金桥生物技术有限公司，产品目录编号为ZB-2305），37℃中孵育2h；弃液体，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，拍干。
5）显色：各孔加TMB单组分显色液100μl，室温避光孵育10min。
6）终止：每孔加终止液50μl。
判定结果：用酶标仪测定450nm下的OD值，以空白对照调零，待测孔OD值大于或等于阴性对照孔的3倍时（即为阳性）的待测样品的最大稀释倍数即为抗体效价。
四、细胞冻存和复苏
用冻存液（即含10％DMSO的完全培养液）将杂交瘤细胞株2B5CGMCCNo.8059制成1×106—2×106个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时，取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后移入培养瓶内培养。
五、单克隆抗体的制备和纯化
取12周龄的健康Balb/C雌性小鼠，每只腹腔注射液体石蜡0.5ml，10天后每只腹腔注射1ml浓度为1×106—2×106个/ml的杂交瘤细胞株2B5CGMCCNo.8059细胞悬液；10～12天后收集腹水，3000rpm离心20min，弃去上层油脂，吸取淡黄色腹水，经饱和硫酸铵分级沉淀纯化后用PBS重悬，获得单克隆抗体2B5，置于-70℃冰箱备用。
六、间接免疫荧光法鉴定单克隆抗体的特异性
将步骤五制备的单克隆抗体2B5用抗体稀释液稀释100倍后分别滴加到蜱传脑炎病毒抗原片、乙型脑炎病毒抗原片、登革病毒4型抗原片、黄热病毒抗原片上，每孔10μL，以抗体稀释液作为阴性对照，置于37℃孵育60min；PBS漂洗3次，晾干后向抗原片滴加用0.02%伊文思蓝稀释20倍的FITC标记羊抗小鼠IgG，每孔10μL，置于37℃孵育40min；PBS漂洗3次，晾干后于荧光显微镜下观察结果，若出现特异性绿色荧光则说明步骤五制备的单克隆抗体2B5可以特异结合相应的抗原片上的病毒抗原（即具有特异性），若孔内无特异性绿色荧光则说明不具有特异性。
结果：只有单克隆抗体2B5滴加到蜱传脑炎病毒抗原片上时出现特异性绿色荧光（图1所示），单克隆抗体2B5滴加到其它病毒的抗原片上均无绿色荧光，阴性对照也无绿色荧光（图1所示），说明单克隆抗体2B5可以特异结合蜱传脑炎病毒抗原。
实施例2、检测黄病毒属病毒的单克隆抗体的筛选和制备
一、免疫原的制备和纯化
与实施例1中的步骤一相同。
二、动物免疫
与实施例1中的步骤二相同。
三、细胞融合和克隆化
从第2次加强免疫开始，每次免疫后第3天，从小鼠眼眶采血，测定抗体效价，选择血清效价最佳的小鼠，取脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞融合；采用有限稀释法筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；采用间接非竞争ELISA的方法筛选出稳定分泌抗步骤一获得的免疫原的单克隆抗体效价最高（效价为1:10240）的单克隆杂交瘤细胞株，命名为2A10，该杂交瘤细胞株已于2013年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCCNo.8060。
上述间接非竞争ELISA测定抗体效价的方法与实施例1中的步骤三中的相同。
四、细胞冻存和复苏
用冻存液（即含10％DMSO的完全培养液）将杂交瘤细胞株2A10CGMCCNo.8060制成1×106—2×106个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时，取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后移入培养瓶内培养。
五、单克隆抗体的制备和纯化
取12周龄的健康Balb/C雌性小鼠，每只腹腔注射液体石蜡0.5ml，10天后每只腹腔注射1ml浓度为1×106—2×106个/ml的杂交瘤细胞株2A10CGMCCNo.8060细胞悬液；10～12天后收集腹水，3000rpm离心20min，弃去上层油脂，吸取淡黄色腹水，经饱和硫酸铵分级沉淀纯化后用PBS重悬，获得单克隆抗体2A10，置于-70℃冰箱备用。
六、间接免疫荧光法鉴定单克隆抗体的特异性
将步骤五制备的单克隆抗体2A10用抗体稀释液稀释100倍后分别滴加到蜱传脑炎病毒抗原片、乙型脑炎病毒抗原片、登革病毒4型抗原片、黄热病毒抗原片上，每孔10μL，以抗体稀释液作为阴性对照，置于37℃孵育60min；PBS漂洗3次，晾干后向抗原片滴加用0.02%伊文思蓝稀释20倍的FITC标记羊抗小鼠IgG，每孔10μL，置于37℃孵育40min；PBS漂洗3次，晾干后于荧光显微镜下观察结果，若出现特异性绿色荧光则说明步骤五制备的单克隆抗体2A10可以特异结合相应的抗原片上的病毒抗原（即具有特异性），若孔内无特异性绿色荧光则说明不具有特异性。
结果：单克隆抗体2A10滴加到蜱传脑炎病毒抗原片、乙型脑炎病毒抗原片、登革病毒4型抗原片和黄热病毒抗原片上时均出现特异性绿色荧光（图2所示，图中只显示了蜱传脑炎病毒的结果），阴性对照无绿色荧光（图2所示），说明单克隆抗体2A10可以结合蜱传脑炎病毒抗原、乙型脑炎病毒抗原、登革病毒4型抗原和黄热病毒抗原。
实施例3、双抗夹心法检测蜱传脑炎病毒的方法及其专用试剂盒
一、试剂盒的组成
本申请的双抗夹心法检测蜱传脑炎病毒的试剂盒包括：单克隆抗体2B5（简称捕获抗体）、生物素标记的单克隆抗体2A10（简称检测抗体）、辣根过氧化酶标记的亲和素，包被缓冲液、洗涤液、封闭液、TMB单组分显色液和终止缓冲液。
所述生物素标记的单克隆抗体2A10的制备方法如下：
使用试剂盒“EZ-LinkSulfo-NHS-LC-BiotinylationKit”（Thermo公司，货号为21435）按照使用说明标记单克隆抗体2A10，获得生物素标记的单克隆抗体2A10。
二、双抗夹心法检测蜱传脑炎病毒的灵敏度
1）包被：将单克隆抗体2B5用包被缓冲液稀释至3μg/mL；分别按100μL/孔的量添加于96孔板中，4℃包被过夜；弃液体，用洗涤液洗涤拍干。
2）封闭：加封闭液300μL/孔，在37℃孵育2h；弃液体，用洗涤液洗涤拍干。
3）加待测抗原：每孔加入用抗体稀释液梯度稀释4、8、16、32、64、128、256、512倍的经56℃水浴30min灭活的蜱传脑炎病毒液（未经稀释前蜱传脑炎病毒液的浓度为1×106PFU/mL），每种浓度设置三个复孔，37℃中孵育2h；弃液体，用洗涤液洗涤拍干；
同时设相同病毒浓度的乙型脑炎病毒、登革病毒4型和黄热病毒液为阴性对照，以不含病毒的抗体稀释液为空白对照。
4）加检测抗体：每孔加入100μL检测抗体（浓度为0.05mg/mL），37℃中孵育2h；弃液体，用洗涤液洗涤拍干。
5）加酶标记的亲和素：每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的亲和素，每孔100μL，37℃孵育2h；用洗涤液洗涤拍干。
6）显色：取TMB单组分显色液，每孔加入100μL，室温避光显色10-15min。
7）终止：每孔加入终止液50μL，以PBS调零，用酶标仪测定各孔450nm处的OD值。
结果如表1所示。
表1、双抗夹心法检测蜱传脑炎病毒及其他同属病毒的结果
稀释倍数 蜱传脑炎病毒 乙型脑炎病毒 登革病毒4型 黄热病毒 空白
4 3.881 0.149 0.191 0.155 0.137
8 3.718 0.133 0.157 0.158
16 2.866 - - - -
32 1.885 - - - -
64 1.054 - - - -
128 0.591 - - - -
256 0.283 - - - -
512 0.241 - - - -
定义OD值高于空白对照3倍以上为阳性。根据表1的结果，本发明所提供的双抗夹心法检测蜱传脑炎病毒的最高稀释度为1:128-1:256（即最低检测浓度为4×103-8×103PFU/mL），且检测黄病毒属的乙型脑炎病毒、登革病毒4型及黄热病毒的结果与空白对照接近。

Claims (2)

1.一种检测或辅助检测蜱传脑炎病毒的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有独立包装的由保藏号为CGMCCNo.8059的杂交瘤细胞株2B5产生的单克隆抗体2B5；所述试剂盒中还含有独立包装的单克隆抗体2A10或生物素标记的单克隆抗体2A10；所述单克隆抗体2A10是由保藏号为CGMCCNo.8060的杂交瘤细胞株2A10产生的；
所述试剂盒中还含有如下1）—5）溶液：
1）包被缓冲液：0.05mol/L、pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液；
2）封闭液：溶剂为PBS溶液，溶质及其浓度为：胎牛血清，10%的体积百分含量；
3）抗体稀释液：溶剂为PBS溶液，溶质及其浓度为：胎牛血清，5%的体积百分含量；
4）洗涤液：溶剂为PBS溶液，溶质及其浓度为：吐温，0.05%的体积百分含量；
5）终止液：2mol/L的硫酸溶液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述PBS溶液：溶剂为水，溶质及其浓度分别为：Na2HPO412H2O,2.86g/L,NaH2PO42H2O,0.312g/L,NaCl,8.5g/L；pH值为7.2。
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