CN102702350A

CN102702350A - 抗病毒性出血性败血症病毒g蛋白的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN102702350A
Application number: CN2012101542747A
Authority: CN
Inventors: 景宏丽; 江育林; 张旻
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2012-05-17
Filing date: 2012-05-17
Publication date: 2012-10-03

Abstract

本发明公开了一种抗病毒性出血性败血症病毒G蛋白的单克隆抗体及其应用。该抗病毒性出血性败血症病毒G蛋白的单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC No.5797的小鼠杂交瘤细胞株分泌产生的。该抗病毒性出血性败血症病毒G蛋白的单克隆抗体可用于检测病毒性出血性败血症病毒。本发明还公开了一种检测病毒性出血性败血症病毒的ELISA试剂盒。

Description

抗病毒性出血性败血症病毒G蛋白的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于免疫学领域，具体涉及一种抗病毒性出血性败血症病毒G蛋白的单克隆抗体，杂交瘤细胞株及建立一种检测病毒性出血性败血症病毒的夹心ELISA方法。

背景技术

病毒性出血性败血症是感染虹鳟鱼类的一种严重的致死性传染性疾病。感染该病鱼类的死亡率可达90-100%。它的病原是病毒性出血性败血症病毒（VHSV）。除了在传统的宿主—虹鳟鱼发现VHSV引起疾病的严重暴发外，养殖大菱鲆、养殖或野生牙鲆、白鲑和大西洋鳕鱼等也会发现VHSV。VHSV不仅宿主范围大，而且在不同宿主的致病性具有显著差异，因而使得控制VHS较为困难。目前，在国际动物卫生组织(OIE)和我国进境动物一、二类传染病名录中均被列为必报疫病(世界动物卫生组织, 2000)。

该病毒属于弹状病毒科Novirhabdovirus属。病毒的基因组为一段单链负链RNA，其线性基因组编码5个蛋白，包括：核衣壳蛋白（N蛋白），两个结构蛋白（M1和M2蛋白），糖蛋白（G蛋白）和RNA聚合酶（L蛋白）。VHSV粒子长约180nm，宽约70nm。其基因组长度为12k 个碱基（Schotze H et al, virus genes,1999；倪穗等，海洋与湖沼，2009）。

近年来，我国一些地方，特别是北方地区，为了加快发展，大规模发展了冷水鱼类（如：虹鳟）养殖，且取得了巨大的经济效益。过去VHS 主要流行于北美洲和欧洲一些国家(MEIER W et al, Fish Diseases,1980; NISHIZAWA T.et al, Appl. Environ. Microbiol.2006 ; SCHLOTFELDT H.J.et al, Appl.Ichthyol,1988; SKALL H.F, Aquat. Org,2005)。可是随着水生动物及其产品进出口贸易的急剧增加, VHS 已经传入我国, 并在我国局部地区流行(牛鲁祺等, 水产学报，1988)。VHS的有效预报或者诊断是我们必须解决的问题。对其检测或者鉴定的方法有：细胞培养方法、传统血清学方法和分子生物学方法，他们都受限于各自的特点，细胞培养方法和传统血清学方法检测时，费时费力；分子生物学方法存在着假阳性，可信度比较低。单克隆抗体技术的引进，为建立一种简单快速的检测方法提供原料基础。根据VHSV有多种的血清型和基因组具有地域性差异的两个特点，我们依据中国地区养殖环境和养殖鱼类的种类的具体情况，制备出抗VHSV的单克隆抗体，建立一种适合中国地区的简单、快速和准确的诊断技术。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种抗病毒性出血性败血症病毒G蛋白的单克隆抗体。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种检测病毒性出血性败血症病毒的ELISA试剂盒。

本发明所要解决的第三个技术问题是提供了一种体外检测病毒性出血性败血症病毒G蛋白的方法。

本发明所要解决的第四个技术问题是提供了一种抗病毒性出血性败血症病毒G蛋白的单克隆抗体在检测病毒性出血性败血症病毒和制备检测病毒性出血性败血症病毒试剂盒中的应用。

一种病毒含有多种抗原，一种抗原又可能含有多个抗原位点。因此针对一种抗原可以获得不止一种抗体，但是这些抗体对抗原的结合特性可能是不同的。为了找到能与抗原特异性结合的单克隆抗体，需要进行大量反复比较、筛选和鉴定工作。本发明通过大量的工作，获得了能分泌特异性结合病毒性出血性败血症病毒G蛋白的杂交瘤细胞株；并在此的基础上首次建立了检测病毒性出血性败血症病毒的夹心ELISA检测方法，并制备了检测病毒性出血性败血症病毒的ELISA试剂盒，可用于大规模病毒性出血性败血症病毒的检测，具有很广阔的应用前景。

为解决上述技术问题，本发明所提供的技术方案如下：

本发明所提供的抗病毒性出血性败血症病毒G蛋白的单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No.5797的小鼠杂交瘤细胞株分泌产生。该小鼠杂交瘤细胞株已于2012年2月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址是中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号），其保藏编号为CGMCC No.5797，其分类命名为抗病毒性出血性败血症病毒杂交瘤细胞株。

保藏编号为CGMCC No.5797的小鼠杂交瘤细胞株也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种检测病毒性出血性败血症病毒的ELISA试剂盒，该试剂盒包括本发明所述的单克隆抗体。进一步地，该试剂盒中还包括已包被抗病毒性出血性败血症病毒的多克隆抗体的固相载体，酶标抗鼠的抗体。所述酶优选为辣根过氧化酶。采用商业化购买的酶标抗鼠的抗体，是因为一方面，若标记本发明中表述的单克隆抗体或者是多克隆抗体，过程比较复杂。即使成功，都可能影响抗体的效价或者抗体的其他方面，使整个试剂盒研发更加繁琐，耗力，耗时。而应用商业化酶标抗鼠的抗体，则不存在这个问题；另一方面，若标记本发明中的单克隆抗体或者是多克隆抗体，整个试剂盒的成本费用就很高，对于试剂盒推广应用是不可行的。应用商业化酶标抗鼠的抗体(sigma)，每1ml费用是2000元左右，降低了试剂盒的成本。

进一步地，为了便于检测，本发明试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，以及ELISA反应所需的酶联免疫检测试剂。其中，所述阳性对照为病毒性出血性败血症病毒溶液，阴性对照为鱼类细胞悬液或者是正常组织匀浆液。所述酶联免疫检测试剂，均为常规的酶联免疫检测试剂，包括但不限于，酶的底物反应液、洗涤液和反应终止液。

本发明所述的抗病毒性出血性败血症病毒的多克隆抗体的制备过程如下：用梯度离心纯化的病毒性出血性败血症病毒作为抗原，多点注射免疫山羊，分别是每1周免疫一次，共免疫4次；取血清纯化即为抗病毒性出血性败血症病毒的多克隆抗体；在经过饱和硫酸铵纯化法提取IgG，作为检测方法中的第一抗体。

本发明还提供了一种体外检测病毒性出血性败血症病毒的方法，该方法包括以下步骤：

（1）将待测样品加样于包被有第一抗体的固相载体，从而使待测样品中的病毒性出血性败血症病毒与固相载体上的第一抗结合，形成带有“第一抗体-病毒”二元复合物的固相载体；所述的第一抗体是抗病毒性出血性败血症病毒的多克隆抗体。

（2）将第二抗体加样于（1）获得的固相载体，从而形成带有“第一抗-病毒-第二抗体”三元度和无的固相载体；所述的第二抗体是本发明所述的单克隆抗体。

（3）将酶标抗鼠的抗体加样于（2）获得的固相载体，从而形成带有“第一抗体-病毒-第二抗体-酶标抗鼠的抗体”四元复合物。

（4）检测四元复合物中的酶标记物，确定待测样品中病毒性出血性败血症病毒的存在与否或存在的量，从而确定病毒性出血性败血症病毒的存在与否。

本发明具有以下优点和效果

1. 获得抗病毒性出血性败血症病毒G蛋白的单克隆抗体及分泌该单克隆抗体杂交瘤细胞株。该杂交瘤细胞增殖后可制备大量所需的特异抗体；杂交瘤细胞注射小鼠后，产生的腹水单抗ELISA效价为1：1×10⁵；杂交瘤细胞株活性高，液氮中冻存8-10个月后，仍能快速复苏并保持良好活性。在所述的单克隆抗体的制备中，细胞融合率为97.4%，阳性率为98%。

2. VHSV对比其他病毒，其免疫原性比较强，所以简单采用差速离心方法就可以获得抗原。制备抗原简单方便。

3. 在筛选过程中，应用了间接ELISA方法，在这种方法中包埋板子采取两方面的措施，一方面是一次性包埋了大量ELISA板子，保证整个实验的统一性；另一方面，在包埋样品中，除了正常的阴性对照（细胞悬液）、病毒性出血性败血症病毒、空白对照外，也包埋了人工表达的VHSV重组蛋白（N蛋白）。这样目的双重保证了获得制备抗病毒性出血性败血症病毒G蛋白的准确性，G蛋白是病毒的表面抗原，更适合应用于ELISA方法建立。

4．建立的检测病毒性出血性败血症病毒的夹心ELISA方法，能够准确的检测出细胞悬液中的病毒及组织中病毒存在与否。该检测方法，预防和诊断中国地区的VHSV提供了有利的条件。

附图说明

图1. 单克隆抗体的特异性分析：M：蛋白分子量 1、VHSV的SDS-PAGE 2、单抗与病毒反应结果。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1 抗病毒性出血性败血症病毒G蛋白的单克隆抗体的制备

1.抗原的制备

将病毒性出血性败血症病毒悬液先经过8000r/min，离心30min；取上清在经过24000r/min，离心5h，沉淀是由200微升0.01mol/LPBS重悬。经过分光光度计测浓度后，用于免疫小鼠。

2.免疫小鼠

免疫用的小鼠为SPF级5周龄雌性BALB/c小鼠。每只小鼠以上述纯化后的病毒性出血性败血症病毒作为抗原进行腹腔注射基础免疫，人工表达重组蛋白（30微克）与弗氏完全佐剂1：1混合，腹腔注射； 2周后加强免疫，病毒性出血性败血症病毒（30微克）与弗氏不完全佐剂1：1混合，腹腔注射；之后每隔1周加强免疫1次，腹腔注射，人工表达重组蛋白注射120微克/只；第4次免疫后第3天，将小鼠脱颈椎处死，无菌取脾脏用于细胞融合。

3.细胞融合

常规的细胞融合技术：取免疫小鼠的脾脏和SP2/0骨髓瘤细胞进行融合后，加入小鼠的胸腺细胞与融合细胞在HAT培养系中共培养。

所述技术中应用的HAT培养基的配制：将50倍浓缩的HAT（2ml，GIBCO公司）及特级胎牛血清（20ml，杭州四季青生物工程材料有限公司）加入到改良型RPMI1640培养基（80ml，hyclone公司）中混匀。

4.杂交瘤细胞的筛选与克隆

融合细胞培养10天后，收取细胞培养上清，以梯度离心纯化的病毒性出血性败血症病毒和人工表达的病毒性出血性败血症病毒的N蛋白作为抗原进行间接ELISA检测。筛选出的阳性杂交瘤细胞株（与病毒反应，不与VHSV的N蛋白反应）有限稀释法进行克隆。其中阳性的小鼠杂交瘤细胞株已于2012年2月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址是中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.5797。

5. 腹水的诱生

取6～8周龄雌性Balb/C小鼠，腹腔内注射无菌的液体石蜡0.5 ml /只；1周后，腹腔内注射阳性杂交瘤细胞；接种杂交瘤细胞后7～10天，见小鼠腹部明显膨大，抽腹水，离心后收集上清，-80℃冻存备用。

实施例2：抗病毒性出血性败血症病毒G蛋白的单克隆抗体的特性鉴定；

1.单克隆抗体的腹水效价鉴定

方法：采用间接ELISA法对单克隆抗体的腹水效价进行鉴定。

结果：本发明所述的单克隆抗体腹水效价为1：1×10⁵，表明杂交瘤细胞株具有分泌高滴度抗体的能力。

2.单克隆抗体的亚型鉴定

方法：应用用美国的SouthernBiotech的分型试剂盒（SBA Clonotyping System/HRP），依照其说明书对本发明所述单克隆抗体的Ig亚型进行鉴定。

结果：本发明所述单克隆抗体的亚型为IgG3型k链。

3.单克隆抗体的特异性分析

免疫印迹法（western blotting）：

以纯化病毒性出血性败血症病毒为检测组，设正常的EPC细胞裂解物为阴性对照，免疫小鼠血清为阳性对照，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，用电转法将凝胶上的蛋白分别转移到硝酸纤维素膜（NC膜，孔径0.20μm）上，经含质量体积为10% 的脱脂奶粉的0.01MPBS溶液中4℃封闭过夜；PBS-T（含体积百分比为0.05%的Tween-20的PBS溶液中）洗涤后，加入小鼠的腹水（单克隆抗体1：1000稀释于PBS），37℃孵育1h；再次PBS-T（含体积百分比为0.05%的Tween-20的PBS溶液中）洗涤后，以辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠IgG为二抗，37℃孵育1h；洗涤后，用底物混合液DAB显色观察。

结果：见图1，本发明制备的抗病毒性出血性败血症病毒G蛋白的单克隆抗体，能特异的与病毒蛋白带发生反应，反应处蛋白带分子量为70kDa。经过文献证实其为病毒性出血性败血症病毒G蛋白。

实施例3 检测病毒性出血性败血症病毒的ELISA试剂盒的组成

检测病毒性出血性败血症病毒的ELISA试剂盒的组成为：实施例1制备的单克隆抗体；包被抗病毒性出血性败血症病毒的多克隆抗体的固相载体；辣根过氧化酶标记的羊抗鼠抗体（购自sigma公司）；酶的底物反应液；阳性对照；阴性对照；洗涤液；反应终止液。

其中，羊抗VHSV的多克隆抗体的制备和包埋ELISA条板：用梯度离心纯化的病毒性出血性败血症病毒作为抗原，多点注射免疫山羊，分别是每1周免疫一次，共免疫4次；取血清纯化即为抗病毒性出血性败血症病毒的多克隆抗体；采用饱和硫酸铵沉淀方法，沉淀2次，饱和硫酸铵浓度分别为50%和33%，最终的沉淀用PBS溶解，装入透析袋，于4℃下透析72h，期间换液至少4次/天。用包被缓冲液（0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH 值9.6）将纯化羊多克隆抗体稀释至浓度3μg/ml，包被96孔ELISA酶标板（美国Corning公司），100μl/孔，4℃过夜。取出后用PBST洗板3次，每次5min，甩干。用0.01mol/LPBS稀释1%的明胶封闭，每孔150μl，37℃封闭1h。取出后用PBST洗板3次，每次3min，甩干，干燥后-80℃保存。

10×PBST的配制：NaCl：80 g，Na₂HPO₄·12H₂O：29g，KH₂PO₄： 2 g，KCl：2g，吐温-20：5 ml，蒸馏水加至1000 ml，4 ℃保存。

酶的底物反应液：是10%硫酸盐（TMB，sigma，用二甲基甲酰胺配置）：150μl，H₂O₂：4μl，pH 5.0 柠檬酸-磷酸缓冲液：10ml。现用现配。

阳性对照为病毒性出血性败血症病毒溶液，阴性对照为鱼类细胞悬液或者是正常组织匀浆液。

洗涤液为：如前述PBST配制。

反应终止液：用蒸馏水配制2mol/LH₂SO₄。

实施例4：检测病毒性出血性败血症病毒的夹心ELISA检测方法

夹心ELISA方法步骤：

1．向包被有羊抗VHSV的IgG的ELISA酶标板加入分别用两种方法稀释的扩增的病毒（病毒的滴度为10⁶ TCID50），一种方法是应用0.01mol/l的PBS以10倍比进行稀释；另一种方法是应用正常的虹鳟组织进行稀释。

2．将第二抗体，即实施例1制备的抗病毒性出血性败血症病毒G蛋白的单克隆抗体，稀释400倍，加入到酶标板上。

3．将辣根过氧化酶标记的羊抗鼠抗体按商品说明进行稀释，然后加入到酶标板上。

4．洗涤酶标板

5. 加入酶的底物反应液

6. 终止反应

结果如表2所示，建立的夹心ELISA法能够特异的检测出病毒性出血性败血症病毒，且滴度能够达到10⁵ TCID50。

表2检测病毒性出血性败血症病毒的夹心ELISA法的检测结果

P/N	病毒10⁰	10^-1	10^-2	10^-3
					0.01mol/LPBS稀释病毒	4.12	3.01	1.73	1.24
正常虹鳟组织稀释病毒	5.01	3.81	1.73	1.24

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims

1.抗病毒性出血性败血症病毒G蛋白的单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No.5797的杂交瘤细胞株分泌产生。

2.分泌产生抗病毒性出血性败血症病毒G蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.5797。

3.一种检测病毒性出血性败血症病毒的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求1所述的单克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括已包被抗病毒性出血性败血症病毒的多克隆抗体的固相载体，酶标抗鼠的抗体。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述酶为辣根过氧化酶。

6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为病毒性出血性败血症病毒的病毒溶液，阴性对照为鱼类细胞悬液或者是正常鱼类组织匀浆液。

8.一种体外检测病毒性出血性败血症病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将待测样品加样于包被有第一抗体的固相载体，从而使待测样品中的病毒性出血性败血症病毒与固相载体上的第一抗结合，形成带有“第一抗体-病毒”二元复合物的固相载体；所述的第一抗体是抗病毒性出血性败血症病毒的多克隆抗体；

（2）将第二抗体加样于（1）获得的固相载体，从而形成带有“第一抗-病毒-第二抗体”三元复合物的固相载体；所述的第二抗体是权利要求1所述的单克隆抗体；

（3）将酶标抗鼠的抗体加样于（2）获得的固相载体，从而形成带有“第一抗体-病毒-第二抗体-酶标抗鼠的抗体”四元复合物；

9.权利要求1所述的单克隆抗体在检测病毒性出血性败血症病毒中的应用。

10.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测病毒性出血性败血症病毒试剂盒中的应用。