CN103602636B - 抗羊口疮病毒b2l蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗羊口疮病毒（Orf virus，ORFV）B2L蛋白的单克隆抗体及其应用。本发明采用原核表达系统，用大肠杆菌表达的ORFV B2L蛋白作为免疫原，免疫小鼠，经细胞融合，筛选得到一株稳定分泌抗B2L蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号是：CCTCC NO:C2013136。单克隆抗体的特异性试验结果表明，该杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体只与ORFV株发生反应，而与羊的其它相关病原，例如FMDV、POXV、JSRV、羊衣原体等不发生交叉反应。因此，本发明单克隆抗体可用于检测ORFV，并且本发明的提出为建立一种快速、简易、特异的ORFV诊断方法及其免疫机制研究、免疫功能检测等提供了物质基础。

Description

抗羊口疮病毒B2L蛋白的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及单克隆抗体，尤其涉及抗羊口疮病毒B2L蛋白的单克隆抗体以及分泌该抗B2L蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本发明还涉及该单克隆抗体在建立检测有关羊口疮病毒方法中的应用，属于羊口疮病毒的检测领域。

背景技术

羊传染性脓疱俗称羊口疮是由羊口疮病毒（Orf virus，ORFV）所致的一种人兽共患传染病，主要感染羊，有时也会感染其他动物。临床上以嘴唇周围出现丘疹和脓疱继而溃烂形成厚痂为特征。该病发病率、病死率较高。但若继发细菌和真菌感染死亡率会更高上升。羔羊也常因口腔齿龈感染引发厌食症使其死亡率高达93%。该病暴发严重影响农民的收入，尤其是在以饲养羊作为收入来源的贫穷落后地区。同其他副痘病毒一样，ORFV进化而来的免疫逃避机制能帮助病毒在宿主免疫防御条件下生存，形成持续性感染。同时ORFV不同毒株间抗原以及免疫靶标的多样性导致了病毒能反复感染同一宿主。

ORFV属于痘病毒科，副痘病毒属，是一种双链DNA病毒。电镜下观察负染标本，病毒粒子大小为200-350nm×125-175nm，外有脂类囊膜，内有双股DNA核心，病毒粒子呈椭圆形线团样，表面呈特征性的编织螺旋-绳索样结构相互交叉排列，围绕病毒粒子的长轴作“8“字型缠绕，但也呈其他缠绕方式。病毒基因组为一条大约长135kb的双链DNA分子，具有封闭的末端发夹结构。基因组中央区域为中心编码区且高度保守，为病毒复制和形态形成所必需，而基因组两头末端区域与病毒毒力和致病性有关。序列分析表明不同ORFV毒株间的同源性较高，表明ORFV相对保守。但是在基因组末端区域存在的许多毒力基因和编码与宿主作用以及免疫调节的基因，同一物种的不同毒株也有较高的变异率。ORFV至少编码有130个基因，这些基因在基因组中的位置基本确定，有些基因的功能研究比较清楚，有些还不太清楚。编码病毒主要毒力因子的基因有OVIFNR，vIL-10，dUTPases和GIF等。ORFV结构基因有10kD蛋白基因，它对病毒结构的形成具有重要作用。而B2L基因编码主要的免疫囊膜蛋白。不同分离株同源性能达到97%～98%，同假牛痘病毒(pseudocoxpx)牛丘疹水疱病毒的(BPSV)同源性能达到82%～83%，该基因的保守性常用于病毒PCR方法的鉴定。

ORFV感染常可通过典型的临床症状和流行情况作出初步诊断。但是羊口疮常与其他疾病如口蹄疫、羊痘，蓝舌病以及细菌性疾病如葡萄球菌性皮炎和嗜皮菌病临床症状相似而相混淆。在此种情况下，实验室诊断非常必要。因此确诊需要通过电镜负染、血清学方法、病理组织病理学，PCR检测和限制性片段长度多态性分析(RFLP)以及动物接种等方法进行进一步的实验室检验。研究证实了这些方法的可行性。然而，这些检测方法在应用时或多或少会受到一些限制，难以及早检测病原，也不利于大规模的流行病学调查；目前国内外没有用于血清学检测的免疫检测的商品化试剂盒；分子生物学方法特异性高、结果确实，但对实验条件及操作人员的要求较高，因此多用于实验室研究，很难进入临床应用阶段。酶联免疫测定技术将酶促反应的高效率和免疫反应的特异性有机结合起来，具有灵敏度高、特异性强、对仪器设备要求不高、成本低、操作简便快捷、无放射性污染、自动化程度高、试剂保存时间长等优点，适用于大批量现地检测工作，将可能成为极具推广价值的诊断方法。随着ORFV对养羊业造成的损失逐年增大，以及国际、国内经济贸易的对食品安全要求的呼声越来越高，广泛地开展ORFV监测已不可避免，现在还没有适合全世界通用的羊口疮检测标准，也没有区别疫苗毒和野毒的标准。因此发展符合中国养羊业的监测方法，不仅符合中国养羊业的要求，而且具有巨大的市场潜力，研制检测羊口疮的ELISA诊断试剂盒对该病的羊口疮疫情监测、流行病学调查及完善免疫策略等都具有重要意义。而在此过程中，单克隆抗体是不可缺少的工具。

发明内容

本发明目的之一是提供一种抗羊口疮病毒B2L蛋白的单克隆抗体以及分泌该抗B2L蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

本发明目的之二是将上述抗羊口疮病毒B2L蛋白的单克隆抗体应用于制备成检测或诊断羊口疮病毒的试剂。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明采用大肠杆菌表达的羊口疮病毒B2L蛋白，纯化后作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，取其脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选获得1株稳定分泌抗B2L蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株D1B3，分类命名为：杂交瘤细胞株D1B3；保藏单位是：中国典型培养物保藏中心，保藏地址是：武汉市武昌珞珈山，武汉大学生命科学学院内，其微生物保藏号是：CCTCC NO:C2013136；保藏时间是：2013年9月11日。

由上述抗B2L蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体（命名为D1B3），抗体亚型为IgG1。抗体的效价测定检测结果表明，本发明杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体诱导小鼠产生的腹水效价为10⁶，细胞上清的效价达到1280。

Western blot检测结果表明，本发明单克隆抗体能与ORFV抗原特异性结合。IFA结果表明，杂交瘤细胞上清及融合前小鼠血清均能与ORFV感染的GSF发生反应，在荧光显微镜下可见到荧光信号而其他对照组均未见荧光，说明本发明获得的McAb均能与ORFV发生反应。单克隆抗体的特异性试验结果表明，本发明单克隆抗体具有良好的特异性，仅与ORFV发生反应，而与FMDV、POXV、JSRV、羊衣原体不发生反应。因此，本发明单克隆抗体可用于检测ORFV，本发明的提出为建立一种快速、简易、准确的诊断方法，以及在免疫机制研究、免疫功能检测、检测方法的建立等方面提供了物质基础。

附图说明

图1为D1B3株单克隆抗体亚类鉴定结果；

图2为应用Western blot分析单克隆抗体（D1B3）与ORFV感染GSF细胞后裂解物的反应性；

M：预染蛋白质分子量;1，3：ORFV感染GSFs细胞裂解物；2，4：正常GSFs细胞裂解物；A:D1B3腹水；B:B2L蛋白免疫小鼠阳性血清；

图3为应用间接免疫荧光试验检测单克隆抗体D1B3株与ORFV临床分离株和正常细胞的反应性结果；

A：ORFV感染GSFs细胞；B：正常GSFs细胞；1：间接免疫光图，2:亚细胞定位重叠图。

具体实施方式

下面结合具体实施实例进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

毒种、细胞、实验动物和生化试剂

（1）重组pET30a-B2L、SP2/0细胞均由本发明人实验室保存；

（2）ORFV毒株由本发明人研究室分离并保存；

（3）8周龄实验用雌性BALB/c小鼠购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心；

（4）标准胎牛血清、改良型培养基RPMI-1640购于Gibco公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、选择性培养基HAT和HT、细胞融合用PEG（MW4000）、单克隆抗体亚型鉴定试剂盒、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG（HRP-IgG）购于Sigma公司。

实施例1单克隆抗体的制备

1、重组蛋白的纯化与检测

本实验室之前已摸索B2L蛋白为包涵体表达，将诱导后的表达B2L蛋白的基因工程菌在37℃200rpm振荡培养5h后收获菌液，5000g离心10min，加10mL的PBS。重悬菌液，将样品置于冰浴中超声波裂解（30%功率）裂解3s、间隔15s、超声40min。然后10000g离心20min，弃上清液，保留细胞沉淀。利用QIAGEN公司的镍柱HIS纯化系统对重组蛋白进行纯化，操作过程如下：

（1）将细胞沉淀用buffer B重悬，室温下小心震荡60min使其裂解至透明清亮，避免泡沫。

（2）10000g离心30min，弃掉沉淀，将上清转另一离心管中。

（3）将1ml50%NI-NTA树脂悬浮加到4ml细胞裂解液中，轻柔混匀，室温结合60min。

（4）将裂解液与NI-NTA树脂悬浮的混合物小心加入下端封闭的空柱后，除去柱下端封闭盖子，收集流出液，保存用于SDS-PAGE分析。

（5）用4ml buffer C漂洗杂蛋白2次，保存漂洗组分用于SDS-PAGE分析。

（6）以0.5ml buffer D洗脱目的蛋白4次，再以0.5ml buffer E洗4次，收集组分，用于SDS-PAGE分析。

结果表明，纯化后的B2L蛋白具有较高的纯度、蛋白得率比较高且具有良好的反应活性。

2、小鼠免疫

以纯化的B2L蛋白作为免疫原，对6周龄雌性BALB/c小鼠进行3次免疫。免疫方案如下：首免，每只小鼠用50μg B2L蛋白与等量FCA混合制成乳化剂，颈背部皮下多点和腹腔注射；二免于首免后2周进行，将FCA换成FICA，剂量和方法同上；三免于二免后2周进行，剂量和方法同二免。细胞融合前1周进行加强免疫，方法是腹腔注射100μg纯化的B2L蛋白。

3、细胞融合

一般在免疫小鼠加强免疫后3～5天做细胞融合结果比较好。细胞融合步骤大致如下：按照常规方法取BALB/c阴性小鼠腹腔巨噬细胞铺于96孔细胞培养板中待用。断颈处死阳性小鼠，无菌取其脾细胞，按脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞5:1的比例用PEG4000进行融合，融合后的细胞铺于准备好的饲养细胞之上（Kohler G,Milstein C:Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.Nature1975,256(5517):495-497.）。

4、阳性杂交瘤细胞株的筛选及亚克隆

取纯化的B2L蛋白以1μg/孔包被聚苯乙烯板，37℃，3h；PBST（0.01mol/L,pH7.3,PBS+0.05%Tween-20）洗涤3次，5min/次；加PBST/BSA（0.01mol/L,pH7.3,PBST+2%BSA），200μL/孔，37℃封闭2h或4℃过夜；PBST洗3次，5min/次，拍干，-20℃存放备用。通过方阵滴定试验确定抗原的最佳稀释倍数，即将ORFV B2L蛋白包被96孔板，进行方阵滴定试验，获得抗原的使用浓度及原核表达蛋白B2L免疫鼠阳性血清的稀释倍数。同时设置阴性小鼠血清做为阴性对照。根据反应结果选择抗原的最佳包被浓度。按常规间接ELISA法检测杂交瘤细胞培养上清。将酶标板置于ELISA酶标仪上读数，以S/P＞2.1作为阳性判定标准。挑选出抗B2L蛋白的杂交瘤细胞克隆孔。

按上述筛选方法，将筛选得到的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，亚克隆采用有限稀释法，将原始孔细胞用HT培养基稀释后重新分96孔细胞板，一个原始孔细胞分一块板子。亚克隆完成后注意观察每个孔的细胞个数及状态。取亚克隆后分泌抗体稳定并且尽可能是单个克隆的孔进行第二次亚克隆。经过三次亚克隆后原先是单克隆的亚克隆板子检测结果的阳性率应达到100%。获得了1株能够稳定分泌特异性针对B2L蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞D1B3，保藏在中国典型培养物保藏中心，其微生物保藏号是：CCTCC NO:C2013136。将其所分泌的单克隆抗体命名为D1B3。

5、单克隆抗体的大量制备

给10周龄左右的健康BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡，0.5mL/只，1w后腹腔注射10⁵个杂交瘤细胞，7-10d后当小鼠腹部极度膨胀时抽取腹水，隔2d抽一次，将抽取的腹水1000g离心10min，去除上层油脂和沉淀，上清分装于-20℃或-70℃保存。

试验例1单克隆抗体的鉴定

1、抗体的效价测定

纯化的B2L蛋白用包被液稀释后，2.5μg/孔加入ELISA反应板中，4℃放置过夜。次日倾去孔内液体，洗涤3次，每次3min。每孔加200μL封闭液，37℃放置1h，洗涤3次，每次3min。将含有单克隆抗体的腹水在另一块板上用PBS进行10倍系列稀释，100μL/孔加到已封闭的ELISA板上，每个样品平行做两个重复，PBS做阴性对照，ORFV阳性血清作为阳性对照。于37℃温箱中温育1h，洗涤3次，每次3min。然后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠（1:5000）的抗体，100μL/孔，于37℃温箱中温育1h，洗涤5次，每次3min。加新鲜配制的底物溶液100μL/孔，室温暗处放置15min，再加入50μL/孔终止液，测定OD450，以S/P＞2.1为阳性判定标准，阳性反应的最大稀释度为阳性细胞株培养上清以及腹水进行抗体效价检测。

检测结果见表1和表2，诱导小鼠产生的腹水效价为106，细胞上清的效价达到1280。

表1D1B3株单抗腹水效价的测定

2、单克隆抗体亚类鉴定

亚类鉴定采用Sigma公司的免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒进行鉴定，具体步骤按试剂盒的说明书操作。主要步骤如下:

将待测细胞培养上清加入已包被抗原的酶标板中，100μL/孔，室温下作用2h，洗板3次。

同型特异试剂IgM、IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3，分别用0.01mol/L PBS1000倍稀释后，按100μL/孔加样，室温下作用30min，洗板3次。

辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG(含甘油)，用0.01mol/L PBS2500倍稀释后，按100μL/孔加样，室温下作用15min，洗板3次。

加入新配底物，100μL/孔，室温下作用10-15min。

用3mol/L的NaOH终止反应，50μL/孔，观察结果。

亚型鉴定结果见图1，本发明单克隆抗体D1B3抗体亚型为IgG1。

3、单克隆抗体（McAbs）免疫活性鉴定

Western blot用于分析单克隆抗体的免疫活性，Western blot程序如下：将ORFV细胞裂解产物和预染蛋白Marker进行SDS-PAGE电泳（胶浓度为12%），电泳产物转印至PVDF膜，剪下每个泳道的蛋白条带及预染蛋白Marker条带（保存备用），然后将含有全病毒裂解产物的PVDF膜条带放入去离子水中清洗10min，5%脱脂乳室温封闭1h，封闭后的NC膜条带分别与1:100倍稀释的单克隆抗体诱生小鼠产生的腹水以及正常SP2/0细胞的培养上清液37℃作用1h，PBST（0.01mol/L，pH7.2；含0.05%的Tween-20）洗涤3次,然后与HRP-羊抗鼠IgG（1:4000）37℃作用1h，PBST洗3次，用3,3′-二氨基联苯胺(DAB)底物溶液进行显色。

Western blot检测结果表明，本发明单克隆抗体能与ORFV抗原特异性结合(图2)。

4、间接免疫荧光（IFA）试验及亚细胞定位

将ORFV毒株感染的GSF细胞及正常GSF培养2天后，倒掉上清液，经PBS轻洗3次，用4%多聚甲醛固定15min，PBS洗涤3次，0.1%Triton X-100透化15min后用PBS洗三次，接着1%BSA封闭1h，PBS洗三次后，滴加杂交瘤细胞上清，同时以SP2/0细胞上清和免疫前小鼠血清、REV阳性血清和融合前小鼠血清分别作为阴、阳性对照，37℃作用1h；PBS洗涤3次，二抗为FITC标记的羊抗鼠IgG（1：32）于37℃作用1h；经PBS洗涤3次后，用5ug/ml DAPI染色10min，PBS洗涤三次，荧光显微镜下观察。

IFA结果表明，D1B3杂交瘤细胞上清能与ORFV感染的GSFs发生反应，在荧光显微镜下可见到荧光信号而正常GSFs未见荧光，说明获得的McAb能与ORFV发生反应，并且亚细胞定位还可见病毒粒子定位在细胞胞浆内，结果见图3。

5、单克隆抗体的特异性试验

采用羊口蹄疫病毒（FMDV）、羊痘病毒（POXV）、绵羊肺腺瘤病毒（JSRV）、羊衣原体、羊支原体ELISA抗体检测试剂盒对杂交瘤细胞上清进行检测，检验其特异性。结果表明，本发明单克隆抗体仅与ORFV抗体检测试剂盒发生反应，而与FMDV，POXV，JSRV抗体检测试剂盒不发生反应，试验结果见表3。

表3A9E8株单克隆抗体的特异性鉴定

Claims (4)

1.一株分泌抗羊口疮病毒（Orf Viruse，ORFV）B2L蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于所述的杂交瘤细胞株保藏在中国典型培养物保藏中心，其微生物保藏号是：CCTCC NO:C2013136。

2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备诊断或检测羊口疮病毒感染试剂中的用途。

4.权利要求2所述的单克隆抗体在制备诊断或检测羊口疮病毒感染试剂中的用途。