CN105018431A - 分泌cav-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株7d7、由该细胞株分泌的单克隆抗体及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株分泌CAV-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株7D7、由该细胞株分泌的单克隆抗体及应用。所述杂交瘤细胞株7D7保藏编号为CGMCC？No.10877。间接免疫荧光结果表明：7D7杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体能特异性识别CAV-2病毒而与MDCK细胞不反应。本发明制备的7D7与2C1分泌的单克隆抗体的叠加实验结果表明：这两个单克隆抗体为针对CAV-2病毒不同抗原表位的。本发明所制备的单克隆抗体能很好的和CAV-2反应，可用于临床分离毒株的鉴定。本发明所制备的7D7单克隆抗体和另一株2C1单克隆抗体是识别CAV-2的两个不同抗原决定簇的单抗，因此说明本发明的单克隆抗体能用于检测CAV-2病原免疫胶体金试纸条的制备和双抗体夹心ELISA方法的建立。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一株分泌CAV-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株及由该细胞株分泌的识别不同抗原表位的单克隆抗体及其应用。
背景技术
目前，犬腺病毒已知血清型是1型和2型。1962年，Dltehfleld从患呼吸道疾病的小狗中分离出犬喉气管炎病毒(即CAV-2)，该毒株与1954年Cabass分离的犬传染性肝炎病毒(CAV-1)在血清学上既相关，但又有明显的差别。
Ditchfleld等经研究已证明CAV-1和CAV-2在毒力、可溶性、抗原结构及红细胞凝集范围方面的区别。但后来1型腺病毒也可引起单纯的呼吸道疾病，所以CAV-2可以认为是CAV-1的变异株，经CAV-2免疫的犬能有效地产生针对CAV-1强毒的免疫力。到目前为止，国外已陆续分离获得多株犬的1型、2型腺病毒，并且在犬和红狐里的携带和发病率较高。国内关于CAV-2病毒的分离报道相对较少，而CAV-2通常被认为是由CAV-1遗传衍化而来，因此，研究犬2型腺病毒对于犬的多种疾病的预防与控制具有重要意义。通常分离到的犬2型腺病毒毒力较弱，相关研究主要集中在其作为载体的应用，而其致病性的研究相对较少。然而正如禽流感、马传贫、马立克氏等病毒不断遗传一样，犬腺病毒也在不断变异。犬腺病毒从最初的1型进化到与其差异较大的2型，以呼吸系统感染损伤为主的犬2型腺病毒又进化到可以感染肠道就是明显证据。所以，犬腺病毒2型必须得被持续的监控下去，这对于更好地研究其致病规律及疾病预防控制具要意义。
单克隆抗体技术自问世的30多年来发展迅猛，目前已被成功地应用于分子生物学、免疫学等许多领域的研究。在兽医学研究领域， 单克隆抗体在疾病的检测和治疗中发挥了重要作用。免疫胶体金试纸条具有快速、准确、特异和灵敏的优点，只需少量检测样品，就能在很短的时间里对样品是否感染做出准确判断，有利于养殖户的早隔离、早治疗，符合基层养殖单位对于疾病快速诊断的要求。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株分泌CAV-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株7D7。
一株分泌CAV-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株7D7，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.10877，保藏日期为2015年5月27日。
本发明的目的之二是提供一株上述杂交瘤细胞株7D7分泌的抗CAV-2病毒单克隆抗体。
本发明的目的之三是提供上述杂交瘤细胞株7D7分泌的抗CAV-2病毒单克隆抗体在制备检测CAV-2病原试剂中的应用，具体表现在以下两个方面：
1、与杂交瘤细胞株2C1分泌的抗CAV-2病毒单克隆抗体用于检测CAV-2病原的免疫胶体金试纸条的制备；
2、与杂交瘤细胞株2C1分泌的抗CAV-2病毒单克隆抗体用于检测CAV-2病原夹心ELISA方法的建立。
杂交瘤细胞株2C1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.10878，保藏日期为2015年5月27日。
本发明将实验室保存的CAV-2病毒接种于MDCK细胞上进行增殖，当80％的细胞出现病变时收获病毒，反复冻融三次，超声30min，12000r/min离心10min，去除细胞碎片及较大的杂质。取上清，4℃，超速28000r/min 5h，取沉淀，用PBS重悬，12000r/min离心10min，取其上清过非连续蔗糖密度梯度(60％-40％-30％)，28000r/min离 心2.5h，取其白色部分，加入大量PBS脱糖，28000r/min离心2.5h，取其沉淀，用1.5ml PBS重悬，最终获得CAV-2纯化的病毒。
ELISA方法检测结果表明：纯化的CAV-2病毒能与CAV-2阳性抗体发生特异性反应，表明其具有良好的抗原性。
取适量纯化的病毒与弗氏佐剂1∶1混合乳化，免疫6周龄BALB/C小鼠，按常规方法取免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，用纯化的病毒作为检测抗原，建立间接EL1SA方法对有融合孔的细胞上清液进行检测筛选阳性细胞克隆株，最终得到2株单一的分泌特异性抗体的杂交瘤细胞克隆，分别命名为7D7，2C1。
间接免疫荧光结果表明：7D7杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体能特异性识别CAV-2病毒而与MDCK细胞不反应。
本发明制备的7D7与2C1分泌的单克隆抗体的叠加实验结果表明：这两个单克隆抗体为针对CAV-2病毒不同抗原表位的单抗。
本发明的主要优点如下：
1、本发明所制备的单克隆抗体能很好的和CAV-2反应，可用于临床分离毒株的鉴定。
2、本发明所制备的7D7单克隆抗体和另一株2C1单克隆抗体是识别CAV-2的两个不同抗原决定簇的单抗，因此说明本发明的单克隆抗体能用于检测CAV-2病原免疫胶体金试纸条的制备和双抗体夹心ELISA方法的建立。
保藏信息
一、分泌CAV-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株7D7
分类命名：分泌抗CAV-2单克隆抗体杂交瘤细胞株；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物研究所；
保藏编号：CGMCC No.10877；
保藏日期：2015年5月27日。
二、分泌CAV-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C1
分类命名：分泌抗CAV-2单克隆抗体杂交瘤细胞株；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物研究所；
保藏编号：CGMCC No.10878；
保藏日期：2015年5月27日。
附图说明
图1为CAV-2特异性目的片段，1：分子量标准DL 1000；2：阴性对照；3，4，5：不同浓度CAV-2目的片段PCR产物；
图2为CAV-2目的片段PCR产物测序结果分析；
图3为纯化后CAV-2病毒蛋白活性的鉴定；
图4为CAV-2各单抗间接免疫荧光的鉴定，a：2C1单抗没接毒对照，b：7D7单抗没接毒对照，c：sp2/0上清，d：2C1单抗；e：7D7单抗；f：阳性血清对照。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
本发明提供了一种识别不同抗原表位抗CAV-2单克隆抗体的制备方法，具体内容如下：
1材料和方法
1.1材料、实验动物与试剂
实验用BALB/c小鼠由中国农科院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供；弗氏佐剂、选择试剂HAT、HT、融合剂PEG购于Sigma公司；标准胎牛血清、培养基RPM11640购于Gibco公司；抗生素购自大连宝生物工程有限公司。CAV-2由哈尔滨兽医研究所疫病诊断中心保存。
1.2CAV-2的培养和基因组DNA的提取
将病毒接种在MDCK细胞上，用含10％牛血清的DMEM培养液培养，待90％细胞发生病变后收获病毒，将病毒培养物按病毒DNA 提取试剂盒说明书上的方法制备基因组DNA模板。
1.3PCR鉴定
利用DNSTAR生物学软件设计针对CAV-2的引物，上游引物为：5′-CGCGCTGAACATTACTACCTTGTC-3′，下游引物为：5′-CCTAGAGCACTTCGTGTCCGCTT-3′。以病毒DNA为模板，用高保真Taq酶(Pyrobest DNA聚合酶，MB1公司)进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，同时将PCR产物送出测序。
1.4CAV-2的纯化
将鉴定为CAV-2的病毒接种于MDCK细胞上进行增殖，当80％的细胞出现病变时收获病毒，反复冻融三次，超声30min，12000r/min离心10min，去除细胞碎片及较大的杂质。取上清，4℃，超速28000r/min离心2.5h，取沉淀，用PBS重悬，12000r/min离心10min，取其上清过非连续蔗糖密度梯度(60％-40％-30％)，28000r/min离心2.5h，取其白色部分，加入大量PBS脱糖，28000r/min离心2.5h，取其沉淀，用1.5ml PBS重悬。
1.5纯化病毒的活性分析
取纯化后的CAV-2以2μg/孔的浓度包被96孔板，以适当稀释的CAV-2病毒感染鼠的阳性血清作为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠1gG为二抗，用TMB底物显色。
1.5单克隆抗体的制备
取适量纯化的病毒与弗氏完全佐剂1∶1混合乳化，接种6～8周龄BALB/C小鼠，此后每间隔二周用等量抗原与弗氏不完全佐剂乳化进行二、三次免疫。三免3天后，取免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞以4∶1～10∶1的比例在PEG1500的作用下进行细胞融合，融合后用HAT选择培养基进行培养，每三天以半换液法更换一次培养液，前6天用HAT培养液，然后用HT培养液以半换液法逐渐代替HAT培养液，待克隆细胞长用满孔底的1/10时，用纯化的病毒作为检测抗原，对有融合孔的细胞上清液进行间接EL1SA检测筛选阳性细胞克隆株。将筛选的阳性细胞克隆株用有限稀释法进行单克隆，用间接EL1SA 法检测，直至阳性率达100％，得到单一的分泌特异性抗体的杂交瘤细胞克隆时，分别扩大培养，并冻存于液氮中。
1.6间接免疫荧光试验
用克隆的CAV-2感染MDCK细胞，当病变达到80％时用4％的多聚甲醛固定细胞15min，然后分别用已知的CAV-2阳性鼠血清、阴性鼠血清和CAV-2株单克隆抗体以及SP2/0细胞培养上清作为一抗，相应地以F1TC标记的羊抗鼠1gG作为二抗，按常规方法进行间接免疫荧光检测。同时设未感染病毒的正常MDCK细胞对照组。
1.7单克隆抗体的亚型鉴定
按照单克隆抗体亚型鉴定试剂盒操作说明对以上得到的单克隆抗体分别进行亚型鉴定。
1.8单克隆抗体的叠加实验
用纯化的病毒作为包被抗原，应用间接EL1SA方法，分别将一株单抗作用1h后，将另一株单抗再作用1h，然后加入辣根标记的羊抗鼠1gG二抗，用TMB显色，同时设孵育单一单抗的对照组，如OD值有明显增加的两个单抗为针对不同抗原表位的单抗。
1.9腹水的制备及效价的测定
按常规的方法进行单抗腹水的制备。用前面建立的间接ELISA方法进行单抗上清和腹水效价的测定。
2结果
2.1CAV-2的鉴定结果
以不同浓度CAV-2毒株基因组DNA为模板，采用CAV-2特异引物进行PCR扩增，结果扩增出1.00kb的条带，与预期目的片段相符，如图1所示。
将PCR产物所测序列上GeneBank上进行BLAST序列比对，结果分析如图2所示，结果显示所得目的片段为CAV-2基因组里的E3蛋白基因序列，说明所鉴定的病毒为CAV-2。
2.2CAV-2活性鉴定
纯化后的CAV-2蛋白包被96孔板，以鼠阳性血清和鼠阴性血清 作为一抗，以HRP标记的羊抗鼠1gG为二抗进行的EL1SA，结果阳性血清孔显蓝色，说明纯化后的蛋白具有抗原反应性，如图3所示。
2.3杂交瘤细胞株的获得
经细胞融合和间接EL1SA方法初步筛选，结果初筛到15株阳性克隆；又进行3次单克隆，直至所有克隆孔的阳性率达100％，最后获得2株稳定分泌的能和CAV-2蛋白发生阳性反应的细胞株，分别命名为2C1、7D7，将其分别冻存。
2.4单克隆抗体的特异鉴定试验
将实验中制备的2株单克隆抗体分别用CAV-2感染的MDCK细胞进行间接免疫荧光检测，结果显示所获得的2株单克隆抗体对CAV-2感染的细胞都具有特异性的荧光，呈现显著阳性，而与未接毒的MDCK细胞无特异性荧光为阴性，CAV-2阳性血清和阴性血清的对照成立，如图4所示。表明所制备的单抗具有良好的特异性，可用于实验室检测CAV-2病原的诊断试剂。
2.5单克隆抗体亚型的鉴定
按照单克隆抗体亚型鉴定试剂盒操作说明对得到的2株单克隆抗体进行了亚型鉴定，结果所有单克隆抗体均为IgG1型，并且所有单克隆抗体的轻链均为k链。
2.6单克隆抗体针对不同抗原表位的鉴定
在单抗叠加实验中，2C1和7D7单抗叠加后的OD值有明显的增加，2C1识别的是一个抗原表位A，7D7识别的是另外一个抗原表位B。如表1所示。所以，本实验获得了两株分泌识别两个不同抗原表位单抗的杂交瘤细胞株。2C1和7D7两株单克隆抗体是识别病毒的两个不同的抗原决定簇的单抗，可用于检测CAV-2病原的免疫胶体金试纸条的制备和检测CAV-2病原双抗体夹心ELISA方法的建立。
表1不同单抗之间的叠加实验
--：表示叠加后OD值没有明显的变化；++表示叠加后OD值有明显的升高
2.7腹水的制备及效价的测定
采用间接ELISA方法测定杂交瘤细胞2C1和7D7腹水的效价分别为1∶104200和1∶204800，明显高于对应细胞上清的效价1∶640.说明所制备的腹水效价高，可用于检测CAV-2病原免疫胶体金试纸条的研制。
Claims (6)
1.一株分泌CAV-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株7D7，保藏编号为CGMCC No.10877，保藏日期为2015年5月27日。
2.权利要求1所述杂交瘤细胞株7D7分泌的识别不同抗原表位CAV-2单克隆抗体。
3.权利要求2所述的杂交瘤细胞株7D7分泌的识别不同抗原表位CAV-2单克隆抗体在检测CAV-2病原诊断试剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的识别不同抗原表位CAV-2单克隆抗体在检测CAV-2病原诊断试剂中的应用，其特征在于所述杂交瘤细胞株7D7分泌的识别不同抗原表位CAV-2单克隆抗体与杂交瘤细胞株2C1分泌的抗CAV-2病毒单克隆抗体用于检测CAV-2病原的免疫胶体金试纸条的制备。
5.根据权利要求3所述的识别不同抗原表位CAV-2单克隆抗体在检测CAV-2病原诊断试剂中的应用，其特征在于所述杂交瘤细胞株7D7分泌的识别不同抗原表位CAV-2单克隆抗体与杂交瘤细胞株2C1分泌的抗CAV-2病毒单克隆抗体用于检测CAV-2病原夹心ELISA方法的建立。
6.根据权利要求4或5所述的识别不同抗原表位CAV-2单克隆抗体在检测CAV-2病原诊断试剂中的应用，其特征在于所述杂交瘤细胞株2C1保藏编号为CGMCC No.10878，保藏日期为2015年5月27日。
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