CN105198986B - 抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体，包含该单克隆抗体的金标试纸条及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体，包含该单克隆抗体的金标试纸条及应用。本发明的抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体由保藏编号为CGMCC NO.11089的杂交瘤细胞株或保藏编号为CGMCC NO.11090杂交瘤细胞株分泌产生。该单克隆抗体对p27蛋白的效价高，特异性好，因此可用于制备检测禽白血病病毒的试剂盒和金标试纸条。本发明提供的单克隆抗体的制备方法简单，抗体纯化过程简单，效率高，成本低。采用本发明提供的抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体制成的金标试纸条来检测禽白血病病毒，特异性强，操作简单，方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简便，易于推广，更适合于即时检测。

Description

抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体，包含该单克隆抗体的金 标试纸条及应用

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体，特别涉及一种抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体，包含该单克隆抗体的金标试纸条及应用，属于生物技术领域。

背景技术

禽白血病是由禽白血病病毒(ALV)引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称。ALV属于反转录病毒科，禽C型反转录病毒属。根据病毒感染的宿主范围、干扰谱和囊膜抗原，可将ALV进一步区分为A至G七个亚群。J亚群禽白血病病毒(ALV-J)最早于1988年在英国分离得到。1999年中国首次报道ALV-J的出现，继而中国大部分地区相继出现了ALV感染的现象。ALV大范围的爆发给我国养禽业带来了很大的经济损失。

禽白血病目前没有有效的防治措施。预防本病的主要方法是淘汰阳性鸡，选育出无白血病鸡群以净化种群。因此，该病的准确诊断尤为重要。本发明利用原核表达的重组衣壳蛋白(p27蛋白)免疫小鼠，通过杂交瘤技术最终获得2株抗p27蛋白的单克隆抗体，命名为4A2和3H11。并且利用两株单抗研制了检测禽白血病病毒的金标试纸条。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体。

本发明的一种抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆单体由保藏编号为CGMCC NO.11089的杂交瘤细胞株或保藏编号为CGMCC NO.11090杂交瘤细胞株分泌产生。

免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒测定两株单抗的的抗体亚型全部是IgG1。单抗特异性鉴定结果表明，IBV，MDV，AIV H5，AIV H7，AIV H9，ILTV，FPV，IBDV，NDV，ARV和REV与两株单抗反应的OD值均小于0.15，且ALV-J，ALV-A，ALV-B与两株单抗反应的OD值均大于1.2，表明两株单抗具有良好的特异性。

本发明利用两株单抗研制了检测禽白血病病毒的金标试纸条。用试纸条检测ALV-J，ALV-A，ALV-B，IBV，MDV，AIV H5，AIV H7，AIV H9，ILTV，FPV，IBDV，NDV，ARV和REV等14种常见的禽类病毒。结果试纸条只与ALV-A，ALV-B和ALV-J抗原反应，说明试纸条具有良好的特异性。用试纸条检测细胞培养的ALV病毒及体外表达的不同浓度p27蛋白(150ng/ml,75ng/ml,37.5ng/ml,18.75ng/ml,9.375ng/ml)纯化的p27蛋白，结果试纸条的灵敏度为18.75ng/ml。用试纸条检测不同浓度J亚群病毒(4000，2000，1000，500，250，125，62.5TCID50/ml)，结果试纸条的灵敏度为250TCID50/ml。

在此基础上，本发明提供了所述的单克隆抗体在制备检测禽白血病病毒的金标试纸条中的应用。及

所述的单克隆抗体在制备检测禽白血病病毒的试剂盒中的应用。

含有所述的单克隆抗体的检测禽白血病病毒的金标试纸条也是本发明保护的范围。及

含有所述的单克隆抗体的检测禽白血病病毒的试剂盒也是本发明保护的范围。

本发明的目的之二是提供产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明以HB09JY03毒株提取的DNA为基础，通过PCR方法，扩增出p27基因并克隆至pMD-18T载体。测序鉴定正确后，通过双酶切将p27基因亚克隆至原核表达载体pET-30a，构建重组质粒pET-30a-p27并转化BL21感受态细菌。通过诱导表达，最终获得重组p27蛋白，并对该蛋白进行纯化。

Western blot分析检测结果表明，纯化的p27蛋白能与兔抗天然p27蛋白阳性血清发生反应，表明具有生物反应活性。

将纯化的p27蛋白作为免疫原，腹腔接种6周龄BALB/c小鼠。按照常规杂交瘤细胞融合技术将免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。用纯化的p27蛋白为筛选抗原，建立间接ELISA方法，最终筛选出2株持续分泌抗禽白血病病毒P27蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中，一株抗禽白血病病毒P27蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为4A2，分类命名为杂交瘤细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号CGMCC NO.11089，保藏日期为：2015年7月20日。

另外一株抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为3H11，分类命名为杂交瘤细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号CGMCC NO.11090，保藏日期为：2015年7月20日。

进一步的，本发明还提供了所述的杂交瘤细胞株在制备检测禽白血病病毒试剂中的应用。

本发明取得的有益效果：

本发明杂交瘤细胞株4A2和3H11能够高效、稳定地分泌抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体。该单克隆抗体对p27蛋白的效价高，特异性好，因此可用于制备检测禽白血病病毒的试剂盒和金标试纸条。本发明提供的抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体的制备方法简单，抗体纯化过程简单，效率高，成本低。采用本发明提供的抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体制成的金标试纸条来检测禽白血病病毒，特异性强，操作简单，方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简便，易于推广，更适合于即时检测。

附图说明

图1为诱导表达p27蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析结果图；其中，A图为诱导表达p27蛋白的SDS-PAGE分析结果图，M：蛋白Marker(ku)；1-3：表达并纯化的重组P27蛋白；B图为诱导表达p27蛋白的Western blot分析结果图，1：纯化的p27蛋白，M：低分子量标准蛋白Marker；

图2为两株单抗间接荧光免疫反应(IFA)分析结果图；

图3为金标试纸条检测p27蛋白敏感性试验结果图；

图4为金标试纸条检测病毒敏感性试验结果图。

具体实施方式

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体的制备及单抗特异性分析

1材料和方法

1.1病毒株、细胞和实验动物

ALV-J(HB09JY03)由哈尔滨兽医研究所分离鉴定。ALV-J(HPRS103，GenBank:Z46390)、ALV-A(RAV-1，GenBank:M19113)和ALV-B(RAV-2，GenBank:M14902)由英国Pirbright研究所Venugopal Nair教授赠送；DF-1、S/P20细胞由本实验室保存；6周龄BALB/c雌鼠购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。

1.2主要试剂

大肠杆菌DH5α和BL21感受态、原核表达载体pET-30a由本实验室保存；pMD-18T载体、IPTG购自宝生物工程(大连)有限公司；PEG-4000、HPR标记的羊抗鼠IgG、羊抗鼠荧光二抗(FITC-IgG)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；HAT、HT购自GibcoBRL；1640培养基、抗体亚类鉴定试剂盒购自赛默飞公司；蛋白纯化用填充材料购自GE healthcare。

1.3引物的设计与合成

根据HB09JY03毒株的序列(潘伟，高玉龙，秦立廷，祁小乐，高宏雷，孙芬芬，王永强，王笑梅.蛋鸡J亚群禽白血病病毒株HB09JY03的分离鉴定及全基因组序列分析.中国兽医科学，2010，40:1110-1114.)，用软件primer premier 5.0设计一对引物P1、P2用于扩增p27基因，是含有BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的一对特异性引物，上游引物P1：5’CGGGATCCATGCCTGTAGTGATTAAGAC 3’，含有BamH Ⅰ酶切位点。下游引物P2：5’ACGTCGACCTAGGGCTGGATAGCAGACG 3’，含有Sal Ⅰ酶切位点。

1.4DNA提取和p27基因的扩增

将毒株HB09JY03接种到对数期生长DF-1细胞的6孔板上，7d后收集细胞培养板。用DNA提取试剂盒从DF-1细胞冻融液中提取DNA(按照操作说明书进行)。以提取的DNA为模板进行PCR，反应条件为94℃ 5min，94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，扩增30个循环，最后72℃延伸7min。扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳分析。

1.5重组表达载体pET-30a-p27的构建及鉴定

利用AXYGEN凝胶回收试剂盒回收PCR产物，连接于pMD-18T载体后转化，提取质粒，用BamHⅠ和SalⅠ双酶切鉴定，鉴定为阳性的重组质粒的命名为pMD-P27并送生物公司测序。利用BamHⅠ和SalⅠ双酶切质粒pMD-p27和pET-30a，分别回收720bp和4900bp片段，T4DNA连接酶连接，连接产物转化BL21感受态细菌，小量提取质粒，BamHⅠ和SalⅠ双酶切鉴定出阳性质粒，命名为pET-30a-p27。

1.6p27基因在原核表达系统中的表达、纯化及活性检测

挑取单个含有pET-30a-p27的BL-21细菌菌落加入Kna⁺(卡那霉素，100μg/ml)的LB中，37℃过夜振摇培养，次日扩大培养至OD600约为0.8，加入IPTG至终浓度0.1mM，于37℃诱导6h，收获细菌。离心后，将菌体用PBS重悬(50μLPBS/mLLB)，于4℃过夜后，超声波温和裂解菌体，离心取上清，12％SDS-PAGE电泳分析。纯化按照文献(汪家政，范明.蛋白质技术手册.北京:科学出版社，2001.)。将纯化的p27蛋白用兔抗天然p27蛋白阳性血清进行Western-blotting分析。

1.7免疫动物

将纯化的p27蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合，乳化后颈背部皮下免疫小鼠(100ug/只)。两周后，将纯化的p27蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合，乳化后对小鼠进行加强免疫。再间隔两周，用二免同样的方法进行第三次免疫。三免后21d，用纯化的p27蛋白(100μg/只)对小鼠进行腹腔注射，3d后，取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。

1.8阳性杂交瘤细胞株的建立

取上述免疫鼠的脾制成细胞悬液与处于对数生长期的S/P20细胞以8:1的比例进行融合。待融合细胞长至孔底1/2或1/3时，通过间接ELISA筛选出阳性杂交瘤细胞株，再利用有限稀释法连续克隆2～3次。至阳性率为100％后进行扩大培养，冻存于液氮中。

1.9p27单克隆抗体的制备

对筛选获得的杂交瘤细胞进行扩大培养后，以5×10⁶/0.5ml杂交瘤细胞腹腔注射BLAB/C小鼠1ml，14d后待小鼠腹围增大后用注射器收集腹水，1000r/min离心10min，上清以0.45μm滤器过滤后即为腹水MAb粗制品。

1.10单抗的效价测定及亚类的测定

将纯化的p27蛋白作1:1000稀释包被酶联反应板，用间接ELISA法测定腹水中MAb效价，以P/N>2.5的最大稀释度作为抗体的效价。用免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒检测五株p27单抗的亚类。操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.11单抗的特异性鉴定

1.11.1单抗与禽类常见病毒的交叉反应

将ALV-J，ALV-A，ALV-B，IBV，MDV，AIV H5，AIV H7，AIV H9，ILTV，FPV，IBDV，NDV，ARV和REV等14种病毒根据蛋白含量的不同，全部稀释至约15μg/mL包被酶联反应板，间接法ELISA检测与单抗反应，DF-1细胞冻融离心后上清作为阴性对照，PBS作为空白对照。OD₄₅₀>0.2判定为阳性。

1.11.2单抗与ALV-J、ALV-A、ALV-B间接荧光免疫反应

将ALV-J(HB09JY03)、ALV-A和ALV-B禽白血病病毒接种于含DF-1细胞的24孔细胞板，不接病毒的DF-1作为阴性对照。5d后将培养液弃掉，用无水乙醇固定15min，将单抗4A2和3H11做1:200稀释，加入细胞板孔内，室温孵育1h。PBST洗4次，抗鼠荧光二抗做1:200稀释加入细胞板孔内，避光室温孵育1h，用PBST洗板4次，加入PBS，荧光显微镜观察结果。

2结果

2.1重组质粒pET-30a-p27的鉴定

重组质粒pET-30a-p27用BamHⅠ和SalⅠ双酶切，消化所得到的片段与预期结果相符。扩增所得到p27基因全长720bp，编码239个氨基酸残基。

2.2p27基因的表达、重组蛋白纯化及蛋白活性检测

重组表达蛋白在非变性条件下纯化获得HIS-p27融合蛋白(图1A)，重组p27蛋白经SDS-PAGE电泳后，转移至硝酸纤维素膜上，用兔抗天然p27蛋白阳性血清进行Western blot分析，结果所表达的蛋白具有生物反应活性(图1B)。

2.3细胞融合率阳性杂交瘤株的建立

通过细胞融合，最终筛选出2株持续分泌抗禽白血病病毒(ALV)p27蛋白的单克隆抗体(MAb)杂交瘤细胞株，其中一株杂交瘤细胞株命名为4A2，分类命名为杂交瘤细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：CGMCC NO.11089；另外一株杂交瘤细胞株命名为3H11，分类命名为杂交瘤细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：CGMCC NO.11090。

2.4单抗效价测定及亚类的测定

用已建立的ELISA方法对2株单抗做效价测定的结果为：4A2 1:2¹¹和3H11 1:2¹¹。免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒测定两株单抗的结果为：4A2和3H11全部是IgG1。

2.5单抗特异性鉴定

IBV，MDV，AIV H5，AIV H7，AIV H9，ILTV，FPV，IBDV，NDV，ARV和REV与两株单抗反应的OD值均小于0.15，且ALV-J，ALV-A，ALV-B与两株单抗反应的OD值均大于1.2。分析荧光显微镜观察单抗4A2和3H11分别与ALV-J(HB09JY03)、ALV-A和ALV-B呈阳性反应，有明显的绿色荧光，且阴性对照无绿色荧光(图2)。

实施例2检测禽白血病病毒的金标试纸条的制备及其性质

1.1胶体金溶液制备

采用柠檬酸钠还原法制备粒径为25nm的胶体金颗粒。在搅拌状态下，100mL0.01％氯金酸水溶液加热至沸腾，迅速加入1.5mL 1％柠檬酸钠水溶液，观察溶液颜色由白色转变为黑色再变成酒红色。当溶液的颜色完全变为酒红色时继续加热5min后停止加热，自然冷却后于2～8℃下避光保存。

1.2金标结合物的制备

金标结合物标记：向10mL胶体金溶液中逐滴加入0.1M K₂CO₃ 0.1mL，搅拌5min，加入鼠抗禽白血病病毒p27抗原的单克隆抗体3H11(实施例1制备)200μL，混匀15min，然后加入终浓度为1％的稳定剂BSA，混匀5min后静置30min。随后对金标结合物溶液采用4℃，12,000rpm离心20min，弃上清。

金标结合物纯化：将上述标记步骤中的金标结合物沉淀中加入含BSA稳定剂的复溶液至10mL，混匀后再次用4℃，12,000rpm离心20min，弃上清，采用金标结合物复溶液重悬。

金标结合物包被：用金标结合物稀释液将纯化后的金标结合物稀释到合适浓度后，采用三维喷点仪将其喷涂至金标结合垫上，湿度<30％的条件下，室温干燥12h以上。

1.3硝酸纤维素反应膜的包被

取1mg/ml的鼠抗禽白血病病毒p27抗原的单克隆抗体4A2(实施例1制备)和0.2mg/ml的羊抗鼠IgG多克隆抗体，分别在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线，湿度<30％的条件下，室温干燥12h。

1.4大板粘贴、切割

启动干燥间干燥设备，待环境湿度小于30％时，取1.3中制备的硝酸纤维素反应膜，首先撕去膜下方的油光纸，将1.2中制备的金标结合物反应垫贴于NC膜的下方，(两者重叠1～2mm)；再将样品垫粘贴到金标垫的下方(两者重叠1～2mm)，且样品垫的下边缘与PVC底板的下边缘对齐；最后撕去NC膜上方的油光纸，在NC膜的上方粘贴吸水垫(两者重叠1～2mm)，且吸水垫的上边缘与PVC底板的上边缘对齐；最后用撕下来的油光纸从左至右轻轻履平粘贴的金标结合垫、样品垫和吸水纸。将上述组装好的大板放在切条机上，卡好位置，确保放正，设置宽度3.94mm/条，启动切条。将切好的试纸条置于试纸卡下盖的凹槽中，盖上上盖，保证加样孔位于样品垫一方，置于压壳机上，压实。

1.5敏感性试验和特异性试验

采用生产的试纸卡，检测细胞培养的ALV病毒及纯化的p27蛋白(稀释成150ng/ml,75ng/ml,37.5ng/ml,18.75ng/ml,9.375ng/ml)，确定本方法的敏感性。

将ALV-J，ALV-A，ALV-B，IBV，MDV，AIV H5，AIV H7，AIV H9，ILTV，FPV，IBDV，NDV，ARV和REV等14种常见的禽类病毒稀释成10μg/mL，评价其特异性。

2结果

2.1金标试纸条特异性试验、敏感性试验

用试纸卡检测ALV-J，ALV-A，ALV-B，IBV，MDV，AIV H5，AIV H7，AIV H9，ILTV，FPV，IBDV，NDV，ARV和REV等14种常见的禽类病毒。结果试纸卡只与ALV-A，ALV-B和ALV-J抗原反应，说明试纸卡具有良好的特异性。

用试纸卡检测细胞培养的ALV病毒及体外表达的不同浓度p27蛋白(150ng/ml,75ng/ml,37.5ng/ml,18.75ng/ml,9.375ng/ml)纯化的p27蛋白，结果试纸卡的灵敏度为18.75ng/ml(图3)。

用试纸卡检测不同浓度J亚群禽白血病病毒(4000，2000，1000，500，250，125，62.5TCID50/ml)，结果试纸卡的灵敏度为250TCID50/ml(图4)。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.一种用于检测禽白血病病毒的金标试纸条，其特征在于，含有抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体4A2以及抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体3H11，其中，抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体4A2用于在硝酸纤维素膜上制备检测线，所述的抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体3H11用于制备金标结合物；所述的抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体4A2由菌种保藏编号为：CGMCC NO.11089的杂交瘤细胞株产生，所述的抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体3H11由菌种保藏编号为：CGMCC NO.11090 的杂交瘤细胞株产生。

2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，按照以下方法制备得到：

(1)胶体金溶液制备

采用柠檬酸钠还原法制备粒径为25nm的胶体金颗粒，在搅拌状态下，100mL0.01％氯金酸水溶液加热至沸腾，迅速加入1.5mL 1％柠檬酸钠水溶液，观察溶液颜色由白色转变为黑色再变成酒红色；当溶液的颜色完全变为酒红色时继续加热5min后停止加热，自然冷却后于2～8℃下避光保存；

(2)金标结合物的制备

金标结合物标记：向10mL胶体金溶液中逐滴加入0.1M K₂CO₃ 0.1mL，搅拌5min，加入鼠抗禽白血病病毒p27抗原的单克隆抗体3H11 200μL，混匀15min，然后加入终浓度为1％的稳定剂BSA，混匀5min后静置30min，随后对金标结合物溶液采用4℃，12,000rpm离心20min，弃上清；

金标结合物纯化：将上述标记步骤中的金标结合物沉淀中加入含BSA稳定剂的复溶液至10mL，混匀后再次用4℃，12,000rpm离心20min，弃上清，采用金标结合物复溶液重悬；

金标结合物包被：用金标结合物稀释液将纯化后的金标结合物稀释到合适浓度后，采用三维喷点仪将其喷涂至金标结合垫上，湿度<30％的条件下，室温干燥12h以上；

(3)硝酸纤维素反应膜的包被

取1mg/ml的鼠抗禽白血病病毒p27抗原的单克隆抗体4A2和0.2mg/ml的羊抗鼠IgG多克隆抗体，分别在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线，湿度<30％的条件下，室温干燥12h；

(4)大板粘贴、切割

启动干燥间干燥设备，待环境湿度小于30％时，取步骤(3)中制备的硝酸纤维素反应膜，首先撕去膜下方的油光纸，将步骤(2)中制备的金标结合物反应垫贴于NC膜的下方，两者重叠1～2mm；再将样品垫粘贴到金标垫的下方，两者重叠1～2mm，且样品垫的下边缘与PVC底板的下边缘对齐；最后撕去NC膜上方的油光纸，在NC膜的上方粘贴吸水垫，两者重叠1～2mm，且吸水垫的上边缘与PVC底板的上边缘对齐；最后用撕下来的油光纸从左至右轻轻履平粘贴的金标结合垫、样品垫和吸水纸；将组装好的大板放在切条机上，卡好位置，确保放正，设置宽度3.94mm/条，启动切条，将切好的试纸条置于试纸卡下盖的凹槽中，盖上上盖，保证加样孔位于样品垫一方，置于压壳机上，压实。