CN113341140A - 一种检测禽白血病p27的间接elisa方法 - Google Patents

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CN113341140A CN202110613946.5A CN202110613946A CN113341140A CN 113341140 A CN113341140 A CN 113341140A CN 202110613946 A CN202110613946 A CN 202110613946A CN 113341140 A CN113341140 A CN 113341140A
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avian leukosis
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陈广
李涛
张喜懿
张小波
刘蔓蔓
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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Abstract

本发明公开了一种检测禽白血病P27的间接ELISA方法，利用禽白血病病毒RSA株p27基因序列设计一对引物以扩增p27基因，构建蛋白表达载体，通过IPTG诱导表达获得重组表达蛋白上清表达，以蛋白上清表达经纯化后作为包被抗原，建立检测禽白血病P27的间接ELISA方法。本发明建立的检测禽白血病P27的间接ELISA方法具有良好的敏感性和特异性，并且方法操作简单快速，成本较低，能够检测到禽白血病群特异性抗原，且与常见的禽类病毒不反应，为禽白血病的诊断、防控奠定了基础。

Description

一种检测禽白血病P27的间接ELISA方法
技术领域
本发明涉及一种检测禽白血病P27的间接ELISA方法，属于禽白血病检测技术领域。
背景技术
禽白血病(Avian leukosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)引起的鸡的肿瘤性疾病之一，自Roloff于1968年报道了欧洲发生的一例鸡“淋巴肉瘤”以来，禽白血病多发于禽类，给养禽业造成巨大的经济损失。p27蛋白是gag基因编码的禽白血病病毒的群特异性抗原，高度保守，是ALV 核心衣壳蛋白的主要成分，有许多易于检测的病毒抗原位点。在外源性ALV(A， B，C，D，J)各亚群间同源性高达90％。p27蛋白含量高，占病毒总蛋白成分的 30％以上，是制备检测抗体的首选抗原。
发明内容
基于上述，本发明提供一种检测禽白血病P27的间接ELISA方法，方法特异性及重复性好，敏感性高，具有良好的可靠性。
本发明的技术方案是：一种检测禽白血病P27的间接ELISA方法，利用禽白血病病毒RSA株p27基因序列设计一对引物以扩增p27基因，构建蛋白表达载体，通过IPTG诱导表达获得重组表达蛋白上清表达，以蛋白上清表达经纯化后作为包被抗原，建立检测禽白血病P27的间接ELISA方法。
可选的，所述禽白血病病毒为病毒RSA株。
可选的，所述一对引物的引物序列如下：
p27-EcoR I-F：CGGAATTCATGCCTGTAGTGATTAAGACAG；
p27-Xba I-R：GCTCTAGACCTAGGGCTGGATAGCAGAC。
可选的，具体步骤如下：
1)用禽白血病病毒RSA株p27基因序列设计一对引物以扩增p27基因，构建重组表达载体经诱导表达获得重组表达蛋白上清表达，上清表达经过纯化后作为包被抗原；
2)将包被抗原放入酶标板内进行包被、封闭，得封闭液；
3)甩掉步骤2)中封闭液，用一抗孵育，然后再用二抗孵育；
4)甩掉步骤3)中酶标二抗孵育液，采用TMB显色液显色，加入显色终止液，终止反应；
5)利用酶标仪测定步骤4)酶标板孔中液体OD450nm值，根据临界值判定阴阳性。
可选的，步骤1)中，所述p27蛋白抗原浓度为0.5μg/mL。
可选的，步骤2)中，包被条件为37℃包被1h，封闭时间为37℃封闭1h。
可选的，步骤3)中，一抗为稀释倍数为1:200的待检测阴阳性血清，孵育条件为37℃作用0.5h；二抗为稀释倍数为1:5000的HRP标记兔抗鸡IgG，孵育条件为37℃作用0.5h。
可选的，显示条件为37℃作用10min。
可选的，所述临界值判定阴阳性的标准为：当OD450nm大于0.481是阳性，小于0.481是阴性。
本发明的有益效果是：本发明建立的检测禽白血病P27的间接ELISA方法具有良好的敏感性和特异性，并且方法操作简单快速，成本较低，能够检测到禽白血病群特异性抗原，且与常见的禽类病毒不反应，为禽白血病的诊断、防控奠定了基础。
附图说明
图1细胞上清PCR扩增(A)、质粒菌液PCR鉴定(B)与双酶切鉴定(C)图谱，A：1，2：细胞沉淀，3：阴性对照；B：1，2，3，4：质粒菌液，5：阴性对照； C：1，2：重组质粒；
图2重组p27蛋白的SDS-PAGE鉴定，M：预染的蛋白分子量标准；1：菌液上清；2：菌体沉淀；
图3ALV p27蛋白纯化结果，M：预染的蛋白分子量标准；1-5：50mmol/L 咪唑洗脱的杂蛋白；6-7：400mmol/L咪唑洗脱的纯化蛋白；8-9：500mmol/L咪唑洗脱的蛋白；
图4p27重组蛋白的his单抗验证，M：预染的蛋白分子量标准；1，2分别为：已纯化、未纯化ALV p27蛋白；3：pColdⅠ。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
1、方法
1.1、P27基因引物的设计
根据GenBank中ALV RSA(GenBank登录号：M37980)株p27基因序列，设计了一对特异性扩增P27基因的引物，引物序列为：
p27-EcoR I-F：CGGAATTCATGCCTGTAGTGATTAAGACAG；
p27-Xba I-R：GCTCTAGACCTAGGGCTGGATAGCAGAC；
上下游引物分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，目的基因扩增片段为757bp，下划线处分别为EcoR I、Xba I酶切位点。
1.2、原核表达载体pColdⅠ-ALV-A-P27的构建
取接种RSA株病毒后的DF-1细胞沉淀提取病毒RNA，并以此为模板反转录为cDNA进行ALV-A P27基因的PCR扩增，PCR产物经凝胶电泳鉴定后，纯化回收PCR产物，将回收产物与原核表达载体pColdⅠ分别用EcoRⅠ和XbaⅠ进行双酶切，并于16℃连接4h(连接酶SolutionI)，然后转化至大肠埃希菌 DH5α感受态细胞中，涂布于含有氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，37℃培养 16～24h，挑单菌落摇菌12～14h，经菌液PCR进行鉴定，鉴定为阳性者，提取质粒进行双酶切验证，将验证为阳性的质粒命名为pColdⅠ-ALV-A-P27。
PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性1min；56℃退火30s；72℃延伸2min，共进行30个循环；最后72℃再延伸10min。
用设计的特异性引物对接种ALV的细胞沉淀进行扩增，产物经电泳检测，扩增出了约750bp大小条带(图1)。产物经纯化、连接、转化后，用菌液PCR 鉴定，也出现了预期大小的条带(图1)。提取鉴定结果为阳性的菌液的质粒，对重组质粒进行双酶切鉴定，结果出现了750bp和4700bp左右的两条特异性条带(图1)，将此重组质粒命名为pColdⅠ-ALV-A-P27。
1.3、重组蛋白的诱导表达
将重组质粒pColdⅠ-ALV-A-P27转化BL21感受态细胞，涂布Amp抗性平板，挑取单克隆37℃摇过夜后，按1：100的比例转接到5mL新鲜的LB液体培养基(含Amp 50μg/mL)中，37℃摇菌至OD600＝0.6～1.0，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，然后置于18℃摇菌18～24h，取菌液8000r/min离心10min，弃掉上清，加入PBS重悬沉淀。将菌液置于冰上超声破碎20min，使其充分裂解。然后10000r/min离心15min，分别收集上清和沉淀。
取经超声裂解离心后的上清和沉淀进行SDS-PAGE分析，结果如图2所示，上清和沉淀在26kD处有特异性蛋白条带，与预期结果一致。表明重组蛋白在上清与沉淀中都有表达，但多以包涵体的形式进行表达。许多外源蛋白高水平表达后，往往以不溶的、无生物活性的包涵体形式存在。包涵体是新生肽链形成时，折叠中间体分子之间产生了不当的相互作用，造成中间体聚集在一起，形成的不溶的物质。本发明中P27蛋白在超声破碎后的上清和沉淀中均有表达，但多以包涵体的形式进行表达，这与现有文献的研究结果正好相反，究其原因可能是由于本发明中诱导温度偏低且使用的是冷休克表达载体pCold I所致。低温条件下菌体生长缓慢，蛋白质合成速率也相应的变慢，这样新合成的蛋白质就有充分的时间折叠，同时较低的培养温度重组蛋白的降解速率也会降低，重组蛋白的稳定性就会提高。然而过低的培养温度会导致重组蛋白基本停止表达或表达量极少。冷休克表达载体pCold I-IV，是利用冷休克基因cspA启动子设计的高效率蛋白质表达载体。CspA是一种冷休克蛋白，培养温度为37℃时几乎不表达，而当低温培养时能够有效地高效地调控重组蛋白的表达。
1.4、ALV p27蛋白的纯化
用咪唑PBS洗涤纯化，具体步骤如下：
(1)取3mL镍柱装入层析柱，用5mL 50mM PBS平衡镍柱；
(2)将超声裂解的加入层析柱，反复上样5次；
(3)用5mL 50mM咪唑PBS(沉淀表达的话咪唑PBS中都需要加入8mol 尿素，下同)洗涤镍柱，用1.5mL离心管每管收集1mL收集5管；
(4)用5mL 400mM咪唑PBS洗涤镍柱，用4mL离心管每管收集2.5mL 收集2管；
(5)用5mL 500mM咪唑PBS洗涤镍柱，用4mL离心管每管收集2.5mL 收集2管；
(6)洗涤液经SDS-PAGE进行验证。
在鉴定了ALV p27蛋白表达形式后，选择了菌液上清进行纯化，纯化后的结果如图3，由图可知ALV p27蛋白在400mmol/L咪唑浓度时洗脱量最大且条带单一。
1.5、ALV p27蛋白的Western blot鉴定
将ALV p27进行SDS-PAGE电泳后利用蛋白湿转仪将蛋白转至PVDF膜上，方法如下：
(1)SDS-PAGE电泳结束后，去除多余的胶，剪下与胶大小一致的PVDF 膜和滤纸，将PVDF膜置甲醇内活化1min后放入转膜缓冲液中备用。按负极- 垫子-凝胶-PVDF膜-垫子-正极的顺序于电转仪30v恒压转膜2h；
(2)电转结束后，将膜放入含5％脱脂奶粉的TBST中37℃恒温封闭1h；
(3)弃去脱脂奶粉后TBST洗膜3次，每次5-10min；
(4)分为三张膜，分别滴加1:1000倍稀释的His单抗、1:1000的兔抗p27 阳性血清、1:1000的纯化后的兔抗p27多抗，4℃摇床孵育过夜；
(5)回收一抗，TBST洗膜3次，每次5-10min；
(6)分别滴加1:1000倍稀释的HRP标记的山羊抗鼠，37℃孵育1h；
(7)弃去二抗，TBST洗膜3-5次，每次5-10min；
(8)ECL显色：将ECL超敏显色试剂盒中的A液和B液按同等比例稀释，滴加到PVDF膜上，避光显色2min，边缘吸干后置于仪器内显影并拍摄。
用His单抗作为一抗，HRP标记的山羊抗鼠抗体为二抗，结果如图4。图中结果显示ALV p27重组蛋白能特异性的与his单抗结合且条带大小一致。
1.6、ALV p27蛋白的浓度测定鉴定
用碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定，具体步骤如下：
(1)将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板中，将稀释液按20、19、18、16、12、8、4将上孔补足到20μL，即标准品浓度分别为0、 0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL；
(2)检测孔每孔加20μL样品；
(3)每孔加入200μL BCA工作液，37℃孵育30min；
(4)用酶标仪测定波长540-595nm之间的吸光度；
(5)绘制标准曲线计算测定样品浓度。
根据BCA试剂盒说明书进行测定，并绘制了标准曲线，按照标准曲线得出公式计算出纯化的兔源p27多抗浓度为2mg/mL。
2、间接ELISA方法的优化
2.1包被抗原浓度与血清稀释度的确定
1)采用方阵滴定的方法，将p27蛋白梯度稀释，分别设8μg/mL，4μg/mL， 2μg/mL，1μg/mL，0.5μg/mL，0.25μg/mL，0.125μg/mL，0.0625μg/mL 8个浓度梯度，依次横向包被酶标板，每个梯度重复12孔，每孔100μL，4℃包被过夜。甩出孔内液体，用PBST振荡洗涤3次，每次3min，最后一次在吸水纸上拍干；
2)每孔加入含5％脱脂奶粉的PBST 200μL，37℃封闭2h，同上洗涤三次，拍干；
3)将阳性血清和阴性血清分别依次梯度稀释，设1:100，1:200，1:400，1:800， 1:1600，1:3200共6个梯度，依次纵向加入酶标板，每孔100μL，同上洗涤三次，拍干；
4)将酶标抗体用PBS作l：5000倍稀释，加入酶标板中，100μL/孔，37℃作用1h，同上洗涤三次，拍干；
5)加入现配的TMB显色液，100μL/孔，37℃孵育15min；
6)每孔加入2M H2S04终止液，50μL/孔，在酶标仪上读取OD450。以阳性孔OD值接近l，P/N值最大时，包被抗体浓度和酶标抗体浓度组合为最佳工作浓度。
试验结果如表1，由表看出选择包被p27蛋白浓度为0.5μg/mL，阴阳性血清稀释倍数为1:200为最佳条件。
表1包被抗原与血清稀释倍数的确定
Figure RE-GDA0003150138580000061
Figure RE-GDA0003150138580000071
2.2、酶标二抗最佳稀释度的确定
选择1:5000，1:10000，1:15000，1:20000共4个稀释度，进行酶标二抗最佳稀释度的摸索。计算P/N的值，取阳性血清的OD450值接近1.0，P/N最大值为最佳优化条件。
试验结果如表2，由表看出选择酶标抗体稀释倍数为1:5000为最佳条件。
表2酶标二抗稀释倍数的确定
Figure RE-GDA0003150138580000072
2.3、包被条件的确定
选择37℃2h，4℃过夜，37℃2h后4℃过夜共3种包被条件，每个条件做3个重复，其他操作步骤同2.1。计算P/N值，取P/N最大值的包被条件为最佳包被条件。
试验结果如表3，由表看出包被时间为37℃1h为最佳条件。
表3包被时间的确定
Figure RE-GDA0003150138580000073
2.4、封闭时间的确定
选择5％脱脂奶粉进行60min，90min，120min进行封闭时间的摸索，其他操作步骤同2.1。计算P/N的值，取P/N最大值为最佳优化条件。
由表4可知3个封闭条件中37℃封闭1h为最佳条件。
表4封闭时间的确定
Figure RE-GDA0003150138580000074
Figure RE-GDA0003150138580000081
2.5、检测血清最佳作用时间的确定
选择30min，60min，90min进行抗原最佳作用时间的摸索，其他操作步骤同2.1。测定OD450值，计算P/N的值，取P/N最大值为抗原最佳作用时间。
由表5可知3个血清作用时间条件中37℃作用0.5h为最佳条件，该条件下阳性OD450值接近于1且P/N值较大。
表5待检血清作用时间的确定
Figure RE-GDA0003150138580000082
2.6、酶标抗体最佳作用时间的确定
酶标抗体最佳稀释度的摸索选择30min，60min，90min进行最佳二抗作用时间的摸索，其他操作步骤同2.2.1。计算P/N的值，取P/N最大值为最佳优化条件。
由表6可知3个酶标抗体作用时间条件中37℃作用0.5h为最佳条件，该条件下阳性OD450值接近于1且P/N值较大。
表6酶标二抗作用时间的确定
Figure RE-GDA0003150138580000083
2.7最佳显色时间的确定
选择10min，15min，20min进行最佳显色时间的摸索，其他操作步骤同2.2.1。计算P/N的值，取P/N最大值为最佳显色时间。
由表7可知3个显色时间条件中37℃作用10min为最佳条件。
表7显色时间的确定
Figure RE-GDA0003150138580000084
2.8、阴阳性临界值的确定
取80份IDEXX试剂盒检测己确定的阴性血清，用已建立的间接ELISA方法检测，测定其OD450值，计算出80份样品OD450值的平均值(X)和标准差(SD)，根据统计学原理X+3SD作为该方法检测阳性临界值的下线，所测OD450≥X+ 3SD时为阳性，OD450≤X+3SD时为阴性，需重复检测。
ALV p27间接ELISA反应条件优化结果如表8，按该条件进行阴阳性临界值的确定，由检测的数据统计，检测数据的平均数(X)为0.211，SD为0.090，因此判定，OD450nm＝X+3SD≥0.481为阳性，OD450nm<0.481判为阴性。
表8 ALV p27间接ELISA反应条件
Figure RE-GDA0003150138580000091
3、检测禽白血病P27的间接ELISA方法的具体步骤包括：
1)用禽白血病病毒RSA株p27基因序列设计一对引物以扩增p27基因，构建重组表达载体经诱导表达获得重组表达蛋白上清表达，上清表达经过纯化后作为包被抗原；
2)将包被抗原放入酶标板内进行包被、封闭，得封闭液，其中，p27蛋白抗原浓度为0.5μg/mL，包被条件为37℃包被1h，封闭时间为37℃封闭1h；
3)甩掉步骤2)中封闭液，用一抗孵育，然后再用二抗孵育，其中，一抗为稀释倍数为1:200的待检测阴阳性血清，孵育条件为37℃作用0.5h；二抗为稀释倍数为1:5000的HRP标记兔抗鸡IgG，孵育条件为37℃作用0.5h；
4)甩掉步骤3)中酶标二抗孵育液，采用TMB显色液显色，显示条件为 37℃作用10min，加入显色终止液，终止反应；
5)利用酶标仪测定步骤4)酶标板孔中液体OD450nm值，根据临界值判定阴阳性，临界值判定阴阳性的标准为：当OD450nm大于0.481是阳性，小于0.481 是阴性。
4、试验验证
4.1特异性实验
对ALV、NDV、H5N1、H7阳性对照进行检测，在检测的样品中仅ALV检测出阳性，特异性试验结果如表9，说明该方法具有良好的特异性。
表9 ALV p27间接ELISA特异性
Figure RE-GDA0003150138580000101
4.2敏感性实验
用该实验中建立的ELISA方法对稀释样品做平行实验，该方法在1:12800 倍稀释是还是阳性，试验结果见表10，说明该方法的敏感性较强。
表10 ALV p27间接ELISA敏感性
Figure RE-GDA0003150138580000102
4.3重复性实验
按照优化好的反应条件进行ALV p27间接ELISA方法批内差异和批间差异试验。批内差异试验结果见表11。由表可知该ALV p27间接ELISA方法批内差异小于15％，有良好的重复性。
表11 ALV p27间接ELISA批内差异
Figure RE-GDA0003150138580000103
批间差异试验结果见表12。由表可知该ALV p27间接ELISA方法批间差异小于15％，有良好的重复性。
表12 ALV p27间接ELISA批间差异
Figure RE-GDA0003150138580000104
核苷酸序列表：
Figure RE-GDA0003150138580000111
SEQUENCE LISTING
序列表
<110> 贵州大学
<120> 一种检测禽白血病P27的间接ELISA方法
<160> 2
<210> 1
<211> DNA
<212> 30
<213> 人工序列
<400> 1
CGGAATTCAT GCCTGTAGTG ATTAAGACAG 30
<210> 2
<211> DNA
<212> 28
<213> 人工序列
<400> 2
GCTCTAGACC TAGGGCTGGA TAGCAGAC 28

Claims (9)

1.一种检测禽白血病P27的间接ELISA方法，其特征在于，利用禽白血病病毒RSA株p27基因序列设计一对引物以扩增p27基因，构建蛋白表达载体，通过IPTG诱导表达获得重组表达蛋白上清表达，以蛋白上清表达经纯化后作为包被抗原，建立检测禽白血病P27的间接ELISA方法。
2.根据权利要求1所述的检测禽白血病P27的间接ELISA方法，其特征在于，所述禽白血病病毒为病毒RSA株。
3.根据权利要求1所述的检测禽白血病P27的间接ELISA方法，其特征在于，所述一对引物的引物序列如下：
p27-EcoR I-F：CGGAATTCATGCCTGTAGTGATTAAGACAG；
p27-Xba I-R：GCTCTAGACCTAGGGCTGGATAGCAGAC。
4.根据权利要求1所述的检测禽白血病P27的间接ELISA方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)用禽白血病病毒RSA株p27基因序列设计一对引物以扩增p27基因，构建重组表达载体经诱导表达获得重组表达蛋白上清表达，上清表达经过纯化后作为包被抗原；
2)将包被抗原放入酶标板内进行包被、封闭，得封闭液；
3)甩掉步骤2)中封闭液，用一抗孵育，然后再用二抗孵育；
4)甩掉步骤3)中酶标二抗孵育液，采用TMB显色液显色，加入显色终止液，终止反应；
5)利用酶标仪测定步骤4)酶标板孔中液体OD450nm值，根据临界值判定阴阳性。
5.根据权利要求4所述的检测禽白血病P27的间接ELISA方法，其特征在于，步骤1)中，所述p27蛋白抗原浓度为0.5μg/mL。
6.根据权利要求4所述的检测禽白血病P27的间接ELISA方法，其特征在于，步骤2)中，包被条件为37℃包被1h，封闭时间为37℃封闭1h。
7.根据权利要求4所述的检测禽白血病P27的间接ELISA方法，其特征在于，步骤3)中，一抗为稀释倍数为1:200的待检测阴阳性血清，孵育条件为37℃作用0.5h；二抗为稀释倍数为1:5000的HRP标记兔抗鸡IgG，孵育条件为37℃作用0.5h。
8.根据权利要求4所述的检测禽白血病P27的间接ELISA方法，其特征在于，步骤4)中，显示条件为37℃作用10min。
9.根据权利要求4所述的检测禽白血病P27的间接ELISA方法，其特征在于，所述临界值判定阴阳性的标准为：当OD450nm大于0.481是阳性，小于0.481是阴性。
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