CN102636644A - 检测禽白血病群特异性抗原的双抗体夹心elisa试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测禽白血病群特异性抗原的双抗体夹心ELISA试剂盒。所述试剂盒中包括由保藏编号为CGMCC No.5961的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体包被的酶标板。本发明还公开了利用所述单克隆抗体建立的一种快速有效的检测ALV的双抗体夹心ELISA方法，其以原核表达的HLJ09MDJ-1p27蛋白制备的单克隆抗体作为包被抗体，p27蛋白制备的多抗作为检测抗体。该方法对p27的最小检出量为1.25ng/ml，且与禽类常见的病毒不反应，特异性好。利用该方法检测蛋清和肛拭子样品，与PCR方法符合率分别为96.5％和88.9％。结果表明，该方法具有方便、快速、特异、敏感等优点，可用于ALV的检测与种群净化。

Description

检测禽白血病群特异性抗原的双抗体夹心ELISA试剂盒

技术领域

本发明涉及一种试剂盒，特别涉及一种检测禽白血病群特异性抗原的双抗体夹心ELISA试剂盒以及利用所述试剂盒检测禽白血病病毒群特异性抗原的方法。属于生物技术领域。

背景技术

禽白血病病毒(ALV)属反转录病毒科，禽C性反转录病毒属，可引起禽类多种肿瘤性疾病。本病在世界各地均有发生，感染率高，发病率低，是危害养禽业的主要疾病之一。禽白血病主要危害有两个方面，一是产生肿瘤，导致鸡的死亡；二是引起母鸡产蛋率下降、蛋重减轻等生产指标的改变；而且，还可以引起鸡的免疫抑制，继发其他细菌和病毒的感染，造成严重的经济损失。近些年来，在国内许多省份，ALV-J主要感染15到29周龄蛋鸡，引起产蛋量显著下降，趾骨周围皮肤和羽毛处淋巴结出血。1997年和1998年，J亚群禽白血病在世界范围内爆发，给养禽业造成了巨大的经济损失。

目前，该病尚无彻底可行的防治措施。迄今为止尚无有效地疫苗可用。预防本病的主要方法是培育具有遗传性抵抗力的新品种，淘汰阳性鸡，净化种群，经过几代选育出无白血病的鸡群。

自1868年，Roloff报道禽白血病以来，研究工作者就对其进行长期的研究，并在病毒的分离、鉴定、检测和诊断方面取得了相当大的成就。建立了很多禽白血病的检测方法，如病毒中和试验、琼脂扩散实验、补体结合试验、ELISA、放射免疫、免疫荧光技术等。国外很早就建立了检测该病的ELISA诊断试剂盒，但国内目前为止还没有令人满意的商品化禽白血病诊断试剂。

禽白血病病毒的主要蛋白质组分有gag基因编码的核心蛋白，pol基因编码的3种酶，env基因编码的两种糖蛋白。在gag编码的非糖基化蛋白中，p27是主要的群特异性抗原，是一种高度保守的非糖基化蛋白，有许多病毒抗原位点，是制备检测抗体的首选抗原。

本发明利用本实验室制备的针对p27的单克隆抗体和多克隆抗体建立了双抗体夹心ELISA方法，为ALV的检测和流行病学调查以及ALV的早期诊断提供依据。

发明内容

本发明的目的之一在于建立一种检测禽白血病群特异性抗原的双抗体夹心ELISA试剂盒，其操作简单，特异性好，敏感性高，具有良好的可靠性；

本发明的目的之二在于提供了一种使用以上所述的试剂盒进行禽白血病病毒群特异性抗原检测的方法；

本发明的目的之三在于提供用于建立以上所述试剂盒的单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

本发明的目的之四在于提供所述的杂交瘤细胞株在制备检测或诊断禽白血病病毒感染试剂中的用途；及所述的单克隆抗体在制备检测或诊断禽白血病病毒感染试剂中的用途。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明发明人从黑龙江省某鸡场送检的海兰褐蛋鸡病料中分离鉴定出1株J亚群禽白血病病毒(ALV-J)，命名为HLJ09MDJ-1。为了解其分子特征，对其进行了全基因组测序，并与其他毒株进行了比较。结果表明，HLJ09MDJ-1分离株的gag和pol基因非常保守，与各参考毒株的同源性为97.5％～99.0％；env基因的同源性为88.4％～97.5％。与参考毒株相比，HLJ09MDJ-1分离株与HPRS-103株的亲缘关系较近。

该毒株HLJ09MDJ-1及全序列分析已分别记载在2010年11期的《动物医学进展》题目为“蛋鸡J亚群禽白血病病毒HLJ09MDJ-1株的分离鉴定”和2010年第8卷的《Virology journal》，题目为“Novel sequences of subgroup J avian leukosis virusesassociated with hemangioma in Chinese layer hens”的文中，公众可通过中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室获取得到。两篇文章以全文引用的方式并入本发明的说明书中。

本发明从ALV-J(HLJ09MDJ-1)病毒株感染的DF-1细胞的冻融裂解液中提取DNA，通过PCR方法扩增出禽白血病群特异性抗原p27基因，将其克隆至pMD18-T载体，酶切鉴定后进行序列测定和分析。最后将p27基因亚克隆到载体pET-30a(+)，转化受体菌BL21，IPTG诱导表达，经SDS-PAGE检测获得融合蛋白。经过Western-blot检测，证明表达的蛋白具有良好的反应原性。将纯化的p27蛋白作为抗原，免疫7周龄BALB/c小鼠，利用淋巴细胞杂交瘤技术，最终制备了5株能够分泌抗p27蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。其分泌的单克隆抗体效价高达10⁷以上，且分泌抗体稳定、特异性高。ALV-J，ALV-A，ALV-B是常见的外源性禽白血病病毒，5株杂交瘤细胞株能够与ALV-J，ALV-A，ALV-B发生特异性反应，能够观察到明显的荧光，且与DF-1细胞不反应。

本发明从五株杂交瘤细胞株挑选出了一株特异性好且效价较高的分泌抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株2E5，分类命名为杂交瘤细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其微生物保藏号为：CGMCCNo.5961，保藏时间为2012年3月29日。

进一步的本发明还提供了由所述的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体。

再进一步的，本发明又提供了所述的杂交瘤细胞株在制备检测或诊断禽白血病病毒感染试剂中的用途。及所述的单克隆抗体在制备检测或诊断禽白血病病毒感染试剂中的用途。

本发明利用得到的单克隆抗体建立了一种检测禽白血病群特异性抗原的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于包括包被抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体的酶标板；

所述的单克隆抗体由杂交瘤细胞株分泌产生，所述的杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株2E5，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5961。

在本发明中，优选的，所述的单克隆抗体的包被量为2μg/ML。

本发明的试剂盒进一步的还可包括抗禽白血病病毒p27蛋白的多抗、酶标抗兔二抗、封闭液以及稀释液等，所述的封闭液优选为含有50g/L的脱脂奶粉的10mM pH7.2的磷酸缓冲液；所述的稀释液优选为10mM pH 7.2的磷酸缓冲液。

所述的试剂盒能够用于制备检测禽白血病群特异性抗原的试剂。

在本发明的一个具体实施例中，优选的，所述的试剂盒包括：

酶标板：由保藏编号为CGMCC No.5961的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体2E5包被，包被量为2μg/ML；

多克隆抗体：抗p27蛋白的多克隆抗体，浓度为4μg/ML；

酶标二抗：HPR标记的羊抗兔IgG(sigma公司)；

封闭液：含有50g/L的脱脂奶粉的10mM pH 7.2的磷酸缓冲液；

稀释液：10mM pH 7.2的磷酸缓冲液；

洗涤液：含0.5％吐温20的10mM pH 7.2的PBS缓冲液；

阴性对照：未接毒生物DF-1细胞培养液；

阳性对照：ALV-J(HLJ09MDJ-1)的DF-1细胞培养液；

显色液：TMB显色液(TianGen)；

终止液：2mol/L硫酸溶液。

其他的任何可获得的禽白血病病毒(ALV)都可作为本发明试剂盒中的阳性对照，而达到相同的技术效果。

本发明还提供了利用所述的试剂盒检测禽白血病病毒群特异性抗原的方法，其特征在于按照双抗体夹心ELISA检测方法进行检测，具体的包括以下步骤：

(1)包被抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体的酶标板4℃过夜后用含0.5％吐温20的磷酸缓冲液洗涤，37℃封闭液封闭4h，洗板；

(2)加入待检样品，室温孵育，洗板；

(3)加入纯化的多抗，室温孵育，洗板；

(4)加入酶标抗兔二抗，室温孵育，洗板；

(5)加入TMB显色液，室温显色，最后加2mol/L硫酸终止反应，测定OD_450nm值。

为了确定出最佳反应条件，本发明在不同反应条件下，对单抗2E5包被量(8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml)，多抗工作浓度(8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml)，HRP标记的抗兔二抗稀释度(1∶8000，1∶5000，1∶3000)，病毒、单抗、酶标二抗(0.5h、1h、1.5h)及TMB工作最佳作用时间(10min、15min、20min)，封闭液的种类(10g/L BSA、50g/L脱脂奶粉、10g/L鱼明胶)进行ELISA实验，检测同一阳性和阴性样品。选择OD_450nm值接近于1.0，P/N值最大的条件为最佳条件。经试验确定DAS-ELISA单抗2E5最佳包被量为2μg/ML，多抗最佳浓度为4μg/ML，酶标二抗最佳稀释度为1∶3000(以上四要素通过方阵法确定)，病毒抗原、多抗、酶标二抗及TMB最佳作用时间分别为1h，1h，1h和20min。封闭液选择含有50g/L脱脂奶粉的10mM pH 7.2磷酸缓冲液。

本实验中建立的DAS-ELISA是以抗p27蛋白的单体和多抗分别作为捕获抗体和检测抗体，而不是ALV其他蛋白的单抗和多抗，是因为p27是主要的群特异性抗原，在不同ALV亚群中高度保守，且有许多病毒抗原位点，是制备检测抗体的首选抗原。

本实验建立的DAS-ELISA具有良好的敏感性和特异性，能够检测到1.25ng/mlp27蛋白，且与常见的禽类病毒不反应(IBV，MDV，AIV等)。ALV-J，ALV-A，ALV-B是常见的外源性禽白血病病毒，DAS-ELISA与ALV-J、ALV-A和ALV-B反应特异，为禽白血病的诊断、防控和净化奠定了基础。

在人工感染试验中，PCR最早检出阳性为感染ALV后第11天(11d.p.i.)，DAS-ELISA最早检出阳性是在12d.p.i.。DAS-ELISA检测到ALV比PCR方法晚一天，敏感性良好，且与PCR的符合率很高。PCR方法检测ALV早有文献报道，但是DAS-ELISA与PCR相比，具有方便、省时和批量检测的优点。DAS-ELSIA在攻毒后12天后就能检测到ALV，为ALV的检测和及时淘汰阳性鸡群奠定了基础。利用DAS-ELSIA检测了491份蛋清样品和190份肛拭子样品，与PCR方法符合率分别为96.5％和88.9％。总之，ALV DAS-ELISA检测方法的建立，为ALV的检测和防控奠定了基础。

附图说明

图1为p27基因的PCR扩增及重组表达载体pET-30a-p27的酶切鉴定；图A为p27基因的PCR扩增(M：DNA Marker DL2000；1：p27基因PCR产物；2：阴性对照)；图B为重组表达载体pET-30a-p27的酶切鉴定(1：pET-30a-p27BamH I/Sal I；M1：DNA Marker DL2000；M2：DNA Marker DL 15000)

图2A为诱导表达p27蛋白的SDS-PAGE分析；图2B为p27蛋白的Western blot分析；

a1.低分子量标准蛋白Marker；a2.a3.a4诱导后表达产物；a5.诱导前表达产物；a6.纯化后的p27蛋白；b1.纯化的p27蛋白；b2.低分子量标准蛋白Marker

图3为单抗的特异性鉴定；

图4为单抗间接荧光免疫反应(IFA)分析结果；

图5为多克隆抗体间接免疫荧光结果；

A：ALV-A间接免疫荧光结果；B：ALV-B间接免疫荧光结果；C：ALV-J间接免疫荧光结果；D：阴性对照；

图6为单抗2E5和多抗的间接免疫荧光鉴定；

图7为DAS-ELSIA的敏感性分析；

图8为DAS-ELSIA的特异性性分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体及分泌该抗体杂交瘤细胞株的制备

1、材料和方法

1.1病毒、实验动物、细胞和血清：

ALV毒株ALV-J(HLJ09MDJ-1)、ALV-A和ALV-B由哈尔滨兽医研究所分离鉴定，提供；IBV，MDV，AIV H5，AIV H7，AIV H9，ILTV，FPV，IBDV，NDV，ARV和REV由哈尔滨兽医研究所提供；3周龄BALB/c小鼠，2月龄新西兰家兔和SPF鸡由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供；DF-1、S/P20细胞由本实验室保存；兔抗天然p27蛋白阳性血清由本实验室制备。

1.2载体、细菌：

克隆载体pMD-18T、原核表达载体pET-30a、大肠杆菌DH5α和BL21菌种由本实验室保存。

1.3试剂：

DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收提取试剂盒购自AXYGEN公司；T4DNA连接酶、IPTG、pMD18-T载体等购自大连宝生物工程(Takara)有限公司；原核表达载体pET-30a购买自Novagen公司；HPR标记的羊抗鼠IgG、抗鼠荧光二抗购自Sigma公司，免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒购自Southern Biotech公司，弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；1640培养基、HAT、HT购自GibcoBRL，蛋白纯化用填充材料购自GE healthcare。

1.4引物的设计与合成：

根据HLJ09MDJ-1毒株的序列(潘伟，高玉龙，秦立廷，等.蛋鸡J亚群禽白血病病毒株HLJ09MDJ-1的分离鉴定及全基因组序列分析，中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会论文集[C].2010.)，用软件，premier 5.0设计一对引物p1、p2用于扩增p27基因，是含有BamH I和SalI酶切位点的一对特异性引物，上游引物P1：5’CGGGATCCATGCCTGTAGTGATTAAGAC 3’，含有BamH I酶切位点。下游引物P2：5’ACGTCGACCTAGGGCTGGATAGCAGACG 3’，含有Sal I酶切位点。

1.5DNA提取和p27基因的扩增：

将毒株HLJ09MDJ-1接种到对数期生长DF-1细胞的6孔板上，7天后收集细胞培养板并冻融DF-1细胞3次。用DNA提取试剂盒从DF-1细胞冻融液中提取DNA(操作按说明书进行)。以提取的DNA为模板进行PCR，反应条件为94℃5min，94℃30s，56℃30s，72℃1min，扩增35次，最后72℃延伸10min。扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳分析。扩增产物进行测序，测序结果如SEQ ID No.2所示。其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

1.6重组表达载体pET-30a-p27的构建及鉴定：

利用AXYGEN凝胶回收试剂盒回收PCR产物，连接于pMD-18T载体后转化，提取质粒，用BamH I和SalI双酶切鉴定，鉴定为阳性的重组质粒的命名为pMD-P27并送生物公司测序。利用BamH I和SalI双酶切质粒pMD-p27和pET-30a，分别回收720bp和4900bp片段，T4DNA连接酶连接，连接产物转化BL21感受态细菌，小量提取质粒，BamH I和SalI双酶切鉴定出阳性质粒，命名为pET-30a-p27。

1.7p27基因在原核表达系统中的表达、纯化及活性检测：

挑取单个含有pET-30a-p27的BL-21细菌菌落加入Kan(100μg/m1)的LB中，37℃过夜振摇培养，次日扩大培养至OD₆₀₀约为0.8，加入IPTG至终浓度0.1mM，于37℃诱导6h，收获细菌。离心后，将菌体用PBS重悬(50μL PBS/mL LB)，于4℃过夜后，超声波温和裂解菌体，离心取上清，12％SDS-PAGE电泳分析。而后转印到NC膜上，封闭后，酶标兔抗p27抗体3000倍稀释孵育，加底物显色。由于p27蛋白与His Tag是以融合蛋白的形式表达，因此可以用Ni填料对其进行非变性纯化，具体方法参照按照GE healthcare公司His Trap^TM HP使用说明书进行。将纯化的His-p27融合蛋白和重组蛋白用兔抗自然P27蛋白阳性血清进行Western blot分析。

1.8免疫动物：

把纯化的p27蛋白(2mg/ml)加等量的弗氏完全佐剂，皮下注射7周龄BLAB/c小鼠，每只0.05ml；21d后用含等量弗氏不完全佐剂的p27蛋白腹腔注射二次免疫，0.1ml/只，21天后仅用p27蛋白腹腔兼尾静脉注射0.05mL/只加强免疫，3d后取脾用于融合。

1.9阳性杂交瘤细胞株的建立：

取上述免疫鼠的脾制成细胞悬液与处于对数生长期的S/P20细胞以8∶1的比例进行融合。待融合细胞长至孔底1/2或1/3时，通过间接ELISA筛选出阳性杂交瘤细胞株，再利用有限稀释法连续克隆2～3次。至阳性率为100％后进行扩大培养，冻存于液氮中。

1.10抗p27蛋白的单克隆抗体的制备：

将筛选得到的杂交瘤细胞进行扩大培养后，以5×10⁶/0.5ml杂交瘤细胞腹腔注射BLAB/C小鼠1ml，14d后待小鼠腹围增大后用注射器收集腹水，1000r/min离心10min，上清以0.45μm滤器过滤后即为腹水MAb粗制品。

1.11单抗的效价测定及亚类的测定：

将纯化的p27蛋白作1∶1000稀释包被酶联反应板，用间接ELISA法测定腹水中MAb效价，以P/N＞2.5的最大稀释度作为抗体的效价。用免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒检测五株p27单抗的亚类。操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.12单抗的特异性鉴定

1.12.1五株单抗与禽类常见病毒的交叉反应：

将ALV-J，ALV-A，ALV-B，IBV，MDV，AIV H5，AIV H7，AIV H9，ILTV，FPV，IBDV，NDV，ARV和REV等14种病毒根据蛋白含量的不同，全部稀释至约15μg/mL包被酶联反应板，间接法ELISA检测与单抗反应，DF-1细胞冻融离心后上清作为阴性对照，PBS作为空白对照。OD₄₅₀＞0.2判定为阳性。

1.12.2五株单抗与ALV-J、ALV-A、ALV-B间接荧光免疫反应：

将ALV-J(HLJ09MDJ-1)、ALV-A和ALV-B禽白血病病毒接种于含DF-1细胞的24孔细胞板，将不接种病毒的DF-1作为阴性对照。5d后将培养液弃掉，用无水乙醇固定15min，将单抗2E5、3H8、4B7、6D9和10G2做1∶200稀释，加入细胞板孔内，室温孵育1h。PBST洗4次，抗鼠荧光二抗做1∶200稀释加入细胞板孔内，避光室温孵育1h，用PBST洗板4次，加入PBS，荧光显微镜观察结果。

2结果

2.1重组质粒pET-30a-p27的鉴定：

提取DNA，经PCR扩增，0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，扩增所得片段大小约720bp，与预期大小相符(见图1A)，将重组质粒pET-30a-p27用BamH I和Sal I双酶切鉴定，与预期的结果相符(见图1B)。扩增所得到p27基因全长717bp，编码239个氨基酸残基。

2.2p27基因的表达、重组蛋白纯化及蛋白活性检测：

将表达蛋白在非变性条件下纯化获得HIS-p27融合蛋白，获得分子量约为34kD的重组p27蛋白(图2A)，重组p27蛋白经SDS-PAGE电泳后，转移至硝酸纤维素膜上，用兔抗天然p27蛋白阳性血清进行Western blot分析，结果所表达的蛋白具有生物反应活性(图2B)。

2.3细胞融合率阳性杂交瘤细胞株的建立：

细胞融合率为89.4％，最终筛选出5株持续分泌抗ALV p27蛋白的MAb杂交瘤细胞株，编号分别是2E5、3H8、4B7、6D9和10G2。

本发明从五株杂交瘤细胞株挑选出了一株特异性好且效价较高的分泌抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株2E5，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其微生物保藏号为：CGMCC No.5961，保藏时间为2012年3月29日。

2.4单抗效价测定及亚类的测定：

用已建立的ELISA方法对五株单抗做效价测定的结果为：2E5:2⁷；3H8:2¹⁰；4B7:2⁹；6D9:2⁷和10G2:2⁸。免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒测定五株单抗的结果为：2E5为IgG2b；3H8、4B7、6D9和10G2全部是IgG1。

2.5单抗特异性鉴定：

IBV，MDV，AIV H5，AIV H7，AIV H9，ILTV，FPV，IBDV，NDV，ARV和REV与五株单抗反应的OD值均小于0.15，且ALV-J，ALV-A，ALV-B与五株单抗反应的OD值均大于1.2。表明五株单抗有良好的特异性(图3)。分析荧光显微镜观察单抗2E5、3H8、4B7、6D9和10G2分别与ALV-J(HLJ09MDJ-1)、ALV-A和ALV-B呈阳性反应，有明显的绿色荧光，且阴性对照无绿色荧光(图4)。

实施例2抗p27蛋白的多克隆抗体的制备

1、多克隆抗体的制备

选4只约2kg的健康雌性新西兰大白兔，用PBS稀释纯化后的重组p27蛋白(按照实施例1所述的方法制备得到)，加入等体积CFA充分乳化后，按每只兔0.5mg重组蛋白剂量皮下多点接种；以后每隔2周用等量IFA乳化，加强免疫2次，三免后7天耳缘静脉采血0.5ml，分离血清。

2、间接免疫荧光试验检测多抗免疫原性

将DF-1细胞铺于24孔板，每孔加入100ulALV-A，ALV-B，ALV-J病毒，并设正常细胞为阴性对照，37℃温箱继续培养5d后，弃上清液，用无水乙醇固定细胞，三免后收集的血清用3％BSA做200倍稀释作为一抗，室温孵育1h，PBST洗3遍，荧光二抗用3％BSA做200倍稀释，避光反应1h，PBST洗3遍，静置5min。每孔加入少量PBS，荧光显微镜观察结果。

3、酶联免疫吸附试验(ELISA)检测多抗效价

将纯化的ALVp27抗原蛋白以4ug/ml浓度包被聚苯乙烯板，4℃过夜，然后每孔加入洗涤液(含0.05％Tween-20，0.01mol/L pH 7.4PBS，PBST)洗涤3次。加入封闭液(5％脱脂奶粉)，37℃孵育2h，甩干，洗板。加入倍比稀释的三免后兔血清，对照组加入正常大白兔血清作为阴性对照，兔抗自然p27蛋白阳性血清作为阳性对照，37℃孵育1h，洗涤同前。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，37℃孵育1h，洗板同上。加底物液TMB显色。加入终止液(2mol/L硫酸)。于Bio-Rad酶标仪450nm下测定光密度值(OD)。

4、结果

4.1间接免疫荧光实验

通过间接免疫荧光实验，获得的兔多抗能很好地与不同亚群的ALV病毒反应产生荧光，而阴性对照没有荧光(见图5)。

2.4酶联免疫吸附试验检测多抗效价结果

将获得的抗原按4ug/ml稀释进行包被。进行ELISA检测后，结果见表1，在血清1∶1000稀释所得到的值约为1.500，与阴性对照组相比较差异极显著，且P/N值远远大于2，因此可以鉴定为阳性，同时可以判断血清具有很高的抗体效价(见表1)。

表1多克隆抗体ELISA检测结果

实施例3禽白血病病毒群特异性抗原的检测方法的建立

1.1病毒与实验动物

毒株HLJ09MDJ-1(ALV-J)，由本实验室保存，3周龄BALB/c小鼠，2月龄新西兰家兔和SPF鸡由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。

1.2试剂与器材

ProteinA、Protein G柱购自GE公司；免疫荧光抗兔二抗、免疫荧光抗鼠二抗、酶标抗兔二抗购自Sigma公司；TMB显色液购自TianGen公司；酶联反应板购自JET公司。

1.3p27单抗和多抗的纯化

将分泌2E5的杂交瘤细胞腹腔注射BLAB/C小鼠1ml，14d后待小鼠腹围增大后用注射器收集腹水，1000r/min离心10min，上清以0.45μm滤器过滤后即为腹水MAb粗制品，利用Protein G进行纯化。将制备的兔抗p27多抗利用Protein A进行纯化，具体操作参照GE公司提供的说明书进行。

1.4DAS-ELISA检测方法的建立

1.4.1操作程序

以pH8.5的Tris-Cl缓冲液稀释单抗2E5包被酶标板，4℃过夜后用含0.5％吐温20的PBS洗涤，加入50g/L脱脂乳的PBS，37℃封闭4h，洗板；加入待检样品(DF-1细胞作为阴性对照)。室温孵育1h，洗板；加入纯化的多抗，室温孵育1h，洗板；加入酶标抗兔二抗，室温孵育1h，洗板；加入TMB显色液，室温显色20min，最后加2mol/L硫酸终止反应，测定OD_450nm值。

1.4.2最佳反应条件的选择

在不同反应条件下，对单抗2E5包被量(8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml)，病毒抗原(HLJ09MDJ-1)原倍使用，多抗工作浓度(8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml)，HRP标记的抗兔二抗稀释度(1∶8000，1∶5000，1∶3000)，病毒、单抗、酶标二抗(0.5h、1h、1.5h)及TMB工作最佳作用时间(10min、15min、20min)，封闭液的种类(10g/LBSA、50g/L脱脂奶粉、10g/L鱼明胶)进行ELISA实验，检测同一阳性和阴性样品。选择OD_450nm值接近于1.0，P/N值最大的条件为最佳条件。

1.5.3阴阳性界判定标准

取20只SPF鸡，采取肛拭子作为阴性样品，进行ELISA检测。设阴阳性对照。计算被检阴性肛拭子平均值OD_450nm值

与偏差(s)，求得阴阳性界限

1.5.4敏感性试验和特异性试验

在最佳反应条件下，将纯化的p27蛋白稀释成250ng/ml，25ng/ml 2.5ng/ml，1.25ng/ml，0.83ng/ml，0.625ng/ml分别进行检测，确定本方法的敏感性。

将ALV-J，ALV-A，ALV-B，IBV，MDV，AIV H5，AIV H7，AIV H9，ILTV，FPV，IBDV，NDV，ARV和REV等14种常见的禽类病毒稀释成10μg/mL，评价其特异性。

1.5.5重复性试验

取5块不同批次包被的酶标板，检测ALV-J(HLJ09MDJ-1)抗原，将其做3个稀释度，每个稀释度设5个重复，在同一块酶标板上进行批内重复，不同酶标板之间进行批间重复，测定OD_450nm值，计算变异系数。

1.6实验室感染

采对ALV抗体为阴性的70只1日龄SPF鸡进行攻毒试验。选择40只鸡作为感染组，腹腔注射剂量为0.2ml 10³ TCID50/MLALV-J(HLJ09MDJ-1)感染DF-1细胞的冻融液。10只鸡作为同居组，另外20只鸡作为对照组。自攻毒的第1天起，每天从感染组抽取12只、对照组抽取5只采取肛拭子，肛拭子保存在含10％双抗的PBS中。同步进行PCR实验。

1.7临床样品对比试验

用DAS-ELISA检测了671份临床样品(491份蛋清样品和190份肛拭子样品)，同时用PCR方法检测同批样品。阴性样品中的阴性检出率即为特异性，阳性样品中的检出率即为相对灵敏度。两种方法检测结果一致的样本数占总体样本的比例即为两者的符合率。

2结果

2.1单抗和多抗的间接免疫荧光鉴定

对单抗2E5和多抗进行间接免疫荧光反应，2E5和多抗分别与ALV-J、ALV-A和ALV-B能够产生强的荧光信号(图6)。

2.2反应参数的确定

经试验确定DAS-ELISA单抗2E5最佳包被量为2μg/ML，病毒抗原原倍，多抗最佳浓度为4μg/ML，酶标二抗最佳稀释度为1∶3000(以上四要素通过方阵法确定)，病毒抗原、多抗、酶标二抗及TMB最佳作用时间分别为1h，1h，1h和20min。封闭液选择含有50g/L脱脂奶粉的10mM pH 7.2的磷酸缓冲液。在如上条件下进行试验效果最佳(数据均未给出)。

2.3阴阳性判断标准

在上述反应参数条件下，用20份ALV阴性肛拭子进行DAS-ELISA，平均值为0.09009，标准差为0.01239，得到阴阳界限值根据统计学原则取OD450nm值≥0.2时，可在99.9％的可信度上判定为阳性，作为检测结果的判断标准。

2.4敏感性试验、特异性试验及重复性试验

用DAS-ELISA测定250ng/ml，25ng/ml，2.5ng/ml，1.25ng/ml，0.83ng/ml，0.625ng/ml不同浓度的p27蛋白，该方法对p27的最小检出量为1.25ng/ml(图7)。IBV，MDV，AIV H5，AIV H7，AIV H9，ILTV，FPV，IBDV，NDV，ARV和REV等14中常见的禽类病毒用DAS-ELISA检测，其OD_450nm值均小于0.15，且ALV-J、ALV-A和ALV-B的OD_450nm值均大于1.2。表明DAS-ELISA有良好的特异性(图8)。批内重复性结果显示变异系数在3.54％-7.82％；批间重复性结果显示变异系数在3.61％-8.74％(数据未列出)。变异系数均小于10％。表明此诊断方法具有良好的重复性。

2.5实验室感染样品检测结果

在人工感染试验的肛拭子样品中，PCR最早检出阳性为感染ALV后11天(11d.p.i.)，DAS-ELISA最早检出阳性是在12d.p.i.(表1)。且DAS-ELISA与PCR的符合率很高(数据未给出)。为临床样品检测奠定基础。

表2DAS-ELISA与PCR检测攻毒试验中肛拭子的结果

2.6临床样品对比试验结果

检测了671份临床样品包括491份蛋清样品和190份肛拭子样品，结果显示(见表3和表4)，与PCR方法符合率分别为96.5％和88.9％。

表3临床蛋清样品检测结果

表4临床肛拭子样品检测结果

实施例4试剂盒的组装

本发明中所述的试剂盒包括：

酶标板：由保藏编号为CGMCC No.5961的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体2E5包被，包被量为2μg/ML；

多克隆抗体：抗p27蛋白的多克隆抗体，浓度为4μg/ML；

酶标二抗：HPR标记的羊抗兔IgG(sigma公司)；

封闭液：含有50g/L的脱脂奶粉的10mM pH 7.2的磷酸缓冲液；

稀释液：10mM pH 7.2的磷酸缓冲液；

洗涤液：含0.5％吐温20的10mM pH 7.2的PBS缓冲液；

阴性对照：未接毒生物DF-1细胞培养液；

阳性对照：ALV-J(HLJ09MDJ-1)的DF-1细胞培养液；

显色液：TMB显色液(TianGen)；

终止液：2mol/L硫酸溶液。

Claims (10)

1.检测禽白血病群特异性抗原的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于包括包被抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体的酶标板；

所述的单克隆抗体由杂交瘤细胞株分泌产生，所述的杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株2E5，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5961。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的单克隆抗体的包被量为2μg/ML。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于还包括抗禽白血病病毒p27蛋白的多抗、酶标抗兔二抗、封闭液以及稀释液，所述的封闭液优选为含有50g/L的脱脂奶粉的10mM pH 7.2的磷酸缓冲液；所述的稀释液优选为10mM pH 7.2的磷酸缓冲液。

4.权利要求1-3任一项所述的试剂盒在制备检测禽白血病群特异性抗原试剂中的应用。

5.利用权利要求1-3所述的试剂盒检测禽白血病病毒群特异性抗原的方法，其特征在于按照双抗体夹心ELISA检测方法进行检测，具体的包括以下步骤：

(1)包被抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体的酶标板4℃过夜后用含0.5％吐温20的磷酸缓冲液洗涤，37℃封闭液封闭4h，洗板；

(2)加入待检样品，室温孵育，洗板；

(3)加入纯化的多抗，室温孵育，洗板；

(4)加入酶标抗兔二抗，室温孵育，洗板；

(5)加入TMB显色液，室温显色，最后加2mol/L硫酸终止反应，测定OD450nm值。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述的单克隆抗体的包被量为2μg/ML，待检样品原倍，多抗的浓度为4μg/ML，酶标抗兔二抗的稀释度为1∶3000，待检样品、多抗、酶标抗兔二抗及TMB的作用时间分别为1h，1h，1h和20min，封闭液为含有50g/L的脱脂奶粉的10mM pH 7.2的磷酸缓冲液。

7.一种分泌权利要求1所述的抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株2E5，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏号为：CGMCC No.5961。

8.由权利要求7所述的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体。

9.权利要求7所述的杂交瘤细胞株在制备检测或诊断禽白血病病毒感染试剂中的用途。

10.权利要求8所述的单克隆抗体在制备检测或诊断禽白血病病毒感染试剂中的用途。

Images