CN108330101A - 一种杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体和应用 - Google Patents

一种杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108330101A
CN108330101A CN201810188948.2A CN201810188948A CN108330101A CN 108330101 A CN108330101 A CN 108330101A CN 201810188948 A CN201810188948 A CN 201810188948A CN 108330101 A CN108330101 A CN 108330101A
Authority
CN
China
Prior art keywords
monoclonal antibody
cell strain
hybridoma cell
alv
hybridoma
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810188948.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108330101B (zh
Inventor
郭慧君
郭晗璞
李宏梅
张丹丹
胡卫国
闫泽
闫泽一
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Agricultural University
Original Assignee
Shandong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Agricultural University filed Critical Shandong Agricultural University
Publication of CN108330101A publication Critical patent/CN108330101A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108330101B publication Critical patent/CN108330101B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体和应用。本发明所述的杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.14290。该杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体能够识别A亚群禽白血病病毒gp85囊膜蛋白，可以用于研制A亚群禽白血病的诊治试剂或药物，为A亚群禽白血病的临床鉴别诊断和实验室研究提供了物质基础。

Description

一种杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体和应用
技术领域
本发明涉及生物技术技术领域，具体涉及一种杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体和 应用。
背景技术
禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus，ALV)属于反转录病毒科，肿瘤病毒亚科，禽 α反转录病毒属，可引起禽类各种阳性或恶性肿瘤。依据病毒囊膜糖蛋白特性、病毒干扰实验、宿主范围等其他分子生物学特性，将ALV分类为11个亚群,其中A、B、C、D、E、 J、K亚群是从鸡中分离得到。A和B亚群是商品蛋鸡中最常见的外源性病毒。
A亚群禽白血病(Avian leukosis，AL)是由A亚群禽白血病病毒(ALV-A)引起的 传染性肿瘤病，主要感染蛋鸡，引起蛋鸡体免疫力降低、生产性能下降，特别是蛋品质及 产蛋率降低。据报道，该病污染了国内很多的蛋种鸡场，并有一定的上升趋势，对我国养 禽业造成严重威胁，给我国养禽业造成巨大经济损失。
ALV属于单股、正链、线性RNA病毒，全长约7.2kb-7.8kb，其本身可直接作为mRNA编码蛋白质，病毒的基因组顺序从5'端至3'端依次为5'R-U5-gag-pol-env-U3-R3'。env基因编码ALV病毒粒子外周蛋白即囊膜蛋白中的gp37和gp85两种糖蛋白，杆状结构的gp37 和球状的gp85通过二硫键和其他非共价键结合后附着于病毒囊膜上，二者作用较弱，gp85 易从囊膜上掉下使病毒失去感染力。囊膜蛋白的差异决定了ALV亚群的特异性，且各亚 群的病毒env蛋白在不同细胞表面有其对应的受体，因此ALV的感染具有宿主特异性。
gp85含受体决定簇，决定禽白血病病毒的特异性及中和活性，利用该特点可以鉴定 分析病毒的亚型，亦可采用基因工程获取gp85蛋白来制作单抗及亚单位疫苗诱导易感动 物产生特异性抗体，为疾病防治提供了理论基础。
目前，对于A亚群禽白血病病毒感染可通过临床剖检和组织病理学检查初步诊断，进 一步确诊需要通过PCR，免疫组织化学，间接免疫荧光和ELISA等方法。PCR方法容易 受到很多因素干扰，并可能出现假阳性和假阴性结果；ELISA的方法目前前市场上尚未有 特异性检测ALV-A的成品试剂盒，现有的试剂盒为美国爱德士公司生产的ALV-A/B抗体 检测试剂盒，但是不能区分样品中抗体的具体类型；免疫组织化学和间接免疫荧光的方法 也需要高特异性的单克隆抗体。
鉴于以上研究现状，基于我国分离毒株制备高特异性的ALV-A病毒单克隆抗体成为 控制和检测我国鸡群ALV-A感染的当务之急。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体， 使所产生的单克隆抗体能够识别A亚群禽白血病病毒(ALV-A)gp85囊膜蛋白，可以用于研制诊断与治疗A亚群禽白血病的试剂或药物。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种杂交瘤细胞株，保藏编号为CGMCC NO.14290。
本发明所述杂交瘤细胞株由以下方法制备获得：
利用重组gp85蛋白免疫Balb/C小鼠，取免疫后小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合，再进行阳性克隆与亚克隆的筛选，最终筛选出一株能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为SDAU-ALV-A14GZ，并于2017年6月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院 微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.14290，分类命名为抗ALV-A阳性杂交瘤细胞株。
上述杂交瘤细胞在制备够识别A亚群禽白血病病毒gp85囊膜蛋白的单克隆抗体中的 应用也是本发明的保护范围。
本发明的第二方面，提供一种单克隆抗体，由保藏编号为CGMCC NO.14290的杂交瘤细胞株分泌产生。
所述单克隆抗体的亚型主要为IgM、IgG3。
所述单克隆抗体识别ALV-A gp85蛋白对应的第84aa-155aa区域。
所述单克隆抗体是由杂交瘤细胞株的培养液中获得；或用杂交瘤细胞株种植到实验动 物腹腔产生腹水而获得。本发明优选为：
(1)选取健康的未免疫的10周龄雌性Balb/c小鼠，于接种瘤细胞1-2周前腹腔注射液体石蜡，0.5mL/只；
(2)将贴壁生长的保藏编号为CGMCC NO.14290的杂交瘤细胞株吹打成单细胞悬液， 用DMEM基础培养基洗涤杂交瘤细胞株，低速离心后，计数并稀释杂交瘤细胞株至5×106个/mL；对处理后的小鼠缓慢多方向腹腔注射0.2mL细胞悬液；
(3)接种所述杂交瘤细胞株7-14天后产生腹水，收集腹水；
(4)将收集的腹水10000rpm离心10min，除去细胞成分及其他沉淀物，收集上清，之后用0.45μm的滤膜过滤，分装，冻存备用。
本发明制备的单克隆抗体只与ALV-A病毒反应，而不与ALV-J、ALV-B毒株反应， 特异性强。
基于此，本发明的第三方面，提供上述杂交瘤细胞株或单克隆抗体在制备检测ALV-A 病毒的试剂盒中的应用。
本发明的第四方面，提供一种检测ALV-A病毒的试剂盒，其含有有效量的上述单克隆抗体。
本发明的有益效果：
本发明经多次筛选和克隆得到了一株杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞株能够稳定、高效的 分泌单克隆抗体，并能实现大规模批量生产。该抗体可以广泛用作ALV-A鉴别诊断和ALV-A gp85蛋白识别研究，为A亚群禽白血病的临床鉴别诊断和实验室研究提供了物质 基础。
附图说明
图1：本发明筛选的杂交瘤细胞染色体鉴定结果；图中标尺为200μm。
图2：注射杂交瘤细胞后的Bal B/C小鼠。
图3：本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体的特异性检测结果；图中，A为单抗与ALV-A感染CEF细胞反应阳性，B单抗与ALV-B感染CEF细胞反应阴性，C为单抗 与ALV-J感染CEF细胞反应阴性。
图4：利用本发明的杂交瘤细胞制备的单抗IFA检测细胞内ALV-A的结果：图中，A为腹水单抗按1:100稀释后检测DF1细胞中ALV-A的阳性结果；B为腹水单抗按1:1000 稀释后检测DF1细胞中ALV-A的阳性结果；C为未加单抗检测DF1细胞中ALV-A的阴 性对照。
图5：利用本发明的杂交瘤细胞制备的单抗检测鸡心肌组织中ALV-A结果；(放大倍数400倍)。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有 指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理 解的相同含义。
正如背景技术中所介绍的，现有A亚群禽白血病诊断技术存在的诸多不足与缺陷。基 于此，本发明提供了一种能够稳定分泌识别A亚群禽白血病病毒的单克隆抗体的杂交瘤细 胞株，该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体可以广泛用作ALV-A鉴别诊断和ALV-A gp85蛋白识别研究，为A亚群禽白血病的临床鉴别诊断和实验室研究提供了物质基础。
在本发明的一个实施方案中，给出了所述杂交瘤细胞株的获得方法：ALV-A毒株gp85 基因的克隆及测序；重组gp85蛋白的表达和纯化；重组gp85蛋白免疫Balb/C小鼠；小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合，阳性克隆与亚克隆的筛选。
在杂交瘤细胞株的获得过程中，融合后的杂交瘤的筛选是最为繁琐和复杂的，融合后 的杂交瘤经HAT培养基培养一周后，然后将每个孔板中的细胞上清取出来，通过ELISA检测其是否分泌特异性抗体，抗体的分泌能力是否强，若检出阳性且分泌能力强的细胞，则需要将此阳性细胞进行多次亚克隆，才能得到阳性单克隆杂交瘤细胞株。在这一过程中，由于细胞变异和竞争，强阳性细胞很可能会被漏选，因此，获得能够持续、稳定、高效的 分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株的难度很大，且具有随机性和不可预测性。所以本发明将 获得的杂交瘤细胞株进行了生物保藏，保藏编号为CGMCC NO.14290。
该保藏编号为CGMCC NO.14290的杂交瘤细胞株具有如下特点：
(1)秋水仙素法检测该杂交瘤细胞内染色体的结果显示该杂交瘤细胞染色体的数目 应接近两种亲本细胞染色体数目的总和，即细胞染色体数目不少于101个。结果如图1所示。
(2)取10周龄雌性Blab/C小鼠，经腹腔注射液体石蜡处理后，注射该杂交瘤细胞。14d后即能观察到小鼠腹部明显膨大，有肿瘤和大量腹水产生，腹水内含有大量识别 ALV-A的抗体。
(3)IFA分析结果表明，该杂交瘤细胞株获得的分泌抗体和腹水抗体只能与ALV-A病毒反应，而不与ALV-J、ALV-B毒株反应。
(4)该杂交瘤细胞获得抗体亚型主要为IgM和IgG3以及少量IgG2b和IgG1。结果 见表1。
表1 制备单抗抗体亚型鉴定结果
IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 IgM
杂交瘤细胞分泌的上清单抗 + - + ++ +++
杂交瘤细胞制备的小鼠腹水单抗 + - + ++ +++
单克隆抗体的亚型类型影响抗体的纯化、应用范围和检测方法的灵敏度和稳定性。在 单抗纯化过程中，单抗亚型决定使用什么样的纯化方法获得特异性更高的蛋白抗体；在使 用单克隆抗体建立相应鉴别检测方法中，单抗亚型也决定了使用哪一种标记的二抗与相应 亚型单抗结合更特异、更灵敏、更稳定，如：用本发明杂交瘤细胞获得的单抗建立特异性 较高的间接荧光免疫分析法IFA、免疫组化和免疫蛋白印迹分析法Western-blot过程中， 使用标记的抗IgM或IgG二抗灵敏度会更高些、也会更稳定；而对建立特异性要求不是 非常高的ELISA方法，单抗的亚型种类不是要求很高，关键的是抗体的效价要足够高。另外，在用此抗体作治疗性或封闭性抗体试剂或药物时，由于不同亚型可能具有不同识别结合位点，具有多种亚型的单抗适用范围更广。本发明杂交瘤细胞获得的单抗亚型主要为IgM和IgG3以及少量IgG2b和IgG1，与现有报道的杂交瘤细胞分泌的单抗A5C1、A4C8 (“A亚群禽白血病病毒单克隆抗体的制备和不同亚群禽白血病病毒共感染相互影响的研 究”，山东农业大学博士论文，邱玉玉)相比，其分泌的单抗的亚型种类更多，单抗的适 用范围更广。
另外，本发明杂交瘤细胞获得的单抗能够特异的识别ALV-A gp85基因上自第252bp 至第465bp碱基序列对应的抗原氨基酸序列，即第84aa-155aa的抗原区域；其识别的抗原 表位也不同于现有报道的杂交瘤细胞分泌的单抗A5C1、A4C8。
综上，即使采用相同或相近的获得方法，所筛选得到的杂交瘤细胞株的生物学特征及 其分泌的单克隆抗体也会存在差异，特别是其分泌的单克隆抗体的识别位点、稳定性、效 价、应用范围等差别较大。与现有报道的能够分泌A亚群禽白血病病毒单克隆抗体的杂交 瘤细胞株相比，本发明的保藏编号为CGMCC NO.14290的杂交瘤细胞株能够更高效、稳定的分泌单克隆抗体，单克隆抗体的效价可达210以上；而且所分泌的单克隆抗体能特异 的识别ALV-A gp85基因上自第252bp至第465bp碱基序列对应的抗原氨基酸序列，即第 84aa-155aa的抗原区域；另外，单抗的抗体亚型种类更多，适用范围更广。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的 实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买 得到。
本发明实施例中所采用的方法未做详细说明的均为本领域现有技术。
实施例1：杂交瘤细胞株的制备
(1)采用常规的方法制备、纯化A亚群gp85重组蛋白；
(2)将纯化的A亚群gp85重组蛋白用灭菌PBS稀释至1.0mg/mL，腹腔注射免疫6 周龄雌性Blab/C小鼠，0.2mL/只，免疫四次。
将上述重组蛋白蛋白与完全/不完全弗氏佐剂等体积混合。一免后的第3w与第5w加 强免疫，所用蛋白剂量与一免相同。首免所用佐剂为完全弗氏佐剂，加强免疫时佐剂改用 不完全弗氏佐剂。三免后1w对小鼠尾静脉采血，分离血清，检测小鼠抗体水平。三免4w后加强免疫一次，3d后取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0(骨髓瘤细胞)进行细胞融合。
(3)融合前一天，选取健康的未免疫的6周龄Blab/C小鼠的脾脏细胞作为饲养层细胞，细胞密度在106个/mL，加到96孔细胞培养板中，100μL/孔，38.5℃，5％CO2培养箱 中培养。
饲养层细胞制备步骤如下
将小鼠脱颈法处死，浸泡于75％酒精中10min；取出小鼠仰卧固定于解剖板上，在超 净工作台中剪开小鼠左侧皮肤，换无菌眼科剪与眼科镊，取出脾脏除去被膜结缔组织，移 入盛有10mL 4℃预冷的DMEM基础培养基的平皿中，将脾脏剪碎，制成细胞悬液；用200目灭菌铜网过滤除去脂肪类组织及结缔组织类碎片，边过滤边用一次性10mL无菌注射器塞头轻轻研磨；用吸管反复吹打过滤后的细胞液，制成单细胞悬液，4℃，1000rpm离心8min；弃上清，加入10mL 4℃预冷的0.17M NH4Cl重悬脾细胞沉淀，4℃静置10min 溶解红细胞。溶解完毕后，4℃，1000rpm离心8min；弃上清，加入10mL 4℃预冷的DMEM 基础培养基，重悬后4℃离心；稀释后铺到96孔板上。
按照脾细胞：SP2/0细胞＝10：1的比例，取适量的SP2/0细胞与脾细胞充分混匀于灭 菌的50mL离心管中，1000rpm离心8min；弃上清，用移液器吸干残余液体，轻轻拍打 管底使细胞沉淀松散均匀；将离心管置于盛有37℃温水的烧杯中，用1mL吸管吸取预热 至37℃的50％PEG 1mL，以1mL/min的速度滴加于细胞沉淀上，边滴加边轻轻搅拌，滴 完后静置1min；以1mL/min的速度加入5mL预热至37℃的DMEM基础培养基，然后以 1mL/min的速度加入10mL的培养基，最后以较快的速度均匀滴加15mL的培养基，37℃ 静置10min；
1000rpm离心5min，弃上清；缓缓加入预热至37℃的HAT培养基，轻轻吹散沉淀使其悬浮并混匀，HAT培养基的用量按2×106个/mL脾细胞添加；将混匀后的细胞悬液加到 的96孔细胞培养板(每孔内已铺好100μL的饲养层细胞)中，100μL/孔，38.5℃，5％CO2培养箱中培养；换液：4d后更换半量HAT培养基，第10d～13d后更用HT培养基；之后 根据细胞增殖情况改用20％DMEM培养基；培养14d后，经常观察杂交瘤细胞的生长状 况，记录并及时检测，待杂交瘤细胞生长至每孔底面积1/3以上时，吸出细胞上清用于抗 体检测。
(4)阳性杂交瘤细胞的筛选、鉴定与克隆化培养
筛选方法如下：
(1)ELISA法初步筛选杂交瘤细胞
取出的杂交瘤细胞上清加到包被有纯化的A亚群gp85重组蛋白的ELISA板中，用免疫Blab/C小鼠的阳性血清和SP2/0细胞培养上清分别做阳性和阴性对照。ELISA法可以 对大量的融合细胞做初步筛选，将不能针对gp85重组蛋白抗原的杂交瘤细胞弃掉，减少 IFA法再次筛选时的工作量，节省时间和成本，提高筛选效率。具体方法如下：
1)包被：将纯化的gp85蛋白用1×碳酸盐缓冲液(pH＝9.6)稀释至5μg/mL，100μL/孔包被于96孔ELISA板中，4℃过夜孵育，次日用PBS’T洗板5次，甩干板内残余液体；
2)封闭：每孔加入200μL封闭液(0.5g脱脂奶粉溶解于20mLPBS’T中)，100μL每 孔，37℃孵育1h，同样方法洗板；
3)加一抗：分别加入待检杂交瘤细胞上清、免疫小鼠的阳性血清(将小鼠阳性血清按照1:102、1:103、1:104……1:108稀释后依次加入反应孔)和SP2/0细胞培养上清，100μL每孔，37℃孵育1h，同样方法洗板；
4)加二抗：每孔加入1:3000倍稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL每孔，37℃孵育1h， 同样方法洗板；
5)加底物：每孔加入TMB单组份底物显色液，100μL每孔，37℃孵育15min；
6)终止显色：每孔加入50μL 2M H2SO4终止液终止显色轻轻震荡混匀，OD450时读数。判定小鼠免疫后抗体水平及效价；将读数大于2.1倍阴性对照OD450值的杂交瘤孔细 胞标记，通过IFA法再次筛选。
(2)IFA法筛选杂交瘤细胞
将杂交瘤细胞上清作为一抗，FITC标记的羊抗鼠IgG作为二抗，与感染ALV-ASDAU09C1病毒的DF-1细胞反应
1)对细胞密度达到70％-80％的DF-1细胞接种ALV-A SDAU09C1病毒，当接毒的DF-1 细胞传至第3代时，将细胞均匀铺至24孔板中；
2)观察细胞的生长状态，待细胞状态良好，IDEXX ALV P27抗原检测试剂盒检测细胞 上清的S/P值大于1.5时，将24孔板取出用于IFA检测；
3)细胞的固定：弃掉细胞板内上层培养基，用PBS清洗1次，3min/次，加入固定液(丙酮：无水乙醇＝3:2)室温固定8min，弃掉固定液，用PBS清洗3次，3min/次；
4)用PBS将所选血清按1:8的倍数稀释，弃掉PBS后每孔加入稀释好的血清200μL，37℃孵育1h；
5)弃血清，用PBS清洗3次，3min/次，每孔加入200μL 1:200倍稀释的FITC标记的羊抗鸡二抗，37℃避光孵育1h；
6)弃二抗，用PBS清洗4次，3min/次，每孔加入200μL 50％甘油覆盖住底部细胞，避光，镜检。在蓝色荧光激发下，通过显微镜观察细胞质呈现绿色荧光者为阳性细胞。
经多次细胞融合、筛选，得到一株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为SDAU-ALV-A14GZ，并于2017年6月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏 编号为CGMCC NO.14290，分类命名为抗ALV-A阳性杂交瘤细胞株。
实施例2：利用杂交瘤细胞制备腹水抗体
(1)选取健康的未免疫的10周龄雌性Balb/c小鼠，于接种杂交瘤细胞1-2周前腹腔注射液体石蜡，0.5mL/只。
(2)将贴壁生长的杂交瘤细胞(保藏编号为CGMCC NO.14290)吹打成单细胞悬液，用DMEM基础培养基洗涤瘤细胞2-3次，低速离心后，计数并稀释瘤细胞至5×106个/mL。 对处理后的小鼠缓慢多方向腹腔注射0.2mL细胞悬液。
(3)注射杂交瘤细胞10d后，观察小鼠腹水产生情况(如图2所示)。若腹部明显 膨大，手指触摸时，皮肤有紧张感，即可用16号针头注射器缓缓抽取腹水。一般可连续 采2-3次，每次间隔2-3天，一次可抽取5mL左右。
(4)将收集的腹水10000rpm离心10min，除去细胞成分及其他沉淀物，收集上清，之后用0.45μm的滤膜过滤，分装，冻存备用。
实施例3：单克隆抗体的特异性检测
采用间接免疫荧光(IFA)检测实施例2制备的腹水抗体的特异性，步骤如下：
将鸡胚成纤维细胞(CEF)生长于96孔细胞培养板，待细胞长成单层后，分别用ALV-A、 ALV-B和ALV-J感染CEF细胞，感染5-7天后用冷丙酮-乙醇(6:4)固定5分钟，经PBS 洗涤1次，空气中干燥，-20℃保存作为检测用抗原。在进行IFA时，将待检测的腹水抗 体作适当稀释后滴加在感染病毒的96孔细胞培养板上，经37℃孵育30min后，用PBS洗 涤5遍，然后加入羊抗小鼠IgG荧光标记的抗体，继续孵育30min，用PBS洗涤5遍，最 后在荧光显微镜下进行观察，结果如图3所示。
由图3可以看出，实施例2制备的腹水抗体与ALV-A感染CEF细胞反应阳性，与 ALV-B和ALV-J感染CEF细胞均反应阴性。说明实施例2的腹水抗体能够特异的识别 ALV-A，具有很好的特异性。
实施例4：单克隆抗体的效价测定
采用间接ELISA方法检测实施例2制备的腹水抗体的效价，检测样品除腹水稀释液、 标准阴、阳性血清外，还应以SP2/0细胞的腹水作对照。判定标准为：阴性血清OD值＜0.2，阳性血清OD值＞1.0，S/N＞2.1时腹水抗体的最大稀释倍数为腹水的ELISA效价。
经检测，实施例2制备的腹水抗体的效价为1：212；与现有报道的杂交瘤细胞株相比， 腹水抗体的效价有了显著的提高。
实施例5：抗体分泌稳定性的测定
将实施例1中筛选得到的杂交瘤细胞株冻存，并分别在第3、6、9、12、18、24个月 复苏，至少传代3次以上，在显微镜下观察细胞生长状态和用间接ELISA法对杂交瘤细 胞株进行抗体分泌能力的测定。
结果表明，本发明的杂交瘤细胞株经冻存复苏后，抗体分泌能力在至少24个月内没 有任何的下降。
实施例6：检测血浆或血清内ALV-A
以保藏编号为CGMCC NO.14290的杂交瘤细胞上清作为一抗，FITC标记的羊抗鼠IgG作为二抗，检测血浆或血清内ALV-A。方法如下：
1)生长良好的鸡成纤维细胞(CEF)或DF1细胞均匀铺至细胞板或细胞板内的盖玻片 中。
2)待细胞生长至70％-80％，弃细胞上清，接种0.2-1.0mL血浆或血清，37℃孵育2h。
3)弃血浆或血清，用温育的无血清细胞培养基洗涤2次，换上含2％胎牛血清的细胞 培养基，维持3-5d。
4)细胞的固定：弃掉细胞板内上层培养基，用PBS清洗1次，3min/次，加入固定液(丙酮：无水乙醇＝3:2)室温固定8min，弃掉固定液，用PBS清洗3次，3min/次；
5)用PBS将制备的单克隆抗体按1:100或1:1000稀释后加入到细胞上，37℃孵育1h。
5)弃上清，用PBS清洗3次，3min/次，每孔加入200μL 1:200倍稀释的FITC标记的羊抗鼠二抗，37℃避光孵育1h；
6)弃二抗，用PBS清洗4次，3min/次，每孔加入200μL 50％甘油覆盖住底部细胞，避光，镜检。在蓝色荧光激发下，通过显微镜观察细胞质呈现绿色荧光者为阳性细胞，镜 检结果如图4所示。
实施例7：检测组织中的ALV-A
以保藏编号为CGMCC NO.14290的杂交瘤细胞上清作为一抗，FITC标记的羊抗鼠IgG作为二抗，检测组织中的ALV-A。具体方法如下：
1)固定：将取出的新鲜的组织如心脏分割成合适大小，浸于福尔马林溶液中固定至 少24h。
2)脱水：固定好的组织修成合适的小块，70％乙醇过夜，次日分别经：85％乙醇、90％ 乙醇、95％乙醇、100％乙醇(Ⅰ)、100％乙醇(Ⅱ)梯度脱水，每个梯度约30-40min。
3)透明、浸蜡：用二甲苯将脱水后的组织透明，时间视组织透明的程度而定，最后将组织浸于溶解的蜡杯中，置于70℃蜡箱中2h。
4)包埋：固定包埋框并倒入溶解的蜡液，用镊子将组织块依次放入热蜡中，冷却固定。
5)修块、切片：蜡块冷却成型后，用刀片切成规则的形状，石蜡切片机切片，将切好的片置于37℃的温箱中烘干，4℃保存备用。
6)心肌组织石蜡切片经脱蜡和抗原修复，用10％BSA 37℃封闭30min，弃去封闭液滴加杂交瘤细胞上清，37℃孵育1h；弃一抗，用PBS洗涤3次，滴加FITC荧光标记的羊 抗鼠二抗，37℃孵育1h；弃二抗，用PBS洗涤3次，50％甘油封片。荧光显微镜下观察 细胞质呈绿色荧光者为阳性细胞，如图5所示。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人 员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、 等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，保藏编号为CGMCC NO.14290。
2.保藏编号为CGMCC NO.14290的杂交瘤细胞株在制备识别A亚群禽白血病病毒gp85囊膜蛋白的单克隆抗体中的应用。
3.一种单克隆抗体，其特征在于，由保藏编号为CGMCC NO.14290的杂交瘤细胞株分泌产生。
4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的亚型包括：IgM和IgG3。
5.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体识别ALV-A gp85蛋白对应的第84aa-155aa区域。
6.权利要求3-5任一项所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)选取健康的未免疫的10周龄雌性Balb/c小鼠，于接种瘤细胞1-2周前腹腔注射液体石蜡；
(2)将贴壁生长的保藏编号为CGMCC NO.14290的杂交瘤细胞株吹打成单细胞悬液，用DMEM基础培养基洗涤杂交瘤细胞株，低速离心后，计数并稀释杂交瘤细胞株至5×106个/mL；对处理后的小鼠缓慢多方向腹腔注射0.2mL细胞悬液；
(3)接种所述杂交瘤细胞株7-14天后产生腹水，收集腹水；
(4)将收集的腹水10000rpm离心10min，收集上清，之后用滤膜过滤，分装，冻存备用。
7.权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求3所述的单克隆抗体在制备检测ALV-A病毒的试剂盒中的应用。
8.一种检测ALV-A病毒的试剂盒，其特征在于，含有有效量的权利要求3-5任一项所述的单克隆抗体。
CN201810188948.2A 2017-11-21 2018-03-08 一种杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体和应用 Expired - Fee Related CN108330101B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711161949 2017-11-21
CN201711161949X 2017-11-21

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108330101A true CN108330101A (zh) 2018-07-27
CN108330101B CN108330101B (zh) 2021-04-16

Family

ID=62928860

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810188948.2A Expired - Fee Related CN108330101B (zh) 2017-11-21 2018-03-08 一种杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108330101B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110117573A (zh) * 2019-04-15 2019-08-13 河北省科学院生物研究所 一种无血清细胞培养基及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050015039A1 (en) * 2003-01-29 2005-01-20 Karl Salzwedel Inhibition of HIV-1 replication by disruption of the processing of the viral capsid-spacer peptide 1 protein
CN102304181A (zh) * 2011-10-24 2012-01-04 山东农业大学 一种j亚群禽白血病病毒表面蛋白的单克隆抗体及其制备方法
CN102636644A (zh) * 2012-04-18 2012-08-15 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 检测禽白血病群特异性抗原的双抗体夹心elisa试剂盒
CN105198986A (zh) * 2015-09-10 2015-12-30 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体，包含该单克隆抗体的金标试纸条及应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104096241B (zh) * 2014-07-19 2017-01-25 青岛易邦生物工程有限公司 一种a亚群禽白血病病毒基因工程亚单位疫苗
CN104548087B (zh) * 2014-12-26 2017-03-22 山东农业大学 一种抗a/b亚群禽白血病病毒感染的表位疫苗及其制备方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050015039A1 (en) * 2003-01-29 2005-01-20 Karl Salzwedel Inhibition of HIV-1 replication by disruption of the processing of the viral capsid-spacer peptide 1 protein
CN102304181A (zh) * 2011-10-24 2012-01-04 山东农业大学 一种j亚群禽白血病病毒表面蛋白的单克隆抗体及其制备方法
CN102636644A (zh) * 2012-04-18 2012-08-15 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 检测禽白血病群特异性抗原的双抗体夹心elisa试剂盒
CN105198986A (zh) * 2015-09-10 2015-12-30 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体，包含该单克隆抗体的金标试纸条及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DANDAN ZHANG等: "Antibody responses induced by recombinant ALV-A gp85 protein vaccine combining with CpG-ODN adjuvant in breeder hens and the protection for their offspring against early infection", 《ANTIVIRAL RESEARCH》 *
邱玉玉等: "一株A 和B 亚群禽白血病病毒特异性单克隆抗体的制备及其特性", 《中国免疫学杂志》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110117573A (zh) * 2019-04-15 2019-08-13 河北省科学院生物研究所 一种无血清细胞培养基及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN108330101B (zh) 2021-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101768218B (zh) 猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法、抗体及应用
CN106434568A (zh) 一种抗猪流行性腹泻病毒s蛋白杂交瘤细胞株及其应用
CN104877968B (zh) 高效分泌抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞a135株
CN1560081A (zh) 用能产生人IgGl重链－κ轻链小鼠作为制备人源化单克隆抗体和应用
CN101793897A (zh) 一种提高杂交瘤筛选效率的方法
CN107449912A (zh) 抗h7n9亚型禽流感病毒单克隆抗体抗原表位及其筛选方法和应用
CN114149497A (zh) 猪细小病毒中和性单克隆抗体及制备方法和应用
CN103923881B (zh) 甲肝病毒单克隆抗体及其应用
CN108330101A (zh) 一种杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体和应用
CN112608384A (zh) 一种抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体的制备方法及其应用
AU603774B2 (en) Specific mycoplasma membrane antigen and antibody and their clinical applications
CN101322844A (zh) 无病毒非结构蛋白的口蹄疫疫苗及其制备方法
CN105132376B (zh) 一个能特异性识别HBsAg多个抗原表位的单克隆抗体及其应用
CN110452884B (zh) 抗BCoV-N蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系及抗体和应用
CN114409776A (zh) 一种鸡毒支原体单克隆抗体的制备方法
CN104357400B (zh) 一种Sabin株脊髓灰质炎Ⅰ型病毒单克隆抗体及其应用
CN109709330B (zh) 一种口蹄疫病毒竞争elisa检测试剂盒
CN105368786B (zh) 分泌鸭1型甲肝病毒亚型单克隆抗体的杂交瘤细胞株
CN110452883A (zh) 禽白血病p27蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用
CN111995673A (zh) 登革病毒抗原的快速检测试纸
CN115094044B (zh) 一种产生犬冠状病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及单克隆抗体及应用
CN210856160U (zh) 一种单克隆抗体筛选平台
CN115094043B (zh) 一种用于犬冠状病毒与犬细小病毒的杂交瘤细胞株及单克隆抗体和应用
CN105925538A (zh) 杂交瘤细胞株及其产生的抗合成大麻单克隆抗体和应用
CN112898419B (zh) 用于检测高致病性prrsv的单克隆抗体及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20210416