CN1616478A - p27蛋白的表达及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及禽白血病相关的p27蛋白的原核表达及其应用。本发明通过设计的特异性引物构建了新的重组表达质粒，从而在原核细胞中成功地表达出高水平高纯度的p27蛋白。

Description

P27蛋白的表达及其应用

技术领域

本发明涉及禽白血病病毒P27蛋白的表达以及所述蛋白的应用。

背景技术

禽白血病(Avian Leukosis)是由禽白血病病毒和禽肉瘤病病毒群中的病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称^[1]。禽白血病是禽类的常见病，目前没有疫苗，也没有有效的抗病毒药，常通过净化措施，培育无白血病鸡群。

禽白血病病毒可以垂直或水平传播，给养鸡业生产造成很大危害，国内兽医、人医生物制品厂生产的数种禽胚源疫苗和禽胚源细胞苗，均以鸡胚为原材料，若不通过禽白血病抗原的检测，引起病毒的扩散与再感染，其危害可想而之。并且涉及到人类的公共卫生问题。

目前用琼脂扩散方法，检测抗原，也有用补体结合试验方法、萤光法、酶联法，这些方法仅限于在实验室研究，在敏感性、特异性、稳定性等方面均有一些问题，停留在研究阶段，所以不能应用于生产中检测，目前尚缺乏有效的检测手段。

P27基因是禽白血病病毒不同亚群之间的一段高度保守的基因。p27蛋白是病毒核心外壳的主要成分，有许多易于检测的病毒抗原，是制备群特异性抗体的首选抗原。

已经克隆了p27和gag基因(祝晓春陈福勇常建宇《中国兽医杂志》2001年(第37卷)第8期，8-10页)。

禽白血病病毒的繁殖是一项相当繁琐的工作，目前尚无专一适用的细胞系用于该病毒的繁殖。制备方法无论是用细胞繁殖还是接种鸡体制备血浆毒都存在着成本高、产量低、耗时、操作繁杂、纯度不高等问题。

本发明人经过多年研究成功地对p27蛋白进行了原核表达，相对于已有的真核表达而言，本发明表达外源基因成本低、产量高、安全、易纯化、纯度高而且简便易行。

发明内容

因此，本发明的目的之一是提供P27蛋白的表达。具体而言，本发明人在已克隆的p27基因的基础上，根据已发表的AMV BAI-A株的基因序列设计了一对特异性引物，以重组质粒pGEM-gag为模板，采用PCR法对p27基因进行亚克隆，构建重组质粒pGEM-p27。对重组质粒PGEM-p27和表达载体pET-28α进行双酶切，回收酶切产物，连接构建重组表达质粒。将构建成功的重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，筛选含重组质粒的基因工程菌。重组工程菌经IPTG诱导得到高效表达，其细胞裂解物用SDS-PAGE及Western blotting进行检测。用Ni-NTA亲和层析法纯化表达蛋白，经SDS-PAGE方法及Westernblotingt检测，分析纯化，获得了高纯度的p27蛋白。所述蛋白的纯度大于97％，蛋白浓度约为0.53mg/ml。高纯度p27蛋白的获得，为p27单抗的制备，重组p27蛋白结构的探讨奠定了基础。本发明制备的P27蛋白的分子量约为30KD。制备的P27目的基因片段的大小约为800bp。

本发明的另一目的是提供P27蛋白作为诊断抗原的应用，从而解决了禽白血病抗原繁殖的难题。

本发明的目的是用纯化的表达蛋白免疫家兔，获得高效价的抗p27单特异性多克隆抗体，从而可用作各种诊断抗体。

本发明还提供了含有本发明表达蛋白的诊断试剂盒。可用于检测正常健康的原种、曾祖代、祖代、新培育的新品种、国家各地方的地方品种鸡群，是否在体内血液、器官、粪便及鸡蛋中携带鸡白血病病毒。检测国内兽医、人医生物制品企业生产的各种来源于鸡源为原材料生产的活疫苗，是否携带外原鸡白血病病毒。检测市场上流通的各种进口禽用疫苗，是否携带鸡白血病病毒。检测国内无特定病原微生物(SPF)鸡场生产的产品，是否携带外原性鸡白血病病毒。以及应用于科学研究等。

附图说明

图1是重组表达质粒(pET28α-p27)的PCR鉴定结果。其中1：未加模板的对照；2：初步鉴定为阳性克隆的PCR扩增结果；3：λDNA/EcoRI+HindIII(21226bp，5148bp，2027bp，1584bp，1375bp，947bp，831bp，564bp)

图2是重组表达质粒(pET28α-p27)的双酶切鉴定结果。1：重组表达质粒的双酶切鉴定；2：λDNA/EcoRI+HindIII(21226bp，5148bp，4268bp，2027bp，1584bp，1375bp，947bp，831bp，564bp)。

图3表明表达产物经15％SDS-PAGE电泳表明表达的融合蛋白的分子量与预期的结果相符。经Alphar Imager进行光密度扫描分析，目的蛋白的表达量占总菌体蛋白约25.3％。1：阴性对照：含有空载体pET28α(+)的BL21(DE3)的表达产物；2：低分子量标准蛋白Maker(97.4KD，66.2KD，43KD，31KD，20.1KD，14.4KD)；3：诱导3小时的表达产物；4：诱导3小时的表达产物；5：诱导4小时的表达产物；6：诱导5小时的表达产物

图4是表达菌超声裂解后的SDS-PAGE分析图。重组工程菌诱导表达后，离心收集菌体，将菌体进行超声裂解，超声裂解后上清液中重组蛋白的含量为22.1％，沉淀中的含量为20.7％。1.超声裂解后的上清液；2.超声裂解后的沉淀；3.低分子量标准蛋白Maker；3.诱导表达产物；4.诱导表达产物。

图5是纯化产物的SDS-PAGE分析图。裂解的菌体上清用镍鏊合剂亲和层析，在不同咪唑浓度的洗脱条件下，进行重组蛋白的纯化。SDS-PAGE电泳的结果显示，仅在分子量约30KDa处有一条清晰的目的蛋白带，而且只有在咪唑浓度为80mM和100mM的洗脱液中含高纯度的目的蛋白，其纯度大于97％，用紫外吸收法测得蛋白的浓度约为0.53mg/ml。其中1：穿透液；2：NTA-0洗脱液；3：NTA-20洗脱物；4：NTA-40洗脱物；5：NTA-60洗脱物；6：NTA-80洗脱物；7：NTA-100洗脱物；8：低分子量标准蛋白Maker；9：NTA-200洗脱物；10：NTA-1000洗脱物。

图6是表达产物的Western印迹分析图。其中1：低分子量标准蛋白Maker(97.4KD，66.2KD，43KD，31KD，20.1KD)；2：经诱导表达后的菌体蛋白。

图7是抗血清的Western印迹分析图。其中1：Western印迹结果；2：低分子量标准蛋白Maker(97.4KD，66.2KD，43KD，31KD，20.1KD)。

图8为使用本发明p27蛋白的检测试剂盒的示意图。

以下通过是实施例进一步说明本发明，实施例仅仅是说明性的，而不以任何方式限制权利要求的保护范围。

实施例

实施例1 P27蛋白制备工艺

1重组工程菌的制备

构建用于表达p27蛋白的重组工程菌，所用的表达载体是pET28α，宿主菌是大肠杆菌BL21(DE3)。

(1)重组工程菌的构建过程

①待插入的目的片断的制备

a)重组质粒pGEM-Teasy/p27的双酶切：

以BmaHI和SalI对重组质粒pGEM-Teasy/p27进行双酶切，反应体系如下：

总反应体系为             50μl

BmaHI                    2μl

SalI                     2μl

10×T缓冲液              7.5μl

底物DNA                  20μl

灭菌水                   18.5μl

以上各组分混匀，短暂离心后，于37℃温育6小时。

b)酶切产物的回收：

琼脂糖凝胶电泳酶切产物。

          ↓

将凝胶取出置于Alpha Imager进行观察，并成像。

          ↓

紫外灯下切下含目的片段的凝胶，分别装入已称量过的离心管。

          ↓

按照DNA快速回收试剂盒的操作步骤，回收目的片断。

②载体pET-28α(+)的双酶切：

对载体做与(1)相同的酶切处理。

酶切结束后补水至100μl，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，乙醇沉淀洗涤后，-20℃保存备用。

③酶切片段与质粒载体的连接：

经BamHI和SalI双酶切的p27基因，插入到同样经同样双酶切的表达载体pET-28α(+)中，用T₄DNA连接酶连接构建成重组质粒pET28α-p27。反应体系如下：

在0.5ml微量离心管中依次加入下列成分：

10×Ligation缓冲液        2μl

pET-28α(+)(50ng)         1μl

p27               9μl(依据回收的p27的浓度而定)

T₄DNA连接酶      1μl

加水至终体积为    20μl

混匀后瞬时离心后，16℃连接12小时，而后于4℃连接24小时或更长时间。

④连接产物的转化：

a.从-80℃低温冰箱中取出感受态细胞JM109，迅速冰浴化开。

b.取10μl连接产物加入100μl感受态细胞内，轻轻混匀，冰浴30分钟。

c.42℃热激90秒，期间勿摇离心管。

d.迅速冰浴5分钟。

e.加入800μl SOC培养基，混匀。160rpm，37℃复壮1小时。

f.取100μl振摇培养物涂布于含Kana(终浓度为30μg/ml)的LB平板上，37℃放置至液体被吸收。

g.倒置平板，于37℃培养12小时。

⑤阳性克隆的鉴定：

重组质粒鉴定的方法很多，本试验选用了限制性内切酶酶切和PCR的方法对阳性克隆进行鉴定。

a.重组质粒的提取：

按照前述方法进行重组质粒的小抽提

b.PCR扩增法鉴定重组质粒：

对提取的重组质粒进行1∶100稀释，用前述方法进行PCR扩增、回收。并用1.2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，在约800bp处有一特异性目的带的质粒，初步确定为阳性重组质粒。

c.双酶切法鉴定：

a)挑取1个阴性菌落和初步鉴定为阳性的菌落，分别接种于1.5ml含Amp的LB液体培养基中，37℃振摇培养16小时。

b)采用上述碱裂解法提取质粒。

c)对提取的质粒进行酶切鉴定。

选用BmaHI和SalI对所提质粒进行酶切鉴定，所加样品如下：

总反应体系为            20μl

BmaHI                   1μl

SalI                    1μl

10×T缓冲液            3μl

底物DNA                15μl

加水至终体积为         20μl

以上各组分混匀，短暂离心后，于37℃温育4小时。

d.)酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，将凝胶取出置于Alpha Imager进行观察，并成像。

f.重组表达工程菌的构建：

将筛选的阳性克隆转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，筛选阳性菌落。

(2)所需材料和试剂

①性内切酶：BamHI和SalI

②DNA纯化回收试剂盒

③T4DNA连接酶

④载体和宿主菌：表达载体pET-28α(+)及其宿主菌BL21(DE3)

⑤大肠杆菌感受态细胞的制备及转化所用溶液

a.0.1M CaCl2：2.94g CaCl2·2H2O溶解于200ml灭菌去离子水中。

b.SOB液体培养基：在950ml去离子水中加入胰蛋白胨20g，酵母提取物5g，NaCl 0.5g，完全溶解后，加入250mmol/L KCl溶液100ml，用5mol/LNaOH溶液调节PH值至7.0，加去离子水定容到1L，高压灭菌30分钟，使用前加入经0.22μm过滤除菌的2M Mg2+(1M MgCl2，1M MgSO4)。

c.SOC液体培养基：SOB培养基1L经高压灭菌，冷却后，加入10ml经0.22μm滤膜除菌的3M葡萄糖溶液。

d.LB液体培养基胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，溶解于950ml去离子水中。溶解后，用10M NaOH调节PH到7.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌，贮存于4℃。

e.卡那霉素(Kana)贮存液，30mg/ml：300mg卡那霉素溶于10ml灭菌水中，过滤除菌，-20℃分装备用。

f.氨苄青霉素(Amp)贮存液，20mg/ml：200mg氨苄青霉素溶于10ml灭菌水中，过滤除菌，-20℃分装备用。

g.含抗生素的LB固体培养基：在1L LB液体培养基中加入15g琼脂粉，融化后高压灭菌。待冷却至约50℃左右，加入抗生素至所需的终浓度，倒制琼脂板。

⑥提取质粒DNA所用的溶液

a.STE液：1.17g  NaCl

         2ml    1M Tris·Cl(PH8.0)

         0.4ml  0.5M EDTA(PH8.0)

加入160ml双蒸水溶解混匀，定容至200ml。

b.溶液I：0.99g葡萄糖

         2.5ml  1M Tris·Cl(PH8.0)

         2ml    0.5M EDTA(PH8.0)

溶于80ml灭菌水中溶解混匀，定容至100ml，10磅高压灭菌20分钟，4℃保存备用。

c.溶液II：0.2M  NaOH(使用前用10M贮存液现用现稀释)

          0.1％ SDS(制成10％溶液现用现稀释)

d.溶液III：60ml 5M KAC

           11.5ml冰乙酸

溶于28.5ml水，定容至100ml，此溶液无需灭菌。

e.溶菌酶：购自北京新经科公司。用蒸馏水配制成50mg/ml的溶液，贮存于20℃。

⑥TE缓冲液(PH8.0)：1ml 1M Tris·Cl(PH8.0)和0.2ml 0.5M EDTA(PH8.0)混合，定容到100ml。

⑦RNAase贮存液(10mg/ml)：将10mg RNAase溶于1ml的10mM Tris·Cl(PH7.5)及15mM NaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份，冻存于-20℃。

f.苯酚：氯仿：异戊醇：

Tris饱和酚(PH＞7.5)静置分层后吸下层溶液  25ml

氯仿                                     24ml

异戊醇                                   1ml

充分混匀，上层覆盖0.1M Tris·Cl(PH8.0)，装于棕色瓶中，4℃保存备用。

⑦琼脂糖凝胶电泳所用溶液：

a.50×TAE(Tris-乙酸)：

Tris碱                      121g

冰乙酸                      28.55ml

0.5M EDTA(PH8.0)            50ml

加双蒸水混合，定容至500ml，工作液浓度为1×TAE

b.10mg/ml溴化乙锭(EB)贮存液：100mg EB溶于10ml双蒸水中，剧烈搅拌，完全溶解后，室温下闭光保存。

c.1.2％琼脂糖凝胶：1×TAE 100ml加入1.2g琼脂糖加热熔化后加入5μl EB(10mg/ml)混匀，室温放置。

d.6×凝胶加样缓冲液：

溴酚兰                      0.025g

二甲苯青FF                  0.025g

甘油                        3ml

加入一定量去离子水溶解，定容到10ml，分装。

(3)阳性克隆的鉴定结果

①重组表达质粒pET28α-27的PCT鉴定。将提取的质粒pET28α-p27作1∶100稀释，用前述方法进行PCR扩增，同时设不含模板的阴性对照。电泳PCR产物，扩增的片段与预期分子量(约800bp)大小一致的质粒初步鉴定为阳性重组质粒。结果见图1。

②重组表达质粒pET28α-27的双酶切鉴定。重组质粒(pET28α-p27)经BamHI及SalI双酶切后，电泳可见到两条大小分别为5.4kb和800bp的条带，与预期结果相符。结果见图2。

实施例2 p27基因的诱导表达及表达产物的纯化

1.p27基因的诱导表达：

(1)表达过程

①挑选生长良好的阳性单菌落接种于3ml LB(含30μg/ml Kana)培养基中，37℃过夜培养。

②取出0.05ml接种到5ml LB(含30μg/ml Kana)培养基中，30℃培养2～3小时(OD600至0.4～0.6)。

③加入IPTG至终浓度为3mM，30℃诱导表达5小时。

④4℃ 5000rpm离心10分钟，弃去培养液，收集细菌沉淀，-20℃保存。

(2)表达所用的试剂

①卡那霉素(Kana)贮存液(30mg/ml)：300mg卡那霉素溶于10ml灭菌水中，过滤除菌，-20℃分装备用。

②LB液体培养基胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，溶解于950ml去离子水中。溶解后，用10M NaOH调节PH到7.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌，贮存于4℃。

③含Kana的LB固体培养基：在1L LB液体培养基中加入15g琼脂粉，融化后高压灭菌。待冷却至约50℃左右，加入Kana至终浓度为30ug/ml，倒制琼脂板。

④IPTG(1M)：2.38g IPTG溶解于10ml灭菌水中，过滤除菌，分装，-20℃保存备用。

2.诱导表达菌的超声裂解：

(1)超声裂解的过程：

①取200ml细菌培养物，12000rpm/分钟，离心5分钟，弃上清。

②用10ml NTA-0缓冲液重悬沉淀。

③加入一定量的PMSF至终浓度为1mM。

④加入一定量的溶菌酶(终浓度为0.2mg/ml)。

⑤混匀，冰上放置30分钟。

⑥超声波裂解菌体。

⑦加入10％TritonX-100(终浓度为0.05％)，充分混匀，冰上放置15分钟，冰浴超声破碎细胞。

⑧加入1M MgCl2至终浓度为1mM，混匀。

⑨室温放置10分钟，12,000转/分钟，4℃离心20分钟。

⑩分别取1ml上清和1ml细菌培养物的沉淀。分别加入100μl SDS上样缓冲液，混匀，煮沸5分钟。取15μl样品做SDS-PAGE。

(2)所需试剂

①PMSF：称取0.35g PMSF溶于10ml无水乙醇中，配制成200mM储存液，于-20℃中保存(注意：PMSF见水分解，需要在使用前加入)。

②溶菌酶：称取10mg溶菌酶溶于10ml蒸馏水中，分装成小管，于-20℃中保存。

③10％Triton X-100：量取10ml Triton X-100，加入80ml蒸馏水，混匀，使TritonX-100完全溶于蒸馏水中，然后用蒸馏水定容到100ml，室温保存。

④1M MgCl2：称取20.3g MgCl2·6H2O溶于90ml蒸馏水中，混匀，加蒸馏水定容到100ml，室温保存。

3.表达产物的纯化

(1)纯化过程

以表达p27蛋白的重组工程菌BL21(DE3)的裂解上清为材料，参照上海申能博彩生物科技有限公司的“SNBC 3S NTA Resin使用方法”，对表达的融合蛋白进行活性纯化。

①将1ml NTA树脂装入层析柱，静置。

②用10ml NTA-0 buffer平衡层析柱。

③取4ml菌体裂解上清加到NTA层析柱中，流速控制在15ml/小时左右，收集穿透部分，标记为“穿透液”。

④用5ml NTA体积的NTA-0缓冲液洗脱，流速控制在30ml/小时左右。

⑤依次用5ml NTA-20，NTA-40，NTA-60，NTA-80，NTA-100，NTA-200，NTA-1000缓冲液洗脱，流速控制在15ml/小时左右。收集洗脱液，每管收集1ml。

⑥将收集的样品，进行SDS-PAGE分析，确定目的蛋白在洗脱液中的分布情况。

⑦测定纯化蛋白的OD260和OD280，并计算蛋白浓度。通过紫外吸收法测定蛋白浓度的计算公式为：蛋白质浓度(mg/ml)＝1.45 OD280-0.74OD260

(2)所需的试剂

①纯化填料：SNBC 3S NTA Resin，购自上海申能博彩生物科技有限公司。

②1M咪唑：称取6.81g咪唑溶于100ml蒸馏水中，室温保存。

③NTA-0Buffer：20mM Tris-Hcl(pH7.9)，0.5M NaCl，10％丙三醇。

④NTA-20Buffer：20mM Tris-Hcl(pH7.9)，0.5M NaCl，10％丙三醇，20mM咪唑

⑤NTA-40Buffer：20mM Tris-Hcl(pH7.9)，0.5M NaCl，10％丙三醇，40mM咪唑

⑥NTA-60Buffer：20mM Tris-Hcl(pH7.9)，0.5M NaCl，10％丙三醇，60mM咪唑

⑦NTA-80Buffer：20mM Tris-Hcl(pH7.9)，0.5M NaCl，10％丙三醇，80mM咪唑

⑧NTA-100Buffer：20mM Tris-Hcl(pH7.9)，0.5M NaCl，10％丙三醇，100mM咪唑

⑨NTA-200Buffer：20mM Tris-Hcl(pH7.9)，0.5M NaCl，10％丙三醇，200mM咪唑

⑩NTA-1000Buffer：20mM Tris-Hcl(pH7.9)，0.5M NaCl，10％丙三醇，1000mM咪唑

4.表达产物及纯化产物的SDS-PAGE电泳检测

(1)电泳过程

①电泳样品的制备：

a.取2ml菌液，12,000g离心2分钟，去上清，加入100μl灭菌去离子水，悬浮沉淀。加入等体积的2×SDS上样缓冲液，混匀，煮沸5分钟。

b.取20ul纯化产物，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，混匀，煮沸5分钟。

②成胶液的配制：

表15％分离胶(10ml)和5％浓缩胶(5ml)的配制比例：

         H2O(ml  I 液    II液     III液   IV液   V液   VI液

         )      (ml)     (ml)     (ml)    (μl)  (μl) (μl)

分离胶   3.3     4        2.5     ——        100    100   4

浓缩胶   3.4     0.830    ——        0.630   50     50    5

各组分按表中所给的量混合，配制成10ml 15％的分离胶注入玻璃板间(梳子离胶面的距离约为1cm)，用灭菌去离子水盖住胶面，放置，使胶凝聚。待分离胶凝固后，吸干胶面上的水，加入配好的浓缩胶，装上梳子。

③待浓缩胶凝固后，拔出梳子，加满电泳液并进行加样。

④上样：取20μl处理好的样品，并加入蛋白分子量标准和阴性对照。

⑤电泳：由负极泳向正极，初期电压控制在160V，当样品浸入到分离胶后，加大电压至180V。当溴酚蓝指示剂到达胶板底部1cm时停止电泳，关闭电源。

⑥染色：用5倍体积的染色液浸泡凝胶，染色30分钟，回收染色液。

⑦脱色：将凝胶置于脱色液中，脱色期间更换脱色液数次，直至有清晰条带出现。

⑧与标准蛋白条带比较，看有无目的条带的出现。用Alphar Imager进行光密度扫描分析，确定目的蛋白的含量。

(2)凝胶试剂的配制

①I液30％丙烯酰胺(W/V)：将30g丙稀酰胺和0.8克甲叉双丙烯酰胺，溶于100ml灭菌去离子水中，PH值不能超过7.0，过滤，于棕色玻璃瓶中4℃保存。

②II液1.5M Tris·Cl缓冲液(PH8.8)：将18.17克Tris碱溶于80ml去离子水中，加入约3ml的浓盐酸调节PH至8.8，定容至100ml。

③III液1M Tris·Cl缓冲液(PH6.8)：将12.1克Tris碱溶于80ml去离子水中，加入约7ml的浓盐酸调PH至6.8，定容至100ml。

④IV液10％SDS(W/V)：将10g SDS溶于100ml去离子水中，加热助溶。

⑤V液10％过硫酸铵(W/V)：0.1克过硫酸铵溶于1ml去离子水中，现用现配。

⑥VI液TEMED原液。

⑦10×电极缓冲液(PH8.3)：将30.3克Tris、144.2克甘氨酸和10克SDS，溶于去离子水并定容至1L，使用时10倍稀释。

⑧2×SDS样品缓冲液：将500mg SDS、10ml巯基乙醇、3ml甘油、4mg溴酚蓝和2ml 1M Tris·Cl(PH6.8)，用去离子水定容到10ml，小份分装，-20℃保存。

⑨染色液：0.25克考马斯亮蓝R250溶于45ml甲醇、45ml水以及10ml冰醋酸的混合液中，溶解后用滤纸过滤，以除去颗粒状物质。

⑩脱色液：醋酸100ml，甲醇250ml，加水650ml，混匀使用。

(3)蛋白表达及纯化结果

①表达产物经15％SDS-PAGE电泳表明表达的融合蛋白的分子量与预期的结果相符。经Alphar Imager进行光密度扫描分析，目的蛋白的表达量占总菌体蛋白约25.3％。结果见图3。

②重组工程菌诱导表达后，离心收集菌体，将菌体进行超声裂解，超声裂解后上清液中重组蛋白的含量为22.1％，沉淀中的含量为20.7％。结果见图4。

裂解的菌体上清用镍鏊合剂亲和层析，在不同咪唑浓度的洗脱条件下，进行重组蛋白的纯化。SDS-PAGE电泳的结果显示，仅在分子量约30KDa处有一条清晰的目的蛋白带，而且只有在咪唑浓度为80mM和100mM的洗脱液中含高纯度的目的蛋白，其纯度大于97％，用紫外吸收法测得蛋白的浓度约为0.53mg/ml。结果附图5。

5.诱导表达产物的Western印迹检测

(1)Western印迹过程：

①取1ml诱导表达的菌液，12000rpm/分钟离心5分钟，弃上清，加入50μl灭菌去离子水，悬浮沉淀。加入等体积的2×SDS上样缓冲液，混匀，煮沸5分钟。取15μl样品加样，进行SDS-PAGE电泳。

②准备转印条件，如转印缓冲液(4℃存放)，硝酸纤维素膜(NC膜)，滤纸等。

③SDS-PAGE电泳完毕后，取出凝胶，除去浓缩胶，并切去下方一小角作为标记。带上手套，按胶的尺寸大小剪取NC膜，同样切去NC膜的一小角作为标记。将切好的凝胶块、NC膜、滤纸在转印缓冲液中浸泡30分钟。按照海绵垫-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-海绵垫的结构，装入转印夹中，各层间不能有气泡。

④凝胶一侧接负极，NC膜一侧接正极。

⑤加入转印缓冲液，将电泳槽置于冰浴中并加磁力搅拌器搅拌，200mA恒流转印1小时。

⑥转印结束后，将电泳凝胶放入考马斯亮蓝染色液中染色，以检测转印是否完全。

⑦按加样孔的位置，剪下分子量标准的膜条，用氨基黑染色，观察转印效果。NC膜其余部分置于封闭液中，室温振摇1小时。

⑧封闭后的NC膜置于用封闭液按一定比例稀释的酶标兔抗p27多抗中，室温振荡2小时。

⑨用TBS洗涤NC膜6次，每次10分钟。

⑩最后将NC膜浸到底物溶液中显色，出现颜色时，立即用蒸馏水冲洗来终止反应。NC膜可夹在两张滤纸间避光保存。用染色好的标准分子量凝胶条带与NC膜一起拍照。

(2)Western印迹试剂：

①转印缓冲液：甘氨酸14.4克，Tris碱3克，甲醇200ml，加蒸馏水至总量为1L。

②封闭液：5％的脱脂乳。

③洗涤液TBS：20mmol/L Tris(PH 7.5)，150mmol/LNaCl。

④15％的氨基黑(10B)染色液：0.15g氨基黑，25ml甲醇，10ml冰醋酸，65ml蒸馏水。

⑤氨基黑脱色液：20％甲醇，7％乙酸。

⑥辣根过氧化物酶标兔抗p27多抗：来自美国IDEXX公司的禽白血病抗原ELISA检测试剂盒。

⑦HRP反应缓冲液(SAB)：0.05mol/L NaAC(PH5.0)。

⑧HRP显色溶液(现用现配)：20ml 0.05mol/L NaAC(PH5.0)，10mg二氨基联苯胺(DAB)，10μl H₂O₂。

(3).结果，见附图6。序列2蛋白质的总氨基酸数为280，MW＝29850；Max ORF：1-840，280AA，MW＝29850

实施例3兔抗p27抗体的制备

(一)兔抗P27抗体的免疫获得

采用皮下、皮内注射结合肌肉注射的方法，用制备的纯化p27蛋白免疫家兔。

1.首免：采用皮内和肌肉注射，注射剂量为100μg/只。取一定量的抗原液，加入等量弗氏完全佐剂，进行完全乳化，皮内和肌肉各注射50μg。

2.二免：一周后，采用皮下和肌肉注射进行二免，注射剂量为200μg/只。取一定量的抗原液，加入等量弗氏不完全佐剂，进行完全乳化，每只家兔皮下和肌肉各注射100μg。

3.三免：二免一周后，进行三免，取一定量的抗原液直接注射，每只家兔皮下和肌肉各注射100μg。

4.四免：两周后，采用耳静脉注射的方式进行四免。每只家兔皮下和肌肉各注射100μg抗原。免疫时，先注射0.1ml(约20mg)，看家兔是否有过敏反应。观察30分钟，如果没出现过敏反应，将剩余的抗原液全部注射。

5.大约10天后，耳静脉采血，将收集的血液室温下凝固后，置于37℃温箱中1～2小时，吸出血清。检测是否已经含有p27多抗。

6.以后每隔一周，采用耳静脉注射的方式对家兔进行加强免疫，剂量为200mg/只。定期对家兔进行心脏采血，收集血清。

(二)兔抗p27抗体的检测：

1.琼扩试验(AGP)：

①制备琼脂板，用打孔器打孔。

②在中间孔分别加入AMV血毒、AMV蛋清毒、标准阳性抗原。

③在周围孔中分别加入倍比稀释的血清，添至孔满为止。

④将平皿放置在37℃恒温箱中，10小时后观察结果。

结果显示，在抗原孔与抗体孔之间出现明显的沉淀线，兔抗p27抗体的效价达1∶32。

2.Western印迹检测抗血清：

为证实免疫家兔所获得的抗血清为p27蛋白的抗血清，进行了Western印迹分析，试验步骤如下：

①取10μl纯化的p27蛋白，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，混匀，煮沸5分钟。取15μl样品加样，进行SDS-PAGE电泳。

②准备转印条件，如转印缓冲液(4℃存放)，NC膜，滤纸等。

③SDS-PAGE电泳完毕后，取出凝胶，除去浓缩胶，并切去下方一小角作为标记。带上手套，按胶的尺寸大小剪取NC膜，同样切去NC膜的一小角作为标记。将切好的凝胶块、NC膜、滤纸在转印缓冲液中浸泡30分钟。按照海绵垫-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-海绵垫的结构，装入转印夹中，各层间不能有气泡。

④凝胶一侧接负极，NC膜一侧接正极。

⑤加入转印缓冲液，将电泳槽置于冰浴中并加磁力搅拌器搅拌，200mA恒流转印1小时。

⑥转印结束后，将电泳凝胶放入考马斯亮蓝染色液中染色，以检测转印是否完全。

⑦按加样孔的位置，剪下分子量标准的膜条，用氨基黑染色，观察转印效果。NC膜其余部分置于封闭液中，室温振摇1小时。

⑧封闭后的NC膜置于用封闭液按1∶4000比例稀释的收集的抗血清中，室温振荡2小时。

⑨用TBS洗涤NC膜4次，每次10分钟。

⑩将NC膜置于用封闭液按一定比例稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG中，室温振荡1小时。

(11)洗涤方法同⑨

(12)最后将NC膜浸到底物溶液中显色，出现颜色时，立即用蒸馏水冲洗来终止反应。NC膜可夹在两张滤纸间避光保存。

(13)用染色好的标准分子量凝胶条带与NC膜一起拍照。抗血清Western印迹检测结果见图7

(三)所用试剂

1.弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂

2.琼脂配方：

琼脂粉                1g

NaCl               8g

蒸馏水             100ml

水浴溶化后，将其倒入灭菌的平皿，制成厚度约为3毫米的琼脂板，冷凝后加盖放入4℃保存，可在1周内使用。

3.Western印迹试剂：

(1)转印缓冲液：甘氨酸14.4克，Tris碱3克，甲醇200ml，加蒸馏水至总量为1L。

(2)封闭液：5％的脱脂乳

(3)洗涤液TBS：20mmol/L Tris(PH7.5)，150mmol/LNaCl

(4)15％的氨基黑(10B)染色液：0.15g氨基黑，25ml甲醇，10ml冰醋酸，65ml蒸馏水。

(5)氨基黑脱色液：20％甲醇，7％乙酸。

(6)过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)：购自北京鼎国生物技术公司

(7)HRP反应缓冲液(SAB)：0.05mol/L NaAC(PH5.0)

(8)HRP显色溶液(现用现配)：20ml 0.05mol/L NaAC(PH5.0)，10mg二氨基联苯胺(DAB)，10μl H₂O₂。

实施例4兔抗P27抗体的纯化

使用常规的IgG纯化的方法，对兔抗P27抗体纯化(饱和硫酸盐沉淀法)。实施例5兔抗P27抗体的反应板包被

包被方法：

将收集的抗血清按一定的比例用包被液稀释后包被酶标板，4℃过夜；

用5％脱脂乳37℃封闭4小时；

加样37℃反应1小时；

洗涤3次，加酶标二抗反应1小时；

洗涤3次，加底物反应10分钟读数

用AMV血毒为检测抗原，并设有阴、阳性对照，进行ELISA试验。在加入底物10分钟后，用酶标仪读取OD值，结果如下表：

实施例6含p27蛋白的试剂盒

使用本发明p27蛋白的试剂盒带有一个盒体，其中盒体(10)、内带有阳性抗原(1)、阴性抗原(2)、酶标抗体(3)、底物浓缩液(4)、底物稀释液(5)、样品稀释液(6)、洗涤液(7)、和终止液(8)。上述各种液体分别装在小瓶内。另外，盒体(10)内还带有5块96孔用真空封装的铝膜包被板。(11)操作说明书。

图8中：(1)阳性抗原、(2)阴性抗原、(3)酶标抗体、(4)底物浓缩液、(5)底物稀释液、(6)样品稀释液、(7)洗涤液、(8)终止液、(9)包被板、(10)盒体、(11)操作说明书

使用步骤如下：

1、加入阴阳性对照抗原，向两个孔中分别加入1号、2号液、每孔100微升。

2、加样品：将待检血清或蛋清，加入包被板的孔中(每孔加入100微升)，若用泄殖腔棉拭子需用样本稀释液进行1∶1稀释，加入100微升，37度反应60分钟。

3、洗涤：甩掉板中样品液，向每孔加入7号液250微升，(前两次每次浸泡2分钟)甩掉，后4次不用浸泡，加入洗涤液后甩掉。

4、加酶标抗体：每孔加入3号液100微升，37度反应60分钟，后甩掉液体。

5、洗涤：向每孔加入7号液250微升，甩掉，洗4次。

6、加底物：甩掉7号液，将4号液与5号液按1∶1混合后每孔加入100微升，反应15分钟。

7、读数：酶标仪选样655NM波长读数，S/P比值大于等于0.15为阳性，小于0.15判为阴性。

中止：加入8号液，每孔100微升

序列表

<110>陈福勇

<120>P27蛋白的表达及其应用

<140>

<141>2003-11-？

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>800bp

<212>核苷酸

<213>人工序列

<223>合成

<400>1

CCTGTAGTGA TTAAGACAGA GGGACCGGCC TGGACCCCTC TGGAGCCAAA

ATTGATCACA AGACTGGCTG ATACGGTCAG GACCAAGGGC TTACGATCCC

CGATCACTAT GGCAGAAGTT GAAGCGCTTA TGTCCTCCCC GCTGCTGCCG

CATGACGTTA CGAATCTAAT GAGAGTTATT TTAGGGCCTG CCCCATATGC

CTTATGGATG GACGCTTGGG GAGTCCAATT GCAGACGGTT ATAGCGGCAG

CCACTCGCGA CCCCCGACAC CCAGCGAATG GTCAAGGGCG GGGGGAACGG

ACTAACTTGG ATCGCTTAAA GGGTCTAGCT GATGGGATGG TGGGCAACCC

ACAGGGTCAG GCCGCATTAT TAAGACCGGG GGAATTGGTT GCTATTACGG

CGGCGGCTCT CCAGGCGTTT AGAGAGGTTG CCCGGCTGGC GGAACCTGCA

GGTCCGTGGG CGGATATCAC GCAGGGACCA TCTGAGCCCT TTGTTGATTT

TGCCAATCGG CTTATAAAGG CGGTTGAGGG GACAGATCTC CCGCCTTCCG

CGCGGGCTCC GGTGATCATT GACTGCCTTA GGCAGAAGTC ACAGCCAGAT

ATTCAGCAGC TTATACGGGC GGCACCCTCC ACGCTGACCA CCCCAGGAGA

GATAATCAAA TATGTGCTAG ACAGGCAGAA GACTGCCCCT CTTACGGATC

AAGGCATAGC CGCGGCTATG

<210>2

<211>？氨基酸

<212>蛋白质

<213>人工序列

<223>合成

<400>2

ATG GGC AGC CAT CAT CAT CAT CAT CAT AGC AGC GGC CTG GTG CCG

Met Gly Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

CGC GGC AGC CAT ATG GCT AGC ATG ACT GGT GGA CAG CAA ATG GGT

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly

CGC GGA TCC ATG CCT GTA GTG ATT AAG ACA GAG GGA CCG GCC TGG

Arg Gly Ser Met Pro Vel Vel Ile Les Thr Glu Gly Pro Ala Trp

ACC CCT CTG GAG CCA AAA TTG ATC ACA AGA CTG GCT GAT ACG GTC

Thr Pro Leu Glu Pro Lys Leu Ile Thr Arg Leu Ala Asp Thr Val

AGG ACC AAG GGC TTA CGA TCC CCG ATC ACT ATG GCA GAA GTT GAA

Arg Thr Lys Gly Leu Arg Ser Pro Ile Thr Met Ala Glu Val Glu

GCG CTT ATG TCC TCC CCG CTG CTG CCG CAT GAC GTT ACG AAT CTA

Ala Leu Met Ser Ser Pro Leu Leu Pro His Asp Val Thr Asn Leu

ATG AGA GTT ATT TTA GGG CCT GCC CCA TAT GCC TTA TGG ATG GAC

Met Arg Val Ile Leu Gly Pro Ala Pro Tyr Ala Leu Trp Met Asp

GTC TGG GGA GTC CAA TTG CAG ACG GTT ATA GCG GCA GCC ACT CGC

Ala Trp Gly Val Gln Leu Gln Thr Val Ile Ala Ala Ala Thr Arg

GAC CCC CGA CGC CCA GCG AAT GGT CAA GGG CGG GGG GAA CGG ACT

Asp Pro Arg His Tro Ala Asn Gly Gln Gly Arg Gly Glu Arg Thr

AAC TTG GAT CGC TTA AAG GGT CTA GCT GAT GGG ATG GTG GGC AAC

Asn Leu Asp Arg Leu Lys Gly Leu Ala Asp Gly Met Val Gly Asn

CCA CAG GGT CAG GCC GCA TTA TTA AGA CCG GGG GAA TTG GTT GCT

Arg Gln Gly Gln Arg Ala Leu Leu Arg Pro Gly Glu Leu Val Ala

ATT ACG GCG GCG GCT GTC GAC GCG TTT AGA GAG GTT GCC CGG CTG

Ile Thr Ala Ala Ala Leu Glu Ala Phe Arg Glu Val Ala Arg Leu

GCG GAA CCT GCA GGT CCG TGG TCG GAT ATC ACG CAG GGA CCA TCT

Ala Glu Pro Ala Gly Pro Trp Ala Asp Ile Thr Gln Gly Pro Ser

GAG CCC TTT GTT GAT TTT GCC AAT CGG CTT ATA AAG GCG GTT GAG

Glu Pro Phe Val Asp Phe Ala Asn Arg Leu Ile Iys Ala Val Glu

GGG ACA GAT CTC CCG CCT TCC GCG CGG GCT CCG GTG ATC ATT GAC

Gly Thr Asp Leu Pro Pro Ser Ala Arg Ala Pro Val Ile Ile Asp

TGC CTT AGG CAG AAG TCA CAG CCA GAT ATT CAG CAG GTT ATA CGG

Cys Leu Arg Gln Lys Ser Gln Pro Asp Ile Gln Gln Leu Ile Arg

GCG GCA CCC TCC ACG CTG ACC ACC CCA GGA GAG ATA ATC AAA TAT

Ala Ala Pro Ser Thr Leu Thr Thr Pro Gly Glu Ile Ile Lys Tyr

GTG CTA GAC AGG CAG AAG ACT GCC CCT CTT ACG GAT GAA GGC ATA

Val Leu Asp Arg Gln Lys Thr Ala Pro Leu Thr Asp Gln Gly Ile

GCC GCG GCT ATG TCG TCT GCT ATC CAG CCC TAG

Ala Ala Ala Met Ser Ser Ala Ile Gln Pro ***

Claims (6)

1、具有序列1所示核苷酸序列的DNA序列。

2、具有如序列2所示氨基酸序列的p27蛋白。

3、含有序列1的质粒。

4、含有序列1的原核宿主细胞。

5、权利要求4的原核宿主细胞为大肠杆菌细胞。

6、含有序列2所示p27蛋白检测试剂盒。

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