CN1210308C

CN1210308C - 人源化抗her2单克隆抗体及其制法和药物组合物

Info

Publication number: CN1210308C
Application number: CN 01132225
Authority: CN
Inventors: 马菁; 王俊林
Original assignee: ZHONGXIN GUOJIAN PHARMACEUTICAL CO Ltd SHANGHAI
Current assignee: Three country Kin Pharmaceutical (Shanghai) Limited by Share Ltd
Priority date: 2001-11-16
Filing date: 2001-11-16
Publication date: 2005-07-13
Anticipated expiration: 2021-11-16
Also published as: CN1420128A

Abstract

本发明提供了一种抗HER2单克隆抗体，它的重链可变区具有SEQ ID NO：1、SEQID NO：5或SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，它的轻链可变区具有SEQ ID NO：2、SEQID NO：6或SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。该单克隆抗体的生物活性和在宿主细胞中的表达量有显著提高。本发明还提供了编码该抗体的DNA分子、该抗体的制备方法和含有该抗体的药物组合物。

Description

人源化抗HER2单克隆抗体及其制法和药物组合物

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及一种新的人源化抗HER2单克隆抗体。另外，本发明还涉及该单克隆抗体的制备方法以及含有该单克隆抗体的药物组合物。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。据统计，全球每年约有120余万妇女患乳腺癌，50万妇女死于乳腺癌。北美洲、西欧、北欧等发达国家乳腺癌发病率最高，非洲发病率最低。近年来，乳腺癌的发病在世界范围内呈明显上升趋势。无论在高发区还是低发区，乳腺癌发病率均以5-20％的速度上升。随着亚洲国家生活水平的提高，亚洲妇女乳腺癌发病的增长趋势已明显高于欧美国家，成为上升幅度最大的地区之一。尽管我国与其他国家和地区相比较，尚属于乳腺癌低发地区，但是乳腺癌的发病率也处于上升阶段。在我国，乳腺癌在一些城市已发展为女性恶性肿瘤发病的首位，上海1972～1974年女性乳腺癌的发病率为18.3/10万，1987～1989年为25.1/10万，增长37.6％，年增长2.3％。据专家预测，2000年上海女性乳腺癌发病率将达28.8/10万，居女性恶性肿瘤的首位。

HER2(人表皮生长因子受体2，human epidermal growth factor receptor2)受体是分子量为185kD、具酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，配体与HER2受体结合后，使HER2受体自身磷酸化并激活其酪氨酸激酶活性，从而促进细胞增殖。正常人中有一定的HER2基因的表达，但其过度表达就可导致细胞过度增殖和表型恶性转化，也就形成了肿瘤。研究发现，在25％～30％晚期乳腺癌的癌组织中有HER2受体基因过度表达，且此基因的过度表达是乳腺癌的一项独立的预后不良因素(Slamon等，Science，235：177-182[1987]；Slamon等，Science，244：707-712[1989])。HER2受体过度表达的乳腺癌特点表现为病情进展迅速，化疗缓解期短，对三苯氧胺易产生耐药，无病生存率和总生存率均低于HER2阴性的乳腺癌。

国内外研究发现，抗HER2的单克隆抗体可以在体外、体内抑制HER2阳性的乳腺癌细胞或其它类型HER2阳性癌细胞的生长。但是用鼠源性抗体治疗人体疾病，受到鼠源性抗体的免疫原性等限制。以往的临床经验已经证实，鼠源抗体很难取得理想的疗效。近年来，人源化抗体技术的出现和发展，为这种针对HER2受体的单抗免疫治疗过渡到临床提供了可能。但是，现有的商品化的抗HER2单克隆抗体Herceptin^(Genentech公司)的生物活性仍有待提高。

因此，本领域中仍需要一种新的生物活性更高的人源化抗HER2单克隆抗体。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性结合HER2受体的单克隆抗体。

本发明的另一目的是提供编码上述抗HER2单克隆抗体的DNA分子。

本发明的另一目的是提供一种含有上述单克隆抗体的药物组合物。

本发明还有一个目的是提供制备上述单克隆抗体的方法。

为达到上述发明目的，本发明一方面提供了一种人源化单克隆抗体，该蛋白特异性结合人HER2受体，该蛋白包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，所述抗体的重链可变区具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；或，所述抗体的重链可变区具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；或，所述抗体的重链可变区具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。

较佳的是，该单克隆抗体中的重链可变区具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

本发明另一方面提供了编码上述人源化单克隆抗体的DNA分子。

在一个较佳的实例中，该DNA分子含有SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7或SEQ IDNO：11所示的编码所述单抗重链可变区的核苷酸序列，以及SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：8或SEQ ID NO：12所示的编码所述单抗轻链可变区的核苷酸序列。

本发明第三方面提供了一种表达载体，该表达载体含有上述DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。

本发明第四方面提供了一种宿主细胞，其特征在于，它被上述表达载体转化。在一个较佳的实例中，该宿主细胞选自大肠杆菌和COS细胞。

本发明第五方面提供了一种药物组合物，其特征在于，它含有药学上有效量的上述人单克隆抗体以及药学上可接受的载体。

本发明第六方面提供了一种制备上述人源化单克隆抗体的方法，其特征在于，该方法包括：

a)提供一表达载体，该表达载体含有上述DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列；

b)用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞；

c)在适合所述人源化单克隆抗体表达的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；和

d)分离纯化获得所述人源化的单克隆抗体。

本发明的优点在于本发明的单克隆抗体的亲和力和在宿主细胞中的表达量比现有的商品化的Herceptin单克隆抗体均有显著提高。本发明的其它目的和优点可通过下面的详细描述得知。

附图说明

图1显示了本发明所用pMG18载体的酶切图谱。图中Ck表示抗体kappa轻链的恒定区基因；IgG1恒定区表示人抗体IgG1的重链恒定区基因；pA表示SV40加polyA位点。

图2显示了构建人源化抗体基因时所用引物之间的位置关系。

具体实施方式

本发明涉及一种人源化单克隆抗体，该蛋白特异性结合人HER2受体，该蛋白包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，重链可变区具有SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。

本文所用的术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一抗体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可用杂交瘤方法(由Kohler等，Nature，256：495(1975)首先提出)制得，或可用重组DNA方法(例如参见美国专利No.4,816,567)制得。“单克隆抗体”也可用例如Clackson等，Nature，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体文库中分离获得。

“人源化”形式的非人(如小鼠)抗体是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv，Fab，Fab′，F(ab′)₂或抗体的其它抗原结合序列)，它们含有非人免疫球蛋白的最小序列。对于大多数情况，人源化抗体是人免疫球蛋白中的互补决定区(CDR)残基被非人源抗体(例如有所需特异性、亲和力和活性的小鼠、大鼠或兔抗体)的CDR残基代替。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)被对应的非人残基代替。另外，人源化抗体还可包括既不存在于受者抗体、又不存在于导入的CDR或构架序列中的残基。作这些修饰能进一步提高和最大化抗体的性能。通常，人源化抗体包含基本上所有的(至少一个、通常两个)可变区，其中所有或基本上所有的CDR区为非人免疫球蛋白的CDR区，所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。

本文所用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是众所周知的。

本发明还涉及编码上述人源化单克隆抗体的DNA分子。在一个较佳的实例中，该DNA分子含有SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：11所示的编码所述单抗重链可变区的核苷酸序列，以及SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：12所示的编码所述单抗轻链可变区的核苷酸序列。

本发明的人源化单克隆抗体通常可通过以下方法来进行制备。

首先，提供含有编码本发明人源化单抗的核苷酸序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列的表达载体。

本文所用的术语“表达调控序列”通常指参与控制核苷酸序列表达的序列。表达调控序列包括与目标核苷酸序列操作性相连的启动子和终止信号。它们通常还包括核苷酸序列适当翻译所需的序列。“操作性相连”是指线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果启动子或增强子增加了编码序列的转录，则它与编码序列是操作性相连的。

编码本发明人源化单抗的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的DNA序列人工合成或用PCR法扩增得到。然后，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。本发明中所用的表达载体是本领域技术人员已知的各种市售的表达载体，例如购自Qiagen和Promega公司的表达载体。

随后，用上述获得的表达载体转化合适的宿主细胞。“宿主细胞”一般包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。在本发明中，较佳的宿主细胞是大肠杆菌和COS细胞。

最后，在适合本发明单克隆抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后用离子交换层析、疏水层析和分子筛层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的人源化单克隆抗体。

本发明还提供了一种药物组合物，该组合物含有药学上有效量的本发明单抗以及药学上可接受的载体。本文所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的突变蛋白相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。

本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。

下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明。

实施例1.鼠源抗Her2单克隆抗体可变区的克隆和测序

A)免疫小鼠

采用Her2高表达的人乳腺瘤细胞SK-Br-6作为免疫原。采用总量为5×10⁷新鲜培养的人乳腺瘤细胞SK-Br-6细胞，加入完全弗氏佐剂，充分研磨至完全乳化后，皮下多点注射10日龄Balb/c小鼠，每点注射50微升，共6点。然后每隔1周注射加强免疫，共5次重复，同时对血清抗体水平进行监测。最后一次静脉注射5×10⁶新鲜细胞/PBS混合液，3日后杀死小鼠，取出脾脏。

B)细胞融合

分离出脾脏单细胞，并确定细胞活性大子90％。将脾脏细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞以10∶1的比例混合离心共沉淀，在37℃水浴锅中加入PEG(1400MW)进入细胞融合，融合时间为1分钟、2分钟、5分钟和10分钟。在各时间点加入新鲜无血清培养基1毫升、2毫升、5毫升和10毫升。离心沉淀后将细胞加入到20％FCS RPM1-1640培养液中，转入96孔板进行培养。37℃培养24小时后，加入选择培养液HAT，至终浓度为1×。每3天更换新鲜培养基1次至长出克隆。

C)克隆筛选

选择单克隆形成孔，在第14天取出上清液，进行SK-Br-6细胞荧光染色。保留阳性孔，亚克隆3次后选出5个高表达细胞株，分别命名为GH0、GH1、GH2、GH3和GH4。

经过鉴定，确认这5个细胞株为高表达细胞株。这5个克隆生长稳定，表达量大于1毫克/升，在96孔培养条件下，稳定至第5代克隆。

鉴定出5个克隆的类型为：GH0为IgG1；GH1为IgG2a，GH2为IgG1，GH3为IgG2b，GH4为IgG2a。

D)抗Her2单克隆抗体的生物活性研究

用蛋白质A法纯化上述单克隆抗体细胞株的培养上清，测定单克隆抗体的生物活性。测定结果见下表1。测活细胞株为SK-BR-6，指标为对该细胞系细胞的分化抑制效应(单位用(受抑制细胞数/细胞总数)×100％表示)。实验重复三次，取平均值作为比较参数。以不加任何抗体作为阴性对照，阳性对照4D5是鼠源单克隆抗体(购自Genentech)。阳性对照Herceptin是人源化的4D5(购自Genentech公司)。

表1 单克隆抗体各细胞株产物对SK-Br-6细胞分化的抑制(％)

从表1结果可以看出，五株细胞株产生的单抗均可明显抑制SK-BR-6细胞的分化，其中GH0、GH2和GH4三株细胞株的抑制作用明显超过阳性对照。由于GH0和GH4具有较高的生物活性，在以下的嵌合和人源化单抗基因和细胞株中将以这两个细胞株为基础进行。

E)抗Her2单克隆抗体可变区的克隆和测序

根据人抗体基因的保守性，设计以下引物以克隆该单克隆抗体的可变区编码序列：

VL-有义：5′-tcctctagacagctgacccagtctcca-3′(SEQ ID NO：13)

VL-反义：5′-gttgctagcccagcttggtacchscdccgaa-3′(SEQ ID NO：14)

VH-有义：5′-aggaagctttgcagsagtcwgg-3′(SEQ ID NO：15)

VH-反义：5′-tgacgtacgggtgaccgtggtcccttggccccat-3′(SEQ ID NO：16)

在上述引物中，H＝a、c或t；S＝c或g；D＝a，g或t；R＝a或g；W＝a或t。

采用Invitrogen公司的Trizol试剂盒，从上述获得的GH0和GH4两个杂交瘤细胞株中抽提纯化总RNA，整个操作步骤按照厂家的说明书进行。

在1％琼脂糖电泳上鉴定上述纯化总RNA的质量后，按照生产商说明书用Pharmacia公司的反转录试剂盒进行反转录，获得总RNA的cDNA。

用上述引物和cDNA分别进行PCR扩增得到VL和VH片段。具体条件如下：

反应体系：

VL(微升) VH(微升)

10×PCR反应缓冲液 5 5

dNTP(10毫摩尔/升) 5 5

MgCl₂(25毫摩尔/升) 6 6

cDNA 10 10

有义引物(10微摩尔/升) 5 5

反义引物(10微摩尔/升) 5 5

Pfu(5U/微升) 1 1

加水至 50微升 50微升

温度循环：

预变性：94℃2分钟；

主循环：94℃45秒，55℃45秒，70℃1分钟，共30个循环；

后延伸：70℃5分钟。

完成上述温度循环后，在1.2％琼脂糖电泳上鉴定扩增产物，发现VL和VH反应体系均出现一条分子量约300～350bp的单一条带。用Promega公司的胶回收试剂盒回收两种扩增产物，连接于pUC18-3K克隆载体(《根据INCP-9质粒序列进行环境监测的工具开发》(DEVELOPMENT OF TOOLS FOR ENVIRONMENTAL MONITORING BASEDON INCP-9 PLASMIDS SEQUENCES)，A.Greated，R.Krasowiak，M.Titok，C.M.Thomas School of Biological Sciences，University of Birmingham，Edgbaston，Birmingham B15 2TT，UK and Faculty of Biology，Dept of Microbiology，Belarus StateUniversity Scorina Av.4，Minsk 220080 Belarus)上，转化大肠杆菌DH5a菌株。然后进行蓝白斑筛选，再经过酶切鉴定，分别获得6个和8个阳性克隆。经测序验证，分别确认2个和3个克隆为正确克隆。

测序结果表明，GH0细胞株的抗体基因编码的产物的氨基酸序列与已经发表的Herceptin的氨基酸序列完全一致，但其DNA序列却与之不同。GH4细胞株的抗体基因编码的产物的氨基酸序列与已经发表的Herceptin的氨基酸序列不一致。SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：18分别是Herceptin单克隆抗体和本发明GH0单克隆抗体的轻链可变区DNA序列。SEQ ID NO：19显示了两者的轻链可变区氨基酸序列。SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：21分别是Herceptin单克隆抗体和本发明GH0单克隆抗体的重链可变区DNA序列。SEQ ID NO：22显示了两者重链可变区氨基酸序列。SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30显示了GH4单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列。SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32显示了GH4单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列。

实施例2 嵌合基因的构建

按照下述方法，将上述测序验证过的VH和VL基因克隆到pMG18-3K载体(该载体的酶切图谱如图1所示)上，使这两个基因与相应的恒定区构成全长的抗体重链和轻链基因。

按照常规方法(参见《分子克隆实验室指南》，金冬雁等，1992，科学出版社)，用XbaI和NheI、HindIII和Bsi WI分别对上述重链和轻链可变区DNA序列进行酶切，用1％琼脂糖电泳纯化酶切片段。然后，将纯化获得的酶切片段分别连接到经Xba I和Nhe I、Hind III和Bsi WI酶切的pMG18载体上。

通过上述操作，获得了VH-IgG1Fc融合基因和VL-Ck融合基因。经酶切鉴定，获得了序列完全正确的克隆。

实施例3 VL和VH基因的人源化

要对鼠源抗Her2单抗进行人源化，首先需要将重链的CDR区和轻链的CDR区直接移植到人源抗体框架上。然而，简单的CDR移植往往丧失或降低了原抗体的亲和力。因此，必须将人FR的某些关键位点氨基酸残基回复突变为鼠源残基才能重建抗体的亲和力。根据人源化的要求(《鼠抗CD3单克隆抗体OKT3.的人源化，人抗体杂交瘤》(humanization of the murine anti-human CD3 monoclonal antibody OKT3.HumAntibod Hybridoma)1994，5(1，2)：41)，对上述VL和VH基因进行人源化设计，获得如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：12所示的三个人源化单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列及其核苷酸编码序列，其中：SEQ ID NO：1-4分别是人源化抗体hGH0/1的重链可变区氨基酸序列、轻链可变区氨基酸序列、重链可变区编码序列和轻链可变区编码序列；SEQ ID NO：5-8分别是人源化抗体hGH0/2的重链可变区氨基酸序列、轻链可变区氨基酸序列、重链可变区编码序列和轻链可变区编码序列；SEQID NO：9-12分别是人源化抗体hGH4/6的重链可变区氨基酸序列、轻链可变区氨基酸序列、重链可变区编码序列和轻链可变区编码序列。

实施例4 人源化抗体重链可变区和轻链可变区基因的合成

将整个人源化抗体huGH0-1的重链可变区编码序列(SEQ ID NO：3)分成如下所示的6套长度为28～85的寡核苷酸片段，每个寡核苷酸的两端各有8～9个与模板互补良好的重叠区域：

1.ctttctagacaggtgcagctgcagcgctccggccccgagctggtgaagcccg(SEQ ID NO：23)

2.ccccgagctggtgaagcccggcgcctccctgaagacctcctgcaccgcctcccacttcaacatcaaggacacctacatccacaaggtg(SEQ ID NO：24)

3.gacacctacatccacaaggtgaagcagcgccccgagcagtccctggagtggatcggccgcacctaccccaccaacggccgcacc(SEQ ID NO：25)

4.ccccaccaacggccgcacccgctacgaccccaagttccagtccaaggccaccatcaccgccgacacctcctccaacaccgcctacctg(SEQ ID NO：26)

5.cctccaacaccgcctacctgcaggtgtcccgcctgacctccgagaccaccgccgtgaagtactgctcccgctggggccgcgacg(SEQ ID NO：27)

6.caagctagcggaggacacggtcacggaggcgccgtggccccagtagtccatggagtagaagccgtcgcggccccagcgggag(SEQ ID NO：28)

上述引物之间的关系如图2所示。

以这6条引物相互为模板进行PCR。PCR采用Roche公司的高保真扩增系统，反应条件均为：95℃5分钟；94℃45秒，55℃45秒，72℃55秒，30个循环；72℃3分钟。6条引物的浓度为：引物1和引物6的终浓度为100nm，其余各引物的终浓度为20nM。所得产物经过琼脂糖凝胶电泳分离，用Promega公司的DNA胶回收试剂盒回收目的条带并克隆到pGEM-T vector中(Promega公司产品，克隆过程参考厂家的说明书进行)。经过蓝自斑筛选以及XbaI/NheI双酶切鉴定，确认有2～5个阳性克隆。用美国ABI自动测序仪对确认的阳性克隆进行测序。根据DNA测序的结果确认序列完全正确的克隆。轻链可变区DNA序列的合成过程与上述步骤相同。

按照实施例2描述的方法将上述方法获得重链和轻链可变区DNA序列插入表达载体pMG18中。序列完全正确的克隆记作pHuGH0/1。用同样方法获得表达载体pHuGH0/2和pHuGH4/6。

实施例5 CHO细胞的转染与重组克隆的筛选

用上述构建的含有人源化抗体基因的表达载体pHuGH0/1、pHuGH0/2和pHuGH4/6转化大肠杆菌DH5a菌株，接种于100毫升LB培养基中进行扩增。按照生产商说明书，用Qiagen公司的超纯质粒DNA纯化试剂盒(Ultrapure Plasmid DNAPurification Kit)抽提纯化质粒DNA。用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒将上述纯化的质粒DNA转染CHO细胞，操作参照厂家的说明书进行。

在HAT选择培养基上对转染的CHO细胞进行连续9周的选择，最后在96孔板上进行极限稀释培养，连续进行3次，进行单克隆化。通过上述操作获得了人源化抗体细胞株hGH0/1、hGH0/2和hGH4/6。

在RPM1641培养基上培养挑出的单克隆细胞系，对上清进行Western印迹试验，根据染色反应判断表达强度。结果发现hGH0/1、hGH0/2和hGH4/6两个细胞株具有明显较高的表达强度，可作为进一步研究的候选克隆。

用Protein A亲和层析柱从上述3个细胞系的培养上清中直接分离纯化抗体hGH0/1、hGH0/2和hGH4/6。SDS-PAGE电泳检查证明，所得产物纯度大子90％。

对亲和层析产物再次进行分子筛层析，获得了纯度大于98％的样品。所得样品可用于以下的进一步研究分析。

实施例6重组人源化单克隆抗体的生物活性研究1)特异性荧光染色

5株抗体GH、GH1、GH2、GH3和GH4特异性对SK-Br-6染色，而对照细胞(HER-2/null阴性)株对染色无反应。其中，GH0能被对照标准抗体(Herceptin)特异性阻断，GH1，GH2，GH3和GH4不能被Herceptin阻断，GH0～GH5相互间不能阻断。这说明上述5个细胞株产生的抗体所结合的免疫决定簇是不同的。除了GH0结合的抗原决定簇与Herceptin是同一个抗原决定簇外，其余4个细胞株所结合的抗原决定簇与Herceptin不同。

2)免疫沉淀实验

Western印迹试验表明，上述5种抗体与对照Herceptin一样，可以与Her2蛋白特异性沉淀和结合。

3)细胞毒性试验

试验证明，上述5种单克隆抗体与4D5和Herceptin一样，10～100微克/升的浓度在体外可以选择性诱导SK-Br-6细胞生长抑制并导致细胞凋亡。

4)生物活性试验

按照实施例1中描述的方法进行生物活性试验。试验结果列在下表2中。单位用(受抑制细胞数/细胞总数)×100％表示。

表2 嵌合和人源化单抗对SK-Br-6细胞分化能力的抑制作用(％)

抗体浓度阴性对照阳性对照待测单抗

(微克/毫升) (CD3抗体) Herceptin hGH0/1 hGH0/2 hGH4/6

0 0.0 0.4 0.9 0.7 2.4

1 8.1 2.3 12.6 8.6 7.4

10 0.0 8.9 48.8 37.6 40.6

100 0.9 18.7 90.6 79.6 88.7

上述结果说明，三株人源化单克隆抗体均具有十分明显的抑制SK-Br-6细胞分化的能力，其作用强度明显高于阳性对照Herceptin。在100微克/毫升浓度下，hGH0/1的生物活性比阳性对照高5倍，hGH0/2比对照高4.2倍，而hGH4/6比阳性对照高4.6倍。人源化的两种单抗与其相应的嵌合抗体相比，活性没有明显降低。这说明我们进行的人源化是成功的，上述人源化单克隆抗体具有明显优于现有商品Herceptin的生物活性。

6)表达量的研究

用ELISA法鉴定上述Herceptin、hGH0/1、hGH0/2和hGH4/6四个细胞株的表达量。具体方法是，采用rpm1641培养基、37℃ 5％CO₂摇瓶培养，转速为88rpm。接种后第7日取样用ELISA法定量测定，取样和测定为3次重复。下表3中为3次重复的平均值。

表3 三株人源化抗体与阳性对照表达量的比较(毫克/毫升)

Herceptin hGH0/1 hGH0/2 hGH4/6

23.24±1.12 227.44±0.37 179.63±0.31 309.21±0.37

从表3可以看出，本发明制得的人源化单克隆抗体的表达量比对照提高了近10倍～14倍。

尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。

序列表

<110>上海兰生国健药业有限公司

<120>人源化抗HER2单克隆抗体及其制法和药物组合物

<130>016015

<160>32

<170>PatentIn version 3.0

<210>1

<211>120

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

Gln Val Gln Leu Gln Arg Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Leu Lys Thr Ser Cys Thr Ala Ser His Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Lys Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Thr Tyr Pro Thr Asn Gly Arg Thr Arg Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Ser Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Val Ser Arg Leu Thr Ser Glu Thr Thr Ala Val Lys Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Arg Asp Gly Phe Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly His

100 105 110

Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>2

<211>109

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Ala Asp Ile Val Met Lys Gln Ser His Lys Phe Asn Ser Thr Ser Val

1 5 10 15

Gly Asp Arg Ser Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ile Asn

20 25 30

Thr Ala Val Ala Ser Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ser Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Gly Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Gln Asp Arg Phe

50 55 60

Thr Gly Asn Arg Leu Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Val Ser Ser Val

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Ile Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Arg

85 90 95

Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Val Glu Ile Lys

100 105

<210>3

<211>360

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>3

caggtgcagc tgcagcgctc cggccccgag ctggtgaagc ccggcgcctc cctgaagacc 60

tcctgcaccg cctcccactt caacatcaag gacacctaca tccacaaggt gaagcagcgc 120

cccgagcagt ccctggagtg gatcggccgc acctacccca ccaacggccg cacccgctac 180

gaccccaagt tccagtccaa ggccaccatc accgccgaca cctcctccaa caccgcctac 240

ctgcaggtgt cccgcctgac ctccgagacc accgccgtga agtactgctc ccgctggggc 300

cgcgacggct tctactccat ggactactgg ggccacggcg cctccgtgac cgtgtcctcc 360

<210>4

<211>327

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>4

gccgacatcg taatgaagca gtcccacaag ttcaactcca cctccgtggg cgaccgctcc 60

tccatcacct gcaaggcctc ccaggacgtg atcaacaccg ccgtggcctc ctaccagcag 120

aagcccggcc actcccccaa gctgctgggc tactccgcct ccttccgcta caccggcgtg 180

caggaccgct tcaccggcaa ccgcctgggc accgacttca ccttcaccgt gtcctccgtg 240

caggccgagg acctggccgt gatctactgc cagcagcact acacccgccc ccccaccttc 300

ggcggcggca cccgcgtgga gatcaag 327

<210>5

<211>120

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>5

Gln Val Gln Leu Trp Arg Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Leu Lys Thr Ser Cys Ala Tyr Ser His Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Lys Gly Lys Gln Arg Pro Glu Gln Ser Leu Tyr Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Thr Tyr Pro Thr Asn Ser Arg Thr Arg Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Thr Ser Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Arg Val Ser Arg Leu Thr Ser Glu Thr Thr Ala Val Lys Ser Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Arg Asp Gly Phe Thr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Lys

100 105 110

Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>6

<211>109

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>6

Ala Asp Ile Val Met Lys Gln Ser Arg Lys Phe Asn Ser Thr Ser Val

1 5 10 15

Gly Asp Arg Ser Ser Ile Lys Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ile Asn

20 25 30

Thr Ala Val Ala Ser Tyr Gln Asp Lys Pro Gly His Ser Pro Lys Leu

35 40 45

Gly Gly Tyr Ser Ala Ser Phe Thr Tyr Thr Gly Val Gln Asp Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Asn Arg Leu Gly Thr Asp Phe Thr Trp Thr Val Ser Ser Val

65 70 75 80

Gln Ala Glu Thr Leu Ala Val Ile Tyr Cys His Gln His Tyr Thr Arg

85 90 95

Pro Ser Thr Phe Gly Ala Gly Thr Arg His Glu Ile Lys

100 105

<210>7

<211>360

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>7

caggtgcagc tgtggcgctc cggccccgag ctggtgcgcc ccggcgcctc cctgaagacc 60

tcctgcgcct actcccactt caacatcaag gacacctaca tccacaaggg caagcagcgc 120

cccgagcagt ccctgtactg gatcggccgc acctacccca ccaactcccg cacccgctac 180

gaccccaagt tcacctccaa ggccaccatc accgccgaca cctcctccaa caccgcctac 240

ctgcgcgtgt cccgcctgac ctccgagacc accgccgtga agtcctgctc ccgctggggc 300

cgcgacggct tcacctccat ggactactgg ggcaagggcg cctccgtgac cgtgtcctcc 360

<210>8

<211>327

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>8

gccgacatcg tgatgaagca gtcccgcaag ttcaactcca cctccgtggg cgaccgctcc 60

tccatcaagt gcaaggcctc ccagtccgtg atcaacaccg ccgtggcctc ctaccaggac 120

aagcccggcc actcccccaa gctgggcggc tactccgcct ccttcaccta caccggcgtg 180

caggaccgct tcaagggcaa ccgcctgggc accgacttca cctggaccgt gtcctccgtg 240

caggccgaga ccctggccgt gatctactgc caccagcact acacccgccc ctccaccttc 300

ggcgccggca cccgccacga gatcaag 327

<210>9

<211>120

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>9

Gln Val Gln Leu Trp Arg Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Leu Lys Thr Ser Cys Thr Ala Ser His Phe Asn Ile Lys Asp Arg

20 25 30

Tyr Ile His Lys Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Thr Tyr Pro Thr Asn Gly Arg Thr Arg Gly Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Ser Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ash Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Val Ser Arg Leu Thr Ser Glu Thr Thr Ala Val Arg Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Arg Asp Gly Phe Tyr Ser Pro Asp Tyr Trp Gly Glu

100 105 110

Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>10

<211>110

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>10

Ala Asp Ile Val Met Lys Gln Ser Arg Lys Phe Asn Ser Thr Ser Val

1 5 10 15

Gly Asp Arg Ser Lys Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ile Asn

20 25 30

Thr Ala Val Ala Ser Tyr Gly Leu Gln Lys Pro Gly His Arg Pro Lys

35 40 45

Leu Leu Gly Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Gln Asp Arg

50 55 60

Phe Thr Arg Asn Arg Leu Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Val Ser His

65 70 75 80

Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Ile Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr

85 90 95

Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210>11

<211>360

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>11

caggtgcagc tgtggcgctc cggccccgag ctggtgaagc ccggcacctc cctgaagacc 60

tcctgcaccg cctcccactt caacatcaag gaccgctaca tccacaaggt gaagcagcgc 120

cccgagcagt ccctggagtg gatcggccgc acctacccca ccaacggccg cacccgcggc 180

gaccccaagt tccagtccaa ggccaccatc accgccgaca cctcctccaa ctccgcctac 240

ctgcaggtgt cccgcctgac ctccgagacc accgccgtgc gctactgctc ccgctggggc 300

cgcgacggct tctactcccc cgactactgg ggcgagggcg cctccgtgac cgtgtcctcc 360

<210>12

<211>330

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>12

gccgacatcg tgatgaagca gtcccgcaag ttcaactcca cctccgtggg cgaccgctcc 60

aagatcacct gcaaggcctc ccaggacgtg atcaacaccg ccgtggcctc ctacggcctg 120

cagaagcccg gccaccgccc caagctgctg ggctactccg cctccttccg ctacaccggc 180

gtgcaggacc gcttcacccg caaccgcctg ggcaccgact tcaccttcac cgtgtcccac 240

gtgcaggccg aggacctggc cgtgatctac tgccagcagc actacaccac cccccccacc 300

ttcggcggcg gcacccgcgt ggagatcaag 330

<210>13

<211>27

<212>DNA

<213>引物

<400>13

tcctctagac agctgaccca gtctcca 27

<210>14

<211>31

<212>DNA

<213>引物

<220>

<221>misc_feature

<223>h＝a，c或t；s＝c或g；d＝a，g或t；

<400>14

gttgctagcc cagcttggta cchscdccga a 31

<210>15

<211>22

<212>DNA

<213>引物

<220>

<221>misc_teature

<223>s＝c或g；w＝a或t

<400>15

aggaagcttt gcagsagtcw gg 22

<210>16

<211>34

<212>DNA

<213>引物

<400>16

tgacgtacgg gtgaccgtgg tcccttggcc ccat 34

<210>17

<211>324

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>17

gctgatatcg tgatgaccca gtcccacaag ttcatgtcca cctctgtggg cgatagggtc 60

agcatcacct gcaaggccag tcaggatgtg aatactgctg tagcctggta tcaacagaaa 120

ccaggacatt ctccgaaact actgatttac tcggcatcct tccggtacac tggagtccct 180

gatcgcttca ctggcaatag atctgggacg gatttcactt tcaccatcag cagtgtgcag 240

gctgaagacc tggcagttta ttactgtcag caacattata ctactcctcc cacgttcgga 300

gggggtacca aggtggagat caaa 324

<210>18

<211>324

<212>DNA

<213>鼠(Mus musculus)

<400>18

gccgacatcg tgatgaccca gtcccacaag ttcatgtcca cctccgtggg cgaccgcgtg 60

tccatcacct gcaaggcctc ccaggacgtg aacaccgccg tggcctggta ccagcagaag 120

cccggccact cccccaagct gctgatctac tccgcctcct tccgctacac cggcgtgccc 180

gaccgcttca ccggcaaccg ctccggcacc gacttcacct tcaccatctc ctccgtgcag 240

gccgaggacc tggccgtgta ctactgccag cagcactaca ccaccccccc caccttcggc 300

ggcggcacca aggtggagat caag 324

<210>19

<211>108

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>19

Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val

1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr

20 25 30

Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ser Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr

50 55 60

Gly Asn Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln

65 70 75 80

Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro

85 90 95

Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210>20

<211>369

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>20

gcgtacgctc aggttcagct gcagcagtct ggccctgagc tggtgaagcc aggggcctca 60

ctcaagttgt cctgtacagc ttctggcttc aacattaaag acacctatat acactgggtg 120

aaacagaggc ctgaacaggg cctggaatgg attggaagga tttatcctac gaatggttat 180

actagatatg acccgaagtt ccaggacaag gccactataa cagcagacac atcctccaac 240

acagcctacc tgcaggtcag ccgcctgaca tctgaggaca ctgccgtcta ttattgttct 300

agatggggag gggacggctt ctatgctatg gactactggg gtcaaggagc ctcggtcacc 360

gtctcctcg 369

<210>21

<211>369

<212>DNA

<213>鼠(Mus musculus)

<400>21

gcataggccc aggtgcagct gcagcagtcc ggccccgagc tggtgaagcc cggcgcctcc 60

ctgaagctgt cctgcaccgc ctccggcttc aacatcaagg acacctacat ccactgggtg 120

aagcagcgcc ccgagcaggg cctggagtgg atcggccgca tctaccccac caacggctac 180

acccgctacg accccaagtt ccaggacaag gccaccatca ccgccgacac ctcctccaac 240

accgcctacc tgcaggtgtc ccgcctgacc tccgaggaca ccgccgtgta ctactgctcc 300

cgctggggcg gcgacggctt ctacgccatg gactactggg gccagggcgc ctccgtgacc 360

gtgtcctcc 369

<210>22

<211>120

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>22

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Val Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>23

<211>52

<212>DNA

<213>引物

<400>23

ctttctagac aggtgcagct gcagcgctcc ggccccgagc tggtgaagcc cg 52

<210>24

<211>88

<212>DNA

<213>引物

<400>24

ccccgagctg gtgaagcccg gcgcctccct gaagacctcc tgcaccgcct cccacttcaa 60

catcaaggac acctacatcc acaaggtg 88

<210>25

<211>84

<212>DNA

<213>引物

<400>25

gacacctaca tccacaaggt gaagcagcgc cccgagcagt ccctggagtg gatcggccgc 60

acctacccca ccaacggccg cacc 84

<210>26

<211>88

<212>DNA

<213>引物

<400>26

ccccaccaac ggccgcaccc gctacgaccc caagttccag tccaaggcca ccatcaccgc 60

cgacacctcc tccaacaccg cctacctg 88

<210>27

<211>84

<212>DNA

<213>引物

<400>27

cctccsacac cgcctacctg caggtgtccc gcctgacctc cgagaccacc gccgtgaagt 60

actgctcccg ctggggccgc gacg 84

<210>28

<211>82

<212>DNA

<213>引物

<400>28

caagctagcg gaggacacgg tcacggaggc gccgtggccc cagtagtcca tggagtagaa 60

gccgtcgcgg ccccagcggg ag 82

<210>29

<211>120

<212>PRT

<213>鼠(Mus musculus)

<400>29

Gln Val Gin Leu Trp Arg Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Leu Lys Thr Ser Cys Thr Ala Ser His Phe Asn Ile Lys Asp Arg

20 25 30

Tyr Ile His Lys Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Ser Leu Glu Trp IIe

35 40 45

Gly Arg Thr Tyr Pro Thr Asn Gly Arg Thr Arg Gly Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Ser Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Val Ser Arg Leu Thr Ser Glu Thr Thr Ala Val Arg Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Arg Asp Gly Phe Tyr Ser Pro Asp Tyr Trp Gly Glu

100 105 110

Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>30

<211>360

<212>DNA

<213>鼠(Mus musculus)

<400>30

caagttcaat tgtggagatc tggtccagaa ttggttaagc caggtacttc tttgaagact 60

tcttgtactg cttctcactt caacattaag gatagataca ttcacaaggt taagcaaaga 120

ccagaacaat ctttggaatg gattggtaga acttacccaa ctaacggtag aactagaggt 180

gatccaaagt tccaatctaa ggctactatt actgctgata cttcttctaa ctctgcttac 240

ttgcaagttt ctagattgac ttctgaaact actgctgtta gatactgttc tagatggggt 300

agagatggtt tctactctcc agattactgg ggtgaaggtg cttctgttac tgtttcttct 360

<210>31

<211>110

<212>PRT

<213>鼠(Mus musculus)

<400>31

Ala Asp Ile Val Met Lys Gln Ser Arg Lys Phe Asn Ser Thr Ser Val

1 5 10 15

Gly Asp Arg Ser Lys Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ile Asn

20 25 30

Thr Ala Val Ala Ser Tyr Gly Leu Gln Lys Pro Gly His Arg Pro Lys

35 40 45

Leu Leu Gly Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Gln Asp Arg

50 55 60

Phe Thr Arg Asn Arg Leu Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Val Ser His

65 70 75 80Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Ile Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr

85 90 95Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210>32

<211>330

<212>DNA

<213>鼠(Mus musculus)

<400>32

gctgatattg ttatgaagca atctagaaag ttcaactcta cttctgttgg tgatagatct 60

aagattactt gtaaggcttc tcaagatgtt attaacactg ctgttgcttc ttacggtttg 120

caaaagccag gtcacagacc aaagttgttg ggttactctg cttctttcag atacactggt 180

gttcaagata gattcactag aaacagattg ggtactgatt tcactttcac tgtttctcac 240

gttcaagctg aagatttggc tgttatttac tgtcaacaac actacactac tccaccaact 300

ttcggtggtg gtactagagt tgaaattaag 330

Claims

1.一种人源化单克隆抗体，该抗体特异性结合人HER2受体，它包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，所述抗体的重链可变区具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；或，所述抗体的重链可变区具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；或，所述抗体的重链可变区具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。

2.一种DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的人源化单克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，该DNA分子含有SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：11所示的编码所述人源化单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，以及SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：12所示的编码所述人源化单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列。

4.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。

5.一种宿主细胞，其特征在于，它被权利要求4所述的表达载体转化。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，它选自大肠杆菌和COS细胞。

7.一种药物组合物，其特征在于，它含有药学上有效量的权利要求1所述的人单克隆抗体以及药学上可接受的载体。

8.一种制备权利要求1所述的人源化单克隆抗体的方法，其特征在于，该方法包括：

a)提供一表达载体，该表达载体含有权利要求2所述的DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列；

b)用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞；

d)分离纯化获得所述人源化的单克隆抗体。