CN101165068B - 抗HER2/ErbB2抗原的单克隆抗体及其制备方法和药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗HER2/ErbB2抗原的鼠源性单克隆抗体，它的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQID No.2所示。本发明还公开了上述抗HER2/ErbB2抗原的嵌合抗体、人源性抗体及重组抗体，上述抗体对HER2/ErbB2抗原表达阳性的乳腺癌/卵巢癌具有明显的生长抑制作用。此外，本发明还公开了上述抗体的制备方法和含有上述抗体的药物组合物。

Description

抗HER2/ErbB2抗原的单克隆抗体及其制备方法和药物组合物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗HER2/ErbB2抗原的单克隆抗体。此外，本发明还涉及该单克隆抗体的制备方法以及含有该单克隆抗体的药物组合物。

背景技术

乳腺癌是妇女常见的恶性肿瘤，在欧美国家的发病率占女性恶性肿瘤的首位。近20年来乳腺癌的发病率有明显上升趋势。在美国，自1960年以来，乳腺癌的发病率和死亡率分别增长了10.6％和7.6％。我国虽然属乳腺癌相对低发地区，但发病率正逐年上升。据2000年发表的11个市县调查资料表明，乳腺癌的发病率在妇女恶性肿瘤中已由1959年的第2位跃居于第1位，上海的粗发病率为10万分之35。环境因素对乳腺癌发病的影响超过遗传因素的影响，可以预见，在今后一段时间内，随着越来越多的农村妇女走进城市，而城市女性受到更多西方文化的影响，我国城乡妇女乳腺癌的发生率还会进一步上升。

原癌基因HER2/ErbB2编码的蛋白质是一种酪氨酸激酶受体，HER2/HER2同二聚体化以及HER2/HER3和HER2/HER4异二聚体化是HER2发挥生物活性所必需，在肿瘤细胞增生、存活和对抗药物治疗方面发挥重要作用。乳腺、卵巢、肺、胃、前列腺等十余种癌症中均显示部分患者有过量表达的HER2/ErbB2蛋白，尤其对于乳腺癌、卵巢癌，HER2/ErbB2已被国际公认是一个重要的临床指标。目前认为约有30％的原发性乳腺癌患者具有HER2/ErbB2高表达。具有HER2/ErbB2高表达的乳腺癌多数分化差、癌细胞倍增速度快、侵袭性强，内分泌治疗依赖性差，患者肿瘤恶性程度高，对TAM(三苯氧胺，Tamoxifen)及非蒽环类药物如CMF方案(CTX、MTX、5-Fu)耐药，治愈率低，易发生转移及术后复发，因此HeR-2/cerbB-2可作为乳腺癌化疗和内分泌治疗重要反应的预示指标及基因治疗的靶点。1986年，美国的Mark.I.Greene教授最早发现，针对鼠HER2/ErbB2的单克隆抗体对高表达HER2/ErbB2的人乳腺癌细胞及移植入小鼠的肿瘤有明显的抑制作用。随后，美国Genentech公司在鼠HER2/ErbB2单抗4D5的基础上，采用重组DNA技术研制出了命名为Herceptin的人源化单克隆抗体，并于1998年底通过了美国食品和药品监督管理局(FDA)的批准上市，该抗体选择性地作用于肿瘤表面的HER2/ErbB2，能显著下调HER2/ErbB2的表达，此作用可逆转细胞的恶性表型，抑制癌细胞的生长并解决因HER2/ErbB2高表达而造成的化疗耐药现象。在临床使用中，Herceptin与化疗药物结合使用时，不但显著地抑制了高表达HER2/ErbB2乳腺癌组织的生长，而且能使肿瘤发生逆转，由癌细胞变回正常细胞，且副作用远远小于传统化疗，用于治疗晚期乳腺癌患者能显著提高病人的生存期。

综上所述，本领域需要生物活性更高的抗HER2/ErbB2的单克隆抗体，若能再筛选多个具有这种功能且活性又高的单克隆抗体，可以提高临床试验的成功率，对提高此类抗体抗肿瘤的临床效应是一件极有意义的工作。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种特异性结合HER2/ErbB2的鼠源性单克隆抗体，及其嵌合抗体、人源性抗体和重组抗体，其对HER2/ErbB2抗原表达阳性的乳腺癌和卵巢癌有明显的抑制作用。

本发明要解决的技术问题之二是提供一种上述抗体的制备方法。

本发明要解决的技术问题之三是提供一种含有上述任何一种抗体的药物组合物。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种特异性结合HER2/ErbB2的鼠源性单克隆抗体，它包含重链可变区和轻链可变区，所述的抗体重链可变区具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；所述的轻链可变区具有SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列。

本发明另外提供了建立在鼠源性单克隆抗体可变区基因序列基础上的鼠/人嵌合抗体的全长氨基酸序列，所述重链全长氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示；轻链全长氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。其中抗体与其抗原结合单元经过各种修饰(如PEG修饰等)，包括氨基酸残基的取代和氨基酸表面基团的修饰以改善药物特性为目的，如延长半衰期和降低免疫原性。

本发明第三方面提供了一种人源性抗体，将上述鼠源性单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区基因进行人源化改造，包括框架区和抗原结合区域/互补决定区的氨基酸置换。其中抗体与其抗原结合单元经过氨基酸表面基团的修饰以改善药物特性为目的，如延长半衰期和降低免疫原性。

本发明第四方面提供了一种重组抗体，包含上述抗体的序列，它不仅能与HER2/ErbB2抗原结合，阻止HER2/ErbB2抗原同二聚体的形成，而且可以阻止HER2/ErbB3和HER2/ErbB4异二聚体的形成。

本发明第五方面提供了一种表达载体，含有上述抗体或抗体片段的编码基因，将上述抗体或抗体片段的编码基因在哺乳动物细胞内翻译表达为蛋白质或多肽。

本发明第六方面提供了一种宿主细胞，它由上述表达载体转化而成，能够表达上述抗体或抗体片段，包括CHO，BHK，NSO和COS细胞等。

本文所采用的术语“单克隆抗体(单抗)”指从一纯系细胞得到的免疫球蛋白，具有相同的结构和化学特性，对单一抗原决定簇有特异性。单克隆抗体与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤或重组工程细胞培养获得，不会混杂有其它免疫球蛋白。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。

“嵌合抗体”系将鼠源性单克隆抗体重链、轻链可变区基因分别与人重链、轻链人恒定区基因融合，通过基因工程手段在动物细胞表达获得的鼠/人杂合抗体，旨在降低鼠源性单克隆抗体的免疫原性，减少在人体应用时所产生的免疫反应。“人源化抗体”系将鼠源性单克隆抗体的氨基酸序列除保留互补决定区(CDR)外，其它所有序列(包括可变区中的框架区序列)全部替换成人免疫球蛋白的氨基酸序列，以达到通过基因工程手段最大限度地降低鼠源性单克隆抗体的免疫原性。

本文所用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)。其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中成为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷1，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

本发明第七方面提供了一种上述抗体的制备方法，包括：

步骤1，提供一种表达载体，该表达载体含有上述抗体的基因序列；

步骤2，用步骤1所述的表达载体转化宿主细胞；

步骤3，在适合所述抗体表达的条件下培养步骤2所得的宿主细胞；

步骤4，分离纯化获得所述的抗体。

本发明的单克隆抗体通常可通过以下方法制备。

首先，提供制备本发明鼠源性单克隆抗体的杂交瘤生产方法。

其次提供将本发明鼠/人嵌合抗体的基因序列构建入动物细胞表达载体的方法。本发明中所用的表达载体包括本领域技术人员已知的各种市售的表达载体，例如购自Invitrogen和Promega公司的表达载体。随后，用上述获得的表达载体转染动物细胞类的宿主细胞，包括CHO，BHK，NSO和COS细胞等。

最后，在适合本发明单克隆抗体表达的条件下，培养上述杂交瘤细胞和工程细胞，利用离子交换层析、疏水层析和分子筛层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的鼠源性单克隆抗体和鼠/人嵌合抗体。

本发明第八方面提供了一种用于治疗HER2/ErbB2抗原表达阳性的乳腺癌和卵巢癌的药物组合物，含有药学上有效量的上述抗体，和药学上可接受的载体。本文所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当的给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的抗体相容，即能与其共混而不会在通常情况下降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween

；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。

本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。

附图说明

图1、图3、图5、图7、图9、图11是抗HER2/ErbB2单克隆抗体FDZJ-1、FDZJ-2、FDZJ-3、FDZJ-4、FDZJ-5、FDZJ-6的生物活性测定结果示意图(测活细胞株为HER2/ErbB2中度水平表达的乳腺癌细胞株MCF-7)；

图2、图4、图6、图8、图10、图12是抗HER2/ErbB2单克隆抗体高表达细胞株FDZJ-1、FDZJ-2、FDZJ-3、FDZJ-4、FDZJ-5、FDZJ-6的生物活性测定结果示意图(测活细胞株为HER2/ErbB2高表达的乳腺癌细胞株SK-BR3)；

图1-图12中的FDZJ-1、FDZJ-2、FDZJ-3、FDZJ-4、FDZJ-5、FDZJ-6表示6个抗HER2/ErbB2单克隆抗体，以抗HER2/ErbB2人源化抗体Herceptin作为阳性对照；以市售人IgG1作为阴性对照。

图13是鼠/人嵌合抗体表达载体的质粒图谱。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1.鼠源抗Her2单克隆抗体可变区的克隆和测序

A)免疫小鼠

将包含编码全长人HER2/ErbB2 cDNA序列的表达载体转染小鼠细胞株NIH-3T3，筛选一稳定表达人HER2/ErbB2的NIH-3T3单克隆细胞株作为免疫原。采用总量为5×10⁷新鲜培养HER2/ErbB2+的NIH-3T3细胞，加入完全弗氏佐剂，充分研磨至完全乳化后，皮下多点注射10日龄Balb/c小鼠，每点注射50微升，共6点。然后每隔1周注射加强免疫，共5次重复，同时对血清抗体水平进行监测。最后一次静脉注射5×10⁶新鲜免疫细胞/PBS混合液，3日后杀死小鼠，取出脾脏。

B)细胞融合

分离出脾脏单细胞，并确定细胞活性大于90％。将脾脏细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞以10∶1的比例混合离心共沉淀，在37℃水浴锅中加入PEG(1400MW)进入细胞融合，融合时间为1分钟、2分钟、5分钟和10分钟。在各时间点加入新鲜无血清培养基1毫升、2毫升、5毫升和10毫升。离心沉淀后将细胞加入到20％FCS RPM1-1640培养液中，转入96孔板进行培养。37℃培养24小时后，加入含HAT的选择培养液。每3天更换新鲜培养基1次至长出克隆。

C)克隆筛选

选择单克隆形成孔，在第14天取出上清液，进行HER2/ErbB2抗原包板的ELISA检测，保留阳性孔。亚克隆3次后选出6个高表达细胞株，分别命名为FDZJ-1、FDZJ-2、FDZJ-3、FDZJ-4、FDZJ-5、FDZJ-6。

D)抗HER2/ErbB2单克隆抗体的生物活性评价

用蛋白质A法纯化上述单克隆抗体细胞株的培养上清，测定单克隆抗体的生物活性，测定结果如图1-图12所示，测活细胞株为HER2/ErbB2高表达的乳腺癌细胞株SK-BR3和HER2/ErbB2中度水平表达的乳腺癌细胞株MCF-7。上述克隆只有FDZJ-6分泌的单克隆抗体对上述两个细胞均有明显的生长抑制作用，而其它克隆与已上市抗HER2/ErbB2人源化抗体Herceptin(购自Roche公司)一样仅对HER2/ErbB2高表达的乳腺癌细胞株SK-BR3的生长有抑制作用，而对MCF-7乳腺癌细胞株无生长抑制作用。实验重复三次，取平均值作为比较参数。以市售人IgG1作为阴性对照，阳性对照为抗人HER2/ErbB2的人源化抗体Herceptin。经过鉴定FDZJ-6为IgG2a。

结果表明，FDZJ-6单克隆抗体对乳腺癌细胞有明显的抑制作用，其作用强度明显高于阳性对照Herceptin，因此上述FDZJ-6单克隆抗体具有明显优于现有商品Herceptin的生物活性。

E)抗HER2/ErbB2单克隆抗体FDZJ-6可变区基因的克隆和测序

根据鼠抗体基因的保守性，设计以下引物以克隆该单克隆抗体的可变区编码序列。

VL-有义：5`-tcctctagacagctgacccagtctcca-3`(SEQ ID NO：5)

VL-反义：5`-gttgctagcccagcttggtacchscdccgaa-3`(SEQ ID NO：6)

VH-有义：5`-aggaagctttgcagsagtcwgg-3`(SEQ ID NO：7)

VH-反义：5`-tgacgtacgggtgaccgtggtcccttggccccat-3`(SEQ ID NO：8)

在上述引物中，H＝a、c或t；S＝c或g；D＝a，g或t；R＝a或g；W＝a或t。

采用Invitrogen公司的Trizol试剂盒，从上述获得的FDZJ-6杂交瘤细胞株中抽提纯化总RNA，整个操作步骤按照厂家的说明书进行。在1％琼脂糖电泳上鉴定上述纯化总RNA的质量后，按照生产商说明书用Invitrogen公司的反转录酶进行反转录，获得总RNA的cDNA。将获得的VH和VL cDNA分别插入pUC18载体，转化大肠杆菌Top10F’，接种于100mlLB培养基中扩增。利用Qiagen公司超纯质粒纯化试剂盒(UltrapurePlasmid DNA Purification Kit)，按照生产商说明书抽提纯化DNA。将扩增后的细菌质粒抽提并进行序列测定，测得的VH和VL氨基酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

实施例2.鼠/人嵌合抗体表达载体的构建

将上述单克隆抗体FDZJ-6重、轻链可变区基因(VH，VL)分别插入表达载体的相应位点中，构建表达完整人鼠嵌合抗体的真核表达载体。表达载体质粒图谱如图13所示。

实施例3.鼠/人嵌合抗体的表达和鉴定

将上述构建好的鼠/人嵌合抗体表达载体pL101/FDZJ-6转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆接种于500ml LB培养基中扩增。利用Qiagen公司超纯质粒纯化试剂盒(Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit)，按照生产商说明书抽提纯化DNA。采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒将上述质粒DNA分别转染CHO、BHK、NSO和COS细胞，操作方法按照生产商说明书进行。

转染后24-48小时将细胞培养基更换为含相应药物的筛选培养基，每3-4天更换筛选培养基一次直至细胞克隆形成。待细胞克隆直径达1-2mm时用克隆环从平板上挑取单克隆转接入24孔板中。单细胞克隆在24孔板中长至50-70％满层时，取各克隆的培养上清进行ELISA检测，选取表达量高的细胞克隆进行药物加压扩增筛选。待筛选药物的浓度上升至最高时检测各克隆单细胞的表达量，选取表达量高且细胞生长状态良好的细胞进行扩增培养，收液。

将包板抗体(抗人IgG γ链特异性抗体)用包被液(pH9.6 CBS)稀释到一定浓度(1ug/ml)后包被于96孔板上，100ul/孔，于2～8℃放置过夜。弃去孔中液体，用PBST洗3次，甩干后加入400μl/孔的封闭液(1％BSA PBST)，室温2hr，再用PBST洗3次，甩干。用稀释液稀释标准品至一定浓度，表达上清根据情况适当稀释，以100μl/孔复孔加样至96孔板中，37℃孵育1hr，弃液，洗板3次，甩干。用稀释液稀释酶联抗体(HRP-抗人IgG κ链特异性抗体)至一定浓度(1∶20000)，以100μl/孔加至96孔板中，37℃下反应1hr，弃液，洗板3-6次，甩干。配制底物混合液，以100μl/孔加入到96孔板中，37℃孵育10min。加入终止液50μl/孔，终止反应。在490nm处读取吸收值OD，根据标准曲线计算样品的含量。

实施例4.鼠/人嵌合抗体的生物学活性评价

测活细胞株为HER2/ErbB2高表达的乳腺癌SK-BR3，HER2/ErbB2中度水平表达的乳腺癌MCF7。

取对数生长期的SK-BR3和MCF7细胞株各一瓶，胰蛋白酶消化计数，加入细胞培养液调整细胞密度至1±0.1×10⁵/ml，将细胞悬液接种于96孔板各孔，每孔100ul，37℃，5％CO₂通气培养过夜。根据样品浓度，用细胞培养基将样品进行梯度稀释，工作浓度依次为：0ug/ml、1ug/ml、2ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml、20ug/ml、30ug/ml、50ug/ml、75ug/ml和100ug/ml，十个梯度，100μl/孔，每梯度三个复孔加样至96孔板中的细胞孔中。将加完样的96孔板放置在37℃，5％CO₂恒温培养箱中，37℃-5％CO₂条件下培养3天后采用结晶紫法对96孔板中的活细胞进行染色，570nm处读取吸收值OD。实验重复三次，取平均值作为比较参数，以人IgG1作为阴性对照。

FDZJ-6抑制MCF-7细胞的EC50值为187.8ug/ml

FDZJ-1抑制SK-BR3细胞的EC50值为182.1ug/ml

FDZJ-2抑制SK-BR3细胞的EC50值为223.2ug/ml

FDZJ-3抑制SK-BR3细胞的EC50值为320ug/ml

FDZJ-4抑制SK-BR3细胞的EC50值为206.2ug/ml

FDZJ-5抑制SK-BR3细胞的EC50值为386.5ug/ml

FDZJ-6抑制SK-BR3细胞的EC50值为166.2ug/ml

人源化抗体Herceptin抑制SK-BR3细胞的EC50值为359.7ug/ml

结果表明来源于FDZJ-6的鼠/人嵌合抗体与FDZJ-6单克隆抗体一样对上述两个细胞均有明显的抑制作用，而对照人源化抗体Herceptin仅对HER2/ErbB2高表达的乳腺癌SK-BR3有抑制作用，而对MCF-7肿瘤细胞无抑制作用。FDZJ-6的鼠/人嵌合抗体对乳腺癌细胞有明显的抑制作用，其作用强度明显高于阳性对照Herceptin，因此上述FDZJ-6的鼠/人嵌合抗体具有明显优于现有商品Herceptin的生物活性。

                       序列表

Claims (6)

1.一种鼠源性单克隆抗体，该抗体特异性结合人HER2/ErbB2抗原，它包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，所述的重链可变区为SEQID No.1所示的氨基酸序列；所述的轻链可变区为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

2.一种嵌合抗体，其特征在于，将编码权利要求1所述的重链可变区和轻链可变区的基因分别与编码人重链、轻链恒定区的基因融合，重链全长氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；轻链全长氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

3.一种表达载体，其特征在于，含有编码权利要求1或2所述抗体的基因序列。

4.一种宿主细胞，其特征在于，它由权利要求3所述的表达载体转化而成。

5.一种如权利要求1或2所述的抗体的制备方法，其特征在于，包括：

步骤1，提供一种表达载体，该表达载体含有编码权利要求1或2所述抗体的基因序列；

步骤2，用步骤1所述的表达载体转化宿主细胞；

步骤3，在适合所述抗体表达的条件下培养步骤2所得的宿主细胞；

步骤4，分离纯化获得所述的抗体。

6.一种用于治疗HER2/ErbB2抗原表达阳性的乳腺癌的药物组合物，其特征在于，含有药学上有效量的如权利要求1或2所述的抗体和药学上可接受的载体。

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