CN106554415B - Her2线性表位中和活性单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供HER2线性表位中和活性单克隆抗体及其应用。将含有HER2胞外区Domain 2/3之间374‑398位氨基酸的多肽，序列如SEQ ID NO.5，与载体蛋白偶联免疫小鼠制备获得多株杂交瘤细胞分泌可以特异性识别乳腺癌细胞表面HER2且具有中和活性的单克隆抗体。本发明提供了上述多肽在制备HER2单抗及治疗以HER2为靶标的疾病治疗药物中的应用。本发明的单抗与HER2结合的亲和力介于1‑4nM，结合到肿瘤细胞表面的HER2后，能够有效抑制肿瘤细胞的增殖，诱导HER2内吞，成为非常理想的生物靶向治疗抗体，将本发明的单抗与曲妥珠或帕妥珠联合用药，可增强治疗效果，具有显著的市场价值。

Description

HER2线性表位中和活性单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及免疫学领域及抗体制备技术，具体地说，涉及抗HER2线性表位中和活性单克隆抗体及其应用。

背景技术

人表皮生长因子受体2(HER2)是表皮生长因子受体(ErbB2)家族中的一员，是相对分子质量为185000的跨膜受体样蛋白，具有酪氨酸激酶活性。HER2是重要的乳腺癌预后判断因子，HER2阳性(过表达或扩增)的乳腺癌，其临床特点和生物学行为有特殊表现，治疗模式也与其他类型的乳腺癌有很大的区别。作用于HER-2靶点的药物，是目前治疗乳腺癌最常用最有效的药物，主要有曲妥珠单抗、帕妥珠单抗等。

基因泰克公司早在1997年就上市了第一个针对乳腺癌标志物HER2的抗体药物赫赛汀(Herceptin，注射用曲妥珠单抗)，每年销售额可达50多亿美元，目前成为仿制药的热点。2012年基因泰克又推出一种针对HER-Domain2位点的抗体药，与赫赛汀联合使用治疗效果更佳。2013年3月，基因泰克又上市了赫赛汀和药物DM1偶联物，对癌症晚期病人也有非常好的疗效。如果能开发出与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的抗原位点不同的新的单抗药物，不仅有利于打破垄断，降低现有药物的市场份额，降低癌症治疗成本，还有利于丰富治疗癌症的抗体药物种类，与现有药物联合用药、增加疗效并巩固治疗效果。但目前还没有针对Domain 2/3位点的单抗药物的报道。

发明内容

本发明的目的是提供针对与曲妥珠单抗识别表位不同的人表皮生长因子受体2(HER2)单克隆抗体及其应用。

本发明提供的HER2线性表位中和活性单克隆抗体是以HER2氨基酸序列第374-398的多肽偶联到KHL载体蛋白作为免疫原免疫小鼠后，制备杂交瘤细胞，筛选能够稳定分泌特异性识别乳腺癌细胞表面HER2且具有生物学活性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。上述用于免疫小鼠的多肽序列为：SLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQ。

本发明提供了人表皮生长因子受体2的线性表位多肽在制备HER2线性表位中和活性单克隆抗体中的应用，所述多肽的氨基酸序列为SLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQ，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明提供了人表皮生长因子受体2的线性表位多肽在制备以HER2为靶标的疾病治疗药物中的应用，所述多肽的氨基酸序列为SLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQ，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明将上述多肽序列与载体蛋白偶联作为免疫原制备获得的单克隆抗体能够特异性地识别HER2蛋白的多肽序列，共获得40个阳性克隆，复筛筛选出6个阳性克隆，进一步中和活性试验筛选出2个阳性克隆，将这两个单克隆抗体分别称之为clone2H4和clone2D9。

本发明提供了HER2线性表位中和活性单克隆抗体clone2H4，

i)其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；以及

ii)其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明提供了产生单克隆抗体clone2H4的杂交瘤细胞。

本发明提供了单克隆抗体clone2H4在制备以HER2为靶标的疾病治疗药物中的应用。

本发明提供了含有单克隆抗体clone2H4的药物、检测试剂或试剂盒。

本发明还提供了HER2线性表位中和活性单克隆抗体clone2D9，

i)其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；以及

ii)其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

产生单克隆抗体clone2D9的杂交瘤细胞属于本发明的保护范围。

本发明提供了单克隆抗体clone2D9在制备以HER2为靶标的疾病治疗药物中的应用。

含有单克隆抗体clone2D9的药物、检测试剂或试剂盒也属于本发明的保护范围。

本发明还提供抗HER2线性表位中和活性单克隆抗体clone2H4或clone2D9的制备方法，以HER2为靶蛋白，设计合成含有HER2胞外区Domain 2/3之间第374-398位氨基酸的多肽，与载体蛋白KLH偶联作为免疫原，免疫小鼠制备获得。其中，所述多肽的氨基酸序列为：SLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQ。

使用可以诱发机体产生免疫反应并生成具有中和效应抗体的多肽序列，偶联至KLH载体蛋白作为免疫原免疫小鼠，采用杂交瘤技术经过细胞融合并筛选得到能持续、稳定分泌抗HER2单克隆抗体的杂交瘤细胞株，由该细胞株分泌得到单克隆抗体。

优选地，上述多肽序列选自HER2：

含有SLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQ。

本发明提供的HER2线性表位中和活性单克隆抗体clone2H4和clone2D9具有良好的亲和力，实验表明，clone2H4和clone2D9与HER2阳性细胞SK-BR-3细胞的亲和力EC50为1-4nM。能够结合到SK-BR-3细胞表面HER2，有效地抑制乳腺癌细胞的增值生长，且诱导HER2内吞，可以成为非常理想的生物靶向治疗抗体。

此外本发明的单克隆抗体识别的是一个在HER2胞外区Domain2/3之间序列的一个线性表位，与帕妥株单抗和曲妥珠单抗的识别HER2表位完全不同，可以和它们二者联合用药，增强治疗效果，在乳腺癌的治疗中有着广阔的前景。

附图说明

图1为本发明实施例1通过间接ELISA法筛选识别HER2的阳性克隆，其中筛选了600个克隆，阳性克隆178个，挑选较好的40个阳性克隆进行下一步复筛。

图2是本发明实施例2中单抗的SDS-PAGE电泳图，其中M是蛋白分子量标准(kDa)，clone2H4和clone2D9分别为本发明获得的两个单克隆抗体；

图3A和图3B分别为clone2H4和clone2D9结合SK-BR-3细胞流式细胞仪检测图，显示能够结合到SK-BR-3细胞表面。

图4A为本发明实施例4中clone2H4结合SK-BR-3细胞流式细胞仪检测图，clone2H4的抑制效果达到40％；图4B为clone2D9结合SK-BR-3细胞流式细胞仪检测图，clone2D9的抑制效果达到30％，均显示良好的中和活性。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1产生clone2H4和clone2D9的杂交瘤细胞系的建立

一、实验材料

1、免疫原：以HER2作为靶蛋白，从中选取一段多肽序列(HER2胞外区Domain 2第266-296位氨基酸的多肽)，序列如下：SLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQ。

采用化学合成的方式制备上述多肽，纯度要求大于90％。将多肽与KLH偶联制备成免疫原。

2、培养基：DMEM培养基购自Hyclone公司，HAT、HT选择培养基、降植烷购自sigma公司。

3、实验动物：Balb/c小鼠，8-12周龄，雌性，SPF级动物培养。

4、其他材料：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂购自Sigma公司，PEG4000购自Fluka公司，HRP-山羊抗小鼠IgG抗体购自JacksonImmune公司，其余试剂均为国产分析纯产品。

二、杂交瘤细胞系的建立

1、动物免疫

1)基础免疫：将抗原与福氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，分点皮下注射，每只Balb/c小鼠每次注射量为100μg。

2)加强免疫：加强免疫采用抗原与福氏不完全佐剂的乳化液。在进行细胞融合前3天，经腹腔注射含150μg抗原的生理盐水溶液。

2、杂交瘤细胞的制备

按常规方法收集小鼠的脾细胞与SP2/0细胞按10:1的比例以500g/L的PEG4000进行融合。用HAT培养液选择培养，融合后10-15天，取上清采用间接ELISA法筛选分泌抗HER2抗原的杂交瘤细胞株。对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆。间接ELISA法的操作步骤如下：用200μl的HER2包板，用免疫小鼠血清1:2000作为阳性对照，无克隆生长的培养基上清和正常小鼠血清作为阴性对照，每孔加1:2000HRP-山羊抗小鼠IgG 100μl，最后测定450nm OD值。OD450值大于阴性对照2倍以上者，即可初步判定为阳性克隆。共获得了178个阳性克隆，从中挑选出40个较好的阳性克隆。(见图1)

3、杂交瘤细胞系的建立

经过4次亚克隆和间接ELISA或细胞ELISA筛选，得到6株分别针对HER2，识别SK-BR-3细胞的稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系。(见表1)

表1

Clone编号	OD值	Clone编号	OD值	Clone编号	OD值
						<u>1A7</u>	0.444	1B7	0.244	1E10	0.089
2D11	0.112	2E1	0.119	2E7	0.106
						3A10	0.121	3A11	0.238	3E6	0.174
5F4	0.099	5F5	0.093	5F6	0.106
						1F8	0.122	<u>1G12</u>	0.772	1G6	0.084
2F3	0.291	2F8	0.174	2G4	0.156
						3F1	0.253	3F2	0.139	3H10	0.342
6A9	0.129	6B10	0.16	<u>6B12</u>	0.638
						1H10	0.138	2D8	0.085	<u>2D9</u>	1.859
<u>2H4</u>	1.062	2H5	0.12	3A8	0.099
						4B7	0.295	4D3	0.113	5B10	0.083
6C1	0.089	6C2	0.094	6G6	0.077
						2D10	0.072	NC	0.126
3A9	0.091	NC	0.132

<u>5D11</u>	1.268	PC	0.184
						6H10	0.083	PC	0.138

4、应用上述杂交瘤细胞系所得单抗的效价检测

1)小鼠腹水效价测定：间接ELISA法检测上述杂交瘤细胞制备的腹水效价为：＞1：20000000。

2)纯化抗体效价测定：间接ELISA法检测上述杂交瘤细胞制备的纯化抗体效价为：＞0.05ng/ml。

5、杂交瘤细胞系的传代培养

将上述杂交瘤细胞系在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中继续进行培养、传代，培养到10代后，杂交瘤细胞系仍然能够生长良好、稳定传代，培养液上清效价仍然可以达到1:10000以上。

以上结果表明，所得杂交瘤细胞系能够稳定传代，可以持续、稳定分泌抗HER2的单克隆抗体。

获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必须将一部分杂交瘤细胞保存，否则在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性。另外在长期的培养过程中，难免不发生污染以至于毁灭。因此必须冷藏保存一部分。保存方法如下：

(1)材料

1)细胞：取对数生长期的细胞。

2)10％二甲基亚砜保护液(二甲基亚砜能损坏滤器，而又被高压所破坏，所以不能过滤或高压消毒。其本身就是毒品，无菌)：含10％二甲基亚砜、20％灭活胎牛血清，70％RPMI-1640液。

3)20％FCS-1640培养液：含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml。

4)灭菌的2ml安瓶等。

(2)操作方法

去掉细胞培养瓶中的旧的培养液，加入10％FCS-1640液，使细胞悬浮。1000r/min离心10min，去上清。细胞沉淀用10％二甲基亚砜保护液制成悬液，使成1.0×10⁷细胞/ml。取样，台盼兰染色，计数活细胞，应在95％以上。用注射器将细胞分装安瓶，每瓶0.5ml-1.0ml，熔封安瓶。放4℃2h。放液氮罐气态部分(-70℃)15h。转入液氮部分。

实施例2抗HER2的单克隆抗体的制备

一、抗体制备

选择成年BALB/c小鼠，腹腔接种降植烷，每只小鼠0.5ml。7-10天后腹腔接种第16代杂交瘤细胞，每只小鼠1×10⁶-2×10⁶个。间隔5天后，待腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用9号针头采集腹水。

将腹水离心(13000r/min 30分钟)，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清。用Protein G～Sepharose CL-4B进行纯化，上柱液为20mM的PBS缓冲液，柱层析洗脱液为：pH2.7，20mM的甘氨酸缓冲液，得到抗HER2的单克隆抗体。

二、抗体的鉴定

1、抗体纯度鉴定：

SDS-PAGE电泳鉴定，纯度在95％以上。(见图2)

2、抗体类及亚类鉴定：

采用间接ELISA法，使用抗小鼠各种Ig亚型的抗体鉴定上述杂交瘤细胞产生的抗体的Ig亚型，其中clone 2H4显示IgG3信号最强，clone2D9显示IgG1信号最强，依据亚型鉴定试剂盒说明中结果判定标准，Clone2H4为IgG3，Clone2D9为IgG1亚型。见表2。

表2

	IgG1	IgG2a	IgG2b	IgG3	IgA	IgM
							clone2H4	0.045	0.051	0.042	0.294	0.06	0.06
clone2D9	0.823	0.054	0.04	0.047	0.061	0.048

3、clone 2H4和clone 2D9的可变区序列测定

将两个克隆的细胞提取mRNA，反转录为cDNA，使用可变区通用引物进行高保真PCR扩增，将PCR产物片段插入到T载体内进行DNA序列测定，并将获得的序列翻译成蛋白质的氨基酸序列。clone2H4和clone 2D9的抗体的可变区氨基酸序列：clone 2H4的氨基酸序列为：轻链如SEQ ID No.1所示，重链如SEQ ID No.2所示。clone 2D9的氨基酸序列为：轻链如SEQID No.3所示，重链如SEQ ID No.4所示。将该序列进行比对后未显示有相同序列，说明所获得的序列为两个克隆各自特异的序列。

实施例3纯化抗体的亲合力实验

一、细胞ELISA法

应用clone2H4和clone2D9单抗做细胞亲和力试验，确定其与HER2阳性SK-BR-3细胞的结合EC50值，见表3。

表3

检测方法：第一天进行SK-BR-3细胞的铺板准备，选取生长良好的SK-BR-3细胞，无菌PBS洗三次，加入0.1％的胰蛋白酶消化细胞1-3分钟，加入含10％FBS的DMEM培养基5ml，离心后获得细胞，细胞计数后调成1×10⁵/ml，每孔200μl铺到96孔中，过夜培养。第二天，细胞去掉培养上清后，PBS洗2次，加入95％的酒精固定15min。固定细胞后，无菌水清洗细胞2次后加入200μl/well5％的脱脂牛奶封闭1h。PBS清洗三次后，加入梯度稀释的Clone 2H4，Clone2D9，37℃孵育1h后，PBS清洗三次后加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的鼠二抗(1:2000)孵育1h后，PBS清洗5次(前三次5min，最后2次10min)加入显色剂显色15min上机检测OD450。

其中显色剂A液配方为每1000mL水中加入过氧化脲1g，10.3g柠檬酸，35.8gNa₂HPO₄·12H₂O，吐温-20100μL，pH5；B液配方为每1000mL蒸馏水中加入四甲基联苯胺(TMB)700mg(40mL DMSO溶解)，10.3g柠檬酸，pH2.4。

检测clone 2H4和clone2D9的EC50值皆达到1.3nM，显示较高的亲和力。

二、流式细胞仪检测

细胞准备：取对数期生长的SK-BR-3细胞，吸除细胞上清，5－10ml PBS清洗一次。加入2ml 0.1％胰酶37℃消化5min，加入含10％FBS的DMEM终止消化，1400转离心3min收集细胞。加入无胎牛秀清的DMEM清洗细胞三次后，PBS重悬细胞后1400转离心3min收集细胞，加入20ug/ml抗体后4℃孵育1h。1400转离心3min收集细胞，PBS清洗细胞三次后，加入FITC标记鼠二抗(1:100)4摄氏度孵育30min后，400转离心3min收集细胞。PBS清洗三次后，上流式细胞仪检测收集荧光信息。

检测如图3A和图3B所示，clone 2H4和clone2D9能够结合SK-BR-3细胞上的HER2。

实施例4纯化抗体的中和活性检测

抑制高表达HER2细胞SK-BR-3细胞的增值细胞准备：取对数期生长的SK-BR-3细胞，吸除细胞上清，5-10ml PBS清洗一次。加入2ml 0.1％胰酶37℃消化5min，加入含10％FBS的DMEM或F-12终止消化，1400转离心3min收集细胞。加入8ml含10％FBS的DMEM稀释细胞，台盼蓝细胞计数法计数细胞，并用含10％FBS的DMEM稀释细胞成2×10⁴/ml.96孔板中每孔铺入100μl即2000/well，37℃，5％CO₂贴壁4h。

检测样本：在无菌的EP管中，不同浓度抗体加入到细胞孔中，每孔100μl。继续培养4d，期间观察细胞的生长。去除细胞培养上清，加入配制好的CCK-8(1:10DMEM)100ul 37℃，5％CO₂继续培养1-4h。在酶标仪中读取OD450。若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μL0.1M的HCL溶液或者1％w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。

检测结果如图4A和图4B所示，clone 2H4和clone2D9能够结合SK-BR-3细胞且抑制其增值，其中clone2H4抑制SK-BR-3细胞的增值达到40％，clone2D9抑制SK-BR-3细胞的增值达到30％。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.HER2线性表位中和活性单克隆抗体clone2H4，其特征在于，

i)其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；以及

ii)其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.产生权利要求1所述单克隆抗体clone2H4的杂交瘤细胞。

3.权利要求1所述的单克隆抗体clone2H4在制备以HER2为靶标的疾病治疗药物中的应用。

4.含有权利要求1所述单克隆抗体clone2H4的药物、检测试剂或试剂盒。

5.一种单克隆抗体-药物偶联物，其特征在于，所述单克隆抗体为权利要求1所述的单克隆抗体clone2H4，所述药物是丝裂霉素或美登素类。

6.HER2线性表位中和活性单克隆抗体clone2D9，其特征在于，

i)其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；以及

ii)其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

7.产生权利要求6所述单克隆抗体clone2D9的杂交瘤细胞。

8.权利要求6所述单克隆抗体clone2D9在制备以HER2为靶标的疾病治疗药物中的应用。

9.含有权利要求6所述单克隆抗体clone2D9的药物、检测试剂或试剂盒。

10.一种单克隆抗体-药物偶联物，其特征在于，所述单克隆抗体为权利要求6所述的单克隆抗体clone2D9，所述药物是丝裂霉素或美登素类。

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