CN102143974A - 人巨细胞病毒中和抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及特异性针对中和人巨细胞病毒(hCMV)的中和抗体，特别是特异性针对于hCMV蛋白UL128、UL130和UL131A的组合的抗体。本发明的抗体以高效力中和感染。本发明还涉及产生该抗体的永生化B细胞、该抗体所结合的表位，以及该抗体和表位在筛选方法以及疾病的诊断和治疗中的用途。
Description
所有引用的文件均通过引用方式完整地结合在本文中。
技术领域
本发明涉及具有中和人巨细胞病毒(hCMV)的高效力(potency)且特异性针对hCMV蛋白UL128、UL130和UL131A的组合的抗体，以及产生该单克隆抗体的永生化B细胞。本发明还涉及通过hCMV蛋白UL128、UL130和UL131A的组合确定的、该抗体所结合的表面抗原，以及该抗体和表位在筛选方法以及疾病的诊断、预防和治疗中的用途。
背景技术
人巨细胞病毒(hCMV)是一种广泛分布的病原体，其可在免疫抑制的成人中和胎儿感染后导致严重的病理，并参与例如动脉粥样硬化的慢性疾病。hCMV感染多种细胞类型，包括成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞和造血细胞[1]。正在被开发作为候选疫苗的体外繁殖的hCMV减毒菌株已经丧失了内皮细胞的向性(tropism)，但是仍然保留感染成纤维细胞的能力[2]。hCMV的细胞向性被认为是由两种病毒糖蛋白复合物调控的。例如gH、gL和gO的糖蛋白的复合物似乎是感染成纤维细胞所需要的，而gH、gL和由UL131-UL128基因编码的蛋白质的复合物参与内皮细胞、上皮细胞和树突细胞的感染[2-8]。
超免疫球蛋白已被商业化用于预防移植相关的hCMV疾病，并且最近的证据表明它们对孕妇有治疗效果[9]。该治疗方法受限于可被递送的中和抗体的量低，因而非常需要获得具有高中和能力的人抗体(如人单克隆抗体)。然而，hCMV中和抗体的靶点仍尚待确 定。尽管一些针对gH、gB以及UL128和UL130基因产物的抗体在体外表明具有中和活性[7，10，11]，且针对gH的抗体已经在临床试验中进行了评估(由于缺乏治疗效果被终止了)，但分离的单克隆抗体的中和效力至今仍一般，因为在抗体浓度范围是0.5-20mg/ml时才可以观察到中和作用。此外，目前的方法通常使用成纤维细胞作为目标细胞来测定抗-hCMV抗体的中和效力。然而，已知hCMV通过感染其他细胞类型(例如内皮细胞、上皮细胞以及白细胞)也能引起病理。已知的针对UL 128和UL 130的抗体显示在中和内皮细胞感染中的效力很低[7]，且看起来不存在可用的能够以高效力中和目标非成纤维细胞的感染的单克隆抗体。
因此，需要能够以高价中和目标非成纤维细胞的hCMV感染的抗体，以及阐明该抗体结合的靶点。
发明概述
本发明部分是基于能够以高效力中和hCMV感染的新抗体以及本发明的这些抗体所结合的新表位的发现。因此，在一个实施方式中，本发明包括具有中和hCMV的高效力的中和抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段特异性针对hCMV蛋白UL128、UL130和UL131A的组合。
在另一个实施方式中，本发明包括编码本发明抗体或抗体片段的核酸分子。
在再一个实施方式中，本发明包括含有编码本发明抗体或抗体片段的核酸分子的载体。
在另一个实施方式中，本发明包括含有包含本发明核酸分子的载体的细胞。
在另一个实施方式中，本发明包括表达具有中和hCMV的高效力的抗体的永生化B细胞克隆，其中所述抗体特异性针对hCMV蛋白UL128、UL130和UL131A的组合。
在再一个实施方式中，本发明包括与本发明的抗体相结合的表 位。
在进一步的实施方式中，本发明包括包含与本发明的抗体相结合的表位的免疫原性多肽。
在另一个实施方式中，本发明包括与结合本发明的抗体的表位相结合的配体。
在进一步的实施方式中，本发明包括用于制备具有中和hCMV的高效力的抗体的方法，其中所述的抗体特异性针对hCMV蛋白UL128、UL130和UL131A的组合。该方法包括(i)培养表达本发明抗体的永生化B细胞克隆和(ii)从B细胞分离抗体。
在另一个实施方式中，本发明包括一种包含本发明抗体或抗体片段、本发明的核酸、表达本发明抗体的永生化B细胞克隆，或包含与本发明的抗体或抗体片段相结合的表位的免疫原性多肽的药物组合物。
在进一步的实施方式中，本发明包括具有中和hCMV的高效力的抗体或抗体片段(其中所述抗体特异性针对hCMV蛋白UL128、UL130和UL131A的组合)、编码具有中和hCMV的高效力的抗体或抗体片段的核酸(其中所述抗体特异性针对hCMV蛋白质UL128、UL130和UL131A的组合)、表达具有中和hCMV的高效力的抗体的永生化B细胞克隆(其中所述抗体特异性针对hCMV蛋白质UL128、UL130和UL131A的组合)，或包含结合具有中和hCMV的高效力的抗体的表位的免疫原性多肽(其中所述抗体特异性针对hCMV蛋白质UL128、UL130和UL131A的组合)在治疗或诊断中的应用。
在另一个实施方式中，本发明包括一种用于诊断hCMV感染的试剂盒，其包含本发明抗体或抗体片段、编码本发明的抗体或抗体片段的核酸，或结合本发明抗体的表位。
在另一个实施方式中，本发明包括用于制备重组细胞的方法。该方法包括：(i)对来自表达本发明抗体的永生化B细胞克隆的核酸进行测序和(ii)利用获自步骤(i)的序列信息来制备用于插入至表达宿 主以允许在该宿主中表达目的抗体的核酸。
在进一步的实施方式中，本发明包括用于制备具有中和hCMV的高效力并且特异性针对hCMV蛋白UL128、UL130和UL131A的组合的抗体的方法。该方法包括培养或传代培养通过上述方法获得的表达宿主，且任选地纯化目的抗体。
在另一个实施方式中，本发明包括筛选可诱导针对hCMV的免疫应答的多肽的方法，包括利用本发明的抗体或抗体片段筛选多肽库。
附图简述
图1显示了表明人单克隆抗体(mAb)6G4识别通过hCMV蛋白UL128、UL130和UL131A的组合所确定的表位的FACS分析。
图2显示了抗体6G4的重链和轻链的核苷酸和氨基酸序列。CDR序列为粗体。
发明详述
本发明是基于中和hCMV感染和具有中和hCMV感染的特别高的效力的抗体和抗体片段的制备的。这些抗体是令人想要的，因为仅需低浓度就能中和一定量的病毒。施用较低量的抗体就能有利于高水平的保护。人单克隆抗体和分泌这些抗体的永生化B细胞克隆也同样包含在本发明的范围之内。
本发明人发现了针对hCMV蛋白UL128、UL130和UL131A的组合的抗体在中和hCMV中是特别有效的。不希望局限于任何理论，该组合可以是形成由抗体识别的独特表位的UL128、UL130和UL131A的精确复合物。
本发明还涉及对抗体所结合的表位的表征以及表位在提高免疫应答中的用途。
本发明还涉及不同的涉及本发明抗体和它们结合的表位的方法和用途。
本发明的抗体
本发明提供了具有中和hCMV的特别高的效力的单克隆抗体或重组抗体。本发明还提供了这些单克隆或重组抗体的片段，特别是保留了所述抗体的抗原结合活性的片段。在本说明书中，“中和hCMV的高效力”是指本发明的抗体分子在标准检测中以比本领域公知的抗体(例如与MSL-109、8F9或3E3相比)低得多的浓度中和hCMV。
在一个实施方式中，本发明的抗体分子能以0.16μg/ml或更低的浓度(即0.15、0.125、0.1、0.075、0.05、0.025、0.02、0.015、0.0125、0.01、0.0075、0.005、0.004、0.003、0.002或更低)中和hCMV。在另一个实施方式中，该抗体能以0.016μg/ml或更低(即以比例如10-8 M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M更低的抗体浓度)的浓度中和hCMV。这意味着，与中和相同效价的hCMV所需的公知抗体(例如MSL-109、8F9或3E3)的浓度相比，体外中和50％的hCMV临床分离物只需要非常低的抗体浓度。在另一个实施方式中，体外中和50％的hCMV临床分离物中内皮细胞、上皮细胞和树突细胞感染所需的本发明抗体的浓度比MSL-109、8F9或3E3所需的浓度低10倍或更高(即25、50、75、100、150、200或更高)。可采用本领域的标准中和检测测定该效力。
本发明的抗体能够中和几种细胞类型的hCMV感染。在一个实施方式中，本发明抗体防止树突细胞的感染。本发明的抗体也可防止上皮细胞(例如视网膜细胞和骨髓细胞(例如树突细胞))的感染。
这些抗体经适当配制后可用作预防或治疗性制剂，或可用作诊断工具。
“中和抗体”是能中和病原体在宿主中开始和/或保持感染的能力的抗体。本发明提供了中和性人单克隆抗体，其中，该抗体识别来自hCMV的抗原。
具体而言，根据本发明的抗体特异性针对hCMV蛋白UL128、 UL130和UL131A的组合。
在一个实施方式中，根据本发明的抗体是在本文中被称为6G4的单克隆抗体。从hCMV感染的供体分离的该抗体，通过被称为6G4的永生化B细胞克隆制备。该抗体中和内皮细胞、上皮细胞(例如视网膜细胞和骨髓细胞(例如树突细胞))的hCMV感染。
6G4的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，且轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。抗体重链的CDR分别被称为CDRH1、CDRH2和CDRH3。类似的，抗体轻链的CDR分别被称为CDRL1、CDRL2和CDRL3。根据IMGT编号系统[12，13，14]将CDR氨基酸的位置限定为：CDR1-IMGT位置27至38，CDR2-IMGT位置56至65和CDR3-IMGT位置105至117。
该抗体CDR的氨基酸序列如表1所示。
表1
| 6G4 | |
| CDRH1 | GYRFTSYY(SEQ ID NO：1) |
| CDRH2 | IYPGDSDI(SEQ ID NO：2) |
| CDRH3 | ARLSLTESGDYVGAFDI(SEQ ID NO：3) |
| CDRL1 | QSLVYSDDNIF(SEQ ID NO：4) |
| CDRL2 | KVS(SEQ ID NO：5) |
| CDRL3 | MQGRHWPPLFT(SEQ ID NO：6) |
本发明还包括含有重链的抗体，所述重链含有一条或多条(即一条、两条或全部三条)来自6G4的重链CDR(SEQ ID NO：1-3)。
在一个实施方式中，本发明的抗体包含含有(i)SEQ ID NO：1的CDRH1、SEQ ID NO：2的CDRH2和SEQ ID NO：3的CDRH3的重链。
在另一个实施方式中，本发明包括含有轻链的抗体，所述轻链含有一条或多条(即一、二或全部三条)来自6G4的轻链CDR(SEQID NO：4-6)。
在另一个实施方式中，本发明包括含有轻链的抗体，所述轻链含有(i)SEQ ID NO：4的CDRL1、SEQ ID NO：5的CDRL2和SEQ IDNO：6的CDRL3。
在另一个实施方式中，本发明的抗体对hCMV蛋白UL128、UL130和UL131A的组合具有特异性，并包含与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的重链。在一个实施方式中，本发明的抗体包含具有SEQ ID NO：7所示的序列的重链。
在另一个实施方式中，本发明的抗体对hCMV蛋白UL128、UL130和UL131A的组合具有特异性，并包含与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的轻链。在又一个实施方式中，本发明的抗体包含具有SEQ ID NO：8所示的序列的轻链。
本发明的抗体还包括含有一个或多个来自6G4的CDR和一个或多个来自针对相同表位的其他抗体的CDR的杂交抗体分子。在一个实施方式中，该杂交抗体含有来自6G4的三个CDR和来自针对相同表位的其他抗体的三个CDR。因此，优选的杂交抗体包含i)来自6G4的三个轻链CDR和来自针对相同表位的其他抗体的三个重链CDR，或ii)来自6G4的三个重链CDR和来自针对相同表位的其他抗体的三个轻链CDR。
另一方面，本发明还包括编码本发明抗体的部分或全部轻链和重链以及CDR的核酸序列。在一个实施方式中，本发明的核酸序列包括与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。在另一个实施方式中，本发明的核酸序列具有序列SEQ ID NO：9(编码6G4重链可变区)或SEQ ID NO：10(编码6G4轻链可变区)。在其他实施方式中，本发明的核酸序列包 含编码包括SEQ ID NO：11(编码6G4CDRH1)、SEQ ID NO：12(编码6G4CDRH2)、SEQ ID NO：13(编码6G4CDRH3)、SEQ ID NO：14(编码6G4CDRL1)、SEQ ID NO：15(编码6G4CDRL2)和SEQ ID NO：16(编码6G4CDRL3)的不同的CDR的序列。由于遗传密码的冗余性，将存在编码相同氨基酸序列的变体。这些变体也包括在本发明的范围内。
抗体变体也包含在本发明的范围内。因此，本申请记载的序列变体也包含在本发明的范围内。这些变体包括在免疫应答期间通过体细胞突变在体内产生的天然变体或者在体外培养永生化B细胞克隆后产生的天然变体。或者，变体可由于如上所述的遗传密码退化产生。或者，天然变体可由于转录或翻译的错误产生。
具有改善的亲和力和/或改善的效力的抗体序列的其他变体可采用本领域公知方法制备得到，且包括在本发明的范围内。例如，可采用氨基酸替换获得亲和力改善的抗体。或者，可采用核苷酸序列的密码子优化改善用于制备抗体的表达系统中的翻译效率。此外，包含通过对本发明的任何核酸序列施用直接进化法得到的具有优化的抗体特异性或中和活性的序列的多核苷酸也包括在本发明的范围内。
在一个实施方式中，抗体变体序列可以与本申请的序列具有70％或更高(即75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高)的氨基酸序列同一性。在一些实施方式中，该序列同一性是通过参考序列(即本申请中描述的序列)的全长来计算的。在另一些实施方式中，本文所述百分比同一性是通过BLAST 2.1.3版本、使用NCBI(国家生物技术信息中心；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)指定的默认参数[Blosum 62矩阵；空位罚分(gap open penalty)＝11且空位延伸罚分(gap extension penalty)＝1]来确定的。
本发明的范围还包括载体，例如包含本发明的核酸序列的表达载体。转化有该载体的细胞也同样包括在本发明范围内。该细胞的例子包括但不限于，真核细胞(例如酵母细胞)、动物细胞或植物 细胞。在一个实施方式中，该细胞是哺乳动物的，例如人、CHO、HEK293T、PER.C6、NS0、骨髓瘤细胞或杂交瘤细胞。
本发明还涉及与能够结合本发明抗体的表位相结合的单克隆抗体，其包括但不限于单克隆抗体6G4。
单克隆和重组抗体在鉴定和纯化它们所针对的单个多肽或其他抗原中是特别有用的。本发明的抗体还有其他用途，其可以作为用于免疫测定、放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)的试剂。在这些应用中，这些抗体可用分析上可检测的试剂(例如放射性同位素、荧光分子或酶)进行标记。这些抗体还可用于抗原的分子识别和表征(表位图谱)。
本发明的抗体可与药物偶联用于输送到治疗位点，或可与可检测的标记物偶联以促进包含目的细胞(例如感染hCMV的细胞)的位点的成像。抗体与药物以及可检测标记物的偶联方法为本领域所熟知的，使用可检测标记物的成像方法也是本领域所熟知的。使用各式各样标记物的标记的抗体可用于各种各样的测定中。通过在抗体上连接可检测的物质便于检测在本发明的抗体与目的表位(hCMV表位)之间形成的抗体-抗原复合物。合适的检测方法包括使用例如放射性核素、酶、辅酶、荧光剂、化学发光物质、色原、酶底物或辅因子、酶抑制剂、辅基复合物、自由基、粒子、染料等标记物。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链亲合素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光物质的例子包括伞形花内酯、荧光素、异硫氰酸酯荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；合适的发光物质的例子为鲁米诺；生物发光物质的例子包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白；和合适的放射性物质的例子包括125I、131I、35S，或3H。该标记的试剂可用于众所周知的各种试验，例如放射性免疫测定、酶免疫测定(例如ELISA)、荧光免疫测定等。参见例子，参考文献15-18。
本发明的抗体可以偶联到治疗部分，例如细胞毒素、治疗剂或 放射性金属离子或放射性同位素。放射性同位素的例子包括但不限于I-131、I-123、I-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、Cu-67、Bi-212、Bi-213、Pd-109、Tc-99、In-111等。该抗体偶联物可用于修饰特定的生物反应；药物部分不应被解释为局限于传统化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有理想的生物活性的蛋白质或多肽。该蛋白可以包括例如毒素，例如相思豆毒素、蓖麻毒素A、绿脓杆菌外毒素或白喉毒素。
将该治疗部分偶联到抗体上的技术是众所周知的。参见，例如，Arnon等人(1985)″Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy，″Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Reisfeld等人(Alan R.Liss，Inc.)，第243-256页；Hellstrom等人(1987)″Antibodies for Drug Delivery，″Controlled Drug Delivery，Robinson等人编辑(第二版；Marcel Dekker，Inc.)，第623-653页；Thorpe(1985)″Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy：A Review，″Monoclonal Antibodies′84：Biological and Clinical Applications，Pinchera等人编辑，第475-506页(Editrice Kurtis，Milano，Italy，1985)；″Analysis，Results，and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy，″Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy，Baldwin等人编辑(Academic Press，New York，1985)，第303-316人；以及Thorpe等人(1982)Immunol.Rev.62：119-158。
可选地，如参考文献19所述，可以将抗体与第二抗体偶联形成异源抗体偶联物(antibody heteroconjugate)。此外，连接分子(linker)可以用于标记物和本发明的抗体之间[20]。抗体或其抗原结合片段可以直接用放射性碘、铟、钇或本领域已知的其他放射性粒子直接标记[21]。治疗可由同时或先后施用偶联抗体和非偶联抗体的治疗组合组成[22，23]。
在另一个实施方式中，本发明的抗体也可以连接到固体支持物上。
另外，本发明的抗体或其功能性抗体片段可以通过共价偶联到聚合物而进行化学修饰，以例如增加其循环半衰期。聚合物的例子以及将其连接到多肽上的方法示于参考文献24-27中。在一些实施方式中，聚合物可以选自聚氧乙烯化的多元醇和聚乙二醇(PEG)。PEG在室温下可溶于水，并且具有如下通式：R(O-CH2-CH2)nO-R，其中R可以是氢或保护基，例如烷基或烷醇基。在一个实施方式中，保护基可以具有1-8个碳。在另一个实施方式中，保护基是甲基。符号n为正整数。在一个实施方式中，n为1-1000之间。在另一个实施方式中，n为2-500之间。在一个实施方式中，PEG平均分子量在1000-40000之间。在另一个实施方式中，PEG分子量在2000-20000之间。在再一个实施方式中，PEG分子量在3000-12000之间。在一个实施方式中，PEG具有至少一个羟基。在另一个实施方式中，PEG具有至少一个端羟基。在再一个实施方式中，该端羟基被活化以与抑制剂的游离氨基反应。但是，应该明白的是，反应基团的类型和数目可以各异，以获得共价偶联的PEG/本发明的抗体。
水溶性聚氧乙烯化的多元醇也可用于本发明中。它们包括聚氧乙烯化的山梨醇、聚氧乙烯化的葡萄糖、聚氧乙烯化的甘油(POG)等。在一个实施方式中，使用POG。不希望局限于任何理论，这可能是因为聚氧乙烯化的甘油的甘油骨架与例如动物和人类的甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯中自然发生的骨架相同，因而该分支不一定会被看作是机体的外源物质。在一些实施方式中，POG的分子量的范围与PEG相同。POG的结构示于参考文献28中。
可以用作增加循环半衰期的另一药物递送系统是脂质体。制备脂质体递送系统的方法讨论在参考文献29、30和31中。其他药物递送系统是本领域内已知的，并描述在例如参考文献32和33中。
本发明的抗体可以以纯化的形式提供。通常情况下，抗体以基本上不含其他多肽的组合物存在，例如少于90％(按重量)、通常少于60％且更通常少于50％的组合物是由其他多肽组成的。
本发明的抗体在非人(或异源)宿主(例如小鼠)中可为免疫 原性的。特别是，该抗体可以含有在非人宿主中、但不是在人类宿主中具有免疫原性的独特位(idiotope)。用于人类的本发明的抗体包括那些不能从宿主例如小鼠、山羊、兔子、大鼠、非灵长类哺乳动物等轻易分离到的抗体以及一般不能通过人源化或从异种小鼠中获得的抗体。
本发明的抗体可以是任何同种型(例如IgA、IgG、IgM，即□、□或μ重链)，但是通常是IgG。在IgG同种型中，抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型。本发明的抗体可以具有□或□轻链。
抗体的产生
本发明的单克隆抗体可以通过本技术领域已知的任何方法制备。使用杂交瘤技术制备单克隆抗体的一般方法是众所周知的[34，35]。优选地，使用参考文献36中描述的可选的EBV永生化方法。
使用参考文献36中描述的方法，可以在多克隆B细胞激活剂的存在下使用EBV来转化产生本发明抗体的B细胞。使用EBV的转化是一个标准技术，并可容易地适于包括多克隆B细胞激活剂。
可以在转化步骤过程中选择性地添加另外的细胞生长和分化的刺激剂，以进一步增加效率。刺激剂可以是细胞因子，例如IL-2和IL-15。一方面，在永生化步骤过程中添加IL-2，以进一步增加永生化效率，但是其使用不是必须的。
使用这些方法产生的永生化B细胞接着使用本技术领域公知的方法进行培养，并从中分离抗体。
单克隆抗体可以进一步纯化，如果需要的话，使用过滤、离心和不同的色谱法(例如HPLC或亲和色谱法)。纯化单克隆抗体的技术(包括用于生产药物等级的抗体的技术)是本领域众所周知的。
本发明的单克隆抗体片段可以通过包括酶(例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化的方法和/或通过二硫键断裂的化学还原从单克隆抗体中获得。可选地，单克隆抗体片段可以通过克隆和表达重链或轻链部分序列获得。抗体“片段”可以包括Fab、Fab’、F(ab′)2和Fv片 段。本发明还包括来源于本发明单克隆抗体重链和轻链的单链Fv片段(scFv)，例如本发明包括含有来源于本发明抗体的CDR的scFv。还包括重链或单链单体和二聚体以及单链抗体，例如其中重链和轻链可变区通过连接肽连接的单链Fv。
分子生物学标准技术可用于制备编码本发明的抗体或抗体片段的DNA序列。所需的DNA序列也可以通过寡核苷酸合成技术全部或部分合成。可以适当使用定点突变和聚合酶链式反应(PCR)技术。
任何合适的宿主细胞/载体系统可用于表达编码本发明抗体分子或其片段的DNA序列。可以使用细菌(例如E.coli)和其他微生物系统部分用于抗体片段(例如Fab和F(ab’)2片段，并且特别是Fv片段和单链抗体片段，例如，单链Fv)的表达。真核(例如哺乳动物)宿主表达系统可用于产生大抗体分子，包括完整的抗体分子。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO、HEK293T、PER.C6、NS0、骨髓瘤细胞或杂交瘤细胞。
本发明还提供了产生本发明的抗体分子的方法，其包括在适于从编码本发明的抗体分子的DNA表达蛋白质的条件下培养包含本发明的载体的宿主细胞，以及分离抗体分子。
抗体分子可以仅包含重链或轻链多肽，在此情况下仅需要使用重链或轻链多肽编码序列转染宿主细胞。为了产生同时包含重链和轻链的产物，可以使用两个载体转染细胞系，第一个载体编码轻链多肽以及第二个载体编码重链多肽。可选地，可以使用单个载体，该载体包含编码轻链和重链多肽的序列。
可选地，本发明的抗体可以通过i)在细胞中表达本发明的核酸序列，并且ii)分离表达的抗体产物。此外，该方法可以包括iii)抗体纯化。
B细胞的筛选和分离
可以筛选那些产生所需抗原特异性的抗体的转化的B细胞，并 且然后可以从阳性细胞中产生单个B细胞克隆。
通过ELISA、组织或细胞(包括转染的细胞)染色、中和测定或众多的用于鉴别想要的抗原特异性的本领域已知的其他方法之一来进行筛选步骤。该测定可以基于简单的抗原识别选择，或可以再基于想要的功能选择，例如以选择中和抗体，而不仅仅是抗原结合抗体，以选择可以改变目标细胞特性(例如它们的信号级联、它们的形态、它们的生长速度、它们影响其他细胞的能力、它们对其他细胞或其他试剂或条件改变的影响的响应、它们的分化状态等)的抗体。
从阳性细胞混合物中分离单个克隆子的克隆步骤可以通过使用限制稀释、显微操作、通过细胞分类的单细胞沉积或本领域已知的其他方法进行。
本发明的永生化B细胞克隆可以不同的方式用于研究等，该方式例如作为单克隆抗体的来源、作为编码目的单克隆抗体的核酸(DNA或mRNA)的来源。
本发明提供一种组合物，其包含永生化B记忆淋巴细胞，其中所述淋巴细胞产生的抗体针对hCMV具有高中和效力，并且其中每日每个细胞产生≥5pg的抗体。本发明还提供一种组合物，其包含永生化B记忆淋巴细胞的克隆，其中所述克隆产生的单克隆抗体针对hCMV具有高中和效力，并且其中每日每个细胞产生≥5pg的抗体。优选地，所述克隆产生的单克隆抗体在中和hCMV感染中具有高效力。本发明的优选的永生化B细胞克隆为6G4。
表位
如上所述，本发明的抗体可以用于它们结合的表位的定位。发明人发现，中和内皮细胞、上皮细胞(例如视网膜细胞)和骨髓细胞(例如树突细胞)的hCMV感染的抗体6G4，针对于由hCMV蛋白UL128、UL130和UL131A的组合确定的表位。尽管发明人不希望受此理论的约束，其确信抗体6G4与由此三种蛋白形成的构象表 位相结合。
本发明的抗体识别的表位可以有多种用途。纯化或合成形式的表位和其模拟表位(mimotope)可以用于提高免疫应答(即，作为疫苗，或用于其他用途的抗体的生产)或用于患者血清抗体的筛选，该抗体可以与表位或其模拟表位发生免疫反应。在一实施方式中，这样的表位或模拟表位，或含有这样的表位或模拟表位的抗原可以用作引起免疫应答的疫苗。本发明的抗体和其抗体片段也可以用在监控疫苗质量的方法中。特别地，该抗体可以用于检查疫苗中抗原是否含有正确构象的正确免疫原性表位。
表位在筛选与所述表位结合的配体时也是非常有用的。此类配体，包括但是不局限于那些来自于骆驼、鲨鱼和其他物种的抗体、抗体片段、肽、噬菌体展示技术产物、适体、其他病毒或细胞蛋白adnectin或片段，它们可以封闭表位并因此防止感染。此类配体包含在本发明的范围之类。
重组表达
本发明的永生化B记忆淋巴细胞也可以用作用于随后重组表达的抗体基因克隆的核酸来源。用于医药用途的重组来源的表达比用于例如稳定性、再现性、培养容易等因素的B细胞或杂交瘤的表达更常见。
因此本发明提供了一种用于制备重组细胞的方法，其包括以下步骤：(i)从B细胞克隆获得一种或多种编码感目的抗体的核酸(例如重链和/或轻链基因)；和(ii)将核酸插入到表达宿主以允许目的抗体在宿主内表达。
同样地，本发明提供一种制备重组细胞的方法，其包括步骤：(i)对来自B细胞克隆的编码目的抗体的核酸进行测序；和(ii)利用来自步骤(i)序列信息制备插入到表达宿主的核酸，以允许目的抗体在该宿主中表达。该核酸可以，但是不是必需，在步骤(i)和(ii)之间被操作来引入限制性位点，以改变密码子选择，和/或 优化调控序列的转录和/或翻译。
本发明还提供了一种制备重组细胞的方法，其包含用一种或多种编码感兴趣的单克隆抗体的核酸转化宿主细胞的步骤，其中该核酸是来自本发明的永生化B细胞克隆的核酸。因此，首先制备核酸以及然后用其转化宿主细胞的步骤可以在不同时间不同人不同地方(例如，在不同国家)进行。
本发明的重组细胞接着可以用于表达以及培养目的。它们对于大量药物生产的抗体表达特别有用。它们还可以用于作药物组合物的活性成分。可以使用任何适当的培养技术，包括但是不局限于静置培养、转瓶培养、腹水流体、中空纤维型生物反应盒、模块化小型发酵罐、搅拌槽、微载体培养、陶瓷芯灌注等等。
从B细胞中获得免疫球蛋白基因以及测序的方法是本技术领域众所周知的(例如，参见参考文献37)。
表达宿主优选是真核细胞，包括酵母和动物细胞，特别是哺乳动物细胞(例如，CHO细胞、NS0细胞、人类细胞例如PER.C6细胞[[Crucell；参考文献38]或HKB-11细胞[Bayer；参考文献39&40]，骨髓瘤细胞[41&42]等)以及植物细胞。优选的表达宿主可以糖基化本发明的抗体，特别是使用在人体中它们自身不是免疫原性的碳水化合物结构。在一实施方式中，表达宿主可以在无血清培养基中生长。在另一实施方式中，表达宿主可以在不含动物来源产品的培养物中生长。
可以培养表达宿主成为细胞系。
本发明提供了一种制备一种或多种编码目的抗体的核酸分子(例如重链和轻链基因)的方法，其包括步骤有：(i)依据本发明制备一种永生化B细胞克隆；(ii)从B细胞克隆中获得编码目的抗体的核酸。本发明还提供了一种获得编码目的抗体的核酸序列的方法，其包括步骤有：(i)依据本发明制备永生化B细胞克隆；(ii)对来源于B细胞克隆中编码目的抗体的核酸进行测序。
本发明还提供了一种制备编码目的抗体的核酸分子的方法，其 包括从B细胞克隆中获得核酸的步骤，该B细胞克隆是从本发明的转化B细胞中获得的。因此，首先获得B细胞克隆、接着从中制备核酸的步骤可以在不同时间不同人不同地方(例如，在不同国家)进行。
本发明提供了一种制备抗体(例如，用于药物用途)的方法，其步骤包括：(i)从表达目的抗体的筛选的B细胞克隆中获得和/测序一种或多种核酸(例如，重链和轻链基因)；(ii)将此核酸插入到或利用此核酸来制备能够表达目的抗体的表达宿主；(iii)在目的抗体表达条件下培养或传代培养表达宿主；以及，可选地，(iv)纯化目的抗体。
本发明还提供了一种制备抗体的方法，其包括步骤：在目的抗体表达的条件下培养或传代培养宿主细胞群，并可选地，纯化目的抗体，其中所述表达宿主细胞群的制备是通过(i)提供编码选择的B细胞目的抗体的核酸，其是通过上述B记忆淋巴细胞群制备获得，(ii)将核酸插入到能够表达目的抗体的宿主中，以及(iii)培养或传代培养含有所述插入核酸的表达宿主，从而产生所述表达宿主细胞群。因此，首先制备重组表达宿主、接着培养其以表达抗体的步骤可以在不同时间不同人不同地方(例如，在不同国家)进行。
药物组合物
本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的抗体和/或抗体片段和/或编码此抗体的核酸和/或表达此抗体的永生化B细胞和/或本发明抗体识别的表位。药物组合物还可以包含一种药学上可接受的载体以便给药。载体本身不应该诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体，且不应该是毒性的。适当的载体可以是大的缓慢代谢的大分子，例如蛋白、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和非活性病毒颗粒。
可以使用药学上可接受的盐，例如，无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐，或有机酸盐，例如醋酸盐、丙酸盐、 丙二酸盐和苯甲酸盐。
治疗组合物中药物上可接受的载体可以还包含液体，例如水、生理盐水、甘油和乙醇。另外，辅助物质(例如润湿剂或乳化剂或pH缓冲液物质)可以出现在此组合物中。这些载体使药物组合物能被制成片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊、液体、凝胶剂、糖浆、浆料和悬浮液，用于患者摄取。
在本发明的范围之内，给药形式可以包括那些适合非消化道给药形式，例如通过注射或输注，例如通过快速注射或连续输注。用于注射或输注的产品，其可以采用油状或水性载体中的悬浮液、溶液或乳剂，并且其可以包含配方试剂，例如悬浮液、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。或者，抗体分子可以是干燥形式，在使用之前用适当的无菌液体重配。
一旦被配制，本发明的组合物可以直接施用给受试者。在一实施方式中，组合物通过调整以适合施用给人类受试者。
本发明的药物组合物可以通过任意多种途径给药，其包括但不局限于：口服、静脉注射、肌肉内注射、动脉内注射、髓内注射、腹腔内注射、鞘内注射、心脑内、透皮、经皮肤、外用、皮下、鼻内、肠内、舌下、阴道内或直肠途经。无针注射器(Hypospray)也可以用于施用本发明药物组分。典型地，治疗组合物可以制备成可注射的液体溶液或悬浮液。也可以制备成适于溶于液体载体中的溶液或悬浮液的注射前固体形式。
组合物的直接输送通常是通过注射、皮下注射、腹膜内注射、静脉注射或肌肉内注射完成，或输送到组织的胞间系。组合物还可以在损伤处施用。治疗剂量可以是单剂量方案或多剂量方案。已知的基于抗体的药物提供关于给药频率的说明，例如药物是否需要每天、每周、每月等给药。频率和剂量也同样视症状的严重程度而定。
本发明的组合物可以制备成不同的类型。例如，组合物可以制备成可注射的溶液溶液或悬浮液。也可以制备成适于溶于液体载体中的溶液或悬浮液的注射前固体形式(例如冻干组合物，如SynagisTM 和HerceptinTM，用于重配含防腐剂的无菌水)。组合物可以制备用于局部给药，例如作为软膏、乳膏或粉末。组合物可以制备用于口服给药，例如作为片剂或胶囊，作为喷雾，或作为糖浆(可选有味道的)。组合物可以制备用于经肺给药，例如作为吸入物，采用精细粉末或喷雾。组合物可以制备作为栓剂或子宫托。组合物可以制备用于经鼻、耳或眼给药，例如作为滴液。组合物可以是试剂盒的形式，设计成在向患者给药前重配混合的组合物。例如，可以提供试剂盒形式的冻干抗体，以及无菌水或无菌缓冲液。
可以理解，组合物的活性成分将是抗体分子、抗体片段或突变体和其衍生物。因此，其容易在消化道降解。因此，如果组合物是通过消化道途径给药，组合物将需要包含保护抗体降解的试剂，但是一旦抗体释放就能从消化道吸收。
有关药学上可接受载体的深入讨论可参见Gennaro(2000)Remington：药剂学科学与实践(The Science and Practice of Pharmacy)，第20版，ISBN：0683306472。
本发明的药物组合物的pH值通常在5.5-8.5之间，在一些实施方式中可以在6-8之间，并且在另外一些实施方式中大约是7。pH值可以用缓冲液来维持。组合物可以是无菌和/或无热原的。组合物可以在人体中是等渗的。在一些实施方式中，本发明的药物组合物可以以密封的封闭容器提供。
药物组合物将包含有效量的一种或多种本发明的抗体和/或本发明的一种或多种永生化B细胞和/或含有本发明抗体结合的表位的多肽，该量即足够用于治疗、改善，或预防某种疾病或状况，或用于揭示可检测的治疗效果的量。治疗效果也包括减少身体症状。对于任何特定受试者的精确有效量将依据他们的体积和健康、状况的性质和程度，以及给药所选择的治疗方法或治疗方法的组合而定。在特定情况下的有效量是通过常规的试验确定的，属于临床诊断范围内。对于本发明的目的，本发明的药物组合物在给药个体中的有效剂量一般是从约0.01mg/kg到约50mg/kg，或约0.05mg/kg到约10 mg/kg。已知的基于抗体的药物提供了此方面的说明，例如HerceptinTM是通过静脉输注21mg/ml溶液给药的，初始上药剂量为4mg/kg体重并且每周维持剂量为2mg/kg体重；RituxanTM每周给药375mg/m2；等等。
在一实施方式中，组合物可以包含多于一种(例如2、3、4、5等)的本发明的抗体，以提供加成性或协同治疗效果。在另一实施方式中，组合物可以包含一种或多种(例如2、3、4、5等)的本发明的抗体或抗体片段，以及一种或多种(例如2、3、4、5等)针对hCMV的其他的抗体或抗体片段。例如，一种抗体可结合由hCMV蛋白UL128、UL130和UL131A的组合确定的表位，而另一个可结合其他的hCMV蛋白。在这个实施方式中，hCMV蛋白可以是gB、gH、gL、gM、gN、gO、UL128、UL130或UL131A或其组合。在进一步的实施方式中，第二抗体或抗体片段可以特异性针对由MSL-109、8F9或3E3识别的表位。在另一个实施方式中，一种抗体可以靶向介导纤维细胞感染的机制，而其他抗体可以靶向介导内皮细胞感染的机制。出于最佳的临床效果，它可能有利于解释hCMV感染和维持的两种机制。
本发明的抗体或片段可以与其他疗法一起给药(或联合或单独)，例如与化疗化合物，放射治疗，等等。优选治疗化合物包括抗-病毒化合物例如更昔洛韦(ganciclovir)、膦甲酸(foscarnet)和西多福韦(cidofovir)。此类联合治疗相对于单个治疗剂单独施用提供了治疗效果的加成性或协同改进。术语“协同”用于描述两种或多种活性试剂的组合效果大于各相应活性试剂的单独效果的总和。因此，当两种或多种试剂的组合效果导致活动或进程的“协同抑制”，希望对活性或进程的抑制大于各相应活性试剂的抑制效果的总和。术语“协同治疗效果”是指使用两种或多种治疗的组合所观察到的治疗效果，其中所述治疗效果(通过多种参数中的任何一种测定)大于使用相应的单个疗法所观察到的单个治疗效果的总和。
抗体或抗体片段可以施用给那些之前对hCMV感染治疗不显示 响应的患者，即那些对抗-hCMV治疗已显示出不应性的患者。此类治疗可以包括前面利用抗-病毒试剂的治疗。这可能是由于，例如，感染了hCMV的抗-病毒抗性菌株。
本发明的组合物包括本发明的抗体，这些抗体可以占组合物总蛋白的至少50重量％(例如，60重量％、70重量％、75重量％、80重量％、85重量％、90重量％、95重量％、97重量％、98重量％、99重量％或更多)。因此，抗体是纯化形式。
本发明提供了一种制备药物的方法，其包括步骤：(i)制备本发明的抗体；和(ii)将纯化的抗体与一种或多种药学上可接受的载体混合。
本发明也提供了一种制备药物的方法，其包括将抗体与一种或多种药物上可接受的载体混合的步骤，其中所述抗体是从本发明的转化的B细胞中获得的单克隆抗体。因此，首先获得单克隆抗体、然后制备药物的过程可以在不同时间由不同人在不同地方(例如不同国家)进行。
作为用于治疗目的递送抗体或B细胞的替代方式，有可能向受试者递送编码目的单克隆抗体(或其活性片段的)核酸(一般是DNA)，从而该核酸可以在受试者中原位表达以提供理想的治疗效果。适当的基因治疗和核酸递送载体是本技术领域已知的。
本发明的组合物可以是免疫原性组合物，在一些实施方式中可以是包含含有在hCMV蛋白UL128、UL130和UL131A的组合上发现的表位的抗原的疫苗组合物。可选地，组合物可以包括(i)包含由hCMV蛋白UL128、UL130和UL131A的组合形成的表位的抗原，以及(ii)包含在hCMV蛋白gB、gH、gL、gM、gN、gO、UL128、UL130或UL131A上发现的表位的抗原，或其组合。本发明的疫苗可以是预防型的(即预防感染)或治疗型的(即治疗感染)。
组合物可以含有抗菌剂，特别是如果包装成多剂量形式。
组合物可以含有去污剂，例如吐温(聚山梨酯)，例如吐温80。去污剂一般以低水平如＜0.01％呈现。
组合物也可以包含钠盐(例如氯化钠)，以产生渗透压(tonicity)。典型的NaCl浓度是10±2mg/ml。
组合物可以包含糖醇(例如甘露醇)或二糖(例如蔗糖或海藻糖)，例如大约15-30mg/ml(例如25mg/ml)，特别地如果它们是冻干的或如果它们包含已从冻干物质重配的材料。冻干组合物的pH值在冻干前调节到大约6.1。
本发明的组合物也可以包含一种或多种免疫调节试剂。在一实施方式中，一种或多种免疫调节试剂包括佐剂。
本发明的表位组合物可以引起细胞介导的免疫应答以及体液免疫应答两者，以有效解决hCMV的感染。该免疫应答可诱导长期持续性(例如中和)抗体，和一旦接触hCMV后作出迅速响应的细胞介导的免疫性。
药物治疗及其应用
本发明的抗体及其抗体片段或其衍生物和突变体可以用于治疗hCMV感染，用于预防hCMV感染或用于诊断hCMV感染。
诊断的方法可包括使抗体或抗体片段与样本接触。该样本可以是采自例如唾液腺、肺、肝、胰腺、肾、耳、眼、胎盘、消化道、心脏、卵巢、垂体、肾上腺、甲状腺、脑或皮肤的组织样品。诊断的方法也可包括抗原/抗体复合物的检测。
因此，本发明提供了(i)本发明的抗体、抗体片段，或其突变体和衍生物，(ii)本发明的永生化B细胞克隆，(iii)能够结合本发明抗体的表位，例如6G4，或(iv)配体，优选能够与结合本发明的用于治疗的抗体的表位(例如6G4)结合的抗体。
还提供治疗患者的方法，包括：向该患者施用(i)本发明的抗体、抗体片段，或其突变体和衍生物，(ii)本发明的永生化B细胞克隆，(iii)能够结合本发明的抗体的表位，例如6G4，或(iv)配体，优选为能够与结合本发明抗体的表位(例如6G4)结合的抗体。
本发明也提供了(i)本发明的抗体、抗体片段，或其突变体和 衍生物，(ii)本发明的永生化B细胞克隆，(iii)能够结合本发明抗体的表位，例如6G4，或(iv)配体，优选能够与结合本发明抗体的表位(例如6G4)结合的抗体，在生产用于预防或治疗hCMV感染药物中的用途。
本发明提供了用作用于预防或治疗hCMV感染的药物的本发明的组合物。其还提供了本发明的抗体和/或含有该抗体结合的表位的蛋白质在制备用于治疗患者和/或诊断患者的药物中的用途。其还提供了用于治疗受试者和/或在受试者上实施诊断的方法，其包括向受试者施用本发明的组合物的步骤。在一些实施例中，受试者可以是人。检测治疗效果的一种方法包括在施用本发明的组合物后监控疾病症状。治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。
在一个实施方式中，本发明的抗体、抗体片段、永生化B细胞克隆、表位或组合物被施用于需要此种治疗的受试者。此类对象包括但不限于，特别处于hCMV感染危险的受试者或易感hCMV感染的受试者，包括例如，免疫受损的受试者。示例性的受试者包括患有HIV或遭受免疫抑制治疗的受试者，例如移植患者。
本发明的抗体可用于被动免疫。
本发明所描述的抗体和其片段也可用于hCMV感染诊断的试剂盒。
能够结合本发明抗体的表位(例如单克隆抗体6G4)可用于通过探测保护性抗hCMV抗体的存在来监控接种过程效果的试剂盒中。
如本发明所述的抗体、抗体片段，或其突变体和衍生物也可以用在用于监控具有理想免疫原性的疫苗的生产的试剂盒中。
本发明还提供了制备药物的方法，其包括将单克隆抗体与一种或多种药学上可接受的载体混合的步骤，其中该单克隆抗体是从本发明表达宿主中获得的单克隆抗体。因此，首先获得单克隆抗体(例如表达和/纯化其)、然后与药物载体混合的程序可以在不同时间由不同人在不同地方(例如不同国家)进行。
从本发明的转化的B细胞开始，可以进行培养、传代培养、克隆、亚克隆、测序、核酸制备等各种步骤，各步骤可可选进行优化，以维持由转化的B细胞所表达的抗体。在一个优先实施方式中，上述方法还包括应用于编码抗体的核酸的优化技术(例如亲和力成熟或优化)。本发明包括在这些步骤中使用和制备的所有细胞、核酸、载体、序列、抗体等。
在所有这些方法中，用于宿主表达的核酸可被操作，以插入、删除或修改特定的核酸序列。这些操作的改变包括但不限于引入限制性位点、修改密码子选择、添加或优化转录和/或翻译调控序列等的改变。也可能改变核酸从而改变编码的氨基酸。例如，将一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)氨基酸取代、缺失和/或插入引入抗体的氨基酸序列中可能是有用的。这样的点突变可以修改效应子功能、抗原结合亲和力、翻译后修饰、免疫原性等，可以引入用于共价基团(例如标志物)的连接的核酸，或可以引入标记物(例如用于纯化目的)。可以向特定的位点引入突变，或可以随机引入突变，接着再进行筛选(例如分子进化)。
概括
术语“包含”包括“包括”以及“由......组成”，例如，一种组合物“包含”X可以是只由X组成，或可以包括另外的元素如X+Y。
词语“基本上”不排除“完全”，例如一种组合物，其“基本上不含”Y可以完全不含Y。当需要时，词语“基本上”可以从本发明的定义中省略。
涉及数值x的术语“大约”是指例如x±10％。
本文中所使用的术语“疾病”通常意图是同义的，可与术语“紊乱”和“状况”(医学状况)互换使用，因为它们均反映了人体或动物体或其破坏正常功能的一部分的异常状况(通常是通过区别征兆和症状来体现的)，并且引起人类或动物寿命缩短或生活质量下降。
本文中所指用的，当提到患者的“治疗”意图包括预防和防治。 术语“患者”是指所有的哺乳动物，包括人。患者的例子包括人、牛、狗、猫、马、山羊、绵羊、猪和兔。一般来说，患者是指人。
实施例
下述实施例仅用于说明本发明，而并非是对其的限制。
实施例1：B细胞克隆和hCMV中和活性的筛选
血清中具有高hCMV中和抗体滴度的供体被确定。使用如参考文献36所述的EBV和CpG分离和永生化记忆B细胞。简而言之，通过使用CD22珠粒的阴性选择来分离记忆B细胞，接着用特异性抗体以及细胞分选除去IgM+、IgD+、IgA+B细胞。在CpG 2006和辐照的同种异体单核细胞的存在下，使用EBV永生化分选的细胞(IgG+)。在20个96孔U型底板中建立各含50个记忆B细胞的重复培养物。2周后，收集培养上清液，在单独的测定中检测其中和纤维细胞或上皮细胞hCMV感染的能力。按照参考文献36所述的，从阳性多克隆培养物中分离B细胞克隆。利用IgG-特异性ELISA来确定所选克隆上清液中的IgG浓度。
在病毒中和测定中，将一定滴度的临床hCMV分离物与等体积的培养上清液或含有中和抗体的人血清稀释液混合。室温孵育1小时后，将混合液添加到96孔平底板中的融合的单层内皮细胞(例如HMEC-1细胞)、上皮细胞(例如ARPE视网膜细胞)或成纤维细胞(例如MRC-9或间质干细胞)，并置于37℃培养2天。除去上清，用冷甲醇固定细胞，并用针对hCMV早期抗原的小鼠单克隆抗体混合物染色，接着用荧光标记的山羊抗鼠Ig染色。用荧光显微镜分析平板。在不存在中和抗体的情况下，感染细胞为～1000/区域，而在饱和浓度的中和抗体的存在下，感染被全部抑制。同样利用树突细胞作为靶细胞来进行病毒中和测定。中和滴定表示为hCMV感染减少50％的抗体浓度(μg/ml)。
表2显示，已表明特异性针对UL128、UL130和UL131A的组 合的6G4，能在非常低的浓度下中和内皮细胞、视网膜细胞和树突细胞的hCMV感染(即具有高效力)。
表2
*在测试的最高浓度无中和反应(即＞2μg/ml).＾Cytotect(Biotest)为hCMV超免疫IgG的库。
实施例2：由单克隆抗体识别的靶抗原的识别
为描绘人单克隆抗体6G4中和内皮细胞感染的特异性，构建了编码全长UL128、UL130、UL131A、gH和gL的表达载体。用这些载体单独或组合转染HEK293T细胞。36小时后，固定细胞，用6G4然后用山羊抗人IgG进行通透和染色。图1表明单克隆抗体6G4染色的细胞共表达至少UL128、UL130和UL131A。当gH和gL与UL128、UL130和UL131A共转染来重建假定的完整糖蛋白复合物gCIII时，6G4染色的强度增加。这些数据表明单克隆抗体6G4特异性针对由hCMV蛋白UL128、UL130和UL131A的组合确定的构象表位。最大的可能在于，仅当UL128、UL130和UL131A与gH和gL一起组装在gCIII中时，该表位处于合适的构型。
可以理解，本发明仅通过实例的方式进行了描述，且在不违背本发明的范围和精神的条件下可以对其进行改变。
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Claims (54)
1.一种具有中和人巨细胞病毒(hCMV)的高效力的中和抗体，其中所述抗体特异性针对hCMV蛋白UL128、UL130和UL131A的组合。
2.根据权利要求1所述的抗体，其包括SEQ ID NO：1-6中的一个或多个。
3.根据权利要求1所述的抗体，其包括包含SEQ ID NO：1-3中的一个或多个的重链。
4.根据权利要求1所述的抗体，其含有包含SEQ ID NO：1的CDRH1、SEQ ID NO：2的CDRH2及SEQ ID NO：3的CDRH3的重链。
5.根据权利要求1所述的抗体，其包括包含SEQ ID NO：4-6中的一个或多个的轻链。
6.根据权利要求1所述的抗体，其含有包含SEQ ID NO：4的CDRL1、SEQ ID NO：5的CDRL2及SEQ ID NO：6的CDRL3的轻链。
7.根据权利要求3所述的抗体，其中所述重链具有SEQ ID NO：7所示的序列。
8.根据权利要求5所述的抗体，其中所述轻链具有SEQ ID NO：8所示的序列。
9.根据前述任一项所述的抗体，其中所述抗体为人单克隆抗体。
10.根据权利要求9所述的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体6G4。
11.与能够结合前述任一项权利要求所述的抗体的表位相结合的抗体。
12.前述任一项权利要求所述的抗体的片段，其中所述片段特异性针对hCMV蛋白UL128、UL130和UL131A的组合。
13.根据权利要求12所述的抗体片段，其为Fab、Fab’、F(ab′)2或Fv片段。
14.编码前述任一项权利要求所述的抗体或抗体片段的核酸分子。
15.根据权利要求14所述的核酸分子，其中所述核酸分子包括SEQ ID NO：9-16中的任一个。
16.包含权利要求14或权利要求15所述的核酸分子的载体。
17.包含权利要求16所述的载体的细胞。
18.表达权利要求1-11中任一项所述的抗体的永生化B细胞克隆。
19.结合权利要求1-11中任一项所述的抗体的表位。
20.包含权利要求19所述的表位的免疫原性多肽。
21.结合权利要求19所述的表位的配体。
22.根据权利要求21所述的配体，其为抗体。
23.一种用于制备权利要求1-11中任一项所述的抗体的方法，包括(i)培养权利要求18所述的永生化B细胞克隆和(ii)从B细胞分离抗体。
24.一种药物组合物，其包含权利要求1-13或22中任一项所述的抗体或抗体片段、权利要求14或权利要求15所述的核酸、权利要求18所述的永生化B细胞克隆或权利要求20所述的免疫原性多肽。
25.根据权利要求24所述的药物组合物，其包含特异性针对通过hCMV蛋白UL128、UL130和UL131A的组合确定的表位的第一抗体或抗体片段，以及特异性针对第二表位的第二抗体或片段。
26.根据权利要求24或权利要求25所述的药物组合物，其进一步包含药学上可接受的稀释剂或载体。
27.权利要求1-13或22中任一项所述的抗体或抗体片段、权利要求14或权利要求15所述的核酸、权利要求18所述的永生化B细胞克隆或权利要求20所述的免疫原性多肽在治疗或诊断中的用途。
28.权利要求1-13或22中任一项所述的抗体或抗体片段、权利要求14或权利要求15所述的核酸、权利要求18所述的永生化B细胞克隆或权利要求20所述的免疫原性多肽在(i)制备用于治疗hCMV感染的药物或(ii)疫苗中的用途。
29.根据权利要求1-13或22中任一项所述的第一抗体或抗体片段以及特异性针对第二表位的第二抗体或抗体片段在制备用于治疗hCMV感染的药物中的用途。
30.根据权利要求28或权利要求29所述的用途，其中所述患者对抗hCMV的常规治疗是不应性的。
31.根据权利要求28或权利要求29所述的用途，其中所述患者被预施用、后施用或同时施用抗病毒剂。
32.根据权利要求31所述的用途，其中所述抗病毒剂选自更昔洛韦、膦甲酸或西多福韦。
33.根据权利要求28或权利要求29所述的用途，其中所述患者是免疫受损的。
34.根据权利要求33所述的用途，其中所述患者患有HIV或是移植患者。
35.权利要求18或22所述的组合物或用途，其中所述第二抗体或抗体片段特异性针对hCMV蛋白质。
36.根据权利要求28所述的组合物或用途，其中所述hCMV蛋白是糖蛋白。
37.根据权利要求28所述的组合物或用途，其中所述hCMV蛋白质是gB、gH、gL、gM、gN、gO、UL128、UL130、UL131A或其组合。
38.根据权利要求28所述的组合物或用途，其中所述第二抗体或抗体片段特异性针对由MSL-109、8F9或3E3识别的表位。
39.一种用于治疗受试者的方法，包括施用权利要求24-26或35-38中任一项所述的药物组合物的步骤。
40.一种用于诊断hCMV感染的试剂盒，其包含权利要求1-13或22中任一项所述的抗体或抗体片段、权利要求14或权利要求15所述的核酸或权利要求19所述的表位。
41.一种制备重组细胞的方法，其包括步骤：(i)对来自权利要求18所述的B细胞克隆的核酸进行测序；(ii)利用获自步骤(i)的序列信息来制备用于插入至表达宿主以允许在所述宿主中表达目的抗体的核酸。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述核酸在步骤(i)和(ii)之间被操作来导入限制性位点、改变密码子选择、和/或优化转录和/或翻译调控序列。
43.根据权利要求41所述的方法，其中所述表达宿主是真核细胞。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述真核细胞为酵母细胞、动物细胞或植物细胞。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述动物细胞为哺乳动物细胞。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述动物细胞为CHO、NS0或人细胞。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述人细胞为PER.C6细胞、HEK293T细胞或HKB-11细胞。
48.一种制备权利要求1-11或22中任一项所述抗体的方法，包括在目的抗体表达的条件下培养或传代培养通过权利要求41所述的方法获得的表达宿主；以及任选地，纯化目的抗体。
49.一种筛选可诱导针对hCMV的免疫应答的多肽的方法，包括利用权利要求1-13或22中任一项所述的抗体或片段筛选多肽库。
50.权利要求1-13或22中任一项所述的抗体或抗体片段在通过检查疫苗中抗原是否含有正确构象的正确表位来监控抗hCMV疫苗的质量中的用途。
51.根据权利要求28-34中任一项所述的用途，其中所述抗体预防内皮细胞、上皮细胞和骨髓细胞的感染。
52.根据权利要求51所述的用途，其中所述抗体预防视网膜细胞和树突细胞的感染。
53.特异性结合权利要求1-13中任一项所述的抗体或抗体片段的表位在(i)治疗、(ii)制备用于治疗hCMV感染的药物，或(iii)作为疫苗中的用途。
54.特异性结合权利要求1-13中任一项所述的抗体或抗体片段的表位在筛选能够中和hCMV感染的配体中的用途。
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