KR20230141840A - 비종말적 항체 발굴 방법 및 단일 세포 분석 - Google Patents
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Abstract
비인간 동물에서 선택 항체의 생성을 모니터링하는 방법으로서, (a) 비인간 동물을 면역원으로 면역화시키는 단계; (b) 상기 비인간 동물로부터 항체 분비 세포(ASC)를 포함하는 혈액 샘플을 얻는 단계; 및 (c) 선택 항체 생성을 위해 혈액 샘플 또는 이의 분획에 존재하는 ASC를 개별적으로 분석하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 선택 항체의 생성을 위해 비인간 동물에서 항체 생성을 유도하는 방법이 또한 제공된다. 예시적인 구현예에서, 방법은 상기와 같이 (a) 내지 (c)의 사이클을 수행하고, 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 미만인 경우 사이클을 반복하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 이상일 때까지 사이클은 반복된다. 단일 세포 분석이 추가로 본원에 제공된다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 2월 5일자로 출원된 미국 가출원 제63/146,135호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
전통적인 동물 기반 항체 발굴 방법은 다양한 정도의 복잡성을 가진 단백질 표적에 대한 다클론 혈청 역가를 기반으로 동물을 희생시키는 것을 수반한다. 일부 항체 발굴 캠페인은 단순한 설계 목표(예: 표적에 결합)를 갖지만 대부분은 더 복잡하며 원하는 항체가 다양한 특성(예: 교차 반응성, 특정 에피토프에 결합, 특정 친화도로 결합 등)을 갖도록 요구한다. 전통적인 항체 발굴 접근법은 B 세포 수확 및 항체 생성을 위해 선택된 동물에 대한 다클론 분비 항체(혈청) 반응의 조사에 의존한다. "혈청 역가" 접근법은 분비된 모든 항체(즉, 다클론 혼합물)의 총 반응성을 측정하고 검출된 항체의 B 세포 공급원을 확인하는 데 사용할 수 없기 때문에(즉, 공급원 B 세포와의 물리적 및 시간적 분리가 있음) 결코 이상적이지 않다. 표현형(항체 역가 측정)과 유전자형(항체를 암호화하는 담당 공급원 B 세포) 사이의 직접적인 연결이 없기 때문에 B 세포 반응의 품질을 해석하기가 어렵다. 혈청에 가용성의, 항원 특이적 항체가 있는지를 결정하는 것 외에도, 동물 선택을 도울 수 있는 이 다클론 분석으로부터 유용한 추가 정보를 얻기는 어렵다.
추가로, 전통적인 방법론은 동물과 관련하여 종말적이므로 동물의 관련 B 세포 레퍼토리를 포획하려는 '일회성' 시도를 대표한다. 기술적인 문제로 인해 초래될 수 있는 이러한 레퍼토리의 포획 실패, 비최적 항체 생성 동물의 선택 및/또는 레퍼토리의 샘플링 깊이 부족(즉, 아주 작은 비율(0.1% 미만)의 B 세포 레퍼토리의 융합을 초래하는 전통적인 바이러스 불멸화 및 하이브리도마 공정의 빈약한 효율성)은 귀중한 자원의 낭비를 초래하고 대체 면역 동물 또는 완전히 새로운 면역화 캠페인을 사용하도록 강요한다. 더욱이, 전통적인 방법은 동일한 동물의 면역계를 활용하여 항체 반응을 진화시키는 지속적인 공정의 가능성을 배제한다.
이러한 제한에도 불구하고 전통적인 방법은 면역 레퍼토리의 허용 가능한 부분을 포획할 수 있게 하고 하류 분석을 수용하도록 쉽게 확장 축소할 수 있는 항체의 재생 가능한 공급원을 제공하기 때문에 부분적으로 널리 사용된다.
이러한 전통적인 방법이 프로젝트 일정을 맞추기에는 너무 느리거나, 잘못된 B 세포 집단을 포획하거나, B 세포 레퍼토리를 충분히 샘플링하지 않거나, 진화하는 B 세포 반응의 실시간 모니터링을 허용하지 않는 상황이 점점 더 많아지고 있다. 또한, 많은 항체 표적 부류(예: 복잡한 막 단백질, 최소 에피토프 공간이 있는 표적, 오르소로그와 매우 유사한 단백질 등)의 까다로운 특성으로 인해 강건한 면역원성 결여로 동물에서 B 세포 반응을 일으키기 어려울 수 있다. 일부 항체 설계 목표의 극도의 복잡성과 결합하여, 원하는 면역 프로파일(즉, B 세포 레퍼토리)을 가진 면역 동물을 생성하는 것은 어려울 수 있다.
앞서 언급한 점을 고려할 때 보다 효율적인 항체 발굴 방법이 필요하다. 예를 들어, 성공적인 항체 발굴을 위해 전통적인 동물 면역화와 B 세포 방법을 더 잘 배치할 수 있는 항체 발굴 방법은 동물 기반 항체 발굴을 크게 향상시킬 것이다.
처음으로 항체 발굴에 유용한 기술을 입증하는 이론적 근거, 실험 방법 및 데이터가 제공된다. 예시적인 양태에서, 방법은 살아있는 비인간 동물의 말초 혈액으로부터 직접 항원 특이적 항체를 확인하는 것을 수반한다. 유리하게도, 본원에 제공된 이러한 방법은 동물 안락사 후 면역 기관(예: 비장, 림프절 및 골수) 적출에 의존하는 전통적인 방법과 달리 동물을 희생시킬 필요 없이 항체 발굴을 가능하게 한다. 이러한 방법은 비종말적이기 때문에(예를 들어, 항체 생성 동물의 안락사를 수반하지 않음), 예를 들어 관심 항체를 얻을 때까지 동일한 동물(들)에서 방법을 여러 번 반복할 수 있다. 동일한 동물(들)에서 방법을 반복하는 능력은 전통적인 방법에 비해 몇 가지 이점이 있다. 예를 들어, 동일한 동물(들)에서 방법을 반복하는 것은 항체 발굴 공정의 전체 비용을 줄여준다. 또한, 동물이 살아 있기 때문에, 현재 개시된 방법은 예를 들어 동물이 관심 표적 항체를 발현하는 B 세포를 생성하지 않는 경우 면역화 프로토콜(다음 면역화에 사용됨)에 대한 전략적 조정이 (이전 면역화로부터) 관찰된 B 세포 반응에 기초하여 이루어질 수 있도록 항체 레퍼토리의 실시간, 생전 샘플링을 가능하게 한다. 이에 의해 본 발명의 방법은 항체 설계 목표에 부합하도록 합리적인 레퍼토리 형성 및/또는 면역 반응의 의도적인 조종을 허용한다. 본 개시의 예시적인 공정은 도 1b 내지 도 1e에 예시되어 있다. 도 1b는 면역화된 동물의 혈액 샘플로부터 얻은 단일 세포의 스크리닝을 포함하는, 면역 반응을 모니터링하기 위한 예시적인 비종말적 방법을 예시한다. 단일 세포 스크리닝의 결과에 기초하여, 동물은 면역화의 반복 라운드의 면역화(예를 들어, 대체 면역화)에 이어서 면역화된 동물로부터 얻은 혈액 샘플로부터의 세포의 단일 세포 스크리닝을 받거나, 스크리닝을 통해 동물이 원하는 표현형을 나타내는 것으로 판단되는 경우 조직 수확을 거칠 수 있다. 도 1c는 선택 항체의 생성을 모니터링하는 예시적인 비종말적 방법을 예시하며, 여기서 면역화된 동물로부터 얻은 혈액 샘플로부터 정제된 항체 분비 세포(ASC)는 단일 세포 수준에서 스크리닝된다. 이 과정은 설계 목표가 충족되고/되거나 선택 항체가 생성될 때까지 반복된다. 도 1d는 선택 항체 생성을 위한 항체 생성을 유도하는 예시적인 비종말적 방법을 예시하며, 여기서 일차 전략은 동물을 면역화시키는 데 사용되고, 면역화된 동물로부터 단리된 PBMC로부터 얻은 ASC는 원하는 표현형에 대해 스크리닝된다. 스크리닝을 통해 설계 목표가 충족되지 않는 것으로 판단되는 경우, 동물은 대체 전략(예: 일차 전략과 상이한 전략)으로 면역화되고, 면역화된 동물로부터 단리된 PBMC로부터 얻은 ASC는 원하는 표현형에 대해 스크리닝된다. 이 과정은 스크리닝을 통해 설계 목표가 충족되었다고 판단할 때까지 반복된다. 설계 목표가 충족될 경우, 하이브리도마, 단일 세포 플랫폼 또는 서열 기반 발굴을 사용하여 항체 구조를 위해 종말적 조직을 수확할 수 있다. 도 1e는 동물을 스크리닝하는 예시적인 비종말적 방법 및 B 세포 프로파일링을 예시하며, 여기서 일련의 동물은 면역원으로 면역화되고 각 동물로부터 얻은 혈액 샘플로부터 얻은 ASC는 스크리닝되고 B 세포 레퍼토리는 프로파일링된다. 예시적인 공정의 다양한 양태에서, 항체 분비 세포(ASC), 예를 들어 형질모세포는 면역화된 마우스의 말초 혈액으로부터 정제된 다음, 관련 활성 또는 표현형에 대해 단일 세포 분해능에서 스크리닝된다. 통상적으로 약 8주가 소요되고 높은 수준의 기술력이 요구되는 (도 1a에 예시된) 전통적인 하이브리도마 생성 공정과 비교하여, 본 개시내용의 공정은 덜 노동 집약적이고 시간이 적게 소요된다.
따라서, 본 개시내용은 비인간 동물에서 선택 항체의 생성을 모니터링하는 방법을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 방법은 (a) 비인간 동물을 면역원으로 면역화시키는 단계; (b) 상기 비인간 동물로부터 항체 분비 세포(ASC)를 포함하는 혈액 샘플을 얻는 단계; 및 (c) 선택 항체 생성을 위해 혈액 샘플 또는 이의 분획에 존재하는 ASC를 분석, 예를 들어 개별적으로 분석하는 단계를 포함한다. 다양한 경우에, 방법은 설계 목표가 충족될 때까지, 예를 들어 선택 항체가 생성될 때까지 (b) 및 (c)를 1회 이상 반복하는 단계를 추가로 포함한다. 도 1c는 본 개시내용의 이러한 예시적인 양태를 예시한다. 본 개시내용은 또한 선택 항체의 생성을 위해 비인간 동물에서 항체 생성을 유도하는 방법을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 방법은 (a) 면역원으로 비인간 동물에 대한 초기 면역화를 수행하는 단계; (b) 상기 비인간 동물로부터 ASC를 포함하는 혈액 샘플을 얻는 단계; (c) 선택 항체 생성을 위해 혈액 샘플 또는 이의 분획에 존재하는 ASC를 분석, 예를 들어 개별적으로 분석하는 단계; 및 (d) 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 미만인 경우 단계의 사이클을 수행하는 단계를 포함하며, 여기서 사이클은 (i) 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 미만인 경우 면역원으로 비인간 동물에 대한 후속 면역화를 수행하는 단계, (ii) 상기 비인간 동물로부터 ASC를 포함하는 혈액 샘플을 얻는 단계, 및 (iii) 선택 항체 생성을 위해 혈액 샘플 또는 이의 분획에 존재하는 ASC를 분석, 예를 들어 개별적으로 분석하는 단계를 포함한다.
다양한 양태에서, 분석하는 단계는 단일 세포, 생세포 분석을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "개별적으로 ASC를 분석하는"이라는 어구는 ASC가 단일 세포 수준 또는 단일 세포 분해능에서 분석 또는 조사된다는 것을 의미한다. 예시적인 경우에, "개별적으로 ASC를 분석하는 것"은 단일 ASC와 관련된 결과를 제공한다. 선택적으로, 다수의 ASC가 동시에 분석된다. 다양한 양태에서, 다수의 ASC가 동시에 개별적으로 분석된다. 예시적인 양태에서, 혈액 샘플은 비종말적 방식으로 비인간 동물로부터 얻어지며, 예를 들어 비인간 동물은 혈액 샘플 수집 동안 살생되지 않는다. 예시적인 경우에, 방법은 비인간 동물로부터 비종말적 혈액 채취를 수행하는 단계를 포함한다. 다양한 경우에, 방법은 혈액 샘플 또는 이의 분획을 매트릭스에 적용하고 매트릭스의 고유 주소를 각각의 ASC에 할당하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 분석하는 단계의 결과는 선택 항체를 생성하는 각 ASC의 확인이다. 특정 양태에서, 분석하는 단계의 결과는 선택 항체를 생성하는 각 ASC의 고유 주소의 확인이다. 예시적인 경우에, 방법은 다음의 적어도 하나의 사이클을 포함한다: (i) 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 미만인 경우 면역원으로 비인간 동물에 대한 후속 면역화를 수행하는 단계, (ii) 상기 비인간 동물로부터 ASC를 포함하는 혈액 샘플을 얻는 단계, (iii) 선택 항체 생성을 위해 혈액 샘플 또는 이의 분획에 존재하는 ASC를 분석, 예를 들어 개별적으로 분석하는 단계. 선택적으로, (iii)에서 분석된 바와 같이, 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 이상일 때까지 사이클은 반복된다. 다양한 경우에, 사이클은 적어도 2회 반복된다.
후속 면역화의 면역원은 예시적인 양태에서 초기 면역화의 면역원과 상이할 수 있다. 예를 들어, 예시적인 양태에서, 각각의 후속 면역화는 (A) 상이한 면역원, 보조제 및/또는 면역조절제가 비인간 동물에게 투여된다는 점, (B) 상이한 용량의 면역원이 비인간 동물에게 투여된다는 점, (C) 면역원, 보조제, 면역조절제의 각 투여 사이의 시간이 상이하다는 점, 및/또는 (D) 면역원, 보조제, 면역조절제의 각 투여에 대한 투여 경로가 상이하다는 점에서 이전 면역화와 상이하다. 선택적으로, 비인간 동물이 면역될 때마다 상이한 면역원이 사용된다. 도 1d는 선택 항체 생성을 위한 항체 생성을 유도하는 예시적인 방법을 예시한다.
본 개시내용은 비인간 동물에서 선택 항체를 생성하는 방법을 추가로 제공한다. 예시적인 구현예에서, 방법은 항체 생성을 유도하는 현재 개시된 방법에 따라 선택 항체의 생성을 위해 비인간 동물에서 항체 생성을 유도한 다음, 선택 항체 및/또는 선택 항체를 생성하는 ASC를 단리하는 단계를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 방법은 (a) 면역원으로 비인간 동물에 대한 초기 면역화 캠페인을 수행하는 단계; (b) 상기 비인간 동물로부터 항체 분비 세포(ASC)를 포함하는 혈액 샘플을 얻는 단계; (c) 선택 항체 생성을 위해 혈액 샘플 또는 이의 분획에 존재하는 ASC를 분석, 예를 들어 개별적으로 분석하는 단계; (d) 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 미만인 경우 단계의 사이클을 수행하는 단계, 여기서 사이클은 (i) 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 미만인 경우 면역원으로 비인간 동물에 대한 후속 면역화를 수행하는 단계, (ii) 상기 비인간 동물로부터 ASC를 포함하는 혈액 샘플을 얻는 단계, 및 (iii) 선택 항체 생성을 위해 혈액 샘플 또는 이의 분획에 존재하는 ASC를 분석, 예를 들어 개별적으로 분석하는 단계를 포함하는, 단계; 및 (e) 선택 항체 및/또는 선택 항체를 생성하는 ASC를 단리하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 방법은 (f) ASC(예를 들어, 선택 항체를 생성하는 단리된 ASC)에 의해 생성된 선택 항체의 중쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 ASC에 의해 생성된 선택 항체의 경쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계, (g) 선택 항체의 중쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 벡터 및 선택 항체의 경쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계, 및 (h) 숙주 세포에 의해 생성된 항체를 단리하는 단계를 포함한다.
예시적인 양태에서, 현재 개시된 방법의 분석하는 단계는 (a) 선택 항체에 결합하고 선택 항체에 결합 시 검출 가능한 신호, 예를 들어 형광 신호를 생성하는 시약과 매트릭스 내의 ASC를 조합하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 현재 개시된 방법의 분석하는 단계는 (a) 선택 항체의 Fc 도메인에 결합하는 적어도 하나의 시약 및 선택 항체가 결합하는 적어도 하나의 시약(예를 들어, 선택 항체의 항원 결합 도메인에 결합하는 시약)과 매트릭스 내의 ASC를 조합하는 단계를 포함하고, 여기서 이들 시약 중 적어도 하나는 검출 가능한 표지에 부착된다. 예시적인 경우에서, ASC는 선택 항체의 Fc 도메인에 결합하고 제1 검출 가능한 표지 및 선택 항체가 결합하는 표적을 포함하는 검출 시약(예를 들어, 선택 항체의 항원 결합 도메인에 결합하는 시약)과 조합된다. 도 2a 내지 도 2c는 현재 개시된 방법의 맥락에서 예시적인 분석을 예시한다. 다양한 경우에, 표적은 제1 검출 가능한 표지와 상이한 제2 검출 가능한 표지에 의해 표지된다. 일부 경우에, 선택 항체의 Fc 도메인에 결합하고 고체 지지체를 포함하는 포획 시약은 추가로 ASC, 검출 시약 및 표지된 표적과 조합된다. 다양한 경우에, 방법은 (b) 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지를 분석하는 단계; 및 (c) 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지가 검출되는 매트릭스 내의 위치를 확인하는 단계, 여기서 각각의 확인된 위치는 선택 항체를 생성하는 개별 ASC의 위치를 표시하는 것인, 단계를 추가로 포함한다. 도 2a 및 도 2b는 표지된 표적 및 포획 시약을 사용한 이러한 예시적인 분석을 예시한다. 도 2a는 매트릭스를 웰로서 예시한다. 도 2b는 매트릭스를 다중 펜 칩 또는 다중 웰 플레이트로서 예시하며 각 ASC는 단일 펜 또는 웰에 위치된다. 다양한 경우에, 표적은 세포에 의해 발현되고 표적을 발현하는 세포는 ASC 및 검출 시약과 조합된다. 예시적인 양태에서, 방법은 (b) 제1 검출 가능한 표지를 분석하는 단계; 및 (c) 제1 검출 가능한 표지가 검출되는 매트릭스 내의 위치를 확인하는 단계, 여기서 각각의 확인된 위치는 선택 항체를 생성하는 개별 ASC의 위치를 표시하는 것인, 단계를 추가로 포함한다. 도 2c는 표적을 발현하는 세포를 사용한 이러한 예시적인 분석을 예시한다. 예시적인 경우에, 현재 개시된 방법의 분석하는 단계는 (a) 매트릭스 내의 ASC를 (i) 선택 항체에 결합하고 고체 지지체를 포함하는 포획 시약, (ii) 선택 항체에 결합하고 제1 검출 가능한 표지를 포함하는 검출 시약, 및 (iii) 선택 항체가 결합하는 표지된 표적과 조합하는 단계, 여기서 표지된 표적은 제1 검출 가능한 표지와 별개인 제2 검출 가능한 표지를 포함하는 것인, 단계; (b) 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지를 분석하는 단계; 및 (c) 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지가 검출되는 매트릭스 내의 위치를 확인하는 단계, 여기서 각각의 확인된 위치는 선택 항체를 생성하는 개별 ASC의 위치를 표시하는 것인, 단계를 포함한다. 선택적으로, 포획제는 고체 지지체에 부착된 항체 Fc 도메인에 결합하는 항체를 포함한다. 예시적인 경우에, 검출제는 제1 검출 가능한 표지에 부착된 항체 Fc 도메인에 결합하는 항체를 포함한다. 다양한 양태에서, 포획제의 항체 Fc 도메인에 결합하는 항체는 검출제의 동일한 항체이다. 예시적인 경우에, 조합하는 단계는 웰에서 일어나고 포획제는 웰에서 단일층을 형성한다. 다양한 양태에서, 방법은 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지가 검출되는 웰 내의 위치를 확인하는 단계를 포함하며, 각각의 확인된 위치는 선택 항체를 생성하는 개별 ASC의 위치를 표시한다.
본 개시내용은 선택 항체를 생성하는 ASC를 확인하기 위한 단일 세포 분석을 추가로 제공한다. 본 개시내용은 선택 항체를 생성하는 ASC를 분석하는 방법을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 분석 또는 방법은 (a) 웰에서 (i) 면역원으로 면역화된 비인간 동물로부터 얻은 혈액 샘플, 또는 이의 분획(혈액 샘플은 ASC를 포함함), (ii) 선택 항체에 결합하고 제1 검출 가능한 표지를 포함하는 검출 시약, 및 (iii) 선택 항체가 결합하는 표적과 조합하는 단계, 여기서 (A) 표적은 제1 검출 가능한 표지와 별개인 제2 검출 가능한 표지를 포함하는 표지된 표적이고, 선택 항체에 결합하고 고체 지지체를 포함하는 포획 시약은 웰에서 추가로 조합되어 웰에서 단일층을 형성하거나 (B) 표적은 세포의 표면에서 발현되고 세포는 웰에서 조합되어 웰에서 단일층을 형성하는 것인, 단계; (b) 표적이 표지된 표적인 경우, 제1 검출 가능한 표지를 분석하고 선택적으로 제2 검출 가능한 표지를 분석하는 단계; 및 (c) 제1 검출 가능한 표지가 검출되거나 제1 및 제2 검출 가능한 표지가 검출되는 웰 내의 위치를 확인하는 단계, 여기서 각각의 확인된 위치는 선택 항체를 생성하는 개별 ASC의 위치를 표시하는 것인, 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 분석 또는 방법은 (a) 웰에서 (i) 면역원으로 면역화된 비인간 동물로부터 얻은 혈액 샘플, 또는 이의 분획, (ii) 고체 지지체에 부착된 항체의 Fc에 결합하는 항체를 포함하는 포획 항체, (iii) 제1 검출 가능한 표지에 부착된 항체의 Fc에 결합하는 항체를 포함하는 검출 시약, 및 (iv) 제1 검출 가능한 표지와 별개인 제2 검출 가능한 표지에 부착된, 면역원을 포함하는 표지된 표적, 또는 이의 일부를 조합하는 단계; (b) 제1 검출 가능한 표지를 분석하는 단계; (c) 제2 검출 가능한 표지를 분석하는 단계; 및 (d) 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지가 검출되는 웰 내의 위치를 확인하는 단계, 여기서 각각의 확인된 위치는 선택 항체를 생성하는 개별 ASC의 위치를 표시하는 것인, 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 분석법 또는 방법은 (a) 웰에서 (i) 면역원으로 면역화된 비인간 동물로부터 얻은 혈액 샘플, 또는 이의 분획, (ii) 선택 항체에 결합하는 검출 시약, 및 (iii) 선택 항체가 결합하는 표적을 세포 표면에서 발현하는 세포, 여기서 세포는 웰에서 조합되어 웰에서 단일층을 형성하는 것인, 세포를 조합하는 단계, (b) 제1 검출 가능한 표지를 분석하는 단계; 및 (c) 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지가 검출되는 웰 내의 위치를 확인하는 단계, 여기서 각각의 확인된 위치는 선택 항체를 생성하는 개별 ASC의 위치를 표시하는 것인, 단계를 포함한다.
현재 개시된 방법의 다양한 양태에서, 비인간 동물은 하나 이상의 이차 림프 기관의 제거 및 안락사를 거치지 않는다. 또한 다양한 경우에, 혈액 샘플로부터의 ASC는 하이브리도마를 만드는 데 사용되지 않는다. 예시적인 양태에서, 비인간 동물은 일련의 비인간 동물 중 하나이고, 분석하는 단계의 결과는 임계값 미만의 선택 항체를 생성하고/하거나 추가 면역화를 요구하는 ASC의 백분율을 갖는 비인간 동물의 확인이다. 대안적인 양태에서, 방법은 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 이상인 경우 비인간 동물을 희생시키고 비인간 동물로부터 조직을 수확하는 단계를 포함한다. 다양한 경우에, 방법의 단계는 일련의 비인간 동물에 대해 수행되며, 방법은 일련의 각각의 비인간 동물에 대한 혈액 샘플의 B 세포 레퍼토리를 프로파일링하고 표적 B 세포 프로파일을 갖는 일련의 하위 집합을 선택하는 단계를 포함한다. 도 1e는 이러한 단계를 예시한다.
합리적인 면역 레퍼토리 생성 및 선택은 동물 기반 항체 발굴 기술에서 중요한 구성 요소이다. 전통적인 B 세포 불멸화에서 NanOBLAST(나노유체 Beacon® 장치의 항체 발굴 공정) 및 마이크로캡슐화와 같은 직접적인 B 세포 플랫폼으로의 발전에도 불구하고, 투입 B 세포의 다양성과 품질은 계속해서 항체 설계 목표를 충족하는 데 필수적인 결정 인자가 되고 있다. 면역 동물을 평가하는 전통적인 접근법은 면역 반응을 평가하고 B 세포 수확 및 항체 생성을 위해 동물을 선택하기 위해 다클론 분비 항체(혈청)의 조사에 의존한다. "혈청 역가" 접근법은 검출된 항체의 개별 B 세포 공급원의 품질이 아니라 분비된 모든 항체의 총 반응성을 측정하기 때문에 결코 이상적이지 않다. 항체 역가 측정과 담당 B 세포 공급원 사이의 직접적인 연결이 없기 때문에 B 세포 반응의 품질을 해석하기가 어렵다. 혈청에 가용성의, 항원 특이적 항체가 있는지를 결정하는 것 외에도, 동물 선택 또는 면역 조종 전략을 도울 수 있는 이 다클론 분석으로부터 유용한 추가 정보를 얻기는 어렵다. 이러한 과제를 해결할 수 있는 비종말적 말초 혈액으로부터 유래된 샘플을 사용하여 면역 동물의 B 세포 반응을 조사하기 위한 ASC 분석이 본원에 제공된다. 따라서, 본 개시내용은 선택 항체를 생성하는 항체 분비 세포(ASC)에 대해 비인간 동물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 예시적인 구현예의 방법은 (a) 일련의 비인간 동물을 면역원으로 면역화시키는 단계; (b) 일련의 각 비인간 동물로부터 ASC를 포함하는 혈액 샘플을 얻는 단계; 및 (c) 선택 항체의 생성을 위해 혈액 샘플 또는 이의 분획에 존재하는 ASC를 개별적으로 분석하는 단계, 여기서 일련의 각 비인간 동물에 대해, 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 결정되는, 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 스크리닝 방법은 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 이상인 경우 희생 및/또는 조직 수확을 위해 비인간 동물(들)을 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 다양한 양태에서, 스크리닝 방법은 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 미만인 경우 후속 면역화를 위해 비인간 동물(들)을 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 따라서, 다양한 구현예에서, 스크리닝 방법은 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율에 기초하여 후속 면역화를 위한 동물 대 희생을 위한 동물을 확인한다.
전술한 바와 일치하여, 후속 면역화를 위해 면역화된 비인간 동물을 선택하는 방법이 제공된다. 예시적인 구현예에서, 방법은 현재 개시된 방법 중 임의의 하나에 따라 비인간 동물에서 선택 항체의 생성을 모니터링하는 단계(방법은 일련의 비인간 동물에서 수행되며, 일련의 각 비인간 동물에 대해 선택 항체를 생성하는 ASC의 수가 확인된다), 및 동물에 대한 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 미만인 경우 후속 면역화를 위해 동물을 선택하는 단계를 포함한다. 또한, 안락사 및 이차 림프구 수확을 위해 면역화된 비인간 동물을 선택하는 방법이 본원에 제공된다. 예시적인 구현예에서, 방법은 현재 개시된 방법 중 임의의 하나에 따라 비인간 동물에서 선택 항체의 생성을 모니터링하는 단계(방법은 일련의 비인간 동물에서 수행되며, 일련의 각 비인간 동물에 대해 선택 항체를 생성하는 ASC의 수가 확인된다), 및 동물에 대한 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 이상인 경우 안락사 및 이차 림프구 수확을 위해 동물을 선택하는 단계를 포함한다.
도 1a는 전통적인 형질전환 마우스 하이브리도마 생성 방법의 예시이다. 도 1b는 면역 반응을 모니터링하기 위한 비종말적 방법의 예시이다. 도 1c는 선택 항체의 생성을 모니터링하는 비종말적 방법의 예시이다. 도 1d는 선택 항체 생성을 위한 항체 생성을 유도하는 비종말적 방법의 예시이다. 도 1e는 동물을 스크리닝하는 비종말적인 방법 및 B 세포 프로파일링의 예시이다.
도 2a는 선택 항체를 생성하는 ASC를 확인하기 위한 예시적인 단일 세포 분석의 적용에 대한 예시이다. 도 2b는 선택 항체를 생성하는 ASC를 확인하기 위한 또 다른 예시적인 단일 세포 분석의 예시이다. 도 2c는 선택 항체를 생성하는 ASC를 확인하기 위한 또 다른 예시적인 단일 세포 분석의 예시이다.
도 3은 항-이디오토프 항체에 결합하는 항체의 예시이다. 파라토프, 이디오타입 및 이디오토프가 제시되어 있다.
도 4는 항체 1로 면역화된 표시된 마우스로부터 얻은 혈청에 대한 다클론 역가의 그래프이다.
도 5의 A는 예시적인 단일 세포 스크린의 구성 요소의 예시이고, 도 5의 B는 항원과 결합하는 항체의 존재 하에 단일 세포 분석의 구성 요소가 어떻게 상호작용하는지에 대한 예시이다. 도 5의 C는 폴리스티렌 비드와 상호작용하여 형광 "블룸"을 생성하는 항체를 분비하는 ASC를 수용하는 개별 펜의 예시이다. IgG 분비 및 항원 특이적 항체는 분석에 의해 검출된다.
도 6은 단일 세포를 수용하는 개별 펜 위의 이중 블룸, 세포의 웰 유출 및 항체 클로닝, 발현, 정제 및 분석을 위한 PCR 분석의 예시이다.
도 7의 A는 적절한 항체 쌍을 선택하는 데 사용되는 샌드위치 ELISA 형식의 예시이다. 도 7의 B는 항체 1의 농도의 함수로서 플롯팅된 ELISA 신호의 그래프이다. 도 7의 C는 항체 농도의 함수로서 플롯팅된 PD1 기능의 그래프이다.
도 8의 A는 항체를 분비하는 ASC가 단일 웰에 위치하는 녹색 형광 반점의 이미지이다. 도 8의 B는 ASC에 의해 분비된 항원 특이적 항체가 단일 웰에 위치하는 적색 형광 반점의 이미지이다. 도 8의 C는 항체를 분비하는 ASC가 단일 웰에 위치하는 유색 반점, ASC에 의해 분비된 항원 특이적 항체가 단일 웰에 위치하는 반점 및 항원 특이적 항체를 분비하는 ASC가 단일 웰에 위치하는 반점의 이미지이다. 도 8의 D는 293T 세포에 의해 발현된 항원이 B 세포에 의해 생성된 항체에 결합되고 Alexa 488로 표지된 염소 항-인간 Fc 항체로 표지된 다중 형광 반점으로 표지된 형질감염된 세포의 예시적인 이미지이다.
도 9는 항체 분비를 나타내는 녹색 채널(상단) 또는 항원(EGFR) 결합을 나타내는 적색 채널(하단) 상의 RFU가 있는, 표시된 하이브리도마 클론(또는 무관한 클론)의 단일 세포의 일련의 이미지이다.
도 10은 하이브리도마의 KD의 함수로서 플롯팅된 RFU 녹색/RFU 적색 비율의 그래프이다.
도 11은 모든 마우스에 걸쳐 사용되는 면역화 프로토콜의 개략도이다. 출혈의 시기와 항원의 변화가 표시되어 있다.
도 12는 그룹 1 및 2의 마우스의 제1 출혈의 혈청 역가의 그래프이다. 그래프는 인간 항원 역가 대 시노 항원 역가를 플롯팅한다.
도 13은 인간 항원 결합을 나타내는 적색 채널(왼쪽), 시노 항원 결합을 나타내는 녹색 채널(중간) 및 인간 항원과 시노 항원 결합을 나타내는 복합 채널(오른쪽) 상의 RFU가 있는, 단일 세포의 일련의 이미지이다. 출혈 1로부터 얻은 혈청의 데이터.
도 14는 인간 항원 단독, 시노 항원 단독, 또는 인간 및 시노 항원 둘 다에 반응하는 그룹 1(닫힌 원) 및 그룹 2(열린 원) 마우스의 항원 양성 ASC의 백분율의 그래프이다. 단일 세포 Incucyte 스크린에 의해 얻은 출혈 1로부터의 세포의 데이터.
도 15는 인간 항원 단독, 시노 항원 단독, 또는 인간 및 시노 항원 둘 다에 반응하는 그룹 1(닫힌 원) 및 그룹 2(열린 원)의 항원 양성 ASC의 백분율의 그래프이다. 단일 세포 Incucyte 스크린에 의해 얻은 출혈 2로부터의 세포의 데이터.
도 16은 인간 항원 단독, 시노 항원 단독, 또는 인간 및 시노 항원 둘 다에 반응하는 그룹 1A(인간 부스트) 및 그룹 1B(시노 부스트)의 항원 양성 ASC의 백분율의 그래프이다. 닫힌 원으로 표시된 출혈 2로부터의 세포의 데이터와 열린 사각형으로 표시된 출혈 3으로부터의 세포의 데이터. 단일 세포 Incucyte 스크린에 의해 얻은 데이터.
도 17은 그룹 1A(인간 부스트) 및 그룹 1B(시노 부스트)의 (출혈 1 대비) 교차 반응성 ASC 빈도 변화의 그래프이다. 단일 세포 Incucyte 스크린에 의해 얻은 데이터.
도 18은 인간 항원에 반응성인 혈청 역가의 함수로서 플롯팅된 시노 항원에 반응성인 혈청 역가의 그래프이다. 교차 반응성 ASC의 백분율이 기재되어 있다. 수확을 위한 선택용 관심 동물이 적색 원으로 표시되어 있다.
도 19는 다중-도메인 단백질(항원)의 인간 및 시노 서브도메인 오르소로그 둘 다에 결합하는 인간 시노 교차 반응성 항체의 생성을 향한 면역 조종을 이용한 면역화 캠페인의 개략도이다.
도 20은 인간 항원에 반응성인 혈청 역가의 함수로서 플롯팅된 시노 항원에 반응성인 혈청 역가의 그래프이다. 출혈 1로부터의 혈청.
도 21은 인간 단독 결합제, 시노 단독 결합제 및 인간/시노 교차 반응성 결합제에 대한 녹색 및 적색 채널 상의 RFU가 있는, t=0시간(하단) 및 t=23시간(상단)에서의 단일 세포의 일련의 이미지이다. 단일 세포 Incucyte 스크린을 사용하여 출혈 1로부터 얻은 혈청의 데이터.
도 22는 인간 항원 단독, 시노 항원 단독, 또는 인간 및 시노 항원 둘 다에 반응하는 항원 양성 ASC의 백분율의 그래프이다. 출혈 1로부터의 세포의 데이터가 제시되어 있다. 단일 세포 Incucyte 스크린에 의해 얻은 데이터.
도 23은 출혈 1 및 출혈 3으로부터의 혈청에서 (무관한 클론 대비) 교차 반응성 ASC 빈도 변화의 그래프이다.
도 24는 출혈 1 및 출혈 3에서 시노 항원 단독(닫힌 원) 또는 시노 및 인간 항원 둘 다(열린 사각형)에 대해 반응성인 항체를 분비하는 ASC의 백분율의 그래프이다. 단일 세포 Incucyte 스크린에 의해 얻은 데이터.
도 25는 인간-시노 교차 반응성 결합제의 백분율의 그래프이다. 수확을 위한 선택용 관심 동물이 사각형으로 표시되어 있다. 단일 세포 Incucyte 스크린에 의해 얻은 데이터.
도 2a는 선택 항체를 생성하는 ASC를 확인하기 위한 예시적인 단일 세포 분석의 적용에 대한 예시이다. 도 2b는 선택 항체를 생성하는 ASC를 확인하기 위한 또 다른 예시적인 단일 세포 분석의 예시이다. 도 2c는 선택 항체를 생성하는 ASC를 확인하기 위한 또 다른 예시적인 단일 세포 분석의 예시이다.
도 3은 항-이디오토프 항체에 결합하는 항체의 예시이다. 파라토프, 이디오타입 및 이디오토프가 제시되어 있다.
도 4는 항체 1로 면역화된 표시된 마우스로부터 얻은 혈청에 대한 다클론 역가의 그래프이다.
도 5의 A는 예시적인 단일 세포 스크린의 구성 요소의 예시이고, 도 5의 B는 항원과 결합하는 항체의 존재 하에 단일 세포 분석의 구성 요소가 어떻게 상호작용하는지에 대한 예시이다. 도 5의 C는 폴리스티렌 비드와 상호작용하여 형광 "블룸"을 생성하는 항체를 분비하는 ASC를 수용하는 개별 펜의 예시이다. IgG 분비 및 항원 특이적 항체는 분석에 의해 검출된다.
도 6은 단일 세포를 수용하는 개별 펜 위의 이중 블룸, 세포의 웰 유출 및 항체 클로닝, 발현, 정제 및 분석을 위한 PCR 분석의 예시이다.
도 7의 A는 적절한 항체 쌍을 선택하는 데 사용되는 샌드위치 ELISA 형식의 예시이다. 도 7의 B는 항체 1의 농도의 함수로서 플롯팅된 ELISA 신호의 그래프이다. 도 7의 C는 항체 농도의 함수로서 플롯팅된 PD1 기능의 그래프이다.
도 8의 A는 항체를 분비하는 ASC가 단일 웰에 위치하는 녹색 형광 반점의 이미지이다. 도 8의 B는 ASC에 의해 분비된 항원 특이적 항체가 단일 웰에 위치하는 적색 형광 반점의 이미지이다. 도 8의 C는 항체를 분비하는 ASC가 단일 웰에 위치하는 유색 반점, ASC에 의해 분비된 항원 특이적 항체가 단일 웰에 위치하는 반점 및 항원 특이적 항체를 분비하는 ASC가 단일 웰에 위치하는 반점의 이미지이다. 도 8의 D는 293T 세포에 의해 발현된 항원이 B 세포에 의해 생성된 항체에 결합되고 Alexa 488로 표지된 염소 항-인간 Fc 항체로 표지된 다중 형광 반점으로 표지된 형질감염된 세포의 예시적인 이미지이다.
도 9는 항체 분비를 나타내는 녹색 채널(상단) 또는 항원(EGFR) 결합을 나타내는 적색 채널(하단) 상의 RFU가 있는, 표시된 하이브리도마 클론(또는 무관한 클론)의 단일 세포의 일련의 이미지이다.
도 10은 하이브리도마의 KD의 함수로서 플롯팅된 RFU 녹색/RFU 적색 비율의 그래프이다.
도 11은 모든 마우스에 걸쳐 사용되는 면역화 프로토콜의 개략도이다. 출혈의 시기와 항원의 변화가 표시되어 있다.
도 12는 그룹 1 및 2의 마우스의 제1 출혈의 혈청 역가의 그래프이다. 그래프는 인간 항원 역가 대 시노 항원 역가를 플롯팅한다.
도 13은 인간 항원 결합을 나타내는 적색 채널(왼쪽), 시노 항원 결합을 나타내는 녹색 채널(중간) 및 인간 항원과 시노 항원 결합을 나타내는 복합 채널(오른쪽) 상의 RFU가 있는, 단일 세포의 일련의 이미지이다. 출혈 1로부터 얻은 혈청의 데이터.
도 14는 인간 항원 단독, 시노 항원 단독, 또는 인간 및 시노 항원 둘 다에 반응하는 그룹 1(닫힌 원) 및 그룹 2(열린 원) 마우스의 항원 양성 ASC의 백분율의 그래프이다. 단일 세포 Incucyte 스크린에 의해 얻은 출혈 1로부터의 세포의 데이터.
도 15는 인간 항원 단독, 시노 항원 단독, 또는 인간 및 시노 항원 둘 다에 반응하는 그룹 1(닫힌 원) 및 그룹 2(열린 원)의 항원 양성 ASC의 백분율의 그래프이다. 단일 세포 Incucyte 스크린에 의해 얻은 출혈 2로부터의 세포의 데이터.
도 16은 인간 항원 단독, 시노 항원 단독, 또는 인간 및 시노 항원 둘 다에 반응하는 그룹 1A(인간 부스트) 및 그룹 1B(시노 부스트)의 항원 양성 ASC의 백분율의 그래프이다. 닫힌 원으로 표시된 출혈 2로부터의 세포의 데이터와 열린 사각형으로 표시된 출혈 3으로부터의 세포의 데이터. 단일 세포 Incucyte 스크린에 의해 얻은 데이터.
도 17은 그룹 1A(인간 부스트) 및 그룹 1B(시노 부스트)의 (출혈 1 대비) 교차 반응성 ASC 빈도 변화의 그래프이다. 단일 세포 Incucyte 스크린에 의해 얻은 데이터.
도 18은 인간 항원에 반응성인 혈청 역가의 함수로서 플롯팅된 시노 항원에 반응성인 혈청 역가의 그래프이다. 교차 반응성 ASC의 백분율이 기재되어 있다. 수확을 위한 선택용 관심 동물이 적색 원으로 표시되어 있다.
도 19는 다중-도메인 단백질(항원)의 인간 및 시노 서브도메인 오르소로그 둘 다에 결합하는 인간 시노 교차 반응성 항체의 생성을 향한 면역 조종을 이용한 면역화 캠페인의 개략도이다.
도 20은 인간 항원에 반응성인 혈청 역가의 함수로서 플롯팅된 시노 항원에 반응성인 혈청 역가의 그래프이다. 출혈 1로부터의 혈청.
도 21은 인간 단독 결합제, 시노 단독 결합제 및 인간/시노 교차 반응성 결합제에 대한 녹색 및 적색 채널 상의 RFU가 있는, t=0시간(하단) 및 t=23시간(상단)에서의 단일 세포의 일련의 이미지이다. 단일 세포 Incucyte 스크린을 사용하여 출혈 1로부터 얻은 혈청의 데이터.
도 22는 인간 항원 단독, 시노 항원 단독, 또는 인간 및 시노 항원 둘 다에 반응하는 항원 양성 ASC의 백분율의 그래프이다. 출혈 1로부터의 세포의 데이터가 제시되어 있다. 단일 세포 Incucyte 스크린에 의해 얻은 데이터.
도 23은 출혈 1 및 출혈 3으로부터의 혈청에서 (무관한 클론 대비) 교차 반응성 ASC 빈도 변화의 그래프이다.
도 24는 출혈 1 및 출혈 3에서 시노 항원 단독(닫힌 원) 또는 시노 및 인간 항원 둘 다(열린 사각형)에 대해 반응성인 항체를 분비하는 ASC의 백분율의 그래프이다. 단일 세포 Incucyte 스크린에 의해 얻은 데이터.
도 25는 인간-시노 교차 반응성 결합제의 백분율의 그래프이다. 수확을 위한 선택용 관심 동물이 사각형으로 표시되어 있다. 단일 세포 Incucyte 스크린에 의해 얻은 데이터.
항체 생성의 B 세포 기능 및 비종말적 모니터링 및 조종
이차 림프 기관(예: 비장 및 림프절)의 배 중심(GC)에서 최근에 항원을 접한 항원 특이적 B 세포는 분열하고 여러 경로로 분화하도록 자극을 받는다. 예를 들어, 문헌[Klein and Dalla-Favera, Nature Reviews Immunol 8: 22-33 (2008)] 참조). 항원 유발 검사에 반응하여 항체를 혈청으로 분비하는 주요 B 세포 계통은 형질 세포이다. 형질 세포 분화는 이차 림프 기관에서 시작되며, 여기서 GC 내에서 세포-세포 상호작용이 항원에 특이적인 항체를 표면에 발현하는 B 세포를 강제하여 형질모세포로 알려진 미성숙 형질 세포로 분화하게 한다. 형질모세포는 가용성 항체를 생성하고 분비하는 빠르게 분열하는 B 세포이다. 그러나 형질모세포는 본질적으로 일시적이며, 생존하고 계속 증식하기 위해서는 상당한 영양 지원을 요구한다. 형질모세포의 주요 생존 틈새는 이차 림프 기관에 있지만, 이러한 대기열은 잠정적이며 동족 항원의 존재에 따라 달라진다.
B 세포는 항원에 대한 장기 체액 기억을 유지하기 위해 다음의 두 가지 주요 전략을 사용한다: IgG+ 기억 B 세포의 형성 및 수명이 긴 성숙한 형질 세포의 형성. 기억 B 세포는 B 세포 수용체(BCR)로 알려진 동족 항체의 세포 표면 결합 버전을 발현하지만, 가용성 항체를 분비하지는 않는다. 이들 세포는 몸 전체의 다양한 위치에 상재하며, 이차 림프 기관 내에 풍부하다. 항원과 다시 접할 경우, 기억 B 세포는 증식(즉, 클론 생성) 및 항체 분비 형질 세포로 분화하도록 유도될 수 있다. 장기 기억으로 가는 또 다른 경로는 수명이 긴 성숙한 형질 세포의 형성을 통한 것이다. 성숙한 형질 세포는 영양 지원을 제공하는 매우 특화된 생존 틈새를 필요로 하며, 염증 조직 내, 장(장 관련 림프 조직(gut-associated lymphoid tissue-GALT))과 관련된 특수 구조 및 골수 내에서 발견될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Fairfax et al., Semin Immunol 20(1): 49-58 (2008)] 참조. 틈새 간질 세포에 의해 생성된 국소 환경은 최종적으로 분화된 형질 세포의 수명을 유지하는 데 필요한 신호를 제공한다.
B 세포가 장기 간질 틈새에 상재하려면 혈액을 통해 이러한 목적지로 이동해야 한다. 실제로, GC에서 항원에 노출된 후, 형질모세포로의 분화 및 이차 림프 기관 내에서의 후속 증식, 이동성 형질모세포의 급증이 순환에서 검출될 수 있다. 마우스에서, 혈액 내 형질모세포의 이 급증은 항원 노출 후 3~7일 후에 발생하며, 이들이 적절한 틈새로 돌아가 수명이 긴 형질 세포로 분화하므로, 시간이 지남에 따라 감소한다.
이들이 혈액을 통해 이동하므로, 최근에 항원 자극된 형질모세포 및 형질 세포(항체 분비 세포, (ASC))의 포획 및 관심 항체, 예를 들어 선택 항체를 생성하는 이러한 세포의 확인을 수반하는 방법이 본원에 제공된다. 본 개시내용의 방법은 혈액 샘플을 이용하고 혈액의 세포 환경은 특히 B 세포 계통의 관점에서 이차 림프 기관의 것보다 실질적으로 덜 복잡하기 때문에, 본 개시내용의 방법은 유리하게도 덜 복잡하다. 본 개시내용의 방법은 역사적으로 상대적으로 낮은 전체 존재비로 인해 어려웠던 이 ASC 집단에 접근하는 어려움을 해결한다.
따라서, 본 개시내용은 비인간 동물에서 선택 항체의 생성을 모니터링하는 방법을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 방법은 (a) 비인간 동물을 면역원으로 면역화시키는 단계; (b) 상기 비인간 동물로부터 항체 분비 세포 ASC를 포함하는 혈액 샘플을 얻는 단계; 및 (c) 선택 항체 생성을 위해 혈액 샘플 또는 이의 분획에 존재하는 ASC를 분석(선택적으로, 개별적으로 분석)하는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 또한 선택 항체의 생성을 위해 비인간 동물에서 항체 생성을 유도하는 방법을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 방법은 (a) 면역원으로 비인간 동물에 대한 초기 면역화 캠페인을 수행하는 단계; (b) 상기 비인간 동물로부터 항체 분비 세포(ASC)를 포함하는 혈액 샘플을 얻는 단계; (c) 선택 항체 생성을 위해 혈액 샘플 또는 이의 분획에 존재하는 ASC를 분석(선택적으로, 개별적으로 분석)하는 단계; 및 (d) 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 미만인 경우 단계의 사이클을 수행하는 단계, 여기서 사이클은 (i) 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 미만인 경우 면역원으로 비인간 동물에 대한 후속 면역화를 수행하는 단계, (ii) 상기 비인간 동물로부터 ASC를 포함하는 혈액 샘플을 얻는 단계, 및 (iii) 선택 항체 생성을 위해 혈액 샘플 또는 이의 분획에 존재하는 ASC를 개별적으로 분석하는 단계를 포함하는, 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 임계값은 약 1% 내지 약 10%, 예를 들어 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%이다. 예시적인 양태에서, 임계값은 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%이다. 대안적 양태에서, 임계값은 50% 초과, 예를 들어 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상이다.
이러한 방법의 예시적인 양태에서, 비인간 동물은 안락사도 하나 이상의 이차 림프 기관의 제거도 당하지 않거나, 동물이 관심 항체, 예를 들어, 선택 항체를 생성하는, 충분한 수의 ASC를 보유하는 것으로 간주된 후에만 동물은 안락사되고 이차 림프 기관이 수확된다. 예시적인 양태에서, 방법은 일련의 비인간 동물로 수행된다. 다양한 경우에, 분석하는 단계의 결과는 임계값 미만이고/이거나 추가 면역화를 필요로 하는, 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율을 갖는 일련의 비인간 동물(들)의 확인이다. 그런 다음, 이러한 비인간 동물(들)은 예를 들어, 선택 항체의 생성을 증가시키기 위해 단계(상기 (d))의 사이클을 거칠 수 있다.
대안적인 경우에, 분석하는 단계의 결과는 임계값 이상인, 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율을 갖는 일련의 비인간 동물(들)의 확인이다. 그런 다음, 이러한 비인간 동물(들)은 희생될 수 있고 이러한 비인간 동물(들)로부터 조직이 수확될 수 있다. 대안적 양태에서, 분석된 ASC의 총 수에 대비 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 이상인 경우, 방법은 비인간 동물을 희생시키고 비인간 동물로부터 조직을 수확하는 단계를 포함한다.
따라서, 더 적은 수의 동물(예를 들어, 임계값 미만의 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율을 갖는 동물)이 불필요하게 살생 당하고 더 많은 백분율의 면역화된 동물이 궁극적으로 선택 항체를 생성하기 때문에 선택 항체 생성을 모니터링 및 유도 또는 조종하는 현재 개시된 방법은 매우 효율적이다. 또한, 다양한 경우에, 이러한 현재 개시된 방법은 하이브리도마를 생성하는 단계를 포함하지 않으며, 따라서 유리하게도 시간 및 물질 소모가 적다.
면역화
본 개시내용의 다양한 양태에서, 방법은 면역원으로 비인간 동물을 면역화시키는 단계를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "면역화"는 상기 면역원에 대한 면역 반응을 일으키기 위한 "면역화 캠페인" 또는 "면역화 프로토콜" 또는 "캠페인"을 수행하거나 실시하는 것을 의미한다. 예시적인 양태에서, 면역 반응은 상기 면역원에 대한 B 세포 면역 반응 및/또는 체액성 면역 반응을 포함한다. 예시적인 양태에서, 비인간 동물에 일어나는 면역 반응은 항체 분비 세포(ASC), 예를 들어, 항체 분비 형질 세포, 형질모세포, 형질 세포(예를 들어, 높은 수준의 가용성 항체를 생성하고 분비하는 빠르게 분열하는 B 세포)의 생성을 포함한다. 다양한 경우에, 면역 반응은 혈액을 통해 이차 림프 기관으로 이동하는 이동성 ASC(예를 들어, 형질 세포, 형질모세포)를 포함한다. 다양한 양태에서, 이차 림프 기관은 림프절(예를 들어, 슬와, 서혜부, 장간막 및 상완), 비장, 페이에르판 또는 점막 조직이다. 예시적인 경우에서, ASC는 항원 노출 후 약 1~7일 후에 생성된다. 선택적으로, ASC, 예를 들어 이동성 형질모세포는 항원 노출 후 약 3일 내지 약 7일(예를 들어, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일) 후에 혈액에서 발견된다. 일부 경우에, ASC, 예를 들어 이동성 형질모세포는 항원 노출 후 약 8일, 약 9일 또는 약 10일 후에 혈액에서 발견된다.
비인간 동물을 면역화하기 위한 적합한 기술은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 3rd ed., Academic Press Limited, San Diego, CA, 1996] 참조. 예를 들어, 문헌[Barry et al., Biotechniques. 16(4):616-8, 620 (1994)]; 문헌[Tang et al., Nature. 12; 356(6365):152-4 (1992)]; 문헌[Bergmann-Leitner and Leitner, Methods Mol Biol 1325: 289-302 (2015)]; 문헌[Aravindaram and Yang, Methods Mol Biol 542: 167-178 (2009)]; 문헌[Johnston and Tang, Methods Cell Biol 43 PtA: 353-365 (1994)]; 및 문헌[Dileo et al., Human Gene Ther 14(1): 79-87 (2003)]에 기재된 유전자 총 방법 또한 비인간 동물을 면역화시키는 데 사용될 수 있다. 또한, 본원에 예시된 바와 같이, 면역화는 항원을 발현하는 세포를 비인간 동물에게 투여하거나 항원이 로딩된 수지상 세포, 종양 세포 백신 또는 면역 세포 기반 백신을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sabado et al., Cell Res 27(1): 74-95 (2017)], [Bot et al., “Cancer Vaccines” in Plotkin’s Vaccines, 7th ed., Editors: Plotkin et al., Elsevier Inc., 2018] 및 [Lee and Dy, “The Current Status of Immunotherapy in Thoraic Malignancies” in Immune Checkpoint Inhibitors in Cancer, Editors: Ito and Ernstoff, Elsevier Inc., 2019] 참조. 다양한 경우에, 면역화는 미세바늘 전달(예를 들어, 문헌[Song et al., Clin Vaccine Immunol 17(9): 1381-1389 (2010)] 참조); 바이러스 유사 입자(VLP)(예를 들어, 문헌[Temchura et al., Viruses 6(8): 3334-3347 (2014)] 참조); 또는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Shakya et al., Vaccine 33(33): 4060-4064 (2015)] 및 문헌[Cai et al., Vaccine 31(9): 1353-1356 (2013)] 참조. 예를 들어 T 세포 에피토프를 항원에 첨가하는 것을 포함하는 면역화 및 면역원 준비를 위한 추가 전략은 문헌[Chen and Murawsky, Front Immunol 9: 460 (2018)]에 기재되어 있다.
다양한 양태에서, 방법은 비인간 동물을 면역원으로 면역화시키는 단계를 포함하고, 상기 면역원은 비인간 동물에게 1회 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5회 이상) 투여된다. 다양한 양태에서, 면역원은 주사, 예를 들어 복강 내, 피하, 근육 내, 피내 또는 정맥 내로 투여된다. 다양한 양태에서, 방법은 일련의 면역원 주사를 투여함으로써 비인간 동물을 면역화시키는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 각각의 투여, 예를 들어 주사는 약 10일 내지 약 18일 간격, 선택적으로 약 12일 내지 약 16일 간격, 또는 약 14일 간격으로 비인간 동물에게 제공된다. 예시적인 양태에서, 각각의 투여, 예를 들어 주사는 약 10일 내지 약 18일 간격보다 더 자주 비인간 동물에게 제공된다. 예를 들어, 예시적인 양태에서, 비인간 동물에 대한 면역원의 투여 사이의 타이밍은 약 1일 내지 약 9일 간격, 선택적으로 약 1일 내지 약 8일, 약 1일 내지 약 7일, 약 1일 내지 약 6일, 약 1일 내지 약 5일, 약 1일 내지 약 4일, 약 1일 내지 약 3일, 약 1일 내지 약 2일, 약 2일 내지 약 9일, 약 3일 내지 약 9일, 약 4일 내지 약 9일, 약 5일 내지 약 9일, 약 6일 내지 약 9일, 약 7일 내지 약 9일, 약 8일 내지 약 9일, 약 4일 내지 약 8일, 약 4일 내지 약 8일, 또는 약 6일 내지 약 8일이다. 비인간 동물에 대한 면역원의 투여 사이의 타이밍은 다양한 양태에서 더 길 수 있다. 예를 들어, 비인간 동물에 대한 면역원의 투여 사이의 타이밍은 약 1 내지 약 20주 이상, 예를 들어 약 1 내지 약 20개월일 수 있다. 선택적으로, 비인간 동물에 대한 면역원의 투여 사이의 타이밍은 약 1주 내지 약 19주, 약 1주 내지 약 18주, 약 1주 내지 약 17주, 약 1주 내지 약 16주, 약 1주 내지 약 15주, 약 1주 내지 약 14주, 약 1주 내지 약 13주, 약 1주 내지 약 12주, 약 1주 내지 약 11주, 약 1주 내지 약 10주, 약 1주 내지 약 9주, 약 1주 내지 약 8주, 약 1주 내지 약 7주, 약 1주 내지 약 6주, 약 1주 내지 약 5주, 약 1주 내지 약 4주, 약 1주 내지 약 3주, 약 1주 내지 약 2주, 약 2주 내지 약 20주, 약 3주 내지 약 20주, 약 4주 내지 약 20주, 약 5주 내지 약 20주, 약 6주 내지 약 20주, 약 7주 내지 약 20주, 약 8주 내지 약 20주, 약 9주 내지 약 20주, 약 10주 내지 약 20주, 약 11주 내지 약 20주, 약 12주 내지 약 20주, 약 13주 내지 약 20주, 약 14주 내지 약 20주, 약 15주 내지 약 20주, 약 16주 내지 약 20주, 약 17주 내지 약 20주, 약 18주 내지 약 20주, 또는 약 19주 내지 약 20주이다. 다양한 양태에서, 면역원 투여 사이의 타이밍은 8일 또는 9일보다 길 수 있다. 선택적으로, 면역원의 투여 사이의 타이밍은 약 1개월 내지 약 8개월, 약 1개월 내지 약 7개월, 약 1개월 내지 약 6개월, 약 1개월 내지 약 5개월, 약 1개월 내지 약 4개월, 약 1개월 내지 약 3개월, 약 1개월 내지 약 2개월, 약 2개월 내지 약 9개월, 약 3개월 내지 약 9개월, 약 4개월 내지 약 9개월, 약 5개월 내지 약 9개월, 약 6개월 내지 약 9개월, 약 7개월 내지 약 9개월, 약 8개월 내지 약 9개월, 약 4 내지 약 8개월, 약 4개월 내지 약 8개월, 또는 약 6개월 내지 약 8개월이다.
다양한 경우에, 면역화 동안, 면역원의 각각의 투여(예를 들어, 주사)는 동일한 (A) 면역원, 보조제, 면역조절제, 또는 이들의 조합, (B) 면역원, 보조제, 면역조절제 또는 이들의 조합의 양 또는 용량, (C) 면역원을 전달하는 투여 경로 또는 방법, (D) 비인간 동물 상의 투여 부위, 또는 (E) 이들의 조합으로 수행된다. 대안적으로, 면역화 동안 면역원의 1회 이상의 투여(예를 들어, 주사)는 상이한 (A) 면역원, 보조제, 면역조절제, 또는 이들의 조합, (B) 면역원, 보조제, 면역조절제 또는 이들의 조합의 양 또는 용량, (C) 면역원을 전달하는 투여 경로 또는 방법, (D) 비인간 동물 상의 투여 부위, 또는 (E) 이들의 조합으로 수행된다. 선택적으로, 면역원의 양은 후속 투여, 예를 들어 주사에 따라 감소하거나 증가한다. 일부 양태에서, 모든 다른 투여, 예를 들어 주사는 제1 및 제3 주사에 비해 감소되거나 증가된 양의 면역원을 포함한다. 예시적인 면역화는 본원에 제공된 실시예에 기재되어 있다.
비인간 동물
유리하게도, 현재 개시된 방법은 임의의 특정 비인간 동물에 제한되지 않는다. 예시적인 양태에서 비인간 동물은 임의의 비인간 포유동물이다. 예시적인 양태에서, 비인간 동물은 마우스, 랫트, 기니아 피그, 저빌 및 햄스터와 같은 설치목의 포유류, 및 토끼와 같은 토끼목의 포유류, 고양이 및 개를 포함한 식육목의 포유류, 소 및 돼지를 포함한 우제목의 포유류, 또는 말을 비롯한 말목의 포유류를 포함하나 이에 제한되지 않는 포유동물이다. 일부 양태에서, 비인간 포유동물은 영장류, 세보이드, 또는 시모이드(원숭이) 또는 유인원목(유인원)에 속한다. 다양한 양태에서, 비인간 동물은 염소, 라마, 알파카, 닭, 오리, 물고기(예: 연어), 양 또는 숫양이다.
예시적인 경우에, 현재 개시된 방법에 사용되는 비인간 동물(들)은 키메라 또는 완전 인간 항체를 생성하도록 변형, 예를 들어 유전적으로 변형된다. 이러한 비인간 동물은 형질전환 동물이라고 한다. 형질전환 동물에서 인간 항체의 생성은 문헌[Bruggemann et al., Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 63(2): 101-108 (2015)]에 기재되어 있다. 형질전환 닭(예: OmniChicken®), 형질전환 랫트(예: OmniRat®), 형질전환 라마 및 형질전환 소(예: Tc Bovine™)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 형질전환 동물이 본 발명에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 비인간 동물은 XenoMouse®, Alloy 마우스, Trianni 마우스, OmniMouse® 및 HuMAb-Mouse®와 같은 형질전환 마우스이다. XenoMouse®는 완전 인간 항체를 생성하는 형질전환 마우스 계통이다. XenoMouse®의 개요는 문헌[Foltz et al., Immunol Rev 270(1): 51-64 (2016)] 및 미국 특허 제5,939,598호에 의해 제공된다. 예시적인 양태에서, 비인간 동물은 형질전환 랫트이다. 다양한 양태에서 형질전환 랫트는 Unirat® 또는 OmniFlic®이며, 이는 각각 문헌[Clarke et al., Front Immunol 9:3037 (2019); doi: 10.3389/fimmu.2018.03037] 및 문헌[Harris et al., Front Immunol 9:889 (2018): doi: 10.3389/fimmu.2018.00889]에 기재되어 있다.
예시적인 경우에, 본 개시내용의 방법은 비인간 동물에 대해 비종말적이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 비인간 동물의 맥락에서 용어 "비종말적"은 방법이 수행되는 동안 비인간 동물의 생명이 종료되지 않음(예를 들어, 안락사되거나 살생이나 희생되지 않음)을 의미한다. 예시적인 양태에서, 비인간 동물은 하나 이상의 이차 림프 기관의 제거 및 안락사를 거치지 않지만, 본 발명은 이러한 기관(예: 비장)의 생검 등과 같은 절차를 허용한다.
면역원
유리하게도, 현재 개시된 방법은 임의의 특정 면역원에 제한되지 않는다. 다양한 양태에서 면역원은 임의의 항원, 선택적으로 단백질, 또는 이의 단편, 융합체 또는 변이체일 수 있다. 다양한 경우에, 면역원은 사이토카인, 림포카인, 호르몬, 성장 인자, 세포외 기질 단백질, 종양 관련 항원, 종양 관련 항원, 체크포인트 억제제 분자, 세포 표면 수용체 또는 이의 리간드이다. 단지 예시적인 면역원을 설명하기 위한 목적으로, 비인간 동물을 면역화시키는 데 사용되는 면역원은 다음 항체 중 임의의 하나가 결합하는 표적 또는 항원일 수 있다: 무로모납(Muromonab)-CD3(상표명 Orthoclone Okt3®으로 판매되는 제품), 압식시맙(상표명 Reopro®로 판매되는 제품), 리툭시맙(상표명 MabThera®, Rituxan®로 판매되는 제품), 바실릭시맙(상표명 Simulect®로 판매되는 제품), 다클리주맙(상표명 Zenapax®로 판매되는 제품), 팔리비주맙(상표명 Synagis®로 판매되는 제품), 인플릭시맙(상표명 Remicade®로 판매되는 제품), 트라스투주맙(상표명 Herceptin®로 판매되는 제품), 알렘투주맙(상표명 MabCampath®, Campath-1H®로 판매되는 제품), 아달리무맙(상표명 Humira®로 판매되는 제품), 토시투모맙-I131(상표명 Bexxar®로 판매되는 제품), 에팔리주맙(상표명 Raptiva®로 판매되는 제품), 세툭시맙(상표명 Erbitux®로 판매되는 제품), 이브리투모맙 티욱세탄(상표명 Zevalin®로 판매되는 제품), 오말리주맙(상표명 Xolair®로 판매되는 제품), 베바시주맙(상표명 Avastin®로 판매되는 제품), 나탈리주맙(상표명 Tysabri®로 판매되는 제품), 라니비주맙(상표명 Lucentis®로 판매되는 제품), 파니투무맙(상표명 Vectibix®로 판매되는 제품), 에쿨리주맙(상표명 Soliris®로 판매되는 제품), 세르톨리주맙 페골(상표명 Cimzia®로 판매되는 제품), 골리무맙(상표명 Simponi®로 판매되는 제품), 카나키누맙(상표명 Ilaris®로 판매되는 제품), 카투막소맙(상표명 Removab®로 판매되는 제품), 우스테키누맙(상표명 Stelara®로 판매되는 제품), 토실리주맙(상표명 RoActemra®, Actemra®로 판매되는 제품), 오파투무맙(상표명 Arzerra®로 판매되는 제품), 데노수맙(상표명 Prolia®로 판매되는 제품), 벨리무맙(상표명 Benlysta®로 판매되는 제품), 락시바쿠맙, 이필리무맙(상표명 Yervoy®로 판매되는 제품) 및 퍼투주맙(상표명 Perjeta®로 판매되는 제품). 예시적인 구현예에서, 항체는 항-TNF 알파 항체, 예컨대 아달리무맙, 인플릭시맙, 에타네르셉트, 골리무맙 및 세르톨리주맙 페골; 항-IL1β 항체, 예컨대 카나키누맙; 항-IL12/23(p40) 항체, 예컨대 우스테키누맙 및 브리아키누맙; 및 항-IL2R 항체, 예컨대 다클리주맙 중 하나이다.
면역화 단계에서 사용하기 위한 면역원의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Fuller et al., Curr Protoc Mol Biol, Chapter 11, Unit 11.4, (2001); Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols, 2nd ed., Ossipow et al. (Eds.), Humana Press 2014] 참조. 다양한 경우에, 면역원은 비인간 동물에게 투여하기 전에 보조제 또는 다른 용액과 혼합된다. 많은 보조제가 당업계에 공지되어 있고, 예시적인 경우에 오일, 백반, 알루미늄 염 또는 리포폴리사카라이드를 포함한다. 다양한 양태에서, 보조제는 무기적이다. 대안적 양태에서, 보조제는 유기적이다. 다양한 양태에서, 보조제는 다음을 포함한다: 백반, 알루미늄 염(예: 인산알루미늄, 수산화알루미늄), 프로인트 완전 보조제, 프로인트 불완전 보조제, RIBI 보조제 시스템(RAS), 지질 A, 시그마 보조제 시스템(Sigma Adjuvant System®), TiterMax® Classic, TiterMax® Gold, 몬타나이드(Montanide) 백신 보조제(예: 몬타나이드 103, 몬타나이드 ISA 720, 몬타나이드 불완전 Seppic 보조제, 몬타나이드 ISA51), AF03 보조제, AS03 보조제, 스페콜(Specol), SPT, 나노에멀젼, VSA3, 오일 또는 지질 기반 용액(예: 스쿠알렌, MF59®, QS21, 사포닌, 모노포스포릴 지질 A(MPL)), 트레할로스 디코리노마이콜레이트(TDM), sTDM 보조제, 비로좀 및 PRR 리간드. 예를 들어, https://www.invivogen.com/review-vaccine-adjuvants의 "Vaccine Adjuvants Review" 및 https://info.gbiosciences.com/blog/role-of-adjuvants-in-antibody-production의, 2016년 6월 2일에 게시된 The Protein Man의 블로그: A Discussion of Protein Research의 "Role of Adjuvants in Antibody Production" 참조. 다양한 경우에, 보조제는 라이소레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌 및 디니트로페놀. BCG(칼메트-게랭간균) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)과 같은 표면 활성 물질을 포함한다.
혈액 샘플 및 이의 분획
비인간 동물의 면역화 후, 상기 면역화된 비인간 동물로부터의 항체 분비 세포(ASC)를 포함하는 혈액 샘플을 얻는다. ASC는 체액성 면역 반응의 최종적으로 분화된 세포이다. ASC는 림프절에서 활성화된 B 세포로부터 분화하며 혈액에서 일시적으로 순환한다. 예시적인 양태에서, 혈액 샘플은 비종말적 방식으로 비인간 동물로부터 얻어지며, 예를 들어 비인간 동물은 혈액 샘플 수집 동안 살생되지 않는다. 예시적인 경우에, 방법은 비인간 동물로부터 비종말적 혈액 채취를 수행하는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 비인간 동물이 면역화된 후 약 1일 내지 약 2일 후에 비인간 동물로부터 혈액 샘플을 얻는다. 다양한 경우에, 면역화 후 약 3 내지 약 7일(예를 들어, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 후에 비인간 동물로부터 혈액 샘플을 얻는다. 면역원의 1회 초과 투여가 면역화 동안 제공되는 경우, 일부 양태에서 면역원의 마지막 투여 후 약 3일 내지 약 7일 후에 동물로부터 혈액 샘플을 얻는다. 다양한 양태에서, 비인간 동물을 면역화시킨 후 약 8일 내지 약 12일 후에 비인간 동물로부터 혈액 샘플을 얻지만, 일부 양태에서는, 더 적은 ASC가 상기 혈액 샘플에 존재할 것으로 예상된다.
예시적인 양태에서, 혈액 샘플은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 포함한다. 선택적으로 혈액 샘플은 B 세포로도 알려진 B 림프구를 포함한다. 다양한 경우에, 혈액 샘플은 혈장 계통의 ASC, 형질 세포 및/또는 형질모세포, 예를 들어 이동성 형질모세포를 포함한다. 다양한 양태에서 ASC는 CD138+ B 세포이다. 선택적으로, ASC는 이동성 형질모세포를 포함한다.
채혈할 수 있는 혈액 샘플의 부피는 비인간 동물에 따라 달라진다. 다양한 경우에, 비인간 동물로부터 얻은 혈액 샘플은 1 L, 500 mL 또는 100 mL 미만, 선택적으로 약 50 mL 미만, 약 25 mL 미만, 약 15 mL 또는 10 mL 미만, 약 5 mL 이하(예를 들어, 약 4 mL, 3 mL, 2 mL, 1 mL 이하)이다. 일부 경우에, 비인간 동물로부터 얻은 혈액 샘플은 약 1 L, 500 mL 또는 100 mL, 선택적으로 약 50 mL 미만, 약 25 mL 미만, 약 15 mL 또는 10 mL 미만, 약 5 mL 이하(예를 들어, 약 4 mL, 3 mL, 2 mL, 1 mL 이하)이다. 일부 경우에, 비인간 동물로부터 500 μL 이하의 혈액을 얻는다. 비인간 동물이 마우스인 구현예에서, 얻은 혈액 샘플은 200 μL, 190 μL, 180 μL, 170 μL, 160 μL, 150 μL, 140 μL, 130 μL, 120 μL, 110 μL, 100 μL, 90 μL, 80 μL, 70 μL, 60 μL, 50 μL, 40 μL, 30 μL, 20 μL, 10 μL, 5 μL, 4 μL, 3 μL, 2 μL 또는 1 μL 미만이다. 비인간 동물이 마우스인 다른 구현예에서, 얻은 혈액 샘플은 약 200 μL, 190 μL, 180 μL, 170 μL, 160 μL, 150 μL, 140 μL, 130 μL, 120 μL, 110 μL, 100 μL, 90 μL, 80 μL, 70 μL, 60 μL, 50 μL, 40 μL, 30 μL, 20 μL, 10 μL, 5 μL, 4 μL, 3 μL, 2 μL, 또는 1 μL이다. 예시적인 경우에, 비인간 동물로부터 얻은 혈액 샘플은 약 500 μL 이하이다. 선택적으로, 혈액 샘플의 부피는 약 100 μL 내지 약 250 μL이다. 다양한 경우에, 혈액 샘플의 부피는 동물에서 순환하는 총 혈액량의 10% 이하이다. 다양한 양태에서, 혈액 샘플의 부피는 동물에서 순환하는 혈액 부피의 10%를 초과하지 않는다. 예시적인 양태에서, 동물 혈액 총 부피의 약 10% 이하가 수집된다. 다양한 경우에, 혈액 샘플의 부피는 동물에서 순환하는 혈액 부피의 약 9% 이하, 약 8% 이하, 약 7% 이하, 약 6% 이하, 또는 약 5% 이하이다. 다양한 경우에, 혈액 샘플은 동물 체중의 10% 이하이다. 다양한 양태에서 혈액 샘플은 동물 체중의 9% 이하, 8% 이하 또는 7% 이하이다.
예시적인 양태에서, 비인간 동물로부터 혈액 샘플을 얻은 후, 혈액 샘플을 가공, 예를 들어 농축 또는 분획화한다. 다양한 경우에, 방법은 예를 들어 혈액 샘플로부터 적혈구, 혈장 및/또는 혈소판을 고갈시킴으로써 ASC에 대해 혈액 샘플을 농축하는 단계를 포함한다. 특정 양태에서, 방법은 세포 표면 IgM을 포함하는 B 세포를 제거하기 위해 항-IgM 항체를 사용하는 고갈 단계를 포함한다. 예시적인 경우에, 방법은 특정 관심 B 세포 집단을 확인하는 하나 이상의 세포 표면 마커를 발현하는 세포가 수행되는 선택 단계를 포함한다. 세포 표면 마커는 일부 양태에서 CD138, CD19, B220, IgG, TACI, SLAM7, BCMA, CD98, SCA-1, Ly6C1/2 등이다. PBMC 유래 B 세포가 요구되는 경우에, 방법은 CD138 양성 세포를 선택하는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 방법은 분석 전에 비인간 동물로부터 얻은 혈액 샘플의 하나 이상의 구성 성분을 제거하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 혈액 샘플로부터 적혈구, 혈장 및/또는 혈소판을 제거한다. 일부 양태에서, CD138+ 세포를 선택하여 혈액 샘플의 분획을 준비한다.
단일 세포 분석
현재 개시된 방법의 다양한 양태에서, 혈액 샘플 또는 이의 분획에 존재하는 ASC는 선택 항체의 생성에 대해 개별적으로 분석된다. 다양한 경우에, 분석하는 단계는 하나 이상의 개별 세포가 분석되는 단일 세포 분석을 포함한다. 다양한 경우에, 분석하는 단계는 하나 이상의 생세포가 분석되는 생세포 분석을 포함한다. 예시적인 양태에서, 면역화된 비인간 동물로부터 얻은 혈액 샘플에 존재하는 다수의 세포, 예를 들어 ASC가 동시에 분석된다. 예시적인 양태에서, 약 10개 초과, 약 100개 초과, 약 500개 초과, 약 1000개 초과, 약 2000개 초과, 약 3000개 초과, 약 4000개 초과, 약 5000개 초과, 약 6000개 초과, 약 7000개 초과, 약 8000개 초과, 약 9000개 초과 또는 약 10,000개 초과의 ASC가 단일 세포 생세포 분석을 통해 동시에 분석된다.
다양한 경우에, 방법은 혈액 샘플 또는 이의 분획을 매트릭스에 적용하고 매트릭스의 고유 주소를 각각의 ASC에 할당하는 단계를 포함한다. 매트릭스는 이차원일 수 있으며, 여기서 매트릭스의 각각의 고유 주소는 수평(X) 및 수직(Y) 축을 따른 위치 측면에서 정의되거나, 매트릭스는 예를 들어 다공성 발포체, 겔, 또는 중합체를 포함하는 3차원 매트릭스이고, 여기서 매트릭스의 각각의 고유 주소는 폭(X), 높이(Y) 및 깊이(Z) 축을 따른 위치 측면에서 정의된다. 다양한 양태에서, 분석하는 단계의 결과는 선택 항체를 생성하는 각 ASC의 확인이고, 특정 양태에서 결과는 선택 항체를 생성하는 각 ASC의 고유 주소의 확인이다.
예시적인 양태에서, 현재 개시된 방법의 분석하는 단계는 (a) 선택 항체에 결합하고 선택 항체에 결합 시 검출 가능한 신호, 예를 들어 형광 신호를 생성하는 시약과 매트릭스 내의 ASC를 조합하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 현재 개시된 방법의 분석하는 단계는 (a) 선택 항체의 Fc 도메인에 결합하는 적어도 하나의 시약 및 선택 항체가 결합하는 적어도 하나의 시약(예를 들어, 선택 항체의 항원 결합 도메인에 결합하는 시약)과 매트릭스 내의 ASC를 조합하는 단계를 포함하고, 여기서 이들 시약 중 적어도 하나는 검출 가능한 표지에 부착된다. 예시적인 경우에서, ASC는 선택 항체의 Fc 도메인에 결합하고 제1 검출 가능한 표지 및 선택 항체가 결합하는 표적을 포함하는 검출 시약(예를 들어, 선택 항체의 항원 결합 도메인에 결합하는 시약)과 조합된다. 다양한 경우에, 표적은 세포에 의해 발현되고 표적을 발현하는 세포는 ASC 및 검출 시약과 조합된다. 예시적인 양태에서, 방법은 (b) 제1 검출 가능한 표지를 분석하는 단계; 및 (c) 제1 검출 가능한 표지가 검출되는 매트릭스 내의 위치를 확인하는 단계, 여기서 각각의 확인된 위치는 선택 항체를 생성하는 개별 ASC의 위치를 표시하는 것인, 단계를 추가로 포함한다.
예시적인 경우에, 현재 개시된 방법의 분석하는 단계는 (a) 매트릭스 내의 ASC를 (i) 선택 항체에 결합하고 고체 지지체를 포함하는 포획 시약, (ii) 선택 항체에 결합하고 제1 검출 가능한 표지를 포함하는 검출 시약, 및 (iii) 선택 항체가 결합하는 표지된 표적과 조합하는 단계, 여기서 표지된 표적은 제1 검출 가능한 표지와 별개인 제2 검출 가능한 표지를 포함하는 것인, 단계; (b) 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지를 분석하는 단계; 및 (c) 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지가 검출되는 매트릭스 내의 위치를 확인하는 단계, 여기서 각각의 확인된 위치는 선택 항체를 생성하는 개별 ASC의 위치를 표시하는 것인, 단계를 포함한다. 선택적으로, 포획제는 고체 지지체에 부착된 항체 Fc 도메인에 결합하는 항체를 포함한다. 고체 지지체는 항-Fc 도메인 항체 및 항-Fc 도메인 항체가 결합하는 항체를 고정시키는, 중합체 비드, 필름, 슬라이드, 웰 바닥 등과 같은 임의의 고체 지지 물질일 수 있다. 예시적인 경우에, 검출제는 제1 검출 가능한 표지에 부착된 항체 Fc 도메인에 결합하는 항체를 포함한다. 다양한 양태에서, 포획 시약의 항체 Fc 도메인에 결합하는 항체는 검출제의 동일한 항체이긴 하나, 포획 시약의 항-Fc 항체는 검출 가능한 표지에 부착되지 않고 검출 시약의 항체는 고체 지지체에 부착되지 않는다.
예시적인 경우에, 조합하는 단계는 웰에서 일어나고 포획제는 웰에서 단일층을 형성한다. 다양한 양태에서, 방법은 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지가 검출되는 웰 내의 위치를 확인하는 단계를 포함하며, 각각의 확인된 위치는 선택 항체를 생성하는 개별 ASC의 위치를 표시한다.
예시적인 경우에, 조합하는 단계는 미세유체 또는 나노유체 챔버, 마이크로웰 또는 나노웰 장치, 미세모세관 또는 나노모세관, 또는 나노유체 칩의 나노펜에서 일어난다. 예시적인 경우에, 조합하는 단계는 나노유체 칩의 나노펜에서 일어난다. 예시적인 경우에, 방법은 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지가 검출되는 나노유체 칩 내의 각각의 펜의 위치를 확인하는 단계를 포함하며, 각각의 확인된 위치는 선택 항체를 생성하는 개별 ASC의 위치를 표시한다. 선택적으로, 혈액 샘플의 단일 ASC는 광전자 포지셔닝(optoelectro positioning, OEP)을 통해 나노유체 칩의 펜으로 이동된다. 이러한 기술은 문헌[Winters et al., MAbs 11(6): 1025-1035 (2016)]에 기재되어 있다.
이차 림프 기관(예: 비장 및 림프절)의 배 중심(GC)에서 최근에 항원을 접한 항원 특이적 B 세포는 분열하고 여러 경로로 분화하도록 자극을 받는다. 항원 유발 검사에 반응하여 항체를 혈청으로 분비하는 주요 B 세포 계통은 형질 세포이다. 형질 세포 분화는 이차 림프 기관에서 시작되며, 여기서 GC 내에서 세포-세포 상호작용이 항원에 특이적인 항체를 표면에 발현하는 B 세포를 강제하여 형질모세포로 알려진 미성숙 형질 세포로 분화하게 한다. 형질모세포는 높은 수준의 가용성 항체를 생성하고 분비하는 빠르게 분열하는 B 세포이다. GC에서 항원에 노출된 후, 형질모세포로의 분화 및 후속 증식, 이동성 형질모세포의 급증이 순환에서 검출될 수 있다. 마우스에서, 혈액 내 형질모세포는 항원 노출 후 3~7일 후에 발생하며, 이들이 적절한 틈새로 돌아가 수명이 긴 형질 세포로 분화하므로, 시간이 지남에 따라 감소한다. 최근에 자극된 항원 특이적 형질모세포의 혈액을 통한 이동은 다클론 혈청 역가에 의한 조사보다는 단일 세포 수준에서 동물 면역 반응 및 특성을 평가하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 구현예에서, 마우스로부터 비종말적 채혈을 수집하고, 혈장 및 가용성 항체를 제거하기 위해 세척하고, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 ASC에 대해 직접 분석한다. 작은 항체 포획 비드를 첨가하여 ASC로부터 분비된 항체를 포획하고 국소화하여 단일 세포 수준에서 특성화를 가능하게 한다. 적혈구(RBC) 오염 물질은 형광 플라크 형성을 방해하는데, 분석을 더 많은 부피로 희석하여 완화할 수 있다. 그러나 이는 더 큰 플레이팅 부피와 더 낮은 분석 처리량을 초래한다. 대안적으로, RBC를 직접 제거하거나 원하는 세포를 플레이팅 전에 혈액 샘플로부터 단리하여, 플레이팅 부피를 줄이고 분석 처리량을 증가시킬 수 있다. 적합한 방법에는 RBC 용해, 밀도 구배 원심분리(예: HetaSep, Ficoll®), 및 자동 세척 기기(예: Curiox Laminar Wash™)를 사용하거나 사용하지 않는, 음성 선택(예: 항-마우스 TER119 RBC 고갈) 또는 양성 선택(예: 마우스 CD138+ 단리) 세포 분리 키트의 사용이 포함되나, 이들로 제한되지 않는다. 관심 표적을 발현하는 세포도 비드 대신 사용할 수 있다. 이러한 기술은 마우스에서 종 반응성 항체를 생성하기 위한 전략을 조사하는 데 사용될 수 있다.
예시적인 구현예에서, 인간-시노 교차 반응성 항체는 인간 및 시노 버전의 항원의 교대 부스트로 동물을 면역화시킴으로써 생성될 수 있다. 각 항원에 대한 반응성은 면역화된 동물로부터의 다클론 혈청을 사용하는 간단한 결합 분석을 사용하여 쉽게 모니터링할 수 있다. 그러나 동물이 두 항원으로 면역화되었고 개별 항원에는 공통 및 고유 에피토프가 모두 있기 때문에, 다클론 혈청에는 두 유형의 에피토프 모두에 반응하는 항체가 포함될 것이다. 유감스럽게도, 이 분석만으로는 두 항원에 대한 관찰된 혈청 반응성이 진정한 교차 반응성 항체 때문인지 또는 항원 단독에 대한 특이성을 가진 다수의 항체로부터 유래되는지 확인할 수 없다. 그러나 PBMC 집단으로부터 유래된 ASC를 사용하여 B 세포 반응을 조사하면 해당 단일 세포로부터의 항체 특이성을 국소화하고 스크리닝하여 항체 발굴을 위한 추가 면역 레퍼토리 형성 또는 동물 선택을 유도할 수 있으므로 이 문제를 극복할 수 있다. 면역 레퍼토리 형성은 상이한 형태의 면역원, 보조제, 면역조절제, 항원 용량, 면역화 시기 및 투여 경로로 전환하는 것과 같은(그러나 이에 제한되지는 않음) 면역화 전략에 대한 수정을 포함할 수 있다.
따라서, 본 개시내용은 선택 항체를 생성하는 ASC를 확인하기 위한 단일 세포 분석을 추가로 제공한다. 본 개시내용은 선택 항체를 생성하는 ASC를 분석하는 방법을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 분석 또는 방법은 (a) 웰에서 (i) 면역원으로 면역화된 비인간 동물로부터 얻은 혈액 샘플, 또는 이의 분획(혈액 샘플은 ASC를 포함함), (ii) 선택 항체에 결합하고 제1 검출 가능한 표지를 포함하는 검출 시약, 및 (iii) 선택 항체가 결합하는 표적과 조합하는 단계, 여기서 (A) 표적은 제1 검출 가능한 표지와 별개인 제2 검출 가능한 표지를 포함하는 표지된 표적이고, 선택 항체에 결합하고 고체 지지체를 포함하는 포획 시약은 웰에서 추가로 조합되어 웰에서 단일층을 형성하거나 (B) 표적은 세포의 표면에서 발현되고 세포는 웰에서 조합되어 웰에서 단일층을 형성하는 것인, 단계; (b) 표적이 표지된 표적인 경우, 제1 검출 가능한 표지를 분석하고 선택적으로 제2 검출 가능한 표지를 분석하는 단계; 및 (c) 제1 검출 가능한 표지가 검출되거나 제1 및 제2 검출 가능한 표지가 검출되는 웰 내의 위치를 확인하는 단계, 여기서 각각의 확인된 위치는 선택 항체를 생성하는 개별 ASC의 위치를 표시하는 것인, 단계를 포함한다.
다양한 양태에서, 분석 또는 방법은 (a) 웰에서 (i) 면역원으로 면역화된 비인간 동물로부터 얻은 혈액 샘플, 또는 이의 분획, (ii) 고체 지지체에 부착된 항체의 Fc에 결합하는 항체를 포함하는 포획 항체, (iii) 제1 검출 가능한 표지에 부착된 항체의 Fc에 결합하는 항체를 포함하는 검출 시약, 및 (iv) 제1 검출 가능한 표지와 별개인 제2 검출 가능한 표지에 부착된, 면역원을 포함하는 표지된 표적, 또는 이의 일부를 조합하는 단계; (b) 제1 검출 가능한 표지를 분석하는 단계; (c) 제2 검출 가능한 표지를 분석하는 단계; 및 (d) 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지가 검출되는 웰 내의 위치를 확인하는 단계, 여기서 각각의 확인된 위치는 선택 항체를 생성하는 개별 ASC의 위치를 표시하는 것인, 단계를 포함한다.
다양한 양태에서, 분석법 또는 방법은 (a) 웰에서 (i) 면역원으로 면역화된 비인간 동물로부터 얻은 혈액 샘플, 또는 이의 분획, (ii) 선택 항체에 결합하고 제1 검출 가능한 표지를 포함하는 검출 시약, 및 (iii) 선택 항체가 결합하는 표적을 세포 표면에서 발현하는 세포, 여기서 세포는 웰에서 조합되어 웰에서 단일층을 형성하는 것인, 세포를 조합하는 단계; (b) 제1 검출 가능한 표지를 분석하는 단계; 및 (c) 제1 검출 가능한 표지가 검출되는 웰 내의 위치를 확인하는 단계, 여기서 각각의 확인된 위치는 선택 항체를 생성하는 개별 ASC의 위치를 표시하는 것인, 단계를 포함한다.
예시적인 양태에서, 제1 검출 가능한 표지, 제2 검출 가능한 표지 및/또는 표지된 표적은 발색단 또는 형광단을 포함한다. 선택적으로, 형광단은 잔텐 유도체(예: 플루오레세인, 로다민, 오레곤 그린, 에오신 및 텍사스 레드), 시아닌 유도체(예: 시아닌, 인도카르보시아닌, 옥사카르보시아닌, 티아카르보시아닌 및 메로시아닌), 스쿠아레인 유도체(예: 세타(Seta) 및 스퀘어(Square) 염료), 스쿠아레인 로탁산 유도체(예: 타우(Tau) 염료), 나프탈렌 유도체(예: 댄실 및 프로댄 유도체), 쿠마린 유도체, 옥사디아졸 유도체(예: 피리딜옥사졸, 니트로벤족사디아졸 및 벤족사디아졸), 안트라센 유도체(예: 안트라퀴논(DRAQ5, DRAQ7 및 CyTRAK 오렌지 포함), 피렌 유도체(예: 캐스케이드 블루), 옥사진 유도체(예: 나일 레드, 나일 블루, 크레실 바이올렛, 옥사진 170), 아크리딘 유도체(예: 프로플라빈, 아크리딘 오렌지, 아크리딘 옐로우), 아릴메틴 유도체(예: 아우라민, 크리스탈 바이올렛, 말라카이트 그린), 테트라피롤 유도체(예: 포르핀, 프탈로시아닌, 빌리루빈) 또는 디피로메텐 유도체(예: BODIPY, 아자-BODIPY)를 포함한다. 다양한 경우에, 제1 검출 가능한 표지, 제2 검출 가능한 표지 및/또는 표지된 표적은 CF 염료(Biotium), DRAQ 또는 CyTRAK 프로브(BioStatus), BODIPY(Invitrogen), EverFluor(Setareh Biotech), Alexa Fluor(Invitrogen), Bella Fluor(Setareh Biotech), CyLight Fluor(Thermo Scientific, Pierce), Atto 또는 Tracy(Sigma Aldrich), FluoProbe(Interchim), Abberior 염료(Abberior), DY 또는 MegaStokes 염료(Dyomics), Sulfo Cy 염료(Cyandye) ), HiLyte Fluor(AnaSpec), 세타, SeTau, 스퀘어 염료(SETA BioMedicals), Quasar 또는 Cal Fluor 염료(SETA BioMedicals), SureLight 염료(APC, RPEPerCP, Phycobiolisome(Columbia Biosciences), APC, APCXL, RPE, BPE( Phyco-Biotech, Greensea, Prozyme, Flogen) 또는 Vio 염료(Miltenyi Biotec)를 포함한다. 예시적인 양태에서, 형광단은 3-하이드록시이소니코틴알데히드, 알로피코시아닌(APC), 아미노쿠마린, APC-Cy7 접합체, BODIPY-FL, 캐스케이드 블루, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy3B, Cy5, Cy5.5, Cy7, 플루오레세인, FluorX, G-Dye100, G-Dye200, G-Dye300, G-Dye400, 하이드록시쿠마린, 리사민 로다민 B, 루시퍼 옐로우, 메톡시쿠마린, NBD, 퍼시픽 블루, 퍼시픽 오렌지, PE-Cy5 접합체, PE-Cy7 접합체, PerCP, R-피코에리트린(PE), 레드 613, 텍사스 레드, TRITC, TruRed 또는 X-로다민을 포함한다. 다양한 양태에서, 제1 검출 가능한 표지 및/또는 제2 검출 가능한 표지를 분석하는 단계는 제1 검출 가능한 표지 및/또는 제2 검출 가능한 표지로부터 신호를 검출하는 단계를 포함한다. 예시적인 경우에, 신호는 형광 신호이다. 예시적인 양태에서, 제1 검출 가능한 표지 및/또는 제2 검출 가능한 표지를 분석하는 단계는 제1 검출 가능한 표지 및/또는 제2 검출 가능한 표지로부터의 신호를 정량화하는 단계를 포함한다. 다양한 경우에, 방법은 제1 검출 가능한 표지 및/또는 제2 검출 가능한 표지로부터의 신호를 정량화하고 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지로부터의 신호를 비율로 표현함으로써 신호를 정규화하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 비율은 제2 검출 가능한 표지로부터의 신호의 RFU당 제1 검출 가능한 표지로부터의 신호의 상대 형광 단위(RFU), 또는 이의 역수이다.
예시적인 양태에서, ASC는 웰에서 또는 웰에 첨가되기 직전에 검출 시약 및/또는 표적에 먼저 노출된다. 다양한 양태에서, ASC는 적어도 30분, 적어도 60분, 적어도 90분 또는 적어도 120분 동안 검출 시약 및 표적과 함께 인큐베이션된다. 선택적으로, 선택 항체는 비인간 동물을 면역화시키는 데 사용되는 면역원과 동일하거나 유사한 표적에 결합한다. 예시적인 경우에, 검출 시약은 제1 검출 가능한 표지에 부착된 항체 Fc 도메인에 결합하는 항체를 포함한다. 선택적으로, 포획제의 항체 Fc 도메인에 결합하는 항체는 검출제의 동일한 항체이다. 다양한 양태에서, 혈액 샘플은 면역화 단계 후 약 3일 내지 약 7일 후에 비인간 동물로부터 얻는다. 다양한 경우에, 비인간 동물로부터 얻은 혈액 샘플은 약 500 μL 미만, 선택적으로 약 100 μL 내지 약 250 μL이다. ASC는 특정 양태에서 CD138+ B 세포이다. 선택적으로, ASC는 이동성 형질모세포를 포함한다. 예시적인 양태에서, 방법은 웰에서 조합하기 전에 비인간 동물로부터 얻은 혈액 샘플의 하나 이상의 구성 성분을 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 혈액 샘플로부터 적혈구, 혈장 및/또는 혈소판을 제거한다. 혈액 샘플의 분획은 다양한 양태에서 CD138+ 세포를 선택하여 준비한다. 다양한 경우에, 선택 항체는 하나 이상의 경쟁적 결합제의 존재 하에 표적에 결합한다. 선택적으로, 경쟁적 결합제는 분석하는 단계 동안 ASC, 검출 시약 및 표적을 발현하는 세포와 조합된다. 예시적인 양태에서, 선택 항체는 표적 친화도를 갖는 표적에 결합하며, 선택적으로, 표적에 대한 선택 항체의 KD는 약 10-11 M 내지 약 10-9 M이다. 선택적으로, 분석하는 단계는 제1 양의 표적을 발현하는 세포로의 제1 라운드 및 제2 양의 표적을 발현하는 세포로의 제2 라운드로 수행되고, 여기서 제1 양은 제2 양보다 더 크다. 일부 양태에서, 분석하는 단계는 제3 양의 표적을 발현하는 세포로의 제3 라운드에서 추가로 수행되고, 제3 양은 제2 양보다 적으며, 여기서 ASC가 각 라운드에서 표지된 표적에 결합할 경우, ASC는 선택 항체를 생성한다.
현재 개시된 방법의 분석하는 단계는 개별 ASC에 의한 선택 항체의 생성을 테스트한다. 용어 "선택 항체"는 설계 목표를 충족하고/하거나 표적 표현형을 나타내는 항체를 지칭한다. 다양한 경우에, 선택 항체는 비인간 동물을 면역화시키는 데 사용되는 면역원과 동일하거나 유사할 수 있는 표적에 결합한다. 표적은 본원에 나열된 임의의 면역원일 수 있다. 예시적인 경우에, 선택 항체는 표적 특이적 항체, 예를 들어 항원 특이적 항체이다. 다양한 경우에, 선택 항체는 적어도 약 10-9 M의 KD로 표시되는 표적(또는 항원)에 대한 결합 친화도를 나타낸다. 다양한 양태에서, 선택 항체는 피코몰 범위의 KD(예를 들어, 약 1 x 10-12 M 내지 9.9 x 10-12 M의 KD)를 나타낸다. 다양한 양태에서, 선택 항체는 하나 이상의 경쟁적 결합제의 존재 하에 표적에 결합한다. 다양한 경우에, 경쟁적 결합제는 인간 혈액, 예를 들어 인간 혈장 또는 혈청 내의 구성 성분이다. 이러한 경우에, 분석하는 단계 동안 경쟁적 결합제, 예를 들어 인간 혈청은 분석하는 단계 동안 ASC, 포획 시약, 검출 시약 및 표지된 표적과 조합된다. 예를 들어, 실시예 1 참조. 다양한 양태에서, 경쟁적 결합제는 인간 또는 비인간 동물체에서 표적에 결합하는 천연 리간드이고, 표적에 결합하는 선택 항체는 표적에 대한 천연 리간드의 결합을 방지하거나 억제한다. 예를 들어, 선택 항체는 항-PD-1 항체이고 경쟁적 결합제는 PD-L1 및/또는 PD-L2이다. 이러한 경우에, 분석하는 단계 동안 경쟁적 결합제, 예를 들어 PD-L1 및/또는 PD-L2는 분석하는 단계 동안 ASC, 포획 시약, 검출 시약 및 표지된 표적과 조합된다. 예를 들어, 실시예 7 참조.
개시된 방법의 스크리닝은 선택 항체를 생성하는 ASC의 후속 분자 구조를 위해 더 큰 웰(예를 들어, 4웰 플레이트 또는 OmniTrayTM)에서 완료될 수 있다. ELISpot 또는 FluoroSpot 분석과 달리, 개시된 방법은 자동화된 형광 단일 세포 선택 시스템(예: CellCelectorTM)을 사용하거나 당업계에 공지된 미세 조작으로 수정 가능한 균질한 생세포 분석이다. 융합된 단일층의 IgG 포획 비드는 ASC를 제자리에 고정하여 형광 플라크를 잘 정의하고 특정 항체를 생성하는 개별 ASC의 위치를 확인할 수 있도록 한다.
개시된 방법은 항체 발굴을 위해 선택 항체를 생성하는 동물의 선택 및 수확을 유도할 수 있다. 동물을 선택하기 위한 전통적인 접근법은 개별 항체의 품질보다는 전체 반응성과 분비된 모든 항체의 품질을 측정하는 다클론 혈청 역가의 조사에 의존한다. PBMC 집단으로부터 유래된 ASC를 사용하여 B 세포 반응을 조사하면 해석하기 어렵거나 다클론 혈청 역가에 숨겨져 있는 선택 항체를 생성하는 개별 ASC를 확인하여 이 문제를 극복할 수 있다. 종말적 조직 수확을 위한 예시적인 동물 선택 방법은 도 1d와 도 1e 및 실시예 12와 실시예 13에 기재되어 있다.
예시적인 양태에서, 선택 항체는 표적 친화도로 표적에 결합하며, 선택적으로, 표적에 대한 선택 항체의 KD는 10-11 M 내지 10-9 M 범위 내에 있다. 다양한 경우에, 표적에 대한 선택 항체의 KD는 피코몰 범위 또는 약 10-12 M 내에 있다. 다양한 경우에, 표적에 대한 선택 항체의 KD는 피코몰 미만의 범위, 예를 들어 <10-12 M이다. 다양한 양태에서, 분석하는 단계는 제1 라운드에서 ASC, 포획 시약 및 검출 시약과 함께 제2 검출 가능한 표지에 부착된 면역원 또는 이의 일부를 포함하는 제1 양의 표지된 표적 및 제2 라운드에서 ASC, 포획 시약 및 검출 시약과 조합된 제2 검출 가능한 표지에 부착된 면역원 또는 이의 일부를 포함하는 제2 양의 표지된 표적을 조합하는 단계를 포함하고, 여기서 제1 양은 제2 양보다 많다. 분석하는 단계는 일부 경우에 제3 양의 표지된 표적을 사용하는 제3 라운드를 포함할 수 있으며, 여기서 제3 양은 제2 양보다 적다. 각 라운드에 걸쳐 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지의 검출에 의해 확인되는 이러한 ASC는 표적에 대해 높은 친화도를 갖는 선택 항체를 생성하는 ASC일 수 있다. 예를 들어, 실시예 8 참조.
선택 항체는 표적 친화도로 표적에 결합한다. 다양한 양태에서, 분석하는 단계는 선택 항체의 Fc 도메인에 결합하고 제1 검출 가능한 표지 및 선택 항체가 제2 표지로서 결합하는 표적을 포함하는 검출 시약과 ASC를 조합하는 단계를 포함한다. 이어서 표적 제2 표지 RFU(상대 형광 단위)에 대한 IgG 분비 제1 표지 RFU의 비율을 결정함으로써 형광 신호 정량화 및 분비 정규화가 뒤따른다. 가장 작은 비율(IgG RFU/표적 RFU)로 확인된 ASC는 표적에 대해 높은 친화도를 갖는 선택 항체를 생성하는 ASC일 수 있다. ASC IgG 정규화된 RFU는 검증된 하이브리도마 또는 세포주에서 발현된 재조합 항체로부터의 알려진 표적 친화도의 ASC와 비교하여 대략적인 상대적 친화도 순위를 제공할 수 있다. 예를 들어, 실시예 11 참조.
다양한 양태에서, 선택 항체는 표적 및 이의 오르소로그 또는 파라로그에 결합하며, 선택적으로, 표적은 인간 단백질이고 오르소로그는 시노몰구스 원숭이 단백질이다. 다양한 경우에, 분석하는 단계 동안, 제2 표지된 표적은 ASC, 포획 시약, 검출 시약 및 표지된 표적과 조합되며, 여기서 제2 표지된 표적은 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지와 구별되는 제3 검출 가능한 표지에 부착된 오르소로그를 포함하고, 여기서 방법은 제3 검출 가능한 표지를 분석하고 제1 검출 가능한 표지, 제2 검출 가능한 표지 및 제3 검출 가능한 표지가 검출되는 위치(들)를 확인하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 각각의 확인된 위치는 선택 항체를 생성하는 개별 ASC의 위치를 표시한다.
다양한 경우에, 선택 항체는 표적에 결합하고 이의 오르소로그 또는 파라로그에는 결합하지 않는다. 선택적으로, 분석하는 단계 동안, 제2 표지된 표적은 ASC, 포획 시약, 검출 시약 및 표지된 표적과 조합되며, 여기서 제2 표지된 표적은 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지와 구별되는 제3 검출 가능한 표지에 부착된 오르소로그를 포함하고, 여기서 방법은 제3 검출 가능한 표지를 분석하고 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지만 검출되고 제3 검출 가능한 표지는 검출되지 않는 위치(들)를 확인하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 각각의 확인된 위치는 선택 항체를 생성하는 개별 ASC의 위치를 표시한다. 예를 들어, 실시예 6 참조.
다양한 양태에서, 선택 항체는 표적의 일부에 결합한다. 선택적으로, 분석하는 단계 동안, 제2 표지된 표적은 ASC, 포획 시약, 검출 시약 및 표지된 표적과 조합되며, 여기서 제2 표지된 표적은 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지와 구별되는 제3 검출 가능한 표지에 부착된 표적의 일부를 포함하고, 여기서 방법은 제3 검출 가능한 표지를 분석하고 제1 검출 가능한 표지, 제2 검출 가능한 표지 및 제3 검출 가능한 표지가 검출되는 위치(들)를 확인하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 각각의 확인된 위치는 선택 항체를 생성하는 개별 ASC의 위치를 표시한다. 다양한 경우에, 표적은 다수의 도메인을 포함하는 단백질이고 선택 항체는 표적의 단 하나의 도메인에만 결합한다. 다양한 양태에서, 분석하는 단계 동안, 표지된 표적은 제2 검출 가능한 표지에 부착된 표적의 세포외 도메인을 포함하고 제2 표지된 표적은 제3 검출 가능한 표지에 부착된 이 하나의 도메인을 포함한다. 예를 들어, 실시예 9 참조. 다양한 양태에서, 선택 항체는 표적의 이량체화 또는 다량체화 시 형성된 구조적 에피토프에 결합하고, 표적은 이량체화 도메인 또는 다량체화 도메인을 포함한다. 선택적으로, 분석하는 단계 동안, 표지된 표적은 제2 검출 가능한 표지에 부착된 면역원의 세포외 도메인을 포함하고, 여기서 제2 표지된 표적은 ASC, 포획 시약, 검출 시약 및 표지된 표적과 조합되고, 여기서 제2 표지된 표적은 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지와 구별되는 제3 검출 가능한 표지에 부착된 면역원의 이량체화 도메인 또는 다량체화 도메인을 포함하고, 여기서 방법은 제3 검출 가능한 표지를 분석하고 제1 검출 가능한 표지, 제2 검출 가능한 표지 및 제3 검출 가능한 표지가 검출되는 위치(들)를 확인하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 각각의 확인된 위치는 선택 항체를 생성하는 개별 ASC의 위치를 표시한다. 예를 들어, 실시예 10 참조.
반복 면역화에 의한 항체 생성 유도
다양한 양태에서, 방법은 비인간 동물을 반복적으로 면역화시키는 단계를 포함한다. 본원에 예시된 바와 같이, 다양한 양태에서, 방법은 비인간 동물을 1회 초과하여 면역화시키는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 방법은 초기 면역화 및 하나 이상의 후속 면역화를 수행하는 단계를 포함한다. 다양한 경우에, 각각의 후속 면역화는 비인간 동물로부터 혈액 샘플을 얻고 선택 항체를 생성하는 ASC를 분석한 후에 반복된다. 다양한 양태에서, 비인간 동물은 적어도 2회 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20회 이상 면역화된다. 다양한 양태에서, 방법은 초기 면역화 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회의 후속 면역화를 수행하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 선택 항체를 생성하는 ASC가 확인되거나 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 이상일 때까지 면역화를 반복한다. 다양한 경우에, 각각의 면역화는 이전 면역화 또는 초기 면역화와 비교하여 동일한 (A) 면역원, 보조제, 면역조절제 또는 이들의 조합, (B) 면역원, 보조제, 면역조절제 또는 이들의 조합의 양 또는 용량, (C) 투여 시기, (D) 면역원을 전달하는 투여 경로 또는 방법, (E) 비인간 동물 상의 투여 부위, 또는 (F) 이들의 조합으로 반복된다. 대안적으로, 각각의 면역화는 이전 면역화 또는 초기 면역화와 비교하여 상이한 (A) 면역원, 보조제, 면역조절제 또는 이들의 조합, (B) 면역원, 보조제, 면역조절제 또는 이들의 조합의 양 또는 용량, (C) 투여 시기, (D) 면역원을 전달하는 투여 경로 또는 방법, (E) 비인간 동물 상의 투여 부위, 또는 (F) 이들의 조합으로 반복된다. 예시적인 양태에서, 동물이 면역화될 때마다, 이전 면역화 또는 초기 면역화와 비교하여 상이한 (A) 면역원, 보조제, 면역조절제, 또는 이들의 조합, (B) 면역원, 보조제, 면역조절제, 또는 이들의 조합의 양 또는 용량, (C) 투여 시기, (D) 면역원을 전달하는 투여 경로 또는 방법, (E) 비인간 동물 상의 투여 부위, 또는 (F) 이들의 조합이 사용된다. 다양한 양태에서, 면역화 단계는 각각의 경우에 따라 변화하여 비인간 동물에서 이에 의해 유도된 면역 반응이 이전 면역화 단계에 의해 유발된 이전 면역 반응에 비해 변형된다. 임의의 특정 이론에 구애됨 없이, 동일한 동물에 대해 여러 가지 상이한 면역화 캠페인을 수행하면 면역 반응이 선택 항체를 생성하도록 유도한다.
예시적인 경우에, 선택 항체 생성을 위해 비인간 동물에서 항체 생성을 유도하는 방법은 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 미만인 경우 단계의 사이클을 수행하는 단계를 포함하며, 여기서 사이클은 (i) 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 미만인 경우 면역원으로 비인간 동물에 대한 후속 면역화를 수행하는 단계, (ii) 상기 비인간 동물로부터 ASC를 포함하는 혈액 샘플을 얻는 단계, 및 (iii) 선택 항체 생성을 위해 혈액 샘플 또는 이의 분획에 존재하는 ASC를 개별적으로 분석하는 단계를 포함한다.
예시적인 경우에, 방법은 다음의 사이클을 포함한다: (i) 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 미만인 경우 면역원으로 비인간 동물에 대한 후속 면역화를 수행하는 단계, (ii) 상기 비인간 동물로부터 ASC를 포함하는 혈액 샘플을 얻는 단계, (iii) 선택 항체 생성을 위해 혈액 샘플 또는 이의 분획에 존재하는 ASC를 개별적으로 분석하는 단계. 다양한 경우에, 사이클은 적어도 1, 2 또는 3회 이상 반복된다. 다양한 양태에서, (iii)에서 분석된 바와 같이, 선택 항체를 생성하는 ASC의 수가 임계값 이상일 때까지 사이클은 반복된다. 예시적인 양태에서, 반복된 사이클 후에, 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50%를 초과하는 면역화된 비인간 동물은 임계값 이상인 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율을 산출한다. 다양한 양태에서, 75% 초과 또는 85% 초과 또는 90% 초과의 면역화된 비인간 동물은 임계값 이상인 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율을 산출한다. 예시적인 양태에서, 후속 면역화의 면역원은 초기 면역화의 면역원과 상이하다. 예를 들어, 예시적인 양태에서, 각각의 후속 면역화는 (A) 상이한 면역원, 보조제 및/또는 면역조절제가 비인간 동물에게 투여된다는 점, (B) 상이한 용량의, 초기 면역화의 면역원이 비인간 동물에게 투여된다는 점, (C) 초기 면역화에 사용되는 면역원, 보조제 및/또는 면역조절제의 각 투여 사이의 시간이 상이하다는 점, 및/또는 (D) 면역원, 보조제 및/또는 면역조절제의 각 투여에 대한 투여 경로가 상이하다는 점에서 이전 면역화와 상이하다. 선택적으로, 비인간 동물이 면역될 때마다 상이한 면역원이 사용된다.
본원에서 논의된 바와 같이, 면역화 단계는 비인간 동물에 대한 면역원(선택적으로 보조제와 함께 제조됨)의 1회 이상의 투여를 포함한다. 본 발명의 방법은 상이한 면역화 조건을 갖는 다수의 면역화 단계를 포함할 수 있으며, 이는 면역화된 비인간 동물이 결국 원하는 표현형을 갖는 항체를 생성하도록 면역 반응을 조종하는 데 사용될 수 있다. 관심 표현형 또는 표현형의 조합에 따라, 면역 반응이 원하는 표현형을 갖는 항체를 생성하게 조종되도록 연속적인 면역화 단계 동안 면역화 조건이 변할 수 있다. 예시적인 구현예에서, 인간-시노 교차 반응성 항체를 생성하기 위해, 비인간 동물은 인간 및 시노 버전의 항원의 교대 부스트로 면역화될 수 있다. 예를 들어, 면역화는 다음의 총 4회의 주사를 포함할 수 있다: 제1 및 제3 주사는 재조합 인간 항원을 사용할 수 있고, 제2 및 제4 주사는 재조합 시노몰구스 항원을 사용할 수 있다. 예시적인 면역화는 본원의 실시예 4에 기재되어 있다. 실시예 5는 상이한 면역화가 사용되는 인간-시노 교차 반응성 항체의 추가 제조 방법을 설명한다. 예시적인 구현예에서, 다중-도메인 단백질의 도메인에 특이적인 항체를 생성하기 위해, 다음의 3가지 유형의 면역원 중 하나 이상으로 면역화가 일어날 수 있다: 다중 도메인 단백질의 전체 세포외 도메인, 도메인, 및/또는 전장 단백질. 예를 들어, 실시예 9 참조. 예시적인 구현예에서, 이량체 또는 다량체 단백질의 이량체화 또는 다량체화 시 형성되는 에피토프에 특이적인 항체를 생성하기 위해, 다음의 3가지 유형의 면역원 중 하나 이상으로 면역화가 일어날 수 있다: 이량체 또는 다량체 단백질의 전체 세포외 도메인, 다량체화 도메인 및/또는 전장 단백질. 예를 들어, 실시예 10 참조. 추가의 예시적인 면역화가 본원에 제공된다. 실시예 참조.
추가 단계
본원에 개시된 방법은 추가 단계를 포함할 수 있다. 예시적인 경우에, 방법은 혈액 샘플을 얻은 후 면역원에 대한 항체 반응을 분석하는 단계를 포함한다. 예시적인 경우에, 혈액 샘플을 얻은 후, 방법은 샘플의 항체 역가를 분석하는 단계를 포함한다. 예시적인 경우에, 방법은 혈액 샘플에 존재하는 항체의 항원 특이성을 분석하는 단계, 선택적으로, 면역원을 사용하는 결합 분석을 포함한다.
다양한 양태에서, 방법은 선택 항체를 생성하는 ASC를 단리하거나 선택 항체를 단리하는 단계를 포함한다. 다양한 경우에, 항체를 단리하는 단계는 선택 항체를 생성하는 단일 ASC를 단리함으로써 달성된다. 다양한 양태에서, ASC를 단리하는 것은 희석 단계, 선택적으로, 연속 희석 단계를 포함하며, 여기서 세포 농도가 감소하여 통계적으로 하나의 세포가 주어진 계산된 부피에 존재하고, 이 계산된 부피가 개별 용기 또는 다중 웰 플레이트의 웰에 놓인다. 다양한 양태에서, 혈액 샘플의 ASC를 단리하는 것은 단일 ASC를 웰 또는 기포로 미세유체적으로 이동시키는 것을 포함한다. 거기서, ASC는 선택 항체가 배양 배지로 분비되고/되거나 ASC가 세포 분열을 겪을 때까지 배양에서 유지된다. 선택적으로, 유지는 적어도 또는 약 3분 내지 약 30분, 6시간, 24시간 또는 그 이상 동안 일어난다. 다양한 양태에서 ASC의 단리는 미세유체, 자성, 모세관 작용, 중력, FACS 또는 광전자 포지셔닝(OEP)을 통해 일어난다.
다양한 양태에서, 본 개시내용의 방법은 표적 표현형을 갖는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 시퀀싱하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 시퀀싱은 RT-PCR을 통해 수행된다. 선택적으로, 방법은 표적 표현형을 갖는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산으로 세포를 형질감염시키는 단계; 형질감염된 세포를 배양하는 단계; 및 배양물로부터 항체를 수확하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 방법의 단계는 일련의 비인간 동물에 대해 수행되며, 방법은 일련의 각각의 비인간 동물에 대한 혈액 샘플의 B 세포 레퍼토리를 프로파일링하고 표적 B 세포 프로파일을 갖는 일련의 하위 집합을 선택하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 실시예 1에 기재되어 있다.
또한, 다양한 양태에서, 방법은 항체의 생성, 정제 및 제형화와 관련된 하나 이상의 상류 단계 또는 하류 단계를 포함한다. 선택적으로, 하류 단계는 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 이러한 하류 가공 단계 중 임의의 하나이다. 예시적인 구현예에서, 방법은 표적 표현형을 갖는 항체를 발현하는 숙주 세포를 생성하는 단계를 포함한다. 숙주 세포는 일부 양태에서 원핵생물 숙주 세포, 예를 들어 E. 콜라이 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)이거나, 숙주 세포는 일부 양태에서 진핵생물 숙주 세포, 예를 들어 효모 세포, 사상성 진균 세포, 원생동물 세포, 곤충 세포 또는 포유동물 세포(예를 들어, CHO 세포)이다. 이러한 숙주 세포는 당해 분야에 기재되어 있다. 예를 들어 문헌[Frenzel, et al., Front Immunol 4: 217 (2013)] 참조. 예를 들어, 방법은 일부 경우에 항체, 또는 이의 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 방법은 세포 배양물에서 세포를 유지하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 이러한 단계는 특정 온도, pH, 삼투질 농도, 용존 산소, 습도를 유지하거나 글루코스, 푸코스, 락테이트, 암모니아, 글루타민 및/또는 글루타메이트 중 하나 이상을 포함하는 배양 배지에서 유지하는 단계를 포함할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 선택 항체를 생성하는 ASC를 단리 및/또는 정제하거나 배양물로부터 선택 항체를 단리 및/또는 정제하는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 방법은 비제한적인 예로서 예를 들어 친화도 크로마토그래피(예를 들어, 단백질 A 친화도 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함하는 하나 이상의 크로마토그래피 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 방법은 재조합 글리코실화 단백질을 포함하는 용액으로부터 결정질 생물분자를 생성하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 방법은 다양한 양태에서, 일부 양태에서, 정제된 선택 항체를 포함하는 제약 조성물을 포함하는 조성물을 제조하기 위한 하나 이상의 단계를 포함한다.
예시적인 구현예에서, 방법은 (a) 표준 프로토콜을 사용하여 동물을 면역화시키는 단계 및 (b) 항원 특이적 항체 반응에 대해 혈청을 평가하는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 방법은 항원으로 부스트를 위해 면역 동물을 선택하고 (예를 들어, 부스트 후 약 4일 후) 이들 동물로부터 혈액을 채취하는 단계를 추가로 포함한다. 다양한 경우에, 방법은 동물로부터 수집된 혈액으로부터 적혈구, 혈장 및 혈소판을 제거하여 B 세포에 대해 혈액을 농축시키는 단계를 포함한다. 예시적인 경우에, 방법은 항체 분비 세포(ASC)를 확인하고 ASC를 단일 세포로서 단리하여 개별 ASC에 의해 생성된 항체의 설명 및/또는 특성화를 허용하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 단일 세포 단리 및 스크리닝은 당업계에 공지된 접근법, 예를 들어, NanOBLAST(예를 들어, 나노유체 Beacon 장치 상에서), 마이크로캡슐화를 사용하여 달성된다. 다양한 양태에서, 개별 ASC에 의해 생성되고 이로부터 분비되는 항체는 표적 표현형에 대해 평가된다. 선택적으로, 표적 표현형에 대한 평가는 다양한 상이한 스크리닝 전략을 사용하여 달성되고, 표적 표현형을 갖는 하나 이상의 항체 뿐만 아니라 항체를 생성하고 분비하는 ASC가 확인된다. 다양한 경우에, 방법은 예를 들어 단일 세포 RT-PCR에 의해 (표적 표현형을 나타내는 항체를 생성하고 분비하는) ASC로부터 항체 VH 및 VL 유전자를 단리하고, 재조합 생성을 위한 세포로 쌍을 이룬 VH 및 VL 유전자의 서열을 클로닝하는 단계를 추가로 포함한다.
스크리닝, 선택 및 프로파일링 방법
본 개시내용은 선택 항체를 생성하는 항체 분비 세포(ASC)에 대해 비인간 동물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 방법은 현재 개시된 모니터링 방법에 따라 비인간 동물에서 선택 항체의 생성을 모니터링하는 단계를 포함하며, 여기서 방법은 일련의 비인간 동물에서 수행되며, 각각의 일련의 비인간 동물에 대해 선택 항체를 생성하는 ASC의 수가 확인된다. 예시적인 구현예에서, 방법은 (a) 일련의 비인간 동물을 면역원으로 면역화시키는 단계; (b) 일련의 각 비인간 동물로부터 ASC를 포함하는 혈액 샘플을 얻는 단계; 및 (c) 선택 항체의 생성을 위해 혈액 샘플 또는 이의 분획에 존재하는 ASC를 개별적으로 분석하는 단계, 여기서 일련의 각 비인간 동물에 대해, 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 결정되는, 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 스크리닝 방법은 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 이상인 경우 희생 및/또는 조직 수확, 예를 들어 이차 림프 조직 수확을 위해 비인간 동물(들)을 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 본 개시내용은 후속 면역화를 위해 면역화된 비인간 동물을 선택하는 방법을 추가로 제공한다. 다양한 양태에서, 스크리닝 방법은 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 미만인 경우 후속 면역화를 위해 비인간 동물(들)을 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 따라서, 다양한 구현예에서, 스크리닝 방법은 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율에 기초하여 희생을 위한 동물 및 후속 면역화를 위한 동물을 확인한다. 예시적인 구현예에서, 방법은 현재 개시된 모니터링 방법에 따라 비인간 동물에서 선택 항체의 생성을 모니터링하는 단계(방법은 일련의 비인간 동물에서 수행되며, 일련의 각 비인간 동물에 대해 선택 항체를 생성하는 ASC의 수가 확인된다), 및 동물에 대한 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 미만인 경우 후속 면역화를 위해 동물을 선택하는 단계를 포함한다. 안락사 및 이차 림프구 수확을 위해 선택 항체를 생성하는 면역화된 비인간 동물을 선택하는 방법이 또한 본원에 추가로 제공된다. 예시적인 구현예에서, 방법은 현재 개시된 모니터링 방법에 따라 비인간 동물에서 선택 항체의 생성을 모니터링하는 단계(방법은 일련의 비인간 동물에서 수행되며, 일련의 각 비인간 동물에 대해 선택 항체를 생성하는 ASC의 수가 확인된다), 및 동물에 대한 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 이상인 경우 안락사 및 이차 림프구 수확을 위해 동물을 선택하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 비인간 동물의 B 세포 레퍼토리를 프로파일링하는 방법을 추가로 제공한다. 예시적인 구현예에서, 방법은 (a) 비인간 동물을 면역원으로 면역화시키는 단계; (b) 상기 비인간 동물로부터 항체 분비 세포(ASC)를 포함하는 혈액 샘플을 얻는 단계; 및 (c) 선택 항체 생성을 위해 혈액 샘플 또는 이의 분획에 존재하는 ASC를 개별적으로 분석하는 단계를 포함한다. 다양한 경우에, 방법은 일련의 비인간 동물에 대해 수행되며, 방법은 일련의 각각의 비인간 동물에 대한 혈액 샘플의 B 세포 레퍼토리를 프로파일링하고 표적 B 세포 프로파일을 갖는 일련의 하위 집합을 선택하는 단계를 포함한다. 예시적인 경우에, 하위 집합은 재면역화를 위해 선택된다. 대안적인 경우에, 하위 집합은 안락사 및 이차 림프 기관 수확을 위해 선택된다.
따라서, 본원에 기재된 스크리닝 및 선택 방법은 선택 항체를 생성하는 비인간 동물의 확인을 가능하게 한다. 이러한 방법의 예시적인 이점은 이러한 항체를 생성하는 비인간 동물이 희생 및 B 세포 수확 전에 확인될 수 있다는 것이다. 이는 선택 항체를 생성하는 비인간 동물, 그리고 이에 따라, B 세포 풀을 농축하여, 전통적인 하류 항체 발굴 방법의 일부 비효율성을 완화하는 데 도움이 된다.
항체 생성
본 개시내용은 비인간 동물에서 선택 항체를 생성하는 방법을 추가로 제공한다. 예시적인 구현예에서, 방법은 항체 생성을 유도하는 현재 개시된 방법에 따라 선택 항체의 생성을 위해 비인간 동물에서 항체 생성을 유도한 다음, 선택 항체 및/또는 선택 항체를 생성하는 ASC를 단리하는 단계를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 방법은 (a) 면역원으로 비인간 동물에 대한 초기 면역화 캠페인을 수행하는 단계; (b) 상기 비인간 동물로부터 항체 분비 세포(ASC)를 포함하는 혈액 샘플을 얻는 단계; (c) 선택 항체 생성을 위해 혈액 샘플 또는 이의 분획에 존재하는 ASC를 개별적으로 분석하는 단계; (d) 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 미만인 경우 면역원으로 비인간 동물에 대한 후속 면역화를 수행하는 단계; 및 (e) 선택 항체 및/또는 선택 항체를 생성하는 ASC를 단리하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 방법은 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 이상일 때까지 다음의 사이클을 반복하는 단계를 포함한다: (i) 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 미만인 경우 면역원으로 비인간 동물에 대한 후속 면역화를 수행하는 단계, (ii) 상기 비인간 동물로부터 ASC를 포함하는 혈액 샘플을 얻는 단계, (iii) 선택 항체 생성을 위해 혈액 샘플 또는 이의 분획에 존재하는 ASC를 개별적으로 분석하는 단계. 선택 항체를 생성하는 ASC를 단리하는 방법 또는 선택 항체를 단리하는 방법은 본원에 기재되어 있다. 예를 들어, 추가 단계 참조.
다양한 양태에서, 방법은 (f) ASC(예를 들어, 선택 항체를 생성하는 단리된 ASC)에 의해 생성된 선택 항체의 중쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 ASC에 의해 생성된 선택 항체의 경쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계, (g) 선택 항체의 중쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 벡터 및 선택 항체의 경쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계, 및 (h) 숙주 세포에 의해 생성된 항체를 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열을 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 단일 세포 PCR을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Tiller et al., J Immunol Methods 350: 189-193 (2009)] 및 상기 문헌[Winters et al., 2019] 참조. 뉴클레오티드 서열을 포함하는 생성 벡터는 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012] 참조. 다양한 양태에서, 선택 항체를 생성하는 방법은 중쇄 서열 및/또는 경쇄 서열을 조작하여 조작된 선택 항체를 달성하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 조작된 선택 항체는 비조작 선택 항체와 비교하여, 예를 들어 저장 또는 제조, 제형화, 충전, 수송 또는 투여 동안 또는 생체 내 조건 하에서, 더 높은 안정성을 나타낸다. 다양한 양태에서, 조작된 선택 항체는 비조작 선택 항체와 비교하여, 표적 또는 이의 오르소로그 또는 파라로그에 대해 더 높은 친화도를 나타낸다. 숙주 세포에 의해 생성된 항체를 단리하기 위한 적합한 기술은 본원에 기재되어 있고 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 본원의 추가 단계 및 문헌[Low et al., J Chromatog B 848(1): 48-63 (2007)]; Ngo 등, 미국 특허 제4,933,435호; 및 문헌[Ayyar et al., Methods 56(2): 116-129 (2012)] 참조.
선택 항체를 생성하는 현재 개시된 방법의 예시적인 구현예에서, 방법은 (a) 면역원으로 비인간 동물에 대한 초기 면역화를 수행하는 단계; (b) 상기 비인간 동물로부터 항체 분비 세포(ASC)를 포함하는 혈액 샘플을 얻는 단계; (c) 선택 항체 생성을 위해 혈액 샘플 또는 이의 분획에 존재하는 ASC를 개별적으로 분석하는 단계; 및 (d) 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 이상인 경우 비인간 동물로부터 하나 이상의 이차 림프 기관을 수확하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 수확된 이차 림프 기관(들)로부터의 면역 세포가 얻어지고, 이러한 면역 세포의 적어도 일부, 예를 들어 IgG 양성 기억 B 세포가 하이브리도마를 생성하는 데 사용된다. 하이브리도마를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있고 본원에 기재되어 있다. 예를 들어, 본원의 증진된 하이브리도마 생성 및 문헌[Zhang, Methods Mol Ciol 01: 117-135 (2012)]; 문헌[Tomita and Tsumoto, Immunotherapy 3(3): 371-380 (2011)]; 및 문헌[Hnasko and Stanker, Methods Mol Biol 1318: 15-28 (2015)] 및 문헌[Zaroff and Tan, Biotechniques 67(3): 90-92 (2019)] 참조. 특정 양태에서 현재 개시된 방법은 하이브리도마를 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
항체
항체 구조는 종 간에 다르지만, 본원에서 사용되는 용어 "항체"는, 전형적으로 중쇄와 경쇄를 포함하고 가변 영역과 불변 영역을 포함하는 통상적인 면역글로불린 형식을 갖는 단백질을 일반적으로 지칭한다. 본 방법에 의해 수득되거나 단리된 항체는 다양한 용도를 가질 수 있다. 예를 들어, 본 방법에 의해 수득된 항체는 치료제로 사용될 수 있다. 본 방법에 의해 수득된 항체는 또한 예를 들어 진단 분석, 예를 들어 진단 이미징 분석 및 기타 시험관 내 또는 생체 내 면역분석, 예를 들어 웨스턴 블롯, 방사면역분석, ELISA, EliSpot 분석 등에 사용되는 시약으로서 비치료적 항체로서 사용될 수 있다. 다양한 양태에서, 항체는 단일클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있다. 예시적인 경우에, 항체는 포유류 항체, 예를 들어, 마우스 항체, 랫트 항체, 토끼 항체, 염소 항체, 말 항체, 닭 항체, 햄스터 항체, 돼지 항체, 인간 항체, 알파카 항체, 낙타 항체, 라마 항체 등이다. 일부 양태에서, 항체는 형질전환 동물에 의해 임의로 생성되는 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있다. 이러한 구현예에서, 생성된 항체는 둘 이상의 종의 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 다양한 경우에, 항체는 2개의 동일한 폴리펩티드 사슬 쌍의 "Y형" 구조인 인간 IgG를 가지며, 각 쌍은 (일반적으로 약 25 kDa의 분자량을 갖는) 하나의 "경쇄" 및 (일반적으로 약 50~70 kDa의 분자량을 갖는) 하나의 "중쇄"를 갖는다. 인간 항체는 가변 영역 및 불변 영역을 갖는다. 인간 IgG 형식에서, 가변 영역은 일반적으로 약 100~110개 이상의 아미노산이며, 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하고, 항원 인식을 주로 담당하고, 상이한 항원에 결합하는 다른 항체들 사이에서 실질적으로 다르다. 예를 들어, 문헌[Janeway et al., “Structure of the Antibody Molecule and the Immunoglobulin Genes”, Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4th ed. Elsevier Science Ltd./Garland Publishing, (1999)] 참조. 간략하게, 인간 항체 스캐폴드에서, CDR은 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 프레임워크 내에 포함되어 항원 결합 및 인식을 주로 담당하는 영역을 구성한다. 인간 항체 가변 영역은 적어도 3개의 중쇄 또는 경쇄 CDR(문헌[Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, Md.]; 또한 문헌[Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917]; 문헌[Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883] 참고)을 프레임워크 영역(문헌[Kabat et al., 1991]에 의하면, 프레임워크 영역 1~4, FR1, FR2, FR3, 및 FR4로 표기됨; 또한 상기 문헌[Chothia and Lesk, 1987] 참고) 내에 포함한다. 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 인간 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로 분류되며, 항체의 이소형을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로 정의한다. IgG에는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함하는(이에 제한되지 않음) 여러 하위부류가 있다. IgM에는 IgM1 및 IgM2를 포함하는(이에 제한되지 않음) 하위부류가 있다. 본 개시내용의 구현예는 인간 항체의 모든 이러한 부류 또는 이소형을 포함한다. 인간 경쇄 불변 영역은 예를 들어 카파형 또는 람다형 경쇄 불변 영역일 수 있다. 중쇄 불변 영역은 예를 들어 알파형, 델타형, 엡실론형, 감마형 또는 뮤형 중쇄 불변 영역일 수 있다. 따라서, 예시적인 구현예에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 중 어느 하나를 포함하는 이소형 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM의 항체이다.
항원 결합 단백질은 인간 항체와 다른 구조를 가질 수 있다. 예시적인 경우에, 항원 결합 단백질은 오로지 중쇄 단편, 예를 들어 중쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역 CH2, 중쇄 불변 영역 CH3만을 포함한다. 다양한 경우에, 항원 결합 단백질은 단봉낙타, 라마 및 상어에 의해 생성된 것과 같은 나노바디의 구조를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Leslie, Science, “Mini-antibodies discovered in sharks and camels could lead to drugs for cancer and other diseases”, 2018, at https://www.sciencemag.org/news/2018/05/mini-antibodies-discovered-sharks-and-camels-could-lead-drugs-cancer-and-other-diseases] 참조.
하기 실시예는 단순히 본 발명을 예시하기 위해 제공되며 어떠한 방식으로든 그 범위를 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1
이 실시예는 마우스에서 선택 항체의 생성을 모니터링하는 예시적인 방법을 설명한다.
이 실시예에서 선택 항체는 PD-1에 특이적인 치료용 인간 IgG 항체(이하 "항체 1"이라고 함)의 이디오토프에 결합하는 항-이디오타입 항체(항-ID ab)였다. 이디오토프는 일반적으로 항원에 결합하는 데 관여하는 항체의 가변 영역(파라토프)에 의해 형성된 독특한 구조이다. 도 3은 항-ID 항체뿐만 아니라 항체 1의 이디오토프 및 파라토프를 예시한다.
면역화 프로토콜
가용성 형태의 항체 1을 보조제(완전 프로인트 보조제에 이어 시그마 보조제 시스템(Sigma Adjuvant System®)(SAS, 카탈로그 번호 S6322; Sigma-Aldrich, 미국 미주리 주 세인트루이스 소재)에 유화시켰다. 그런 다음, 항체-보조제 혼합물을 Balb/c, CD1 및 B6/129 마우스를 포함한 야생형 마우스의 여러 계통으로 전달하였다. 완전한 면역화 캠페인은 38일 동안 2주 간격으로 전달된 3회의 주사로 이루어졌다. 제1 면역화는 각 마우스 등쪽의 2개 지점에 피하 주사된, 100 μl의 완전 프로인트 보조제에 유화된 50 μg의 항체 1로 구성되었다. 14일 후, 25 μg의 항체 1을 200 μl의 시그마 보조제 시스템에 현탁하고, 혼합물 100 μl를 각 마우스의 등쪽 2개 지점에 피하 주사하고, 나머지 100 μl를 복강 내 주사하였다. 제3 면역화는 14일 후에 전달되었으며 항체 1의 총량이 15 μg으로 감소된 것을 제외하고는 경로 및 보조제가 제2 면역화와 동일했다.
항원 반응성을 확인하고 최종 부스트를 위한 동물 선택을 알리기 위해 문헌[Winters et al., mAbs 11(6): 1025-1035 (2019)]에 본질적으로 설명된 대로 각 마우스로부터의 혈청 역가의 가교 ELISA 분석을 수행하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, Balb/c 및 B6/129 마우스를 포함한 모든 면역화된 마우스가 대조군(혈청 없음)보다 높은 혈청 역가 수준을 나타내었지만, 혈청 역가 수준은 CD1 마우스 중에서 가장 높았다. 비종말적 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 수확 4일 전, 인산염 완충 식염수(PBS) 150 μl에 현탁된 항체 1 50 μg을 복강 내 경로를 통해 각 동물(N=12)에 주사하여 항원 특이적 항체 분비 세포(ASC)를 자극하였다.
혈액 수집 및 농축
각 동물로부터 혈액을 수집하고 단일 세포 단리 및 스크리닝을 위해 처리하였다. 표 1은 마우스 계통 및 각 마우스로부터 수확한 혈액 부피를 나열한다.
마우스 ID | 마우스 계통 | 수확한 혈액 부피*(μL) |
1 | CD1 | 180 |
2 | CD1 | 170 |
3 | CD1 | 200 |
4 | Balb/c | 120 |
5 | Balb/c | 170 |
6 | Balb/c | 160 |
7 | Balb/c | 140 |
8 | B6/129 | 180 |
9 | B6/129 | 100 |
10 | B6/129 | 150 |
11 | B6/129 | 150 |
12 | B6/129 | 210 |
*전체 혈액 부피의 최대 7%그런 다음 수집된 혈액을 처리하여 B 세포 풀을 농축하였다. 먼저, RedSift 세포 처리기(Aviva Systems Biology, Corp., 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)를 사용하여 수확한 혈액으로부터 적혈구(RBC), 혈소판 및 혈청 혈장을 제거하였다. 그런 다음, EasySep™ 마우스 B 세포 단리 키트(STEMCELL Technologies, Inc., 캐나다 브리티시 컬럼비아 주 밴쿠버 소재)를 제조업체의 절차에 따라 수행하여 B 세포를 추가로 농축하였다. 세포 표면 IgM을 발현하는 나이브 B 세포를 효과적으로 제거하기 위해 자체 유래 랫트 항-뮤린 IgM mAb(클론 8M3.1)를 사용하는 추가 단계를 수행하였다. 이 추가 단계를 통해 ASC 집단 내에서 항원 특이적, 부류 전환된 IgG 분비 세포를 추가로 농축할 수 있었다.
농축된 B 세포 풀을 형광 표지된 항-CD138 항체와 함께 인큐베이션하여 형질 B 세포 계통의 세포를 표시하였다. 높은 수준의 CD138 발현은 PBMC 유래 B 세포로부터의 IgG 분비의 가장 신뢰할 수 있는 지표인 것으로 입증되었지만, 다른 세포 표면 마커(예를 들어, B220, CD19, IgG. TACI, SLAM7, BCMA, CD98, SCA-1, Ly6C1/2 등) 또는 마커의 조합이 관심 특정 B 세포 집단을 확인하는 데 사용될 수 있음이 본원에서 고려된다. 문헌[Tellier et al., Eur J Immunol 47(8): 1276-1279 (2017)].
단일 세포 스크리닝 분석
그런 다음, 형광 표지된 세포를 광전자 포지셔닝(OEP)을 통해 OptoSelect™ 칩의 개별 펜으로 개별 B 세포를 조작하는 Beacon® Optofluidic Platform(Berkeley Lights, Inc., 미국 캘리포니아주 에머리빌 소재)을 사용하여 OptoSelect™ 칩(Berkeley Lights, Inc., 미국 캘리포니아주 에머리빌 소재)에 로딩하였다. 이 칩에는 3513개의 개별 펜이 있고, 각 펜은 약 740피코리터 용량을 가지며 고유한 펜 식별 번호가 있다. CD138 발현을 통해 Beacon® Optofluidic Platform의 온보드 광학을 사용하여 칩 로딩된 ASC를 확인하였다. 이 기술을 사용하여 개별 B 세포에 의해 분비된 항체가 단리되도록 개별 B 세포를 칩의 개별 펜으로 격리하였다. 하나의 B 세포에 의해 생성되고 분비되는 항체는 다른 B 세포에 의해 생성되고 분비되는 항체와 혼합되지 않았다. 이 "하나의 ASC 대 하나의 펜" 관계는 단일 B 세포에 의해 생성된 항체의 표현형 특성화를 가능하게 하였고, ASC가 특정 유전자형을 갖기 때문에 표현형 대 유전자형 연관성이 만들어질 수 있다. 펜의 부피가 매우 작고 형질모세포와 형질 세포의 빠른 분비 속도로 인해(Wener Faver, et al., Eur J Immunol 23(8): 2038-2040 (1993)), 각 펜 내 ASC 유래 항체 농도가 빠르게 증가하였다. 5~15분 이내에 선택 항체의 원하는 특성(예: 표현형)을 스크리닝하기에 충분한 수준의 항체가 달성되었다.
관련된 항원 특이적 항체(선택 항체)를 발현하는 ASC는 일련의 반복적인 균질한 스크린을 사용하여 확인할 수 있다. 선택 항체의 원하는 항체 특성에 따라, 이러한 스크린은 단순한 결합 분석(예: 항원 결합, 종 교차 반응성 등)일 수 있거나, 추가 설계 목표(예: 리간드 차단, 경쟁, 기능 등)를 충족하는 항체를 확인하도록 설계될 수 있다. 여기서, 항체 1에 대해 지시된 항-ID ab(선택 항체)를 분비하는 ASC를 확인하기 위해, 균질한 비드 기반 경쟁 분석을 수행하였다. 분석은 도 5의 A 내지 C에 예시되어 있다. 이 분석에서, 3.2 μm 폴리스티렌 비드(Spherotech Inc, 미국 일리노이 주 레이크 포레스트 소재)에 연결된 항-마우스 IgG 항체(항-mu IgG)를 포함하는 포획 시약을 Fluor A로 표지된 항-마우스 IgG를 포함하는 검출 시약, Fluor-B로 표지된 항체 1을 포함하는 표지된 표적 및 과량의 인간 혈청(10% 정상 인간 혈청)과 혼합하였다. 도 5의 A 참조. 경쟁적 결합 조건을 제공하기 위해 혈청을 포함시켰다. 특정 이론에 구애됨 없이, 이러한 경쟁적 결합 조건 하에서, 원하는 치료용 IgG 파라토프 외부의 에피토프에 특이적인 항체는 표지된 표적(Fluor-B 표지된 항체 1)에 결합하지 않는다.
그런 다음, 비드가 개별적으로 격리된 ASC를 포함하는 각 펜의 입구에 위치하도록 이 분석 혼합물을 칩 미세유체 채널로 유입시켰다(도 5의 B). 그런 다음, 항체를 분비하는 세포를 포함하는 펜을 Beacon® Optofluidic Platform(Berkeley Lights, Inc., 미국 캘리포니아주 에머리빌 소재)의 형광 이미징 능력과 Fluor-A의 검출을 허용하는 필터를 사용하여 검출하였다. ASC 유래 항체 수준이 증가함에 따라, 펜의 입구 밖으로 확산되어 포획 시약에 의해 포획(및 농축)되었다. 비드에 결합된 항체의 양이 증가하여 결국 Fluor-A에 접합된 항-마우스 IgG 항체가 농축되어, 관심 펜(IgG 항체를 분비하는 ASC를 포함하는 펜; 도 5의 C)의 입구에 집중되는 특징적인 형광 "블룸" 패턴이 생성되었다. IgG 항체를 분비하는 ASC를 보유하는 82개의 펜을 Fluor A 블룸에 의해 확인하고, 이들의 펜 식별 번호를 기록하였다. 항체 1에 특이적인 항체(선택 항체)를 분비하는 ASC를 확인하기 위해, 제2 형광 필터 큐브를 사용하여 Fluor-B 신호를 검출하였다. 인간 혈청의 존재 하에 표지된 표적에 결합하는 항체 1에 특이적인 선택 항체를 발현하는 23개의 ASC는 Fluor B 블룸으로 표시되었다(도 5의 C).
시퀀싱, 클로닝 및 재조합 발현
선택 항체를 검증하기 위해, 23개의 ASC를 OEP를 사용하여 OptoSelect™ 칩의 펜에서 개별적으로 이동시키고 Beacon® Optofluidic Platform의 통합 미세유체를 사용하여 세포 용해 완충액을 포함하는 표준 96웰 플레이트의 개별 웰로 내보냈다(도 6). 상기 문헌[Winters et al., 2019]에 본질적으로 기재된 프로토콜에 따라 단일 세포 RT-PCR을 통해 각 웰의 ASC에 의해 생성된 항체에 대한 상응하는 항체 중쇄(HC) 및 경쇄(LC) 가변 영역의 서열을 결정하였다. 이어서, 서열을 항체 불변 영역을 보유하는 포유동물 발현 벡터로 클로닝하였다. 하나의 벡터는 HC 가변 영역과 항체 불변 영역을 보유하였고 제2 벡터는 LC 가변 영역과 항체 불변 영역을 보유하였다. 이어서, 재조합 항체 HC/LC 쌍을 293T 세포에 형질감염시키고 가용성 항체로서 배양 상청액에 발현시켰다.
이어서, 배양 상청액 내의 항체는 상기 문헌[Winters et al., 2019]에 본질적으로 기재되고 도 7의 A에 예시된 바와 같이 인간 혈청의 존재 하에 샌드위치 ELISA에 의해 항체 1에 대한 결합을 테스트하였다. 이 방법을 사용하여 원하는 특성을 보유하고 항체 1에 대한 항 ID 항체 역할을 할 수 있는 9개의 항체를 확인하였다. 9개의 항-ID 후보 중 단일 항체(Ab287)는 임상 환자 샘플에서 0.5 ng/ml의 잠재적 정량 하한(LLOQ)을 나타내는 최선의 프로파일을 가졌다. 상이한 공급원으로부터의 혈청의 존재 하에 샌드위치 ELISA에서 Ab287의 성능이 도 7의 B에 도시되어 있다. 항체 1의 파라토프에 결합하는 항-ID에 대해 예상한 바와 같이, 항-ID 항체인 Ab287은 233.9 nM의 EC50으로 항체 1이 표적(PD-1)에 결합하는 것을 차단하였다(도 7의 C). Ab287은 임상 샘플에서 유리 및 생체 활성 항체 1을 측정할 것으로 예상되었으므로 추가 개발을 위해 선택되었다.
실시예 2
이 실시예는 마우스에서 선택 항체의 생성을 모니터링하는 또 다른 예시적인 방법을 설명한다.
면역화 프로토콜
이 실시예에서, 선택 항체는 항-인간 EGFR 항체였다. CD1 마우스를 인간 EGFR(huEGFR)의 가용성 세포외 도메인으로 2주 간격으로 총 4회 면역화시켰다. 제1 면역화는 각 마우스 등쪽의 2개 지점에 피하 주사된, 100 μl의 완전 프로인트 보조제에 유화된 50 μg의 인간 huEGFR로 구성되었다. 14일 후, 25 μg의 huEGFR을 200 μl의 시그마 보조제 시스템에 현탁하고, 혼합물 100 μl를 각 마우스의 등쪽 2개 지점에 피하 주사하고, 나머지 100 μl를 복강 내 주사하였다. 제3 면역화는 14일 후에 전달되었으며 huEGFR의 총량이 15 μg으로 감소된 것을 제외하고는 경로 및 보조제가 제2 면역화와 동일했다. 제4 부스트는 보조제의 부재 하에 50 μg의 huEGFR을 함유하고 피하 및 복강 내 경로 둘 다에 의해 전달되었다.
혈액 수집 및 농축
최종 부스트 후 1 내지 8일에 혈액을 수집하였다. 제조업체의 절차에 따라 자성 CD138 양성 선택 키트(StemCell Technologies, 캐나다 밴쿠버 소재)를 사용하여 ASC를 농축하였다.
단일 세포 스크리닝 분석
농축된 B 세포를 비드에 연결된 염소 항-인간 Fc를 포함하는 포획 시약, 녹색 형광 신호를 생성하는 Alexa 488로 표지된 염소 항-인간 Fc 항체를 포함하는 검출 시약, 및 적색 형광 신호를 생성하는 Alexa 594로 표지된 EGFR을 포함하는 표지된 표적과 혼합하였다. 이어서, 혼합물을 384웰 플레이트의 단일 웰로 옮기고 혼합물의 구성 성분을 약 10분 동안 웰에 침전시켰다.
Incucyte 생세포 분석 시스템을 사용하여 특정 ASC를 확인하기 위해 세포 이미징을 수행하였다. 도 8의 A는 항체 분비를 나타내는 녹색 형광 신호의 예시적인 이미지를 제공하고, 도 8의 B는 항체의 항원 특이성을 나타내는 적색 형광 신호의 예시적인 이미지를 제공한다. 도 8의 C는 도 8의 A 내지 B에 묘사된 동일한 웰의 예시적인 분석된 복합 이미지를 제공하며, 여기서 항체 분비를 나타내는 녹색 형광 신호는 마젠타색으로 표시되고, 적색 형광 신호는 시안색으로 표시되며, 녹색 및 적색 신호의 중첩은 로얄 블루색으로 표시되어 있다. 이 이미징 분석에서, 10개의 세포가 항체 분비를 나타내는 것으로 밝혀진 반면, 단 1개의 세포만이 항원(EGFR) 특이적인 항체를 분비하는 것으로 입증되었다.
실시예 3
이 실시예는 선택 ASC를 확인하기 위한 대안적인 단일 세포 이미징 분석을 설명하며, 여기서 표적은 천연 형태의 세포에 의해 발현된다.
항-CB-1 항체 생성을 위해 마우스를 CB-1로 면역화시켰다. 면역화된 마우스로부터 혈액 샘플을 수집한 다음, 본질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 B 세포를 분비하는 IgG에 대해 농축하였다. 293펙틴을 사용하여 전장 CB1을 암호화하는 벡터로 형질감염된 293 T 세포를 배양 배지로 세척한 다음 40 μm 스트레이너에 통과시켰다. 다음으로, 농축된 B 세포, CB-1 발현 293T 세포 및 Alexa 488로 표지된 염소 항-인간 Fc 항체의 혼합물을 웰에 첨가하고, 단일층으로 침전시켰다. 형질감염된 세포의 표면에서 형광 신호를 검출하기 위해 Incucyte 이미징 시스템을 사용하여 특정 ASC를 확인하였다. 도 8의 D는 293T 세포에 의해 발현된 항원이 B 세포에 의해 생성된 항체에 결합되고 Alexa 488로 표지된 염소 항-인간 Fc 항체로 표지된 다중 형광 반점으로 표지된 형질감염된 세포의 예시적인 이미지를 제공한다. 이러한 결과는 농축된 B 세포 풀이 CB-1에 특이적인 항체를 분비하는 세포를 함유하고 있음을 입증하였다.
실시예 4
이 실시예는 선택 항체의 생성을 위해 비인간 동물에서 항체 생성을 유도하는 예시적인 방법을 설명한다. 이 실시예에서, 선택 항체는 TNF-알파에 특이적인 인간-시노 교차 반응성 IgG 항체이다.
인간-시노 교차 반응성 항체를 생성하기 위해, 동물은 인간 및 시노 버전의 항원의 교대 부스트로 면역화된다. 이 면역화 접근법은 인간 항원과 시노 항원 간에 공유되는 에피토프가 각 부스트 동안 면역계에 일관되게 제시되어 교차 반응성 항체를 암호화하는 관련 B 세포의 지속적인 자극을 허용한다는 가정에 의존한다. 각 항원에 대한 반응성은 간단한 결합 분석과 면역화된 동물로부터의 다클론 혈청을 사용하여 쉽게 모니터링할 수 있다. 그러나 동물은 두 항원 모두로 면역화되었고 개별 항원이 공통 및 고유 에피토프를 모두 가지고 있기 때문에, 다클론 혈청은 인간 항원 반응성 항체, 시노 항원 반응성 항체 및/또는 인간 및 시노 항원 반응성 항체를 포함할 것이다. 다클론 혈청 분석은 교차 반응성 항체가 존재한다는 결정을 허용하지 않는다. PBMC 집단으로부터 유래한 단리된 단일 ASC의 조사는 이 문제를 극복한다. 단일 세포 분석은 진정한 교차 반응성 항체를 분비하는 ASC를 스크리닝한다.
면역화 프로토콜
완전한 면역화 캠페인은 50일 동안 2주 간격으로 전달된 3회의 주사로 이루어진다. 제1 및 제3 주사의 경우, 완전 프로인트 보조제에 이어 시그마 보조제 시스템(Sigma Adjuvant System®)(카탈로그 번호 S6322; Sigma-Aldrich, 미국 미주리 주 세인트루이스 소재)로 유화된 재조합 인간 TNF-알파(카탈로그 번호 300-01A; PeproTech®; 미국 뉴저지 주 로키힐 소재)가 사용된다. 제2 및 제4 주사의 경우, 완전 프로인트 보조제에 이어 시그마 보조제 시스템(Sigma Adjuvant System®)(카탈로그 번호 S6322; Sigma-Aldrich, 미국 미주리 주 세인트루이스 소재)로 유화된 재조합 시노몰구스 원숭이 TNF-알파(카탈로그 번호 RP1021Y-005, Kingfisher Biotech, Inc., 미국 미네소타 주 세인트폴 소재)가 사용된다. 제1 주사의 경우, 약 50 μg의 인간 TNF를 보조제에 현탁하고 각 마우스의 등쪽 2개 지점에 걸쳐 피하 주사한다. 14일 후, 보조제에 현탁된 시노몰구스 원숭이 TNF 50 μg을 사용하여 제2 주사를 각 마우스의 등쪽 2개 지점에 걸쳐 피하 주사하였다. 이차 주사 14일 후, 인간 TNF 25 μg을 포함하는 제3 주사를 200 μl의 시그마 보조제 시스템에 현탁하고, 혼합물 100 μl를 각 마우스의 등쪽 2개 지점에 피하 주사하고, 나머지 100 μl를 복강 내 주사하였다. 14일 후, 시노 TNF 25 μg을 포함하는 제4 주사를 200 μl의 시그마 보조제 시스템에 현탁하고, 혼합물 100 μl를 각 마우스의 등쪽 2개 지점에 피하 주사하고, 나머지 100 μl를 복강 내 주사하였다. 항원 반응성을 확인하고 비종말적 항체 발굴을 위한 동물 선택을 알리기 위해 각 마우스로부터의 혈청 역가에 대한 가교 ELISA 분석을 수행한다. 비종말적 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 수확 4일 전, 150 μl의 PBS에 현탁된 25 μg의 인간 TNF 및 25 μg의 시노 TNF를 포함하는 용액을 각 동물(N=12)에게 복강 내 경로를 통해 주사하여 항원 특이적 항체 분비 세포(ASC)를 자극한다.
혈액 수집 및 농축 및 단일 세포 스크리닝 분석
실시예 1에 본질적으로 기재된 바와 같이 각각의 마우스로부터 혈액을 수집하고 B 세포에 대해 농축한다. 표지된 세포를 Beacon® Optofluidic Platform을 사용하여 OptoSelect™ 칩(Berkeley Lights, Inc., 미국 캘리포니아 주 에머리빌 소재)에 로딩하고, 개별 B 세포를 칩의 개별 펜으로 격리하여 개별 B 세포에 의해 분비된 항체가 단리되게 한다.
선택 항체(인간 TNF 및 시노 TNF에 반응성인 항-TNF 항체)를 분비하는 ASC를 확인하기 위해, 실시예 1에 기재된 균질한, 비드 기반의 경쟁 분석을 수행한다. 여기서, 항-마우스 IgG에 연결된 비드를 포함하는 포획 시약을 Fluor-A 표지된 항-마우스 IgG를 포함하는 검출 시약, Fluor-B로 표지된 인간 TNF를 포함하는 표지된 표적, 및 과량의 인간 혈청과 혼합한다. 그런 다음, 비드가 개별적으로 격리된 ASC를 포함하는 각 펜의 입구에 위치하도록 이 분석 혼합물을 칩 미세유체 채널로 유입시킨다. Fluor-A 블룸은 IgG 항체를 분비하는 ASC를 보유하는 펜을 표시하는 반면, Fluor B 블룸은 인간 TNF에 결합하는 항체를 분비하는 ASC를 보유하는 펜을 표시한다. 각 블룸 유형별로 표시된 펜의 펜 ID 번호를 확인하고 기록한다.
비드 기반 분석의 제2 부분에서, Fluor-C로 표지된 시노 TNF를 포함하는 검출 시약을 첨가한다. Fluor-C 블룸은 시노 TNF에 결합하는 항체를 분비하는 ASC를 보유하는 펜을 표시한다. Fluor C 블룸으로 표시된 펜의 펜 ID 번호를 기록한다.
3가지 블룸(Fluor A 블룸, Fluor B 블룸 및 Fluor C 블룸) 모두에 대해 양성으로 기록된 펜이 선택 항체를 분비하는 후보 ASC로 선택된다. 후보 ASC를 OEP를 사용하여 OptoSelect™ 칩의 펜에서 개별적으로 이동시키고 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 Beacon® Optofluidic Platform의 통합 미세유체를 사용하여 세포 용해 완충액을 포함하는 표준 96웰 플레이트의 개별 웰로 내보낸다. 각 후보 ASC에 의해 생성된 항체에 대한 HC 및 LC 가변 영역을 단일 세포 RT-PCR을 통해 결정한다. 서열을 벡터로 클로닝한 다음, 벡터로 293T 세포를 형질감염시킨다. 배양 상청액의 항체를 수집한 다음, 기능 분석에서 인간 및 시노 TNF에 대한 교차 반응성을 테스트한다.
어떤 펜도 세 가지 블룸 모두에 대해 양성이 아닌 경우, Fluor A 블룸 및 Fluor B 블룸에 대해 이중 양성인 펜을 확인한다. 대안적으로, Fluor A 블룸 및 Fluor C 블룸에 대해 이중 양성인 펜을 확인한다. 이중 양성 펜의 ASC를 포함하는 혈액의 마우스를 제2 면역화 캠페인을 위해 선택한다. Fluor A 및 Fluor B 이중 양성 ASC가 얻어진 마우스의 경우, 제2 면역화 캠페인은 (전술한) 제1 캠페인과 동일한 면역화 캠페인을 포함하지만, 제1 및 제3 주사는 1/2 양의 인간 TNF로 수행된다.
Fluor A 및 Fluor C 이중 양성 ASC가 얻어진 마우스의 경우, 제2 면역화 캠페인은 (전술한) 제1 캠페인과 동일한 면역화 캠페인을 포함하지만, 제2 및 제4 주사는 1/2 양의 시노 TNF로 수행된다.
(혈액 수집에서 비드 기반 분석까지) 면역화 이후의 모든 단계는 이 실시예에 기재된 대로 이후에 수행된다. 3가지 블룸(Fluor A 블룸, Fluor B 블룸 및 Fluor C 블룸) 모두에 대해 양성으로 기록된 펜이 표적 표현형을 가진 항체를 분비하는 후보 ASC로 선택된다. 가변 영역을 시퀀싱하고, 벡터로 클로닝하고, 재조합 항체 생성을 위해 세포를 벡터로 형질감염시키고, 재조합 생성된 항체를 표적 표현형에 대해 테스트한다.
삼중 양성 펜이 여전히 확인되지 않는 경우, 제3 면역화 캠페인을 설계하고, 제2 면역화 캠페인을 받는 동일한 마우스에서 수행한다. 제3 면역화 캠페인에서, Fluor A/Fluor B 이중 양성인 마우스의 경우, 제2 및 제4 주사를 증가된 양의 시노 TNF로 수행하고, 제1 및 제3 주사를 1/2 또는 1/4 양의 인간 TNF로 수행하고, Fluor A/Fluor C 이중 양성인 마우스의 경우, 제1 및 제3 주사를 증가된 양의 인간 TNF로 수행하고, 제2 및 제4 주사를 1/2 또는 1/4 양의 시노 TNF로 수행한다. 제3 캠페인 이후, (혈액 수집에서 비드 기반 분석까지) 면역화 이후의 모든 단계는 이 실시예에 기재된 대로 이후에 수행된다. 3가지 블룸(Fluor A 블룸, Fluor B 블룸 및 Fluor C 블룸) 모두에 대해 양성으로 기록된 펜이 표적 표현형을 가진 항체를 분비하는 후보 ASC로 선택된다. 삼중 양성 펜이 제3 캠페인 후에도 여전히 확인되지 않는 경우, 제4 면역화 캠페인을 설계하고 수행한다. 표적 표현형을 갖는 항체가 확인될 때까지 과정을 반복한다.
이 방법은 유리하게도 레퍼토리 조종을 가능하게 하는 종적 생전 B 세포 프로파일링의 능력을 제공한다. 면역 동물의 발달 중인 B 세포 반응을 실시간으로 모니터링하고, 이 정보를 사용하여 면역화 전략을 반복적으로 수정한다. 이 접근법은 비종말적이기 때문에, 면역계의 힘을 활용하여 동물을 희생시키지 않고 원하는 결과를 향해 B 세포 반응을 계속 진화시킬 수 있다. 면역화 전략에 대한 수정은 상이한 형태의 면역원, 보조제, 면역조절제, 항원 용량, 면역화 시기 및 투여 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이 시나리오에서, 인간 항원을 사용한 초기 면역화 시도는 PBMC의 비종말적 ASC 스크리닝에 의해 결정된 바와 같이 시노 항원에 대해 교차 반응하는 항체를 생성하는 B 세포를 유도하는 데 실패하였다. 이 접근 방식은 레퍼토리 품질 정보를 제공하므로 면역화 전략을 수정하는 데 사용할 수 있다. 이 실시예에서, 면역원이 인간 항원에서 시노 오르소로그로 전환될 수 있었고, 면역화 캠페인은 교차 반응 항체를 발현하는 B 세포가 확인될 때까지 계속되었다. 원하는 B 세포 레퍼토리를 유도한 동물은 본원에 기재된 대로 전통적인 전략 또는 비종말적 ASC 방법을 사용하여 항체 생성에 사용될 수 있다.
실시예 5
이 실시예는 선택 항체의 생성을 위해 비인간 동물에서 항체 생성을 유도하는 또 다른 예시적인 방법을 설명한다. 이 실시예에서, 선택 항체는 항원 X에 특이적인 인간-시노 교차 반응성 IgG 항체이다.
이 실시예는 항원 X의 인간 및 시노몰구스(시노) 오르소로그 둘 다에 대해 교차 반응하는 항체의 확인을 설명한다. 오르소로그는 낮은 서열 상동성을 가지므로 교차 반응성 항체의 생성은 드물다. 단 하나의 항원으로 면역화하면 일부 교차 반응성 항체가 생성될 수 있지만, 표준 혈청 역가의 검출 수준보다 낮다. 대안적으로, 인간 및 시노 항원 둘 다와의 공동 면역화는 인간 또는 시노 오르소로그에 우세하게 결합하는 항체를 생성하지만, 교차 반응하는 항체는 거의 없다. 표준 혈청 역가는 인간 또는 시노 항원에 독립적으로 결합하는 항체를 생성한 마우스와 교차 반응성 항체를 생성한 마우스를 구분하지 않는다. 따라서, 반응 마우스에서 진정한 교차 반응성 항체를 확인하기 위해서는 단일 세포 스크리닝이 필요하다. 이는 효율적인 회수를 위해 관심 B 세포의 선택적 증폭과 결합된다.
마우스를 2주 간격으로 총 4회 주사를 위해 인간 버전의 항원 X로 면역화시킨다. 제1 부스트를 위해, 인간 항원 X 50 μg을 프로인트 완전 보조제 100 μl에 유화시키고 혼합물을 피하 투여한다. 14일 후, 25 μg의 인간 항원 X를 200 μl의 시그마 보조제 시스템에 현탁하고, 100 μl를 피하 주사하고 100 μl를 복강 내 주사한다. 제3 주사의 경우, 인간 항원 X 15 μg을 시그마 보조제 시스템에 유화시키고, 제2 부스트에 대해 기재된 바와 같이, 피하 및 복강 내 주사한다. 인간 항원 X의 50 μg의 최종 부스트를 보조제 부재 하에 복강 내 주사한다.
최종 부스트 후 4일 후 설치류 체중의 10%에 해당하는 최종 부피에 대해 혈액을 수집한다. CD138+ B 세포를 자기적으로 단리하고 비드에 연결된 항-인간 IgG 항체를 포함하는 포획 시약, Alexa488 표지된 항-인간 IgG 항체를 포함하는 검출 시약, 차등적으로 표지된 형광 인간 항원 X 및 시노 항원 X의 혼합물에 첨가한다. 혼합물을 미세적정 플레이트에 단일층으로 플레이팅한 다음, 인큐베이션하여 항체 및 항원 포획을 허용한다. 항원 특이적 교차 반응성 ASC는 실시예 2에 본질적으로 기재된 바와 같이 세포 이미징을 사용하여 이중 염색 형광 플라크로 확인된다.
이어서, 교차 반응성 항체를 분비하는 B 세포를 생성한 동물을 추가 4주 동안 주 1회 시그마 보조제 시스템과 조합한 시노 및 인간 항원의 교대 용량으로 면역화시킨다. 마지막 부스트 후 3일 후에 혈액을 수집하고, 인간 및 시노 항원에 대한 스크리닝을 위해 B 세포를 단리한다.
교차 반응성 항체의 수가 증가한 것으로 확인된 동물을 조직 수확 및 항체 생성을 위해 안락사시킨다. 단일 반응성에 비해 교차 반응성 항체의 비율이 낮은 동물은 추가 3주 동안 대체 용량의, 항원 X의 인간 및 시노 오르소로그로 면역화한 후, 교차 반응성 항체에 대한 단일 세포 스크리닝을 수행한다. 선택 항체(인간-시노 교차 반응성 항체)를 생성하는 ASC의 임계값(%)이 충족될 때까지 이 과정을 계속한다.
설명한 접근법은 단백질의 다수의 오르소로그 또는 파라로그에 대한 교차 반응성을 필요로 하는 임의의 항체 발굴 캠페인에 적용될 수 있다. 상이한 종에 교차 반응하는 항체를 생성할 필요성은 종종 효능 및 안전성 연구에 필요하다. 단일 B 세포 스크리닝은 일반적인 예로 랫트, 토끼, 기니아 피그, 개, 고양이 또는 돼지에 대한 교차 반응성이 필요한 프로그램에 적용될 수 있다.
실시예 6
이 실시예는 선택 항체의 생성을 위해 비인간 동물에서 항체 생성을 유도하는 방법을 설명한다. 이 실시예에서, 선택 항체는 단백질의 유일한 파라로그인 항원 X에 결합하지만, 밀접하게 관련된 패밀리 구성원인 항원 Y에는 결합하지 않는 항체이다.
항원 X와 항원 Y 사이의 유사성으로 인해, 항원 X로 면역화된 동물은 두 단백질 모두에 대해 다클론성 혈청 교차 반응성을 나타낸다. 따라서, 관심 패밀리 구성원에 대해 편향된 항체 반응을 생성할 가능성이 있는 마우스를 확인하려면 직접적인 단일 세포 스크리닝이 필요하다. 선택된 동물은 항원 X에만 반응하는 항체를 생성하는 B 세포의 생성을 최대화하는 방향으로 면역 반응을 조종하기 위해 대안적인 면역화 프로토콜을 사용하여 추가로 면역화된다.
설치류를 4주 동안 주 2회 항원 X로 피하 면역화시킨다. 프라이밍 면역원 복합체는 프로인트 완전 보조제와 조합한 10 μg의 항원을 함유하는 반면, 부스팅 복합체는 시그마 보조제 시스템과 조합한 5 μg의 항원을 함유한다. 마지막 부스트 후 4일 후, 혈액을 수집하고, CD138+ B 세포를 혈청으로부터 분리한다.
세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 단일 세포 분석을 통해 분석하고, 세포를 Fluor A-태그된 항원 X를 사용하여 항원 X에 대한 결합에 대해 스크리닝하고/하거나, Fluor B-표지된 항원 Y를 사용하여 항원 Y에 대한 결합에 대해 스크리닝한다. Fluor A 블룸은 항원 X에 특이적인 항체를 분비하는 ASC를 함유하는 펜을 표시하고, Fluor B 블룸은 항원 Y에 결합하는 항체를 분비하는 ASC를 함유하는 펜을 표시한다. Fluor A 블룸에만 양성인(Fluor B 블룸에 대해서는 양성이 아닌) 펜은 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 OEP를 통해 펜에서 단일 세포 PCR용 웰로 내보내진다. ASC에 의해 생성된 항체는 항원 X에 대한 결합 및 항원 Y에 대한 결합 없음에 대해 분석될 것이다.
펜이 Fluor A 블룸에 대해 단일 양성이 아닌 경우, 항원 X의 보존된 도메인이 생물정보학적으로 확인된다. 추가 3회의 부스트를 위해, 시그마 보조제 시스템과 조합하여 주 1회 보존된 항원 X 도메인으로 동물을 피하 면역화시킨다. 설치류를 마지막 부스트 후 3일 후에 출혈시키고, 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 B 세포를 농축한다. 세포를 단일 세포 수준에서 스크리닝하여 항원 X에만 결합하고 항원 Y에는 결합하지 않는 항체를 분비하는 B 세포를 확인한다. 단일 세포 분석에서, Fluor C로 표지된 보존된 항원 X 도메인을 표지된 표적으로 사용한다. Fluor C 블룸은 선택 항체(항원 Y와 교차 반응하지 않는 항원 X에 특이적인 항체)를 분비하는 ASC를 포함하는 펜을 표시한다.
선택 항체를 발현하는 B 세포 수가 개선된 설치류를 조직 수확을 위해 안락사시킨다. 개선된 수를 나타내지 않는 마우스를 3차로 면역화시킨다.
실시예 7
이 실시예는 선택 항체의 생성을 위해 비인간 동물에서 항체 생성을 유도하는 방법을 설명한다. 이 실시예에서, 선택 항체는 인간 PD-1에 대한 결합에 대해 천연 인간 PD-L1 및 천연 인간 PD-L2를 능가하는 항체이다.
설치류를 실시예 6에 기재된 바와 같이 PD-1 항원의 용량을 감소시키면서 주 2회 면역화시킨다.
개별 B 세포를 하나의 세포 대 하나의 펜 비율을 달성하기 위해 칩의 펜으로 옮긴다. 비드 기반 분석을 항-마우스 IgG에 연결된 비드를 포함하는 포획 시약, Fluor A-표지된 항-마우스 IgG 항체를 포함하는 검출 시약, Fluor-B로 표지된 인간 PD-1을 포함하는 표지된 표적, 및 과량의 인간 혈청을 사용하여 수행한다. 그런 다음, 비드가 개별적으로 격리된 ASC를 포함하는 각 펜의 입구에 위치하도록 이 분석 혼합물을 칩 미세유체 채널로 유입시킨다. Fluor-A 블룸은 IgG 항체를 분비하는 ASC를 보유하는 펜을 표시하고, Fluor B 블룸은 PD-1에 결합하는 항체를 분비하는 ASC를 보유하는 펜을 표시한다. Fluor A 블룸, Fluor B 블룸, 또는 이중 양성 Fluor A 및 Fluor B 블룸으로 표시된 펜의 펜 ID 번호를 기록한다.
비드 기반 분석을 2차로 수행하며, 이번에만 증가하는 양의 PD-L1을 분석에 추가한다. Fluor A/Fluor B 이중 블룸은 PD-1 특이적 항체를 생성하는 ASC를 포함하는 펜을 확인할 수 있게 하며, PD-L1의 존재 하에 유지된 신호 강도는 재조합으로 생성된 항체가 PD-1에 대한 결합에 대해 PD-L1을 능가함을 나타낸다. PD-L1의 존재 하에 유지된 신호 강도에서 이중 블룸을 나타내는 펜의 펜 번호를 기록한다.
비드 기반 분석을 3차로 수행하며, 이번에만 증가하는 양의 PD-L2를 분석에 추가한다. Fluor A/Fluor B 이중 블룸은 PD-1 특이적 항체를 생성하는 ASC를 포함하는 펜을 확인할 수 있게 하며, PD-L2의 존재 하에 유지된 신호 강도는 재조합으로 생성된 항체가 PD-1에 대한 결합에 대해 PD-L2를 능가함을 나타낸다. PD-L2의 존재 하에 유지된 신호 강도에서 이중 블룸을 나타내는 펜의 펜 번호를 기록한다. 바람직하게는, PD-1에 대한 결합에 대해 PD-L1 및 PD-L2 모두를 능가할 수 있는 PD-1특이적 항체를 생성하는 ASC를 함유하는 것으로 확인된 펜이 있다.
Fluor A 및 Fluor B 블룸에 대해 이중 양성인 펜을 기록하고, 이러한 펜으로부터의 항체의 HC 및 LC의 가변 영역을 시퀀싱한다. 서열을 벡터로 클로닝하고 재조합 항체 생성을 위해 벡터로 293T 세포를 형질감염시킨다. 항체를 293T 세포 배양물의 상층액으로부터 수집한 다음, PD-L1의 양을 증가시키면서 재조합 PD-1에 대한 결합에 대해 테스트한다. 여기서, PD-1은 주어진 파장에서 신호를 방출하는 형광단으로 표지되며, 재조합적으로 생성된 항체는 면역침전 분석에서와 같이 비드에 결합된다. 표지된 PD-1을 비드에 결합된 항체와 혼합한다. 비특이적 결합을 위해 비드를 세척한다. 주어진 파장에서 신호의 검출 시, 표지된 PD-1 및 재조합적으로 생성된 항체를 포함하는 면역 복합체를 검출한다. 그런 다음, 이 절차를 PD-L1 및/또는 PD-L2의 양을 증가시키면서 수행한다. PD-L1 및/또는 PD-L2의 존재 하에 유지된 신호 강도는 재조합적으로 생성된 항체가 PD-1에 대한 결합에 대해 PD-L1 및 PD-L2를 능가한다는 것을 나타낸다.
PD1에 결합하지만 PD-L1 또는 PD-L2와 완전히 경쟁하지 않는 B 세포를 생성하는 동물을 3회의 추가 부스트를 위해 시그마 보조제 시스템과 조합하여 PD1 2.5 μg으로 면역화시킨다. 마지막 부스트 후 3일 후에 마우스를 출혈시키고, 단리된 B 세포를 전술한 바와 같이 스크리닝한다.
실시예 8
이 실시예는 선택 항체의 생성을 위해 비인간 동물에서 항체 생성을 유도하는 방법을 설명한다. 이 실시예에서, 선택 항체는 항원 X에 대해 특정 결합 친화도를 갖는 항체이다.
이 실험의 목표는 피코몰 미만의 친화도로 항원 X에 결합하는 항체를 확인하는 것이다. 친화도는 항체의 클론 공급원에서만 측정할 수 있으므로, 혈청을 사용하여 고친화도 항체를 생성한 마우스를 확인할 수 없다. 전통적으로, 마우스는 하이브리도마 융합 및 특성화를 위한 B 세포를 얻기 위해 안락사되며, 임의의 추가 면역 조종을 배제한다. 실시간, 비종말적 B 세포 샘플링 및 조사를 적응 면역화 전략과 결합하면 경쟁적인 생체 내 환경을 활용하여 고친화도 B 세포 클론의 진화를 강제하고 유도하므로 고친화도 항체를 생성하는 전통적인 방법에 비해 상당한 이점을 제공한다.
설치류를 총 4회의 부스트를 위해 2주마다 감소하는 용량의 항원 X로 피하 면역화시킨다. 프라이밍 면역원은 프로인트 완전 보조제와 조합한 항원 X 40 μg을 함유한다. 후속 3회 부스트는 시그마 보조제 시스템과 조합하여 Antigen X 20 μg, 10 μg 또는 5 μg의 항원 X를 함유한다. 최종 부스트 후 4일 후, 설치류로부터 혈액을 수확하고 수집된 혈액 샘플을 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 B 세포에 대해 농축한다. 미세유체 장치를 사용하여 세포를 펜닝하고 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 형광 표지된 항원 X에 대한 결합을 스크리닝한다. 항-항원 X 항체를 생성하는 ASC를 확인하고, 이어서 분자 회수를 위해 펜에서 웰로 내보내고, 재조합 클론의 친화도를 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 결정한다.
친화도는 KinExA(Sapidyne) 또는 Carterra 고처리량 스크리닝 장치(Carterra)에 의해 결정한다.
고친화도 항체를 발현하는 B 세포를 생성한 동물을 3회의 추가 부스트를 위해 시그마 보조제 시스템과 조합하여 2.5 μg의 항원으로 주 1회 부스팅한다. 마지막 부스트 후 3일 후에 마우스를 출혈시키고, 단리된 B 세포를 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 항원 X에 대한 결합에 대해 스크리닝한다.
그런 다음, B 세포를 또 다른 라운드의 시퀀싱, 클로닝, 발현 및 친화도 특성화를 위해 내보낸다. 친화도 막대를 충족하는 B 세포가 있는 설치류는 조직 수확을 위해 안락사될 것이다. 친화도 요건에 미치지 못하는 B 세포를 생성한 설치류는 3회의 추가 부스트를 위해 주 1회 시그마 보조제 시스템과 조합하여 항원 2.5 μg으로 부스팅할 것이다. 설계 목표가 달성될 때까지 동물을 스크리닝하고 부스팅한다. 한 라운드의 스크리닝에서, 표지된 표적이 EGFR 대신 Alexa 594로 표지된 항원 X를 포함하는 것을 제외하고는, 농축된 B 세포를 실시예 2에 기재된 단일 세포 분석에 적용한다. 중첩 신호를 나타내는 반점은 항원 X에 특이적인 항체를 분비하는 ASC를 확인시켜 준다. Alexa 594로 표지된 항원 X의 양보다 약 10배 적은 Alexa 488로 표지된 항원 X의 양으로 단일 세포 이미징 분석을 반복한다. (Alexa594 및 Alexa 488로부터) 중첩 신호를 보유하는 반점은 항원 X에 대해 더 높은 친화도를 나타내므로, 표적에 대해 원하는 높은 친화도를 나타낸다.
실시예 9
이 실시예는 선택 항체의 생성을 위해 비인간 동물에서 항체 생성을 유도하는 방법을 설명한다. 이 실시예에서, 선택 항체는 도메인 특이적 항체이다.
이 실시예는 다중 도메인 인간 단백질인 단백질 Z의 도메인 1에 대한 항체의 확인을 설명한다. 단백질 Z의 전체 세포외 도메인으로 면역화하면 일부 도메인이 과도하게 제시되고 도메인 1 항체가 다클론 혈청 역가 수준에서 검출되지 않는 불균형한 면역 반응이 생성된다. 도메인 1 단독으로의 면역화는 천연 세포외 도메인을 인식할 수 있는 항체를 생성하지 않는다. 단일 세포 스크리닝은 단백질의 천연 세포외 도메인으로의 면역화 후 희귀 도메인 1 항체를 생성한 마우스를 확인하는 데 필요하다. 이러한 B 세포는 도메인 1 반응성 B 세포를 확장하기 위해 도메인 1 펩티드 및 전장 단백질의 후속 부스팅으로 증폭되지만, 펩티드 단독에 대한 드노보(de novo) 반응을 생성하지 않는다.
마우스를 2주 간격으로 총 4회 부스트를 위해 단백질 Z로 면역화시킨다. 프라이밍 부스트는 완전 프로인트 보조제(CFA)에 유화된 항원 50 μg을 함유하고, 피하 투여된다. 후속 부스트는 SAS에서 유화되고 각각 25 및 15 μg의 항원으로 절반은 복강 내로, 절반 은 피하로 투여된다. 그런 다음, 마우스를 PBS 중 50 μg의 항원으로 부스팅하고, 4일 후에 혈액을 수집한다. CD138+ B 세포를 단리하고 IgG 포획 비드와 차등적으로 표지된 형광 도메인 1 펩티드 및 전체 세포외 도메인의 혼합물에 첨가한다. 혼합물을 미세적정 플레이트에 단일층으로 플레이팅한 다음, 본질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 인큐베이션하여 항체 및 항원 포획을 허용한다. 도메인 1 특이적 항체를 생성하는 ASC는 세포 이미징을 사용하여 이중 염색 형광 플라크로 확인된다(실시예 2).
도메인 1 특이적 B 세포를 생성한 마우스를 2주 동안 주 2회 도메인 1 펩티드 5 μg으로 부스팅한다. 그런 다음, 마우스를 PBS에서 50 μg의 전체 가용성 세포외 도메인으로 부스팅하고, 4일 후에 혈액을 수집한다. 마우스를 전장 단백질뿐만 아니라 도메인 1에 대한 결합에 대해서도 스크리닝한다. 관심 동물을 조직 처리 및 스크리닝을 위해 안락사시킨다. 설계 목표가 충족될 때까지 다른 마우스에 대해 과정을 반복한다.
설명한 접근법은 면역 반응이 관심이 낮은 단백질 영역에 대해 주로 유도되는 임의의 항체 발굴 캠페인에 적용될 수 있다. 일반적인 예는 항체 레퍼토리에서 과도하게 제시되는 면역우성 영역을 가진 단백질이다. 면역 반응은 해당 도메인에서 벗어나 관심 영역으로 조종되어야 할 것이다.
실시예 10
이 실시예는 선택 항체의 생성을 위해 비인간 동물에서 항체 생성을 유도하는 방법을 설명한다. 이 실시예에서, 선택 항체는 다량체 항원의 다량체화 도메인에 결합하는 항체이다.
이 실험은 헤테로삼량체 막관통 단백질에 결합하는 항체의 확인을 설명한다. 천연 단백질로의 면역화는 면역 반응을 이끌어내지 못한다. 가용성 도메인만으로 면역화된 마우스는 면역 반응을 일으키지만, 항체는 단백질의 천연 형태를 인식하지 못한다. 이 마우스를 점점 더 천연 유사 구조로 만들어진 일련의 면역원으로 면역화한다: 면역원 1은 항원 X의 세포외 도메인으로 구성된 단백질을 함유한다; 면역원 2는 다량체화 도메인에 연결된 단백질을 함유하여 헤테로삼량체 복합체를 형성하고, 면역원 3은 전체 복합체를 암호화하는 DNA를 함유한다.
설치류를 시그마 보조제 시스템과 조합하여 5 μg의 면역원 1로 피하 면역화시킨다. 동물을 총 6회 부스트를 위해 주 2회 부스팅한다. 마지막 부스트 후 4일 후에 마우스로부터 혈액을 수집하고, CD138+ B 세포를 자기적으로 단리한다. 세포를 IgG 포획 비드와 차등적으로 표지된 형광성 면역원 1 및 면역원 2의 혼합물에 첨가한다. 혼합물을 미세적정 플레이트에 단일층으로 플레이팅한 다음 본질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 인큐베이션하여 항체 및 항원 포획을 허용한다. 항원 특이적 ASC는 세포 이미징을 사용하여 이중 염색 형광 플라크로 확인된다(실시예 2). 면역원 2에 자연적으로 교차 반응하는 희귀 항체를 생성하는 마우스는 추가 조종을 위해 확인된다. 이들 마우스는 총 6회의 부스트를 위해 시그마 보조제 시스템과 조합하여 5 μg의 면역원 2로 주 2회 추가 부스트를 받아 반응을 증폭시킨다. 설치류를 마지막 부스트 후 4일 후에 출혈시키고, 면역원 2 및 면역원 3에 대한 단일 세포 스크리닝을 위해 B 세포를 단리한다. 면역원 3을 인식하는 항체를 암호화하는 B 세포를 보유하는 동물을 전체 복합체를 암호화하는 플라스미드로 유전적으로 면역화시킨다. 이들 설치류를 총 6회의 부스트를 위해 유전자 총 총알로 주 2회 부스팅한다. 단일 세포 스크리닝을 위해 마우스로부터 혈액을 수집하고 관심 마우스를 안락사시키고 조직을 수확한다. 설계 목표가 충족될 때까지 더 약한 반응을 생성하는 마우스를 부스팅하고 스크리닝한다.
실시예 11
이 실시예는 ASC에 의해 분비된 항체의 친화도에 의해 ASC의 순위를 매기기 위한 단일 세포 분석의 예시적인 적용을 설명한다.
EGFR 특이적 항체를 생성하는 하이브리도마 클론을 단리하고 각 클론에 대한 EGFR 결합 특성을 Octet® 바이오층 간섭계 플랫폼(Satorius)에서 결정하였다. EGFR 결합 친화도(KD 4.7 x 10-10 내지 1.1 x 10-8) 범위의 항체를 생성하는 5개의 하이브리도마 클론을 단일 세포 분석에서의 평가를 위해 선택하였다. 선택된 하이브리도마 클론과 각각에 의해 생성된 항체의 결합 특성은 표 2에 나열되어 있다.
하이브리도마 명칭 | KD (M) | kon(1/ms) | K해리(1/s) |
7.35.4 | 4.7 x 10-10 | 3.9 x 105 | 1.8 x 10-4 |
12B4.1 | 2.4 x 10-9 | 7.5 x 105 | 1.8 x 10-3 |
1C2.1 | 9.5 x 10-9 | 5.3 x 105 | 5.0 x 10-3 |
7C11.1 | 1.1 x 10-8 | 5.3 x 105 | 5.7 x 10-3 |
2G8.1 | 2.3 x 10-8 | 7.5 x 105 | 1.8 x 10-2 |
실시예 2에 기재된 바와 같이 표 2의 하이브리도마 클론으로 단일 세포 스크리닝 분석을 수행하였다. 간략하게, 하이브리도마 12B4.1의 클론을 비드에 연결된 염소 항-인간 Fc를 포함하는 포획 시약, 녹색 형광 신호를 생성하는 Alexa 488로 표지된 염소 항-인간 Fc 항체를 포함하는 검출 시약, 및 적색 형광 신호를 생성하는 Alexa 594로 표지된 EGFR을 포함하는 표지된 표적과 혼합하였다. 이어서, 포획 시약, 검출 시약, 표지된 표적 및 12B4.1 클론을 포함하는 혼합물을 384웰 플레이트의 단일 웰로 옮겼다. 이들 단계는 플레이트의 각 웰이 단일 하이브리도마의 클론을 포함하는 혼합물을 함유하도록(예를 들어, 하이브리도마 1C2.1 클론용 1개의 웰, 하이브리도마 7C11.1 클론용 1개의 웰, 하이브리도마 2G8.1 클론용 1개의 웰, 하이브리도마 12B4.1 클론용 1개의 웰 및 하이브리도마 7.35.4 클론용 1개의 웰) 표 2의 각각의 하이브리도마 클론의 클론으로 수행되었다. 혼합물의 구성 성분이 웰에 침전된 후 Incucyte 생세포 분석 시스템을 사용하여 세포 이미징을 수행하고, 녹색 형광 및 적색 형광에 대한 상대 형광 단위(RFU) 값을 각 웰의 6개의 개별 세포(ASC)에 대해 결정하였다. 실시예 이미지는 도 9에 도시되어 있다. RFU 값을 기록하고 데이터의 정규화를 위해 녹색 RFU(IgG 분비를 나타냄) 대 적색 RFU(EGFR 결합을 나타냄)의 비율을 결정하였다(표 3). IgG 분비 수준이 세포 건강, 세포 주기 및 ASC의 기타 특성에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에 RFU 정규화는 중요하다. 단일 하이브리도마의 6개 클론에 대한 RFU 비율의 평균을 구하고, Ratio Avg로 기록하였다(표 3).
하이브리도마 명칭 | ASC # | 평균 IgG RFU(녹색 채널) | 평균 EGFR RFU(적색 채널) | 녹색/적색 RFU | CV(%) | Ratio Avg |
7.35.4 | 1 | 15.8 | 3.5 | 4.5 | 0.3 | 4.0 |
2 | 28.7 | 6.4 | 4.5 | |||
3 | 29.0 | 8.0 | 3.6 | |||
4 | 12.2 | 3.2 | 3.8 | |||
5 | 43.7 | 11.5 | 3.8 | |||
6 | 30.7 | 7.8 | 3.9 | |||
12B4.1 | 1 | 16.8 | 2.7 | 6.3 | 0.6 | 6.0 |
2 | 14.4 | 2.6 | 5.6 | |||
3 | 28.2 | 4.0 | 7.0 | |||
4 | 11.9 | 2.3 | 5.3 | |||
5 | 15.5 | 2.5 | 6.3 | |||
6 | 11.6 | 2.1 | 5.5 | |||
1C2.1 | 1 | 22.4 | 2.1 | 10.7 | 1.6 | 12.4 |
2 | 42.0 | 2.8 | 15.2 | |||
3 | 25.2 | 2.2 | 11.7 | |||
4 | 22.0 | 2.0 | 11.2 | |||
5 | 28.4 | 2.0 | 13.9 | |||
6 | 25.2 | 2.1 | 11.8 | |||
7C11.1 | 1 | 18.1 | 1.8 | 10.1 | 2.0 | 13.9 |
2 | 25.5 | 1.7 | 15.0 | |||
3 | 34.6 | 2.2 | 15.7 | |||
4 | 22.4 | 1.8 | 12.3 | |||
5 | 31.1 | 2.1 | 15.0 | |||
6 | 38.2 | 2.5 | 15.4 | |||
2G8.1 | 1 | 37.2 | 1.9 | 19.6 | 2.6 | 18.5 |
2 | 32.0 | 2.0 | 16.3 | |||
3 | 24.5 | 1.7 | 14.8 | |||
4 | 36.1 | 2.1 | 17.6 | |||
5 | 44.3 | 2.0 | 22.6 | |||
6 | 39.0 | 1.9 | 20.3 | |||
무관한 클론 | 1 | 23.3 | 1.1 | 21.2 | 4.8 | 22.2 |
2 | 20.4 | 1.2 | 17.3 | |||
3 | 26.9 | 1.0 | 26.9 | |||
4 | 18.4 | 1.2 | 14.8 | |||
5 | 34.0 | 1.3 | 26.2 | |||
6 | 32.9 | 1.2 | 27.0 |
각 하이브리도마에 대한 Ratio Avg를 표 2의 KD 값의 함수로 플롯팅하였다(도 10). 도 10에 도시된 바와 같이, Ratio Avg 및 KD 값(Octet® 바이오층 간섭계 플랫폼(Satorius)에서 결정됨)은 통계적 유의성을 갖고 상관관계가 있었다(R2=0.932). 종합하면, 이러한 결과는 단일 클론의 정규화된 RFU가 항체 친화도 순위를 매기는 데 유용하다는 것을 입증한다. 이러한 결과는 또한 현재 개시된 단일 세포 분석이 분비된 항체의 친화도에 따라 개별 ASC의 순위를 매기는 데 사용될 수 있음을 시사한다.
실시예 12
이 실시예는 항원의 인간 및 시노몰구스 원숭이(시노) 오르소로그 둘 다에 대해 교차 반응하는 항체를 생성하기 위해 마우스에서 면역 반응을 유도하는 방법을 설명한다. 이 실시예에서는 교차 반응 항체 형성에 대한 다양한 면역화 전략의 영향과 이러한 변화를 검출하는 단일 세포 스크리닝 전략의 능력을 탐구한다. 이 실시예는 또한 면역 조종에서 단일 세포 분석의 적용을 입증한다.
면역화
CD1 마우스를 항원의 인간 오르소로그로 2주마다 면역화시켰다. 초기 부스트를 위해, 마우스를 완전 프로인트 보조제(CFA)에서 인간 항원 25 μg으로 피하 면역화시켰다. 제2 부스트는 50% 시그마 보조제 시스템(SAS)과 조합한 25 μg의 인간 항원을 함유하였고, 절반은 피하로, 절반은 복강 내로 투여되었다. 제3 용량은 50% SAS와 조합한 15 μg의 인간 항원을 가지고 있었고, 절반은 피하로, 절반은 복강 내로 투여되었다. 마우스를 14주 동안 쉬게 한 다음, 보조제 없이 25 μg의 인간 항원(인산염 완충 식염수(PBS) 중)을 복막강으로 부스팅하였다. 혈청학 및 단일 세포 스크리닝을 위해 부스트 4일 후에 혈액을 수집하였다(도 11, 출혈 1).
그런 다음, 마우스를 두 그룹으로 나누었다: 그룹 2는 일주일에 한 번 시노 항원을 피하로 부스팅하여 인간/시노 교차 반응성 항체 생성을 향해 면역 조종된 반면, 그룹 1은 대조군 역할을 하여 인간 항원으로 부스팅되었다. 두 그룹의 마우스를 제8 부스트 후 4일 후에 출혈시키고(도 11, 출혈 2), 분석을 위해 혈액을 준비하였다.
제8 부스트 후, 그룹 1로부터의 마우스를 2개의 하위 그룹(그룹 1A 및 1B)으로 나누고, 시노 항원(그룹 1B) 또는 인간(그룹 1A) 항원의 단일 비보조 부스트를 제공하였다. 부스트 4일 후에 두 하위 그룹의 마우스를 출혈시키고(도 11, 출혈 3), 분석을 위해 혈액을 준비하였다.
혈액 준비 및 세포 농축
도 11에 표시된 시간에 혈액을 수집하였다(출혈 1, 출혈 2 및 출혈 3). 각 경우에, 혈액을 원심분리하여 혈액 세포로부터 혈청을 분리하였다. 혈청을 하기 기재된 혈청 역가 분석에 사용하였고, CD138 농축 키트((STEMCELL Technologies, Inc., 캐나다 브리티시 컬럼비아 주 밴쿠버 소재))의 표준 프로토콜의 수정된 버전을 사용하여 CD138+ B 세포를 농축함으로써 혈액 세포를 ASC에 대해 농축하였다.
단일 세포 스크리닝 분석
실시예 2에 기재된 바와 같이 농축된 CD138+ B 세포 집단으로 단일 세포 스크리닝 분석을 수행하였다. 간략하게, 농축된 CD138+ B 세포 집단을 3.4 μm 폴리스티렌 비드(Spherotech Inc, 미국 일리노이 주 레이크 포레스트 소재)에 연결된 염소 항-생쥐 IgG Fc를 포함하는 포획 시약, 녹색 형광 신호를 생성하는 Alexa 488로 표지된 시노 항원, 적색 형광 신호를 생성하는 Alexa 594로 표지된 인간 항원과 혼합하고, B 세포 배지를 희석제로 사용하여 최종 농도로 제조하였다. 상이한 형광 신호(시노 항원의 경우 녹색, 인간 항원의 경우 적색)를 사용하여 단일 세포 분석에서 인간 오르소로그에만 결합하는 단일 세포, 시노 오르소로그에만 결합하는 단일 세포, 두 오르소로그 모두에 결합하는 단일 세포를 구분할 수 있었다. 혼합물을 384웰 플레이트의 단일 웰로 옮겼고, 최종 농축된 B 세포 농도는 웰당 약 2~3 μL의 세포 혼합물이었다. 혼합물의 구성 성분을 약 10분 동안 웰에 침전시킨 후, Incucyte 생세포 분석 시스템을 사용하여 세포 이미징을 수행하였다. 녹색 형광 및 적색 형광에 대한 RFU 값을 결정하였다.
혈청 역가 분석
출혈 1 및 3으로부터의 혈청을 1:100, 1:1000 및 1:10,000의 최종 농도까지 희석한 다음, V-바닥 96웰 플레이트에 플레이팅된, 포획된 비오티닐화 항원이 있는 비드에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 비드를 세척하고 최종 농도 5 μg/mL에서 30 μg의 염소 항-마우스 IgG Fc(Jackson Immunoresearch)에 재현탁하였다. 15분 인큐베이션 후, 비드를 FACS 완충액으로 세척하고 재현탁하였다. 그런 다음, 유세포 분석을 위해 플레이트를 준비하였다.
결과 및 토론
그룹 1 및 2 마우스를 초기에 동일한 방식으로 부스팅하였고, 혈청 역가 분석은 모든 마우스가 인간 및 시노 오르소로그 둘 다에 대해 강력한 면역 반응을 생성하였음을 나타내었지만, 역가 데이터는 인간-시노 교차 반응성 결합제와 시노 단독을 구별할 수 없었다(도 12, 출혈 1). 단일 세포 스크린을 사용하여 각 개별 마우스에서 인간 단독, 시노 단독 또는 시노-인간 오르소로그 둘 다에 결합하는 항체의 백분율을 확인하였다(도 13 및 도 14, 출혈 1). 우세한 면역 반응은 인간 오르소로그에 대한 것이었지만 교차 반응성 항체는 일부 마우스에서 쉽게 확인할 수 있었다(도 14).
그런 다음, 단일 세포 스크린이 면역 조종 후 항체 레퍼토리의 변화를 검출할 수 있는지를 결정하기 위해 면역화 조건을 변화시켰다. 그룹 1 마우스는 인간 오르소로그로 계속 부스트를 받은 반면, 그룹 2 마우스는 시노 오르소로그로 부스팅하였다(도 11, 출혈 2). 단일 세포 스크리닝 분석은 현재 면역 반응을 지배하는 시노 단독 항체를 갖는 그룹 2 마우스(도 15)에서 시노 대 인간 오르소로그에 결합하는 항체의 백분율의 강한 변화를 검출할 수 있었다. 그룹 1 대조군 마우스는 출혈 1 및 2에서 유사한 반응을 보였다(도 14 대 도 15). 두 그룹 모두 교차 반응성 항체 생성에 유의미한 변화가 없었다. 이러한 데이터는 단일 세포 스크리닝 분석이 면역 반응의 변화를 검출할 수 있는 분해능을 가지고 있으며 면역화 전략의 작은 변화가 항체 레퍼토리를 형성할 수 있음을 입증한다.
그런 다음, 그룹 1 마우스를 마지막으로 한 번 부스팅하여 최소한의 시노 단독 반응으로 면역 반응이 교차 반응성 항체의 증가 방향으로 조종될 수 있는지를 결정하였다. 이전 데이터는 시노 항원에 대한 강력한 드 노보 반응이 있을 것이며, 다수의 부스트가 필요한 반응을 생성하지 않을 것임을 입증하였다. 따라서, 그룹 1 마우스는 드 노보 반응을 최소화하기 위해 보조제 없이 25 μg의 단백질과 함께 단일 부스트를 받았다. 그룹 1A는 인간 오르소로그로, 그룹 1B는 시노 오르소로그로 부스트를 받았다. 인간 부스트를 받은 마우스(그룹 1A)는 출혈 1에 비해 교차 반응성 항체의 백분율에 변화가 없었다(도 16 내지 도 17). 인간 항원으로만 부스팅된 마우스에서 변화가 없다는 점은 단일 세포 스크린의 재현성을 강조한다. 대조적으로, 시노 부스팅된 그룹(그룹 1B)은 교차 반응성 항체의 2~16배 범위의 증가(도 17)와 함께, 교차 반응성 항체의 백분율에서 상당한 증가를 가졌다(도 16). 단일 부스트가 시노 단독 항체의 드 노보 생성을 최소화했음을 나타내는 시노 단독에 결합하는 항체의 최소한의 백분율이 있었다. 시노 부스팅한 그룹(그룹 1B)의 모든 마우스는 이제 표준 다클론 혈청학을 사용하여 식별할 수 없는 상위 동물로 설계 목표를 충족하였다(도 18). 이는 새로 형성된 ASC가 레퍼토리의 아주 작은 백분율에만 기여하는 면역화 캠페인을 통해 생성된 모든 항체의 다클론성 혼합물을 포함하는 혈청 때문일 가능성이 높다.
종합하면, 이러한 결과는 예를 들어 상이한 오르소로그 항원으로 부스팅함으로써 면역 조종에 의해 상이한 면역 반응이 달성될 수 있음을 시사한다. 이러한 결과는 인간 오르소로그에만 결합하는 항체 대 시노 오르소로그에만 결합하는 항체 대 두 오르소로그에 결합하는(인간 및 시노 오르소로그 모두에 교차 반응하는) 항체를 구별할 수 없는 다클론 혈청 역가 분석과 달리, 본 개시내용의 단일 세포 스크리닝 분석이 면역화 전략에서 단지 작은 변화가 발생하는 경우에도 항체 생성을 추적 또는 모니터링할 수 있는 면역 반응 및 면역 레퍼토리의 변화를 검출하는 데 필요한 분해능 및 감도를 가짐을 추가로 뒷받침한다.
실시예 13
이 실시예는 다중-도메인 단백질의 인간 및 시노 오르소로그 둘 다에 교차 반응하는 항체의 비율을 증가시키기 위해 면역 반응을 조종하는 방법을 설명한다.
다중 도메인 단백질인 항원에 대한 인간/시노 교차 반응성 항체를 생성하려는 이전의 시도가 있었다. 시노 및 인간 오르소로그는 상동성이 80% 미만이다. 이전의 시도에서, 인간 항원의 부스트는 시노 항원의 부스트와 교대되었는데, 이 접근법은 각각의 오르소로그 단백질에 대한 강력한 드 노보 반응을 유도했지만, 매우 적은 수의 항체가 교차 반응하였다. 본원의 이 실시예에서는, 마우스를 처음에 인간 단백질의 전체 세포외 도메인(항원 1)으로 부스팅하였고, 이후 단백질의 서브도메인(항원 2)으로 부스팅하였다. 시노 서브도메인과 인간 서브도메인은 상동성이 80%를 초과한다.
면역화
CD-1 마우스를 총 4회의 부스트 동안 2주마다 항원 1로 면역화시켰다(도 19). 제1 부스트는 CFA에 유화된 50 μg의 항원 1이었고 피하 주사되었다. 제2 부스트는 50% SAS와 조합한 25 μg의 항원 1이었고, 절반은 피하로, 나머지 절반은 복강 내로 전달되었다. 제3 부스트는 50% SAS와 조합한 15 μg의 항원 1이었고, 마우스에 절반은 피하로, 절반은 복강 내로 주사하였다. 제4 부스트는 보조제 부재 하의 항원 1 25μg이었다. 단일 세포 스크리닝을 위해 4일 후에 혈액을 수집하였다(출혈 1). 출혈 1 이후에 2회의 추가 부스트가 투여되었다. 각각 25 μg의 항원 2를 사용하고 각각 4일 후에 혈액을 수집하였다(출혈 2 및 출혈 3).
혈액 준비 및 세포 농축
혈액을 도 19에 표시된 대로 면역화 캠페인 전체에 걸쳐 3회 수집하였다(출혈 1, 출혈 2, 출혈 3). 각 경우에, 혈액을 원심분리하여 혈액 세포로부터 혈청을 분리하였다. 혈청을 하기 기재된 혈청 역가 분석에 사용하였고, CD138 농축 키트((STEMCELL Technologies, Inc., 캐나다 브리티시 컬럼비아 주 밴쿠버 소재))의 표준 프로토콜의 수정된 버전을 사용하여 CD138+ B 세포를 농축함으로써 혈액 세포를 ASC에 대해 농축하였다.
단일 세포 스크리닝 분석
실시예 2에 기재된 바와 같이 농축된 CD138+ B 세포 집단으로 단일 세포 스크리닝 분석을 수행하였다. 간략하게, 농축된 CD138+ B 세포 집단을 3.4 μm 폴리스티렌 비드(Spherotech Inc, 미국 일리노이 주 레이크 포레스트 소재)에 연결된 염소 항-생쥐 IgG Fc를 포함하는 포획 시약, 녹색 형광 신호를 생성하는 Alexa 488로 표지된 시노 항원, 적색 형광 신호를 생성하는 Alexa 594로 표지된 인간 항원과, His 태그 특이적 역가와 경쟁하기 위해 적어도 100배의 몰 과량의 HexaHis 단백질과 혼합하고, B 세포 배지를 희석제로 사용하여 최종 농도로 제조하였다. 상이한 형광 신호(시노 항원의 경우 녹색, 인간 항원의 경우 적색)를 사용하여 단일 세포 분석에서 인간 오르소로그에만 결합하는 단일 세포, 시노 오르소로그에만 결합하는 단일 세포, 두 오르소로그 모두에 결합하는 단일 세포를 구분할 수 있었다. 혼합물을 384웰 플레이트의 단일 웰로 옮겼고, 최종 농축된 B 세포 농도는 웰당 약 2~3 μL의 세포 혼합물이었다. 혼합물의 구성 성분을 약 10분 동안 웰에 침전시킨 후, Incucyte 생세포 분석 시스템을 사용하여 세포 이미징을 수행하였다. 녹색 형광 및 적색 형광에 대한 RFU 값을 결정하였다.
혈청 역가 분석
혈청을 1:100, 1:1000 및 1:10,000의 최종 농도까지 희석한 다음, V-바닥 96웰 플레이트에 플레이팅된, 포획된 비오티닐화 항원이 있는 비드에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 비드를 세척하고 최종 농도 5 μg/mL에서 30 μg의 염소 항-마우스 IgG Fc(Jackson Immunoresearch)에 재현탁하였다. 15분 인큐베이션 후, 비드를 FACS 완충액으로 세척하고 재현탁하였다. 그런 다음, 유세포 분석을 위해 플레이트를 준비하였다.
결과 및 토론
출혈 1로부터의 혈청 역가는 인간 항원에 대한 강력한 면역 반응을 검출할 수 있었으며, 시노 항원에 대한 결합은 낮지만 검출할 수 있었다(도 20). 그러나 다클론 역가 데이터는 시노 항원에만 결합하는 항체와 인간과 시노 둘 다와 교차 반응할 수 있는 항체를 구별할 수 없었다. 대조적으로, 단일 세포 스크린은 인간 단독, 시노 단독 및 인간 및 시노 교차 반응성 항체 둘 다에 대한 결합을 검출할 수 있었다(도 21 내지 도 22). 혈청 역가 및 단일 세포 스크린 모두 우세한 면역 반응이 인간 오르소로그에만 결합하는 항체로 제한된다는 것을 입증하였다. 일부 교차 반응성 항체가 생성되었지만 대부분의 시노 반응은 인간 오르소로그에 결합할 수 없었고 추가적인 면역화가 필요하였다.
그런 다음, 마우스를 전장 단백질에 비해 더 높은 수준의 인간/시노 상동성을 갖는 인간 항원(항원 2)의 서브도메인으로 부스팅하였다. 마우스는 처음에 복막강에 보조제 없이 25 μg의 항원 2의 주사를 받았다. 그런 다음, 마우스를 출혈시키고(출혈 2), 샘플을 시노 및 인간 오르소로그에 대한 결합에 대해 스크리닝하였다. 이 부스트는 신뢰를 가지고 교차 반응성 항체를 확인할 수 있을 만큼 충분히 강력한 면역 반응을 생성하지 못하였다. 따라서, 마우스를 50% SAS와 조합한 25 μg의 항원 2로 한 번 더 부스팅하였다. 부스트 4일 후에 마우스를 출혈시키고(출혈 3), 전술한 바와 같이 CD138+ ASC를 단리하고 스크리닝하였다. 이 실험은 필요한 경우 조정 및 부스트 확장을 허용하기 위해 비종말적인 샘플링을 사용하는 것의 가치를 강조한다.
항원 2를 이용한 부스팅은 항원의 시노 오르소로그에 대한 혈청 역가의 강력한 증가를 생성하였다(도 23). 이 관찰과 일관되게, 단일 세포 분석은 또한 출혈 1에 비해 출혈 3에서 시노 단독 및 시노-인간 교차 반응성 항체 둘 다의 증가를 검출하였다(도 24). 그런 다음, 관심 동물을 시노 단독 결합 백분율과 인간 및 시노 오르소로그 둘 다 결합 백분율을 플롯팅하여 확인할 수 있었다. 이 플롯은 일부 마우스가 시노 오르소로그 단독에 대한 반응을 생성하는 반면 다른 마우스는 강력한 교차 반응성을 나타냄을 보여주었다. 이는 표준 다클론 혈청학을 사용하여 식별할 수 없다.
본원에 인용된 간행물, 특허 출원, 및 특허를 비롯한 모든 참고문헌은, 각 참고문헌이 참조로 포함되는 것으로서 개별적으로 그리고 구체적으로 나타내고 그 전체가 본원에 제시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
본 발명을 기술하는 문맥에서(특히 하기 청구범위의 문맥에서) 단수형 용어 및 유사한 지시 대상의 사용은 본원에서 달리 나타내지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 단수와 복수를 모두 포함하는 것으로 해석되어야 한다. "포함하는", "갖는", 및 "함유하는"이란 용어는 달리 명시되지 않는 한, 확장 가능한 용어(즉, "포함하나 이에 제한되지 않는"을 의미)로 해석되어야 한다.
본원에서 값의 범위의 언급은 본원에서 달리 명시되지 않는 한, 단지 그 범위 내에 있는 각각의 개별 값 및 각각의 끝점을 개별적으로 지칭하는 약식 방법으로 사용되는 것이며, 각각의 개별 값 및 끝점은 마치 본원에 개별적으로 언급된 것처럼 명세서에 포함된다.
본원에 기재된 모든 방법은 본원에서 달리 나타내지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공되는 모든 예, 또는 예시적인 용어(예를 들어, "~와 같은")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 예시하기 위한 것으로, 달리 청구되지 않는 한, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 명세서의 어떤 언어도 청구되지 않은 요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 발명을 수행하기 위해 본 발명자들에게 알려진 최선의 방식을 포함하여 본 발명의 바람직한 구현예가 본원에 기재되어 있다. 이러한 바람직한 구현예의 변형예는 상기 설명을 접한 당업자에게 명백해질 수 있다. 본 발명자들은 당업자가 이러한 변형예를 적절히 사용할 것을 예상하며, 본 발명이 본원에 구체적으로 기재된 것과 다르게 실시되도록 의도한다. 따라서, 본 발명은 관련 법률이 허용하는 바와 같이 여기에 첨부된 청구범위에 언급된 요지의 모든 변형예 및 균등물을 포함한다. 또한, 본원에서 달리 나타내지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 본 발명의 모든 가능한 변형예의 전술한 요소의 임의의 조합은 본 발명에 포함된다.
Claims (81)
- 비인간 동물에서 선택 항체의 생성을 모니터링하는 방법으로서,
a. 면역원으로 비인간 동물을 면역화시키는 단계;
b. 상기 비인간 동물로부터 항체 분비 세포(ASC)를 포함하는 혈액 샘플을 얻는 단계; 및
c. 선택 항체 생성을 위해 혈액 샘플 또는 이의 분획에 존재하는 ASC를 개별적으로 분석하는 단계를 포함하는, 방법. - 선택 항체의 생성을 위해 비인간 동물에서 항체 생성을 유도하는 방법으로서,
a. 면역원으로 비인간 동물에 대한 초기 면역화를 수행하는 단계;
b. 상기 비인간 동물로부터 항체 분비 세포(ASC)를 포함하는 혈액 샘플을 얻는 단계;
c. 선택 항체 생성을 위해 혈액 샘플 또는 이의 분획에 존재하는 ASC를 개별적으로 분석하는 단계; 및
d. 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 미만인 경우 단계의 사이클을 수행하는 단계를 포함하고, 사이클은
i. 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 미만인 경우 면역원으로 비인간 동물에 대한 후속 면역화를 수행하는 단계,
ii. 상기 비인간 동물로부터 ASC를 포함하는 혈액 샘플을 얻는 단계,
iii. 선택 항체 생성을 위해 혈액 샘플 또는 이의 분획에 존재하는 ASC를 개별적으로 분석하는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 분석하는 단계는 단일 세포, 생세포 분석을 포함하는 것인, 방법.
- 제3항에 있어서, 다수의 ASC가 동시에 분석되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 혈액 샘플 또는 이의 분획을 매트릭스에 적용하고 매트릭스의 고유 주소를 각각의 ASC에 할당하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제5항에 있어서, 분석하는 단계의 결과는 선택 항체를 생성하는 각 ASC의 확인인, 방법.
- 제6항에 있어서, 결과는 선택 항체를 생성하는 각 ASC의 고유 주소의 확인을 포함하는 것인, 방법.
- 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 사이클은 적어도 1회 수행되는 것인, 방법.
- 제8항에 있어서, (iii)에서 분석된 바와 같이, 선택 항체를 생성하는 ASC의 수가 임계값 이상일 때까지 사이클은 반복되는 것인, 방법.
- 제9항에 있어서, 사이클은 적어도 2회 반복되는 것인, 방법.
- 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 후속 면역화의 면역원은 초기 면역화의 면역원과 상이한 것인, 방법.
- 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 후속 면역화는 (A) 상이한 면역원, 보조제 및/또는 면역조절제가 비인간 동물에게 투여된다는 점, (B) 상이한 용량의 면역원이 비인간 동물에게 투여된다는 점, (C) 면역원, 보조제, 면역조절제의 각 투여 사이의 시간이 상이하다는 점, 및/또는 (D) 면역원, 보조제, 면역조절제의 각 투여에 대한 투여 경로가 상이하다는 점에서 이전 면역화와 상이한 것인, 방법.
- 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물이 면역될 때마다 상이한 면역원이 사용되는 것인, 방법.
- 비인간 동물에서 선택 항체를 생성하는 방법으로서,
a. 면역원으로 비인간 동물에 대한 초기 면역화를 수행하는 단계;
b. 상기 비인간 동물로부터 항체 분비 세포(ASC)를 포함하는 혈액 샘플을 얻는 단계;
c. 선택 항체 생성을 위해 혈액 샘플 또는 이의 분획에 존재하는 ASC를 개별적으로 분석하는 단계;
d. 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 미만인 경우 단계의 사이클을 수행하는 단계를 포함하고, 사이클은
i. 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 미만인 경우 면역원으로 비인간 동물에 대한 후속 면역화를 수행하는 단계,
ii. 상기 비인간 동물로부터 ASC를 포함하는 혈액 샘플을 얻는 단계,
iii. 선택 항체 생성을 위해 혈액 샘플 또는 이의 분획에 존재하는 ASC를 개별적으로 분석하는 단계, 및
e. 선택 항체 및/또는 선택 항체를 생성하는 ASC를 단리하는 단계를 포함하는, 방법. - 제14항에 있어서, ASC에 의해 생성된 선택 항체의 중쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 ASC에 의해 생성된 선택 항체의 경쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계, 선택 항체의 중쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 벡터 및 선택 항체의 경쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계, 및 숙주 세포에 의해 생성된 항체를 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 분석하는 단계는
a. 매트릭스 내의 ASC를 (i) 선택 항체에 결합하고 고체 지지체를 포함하는 포획 시약, (ii) 선택 항체에 결합하고 제1 검출 가능한 표지를 포함하는 검출 시약, 및 (iii) 선택 항체가 결합하는 표지된 표적과 조합하는 단계, 여기서 표지된 표적은 제1 검출 가능한 표지와 별개인 제2 검출 가능한 표지를 포함하는 것인, 단계;
b. 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지를 분석하는 단계; 및;
c. 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지가 검출되는 매트릭스 내의 위치를 확인하는 단계, 여기서 각각의 확인된 위치는 선택 항체를 생성하는 개별 ASC의 위치를 표시하는 것인, 단계를 포함하는, 방법. - 제16항에 있어서, 포획제는 고체 지지체에 부착된 항체 Fc 도메인에 결합하는 항체를 포함하는 것인, 방법.
- 제16항 또는 제17항에 있어서, 검출제는 제1 검출 가능한 표지에 부착된 항체 Fc 도메인에 결합하는 항체를 포함하는 것인, 방법.
- 제18항에 있어서, 포획제의 항체 Fc 도메인에 결합하는 항체는 검출제의 동일한 항체인, 방법.
- 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 조합하는 단계는 웰에서 일어나고 포획제는 웰에서 단일층을 형성하고, 선택적으로, ASC는 웰에서 또는 웰에 첨가되기 직전에 포획 시약, 검출 시약, 및/또는 표지된 표적에 먼저 노출되는 것인, 방법.
- 제20항에 있어서, 방법은 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지가 검출되는 웰 내의 위치를 확인하는 단계를 포함하며, 각각의 확인된 위치는 선택 항체를 생성하는 개별 ASC의 위치를 표시하는 것인, 방법.
- 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 조합하는 단계는 미세유체 또는 나노유체 챔버, 마이크로웰 또는 나노웰 장치, 미세모세관 또는 나노모세관, 또는 나노유체 칩의 나노펜에서 일어나는 것인, 방법.
- 제22항에 있어서, 조합하는 단계는 나노유체 칩의 나노펜에서 일어나는 것인, 방법.
- 제23항에 있어서, 방법은 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지가 검출되는 나노유체 칩 내의 각각의 펜의 위치를 확인하는 단계를 포함하며, 각각의 확인된 위치는 선택 항체를 생성하는 개별 ASC의 위치를 표시하는 것인, 방법.
- 제23항 또는 제24항에 있어서, 혈액 샘플의 단일 ASC는 광전자 포지셔닝(optoelectro positioning, OEP)을 통해 나노유체 칩의 펜으로 이동되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 선택 항체는 비인간 동물을 면역화시키는 데 사용되는 면역원과 동일하거나 유사한 표적에 결합하는 것인, 방법.
- 제26항에 있어서, 선택 항체는 하나 이상의 경쟁적 결합제의 존재 하에 표적에 결합하는 것인, 방법.
- 제27항에 있어서, 경쟁적 결합제는 분석하는 단계 동안 ASC, 포획 시약, 검출 시약 및 표지된 표적과 조합되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 선택 항체는 표적 친화도로 표적에 결합하며, 선택적으로, 표적에 대한 선택 항체의 KD는 약 10-11 M 내지 약 10-9 M인, 방법.
- 제29항에 있어서, 분석하는 단계는 제1 양의 표지된 표적으로의 제1 라운드 및 제2 양의 표지된 표적으로의 제2 라운드로 수행되고, 여기서 제1 양은 제2 양보다 더 크고, 선택적으로, 분석하는 단계는 제3 양의 표지된 표적으로의 제3 라운드에서 추가로 수행되고, 제3 양은 제2 양보다 적으며, 여기서 ASC가 각 라운드에서 표지된 표적에 결합할 경우, ASC는 선택 항체를 생성하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 선택 항체는 표적 및 이의 오르소로그 또는 파라로그에 결합하며, 선택적으로, 표적은 인간 단백질이고 오르소로그는 시노몰구스 원숭이 단백질인, 방법.
- 제31항에 있어서, 제2 표지된 표적은 ASC, 포획 시약, 검출 시약 및 표지된 표적과 조합되며, 여기서 제2 표지된 표적은 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지와 구별되는 제3 검출 가능한 표지에 부착된 오르소로그를 포함하고, 여기서 방법은 제3 검출 가능한 표지를 분석하고 제1 검출 가능한 표지, 제2 검출 가능한 표지 및 제3 검출 가능한 표지가 검출되는 위치(들)를 확인하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 각각의 확인된 위치는 선택 항체를 생성하는 개별 ASC의 위치를 표시하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 선택 항체는 표적에 결합하고 이의 오르소로그 또는 파라로그에는 결합하지 않는 것인, 방법.
- 제33항에 있어서, 제2 표지된 표적은 ASC, 포획 시약, 검출 시약 및 표지된 표적과 조합되며, 여기서 제2 표지된 표적은 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지와 구별되는 제3 검출 가능한 표지에 부착된 오르소로그를 포함하고, 여기서 방법은 제3 검출 가능한 표지를 분석하고 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지만 검출되고 제3 검출 가능한 표지는 검출되지 않는 위치(들)를 확인하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 각각의 확인된 위치는 선택 항체를 생성하는 개별 ASC의 위치를 표시하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 선택 항체는 표적의 일부에 결합하는 것인, 방법.
- 제35항에 있어서, 제2 표지된 표적은 ASC, 포획 시약, 검출 시약 및 표지된 표적과 조합되며, 여기서 제2 표지된 표적은 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지와 구별되는 제3 검출 가능한 표지에 부착된 표지의 일부를 포함하고, 여기서 방법은 제3 검출 가능한 표지를 분석하고 제1 검출 가능한 표지, 제2 검출 가능한 표지 및 제3 검출 가능한 표지가 검출되는 위치(들)를 확인하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 각각의 확인된 위치는 선택 항체를 생성하는 개별 ASC의 위치를 표시하는 것인, 방법.
- 제36항에 있어서, 표적은 다수의 도메인을 포함하는 단백질이고 선택 항체는 표적의 단 하나의 도메인에만 결합하고, 표지된 표적은 제2 검출 가능한 표지에 부착된 표적의 세포외 도메인을 포함하고 제2 표지된 표적은 제3 검출 가능한 표지에 부착된 이 하나의 도메인을 포함하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 선택 항체는 표적의 이량체화 또는 다량체화 시 형성된 구조적 에피토프에 결합하고, 표적은 이량체화 도메인 또는 다량체화 도메인을 포함하는 것인, 방법.
- 제38항에 있어서, 표지된 표적은 제2 검출 가능한 표지에 부착된 면역원의 세포외 도메인을 포함하고, 여기서 제2 표지된 표적은 ASC, 포획 시약, 검출 시약 및 표지된 표적과 조합되고, 여기서 제2 표지된 표적은 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지와 구별되는 제3 검출 가능한 표지에 부착된 면역원의 이량체화 도메인 또는 다량체화 도메인을 포함하고, 여기서 방법은 제3 검출 가능한 표지를 분석하고 제1 검출 가능한 표지, 제2 검출 가능한 표지 및 제3 검출 가능한 표지가 검출되는 위치(들)를 확인하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 각각의 확인된 위치는 선택 항체를 생성하는 개별 ASC의 위치를 표시하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 혈액 샘플은 면역화 단계 후 약 3일 내지 약 7일 후에 비인간 동물로부터 얻는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물로부터 얻은 혈액 샘플은 약 500 μL 이하인, 방법.
- 제41항에 있어서, 혈액 샘플은 약 100 μL 내지 약 250 μL인, 방법.
- 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, ASC는 CD138+ B 세포인, 방법.
- 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, ASC는 이동성 형질모세포를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 분석 전에 비인간 동물로부터 얻은 혈액 샘플의 하나 이상의 구성 성분을 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제45항에 있어서, 적혈구, 혈장 및/또는 혈소판은 혈액 샘플로부터 제거되는 것인, 방법.
- 제45항 또는 제46항에 있어서, 혈액 샘플의 분획은 CD138+ 세포를 선택하여 준비되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물은 하나 이상의 이차 림프 기관의 제거 및 안락사를 거치지 않는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 혈액 샘플로부터의 ASC는 하이브리도마를 만드는 데 사용되지 않는 것인, 방법.
- 제2항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물은 일련의 비인간 동물 중 하나이고, 분석하는 단계의 결과는 임계값 미만의 선택 항체를 생성하고/하거나 추가 면역화를 요구하는 다수의 ASC를 갖는 비인간 동물의 확인인, 방법.
- 제2항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 방법의 단계는 일련의 비인간 동물에 대해 수행되며, 방법은 일련의 각각의 비인간 동물에 대한 혈액 샘플의 B 세포 레퍼토리를 프로파일링하고 표적 B 세포 프로파일을 갖는 일련의 하위 집합을 선택하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 이상인 경우 비인간 동물을 희생시키고 비인간 동물로부터 조직을 수확하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제52항에 있어서, 비인간 동물로부터 비장을 수?d하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제53항에 있어서, 비장의 B 세포를 스크리닝하고/하거나 비장의 세포로부터 하이브리도마를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
- 선택 항체를 생성하는 항체 분비 세포(ASC)에 대해 일련의 비인간 동물을 스크리닝하는 방법으로서,
제1항 내지 제54항 중 어느 한 항의 방법에 따라 일련의 비인간 동물에서 하나의 비인간 동물에서 선택 항체의 생성을 모니터링하는 단계를 포함하고,
일련의 비인간 동물 각각에 대해 선택 항체를 생성하는 ASC의 수가 확인되는 것인, 방법. - 제55항에 있어서, 동물에 대한 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 미만인 경우, 후속 면역화를 수행하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제56항에 있어서, 동물에 대한 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 이상인 경우, 동물로부터 이차 림프 기관을 수확하는 단계를 포함하는, 방법.
- 후속 면역화를 위해 면역화된 비인간 동물을 선택하는 방법으로서,
제1항 내지 제57항 중 어느 한 항의 방법에 따라 비인간 동물에서 선택 항체의 생성을 모니터링하는 단계,
여기서 비인간 동물 각각에 대해, 선택 항체를 생성하는 ASC의 수가 확인되는 것인, 단계, 및
동물에 대한 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 미만인 경우, 후속 면역화를 위해 동물을 선택하는 단계를 포함하는 방법. - 안락사 및 이차 림프구 수확을 위해 면역화된 비인간 동물을 선택하는 방법으로서,
제1항 내지 제58항 중 어느 한 항의 방법에 따라 비인간 동물에서 선택 항체의 생성을 모니터링하는 단계,
여기서 비인간 동물 각각에 대해, 선택 항체를 생성하는 ASC의 수가 확인되는 것인, 단계, 및
동물에 대한 선택 항체를 생성하는 ASC의 백분율이 임계값 이상인 경우, 안락사 및 이차 림프구 수확을 위해 동물을 선택하는 단계를 포함하는 방법. - 선택 항체를 생성하는 ASC를 분석하는 방법으로서,
a. 웰에서 (i) 면역원으로 면역화된 비인간 동물로부터 얻은 혈액 샘플, 또는 이의 분획(여기서, 혈액 샘플은 항체 분비 세포(ASC)를 포함함), (ii) 선택 항체에 결합하고 제1 검출 가능한 표지를 포함하는 검출 시약, 및 (iii) 선택 항체가 결합하는 표적을 조합하는 단계,
여기서,
(A) 표적은 제1 검출 가능한 표지와 별개인 제2 검출 가능한 표지를 포함하는 표지된 표적이고, 선택 항체에 결합하고 고체 지지체를 포함하는 포획 시약은 웰에서 추가로 조합되어 웰에서 단일층을 형성하거나,
또는
(B) 표적은 세포의 표면에서 발현되고 세포는 웰에서 조합되어 웰에서 단일층을 형성하는 것인, 단계,
b. 표적이 표지된 표적인 경우, 제1 검출 가능한 표지를 분석하고 선택적으로 제2 검출 가능한 표지를 분석하는 단계;
c. 제1 검출 가능한 표지가 검출되거나 또는 제1 및 제2 검출 가능한 표지가 검출되는 웰 내의 위치를 확인하는 단계, 여기서 각각의 확인된 위치는 선택 항체를 생성하는 개별 ASC의 위치를 표시하는 것인, 단계를 포함하는 방법. - 제60항에 있어서, ASC는 웰에서 또는 웰에 첨가되기 직전에 검출 시약 및/또는 표적에 먼저 노출되는 것인, 방법.
- 제60항 또는 제61항에 있어서, 선택 항체는 비인간 동물을 면역화시키는 데 사용되는 면역원과 동일하거나 유사한 표적에 결합하는 것인, 방법.
- 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 시약은 고체 지지체에 부착된 항체 Fc 도메인에 결합하는 항체를 포함하고/하거나, 검출제는 제1 검출 가능한 표지에 부착된 항체 Fc 도메인에 결합하는 항체를 포함하는 것인, 방법.
- 제63항에 있어서, 포획제의 항체 Fc 도메인에 결합하는 항체는 검출제의 동일한 항체인, 방법.
- 제60항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 혈액 샘플은 면역화 단계 후 약 3일 내지 약 7일 후에 비인간 동물로부터 얻는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물로부터 얻은 혈액 샘플은 약 500 μL 이하, 선택적으로, 약 100 μL 내지 약 250 μL인, 방법.
- 제60항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, ASC는 CD138+ B 세포인, 방법.
- 제60항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, ASC는 이동성 형질모세포를 포함하는, 방법.
- 제60항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 웰에서 조합하기 전에 비인간 동물로부터 얻은 혈액 샘플의 하나 이상의 구성 성분을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제69항에 있어서, 적혈구, 혈장 및/또는 혈소판은 혈액 샘플로부터 제거되는 것인, 방법.
- 제69항 또는 제70항에 있어서, 혈액 샘플의 분획은 CD138+ 세포를 선택하여 준비되는 것인, 방법.
- 제60항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 선택 항체는 하나 이상의 경쟁적 결합제의 존재 하에 표적에 결합하는 것인, 방법.
- 제72항에 있어서, 경쟁적 결합제는 분석하는 단계 동안 ASC, 검출 시약 및 표적을 발현하는 세포와 조합되는 것인, 방법.
- 제60항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 선택 항체는 표적 친화도로 표적에 결합하며, 선택적으로, 표적에 대한 선택 항체의 KD는 약 10-11 M 내지 약 10-9 M인, 방법.
- 제74항에 있어서, 분석하는 단계는 제1 양의, 표적을 발현하는 세포로의 제1 라운드 및 제2 양의, 표적을 발현하는 세포로의 제2 라운드로 수행되고, 여기서 제1 양은 제2 양보다 더 크고, 선택적으로, 분석하는 단계는 제3 양의, 표적을 발현하는 세포로의 제3 라운드에서 추가로 수행되고, 제3 양은 제2 양보다 적으며, 여기서 ASC가 각 라운드에서 표지된 표적에 결합할 경우, ASC는 선택 항체를 생성하는 것인, 방법.
- 제60항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 선택 항체는 표적 및 이의 오르소로그 또는 파라로그에 결합하며, 선택적으로, 표적은 인간 단백질이고 오르소로그는 시노몰구스 원숭이 단백질인, 방법.
- 제76항에 있어서, 세포는 표적 및 이의 오르소로그 또는 파라로그를 발현하는 것인, 방법.
- 제60항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 선택 항체는 표적에 결합하고 이의 오르소로그 또는 파라로그에는 결합하지 않는 것인, 방법.
- 제60항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 선택 항체는 표적의 일부에 결합하는 것인, 방법.
- 제79항에 있어서, 표적은 다수의 도메인을 포함하는 단백질이고 선택 항체는 표적의 단 하나의 도메인에만 결합하고, 표지된 표적은 제2 검출 가능한 표지에 부착된 표적의 세포외 도메인을 포함하고 제2 표지된 표적은 제3 검출 가능한 표지에 부착된 이 하나의 도메인을 포함하는 것인, 방법.
- 제60항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 선택 항체는 표적의 이량체화 또는 다량체화 시 형성된 구조적 에피토프에 결합하고, 표적은 이량체화 도메인 또는 다량체화 도메인을 포함하는 것인, 방법.
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