CN117098839A - 非终末抗体发现方法和单细胞测定 - Google Patents

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Abstract

本文提供了监测非人动物中的选定抗体产生的方法，这些方法包括(a)用免疫原免疫接种非人动物；(b)从所述非人动物中获得包含抗体分泌细胞(ASC)的血液样品；以及(c)单独地测定在该血液样品或其级分中存在的ASC的选定抗体产生。还提供了在非人动物中指导抗体产生以产生选定抗体的方法。在示例性实施例中，该方法包括执行如上所述的(a)至(c)的循环，以及当产生选定抗体的ASC的百分比低于阈值时重复该循环。在各个方面，重复该循环，直到产生选定抗体的ASC的百分比等于或高于阈值。本文进一步提供了单细胞测定。

Description

非终末抗体发现方法和单细胞测定
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年2月5日提交的美国临时申请号63/146,135的优先权，该申请的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
基于针对不同复杂程度的蛋白质靶标的多克隆血清效价，传统的基于动物的抗体发现方法涉及处死动物。虽然一些抗体发现活动具有简单的设计目标(例如，与靶标结合)，但是大多数更为复杂并且需要所需的抗体具有多种特征(例如，交叉反应性、与特定表位结合、以特定的亲和力结合等)。传统的抗体发现方法依赖于询问多克隆分泌的抗体(血清)反应来选择用于B细胞收获和抗体产生的动物。“血清效价”方法不太理想，因为其测量所有分泌抗体(即，其为多克隆混合物)的总反应性，并且不能用于鉴定检测到的抗体的B细胞来源(即，存在与来源B细胞的物理分离和时间分离两者)。表型(抗体效价测量)和基因型(编码抗体的负责的来源B细胞)之间缺乏直接联系使得解释B细胞反应的质量变得困难。除了确定血清中是否存在可溶性抗原特异性抗体之外，很难从这种多克隆分析中获得可以有助于动物选择的另外的有用信息。
此外，传统方法学对于动物而言是终末的，并且因此代表了捕获动物的相关B细胞库的‘一次性’尝试。未能捕获此库可能由技术问题、选择具有次优抗体产生的动物和/或库采样深度的缺乏(即，传统病毒永生化和杂交瘤方法的低效率导致B细胞库的非常小一部分(小于0.1％)的融合)引起，导致宝贵资源的浪费并且迫使使用替代性免疫动物或全新的免疫接种活动。此外，传统方法排除了利用同一动物的免疫系统进化抗体反应的连续方法的可能性。
尽管有这些限制，传统方法仍被广泛使用，部分原因是它们允许捕获免疫库的可接受部分并且提供可以容易地扩展以适应下游测定的可更新的抗体来源。
在越来越多的情况下，这些传统方法太慢而无法满足项目时间表，捕获错误的B细胞群，对B细胞库采样不足，或者不允许实时监测进化的B细胞反应。此外，许多抗体靶标类别(例如，复合膜蛋白、具有最小表位空间的靶标、与直系同源物高度相似的蛋白质等)的挑战性质可能使得由于缺乏强烈的免疫原性而难以提高动物中的B细胞反应。再加上一些抗体设计目标的极端复杂性，产生具有所需免疫谱(即B细胞库)的免疫动物可能是困难的。
鉴于上述情况，需要更有效的抗体发现方法。例如，可以更好地定位传统动物免疫接种的抗体发现方法和成功发现抗体的B细胞方法将大大增强基于动物的抗体发现。
发明内容
首次提供了可用于抗体发现的基本原理、实验方法和数据展示技术。在示例性方面，这些方法涉及直接从活的非人动物的外周血中鉴定抗原特异性抗体。有利地，本文提供的此类方法允许在不需要处死动物的情况下进行抗体发现，这与依赖于动物安乐死随后收获免疫器官(例如，脾、淋巴结和骨髓)的传统方法不同。因为此类方法是非终末的(例如，不涉及产生抗体的动物的安乐死)，这些方法可以在相同动物中重复多次，直到例如获得目的抗体。与传统方法相比，在相同动物中重复该方法的能力具有几个优点。例如，在同一动物中重复该方法降低了抗体发现方法的总成本。此外，由于动物保持存活，本发明披露的方法允许对抗体库进行实时的活体采样，使得如果例如动物不产生表达目的靶抗体的B细胞，则可以基于观察到的B细胞反应(来自先前的免疫接种)对免疫接种方案(用于下一次免疫接种)进行战略性调整。因此，本发明的方法允许合理的库整形(repertoire shaping)和/或对免疫反应进行有目的的引导以匹配抗体设计目标。本披露的示例性方法在图1B-1E中示出。图1B示出了用于监测免疫反应的示例性非终末方法，该示例性非终末方法包括筛选从经免疫接种的动物的血液样品中获得的单细胞。基于单细胞筛选的结果，可以对动物进行重复轮次的免疫接种(例如，替代性免疫接种)，随后对来自从经免疫接种的动物中获得的血液样品的细胞进行单细胞筛选，或者如果该筛选确定动物表现出所需表型，该动物可以经历组织收获。图1C示出了监测选定抗体的产生的示例性非终末方法，其中在单细胞水平上筛选从经免疫接种的动物中获得的血液样品中纯化的抗体分泌细胞(ASC)。重复该方法，直到达到设计目标和/或产生选定抗体。图1D示出了指导抗体产生以产生选定抗体的示例性非终末方法，其中初级策略用于免疫接种动物，并且针对所需表型筛选从经免疫接种的动物中分离的PBMC获得的ASC。如果该筛选确定没有达到设计目标，则用替代性策略(例如，不同于初级策略的策略)对动物进行免疫接种，并且针对所需表型筛选从经免疫接种的动物分离的PBMC获得的ASC。重复该方法，直到筛选确定达到设计目标。当达到设计目标时以及如果达到设计目标，可以使用杂交瘤、单细胞平台或基于序列的发现来收获终末组织用于抗体拯救。图1E示出了筛选动物和B细胞谱分析的示例性非终末方法，其中用免疫原免疫接种一系列动物，并且筛选从获自每只动物的血液样品中获得的ASC并对B细胞库进行谱分析。在示例性方法的各个方面，从经免疫接种的小鼠的外周血中纯化抗体分泌细胞(ASC)，例如浆母细胞，并且然后以单细胞分辨率筛选相关活性或表型。与通常需要约8周并且需要高水平技术技能的传统杂交瘤产生方法(如图1A所示)相比，本披露的方法劳动强度较低并且需要较少的时间。
因此，本披露提供了监测非人动物中选定抗体的产生的方法。在示例性实施例中，该方法包括(a)用免疫原免疫接种非人动物；(b)从所述非人动物中获得包含抗体分泌细胞(ASC)的血液样品；和(c)测定(例如单独地测定)在血液样品或其级分中存在的ASC的选定抗体产生。在各种情况下，该方法进一步包括重复(b)和(c)一次或多次，直到达到设计目标，例如，直到产生选定抗体。图1C示出了本披露的这一示例性方面。本披露还提供了在非人动物中指导抗体产生以产生选定抗体的方法。在示例性实施例中，该方法包括(a)用免疫原对非人动物进行初始免疫接种；(b)从所述非人动物中获得包含ASC的血液样品；(c)测定(例如单独地测定)在血液样品或其级分中存在的ASC的选定抗体产生；和(d)当产生选定抗体的ASC的百分比低于阈值时，执行步骤循环，其中该循环包括(i)当产生选定抗体的ASC的百分比低于阈值时，用免疫原对非人动物进行后续免疫接种，(ii)从所述非人动物中获得包含ASC的血液样品，和(iii)测定(例如，单独地测定)在血液样品或其级分中存在的ASC的选定抗体产生。
在各个方面，该测定包括单细胞活细胞测定。如本文所用，短语“单独地测定ASC”意指在单细胞水平上或以单细胞分辨率测定或检查ASC。在示例性情况下，“单独地测定ASC”提供与单一ASC相关的结果。任选地，同时测定多个ASC。在各个方面，同时单独地测定多个ASC。在示例性方面，以非终末方式从非人动物中获得血液样品，例如，在血液样品采集期间不杀死非人动物。在示例性情况下，该方法包括从非人动物进行非终末抽血。在各种情况下，该方法包括将血液样品或其级分施加到基质，并且将该基质的唯一地址分配给每一ASC。任选地，测定的结果是对产生选定抗体的每一ASC的鉴定。在某些方面，测定的结果是对产生选定抗体的每一ASC的唯一地址的鉴定。在示例性情况下，该方法包括以下各项的至少一个循环：(i)当产生选定抗体的ASC的百分比低于阈值时，用免疫原对非人动物进行后续免疫接种，(ii)从所述非人动物中获得包含ASC的血液样品，(iii)测定(例如，单独地测定)在血液样品或其级分中存在的ASC的选定抗体产生。任选地，重复该循环，直到如(iii)中所测定的，产生选定抗体的ASC的百分比等于或高于阈值。在各种情况下，该循环重复至少两次。
在示例性方面，后续免疫接种的免疫原可以不同于初始免疫接种的免疫原。例如，在示例性方面，每次后续免疫接种与先前免疫接种的不同之处在于：(A)将不同的免疫原、佐剂和/或免疫调节剂施用至非人动物，(B)将不同剂量的免疫原施用至非人动物，(C)免疫原、佐剂、免疫调节剂的每次施用之间的时间不同，和/或(D)免疫原、佐剂、免疫调节剂的每次施用的施用途径不同。任选地，每次免疫接种非人动物时使用不同的免疫原。图1D示出了指导抗体产生以产生选定抗体的示例性方法。
本披露进一步提供了在非人动物中产生选定抗体的方法。在示例性实施例中，该方法包括根据本发明披露的指导抗体产生的方法在非人动物中指导抗体产生以产生选定抗体，并且然后分离选定抗体和/或产生选定抗体的ASC。在示例性实施例中，该方法包括(a)用免疫原对非人动物进行初始免疫接种活动；(b)从所述非人动物中获得包含抗体分泌细胞(ASC)的血液样品；(c)测定(例如单独地测定)在血液样品或其级分中存在的ASC的选定抗体产生；(d)当产生选定抗体的ASC的百分比低于阈值时，执行步骤循环，其中该循环包括(i)当产生选定抗体的ASC的百分比低于阈值时，用免疫原对非人动物进行后续免疫接种，(ii)从所述非人动物中获得包含ASC的血液样品，和(iii)测定(例如，单独地测定)在血液样品或其级分中存在的ASC的选定抗体产生；和(e)分离选定抗体和/或产生选定抗体的ASC。在各个方面，该方法包括(f)确定编码由ASC(例如，产生选定抗体的分离的ASC)产生的选定抗体的重链可变区的核苷酸序列和编码由ASC产生的选定抗体的轻链可变区的核苷酸序列，(g)将包含编码选定抗体的重链可变区的核苷酸序列的第一载体和包含编码选定抗体的轻链可变区的核苷酸序列的第二载体引入宿主细胞中，和(h)分离由宿主细胞产生的抗体。
在示例性方面，本发明披露的方法的测定包括(a)将基质内的ASC与结合选定抗体并在结合选定抗体后产生可检测信号(例如，荧光信号)的试剂组合。在各个方面，本发明披露的方法的测定包括(a)将基质内的ASC与结合至选定抗体的Fc结构域的至少一种试剂以及与选定抗体结合的至少一种试剂(例如，结合至选定抗体的抗原结合结构域的试剂)组合，其中这些试剂中的至少一种附接至可检测标记。在示例性情况下，将ASC与结合至选定抗体的Fc结构域并且包含第一可检测标记的检测试剂以及与选定抗体结合的靶标(例如，结合至选定抗体的抗原结合结构域的试剂)组合。图2A-2C示出了在本发明披露的方法的背景下的示例性测定。在各种情况下，靶标被与第一可检测标记不同的第二可检测标记所标记。在一些情况下，将结合至选定抗体的Fc结构域并且包含固体支持物的捕获试剂进一步与ASC、检测试剂和经标记的靶标组合。在各种情况下，该方法进一步包括(b)测定第一可检测标记和第二可检测标记；和(c)鉴定在基质内检测到该第一可检测标记和该第二可检测标记的位置，其中每个所鉴定位置定位产生选定抗体的单独ASC。图2A和2B示出了用经标记的靶标和捕获试剂进行的这样的示例性测定。图2A将基质作为一个孔示出。图2B将基质作为多笔式芯片(multi-pen chip)或多孔板示出，并且每一ASC被置于单个笔或孔中。在各种情况下，靶标由细胞表达，并且将表达靶标的细胞与ASC和检测试剂组合。在示例性方面，该方法进一步包括(b)测定第一可检测标记；和(c)鉴定在基质内检测到该第一可检测标记的位置，其中每个所鉴定位置定位产生选定抗体的单独ASC。图2C示出了用表达靶标的细胞进行的这样的示例性测定。在示例性情况下，本发明披露的方法的测定包括(a)将基质内的ASC与(i)结合至选定抗体并且包含固体支持物的捕获试剂、(ii)结合至选定抗体并且包含第一可检测标记的检测试剂和(iii)与选定抗体结合的经标记的靶标组合，其中该经标记的靶标包含与第一可检测标记不同的第二可检测标记；(b)测定该第一可检测标记和该第二可检测标记；和(c)鉴定在基质内检测到该第一可检测标记和该第二可检测标记两者的位置，其中每个所鉴定位置定位产生选定抗体的单独ASC。任选地，捕获剂包含结合至与固体支持物附接的抗体Fc结构域的抗体。在示例性情况下，检测剂包含结合至与第一可检测标记附接的抗体Fc结构域的抗体。在各个方面，结合至捕获剂的抗体Fc结构域的抗体与检测剂的抗体相同。在示例性情况下，该组合发生在孔中，并且捕获剂在孔中形成单层。在各个方面，该方法包括鉴定在孔内检测到该第一可检测标记和该第二可检测标记两者的位置，其中每个所鉴定位置定位产生选定抗体的单独ASC。
本披露另外还提供了用于鉴定产生选定抗体的ASC的单细胞测定。本披露提供了测定产生选定抗体的ASC的方法。在示例性实施例中，该测定或方法包括(a)在孔中组合(i)从用免疫原免疫接种的非人动物中获得的血液样品或其级分，其中该血液样品包含ASC，(ii)结合至选定抗体并且包含第一可检测标记的检测试剂，和(iii)与选定抗体结合的靶标，其中(A)该靶标是包含与第一可检测标记不同的第二可检测标记的经标记的靶标，并且在孔中进一步组合结合至选定抗体并且包含固体支持物的捕获试剂以在孔中形成单层，或者(B)该靶标在细胞表面上表达，并且在孔中组合这些细胞以在孔中形成单层；(b)当该靶标是经标记的靶标时，测定第一可检测标记和任选地测定第二可检测标记；和(c)鉴定在孔内检测到第一可检测标记或检测到第一可检测标记和第二可检测标记的位置，其中每个所鉴定位置定位产生选定抗体的单独ASC。在各个方面，该测定或方法包括(a)在孔中组合(i)从用免疫原免疫接种的非人动物中获得的血液样品或其级分，(ii)捕获试剂，该捕获试剂包含结合至与固体支持物附接的抗体Fc的抗体，(iii)检测试剂，该检测试剂包含结合至与第一可检测标记附接的抗体Fc的抗体，和(iv)经标记的靶标，该经标记的靶标包含附接至跟第一可检测标记不同的第二可检测标记的免疫原或其部分，其中该捕获剂在孔中形成单层；(b)测定第一可检测标记；(c)测定第二可检测标记；和(d)鉴定在孔内检测到该第一可检测标记和该第二可检测标记两者的位置，其中每个所鉴定位置定位产生选定抗体的单独ASC。在各个方面，该测定或方法包括(a)在孔中组合(i)从用免疫原免疫接种的非人动物中获得的血液样品或其级分，(ii)结合至选定抗体的检测试剂，和(iii)在细胞表面上表达与选定抗体结合的靶标的细胞，其中在孔中组合这些细胞以在孔中形成单层，(b)测定第一可检测标记；和(c)鉴定在孔内检测到该第一可检测标记和该第二可检测标记两者的位置，其中每个所鉴定位置定位产生选定抗体的单独ASC。
在本发明披露的方法的各个方面，非人动物既不经历一个或多个次级淋巴器官的切除，也不经历安乐死。此外，在各种情况下，来自血液样品的ASC不用于制造杂交瘤。在示例性方面，非人动物是一系列非人动物中的一只，并且测定的结果是对产生选定抗体的ASC的百分比低于阈值和/或需要进一步免疫接种的非人动物的鉴定。在替代性方面，该方法包括当产生选定抗体的ASC的百分比等于或高于阈值时，处死非人动物并且从非人动物中收获组织。在各种情况下，该方法的步骤在一系列非人动物上执行，并且该方法包括对该系列中的每只非人动物的血液样品的B细胞库进行谱分析，并且选择该系列中具有靶B细胞谱的亚组。图1E示出了此类步骤。
合理的免疫库产生和选择是基于动物的抗体发现技术的关键组分。尽管从传统的B细胞永生化发展到直接的B细胞平台，例如(但不限于)NanOBLAST(在纳米流体装置上的抗体发现方法)和微胶囊化，但是输入B细胞的多样性和质量仍然是达到抗体设计目标的重要决定因素。评价免疫动物的传统方法依赖于询问多克隆分泌抗体(血清)来评价免疫反应并选择用于B细胞收获和抗体产生的动物。“血清效价”方法不太理想，因为其测量所有分泌抗体的总反应性，而不是检测到的抗体的单独B细胞来源的质量。抗体效价测量与负责的B细胞来源之间缺乏直接联系使得解释B细胞反应的质量变得困难。除了确定血清中是否存在可溶性抗原特异性抗体之外，很难从这种多克隆分析中获得可以有助于动物选择或免疫引导策略的另外的有用信息。本文提供了使用来源自非终末外周血的样品来询问免疫动物的B细胞反应的ASC测定，其将解决这些挑战。因此，本披露提供了一种筛选非人动物的产生选定抗体的抗体分泌细胞(ASC)的方法。示例性实施例中的方法包括(a)用免疫原免疫接种一系列非人动物；(b)从该系列的每只非人动物中获得包含ASC的血液样品；和(c)单独地测定血液样品或其级分中存在的ASC的选定抗体产生，其中，对于该系列的每只非人动物，确定产生选定抗体的ASC的百分比。在各个方面，筛选方法进一步包括当产生选定抗体的ASC的百分比等于或高于阈值时，选择该一只或多只非人动物进行处死和/或组织收获。在各个方面，筛选方法进一步包括当产生选定抗体的ASC的百分比低于阈值时，选择该一只或多只非人动物进行后续免疫接种。因此，在各种实施例中，筛选方法基于产生选定抗体的ASC的百分比来鉴定要处死的动物与进行后续免疫接种的动物。
与前述描述一致，提供了选择经免疫接种的非人动物进行后续免疫接种的方法。在示例性实施例中，该方法包括根据本发明披露的方法中的任何一种监测非人动物中的选定抗体产生，其中该方法在一系列非人动物上执行，其中对于该系列中的每只非人动物，鉴定产生选定抗体的ASC的数量，并且当动物的产生选定抗体的ASC的百分比低于阈值时，选择该动物进行后续免疫接种。本文还提供了选择经免疫接种的非人动物进行安乐死和次级淋巴收获的方法。在示例性实施例中，该方法包括根据本发明披露的方法中的任何一种监测非人动物中的选定抗体产生，其中该方法在一系列非人动物上执行，其中对于该系列中的每只非人动物，鉴定产生选定抗体的ASC的数量，并且当动物的产生选定抗体的ASC的百分比等于或高于阈值时，选择该动物进行安乐死和次级淋巴收获。
附图说明
图1A是传统转基因小鼠杂交瘤产生方法的图示。图1B是用于监测免疫反应的非终末方法的图示。图1C是监测选定抗体产生的非终末方法的图示。图1D是指导抗体产生以产生选定抗体的非终末方法的图示。图1E是筛选动物和B细胞谱分析的非终末方法的图示。
图2A是用于鉴定产生选定抗体的ASC的示例性单细胞测定的应用的图示。图2B是用于鉴定产生选定抗体的ASC的另一个示例性单细胞测定的图示。图2C是用于鉴定产生选定抗体的ASC的又另一个示例性单细胞测定的图示。
图3是抗体与抗独特位抗体结合的图示。显示了互补位、独特型和独特位。
图4是从用抗体1免疫接种的所示小鼠获得的血清的多克隆效价的图。
图5A是示例性单细胞筛选的组分的图示，并且图5B是单细胞测定的组分在结合抗原的抗体的存在下如何相互作用的图示。图5C是持有分泌抗体的ASC的单独笔与聚苯乙烯珠相互作用以产生荧光“水华”(fluorescent“bloom”)的图示。通过该测定检测IgG分泌和抗原特异性抗体。
图6是持有单个细胞的单独笔上方的双水华、将细胞输出到孔中、以及用于抗体克隆、表达、纯化和分析的PCR分析的图示。
图7A是用于选择适当的抗体对的夹心ELISA形式的图示。图7B是ELISA信号作为抗体1浓度的函数绘制的图。图7C是PD1功能作为抗体浓度的函数绘制的图。
图8A是分泌抗体的ASC位于单个孔中的绿色荧光点的图像。图8B是由ASC分泌的抗原特异性抗体位于单个孔中的红色荧光点的图像。图8C是分泌抗体的ASC位于单个孔中的彩色点、由ASC分泌的抗原特异性抗体位于单个孔中的点和分泌抗原特异性抗体的ASC位于单个孔中的点的图像。图8D是用多个荧光点标记的转染细胞的示例性图像，在这些荧光点上，由293T细胞表达的抗原结合由B细胞产生并且用标记有Alexa 488的山羊抗人Fc抗体标记的抗体。
图9是所示杂交瘤克隆(或不相关克隆)的单细胞与代表抗体分泌的绿色通道(顶部)或代表抗原(EGFR)结合的红色通道(底部)的RFU的一系列图像。
图10是RFU绿色/RFU红色的比率作为杂交瘤的KD的函数绘制的图。
图11是在所有小鼠中使用的免疫接种方案的示意图。指出了放血和抗原转换的时间。
图12是第1组和第2组小鼠第一次放血的血清效价的图。该图绘制了人抗原效价与食蟹猴抗原效价。
图13是单细胞与代表人抗原结合的红色通道(左)、代表食蟹猴抗原结合的绿色通道(中)以及代表人抗原和食蟹猴抗原结合的复合通道(右)的RFU的一系列图像。从放血1获得的血清的数据。
图14是仅对人抗原、仅对食蟹猴抗原或同时对人和食蟹猴抗原反应的第1组(实心圆)和第2组(空心圆)小鼠抗原阳性ASC的百分比的图。通过单细胞Incucyte筛选获得的来自放血1的细胞的数据。
图15是仅对人抗原、仅对食蟹猴抗原或同时对人和食蟹猴抗原反应的第1组(实心圆)和第2组(空心圆)抗原阳性ASC的百分比的图。通过单细胞Incucyte筛选获得的来自放血2的细胞的数据。
图16是仅对人抗原、仅对食蟹猴抗原或同时对人和食蟹猴抗原反应的第1A组(人加强)和第1B组(食蟹猴加强)抗原阳性ASC的百分比的图。来自放血2的细胞的数据以实心圆显示，并且来自放血3的细胞的数据以空心方形显示。通过单细胞Incucyte筛选获得的数据。
图17是第1A组(人加强)和第1B组(食蟹猴加强)的交叉反应性ASC频率(相对于放血1)的变化的图。通过单细胞Incucyte筛选获得的数据。
图18是对食蟹猴抗原反应的血清效价作为对人抗原反应的血清效价的函数绘制的图。记录了交叉反应性ASC的百分比。选择进行收获的目的动物以红色圈起来。
图19是免疫引导至产生与多结构域蛋白质(抗原)的人和食蟹猴亚结构域直系同源物结合的人-食蟹猴交叉反应性抗体的免疫接种活动的示意图。
图20是对食蟹猴抗原反应的血清效价作为对人抗原反应的血清效价的函数绘制的图。来自放血1的血清。
图21是在t＝0小时(底部)和t＝23小时(顶部)时单细胞与仅人结合物、仅食蟹猴结合物和人/食蟹猴交叉反应性结合物的绿色通道和红色通道RFU的一系列图像。使用单细胞Incucyte筛选从放血1获得的血清的数据。
图22是仅对人抗原、仅对食蟹猴抗原或同时对人和食蟹猴抗原反应的抗原阳性ASC的百分比的图。显示了来自放血1的细胞的数据。通过单细胞Incucyte筛选获得的数据。
图23是来自放血1和放血3的血清中交叉反应性ASC频率(相对于不相关克隆)的变化的图。
图24是在放血1和放血3处分泌仅对食蟹猴抗原(实心圆)或对食蟹猴和人抗原两者(空心方形)反应的抗体的ASC的百分比的图。通过单细胞Incucyte筛选获得的数据。
图25是人-食蟹猴交叉反应性结合物的百分比的图。选择进行收获的目的动物以方形记录。通过单细胞Incucyte筛选获得的数据。
具体实施方式
B细胞功能以及非终末监测和引导抗体产生
最近在次级淋巴器官(例如，脾和淋巴结)的生发中心(GC)中遇到抗原的抗原特异性B细胞被刺激分裂并致力于向多条途径分化。参见例如Klein和Dalla-Favera,NatureReviews Immunol[自然评论-免疫学]8:22-33(2008)。负责响应于抗原激发而分泌抗体到血清中的主要B细胞谱系是浆细胞。浆细胞分化开始于次级淋巴器官，其中GC内的细胞间相互作用迫使在其表面上表达对抗原具有特异性的抗体的B细胞分化为称为浆母细胞的未成熟浆细胞。浆母细胞快速分裂产生和分泌可溶性抗体的B细胞。然而，浆母细胞本质上是短暂的，并且需要大量的营养支持才能存活并继续增殖。浆母细胞的主要存活小生境(niche)是在次级淋巴器官中，但这些队列是临时的并且取决于同源抗原的存在。
B细胞使用两种主要策略来维持对抗原的长期体液记忆：IgG+记忆B细胞的形成和长寿的成熟浆细胞的形成。记忆B细胞表达其同源抗体的细胞表面结合版本，称为B细胞受体(BCR)，但不分泌可溶性抗体。这些细胞驻留在全身多个部位，并且在次级淋巴器官中丰度很高。当再次遇到抗原时，记忆B细胞可以被诱导增殖(即产生它们自身的克隆)并分化为分泌抗体的浆细胞。另一种通往长期记忆的途径是经由形成长寿的成熟浆细胞。成熟浆细胞需要非常特殊的生存小生境来提供营养支持，并且可以在发炎的组织内、在与肠道相关的特殊结构(肠道相关淋巴组织-GALT)中和在骨髓内找到。参见例如Fairfax等人,SeminImmunol[免疫学研讨文辑]20(1):49-58(2008)。由小生境基质细胞创造的局部环境为维持终末分化的浆细胞的寿命提供了必要的信号。
为了让B细胞驻留在长期基质小生境中，它们必须经由血液迁移到这些目的地。事实上，在暴露于GC中的抗原、分化为浆母细胞并随后在次级淋巴器官中增殖之后，可以在循环中检测到迁移性浆细胞的波。在小鼠中，血液中浆母细胞的这种激增出现在抗原暴露后3-7天，并且随着时间的推移而下降，因为它们回到了它们适当的小生境并分化为长寿的浆细胞。
本文提供了方法，这些方法涉及当抗原最近刺激的浆母细胞和浆细胞(抗体分泌细胞，(ASC))通过血液迁移时捕获它们、以及鉴定产生目的抗体(例如，选定抗体)的那些细胞。因为本披露的方法利用血液样品，并且血液的细胞环境本质上不如次级淋巴器官的细胞环境复杂，特别是从B细胞谱系的角度来看，所以本披露的方法有利的是不太复杂。本披露的方法解决了获得这种ASC群体的困难，由于ASC群体相对较低的总体丰度，这在历史上一直是困难的。
因此，本披露提供了监测非人动物中选定抗体的产生的方法。在示例性实施例中，该方法包括(a)用免疫原免疫接种非人动物；(b)从所述非人动物中获得包含抗体分泌细胞(ASC)的血液样品；和(c)测定(任选地，单独地测定)在血液样品或其级分中存在的ASC的选定抗体产生。本披露还提供了在非人动物中指导抗体产生以产生选定抗体的方法。在示例性实施例中，该方法包括(a)用免疫原对非人动物进行初始免疫接种活动；(b)从所述非人动物中获得包含抗体分泌细胞(ASC)的血液样品；(c)测定(任选地，单独地测定)在血液样品或其级分中存在的ASC的选定抗体产生；和(d)当产生选定抗体的ASC的百分比低于阈值时，执行步骤循环，其中该循环包括(i)当产生选定抗体的ASC的百分比低于阈值时，用免疫原对非人动物进行后续免疫接种，(ii)从所述非人动物中获得包含ASC的血液样品，和(iii)单独地测定在血液样品或其级分中存在的ASC的选定抗体产生。在示例性方面，阈值为约1％至约10％，例如约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％。在示例性方面，阈值为10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。在替代性方面，阈值为大于50％，例如55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高。
在此类方法的示例性方面，非人动物既不经历安乐死，也不经历一个或多个次级淋巴器官的切除，或者仅在动物已被认为拥有足够数量的产生目的抗体(例如，选定抗体)的ASC之后，才对动物实施安乐死并且收获次级淋巴器官。在示例性方面，用一系列非人动物来执行这些方法。在各种情况下，测定的结果是对该系列中产生选定抗体的ASC的百分比低于阈值和/或需要进一步免疫接种的一只或多只非人动物的鉴定。然后可以对此类非人动物进行步骤循环((d)，上文)以便例如增加选定抗体的产生。
在替代性情况下，测定的结果是对该系列中产生选定抗体的ASC的百分比等于或高于阈值的一只或多只非人动物的鉴定。然后可以处死此类非人动物，并且从此类非人动物中收获组织。在替代性方面，当产生选定抗体的ASC相对于所测定的ASC总数的百分比等于或高于阈值时，该方法包括处死非人动物并且从该非人动物收获组织。
因此，本发明披露的监测和指导或引导选定抗体产生的方法是高效的，因为更少的动物(例如，产生选定抗体的ASC的百分比低于阈值的那些动物)被不必要地杀死，并且更大百分比的经免疫接种的动物最终产生选定抗体。此外，在各种情况下，此类本发明披露的方法不包括产生杂交瘤，并且因此有利地时间和材料消耗更少。
免疫接种
在本披露的各个方面，该方法包括用免疫原免疫接种非人动物。如本文所用，术语“免疫接种”是指进行或执行“免疫接种活动”或“免疫接种方案”或“活动”以发起针对所述免疫原的免疫反应。在示例性方面，免疫反应包括针对所述免疫原的B细胞免疫反应和/或体液免疫反应。在示例性方面，在非人动物中发起的免疫反应包括产生抗体分泌细胞(ASC)，例如，分泌抗体的浆细胞、浆母细胞、浆细胞(例如，产生和分泌高水平的可溶性抗体的快速分裂的B细胞)。在各种情况下，免疫反应包括通过血液迁移到次级淋巴器官的迁移性ASC(例如，浆细胞、浆母细胞)。在各个方面，次级淋巴器官是淋巴结(例如，腘窝、腹股沟、肠系膜和臂淋巴结)、脾、派伊尔氏斑(Peyer’s patch)或粘膜组织。在示例性情况下，在抗原暴露后约1-7天产生ASC。任选地，在抗原暴露后约3天至约7天(例如，约3天、约4天、约5天、约6天、约7天)在血液中发现ASC，例如迁移性浆母细胞。在一些情况下，在抗原暴露后约8天、约9天或约10天在血液中发现ASC，例如迁移性浆母细胞。
本领域中已知用于免疫接种非人动物的合适技术。参见例如Goding,MonoclonalAntibodies:Principles and Practice[单克隆抗体：原理与实践],第3版，学术出版社有限公司(Academic Press Limited)，加利福利亚州圣地亚哥(San Diego,CA)，1996年。在例如Barry等人,Biotechniques[生物技术].16(4):616-8,620(1994)；Tang等人,Nature[自然].12；356(6365):152-4(1992)；Bergmann-Leitner和Leitner,Methods Mol Biol[分子生物学方法]1325:289-302(2015)；Aravindaram和Yang,Methods Mol Biol[分子生物学方法]542:167-178(2009)；Johnston和Tang,Methods Cell Biol[细胞生物学方法]43PtA:353-365(1994)；以及Dileo等人,Human Gene Ther[人类基因疗法]14(1):79-87(2003)中所描述的基因枪方法也可以用于免疫接种非人动物。此外，如本文所举例说明，免疫接种可以包括向非人动物施用表达抗原的细胞或施用负载抗原的树突状细胞、肿瘤细胞疫苗或基于免疫细胞的疫苗。参见例如Sabado等人,Cell Res[细胞研究]27(1):74-95(2017)；Bot等人,“Cancer Vaccines[癌症疫苗]”，载于：Plotkin’s Vaccines [普洛特金的疫苗学],第7版,编辑：Plotkin等人，爱思唯尔公司(Elsevier Inc.)，2018年；以及Lee和Dy，“TheCurrent Status of Immunotherapy in Thoraic Malignancies[胸部恶性肿瘤中免疫疗法的现状]”，载于Immune Checkpoint Inhibitors in Cancer [癌症中的免疫检查点抑制 剂]，编辑：Ito和Ernstoff，爱思唯尔公司，2019年。在各种情况下，可以通过微针递送(参见例如Song等人,Clin Vaccine Immunol[临床及疫苗免疫学]17(9):1381-1389(2010))；用病毒样颗粒(VLP)(参见例如Temchura等人,Viruses[病毒]6(8):3334-3347(2014))；或者通过本领域已知的任何手段来执行免疫接种。参见例如Shakya等人,Vaccine[疫苗]33(33):4060-4064(2015)以及Cai等人,Vaccine[疫苗]31(9):1353-1356(2013)。Chen和Murawsky,Front Immunol[免疫学前沿]9:460(2018)中描述了用于免疫接种和免疫原制备的另外的策略，包括例如将T细胞表位添加到抗原中。
在各个方面，该方法包括用免疫原免疫接种非人动物，并且将所述免疫原施用至非人动物一次或多次(例如，2次、3次、4次、5次或更多次)。在各个方面，免疫原通过注射施用，例如腹膜内、皮下、肌内、皮内或静脉内施用。在各个方面，该方法包括通过施用一系列免疫原注射来免疫接种非人动物。在示例性方面，每次施用(例如，注射)间隔约10天至约18天(任选地间隔约12天至约16天、或间隔约14天)给予至非人动物。在示例性方面，每次施用(例如，注射)比间隔约10天至约18天更频繁地给予至非人动物。例如，在示例性方面，在向非人动物施用免疫原之间的时间为间隔约1天至约9天，任选地约1天至约8天、约1天至约7天、约1天至约6天、约1天至约5天、约1天至约4天、约1天至约3天、约1天至约2天、约2天至约9天、约3天至约9天、约4天至约9天、约5天至约9天、约6天至约9天、约7天至约9天、约8天至约9天、约4天至约8天、约4天至约8天、或约6天至约8天。在各个方面，在向非人动物施用免疫原之间的时间可以更长。例如，在向非人动物施用免疫原之间的时间可以为约1周至约20周或更长时间，例如约1个月至约20个月。任选地，在向非人动物施用免疫原之间的时间为约1周至约19周、约1周至约18周、约1周至约17周、约1周至约16周、约1周至约15周、约1周至约14周、约1周至约13周、约1周至约12周、约1周至约11周、约1周至约10周、约1周至约9周、约1周至约8周、约1周至约7周、约1周至约6周、约1周至约5周、约1周至约4周、约1周至约3周、约1周至约2周、约2周至约20周、约3周至约20周、约4周至约20周、约5周至约20周、约6周至约20周、约7周至约20周、约8周至约20周、约9周至约20周、约10周至约20周、约11周至约20周、约12周至约20周、约13周至约20周、约14周至约20周、约15周至约20周、约16周至约20周、约17周至约20周、约18周至约20周、或约19周至约20周。在各个方面，在施用免疫原之间的时间可以长于8天或9天。任选地，在施用免疫原之间的时间为约1个月至约8个月、约1个月至约7个月、约1个月至约6个月、约1个月至约5个月、约1个月至约4个月、约1个月至约3个月、约1个月至约2个月、约2个月至约9个月、约3个月至约9个月、约4个月至约9个月、约5个月至约9个月、约6个月至约9个月、约7个月至约9个月、约8个月至约9个月、约4个月至约8个月、约4个月至约8个月或约6个月至约8个月。
在各种情况下，在免疫接种期间，免疫原的每次施用(例如，注射)用(A)相同的免疫原、佐剂、免疫调节剂或其组合，(B)相同量或剂量的免疫原、佐剂、免疫调节剂或其组合，(C)相同的递送免疫原的施用途径或方法，(D)在非人动物上的相同施用部位，或(E)其组合来执行。可替代地，在免疫接种期间免疫原的一次或多次施用(例如，注射)(A)不同的免疫原、佐剂、免疫调节剂或其组合，(B)不同量或剂量的免疫原、佐剂、免疫调节剂或其组合，(C)不同的递送免疫原的施用途径或方法，(D)在非人动物上的不同施用部位，或(E)其组合来进行。任选地，免疫原的量随着后续施用(例如，注射)而减少或增加。在一些方面，相对于第一次注射和第三次注射，每一次其他施用(例如，注射)包括减少量或增加量的免疫原。本文提供的实例中描述了示例性免疫接种。
非人动物
有利地，本发明披露的方法不限于任何特定的非人动物。在示例性方面，非人动物是任何非人哺乳动物。在示例性方面，非人动物是哺乳动物，包括(但不限于)啮齿目(Rodentia)哺乳动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠、沙鼠和仓鼠；和兔目哺乳动物，例如兔；来自食肉目的哺乳动物，包括猫科动物(猫)和犬科动物(犬)；来自偶蹄目的哺乳动物，包括牛科动物(奶牛)和猪科动物(猪)；或奇蹄目，包括马科动物(马)。在一些方面，非人哺乳动物属于灵长目(Primates)、阔鼻小目(Ceboid)或猴目(Simoid)(猴)或类人猿目(Anthropoids)(猿类)。在各个方面，非人动物是山羊、美洲驼、羊驼、鸡、鸭、鱼(例如，鲑鱼)、绵羊或公羊。
在示例性情况下，本发明披露的方法中使用的非人动物被修饰(例如，遗传修饰)，使得它们产生嵌合或全人抗体。此类非人动物被称为转基因动物。在Bruggemann等人,ArchImmunol Ther Exp(Warsz)[免疫学与治疗实验档案(Warsz)]63(2):101-108(2015)中描述了转基因动物中人抗体的产生。任何转基因动物都可以用于本发明，包括但不限于转基因鸡(例如，)、转基因大鼠(例如，/>)、转基因美洲驼和转基因牛(例如，Tc BovineTM)。在特定的实施例中，非人动物是转基因小鼠，例如/>Alloy小鼠、Trianni小鼠、/>和/>是一种产生全人抗体的转基因小鼠的品系。Foltz等人,Immunol Rev[免疫学评论]270(1):51-64(2016)和美国专利号5,939,598提供了/>的综述。在示例性方面，非人动物是转基因大鼠。在各个方面，转基因大鼠是/>或/>其分别描述于Clarke等人,Front Immunol[免疫学前沿]9:3037(2019)；doi:10.3389/fimmu.2018.03037以及Harris等人,Front Immunol[免疫学前沿]9:889(2018):doi:10.3389/fimmu.2018.00889中。
在示例性情况下，本披露的方法对于非人动物而言是非终末的。如本文所用，在非人动物的上下文中，术语“非终末的”意味着在执行该方法的同时，非人动物的生命没有被终止(例如，没有被实施安乐死或以其他方式被杀死或处死)。在示例性方面，非人动物既不经历一个或多个次级淋巴器官的切除，也不经历安乐死，尽管本发明确实允许对此类器官(例如，脾)进行诸如活检等程序。
免疫原
有利地，本发明披露的方法不限于任何特定的免疫原。在各个方面，免疫原可以是任何抗原，任选地蛋白质或其片段、融合物或变体。在各种情况下，免疫原是细胞因子、淋巴因子、激素、生长因子、细胞外基质蛋白、肿瘤相关抗原、肿瘤相关抗原、检查点抑制剂分子、细胞表面受体或其配体。出于仅说明示例性免疫原的目的，用于免疫接种非人动物的免疫原可以是与以下抗体中的任一种所结合的靶标或抗原：莫罗单抗-CD3(以商品名Orthoclone上市的产品)、阿昔单抗(以商品名/>上市的产品)、利妥昔单抗(以商品名/>上市的产品)、巴利昔单抗(以商品名/>上市的产品)、达利珠单抗(以商品名/>上市的产品)、帕立珠单抗(以商品名上市的产品)、英利昔单抗(以商品名/>上市的产品)、曲妥珠单抗(以商品名/>上市的产品)、阿仑单抗(以商品名/>上市的产品)、阿达木单抗(以商品名/>上市的产品)、托西莫单抗-I131(以商品名上市的产品)、依法珠单抗(以商品名/>上市的产品)、西妥昔单抗(以商品名/>上市的产品)、替伊莫单抗(以商品名/>上市的产品)、奥马珠单抗(以商品名/>上市的产品)、贝伐单抗(以商品名/>上市的产品)、那他珠单抗(以商品名/>上市的产品)、兰尼单抗(以商品名/>上市的产品)、帕尼单抗(以商品名/>上市的产品)、依库丽单抗(以商品名/>上市的产品)、培戈-瑟托利珠单抗(以商品名/>上市的产品)、戈利木单抗(以商品名/>上市的产品)、康纳单抗(以商品名/>上市的产品)、卡托索单抗(以商品名/>上市的产品)、优特克单抗(以商品名/>上市的产品)、托珠单抗(以商品名上市的产品)、奥法木单抗(以商品名/>上市的产品)、地诺单抗(以商品名/>上市的产品)、贝利单抗(以商品名/>上市的产品)、雷昔库单抗、伊匹单抗(以商品名/>上市的产品)、帕妥珠单抗(以商品名/>上市的产品)。在示例性实施例中，抗体是以下中的一种：抗TNFα抗体，例如阿达木单抗、英利昔单抗、依那西普、戈利木单抗和培戈-瑟托利珠单抗；抗IL1β抗体，例如康纳单抗；抗IL12/23(p40)抗体，例如优特克单抗和布瑞吉努单抗；以及抗IL2R抗体，例如达利珠单抗。
制备用于免疫接种步骤中的免疫原的方法是本领域已知的。参见例如Fuller等人,Curr Protoc Mol Biol[现代分子生物学协议],第11章,第11.4单元,(2001)；Monoclonal Antibodies:Methods and Protocols[单克隆抗体：方法和协议]，第2版，Ossipow等人(编辑),胡马纳出版社(Humana Press)2014年。在各种情况下，在施用至非人动物之前将免疫原与佐剂或其他溶液混合。许多佐剂是本领域已知的，并且在示例性情况下包括油、明矾、铝盐或脂多糖。在各个方面，佐剂是无机的。在替代性方面，佐剂是有机的。在各个方面，佐剂包括：明矾、铝盐(例如，磷酸铝、氢氧化铝)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、RIBI佐剂体系(RAS)、脂质A、Sigma Adjuvant 经典、Gold、Montanide疫苗佐剂(例如，Montanide 103、Montanide ISA 720、Montanide不完全Seppic佐剂、Montanide ISA51)、AF03佐剂、AS03佐剂、Specol、SPT、纳米乳剂、VSA3、油基或脂基溶液(例如，角鲨烯、/>QS21、皂苷、单磷酸脂质A(MPL))、海藻糖二棒杆菌分枝菌酸酯(trehalose dicorynomycolate，TDM)、sTDM佐剂、病毒体和PRR配体。参见例如“Vaccine Adjuvants Review[疫苗佐剂综述]”(网址https://www.invivogen.com/review-vaccine-adjuvants)；以及“佐剂在抗体生产中的作用(Roleof Adjuvants in Antibody Production)”，The Protein Man’s Blog:A Discussion ofProtein Research[蛋白质人博客：关于蛋白质研究的讨论]，发表于2016年6月2日，网址https://info.gbiosciences.com/blog/role-of-adjuvants-in-antibody-producti on。在各种情况下，佐剂包括表面活性物质，例如溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇类(pluronicpolyol)、聚阴离子、肽、油乳液、钥孔血蓝蛋白和二硝基苯酚。BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。
血液样品及其级分
在非人动物免疫接种后，从所述经免疫接种的非人动物中获得包含抗体分泌细胞(ASC)的血液样品。ASC是体液免疫反应的终末分化细胞；ASC从淋巴结中激活的B细胞分化而来，并且在血液中短暂循环。在示例性方面，以非终末方式从非人动物中获得血液样品，例如，在血液样品采集期间不杀死非人动物。在示例性实例中，该方法包括从非人动物进行非终末抽血。在示例性方面，血液样品在非人动物被免疫接种后约1天至约2天从非人动物中获得。在各种情况下，在免疫接种后约3天至约7天(例如，3天、4天、5天、6天或7天)从非人动物中获得血液样品。如果在免疫接种期间给予多于一次免疫原施用，在一些方面，在最后一次施用免疫原后约3天至约7天从动物中获得血液样品。在各个方面，在免疫接种非人动物后约8天至约12天从非人动物中获得血液样品，但是在一些方面，预计所述血液样品中存在较少的ASC。
在示例性方面，血液样品包含外周血单核细胞(PBMC)。任选地，血液样品包含B淋巴细胞，也称为B细胞。在各种情况下，血液样品包含血浆谱系、浆细胞和/或浆母细胞(例如，迁移性浆母细胞)的ASC。在各个方面，ASC是CD138+B细胞。任选地，ASC包含迁移性浆母细胞。
可以采集的血液样品的体积取决于非人动物。在各种情况下，从非人动物中获得的血液样品为小于1L、500mL或100mL，任选地小于约50mL、小于约25mL、小于约15mL或10mL、小于或约5mL(例如，约4mL、3mL、2mL、1mL或更少)。在一些情况下，从非人动物中获得的血液样品为约1L、500mL或100mL，任选地小于约50mL、小于约25mL、小于约15mL或10mL、小于或约5mL(例如，约4mL、3mL、2mL、1mL或更少)。在一些情况下，从非人动物中获得500μL或更少的血液。在非人动物是小鼠的实施例中，所获得的血液样品为小于200μL、190μL、180μL、170μL、160μL、150μL、140μL、130μL、120μL、110μL、100μL、90μL、80μL、70μL、60μL、50μL、40μL、30μL、20μL、10μL、5μL、4μL、3μL、2μL或1μL。在非人动物是小鼠的其他实施例中，所获得的血液样品为约200μL、190μL、180μL、170μL、160μL、150μL、140μL、130μL、120μL、110μL、100μL、90μL、80μL、70μL、60μL、50μL、40μL、30μL、20μL、10μL、5μL、4μL、3μL、2μL或1μL。在示例性情况下，从非人动物中获得的血液样品小于或为约500μL。任选地，血液样品的体积为约100μL至约250μL。在各种情况下，血液样品的体积为动物中循环的血液总量的不超过10％。在各个方面，血液样品的体积不超过在动物中循环的血液体积的10％。在示例性方面，采集动物血液总体积的不超过约10％。在各种情况下，血液样品的体积为动物中循环的血液体积的约9％或更少、约8％或更少、约7％或更少、约6％或更少、或约5％或更少。在各种情况下，血液样品代表不超过10％的动物体重。在各个方面，血液样品为动物体重的不超过9％、不超过8％或不超过7％。
在示例性方面，在从非人动物中获得血液样品之后，对血液样品进行处理，例如富集或分级。在各种情况下，该方法包括通过例如从血液样品中耗尽红细胞、血浆和/或血小板来富集血液样品中的ASC。在某些方面，该方法包括使用抗IgM抗体去除包含细胞表面IgM的B细胞的耗尽步骤。在示例性情况下，该方法包括执行选择步骤，其中细胞表达鉴定目的特定B细胞群的一种或多种细胞表面标记。在一些方面，细胞表面标记是CD138、CD19、B220、IgG、TACI、SLAM7、BCMA、CD98、SCA-1、Ly6C1/2等。在其中需要PBMC衍生的B细胞的情况下，该方法包括选择CD138阳性细胞。在示例性方面，该方法包括在测定之前去除从非人动物中获得的血液样品的一种或多种组分。任选地，从血液样品中去除红细胞、血浆和/或血小板。在一些方面，通过选择CD138+细胞来制备血液样品的级分。
单细胞测定
在本发明披露的方法的各个方面，单独地测定血液样品或其级分中存在的ASC的选定抗体产生。在各种情况下，测定包括单细胞测定，其中分析一个或多个单独的细胞。在各种情况下，测定包括活细胞测定，其中分析一个或多个活细胞。在示例性方面，同时测定从经免疫接种的非人动物中获得的血液样品中存在的多个细胞，例如ASC。在示例性方面，经由单细胞活细胞测定同时测定大于约10个、大于约100个、大于约500个、大于约1000个、大于约2000个、大于约3000个、大于约4000个、大于约5000个、大于约6000个、大于约7000个、大于约8000个、大于约9000个或大于约10,000个ASC。
在各种情况下，该方法包括将血液样品或其级分施加到基质，并且将该基质的唯一地址分配给每一ASC。基质可以是二维的，其中该基质的每个唯一地址根据沿着水平(X)和垂直(Y)轴的位置来定义，或者基质是包括例如多孔泡沫、凝胶或聚合物的三维基质，其中该基质的每个唯一地址根据沿着宽度(X)、高度(Y)和深度(Z)轴的位置来定义。在各个方面，测定的结果是对产生选定抗体的每一ASC的鉴定，并且在某些方面，结果是对产生选定抗体的每一ASC的唯一地址的鉴定。
在示例性方面，本发明披露的方法的测定包括(a)将基质内的ASC与结合选定抗体并在结合选定抗体后产生可检测信号(例如，荧光信号)的试剂组合。在各个方面，本发明披露的方法的测定包括(a)将基质内的ASC与结合至选定抗体的Fc结构域的至少一种试剂以及与选定抗体结合的至少一种试剂(例如，结合至选定抗体的抗原结合结构域的试剂)组合，其中这些试剂中的至少一种附接至可检测标记。在示例性情况下，将ASC与结合至选定抗体的Fc结构域并且包含第一可检测标记的检测试剂以及与选定抗体结合的靶标(例如，结合至选定抗体的抗原结合结构域的试剂)组合。在各种情况下，靶标由细胞表达，并且将表达靶标的细胞与ASC和检测试剂组合。在示例性方面，该方法进一步包括(b)测定第一可检测标记；和(c)鉴定在基质内检测到该第一可检测标记的位置，其中每个所鉴定位置定位产生选定抗体的单独ASC。
在示例性情况下，本发明披露的方法的测定包括(a)将基质内的ASC与(i)结合至选定抗体并且包含固体支持物的捕获试剂、(ii)结合至选定抗体并且包含第一可检测标记的检测试剂和(iii)与选定抗体结合的经标记的靶标组合，其中该经标记的靶标包含与第一可检测标记不同的第二可检测标记；(b)测定该第一可检测标记和该第二可检测标记；和(c)鉴定在基质内检测到该第一可检测标记和该第二可检测标记两者的位置，其中每个所鉴定位置定位产生选定抗体的单独ASC。任选地，捕获剂包含结合至与固体支持物附接的抗体Fc结构域的抗体。固体支持物可以是锚定抗Fc结构域抗体和该抗Fc结构域抗体所结合的抗体的任何固体支持性材料，例如聚合物珠、膜、载玻片、孔底等。在示例性情况下，检测剂包含结合至与第一可检测标记附接的抗体Fc结构域的抗体。在各个方面，结合至捕获剂的抗体Fc结构域的抗体与检测剂的抗体相同，但是捕获试剂的抗Fc抗体没有附接到可检测标记上，并且检测试剂的抗体没有附着到固体支持物上。
在示例性情况下，该组合发生在孔中，并且捕获剂在孔中形成单层。在各个方面，该方法包括鉴定在孔内检测到该第一可检测标记和该第二可检测标记两者的位置，其中每个所鉴定位置定位产生选定抗体的单独ASC。
在示例性情况下，组合发生在微流体室或纳米流体室、微孔装置或纳米孔装置、微毛细管或纳米毛细管、或纳米流体芯片的纳米笔中。在示例性情况下，组合发生在纳米流体芯片的纳米笔中。在示例性情况下，该方法包括鉴定在纳米流体芯片内检测到第一可检测标记和第二可检测标记的每个笔的位置，其中每个所鉴定位置定位产生选定抗体的单独ASC。任选地，血液样品的单一ASC通过光电定位(OEP)被移动到纳米流体芯片的笔中。此类技术在Winters等人,MAbs[单克隆抗体]11(6):1025-1035(2016)中进行了描述。
最近在次级淋巴器官(例如，脾和淋巴结)的生发中心(GC)中遇到抗原的抗原特异性B细胞被刺激分裂并致力于向多条途径分化。负责响应于抗原激发而分泌抗体到血清中的主要B细胞谱系是浆细胞。浆细胞分化开始于次级淋巴器官，其中GC内的细胞间相互作用迫使在其表面上表达对抗原具有特异性的抗体的B细胞分化为称为浆母细胞的未成熟浆细胞。浆母细胞快速分裂产生和分泌高水平的可溶性抗体的B细胞。在暴露于GC中的抗原、分化为浆母细胞并随后增殖之后，可以在循环中检测到迁移性浆细胞的波。在小鼠中，血液中的浆母细胞出现在抗原暴露后3-7天，并且随着时间的推移而下降，因为它们回到了它们适当的小生境并分化为长寿的浆细胞。最近刺激的抗原特异性浆母细胞通过血液的迁移可以用于在单细胞水平上而不是通过多克隆血清效价进行询问来评价动物的免疫反应和特征。在示例性实施例中，从小鼠采集非终末抽血，洗涤以去除血浆和可溶性抗体，并且直接测定外周血单核细胞(PBMC)的ASC。添加小抗体捕获珠来捕获和定位来自ASC的分泌抗体，从而使得能够在单细胞水平上进行表征。红细胞(RBC)污染物会干扰荧光斑块形成，并且可以通过将测定稀释到更高的体积来减轻。然而，这导致更高的铺板体积和更低的测定通量。可替代地，可以直接去除RBC，或者可以在铺板前从血液样品中分离所需的细胞，从而减少铺板体积并增加测定通量。合适的方法包括但不限于RBC裂解、密度梯度离心(例如，HetaSep、)和使用阴性选择(例如，抗小鼠TER119RBC耗尽)或阳性选择(例如，小鼠CD138+分离)细胞分离试剂盒，使用或不使用自动洗涤仪器(例如，Curiox Laminar WashTM)。也可以使用表达目的靶标的细胞来代替珠。此类技术可以用于研究在小鼠中产生物种反应性抗体的策略。
在示例性实施例中，可以通过用人和食蟹猴版本的抗原的交替加强免疫接种动物来产生人-食蟹猴交叉反应性抗体。使用来自经免疫接种的动物的多克隆血清，使用简单的结合测定可以容易地监测对每种抗原的反应性。然而，由于已经用两种抗原免疫接种动物，并且单独的抗原包含共同和独特的表位两者，所以多克隆血清将含有对两种类型的表位均有反应的抗体。不幸的是，人们不能仅从此分析中确定，观察到的对两种抗原的血清反应性是由于真正的交叉反应性抗体，还是来源于对任一种单独的抗原具有特异性的多种抗体。然而，使用源自PBMC群体的ASC询问B细胞反应通过以下方式克服了这个问题：定位和筛选来自该单细胞的抗体特异性，这然后可以指导进一步的免疫库整形或用于抗体发现的动物选择。免疫库整形可以包括对免疫接种策略的修改，例如(但不限于)转换到不同形式的免疫原、佐剂、免疫调节剂、抗原剂量、免疫接种的时间和施用途径。
因此，本披露另外还提供了用于鉴定产生选定抗体的ASC的单细胞测定。本披露提供了测定产生选定抗体的ASC的方法。在示例性实施例中，该测定或方法包括(a)在孔中组合(i)从用免疫原免疫接种的非人动物中获得的血液样品或其级分，其中该血液样品包含ASC，(ii)结合至选定抗体并且包含第一可检测标记的检测试剂，和(iii)与选定抗体结合的靶标，其中(A)该靶标是包含与第一可检测标记不同的第二可检测标记的经标记的靶标，并且在孔中进一步组合结合至选定抗体并且包含固体支持物的捕获试剂以在孔中形成单层，或者(B)该靶标在细胞表面上表达，并且在孔中组合这些细胞以在孔中形成单层；(b)当该靶标是经标记的靶标时，测定第一可检测标记和任选地测定第二可检测标记；和(c)鉴定在孔内检测到第一可检测标记或检测到第一可检测标记和第二可检测标记的位置，其中每个所鉴定位置定位产生选定抗体的单独ASC。
在各个方面，该测定或方法包括(a)在孔中组合(i)从用免疫原免疫接种的非人动物中获得的血液样品或其级分，(ii)捕获试剂，该捕获试剂包含结合至与固体支持物附接的抗体Fc的抗体，(iii)检测试剂，该检测试剂包含结合至与第一可检测标记附接的抗体Fc的抗体，和(iv)经标记的靶标，该经标记的靶标包含附接至跟第一可检测标记不同的第二可检测标记的免疫原或其部分，其中该捕获剂在孔中形成单层；(b)测定第一可检测标记；(c)测定第二可检测标记；和(d)鉴定在孔内检测到该第一可检测标记和该第二可检测标记两者的位置，其中每个所鉴定位置定位产生选定抗体的单独ASC。
在各个方面，该测定或方法包括(a)在孔中组合(i)从用免疫原免疫接种的非人动物中获得的血液样品或其级分，(ii)结合至选定抗体并且包含第一可检测标记的检测试剂，和(iii)在细胞表面上表达与选定抗体结合的靶标的细胞，其中在孔中组合这些细胞以在孔中形成单层；(b)测定第一可检测标记；和(c)鉴定在孔内检测到该第一可检测标记的位置，其中每个所鉴定位置定位产生选定抗体的单独ASC。
在示例性方面，经标记的靶标的第一可检测标记和/或第二可检测标记包括发色团或荧光团。任选地，荧光团包含氧杂蒽衍生物(例如，荧光素、罗丹明、俄勒冈绿、曙红和德克萨斯红)、花青衍生物(例如，花青、吲哚碳菁、氧杂碳菁、硫杂碳菁和部花青)、方酸菁衍生物(例如，Seta和Square染料)、方酸菁轮烷衍生物(例如，Tau染料)、萘衍生物(例如，丹酰衍生物和prodan衍生物)、香豆素衍生物、噁二唑衍生物(例如，吡啶噁唑、硝基苯并噁二唑和苯并噁二唑)、蒽衍生物(例如，蒽醌，包括DRAQ5、DRAQ7和CyTRAK橙)、芘衍生物(例如，级联蓝)、噁嗪衍生物(例如，尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫、噁嗪170)、吖啶衍生物(例如，原黄素、吖啶橙、吖啶黄)、芳基次甲基(arylmethine)衍生物(例如，金胺、结晶紫、孔雀石绿)、四吡咯衍生物(例如，卟啉、酞菁、胆红素)或亚甲基二吡咯衍生物(例如，BODIPY、氮杂-BODIPY)。在各种情况下，经标记的靶标的第一可检测标记和/或第二可检测标记包括CF染料(佰奥添公司(Biotium))、DRAQ或CyTRAK探针(BioStatus公司)、BODIPY(英杰公司(Invitrogen))、EverFluor(塞塔雷生物技术公司(Setareh Biotech))、Alexa Fluor(英杰公司)、BellaFluor(塞塔雷生物技术公司)、CyLight Fluor(赛默科技公司(Thermo Scientific)、皮尔斯公司(Pierce))、Atto或Tracy(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))、FluoProbe(Interchim公司)、Abberior染料(阿贝锐纳公司(Abberior))、DY或MegaStokes染料(Dyomics公司)、Sulfo Cy染料(Cyandye公司)、HiLyte Fluor(安纳斯派克公司(AnaSpec))、Seta、SeTau、Square染料(塞塔生物医学公司(SETA BioMedicals))、Quasar或Cal Fluor染料(塞塔生物医学公司)、SureLight染料(APC、RPEPerCP、Phycobiolisome(哥伦比亚生物科技公司(Columbia Biosciences)))、APC、APCXL、RPE、BPE(Phyco生物技术公司、绿海公司(Greensea)、Prozyme公司、Flogen公司)或Vio染料(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec))。在示例性方面，荧光团包含3-羟基异烟醛、别藻蓝蛋白(APC)、氨基香豆素、APC-Cy7缀合物、BODIPY-FL、级联蓝、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy3B、Cy5、Cy5.5、Cy7、荧光素、FluorX、G-Dye100、G-Dye200、G-Dye300、G-Dye400、羟基香豆素、丽丝胺罗丹明B、荧光黄、甲氧基香豆素、NBD、太平洋蓝、太平洋橙、PE-Cy5缀合物、PE-Cy7缀合物、PerCP、R-藻红蛋白(PE)、红613、德克萨斯红、TRITC、TruRed或X-罗丹明。在各个方面，对第一可检测标记和/或第二可检测标记的测定包括检测来自第一可检测标记和/或第二可检测标记的信号。在示例性情况下，信号是荧光信号。在示例性方面，对第一可检测标记和/或第二可检测标记的测定包括定量来自第一可检测标记和/或第二可检测标记的信号。在各种情况下，该方法包括定量来自第一可检测标记和/或第二可检测标记的信号，并且通过将来自第一可检测标记和第二可检测标记的信号表示为比率来归一化该信号。在各个方面，该比率是来自第一可检测标记的信号的相对荧光单位(RFU)/来自第二可检测标记的信号的RFU，或其倒数。
在示例性方面，首先将ASC暴露于检测试剂和/或靶标，该检测试剂和/或靶标处于孔中或紧接着之后被添加到孔中。在各个方面，ASC与检测试剂和靶标一起孵育至少30分钟、至少60分钟、至少90分钟或至少120分钟。任选地，选定抗体结合至与用于免疫接种非人动物的免疫原相同或相似的靶标。在示例性情况下，检测试剂包含结合至与第一可检测标记附接的抗体Fc结构域的抗体。任选地，结合至捕获剂的抗体Fc结构域的抗体与检测剂的抗体相同。在各个方面，血液样品在免疫接种步骤后约3天至约7天从非人动物中获得。在各种情况下，从非人动物中获得的血液样品小于或为约500μL，任选地约100μL至约250μL。在某些方面，ASC是CD138+B细胞。任选地，ASC包含迁移性浆母细胞。在示例性方面，该方法进一步包括在孔中组合之前去除从非人动物中获得的血液样品的一种或多种组分。在一些情况下，从血液样品中去除红细胞、血浆和/或血小板。在各个方面，通过选择CD138+细胞来制备血液样品的级分。在各种情况下，选定抗体在一种或多种竞争性结合剂的存在下与靶标结合。任选地，在测定期间，将竞争性结合剂与ASC、检测试剂和表达靶标的细胞组合。在示例性方面，选定抗体以目标亲和力结合靶标，任选地其中选定抗体对靶标的KD为约10-11M至约10-9M。任选地，在第一轮中用第一量的表达靶标的细胞且在第二轮中用第二量的表达靶标的细胞执行测定，其中该第一量大于该第二量。在一些方面，进一步在第三轮中用第三量的表达靶标的细胞执行测定，并且该第三量小于该第二量，其中当ASC在每一轮中与经标记的靶标结合时，ASC产生选定抗体。
本发明披露的方法的测定测试单独ASC的选定抗体产生。术语“选定抗体”是指达到设计目标和/或表现出目标表型的抗体。在各种情况下，选定抗体结合可能与用于免疫接种非人动物的免疫原相同或相似的靶标。靶标可以是本文所列的免疫原中的任一种。在示例性情况下，选定抗体是靶标特异性抗体，例如抗原特异性抗体。在各种情况下，选定抗体表现出对靶标(或抗原)的结合亲和力，如由至少约10-9M的KD所表示。在各个方面，选定抗体表现出皮摩尔范围内的KD(例如，约1x10-12M至9.9x10-12M的KD)。在各个方面，选定抗体在一种或多种竞争性结合剂的存在下与靶标结合。在各种情况下，竞争性结合剂是人血液内的组分，例如人血浆或血清。在此类情况下，在测定期间，将竞争性结合剂(例如，人血清)在测定期间与ASC、捕获试剂、检测试剂和经标记的靶标组合。参见例如实例1。在各个方面，竞争性结合剂是与在人或非人动物体内的靶标结合的天然配体，并且与靶标结合的选定抗体防止或抑制天然配体与靶标的结合。例如，选定抗体是抗PD-1抗体，并且竞争性结合剂是PD-L1和/或PD-L2。在此类情况下，在测定期间，将竞争性结合剂(例如，PD-L1和/或PD-L2)在测定期间与ASC、捕获试剂、检测试剂和经标记的靶标组合。参见例如实例7。
所披露的方法的筛选可以在更大的孔(例如，4孔板或OmniTrayTM)中完成，用于产生选定抗体的ASC的后续分子拯救。与ELISpot或FluoroSpot测定不同，所披露的方法是同质活细胞测定，其可修改为本领域已知或具有自动化荧光单细胞挑选系统的显微操作(例如CellCelectorTM)。IgG捕获珠的汇合单层将ASC锁定在适当的位置，使得能够明确定义荧光斑块和鉴定产生选定抗体的单独ASC的位置。
所披露的方法可以指导选择和收获产生选定抗体的动物用于抗体发现。选择动物的传统方法依赖于对多克隆血清效价的询问，该多克隆血清效价测量所有分泌抗体的总反应性和质量，而不是单独抗体的质量。使用源自PBMC群体的ASC询问B细胞反应可以通过鉴定产生选定抗体的单独ASC来克服这个问题，否则这些抗体将难以解释或将被隐藏在多克隆血清效价中。图1D和1E以及实例12和13中描述了用于终末组织收获的动物选择的示例性方法。
在示例性方面，选定抗体以目标亲和力结合靶标，任选地其中这些选定抗体对靶标的KD在10-11M至10-9M的范围内。在各种情况下，选定抗体对靶标的KD在皮摩尔范围内或为约10-12M。在各种情况下，选定抗体对靶标的KD在亚皮摩尔范围内，例如<10-12M。在各个方面，该测定包括在第一轮中将第一量的附接至第二可检测标记的包含免疫原或其部分的经标记的靶标与ASC、捕获试剂和检测试剂组合，并且在第二轮中将第二量的附接至第二可检测标记的包含免疫原或其部分的经标记的靶标与ASC、捕获试剂和检测试剂组合，其中该第一量大于该第二量。在一些情况下，该测定可以包括使用第三量的经标记的靶标的第三轮，其中该第三量小于该第二量。通过在每一轮中检测第一可检测标记和第二可检测标记而鉴定的那些ASC可以是产生对靶标具有高亲和力的选定抗体的ASC。参见例如实例8。
选定抗体以目标亲和力结合靶标。在各个方面，该测定包括将ASC与结合选定抗体的Fc结构域并且包含第一可检测标记的检测试剂和选定抗体所结合作为第二标记的靶标组合。随后是通过确定IgG分泌第一标记RFU(相对荧光单位)与靶标第二标记RFU的比率进行荧光信号定量和分泌归一化。以最小比率(IgG RFU/靶标RFU)鉴定的那些ASC可以是产生对靶标具有高亲和力的选定抗体的ASC。可以将ASC IgG归一化的RFU与来自验证杂交瘤的具有已知靶标亲和力的ASC或在细胞系中表达的重组抗体进行比较，以提供粗略的相对亲和力排序。参见例如实例11。
在各个方面，选定抗体与靶标及其直系同源物或旁系同源物结合，任选地其中该靶标是人蛋白质并且该直系同源物是食蟹猴蛋白质。在各种情况下，在测定期间，将第二经标记的靶标与ASC、捕获试剂、检测试剂和经标记的靶标组合，其中该第二经标记的靶标包含与不同于第一可检测标记和第二可检测标记的第三可检测标记附接的直系同源物，其中该方法进一步包括测定第三可检测标记并且鉴定检测到第一可检测标记、第二可检测标记和第三可检测标记的一个或多个位置，其中每个所鉴定位置定位产生选定抗体的单独ASC。
在各种情况下，选定抗体与靶标结合，而不与其直系同源物或旁系同源物结合。任选地，在测定期间，将第二经标记的靶标与ASC、捕获试剂、检测试剂和经标记的靶标组合，其中该第二经标记的靶标包含与不同于第一可检测标记和第二可检测标记的第三可检测标记附接的直系同源物，其中该方法进一步包括测定第三可检测标记并且鉴定仅检测到第一可检测标记和第二可检测标记而未检测到第三可检测标记的一个或多个位置，其中每个所鉴定位置定位产生选定抗体的单独ASC。参见例如实例6。
在各个方面，选定抗体与靶标的一部分结合。任选地，在测定期间，将第二经标记的靶标与ASC、捕获试剂、检测试剂和经标记的靶标组合，其中该第二经标记的靶标包含与不同于第一可检测标记和第二可检测标记的第三可检测标记附接的靶标的一部分，并且其中该方法进一步包括测定第三可检测标记并且鉴定检测到第一可检测标记、第二可检测标记和第三可检测标记的一个或多个位置，其中每个所鉴定位置定位产生选定抗体的单独ASC。在各种情况下，靶标是包含多个结构域的蛋白质，并且选定抗体仅与靶标的一个结构域结合。在各个方面，在测定期间，经标记的靶标包含与第二可检测标记附接的靶标的胞外结构域，并且第二经标记的靶标包含与第三可检测标记附接的一个结构域。参见例如实例9。在各个方面，选定抗体结合至在靶标二聚化或多聚化后形成的构象表位，并且靶标包含二聚化结构域或多聚化结构域。任选地，在测定期间，经标记的靶标包含与第二可检测标记附接的免疫原的胞外结构域，其中将该第二经标记的靶标与ASC、捕获试剂、检测试剂和经标记的靶标组合，其中第二经标记的靶标包含与不同于第一可检测标记和第二可检测标记的第三可检测标记附接的免疫原的二聚化结构域或多聚化结构域，并且其中该方法进一步包括测定第三可检测标记并且鉴定检测到第一可检测标记、第二可检测标记和第三可检测标记的一个或多个位置，其中每个所鉴定位置定位产生选定抗体的单独ASC。参见例如实例10。
通过重复免疫接种指导抗体产生
在各个方面，该方法包括重复免疫接种非人动物。如本文所举例说明，在各个方面，该方法包括免疫接种非人动物多于一次。在各个方面，该方法包括进行初始免疫接种和一次或多次后续免疫接种。在各种情况下，在从非人动物中获得血液样品并且测定产生选定抗体的ASC之后，重复每次后续免疫接种。在各个方面，非人动物被免疫接种至少两次或更多次，例如2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次、20次或更多次。在各个方面，该方法包括进行初始免疫接种和1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次后续免疫接种。任选地，重复免疫接种，直到鉴定出产生选定抗体的ASC或产生选定抗体的ASC的百分比等于或高于阈值。在各种情况下，与先前的免疫接种或初始免疫接种相比，用(A)相同的免疫原、佐剂、免疫调节剂或其组合，(B)相同量或剂量的免疫原、佐剂、免疫调节剂或其组合，(C)相同的施用时间，(D)相同的递送免疫原的施用途径或方法，(E)在非人动物上的相同施用部位，或(F)其组合来重复每次免疫接种。可替代地，与先前的免疫接种或初始免疫接种相比，用(A)不同的免疫原、佐剂、免疫调节剂或其组合，(B)不同量或剂量的免疫原、佐剂、免疫调节剂或其组合，(C)不同的施用时间，(D)不同的递送免疫原的施用途径或方法，(E)在非人动物上的不同施用部位，或(F)其组合来重复每次免疫接种。在示例性方面，与先前的免疫接种或初始免疫接种相比，每次用(A)不同的免疫原、佐剂、免疫调节剂或其组合，(B)不同量或剂量的免疫原、佐剂、免疫调节剂或其组合，(C)不同的施用时间，(D)不同的递送免疫原的施用途径或方法，(E)在非人动物上的不同施用部位，或(F)其组合来免疫接种动物。在各个方面，免疫接种随着每次发生而变化，使得在非人动物中由此引发的免疫反应相对于由先前免疫接种引起的先前免疫反应被改变。不受任何特定理论所束缚，对同一动物进行多次不同的免疫接种活动会指导免疫反应至产生选定抗体。
在示例性情况下，在非人动物中指导抗体产生以产生选定抗体的方法包括当产生选定抗体的ASC的百分比低于阈值时，执行步骤循环，其中该循环包括(i)当产生选定抗体的ASC的百分比低于阈值时，用免疫原对非人动物进行后续免疫接种，(ii)从所述非人动物中获得包含ASC的血液样品，和(iii)单独地测定在血液样品或其级分中存在的ASC的选定抗体产生。
在示例性情况下，该方法包括以下各项的循环：(i)当产生选定抗体的ASC的百分比低于阈值时，用免疫原对非人动物进行后续免疫接种，(ii)从所述非人动物中获得包含ASC的血液样品，(iii)单独地测定在血液样品或其级分中存在的ASC的选定抗体产生。在各种情况下，该循环重复至少1次、2次或3次或更多次。在各个方面，重复该循环，直到如(iii)中所测定，产生选定抗体的ASC的数量等于或高于阈值。在示例性方面，在重复循环之后，大于10％、20％、30％、40％或50％的经免疫接种的非人动物产生等于或高于阈值的产生选定抗体的ASC的百分比。在各个方面，大于75％或大于85％或大于90％的经免疫接种的非人动物产生等于或高于阈值的产生选定抗体的ASC的百分比。在示例性方面，后续免疫接种的免疫原不同于初始免疫接种的免疫原。例如，在示例性方面，每次后续免疫接种与先前免疫接种的不同之处在于：(A)将不同的免疫原、佐剂和/或免疫调节剂施用至非人动物，(B)将不同剂量的初始免疫接种的免疫原施用至非人动物，(C)初始免疫接种中使用的免疫原、佐剂和/或免疫调节剂的每次施用之间的时间不同，和/或(D)初始免疫接种中使用的免疫原、佐剂和/或免疫调节剂的每次施用的施用途径不同。任选地，每次免疫接种非人动物时使用不同的免疫原。
如本文所讨论，免疫接种包括向非人动物一次或多次施用免疫原(任选地用佐剂制备)。本发明的方法可以包括使用不同免疫接种条件的多个免疫接种步骤，其可以用于引导免疫反应，使得经免疫接种的非人动物最终产生具有所需表型的抗体。取决于目的表型或表型的组合，免疫接种条件可以在连续的免疫接种步骤期间改变，使得免疫反应被引导以产生具有所需表型的抗体。在示例性实施例中，为了产生人-食蟹猴交叉反应性抗体，可以用抗原的人和食蟹猴版本的交替加强来免疫接种非人动物。例如，免疫接种可以包括总共四次注射：对于第一次注射和第三次注射，可以使用重组人抗原，并且对于第二次注射和第四次注射，可以使用重组食蟹猴抗原。示例性免疫接种在本文实例4中进行了描述。实例5描述了制备人-食蟹猴交叉反应性抗体的另外的方法，其中使用不同的免疫接种。在示例性实施例中，为了产生对多结构域蛋白质的结构域具有特异性的抗体，免疫接种可以用三种类型的免疫原中的一种或多种来进行：多结构域蛋白质的完整胞外结构域、结构域和/或全长蛋白质。参见例如实例9。在示例性实施例中，为了产生对二聚体蛋白质或多聚体蛋白质的二聚化或多聚化后形成的表位具有特异性的抗体，免疫接种可以用三种类型的免疫原中的一种或多种来进行：二聚体蛋白质或多聚体蛋白质的完整胞外结构域、多聚化结构域和/或全长蛋白质。参见例如实例10。本文提供了另外的示例性免疫接种。参见实例。
另外的步骤
本文披露的方法可以包括另外的步骤。在示例性情况下，该方法包括在获得血液样品之后测定针对免疫原的抗体反应。在示例性情况下，在获得血液样品之后，该方法包括测定样品的抗体效价。在示例性情况下，该方法包括测定血液样品中存在的抗体的抗原特异性，任选地使用免疫原的结合测定。
在各个方面，该方法包括分离产生选定抗体的ASC或分离选定抗体。在各种情况下，抗体的分离是通过分离产生选定抗体的单一ASC来实现的。在各个方面，分离ASC包括稀释步骤，任选地连续稀释步骤，其中细胞浓度降低，使得在统计学上，一个细胞存在于给定的计算体积中，该计算体积被放入单独的容器中或多孔板的孔中。在各个方面，分离血液样品的ASC包括将单一ASC微流体地移动到孔中或气泡(bubble)中。在那里，ASC保持在培养物中，直到选定抗体被分泌到培养基中和/或ASC经历细胞分裂。任选地，维持发生至少或约3分钟至约30分钟、6小时、24小时或更长时间。在各个方面，ASC的分离经由微流体、磁力、毛细管作用、重力、FACS或光电定位(OEP)发生。
在各个方面，本披露的方法包括对具有目标表型的抗体的重链可变区和轻链可变区进行测序。任选地，经由RT-PCR执行测序。任选地，该方法进一步包括用编码具有目标表型的抗体的重链可变区和轻链可变区的核酸转染细胞；培养转染的细胞；以及从培养物中收获抗体。在一些方面，该方法的步骤在一系列非人动物上执行，并且该方法包括对该系列中的每只非人动物的血液样品的B细胞库进行谱分析，以及选择该系列中具有靶B细胞谱的亚组。此类方法在实例1中进行了描述。
此外，在各个方面，该方法包括涉及产生、纯化和配制抗体的一个或多个上游步骤或下游步骤。任选地，下游步骤是本文所述或本领域已知的那些下游加工步骤中的任何一个。在示例性实施例中，该方法包括用于产生表达具有目标表型的抗体的宿主细胞的步骤。在一些方面，宿主细胞是原核宿主细胞，例如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，或者在一些方面，宿主细胞是真核宿主细胞，例如酵母细胞、丝状真菌细胞、原生动物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)。本领域中描述了此类宿主细胞。参见例如Frenzel等人,Front Immunol[免疫学前沿]4:217(2013)。例如，在一些情况下，这些方法包括将包含核酸的载体引入宿主细胞中，该核酸包含编码抗体或其轻链或重链的核苷酸序列。在示例性方面，这些方法包括将细胞维持在细胞培养物中。任选地，这样的步骤可以包括维持特定的温度、pH、渗透压、溶解氧、湿度，或者维持在包含葡萄糖、岩藻糖、乳酸盐、氨、谷氨酰胺和/或谷氨酸盐中的一种或多种的培养基中。
在示例性实施例中，本文披露的方法包括用于分离和/或纯化产生选定抗体的ASC或从培养物中分离和/或纯化选定抗体的步骤。在示例性方面，该方法包括一个或多个层析步骤，该一个或多个层析步骤包括但不限于例如亲和层析(例如，蛋白质A亲和层析)、离子交换层析和/或疏水性相互作用层析。在示例性方面，该方法包括用于从包含重组糖基化蛋白质的溶液中产生结晶生物分子的步骤。
在各个方面，本披露的方法包括用于制备组合物的一个或多个步骤，该组合物在一些方面包括包含纯化的选定抗体的药物组合物。
在示例性实施例中，该方法包括(a)使用标准方案免疫接种动物和(b)评价血清的抗原特异性抗体反应。在示例性方面，该方法进一步包括选择免疫动物进行抗原加强，并且从这些动物中收获血液(例如，加强后约4天以后)。在各种情况下，该方法包括从采集自动物的血液中去除红细胞、血浆和血小板以富集血液中的B细胞。在示例性情况下，该方法包括鉴定抗体分泌细胞(ASC)并且将ASC分离为单细胞以允许阐明和/或表征由单独ASC产生的抗体。任选地，单细胞分离和筛选使用本领域已知的方法来完成，这些方法例如NanOBLAST(例如，在纳米流体Beacon装置上)、微胶囊化。在各个方面，评价由单独ASC产生和分泌的抗体的目标表型。任选地，通过使用各种不同的筛选策略来完成对目标表型的评价，并且鉴定具有目标表型的一种或多种抗体以及产生和分泌抗体的ASC。在各种情况下，该方法进一步包括通过例如单细胞RT-PCR从ASC(其产生和分泌表现出目标表型的抗体)中分离抗体VH和VL基因，并且将成对的VH和VL基因的序列克隆到细胞中进行重组产生。
筛选、选择和谱分析方法
本披露提供了一种筛选非人动物的产生选定抗体的抗体分泌细胞(ASC)的方法。在示例性实施例中，该方法包括根据本发明披露的监测方法监测非人动物中的选定抗体产生，其中该方法在一系列非人动物上执行，其中对于该系列中的每只非人动物，鉴定产生选定抗体的ASC的数量。在示例性实施例中，该方法包括(a)用免疫原免疫接种一系列非人动物；(b)从该系列的每只非人动物中获得包含ASC的血液样品；和(c)单独地测定血液样品或其级分中存在的ASC的选定抗体产生，其中，对于该系列的每只非人动物，确定产生选定抗体的ASC的百分比。在各个方面，筛选方法进一步包括当产生选定抗体的ASC的百分比等于或高于阈值时，选择该一只或多只非人动物进行处死和/或组织收获(例如，次级淋巴组织收获)。本披露进一步提供了选择经免疫接种的非人动物进行后续免疫接种的方法。在各个方面，筛选方法进一步包括当产生选定抗体的ASC的百分比低于阈值时，选择该一只或多只非人动物进行后续免疫接种。因此，在各种实施例中，该筛选方法基于产生选定抗体的ASC的百分比来鉴定要处死的动物和进行后续免疫接种的动物。在示例性实施例中，该方法包括根据本发明披露的监测方法监测非人动物中的选定抗体产生，其中该方法在一系列非人动物上执行，其中对于该系列中的每只非人动物，鉴定产生选定抗体的ASC的数量，并且当动物的产生选定抗体的ASC的百分比低于阈值时，选择该动物进行后续免疫接种。此外，本文进一步提供了选择经免疫接种的产生选定抗体的非人动物进行安乐死和次级淋巴收获的方法。在示例性实施例中，该方法包括根据本发明披露的监测方法监测非人动物中的选定抗体产生，其中该方法在一系列非人动物上执行，其中对于该系列中的每只非人动物，鉴定产生选定抗体的ASC的数量，并且当动物的产生选定抗体的ASC的百分比等于或高于阈值时，选择该动物进行安乐死和二次淋巴收获。
本披露进一步提供了对非人动物的B细胞库进行谱分析的方法。在示例性实施例中，该方法包括(a)用免疫原免疫接种非人动物；(b)从所述非人动物中获得包含抗体分泌细胞(ASC)的血液样品；以及(c)单独地测定在该血液样品或其级分中存在的ASC的选定抗体产生。在各种情况下，该方法在一系列非人动物上执行，并且该方法包括对该系列中的每只非人动物的血液样品的B细胞库进行谱分析，并且选择该系列中具有靶B细胞谱的亚组。在示例性情况下，选择该亚组进行再免疫接种。在替代性情况下，选择该亚组进行安乐死和收获次级淋巴器官。
因此，本文所述的筛选和选择方法允许对产生选定抗体的非人动物进行鉴定。此类方法的示例性益处是，可以在处死和B细胞收获之前鉴定产生此类抗体的非人动物。对于产生选定抗体的那些动物而言，这丰富了非人动物，从而丰富了B细胞池，从而有助于减轻传统下游抗体发现方法的一些无效。
抗体产生
本披露进一步提供了在非人动物中产生选定抗体的方法。在示例性实施例中，该方法包括根据本发明披露的指导抗体产生的方法在非人动物中指导抗体产生以产生选定抗体，并且然后分离选定抗体和/或产生选定抗体的ASC。在示例性实施例中，该方法包括(a)用免疫原对非人动物进行初始免疫接种活动；(b)从所述非人动物中获得包含抗体分泌细胞(ASC)的血液样品；(c)单独地测定在血液样品或其级分中存在的ASC的选定抗体产生；(d)当产生选定抗体的ASC的百分比低于阈值时，用免疫原对非人动物进行后续免疫接种；和(e)分离选定抗体和/或产生选定抗体的ASC。在各个方面，该方法包括重复以下各项的循环：(i)当产生选定抗体的ASC的百分比低于阈值时，用免疫原对非人动物进行后续免疫接种，(ii)从所述非人动物中获得包含ASC的血液样品，(iii)单独地测定在血液样品或其级分中存在的ASC的选定抗体产生，直到产生选定抗体的ASC的百分比等于或高于阈值。本文描述了分离产生选定抗体的ASC或分离选定抗体的方法。参见例如另外的步骤。
在各个方面，该方法进一步包括(f)确定编码由ASC(例如，产生选定抗体的分离的ASC)产生的选定抗体的重链可变区的核苷酸序列和编码由ASC产生的选定抗体的轻链可变区的核苷酸序列，(g)将包含编码选定抗体的重链可变区的核苷酸序列的第一载体和包含编码选定抗体的轻链可变区的核苷酸序列的第二载体引入宿主细胞中，和(h)分离由宿主细胞产生的抗体。确定抗体的重链可变区和轻链可变区的序列的方法是本领域已知的，并且包括例如单细胞PCR。参见例如Tiller等人,J Immunol Methods[免疫学方法杂志]350:189-193(2009)；以及Winters等人,2019,同上。产生包含核苷酸序列的载体是已知的。参见例如Green和Sambrook,Molecular Cloning：A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册]，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，2012年。在各个方面，产生选定抗体的方法包括工程化重链序列和/或轻链序列以获得工程化的选定抗体。在各个方面，与非工程化选定抗体相比，工程化选定抗体例如在存储或制造、配制、填充、运输或施用期间或在体内条件下表现出更高的稳定性。在各个方面，与非工程化选定抗体相比，工程化选定抗体对靶标或其直系同源物或旁系同源物表现出更高的亲和力。用于分离由宿主细胞产生的抗体的合适技术在本文中进行了描述并且是本领域已知的。参见例如本文中的另外的步骤，以及Low等人,JChromatog B[色谱杂志B]848(1):48-63(2007)；Ngo等人,美国专利号4,933,435；以及Ayyar等人,Methods[方法]56(2):116-129(2012)。
在本发明披露的产生选定抗体的方法的示例性实施例中，该方法包括(a)用免疫原对非人动物进行初始免疫接种；(b)从所述非人动物中获得包含抗体分泌细胞(ASC)的血液样品；(c)单独地测定在血液样品或其级分中存在的ASC的选定抗体产生；和(d)当产生选定抗体的ASC的百分比等于或高于阈值时，从非人动物中收获一个或多个次级淋巴器官。在各个方面，从收获的次级淋巴器官获得免疫细胞，并且将那些免疫细胞的至少一部分(例如，IgG阳性记忆B细胞)用于产生杂交瘤。产生杂交瘤的方法是本领域已知的，并且在本文中进行了描述。参见例如本文中的增强的杂交瘤产生，以及Zhang,Methods Mol Ciol[分子生物学方法]01:117-135(2012)；Tomita和Tsumoto,Immunotherapy[免疫疗法]3(3):371-380(2011)；以及Hnasko和Stanker,Methods Mol Biol[分子生物学方法]1318:15-28(2015)；以及Zaroff和Tan,Biotechniques[生物技术]67(3):90-92(2019)。本发明披露的方法在某些方面进一步包括产生杂交瘤。
抗体
尽管抗体结构在物种之间不同，但是如本文所用，术语“抗体”通常是指具有常规免疫球蛋白形式、典型地包含重链和轻链并且包含可变区和恒定区的蛋白质。通过本发明的方法获得或分离的抗体可以具有多种用途。例如，通过本发明的方法获得的抗体可以用作治疗剂。通过本发明的方法获得的抗体也可以用作非治疗性抗体，例如，用于诊断性测定(例如，诊断性成像测定)和用于其他体外或体内免疫测定(例如，Western印迹、放射性免疫测定、ELISA、EliSpot测定等)的试剂。在各个方面，该抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体。在示例性情况下，抗体是哺乳动物抗体，例如小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、马抗体、鸡抗体、仓鼠抗体、猪抗体、人抗体、羊驼抗体、骆驼抗体、美洲驼抗体等。在一些方面，抗体可以是任选地由转基因动物产生的单克隆抗体或多克隆抗体。在此类实施例中，所产生的抗体是包含两种或更多种物种的序列的嵌合抗体。在各种情况下，抗体具有人IgG，其是两对相同多肽链的“Y形”结构，每对具有一条“轻”链(典型地具有约25kDa的分子量)和一条“重”链(通常具有约50-70kDa的分子量)。人抗体具有可变区和恒定区。在人IgG形式中，可变区通常为约100-110个或更多个氨基酸，包含三个互补决定区(CDR)，主要负责抗原识别，并且与结合不同抗原的其他抗体差异很大。参见例如Janeway等人,“Structure of theAntibody Molecule and the Immunoglobulin Genes”[抗体分子和免疫球蛋白基因的结构],Immunobiology：The Immune System in Health and Disease[免疫生物学：健康与疾病的免疫系统],第4版.爱思唯尔科学有限公司(Elsevier Science Ltd.)/加兰出版社(Garland Publishing),(1999)。简而言之，在人抗体支架中，CDR嵌埋于重链可变区和轻链可变区中的框架内，其中这些CDR构成主要负责抗原结合和识别的区域。人抗体可变区包含至少三个重链或轻链CDR(Kabat等人,1991,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest[免疫学关注的蛋白质序列],Public Health Service[美国公共卫生署]N.I.H.,马里兰州贝塞斯达；还参见Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917；Chothia等人,1989,Nature[自然]342:877-883)，其位于框架区内(由Kabat等人,1991指定框架区1-4、FR1、FR2、FR3和FR4；还参见Chothia和Lesk,1987,同上)。人轻链分类为κ轻链和λ轻链。人重链分类为μ、δ、γ、α或ε，并且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有若干个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。本披露的实施例包括所有此类人抗体类别或同种型。人轻链恒定区可以是例如κ型或λ型轻链恒定区。重链恒定区可以是例如α型、δ型、ε型、γ型或μ型重链恒定区。因此，在示例性实施例中，抗体是同种型IgA、IgD、IgE、IgG或IgM的抗体，包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的任一种。
抗原结合蛋白可以具有不同于人抗体的结构。在示例性情况下，抗原结合蛋白仅包含重链片段，例如重链可变区、重链恒定区CH2、重链恒定区CH3。在各种情况下，抗原结合蛋白包含纳米抗体(例如由单峰骆驼、美洲驼和鲨鱼制成的那些纳米抗体)的结构。参见例如Leslie,Science[自然],“Mini-antibodies discovered in sharks and camels couldlead to drugs for cancer and other diseases[在鲨鱼和骆驼中发现的微型抗体可能导致用于癌症和其他疾病的药物]”,2018,网址https://www.sciencemag.org/news/2018/05/mini-antibodies-discovered-sharks-and-camels-could-lead-drugs-cancer-and-other-diseases。
给出以下实例仅用于说明本发明，而不以任何方式限制其范围。
实例
实例1
本实例描述了监测小鼠中选定抗体产生的示例性方法。
在本实例中，选定抗体是与对PD-1具有特异性的治疗性人IgG抗体(以下称为“抗体1”)的独特位结合的抗独特型抗体(抗ID抗体)。独特位是由抗体的可变区形成的独特结构，其通常参与跟抗原的结合(互补位)。图3示出了抗体1以及抗ID抗体的独特位和互补位。
免疫接种方案
将抗体1的可溶性形式在佐剂(完全弗氏佐剂，随后用Sigma Adjuvant(SAS，目录号S6322；西格玛-奥德里奇公司，密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO)))中乳化。然后将抗体-佐剂混合物递送到多种野生型小鼠品系(包括Balb/c、CD1和B6/129小鼠)中。完整的免疫接种活动包括三次注射，其在38天的进程内间隔2周递送。第一次免疫接种包括在每只小鼠背侧的2个点上皮下注射在100μl完全弗氏佐剂中乳化的50μg抗体1。14天以后，将25μg抗体1悬浮于200μl Sigma Adjuvant System中，并且在每只小鼠背侧的2个点皮下注射100μl混合物，并且剩余的100μl腹膜内注射。第3次免疫接种在14天以后递送，并且除了抗体1的总量减少到15μg之外，在途径和佐剂方面与第2次免疫接种相同。
对来自每只小鼠的血清效价的桥接ELISA分析基本上如Winters等人,mAbs[单克隆抗体]11(6):1025-1035(2019)中所述的执行，以确认抗原反应性，并且通告动物选择用于最终加强。如图4所示，CD1小鼠中的血清效价水平最高，但是所有经免疫接种的小鼠(包括Balb/c和B6/129小鼠)表现出的血清效价水平均高于对照(无血清)。在非终末外周血单核细胞(PBMC)收获前四天，经由腹膜内途径将悬浮在150μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的50μg抗体1注射到每只动物(N＝12)中，以刺激分泌抗原特异性抗体的细胞(ASC)。
血液采集和富集
采集每只动物的血液并且将其处理以进行单细胞分离和筛选。表1列出了小鼠品系和从每只小鼠收获的血液体积。
表1
小鼠ID 小鼠品系 收获的血液体积*(μL)
1 CD1 180
2 CD1 170
3 CD1 200
4 Balb/c 120
5 Balb/c 170
6 Balb/c 160
7 Balb/c 140
8 B6/129 180
9 B6/129 100
10 B6/129 150
11 B6/129 150
12 B6/129 210
*全血体积的至多7％
然后对采集的血液进行处理，以富集B细胞池。首先，使用RedSift细胞处理器仪器(奥维亚系统生物公司(Aviva Systems Biology,Corp.)，加利福利亚州圣地亚哥)从收获的血液中去除红细胞(RBC)、血小板和血清血浆。然后按照制造商的程序执行EasySepTM小鼠B细胞分离试剂盒(干细胞技术有限公司(STEMCELL Technologies,Inc.)，加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华(Vancouver,British Columbia))，以进一步富集B细胞。执行使用内部来源的大鼠抗鼠类IgM mAb(克隆8M3.1)的另外步骤，以有效地去除表达细胞表面IgM的幼稚B细胞。这一另外的步骤允许在ASC群体中进一步富集抗原特异性的类别转换的IgG分泌细胞。
将富集的B细胞池与加荧光标记的抗CD138抗体一起孵育，以标记血浆B细胞谱系的细胞。高水平的CD138表达已被证明是从PBMC衍生的B细胞分泌IgG的最可靠的指标，但是本文预期其他细胞表面标记(例如B220、CD19、IgG、TACI、SLAM7、BCMA、CD98、SCA-1、Ly6C1/2等)或标记的组合可以用于鉴定目的特定B细胞群。Tellier等人,Eur J Immunol[欧洲免疫学杂志]47(8):1276-1279(2017)。
单细胞筛选测定
然后使用光学流体平台(伯克利之光有限公司(Berkeley Lights,Inc.)，加利福尼亚州埃默里维尔(Emeryville,CA))将加荧光标记的细胞加载到OptoSelectTM芯片(伯克利之光有限公司，加利福尼亚州埃默里维尔)上，该平台通过光电定位(OEP)将单独的B细胞操作到OptoSelectTM芯片的单独笔中。该芯片具有3513个单独的笔，每个笔具有约740皮升的容量和唯一的笔鉴定编号。通过CD138表达，使用/>光学流体平台的板载光学器件鉴定芯片加载的ASC。使用此技术，将单独B细胞隔离到芯片的离散笔中，以便分离出由单独B细胞分泌的抗体。由一个B细胞产生和分泌的抗体不与由另一个B细胞产生和分泌的抗体混合。这种“一个ASC对一个笔”的关系允许对由单个B细胞产生的抗体进行表型表征，并且由于ASC具有特定的基因型，因此可以进行表型与基因型的关联。由于笔的极小体积以及浆母细胞和浆细胞的快速分泌速率(Wener Faver等人,Eur JImmunol[欧洲免疫学杂志]23(8):2038-2040(1993))，每个笔内的ASC来源的抗体的浓度快速增加。在5-15分钟内达到足够的抗体水平，以允许筛选选定抗体的所需特征(例如，表型)。
可以使用一系列迭代同质筛选来鉴定表达相关的抗原特异性抗体(选定抗体)的ASC。取决于选定抗体的所需抗体特征，这些筛选可以是简单的结合测定(例如，抗原结合、物种交叉反应性等)或可以被设计用于鉴定达到另外的设计目标(例如，配体阻断、竞争、功能等)的抗体。这里，为了鉴定分泌针对抗体1(选定抗体)的抗ID抗体的ASC，进行了同质的基于珠的竞争测定。该测定如图5A-5C所示。在此测定中，将包含与3.2μm聚苯乙烯珠(Spherotech公司，伊利诺伊州森林湖(Lake Forest,IL))连接的抗小鼠IgG抗体(抗muIgG)的捕获试剂与包含用Fluor A标记的抗小鼠IgG的检测试剂、包含用Fluor-B标记的抗体1的经标记的靶标和过量人血清(10％正常人血清)混合。参见图5A。包括血清以提供竞争性结合条件。不受特定理论所束缚，在此类竞争性结合条件下，对所需治疗性IgG互补位之外的表位具有特异性的抗体不与经标记的靶标(用Fluor-B标记的抗体1)结合。
然后使此测定混合物流入芯片微流体通道中，使得珠被定位于含有单独隔离的ASC的每个笔的开口处(图5B)。然后使用光学流体平台(伯克利之光有限公司(Berkeley Lights,Inc.)，加利福尼亚州埃默里维尔(Emeryville,CA))的荧光成像能力和允许检测Fluor-A的滤光片来检测含有分泌抗体的细胞的笔。随着ASC来源的抗体水平的增加，它们扩散出笔的开口，在那里它们被捕获试剂捕获(并浓缩)。递增量的抗体与珠结合进而又浓缩了与Fluor-A缀合的抗小鼠IgG抗体，导致集中在目的笔(含有分泌IgG抗体的ASC的笔；图5C)的开口处的特征性荧光“水华”模式。通过Fluor A水华鉴定了82个具有分泌IgG抗体的ASC的笔，并且记录了它们的笔鉴定编号。为了鉴定分泌对抗体1(选定抗体)具有特异性的抗体的ASC，使用第二荧光滤光片组(fluorescent filter cube)来检测Fluor-B信号。在人血清的存在下，表达与经标记的靶标结合的对抗体1具有特异性的选定抗体的23个ASC被Fluor B水华标记(图5C)。
测序、克隆和重组表达
为了验证选定抗体，使用OEP将23个ASC单独移出OptoSelectTM芯片的笔，并且使用光学流体平台的集成微流体将其输出到含有细胞裂解缓冲液的标准96孔板的单独孔中(图6)。遵循基本上如Winters等人,2019,同上中所述的方案经由单细胞RT-PCR确定由每个孔的ASC产生的抗体的相应抗体重链(HC)和轻链(LC)可变区的序列。然后将序列克隆到携带抗体恒定区的哺乳动物表达载体中。一个载体携带HC可变区和抗体恒定区，并且第二个载体携带LC可变区和抗体恒定区。然后将重组抗体HC/LC对转染到293T细胞中，并且作为可溶性抗体表达到培养物上清液中。
然后在人血清的存在下，通过夹心ELISA测试培养物上清液中的抗体与抗体1的结合，基本上如Winters等人,2019,同上所述并且如图7A所示。使用此方法，鉴定了9种抗体，其具有所需特征并且可以用作针对抗体1的抗ID抗体。在9种抗ID抗体候选物中，单个抗体(Ab287)具有最佳的谱，其在临床患者样品中显示0.5ng/ml的潜在定量下限(LLOQ)。在不同来源的血清的存在下，Ab287在夹心ELISA中的表现如图7B所示。正如与抗体1的互补位结合的抗ID抗体所预期的那样，抗ID抗体Ab287以233.9nM的EC50阻断了抗体1与其靶标(PD-1)的结合(图7C)。预期Ab287可测量临床样品中的游离和生物活性抗体1，并且因此被选择用于进一步开发。
实例2
本实例描述了监测小鼠中的选定抗体产生的另一种示例性方法。
免疫接种方案
在本实例中，选定抗体是抗人EGFR抗体。用人EGFR(huEGFR)的可溶性胞外结构域免疫接种CD1小鼠，总共进行四次间隔两周的免疫接种。第一次免疫接种包括在每只小鼠背侧的2个点上皮下注射在100μl完全弗氏佐剂中乳化的50μg人huEGFR。14天以后，将25μghuEGFR悬浮于200μl Sigma Adjuvant System中，并且在每只小鼠背侧的2个点皮下注射100μl混合物，并且剩余的100μl腹膜内注射。第三次免疫接种在14天后递送，并且除了huEGFR的总量减少到15μg之外，在途径和佐剂方面与第二次免疫接种相同。第四次加强在没有佐剂的情况下含有50μg huEGFR，并且通过皮下和腹膜内这两种途径递送。
血液采集和富集
最后一次加强后1天至8天采集血液。按照制造商的程序，使用磁性CD138阳性选择试剂盒(干细胞技术有限公司，加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华)富集ASC。
单细胞筛选测定
将富集的B细胞与包含连接至珠的山羊抗人Fc的捕获试剂、包含用产生绿色荧光信号的Alexa 488标记的山羊抗人Fc抗体的检测试剂和包含用产生红色荧光信号的Alexa594标记的EGFR的经标记的靶标混合。然后将混合物转移到384孔板的单个孔中，并且使混合物的组分在孔中沉降约10分钟。
使用Incucyte活细胞分析系统执行细胞成像以鉴定特异性ASC。图8A提供了展示抗体分泌的绿色荧光信号的示例性图像，并且图8B提供了展示抗体的抗原特异性的红色荧光信号的示例性图像。图8C提供了图8A-8B中所描绘的同一孔的示例性分析复合图像，其中展示抗体分泌的绿色荧光信号以紫红色显示，红色荧光信号以青色显示，并且绿色和红色信号的重叠以宝蓝色显示。从此成像测定中，发现10个细胞展示抗体分泌，而只有1个细胞展示为分泌抗原(EGFR)特异性的抗体。
实例3
本实例描述了一种鉴定选定的ASC的替代性单细胞成像测定，其中该靶标由细胞以其天然构象表达。
用CB-1免疫接种小鼠以产生抗CB-1抗体。从经免疫接种的小鼠采集血液样品，并且然后富集分泌IgG的B细胞，基本上如实例2中所述。使用293fectin用编码全长CB1的载体转染的293T细胞用培养基洗涤，并且然后通过40μm滤过器。然后将富集的B细胞、表达CB-1的293T细胞和用Alexa 488标记的山羊抗人Fc抗体的混合物添加孔中，并且允许作为单层沉降。使用Incucyte成像系统检测在转染细胞表面处的荧光信号来鉴定特异性ASC。图8D提供了用多个荧光点标记的转染细胞的示例性图像，在这些荧光点上，由293T细胞表达的抗原结合由B细胞产生并且用标记有Alexa 488的山羊抗人Fc抗体标记的抗体。这些结果证明，富集的B细胞池含有分泌对CB-1具有特异性的抗体的细胞。
实例4
本实例描述了在非人动物中指导抗体产生以产生选定抗体的示例性方法。在本实例中，选定抗体是对TNF-α具有特异性的人-食蟹猴交叉反应性IgG抗体。
为了产生人-食蟹猴交叉反应性抗体，用抗原的人和食蟹猴版本的交替加强来免疫接种动物。这种免疫接种方法依赖于这样的假设，即在每次加强期间，在人抗原与食蟹猴抗原之间共享的表位一致地呈现给免疫系统，从而允许持续刺激编码交叉反应性抗体的相关B细胞。使用简单的结合测定和来自经免疫接种的动物的多克隆血清，可以容易地监测对每种抗原的反应性。然而，由于动物已经用两种抗原免疫接种，并且单独的抗原包含共同表位和独特表位两者，多克隆血清将含有对人抗原反应的抗体、对食蟹猴抗原反应的抗体和/或对人和食蟹猴抗原反应的抗体。测定多克隆血清不允许确定存在交叉反应性抗体。对源自PBMC群体的分离的单一ASC的询问克服了这个问题。单细胞测定筛选分泌真正交叉反应性抗体的ASC。
免疫接种方案
完整的免疫接种活动包括四次注射，在50天的进程内间隔2周递送。对于第一次注射和第三次注射，使用重组人TNF-α(目录号300-01A；新泽西州罗基希尔(Rocky Hill,NJ))，其用完全弗氏佐剂，然后用Sigma Adjuvant/>(目录号S6322；西格玛-奥德里奇公司，密苏里州圣路易斯)乳化。对于第二次注射和第四次注射，使用重组食蟹猴TNF-α(目录号RP1021Y-005，Kingfisher生物科技有限公司，明尼苏达州圣保罗(St.Paul,MN))，其用完全弗氏佐剂，然后用Sigma Adjuvant/>(目录号S6322；西格玛-奥德里奇公司，密苏里州圣路易斯)乳化。对于第一次注射，将约50μg人TNF悬浮于佐剂中，并且在每只小鼠背侧的2个点上皮下注射。14天以后，将使用悬浮于佐剂中的50μg食蟹猴TNF进行的第二次注射在每只小鼠背侧的2个点上皮下注射。第二次注射后14天，将包含25μg人TNF的第三次注射悬浮于200μl Sigma Adjuvant System中，并且在每只小鼠背侧的2个点皮下注射100μl混合物，并且剩余的100μl腹膜内注射。14天以后，将包含25μg食蟹猴TNF的第四次注射悬浮于200μl Sigma Adjuvant System中，并且在每只小鼠背侧的2个点皮下注射100μl混合物，并且剩余的100μl腹膜内注射。对每只小鼠的血清效价执行桥接ELISA分析，以确认抗原反应性并且通告动物选择用于非终末抗体发现。在非终末外周血单核细胞(PBMC)收获前四天，经由腹膜内途径将包含悬浮于150μl PBS中的25μg人TNF和25μg食蟹猴TNF的溶液注射到每只动物(N＝12)中，以刺激分泌抗原特异性抗体的细胞(ASC)。
血液采集和富集以及单细胞筛选测定
从每只小鼠采集血液并且富集B细胞，基本上如实例1中所述。使用光学流体平台将经标记的细胞加载到OptoSelectTM芯片(伯克利之光有限公司，加利福尼亚州埃默里维尔)上，并且将单独B细胞隔离到芯片的离散笔中，以便分离由单独B细胞分泌的抗体。
为了鉴定分泌选定抗体(对人TNF和食蟹猴TNF反应的抗TNF抗体)的ASC，执行实例1中所描述的同质的基于珠的竞争测定。这里，将包含与抗小鼠IgG连接的珠的捕获试剂与包含用Fluor-A标记的抗小鼠IgG的检测试剂、包含用Fluor-B标记的人TNF的经标记的靶标和过量的人血清混合。然后使此测定混合物流入芯片微流体通道中，使得珠被定位于含有单独隔离的ASC的每个笔的开口处。Fluor-A水华标记了具有分泌IgG抗体的ASC的笔，而Fluor B水华标记了具有分泌与人TNF结合的抗体的ASC的笔。鉴定并记录由每种水华类型标记的笔的笔ID编号。
在基于珠的测定的第二部分中，添加包含用Fluor-C标记的食蟹猴TNF的检测试剂。Fluor-C水华标记了具有分泌与食蟹猴TNF结合的抗体的ASC的笔。记录由Fluor C水华标记的笔的笔ID编号。
记录为对所有三种水华(Fluor A水华、Fluor B水华和Fluor C水华)均呈阳性的笔被选择为分泌选定抗体的候选ASC。使用OEP将候选ASC单独移出OptoSelectTM芯片的笔，并且使用光学流体平台的集成微流体将其输出到含有细胞裂解缓冲液的标准96孔板的单独孔中，基本上如实例1中所述。经由单细胞RT-PCR确定由每个候选ASC产生的抗体的HC和LC可变区。将序列克隆到载体中，并且然后将载体转染到293T细胞中。收集培养物上清液中的抗体，并且然后在功能测定中测试对人TNF和食蟹猴TNF的交叉反应性。
如果没有一个笔对所有三种水华均呈阳性，则鉴定对Fluor A水华和Fluor B水华呈双阳性的笔。可替代地，鉴定对Fluor A水华和Fluor C水华呈双阳性的笔。选择含有双阳性笔的ASC的血液的小鼠进行第二次免疫接种活动。对于获得Fluor A和Fluor B双阳性ASC的小鼠，第二次免疫接种活动包括与第一次活动(如上文所述)相同的免疫接种活动，但是用减半量的人TNF执行第一次注射和第三次注射。
对于获得Fluor A和Fluor C双阳性ASC的小鼠，第二次免疫接种活动包括与第一次活动(如上文所述)相同的免疫接种活动，但是用减半量的食蟹猴TNF执行第二次注射和第四次注射。
随后如本实例中所述的执行免疫接种后的所有步骤(从血液采集到基于珠的测定)。记录为对所有三种水华(Fluor A水华、Fluor B水华和Fluor C水华)均呈阳性的笔被选择为分泌具有目标表型的抗体的候选ASC。对可变区测序，将其克隆到载体中，将载体转染到细胞中用于重组抗体产生，并且测试重组产生的抗体的目标表型。
如果仍然没有鉴定出三阳性笔，则设计第三次免疫接种活动，并且在接受第二次免疫接种活动的相同小鼠上执行。在第三次免疫接种活动中，对于呈Fluor A/Fluor B双阳性的小鼠，用增加量的食蟹猴TNF执行第二次注射和第四次注射，并且用减半量或四分之一量的人TNF执行第一次注射和第三次注射；并且对于呈Fluor A/Fluor C双阳性的小鼠，用增加量的人TNF执行第一次注射和第三次注射，并且用减半量或四分之一量的食蟹猴TNF执行第二次注射和第四次注射。在第三次活动之后，随后如本实例中所述的执行免疫接种后的所有步骤(从血液采集到基于珠的测定)。记录为对所有三种水华(Fluor A水华、Fluor B水华和Fluor C水华)均呈阳性的笔被选择为分泌具有目标表型的抗体的候选ASC。如果在第三次活动之后仍未鉴定出三阳性的笔，则设计并执行第四次免疫接种活动。重复该过程，直到鉴定出具有目标表型的抗体。
这种方法有利地提供了纵向活体B细胞谱分析使能够进行库引导的能力。实时监测免疫动物的B细胞反应发展，并且该信息被用于迭代地修改免疫接种策略。因为此方法是非终末的，所以其允许人们利用免疫系统的力量继续进化B细胞反应至所需的结果，而不处死动物。对免疫接种策略的修改包括(但不限于)不同形式的免疫原、佐剂、免疫调节剂、抗原剂量、免疫接种的时间和施用途径。在这种情况下，使用人抗原的初始免疫接种尝试未能引发产生与食蟹猴抗原交叉反应的抗体的B细胞，如PBMC的非终末ASC筛选所确定的。由于此方法为我们提供了库质量信息，所以其然后可以用于修改免疫接种策略。在本实例中，免疫原可以从人抗原转换为食蟹猴直系同源物，并且免疫接种活动继续进行，直到鉴定出表达交叉反应性抗体的B细胞。使用传统策略或如在此所述的非终末ASC方法，已经引发所需的B细胞库的动物然后可以用于抗体产生。
实例5
本实例描述了在非人动物中指导抗体产生以产生选定抗体的另一种示例性方法。在本实例中，选定抗体是对抗原X具有特异性的人-食蟹猴交叉反应性IgG抗体。
本实例描述了对与抗原X的人直系同源物和食蟹猴(cyno)直系同源物两者交叉反应的抗体的鉴定。直系同源物具有低序列同源性，并且因此交叉反应性抗体的产生是罕见的。仅用一种抗原免疫接种可以产生一些交叉反应性抗体，但它们将低于标准血清效价的检测水平。可替代地，用人抗原和食蟹猴抗原共同免疫接种会产生主要与人直系同源物或食蟹猴直系同源物结合的抗体，但很少会交叉反应。标准血清效价无法区分已经产生交叉反应性抗体的小鼠与已经产生独立结合人抗原或食蟹猴抗原的抗体的小鼠。因此，单细胞筛选对于在反应的小鼠中鉴定真正的交叉反应性抗体是必要的。这与选择性扩增目的B细胞相结合，以有效回收。
用抗原X的人版本免疫接种小鼠，总共四次间隔两周的注射。对于第一次加强，将50μg人抗原X在100μl弗氏完全佐剂中乳化，并且皮下施用混合物。14天以后，将25μg人抗原X悬浮于200μl Sigma Adjuvant System中，并且皮下注射100μl和腹膜内注射100μl。对于第三次注射，将15μg人抗原X在Sigma Adjuvant System中乳化，并且皮下和腹膜内注射，如针对第二次加强所述。在没有佐剂的情况下，腹膜内注射50μg人抗原X的最后一次加强。
在最后一次加强后四天，采集最终体积为啮齿动物体重10％的血液。磁性分离CD138+B细胞，并且将其添加到包含与珠连接的抗人IgG抗体的捕获试剂、包含Alexa488标记的抗人IgG抗体的检测试剂以及差异标记的荧光人抗原X和食蟹猴抗原X的混合物中。将混合物作为单层铺板在微量滴定板中，并且然后孵育以允许抗体和抗原捕获。基本上如实例2中所述，使用细胞成像将抗原特异性交叉反应性ASC鉴定为双重染色荧光斑块。
产生分泌交叉反应性抗体的B细胞的动物然后用交替剂量的与Sigma Adjuvant组合的食蟹猴抗原和人抗原皮下免疫接种，每周一次，持续另外四周。在最后一次加强后三天采集血液，并且分离B细胞用于针对人抗原和食蟹猴抗原的筛选。/>
被鉴定为具有增加数量的交叉反应性抗体的动物被实施安乐死用于组织收获和抗体产生。交叉反应性抗体与单反应性抗体比率低的动物用替代剂量的抗原X的人直系同源物和食蟹猴直系同源物免疫接种另外3周，随后对交叉反应性抗体进行单细胞筛选。此过程继续进行，直到达到产生选定抗体(人-食蟹猴交叉反应性抗体)的ASC的阈值％。
所描述的方法可以应用于需要对蛋白质的多种直系同源物或旁系同源物具有交叉反应性的任何抗体发现活动。对于功效和安全性研究，经常需要产生对不同物种交叉反应的抗体。单个B细胞筛选可以应用于需要对大鼠、兔、豚鼠、狗、猫或猪(作为常见的实例)具有交叉反应性的程序。
实例6
本实例描述了在非人动物中指导抗体产生以产生选定抗体的方法。在本实例中，选定抗体是仅与蛋白质的一种旁系同源物(抗原X)结合、但不与密切相关的家族成员抗原Y结合的抗体。
由于抗原X与抗原Y之间的相似性，用抗原X免疫接种的动物显示出对两种蛋白质的多克隆血清交叉反应性。因此，需要直接单细胞筛选来鉴定具有对目的家族成员产生偏向抗体反应的潜力的小鼠。使用替代性免疫接种方案进一步免疫接种选定的动物，以引导免疫反应至最大化B细胞产生，从而产生专门对抗原X反应的抗体。
用抗原X对啮齿动物皮下免疫接种，每周两次，持续四周。触发免疫原(primingimmunogen)复合物包含与弗氏完全佐剂组合的10μg抗原，而加强复合物包含与SigmaAdjuvant组合的5μg抗原。最后一次加强后四天，采集血液，并且从血清中分离CD138+B细胞。
如实例1中所述，通过单细胞测定来测定细胞，并且将细胞使用Fluor A标记的抗原X筛选与抗原X的结合和/或使用Fluor B标记的抗原Y筛选与抗原Y的结合。Fluor A水华标记了含有分泌对抗原X具有特异性的抗体的ASC的笔并且Fluor B水华标记了含有分泌与抗原Y结合的抗体的ASC的笔。仅对Fluor A水华呈阳性(而对Fluor B水华不呈阳性)的笔经由OEP输出笔并且进入用于单细胞PCR的孔中，基本上如实例1中所述。将对由ASC产生的抗体测定与抗原X结合而不与抗原Y结合。
如果笔不是对Fluor A水华呈单阳性，则在生物信息学上鉴定抗原X的保守结构域。每周一次用与Sigma Adjuvant组合的保守的抗原X结构域对动物皮下免疫接种，持续另外的3次加强。啮齿动物在最后一次加强后三天放血并且富集B细胞，基本上如实例1中所述。在单细胞水平上筛选细胞，以鉴定分泌仅与抗原X结合而不与抗原Y结合的抗体的B细胞。在单细胞测定中，用Fluor C标记的保守抗原X结构域用作经标记的靶标。Fluor C水华标记了含有分泌选定抗体(不与抗原Y交叉反应的对抗原X具有特异性的抗体)的ASC的笔。
表达选定抗体的B细胞数量增加的啮齿动物被实施安乐死以收获组织。对没有表现出数量增加的小鼠进行第三次免疫接种。
实例7
本实例描述了在非人动物中指导抗体产生以产生选定抗体的方法。在本实例中，选定抗体是在与人PD-1结合方面胜过天然人PD-L1和天然人PD-L2的抗体。
如实例6中所述，用递减剂量的PD-1抗原每周两次免疫接种啮齿动物。
将单独的B细胞转移到芯片的笔中，以实现一个细胞对一个笔的比率。使用包含与抗小鼠IgG连接的珠的捕获试剂、包含用Fluor A标记的抗小鼠IgG抗体的检测试剂、包含用Fluor-B标记的人PD-1的经标记的靶标和过量的人血清执行基于珠的测定。然后使此测定混合物流入芯片微流体通道中，使得珠被定位于含有单独隔离的ASC的每个笔的开口处。Fluor-A水华标记了具有分泌IgG抗体的ASC的笔，Fluor B水华标记了具有分泌与PD-1结合的抗体的ASC的笔。记录由Fluor A水华、Fluor B水华或双阳性Fluor A和Fluor B水华标记的笔的笔ID编号。
第二次执行基于珠的测定，只是这一次，向测定中添加递增量的PD-L1。Fluor A/Fluor B双水华允许鉴定含有产生PD-1特异性抗体的ASC的笔，并且在PD-L1的存在下维持的信号强度表明重组产生的抗体在结合PD-1方面胜过PD-L1。记录以在PD-L1的存在下维持的信号强度表现出双水华的笔的笔编号。
第三次执行基于珠的测定，只是这一次，向测定中添加递增量的PD-L2。Fluor A/Fluor B双水华允许鉴定含有产生PD-1特异性抗体的ASC的笔，并且在PD-L2的存在下维持的信号强度表明重组产生的抗体在结合PD-1方面胜过PD-L2。记录以在PD-L2的存在下维持的信号强度表现出双水华的笔的笔编号。理想的是，有一个笔，其被鉴定为含有产生PD-1特异性抗体的ASC，该抗体在与PD-1结合方面可以胜过PD-L1和PD-L2两者。
记录对Fluor A和Fluor B水华呈双阳性的笔，并且对来自这些笔的抗体的HC和LC的可变区进行测序。将序列克隆到载体中，并且将载体转染到293T细胞中用于重组抗体产生。从293T细胞培养物的上清液中收集抗体，并且然后在递增量的PD-L1的存在下测试与重组PD-1的结合。这里，用在给定波长发射信号的荧光团标记PD-1，并且重组产生的抗体与珠结合，如在免疫沉淀测定中一样。将经标记的PD-1与结合到珠上的抗体混合。洗涤珠用于非特异性结合。在给定波长检测到信号后，检测包含经标记的PD-1和重组产生的抗体的免疫复合物。然后用递增量的PD-L1和/或PD-L2执行此程序。在PD-L1和/或PD-L2的存在下维持的信号强度表明重组产生的抗体在结合PD-1方面胜过PD-L1和PD-L2。
产生与PD1结合但不与PD-L1或PD-L2完全竞争的B细胞的动物用与SigmaAdjuvant组合的2.5μg PD1免疫接种，进行3次另外的加强。小鼠在最后一次加强后三天放血并且筛选分离的B细胞，如上文所述。
实例8
本实例描述了在非人动物中指导抗体产生以产生选定抗体的方法。在本实例中，选定抗体是对抗原X具有特定结合亲和力的抗体。
本实验的目标是鉴定以亚皮摩尔亲和力结合至抗原X的抗体。亲和力只能在抗体的克隆来源上测量，并且因此血清不能用于鉴定已经产生高亲和力抗体的小鼠。传统上，小鼠被实施安乐死以获得用于杂交瘤融合和表征的B细胞，排除了任何另外的免疫引导。将实时非终末B细胞采样和询问与适应性免疫接种策略相结合，提供了相对于产生高亲和力抗体的传统方法的显著优势，因为其利用竞争性的体内环境来强制并且然后指导更高亲和力B细胞克隆的进化。
用递减剂量的抗原X对啮齿动物皮下免疫接种，每两周一次，总共四次加强。触发免疫原含有与弗氏完全佐剂组合的40μg抗原X。随后的三次加强含有与Sigma Adjuvant组合的20μg、10μg或5μg抗原X。最后一次加强后四天，从啮齿动物中收获血液，并且对采集的血液样品进行B细胞富集，基本上如实例1中所述。基本上如实例1中所述，使用微流体装置将细胞装入笔中，并且筛选与加荧光标记的抗原X的结合。鉴定产生抗-抗原X抗体的ASC，并且随后将其输出笔并且放入孔中进行分子回收，并且基本上如实例1中所述确定重组克隆的亲和力。
通过KinExA(Sapidyne公司)或卡特拉(Carterra)高通量筛选装置(卡特拉公司)确定亲和力。
产生表达高亲和力抗体的B细胞的动物然后用与Sigma Adjuvant 组合的2.5μg抗原每周加强一次，进行3次另外的加强。将小鼠在最后一次加强后三天放血，并且对分离的B细胞筛选与抗原X的结合，基本上如实例1中所述。
然后将B细胞输出用于另一轮的测序、克隆、表达和亲和力表征。B细胞达到亲和力标准的啮齿动物将被实施安乐死以收获组织。产生达不到亲和力要求的B细胞的啮齿动物将用与Sigma Adjuvant组合的2.5μg抗原进行加强，每周一次，进行3次另外的加强。筛选并加强动物，直到达到设计目标。在一轮筛选中，除了经标记的靶标包含用Alexa594标记的抗原X而不是EGFR之外，富集的B细胞经历实例2中所述的单细胞测定。展示重叠信号的点鉴定分泌对抗原X具有特异性的抗体的ASC。用一定量的用Alexa 488标记的抗原X重复单细胞成像测定，该量比用Alexa 594标记的抗原X的量少约10倍。那些保留重叠信号的点(来自Alexa594和Alexa 488)展示出更高的对抗原X的亲和力，并且因此显示出对靶标的所需的高亲和力。
实例9
本实例描述了在非人动物中指导抗体产生以产生选定抗体的方法。在本实例中，选定抗体是结构域特异性抗体。
本实例描述了针对多结构域人蛋白质(蛋白质Z)的结构域1的抗体的鉴定。用蛋白质Z的完整胞外结构域免疫接种产生不平衡的免疫反应，其中一些结构域高度过度呈现并且在多克隆血清效价水平上检测不到结构域1抗体。用单独的结构域1免疫接种不会产生能够识别天然胞外结构域的抗体。需要单细胞筛选来鉴定在用蛋白质的天然胞外结构域免疫接种之后已产生稀少的结构域1抗体的小鼠。用结构域1肽和全长蛋白质的后续加强扩增这些B细胞，以便扩增结构域1反应性B细胞，但不产生对单独的肽的从头反应。
用蛋白质Z免疫接种小鼠，总共四次间隔两周的加强。触发加强含有50μg在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化的抗原，并且进行皮下施用。后续加强在SAS中乳化，并且分别用25μg和15μg抗原一半腹膜内施用和一半皮下施用。然后用PBS中的50μg抗原加强小鼠，并且4天之后采集血液。分离CD138+B细胞，并且将其添加到IgG捕获珠和差异标记的荧光结构域1肽和完整胞外结构域的混合物中。基本上如实例2中所述，将混合物作为单层铺板在微量滴定板中，并且然后孵育以允许抗体和抗原捕获。使用细胞成像将产生结构域1特异性抗体的ASC鉴定为双重染色荧光斑块(实例2)。
将已经产生结构域1特异性B细胞的小鼠用5μg结构域1肽加强，每周两次，持续两周。然后对小鼠用PBS中的50μg完整可溶性胞外结构域加强并且4天之后采集血液。对小鼠筛选与结构域1的结合以及与全长蛋白质的结合两者。目的动物被实施安乐死用于组织处理和筛选。对其他小鼠重复该过程，直到达到设计目标。
所描述的方法可以应用于任何抗体发现活动，其中免疫反应主要针对低兴趣的蛋白质区域。常见的实例是具有免疫显性区域的蛋白质，该区域在抗体库中被过度呈现。免疫反应将需要从该结构域引导到目的区域上。
实例10
本实例描述了在非人动物中指导抗体产生以产生选定抗体的方法。在本实例中，选定抗体是与多聚体抗原的多聚化结构域结合的抗体。
本实验描述了对与异源三聚体跨膜蛋白结合的抗体的鉴定。用天然蛋白质免疫接种无法引发免疫反应。用单独的可溶性结构域免疫接种的小鼠确实产生了免疫反应，但是抗体不识别蛋白质的天然构象。用制备为具有越来越类似天然结构的一系列免疫原对小鼠进行免疫接种：免疫原1含有由抗原X的胞外结构域构成的蛋白质；免疫原2含有与多聚化结构域连接以形成异源三聚体复合物的蛋白质，并且免疫原3含有编码完整复合物的DNA。
用在与Sigma Adjuvant的复合物中的5μg免疫原1对啮齿动物进行皮下免疫接种。这些动物每周被加强两次，总共6次加强。在最后一次加强后四天从小鼠中采集血液，并且磁性分离CD138+B细胞。将细胞添加到IgG捕获珠和差异标记的荧光免疫原1和免疫原2的混合物中。基本上如实例2中所述，将混合物作为单层铺板在微量滴定板中，并且然后孵育以允许抗体和抗原捕获。使用细胞成像将抗原特异性ASC鉴定为双重染色荧光斑块(实例2)。产生稀少的与免疫原2自然交叉反应的抗体的小鼠被鉴定用于进一步引导。这些小鼠接受在与Sigma Adjuvant/>的复合物中的5μg免疫原2的另外的每周两次加强，总共6次加强以扩大反应。啮齿动物在最后一次加强后四天放血，并且分离B细胞用于针对免疫原2和免疫原3的单细胞筛选。携带编码识别免疫原3的抗体的B细胞的动物用编码完整复合物的质粒进行遗传免疫接种。这些啮齿动物用基因枪子弹每周加强两次，总共6次加强。从小鼠中采集血液用于单细胞筛选，并且对目的小鼠实施安乐死并收获组织。产生较弱反应的小鼠被加强和筛选，直到达到设计目标。
实例11
本实例描述了单细胞测定用于通过ASC分泌的抗体的亲和力对ASC进行排序的示例性应用。
分离产生EGFR特异性抗体的杂交瘤克隆，并且在生物层干涉测量平台(赛多利斯公司(Satorius))上确定每个克隆的EGFR结合特征。选择产生在EGFR结合亲和力范围(KD 4.7x10-10至1.1x10-8)内的抗体的五个杂交瘤克隆用于评价单细胞测定。选定的杂交瘤克隆以及由每个杂交瘤克隆产生的抗体的结合特征列于表2中。
表2
杂交瘤名称 KD(M) k结合(1/ms) K解离(1/s)
7.35.4 4.7x10-10 3.9x105 1.8x10-4
12B4.1 2.4x10-9 7.5x105 1.8x10-3
1C2.1 9.5x10-9 5.3x105 5.0x10-3
7C11.1 1.1x10-8 5.3x105 5.7x10-3
2G8.1 2.3x10-8 7.5x105 1.8x10-2
如实例2中所述，用表2的杂交瘤克隆执行单细胞筛选测定。简而言之，将杂交瘤12B4.1的克隆与包含连接至珠的山羊抗人Fc的捕获试剂、包含用产生绿色荧光信号的Alexa 488标记的山羊抗人Fc抗体的检测试剂和包含用产生红色荧光信号的Alexa 594标记的EGFR的经标记的靶标混合。然后将包含捕获试剂、检测试剂、经标记的靶标和12B4.1克隆的混合物转移到384孔板的单个孔中。用表2的每个杂交瘤克隆的克隆执行这些步骤，使得板的每个孔含有包含单个杂交瘤的克隆的混合物(例如，一个孔用于杂交瘤1C2.1克隆，一个孔用于杂交瘤7C11.1克隆，一个孔用于杂交瘤2G8.1克隆，一个孔用于杂交瘤12B4.1克隆和一个孔用于杂交瘤7.35.4克隆)。在混合物的组分沉降到孔中之后，使用Incucyte活细胞分析系统执行细胞成像，并且确定每个孔的六个单独细胞(ASC)的绿色荧光和红色荧光的相对荧光单位(RFU)值。示例性图像如图9所示。记录RFU值，并且确定绿色RFU(代表IgG分泌)与红色RFU(代表EGFR结合)的比率，以使数据归一化(表3)。RFU归一化很重要，因为IgG分泌水平可能会受到细胞健康、细胞周期和ASC的其他特性的影响。将单个杂交瘤的六个克隆的RFU比率平均并记录为比率平均值(表3)。
表3
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然后将每个杂交瘤的比率平均值作为表2中其KD值的函数绘图(图10)。如图10所示，比率平均值和KD值(如在生物层干涉测量平台(赛多利斯公司)上所确定的)在统计显著性上相关(R2＝0.932)。综上所述，这些结果证明了单个克隆的归一化RFU可用于抗体亲和力排序。这些结果进一步表明，本发明披露的单细胞测定可以用于根据其分泌的抗体的亲和力对单独ASC进行排序。
实例12
本实例描述了一种指导小鼠免疫反应以产生抗体的方法，该抗体与抗原的人和食蟹猴(cyno)直系同源物均交叉反应。本实例探讨了不同免疫接种策略对交叉反应性抗体形成的影响、以及单细胞筛选策略检测那些变化的能力。本实例也展示了单细胞测定在免疫引导中的应用。
免疫接种
用抗原的人直系同源物每2周免疫接种一次CD1小鼠。对于初始加强，用25μg在完全弗氏佐剂(CFA)中的人抗原对小鼠进行皮下免疫接种。第二次加强含有与50％ SigmaAdjuvant System(SAS)组合的25μg人抗原，并且一半皮下施用，一半腹膜内施用。第三个剂量具有与50％ SAS组合的15μg人抗原，并且一半皮下施用，一半腹膜内施用。小鼠休息14周，并且然后用不含佐剂的25μg人抗原(在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中)在腹膜腔中加强。加强后四天采集血液用于血清学和单细胞筛查(图11，放血1)。
然后将小鼠分成两个组：第2组通过每周一次用食蟹猴抗原皮下加强而免疫引导至产生人/食蟹猴交叉反应性抗体，而第1组作为对照组并且用人抗原加强。两个组的小鼠在第八次加强后四天放血(图11，放血2)，并且制备血液用于分析。
在第八次加强后，将来自第1组的小鼠分成两个亚组(第1A组和第1B组)，并且给予食蟹猴抗原(第1B组)或人抗原(第1A组)的单次无佐剂加强。两个亚组的小鼠在加强后四天放血(图11，放血3)，并且制备血液用于分析。
血液制备和细胞富集
在图11中所指示的时间采集血液(放血1、放血2和放血3)。在每种情况下，将血液离心以从血细胞中分离血清。将血清用于下文所述的血清效价分析，并且通过使用CD138富集试剂盒(干细胞技术有限公司，加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华)标准方案的修改版本富集CD138+B细胞来富集血细胞中的ASC。
单细胞筛选测定
如实例2中所述，用富集的CD138+B细胞群执行单细胞筛选测定。简而言之，将富集的CD138+B细胞群与包含与3.4μm聚苯乙烯珠(Spherotech公司，伊利诺伊州森林湖)连接的山羊抗小鼠IgG Fc的捕获试剂、用产生绿色荧光信号的Alexa 488标记的食蟹猴抗原、用产生红色荧光信号的Alexa 594标记的人抗原混合，并且使用B细胞培养基作为稀释剂使达到最终浓度。使用不同的荧光信号(绿色代表食蟹猴抗原，并且红色代表人抗原)允许单细胞测定区分仅与人直系同源物结合的单细胞、仅与食蟹猴直系同源物结合的单细胞和与两种直系同源物结合的单细胞。将混合物转移到384孔板的单个孔中，并且最终富集的B细胞浓度为每孔约2-3μL细胞混合物。在允许混合物的组分在孔中沉降约10分钟之后，使用Incucyte活细胞分析系统执行细胞成像。确定了绿色荧光和红色荧光的RFU值。
血清效价分析
将来自放血1和放血3的血清稀释至1:100、1:1000和1:10,000的最终浓度，并且然后添加到具有捕获的生物素化抗原的珠中，这些珠铺板在V形底96孔板中。将混合物在室温下孵育1小时。然后将珠洗涤并且以5μg/mL的最终浓度重新悬浮于30μg山羊抗小鼠IgG Fc(杰克逊免疫研究公司(Jackson Immunoresearch))中。在孵育15分钟之后，将珠用FACS缓冲液洗涤并重新悬浮在FACS缓冲液中。然后制备板用于流式细胞术。
结果与讨论
第1组和第2组小鼠最初以相同的方式加强，并且血清效价分析表明，所有小鼠对人直系同源物和食蟹猴直系同源物均产生了强烈的免疫反应，但效价数据不能区分仅食蟹猴结合物与人-食蟹猴交叉反应性结合物(图12，放血1)。单细胞筛选用于鉴定在每只单独小鼠中仅与人直系同源物结合、仅与食蟹猴直系同源物结合或与食蟹猴-人两者的直系同源物结合的抗体的百分比(图13和14，放血1)。虽然主要的免疫反应是针对人直系同源物，但交叉反应性抗体可以很容易地在一些小鼠中鉴定出来(图14)。
然后改变免疫接种条件，以确定单细胞筛选是否可以检测到免疫引导之后抗体库的变化。第1组小鼠继续接受人直系同源物的加强，而第2组小鼠用食蟹猴直系同源物加强(图11，放血2)。单细胞筛选测定能够在第2组小鼠中检测到结合食蟹猴直系同源物与人直系同源物的抗体百分比的强烈变化(图15)，现在仅食蟹猴抗体主导免疫反应。第1组对照小鼠在放血1和放血2时具有相似的反应(图14与15)。两个组在交叉反应性抗体的产生方面都没有显著变化。这些数据证明，单细胞筛选测定具有检测免疫反应变化的分辨率，并且免疫接种策略的小的变化可以对抗体库进行整形。
然后最后一次加强第1组小鼠，以确定免疫反应是否可以被引导至增加交叉反应性抗体，对仅食蟹猴具有最小的反应。先前的数据证明，对食蟹猴抗原有强烈的从头反应，并且多次加强将不产生所需的反应。因此，第1组小鼠接受了25μg蛋白质和无佐剂的单次加强，以使从头反应最小化。第1A组接受人直系同源物的加强，并且第1B组接受食蟹猴直系同源物的加强。接受人加强的小鼠(第1A组)的交叉反应性抗体百分比相对于放血1没有变化(图16-17)。仅用人抗原加强的小鼠中缺乏变异突出了单细胞筛选的可再现性。相比之下，食蟹猴加强组(第1B组)的交叉反应性抗体百分比显著增加(图16)，其中交叉反应性抗体具有2-16倍范围内的增加(图17)。与单独的食蟹猴结合的抗体百分比最小，表明单次加强使仅食蟹猴抗体的从头产生最小化。食蟹猴加强组(第1B组)中的所有小鼠现在均达到设计目标，使用标准多克隆血清学无法辨别最高的动物(图18)。这可能是由于血清含有整个免疫接种活动中所产生的所有抗体的多克隆混合物，而新形成的ASC仅贡献库的很小百分比。
总之，这些结果表明，通过免疫引导，通过例如用不同的直系同源物抗原加强，可以获得不同的免疫反应。这些结果进一步支持，与不能区分仅结合人直系同源物的抗体与仅结合食蟹猴直系同源物的抗体与结合两种直系同源物(与人直系同源物和食蟹猴直系同源物两者交叉反应)的抗体的多克隆血清效价分析不同，本披露的单细胞筛选测定具有检测免疫反应和免疫库的变化所需要的分辨率和灵敏度，这些变化允许跟踪或监测抗体产生，即使在免疫接种策略仅发生小的变化时也是如此。
实例13
本实例描述了一种引导免疫反应以增加与多结构域蛋白质的人直系同源物和食蟹猴直系同源物交叉反应的抗体比例的方法。
先前曾尝试产生针对作为多结构域蛋白质的抗原的人/食蟹猴交叉反应性抗体。食蟹猴直系同源物和人直系同源物具有低于80％的同源性。在先前的尝试中，人抗原的加强与食蟹猴抗原的加强交替进行，该方法导致对每种直系同源物蛋白质的强烈的从头反应，但非常少的抗体是交叉反应的。这里，在本实例中，小鼠最初用人蛋白质的完整胞外结构域(抗原1)加强，随后用蛋白质的亚结构域(抗原2)加强。食蟹猴亚结构域和人亚结构域具有大于80％的同源性。
免疫接种
CD-1小鼠用抗原1每两周免疫接种一次，总共四次加强(图19)。第一次加强是在CFA中乳化的50μg抗原1，并且皮下注射。第二次加强是与50％ SAS组合的25μg抗原1，一半皮下递送，另一半腹膜内递送。第三次加强是与50％ SAS组合的15μg抗原1，并且一半皮下注射和一半腹膜内注射到小鼠体内。第四次加强是在没有佐剂的情况下的25μg抗原1。四天后采集血液用于单细胞筛选(放血1)。在放血1后施用两次另外的加强。每次加强用25μg抗原2，并且每次加强后四天采集血液(放血2和放血3)。
血液制备和细胞富集
如图19所指示，在整个免疫接种活动中采集三次血液(放血1、放血2、放血3)。在每种情况下，将血液离心以从血细胞中分离血清。将血清用于下文所述的血清效价分析，并且通过使用CD138富集试剂盒(干细胞技术有限公司，加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华)标准方案的修改版本富集CD138+B细胞来富集血细胞中的ASC。
单细胞筛选测定
如实例2中所述，用富集的CD138+B细胞群执行单细胞筛选测定。简而言之，将富集的CD138+B细胞群与包含与3.4μm聚苯乙烯珠(Spherotech公司，伊利诺伊州森林湖)连接的山羊抗小鼠IgG Fc的捕获试剂、用产生绿色荧光信号的Alexa 488标记的食蟹猴抗原、用产生红色荧光信号的Alexa 594标记的人抗原、以及胜过His标签特异性效价的至少100倍摩尔过量的六His蛋白(GenScript RP11737)混合，并且使用B细胞培养基作为稀释剂使达到最终浓度。使用不同的荧光信号(绿色代表食蟹猴抗原，并且红色代表人抗原)允许单细胞测定区分仅与人直系同源物结合的单细胞、仅与食蟹猴直系同源物结合的单细胞和与两种直系同源物结合的单细胞。将混合物转移到384孔板的单个孔中，并且最终富集的B细胞浓度为每孔约2-3μL细胞混合物。在允许混合物的组分在孔中沉降约10分钟之后，使用Incucyte活细胞分析系统执行细胞成像。确定了绿色荧光和红色荧光的RFU值。
血清效价分析
将血清稀释至1:100、1:1000和1:10,000的最终浓度，并且然后添加到具有捕获的生物素化抗原的珠中，这些珠铺板在V形底96孔板中。将混合物在室温下孵育1小时。然后将珠洗涤并且以5μg/mL的最终浓度重新悬浮于30μg山羊抗小鼠IgG Fc(杰克逊免疫研究公司(Jackson Immunoresearch))中。在孵育15分钟之后，将珠用FACS缓冲液洗涤并重新悬浮在FACS缓冲液中。然后制备板用于流式细胞术。
结果与讨论
来自放血1的血清效价能够检测到对人抗原的强烈的免疫反应，和低但可检测的与食蟹猴抗原的结合(图20)。然而，多克隆效价数据不能区分仅结合食蟹猴抗原的抗体和可以与人和食蟹猴两者交叉反应的那些抗体。相比之下，单细胞筛选能够检测到仅与人抗体的结合、仅与食蟹猴抗体的结合以及与人和食蟹猴交叉反应性抗体的结合(图21-22)。血清效价和单细胞筛选两者都证明，主导的免疫反应只限于仅结合人直系同源物的抗体。虽然产生了一些交叉反应性抗体，但大多数食蟹猴反应不能与人直系同源物结合，并且需要另外的免疫接种。
然后用人抗原的亚结构域(抗原2)加强小鼠，该亚结构域相对于全长蛋白质具有更高程度的人/食蟹猴同源性。小鼠最初在腹膜腔内接受25μg抗原2(没有佐剂)的注射。然后对小鼠放血(放血2)，并且筛选样品与食蟹猴直系同源物和人直系同源物的结合。此加强没有产生足够强的免疫反应来有把握地鉴定交叉反应性抗体。因此，用与50％ SAS组合的25μg抗原2对小鼠进行了一次另外的加强。在加强后四天对小鼠放血(放血3)，并且如上所述分离和筛选CD138+ASC。本实验强调了使用非终末采样以允许在需要时进行调整和加强扩展的价值。
用抗原2加强产生了对抗原的食蟹猴直系同源物的血清效价的强烈增加(图23)。与这一观察结果一致，单细胞测定还检测到相对于放血1，在放血3中仅食蟹猴抗体和食蟹猴-人交叉反应性抗体(图24)均有所增加。然后可以通过绘制仅结合食蟹猴直系同源物与结合人直系同源物和食蟹猴直系同源物两者的百分比来鉴定目的动物。这个图揭示了一些小鼠对单独的食蟹猴直系同源物产生反应，而另一些小鼠具有强烈的交叉反应性。使用标准多克隆血清学这将是无法辨别的。
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本文描述了本披露的优选实施例，包括诸位发明人已知用于实施本披露的最佳方式。在阅读以上描述后，那些优选实施例的变化对于本领域普通技术人员可能变得显而易见。诸位发明人预期熟练技术人员视情况采用此类变化，并且诸位发明人旨在以除本文特别描述外的方式实施本披露。因此，本披露包括所附权利要求中叙述的主题的为适用法律所允许的所有修改和等同物。此外，除非本文中另外指示或上下文另外明显相矛盾，否则本披露涵盖上述要素以其所有可能变化的任何组合。

Claims (81)

1.一种监测非人动物中的选定抗体产生的方法，所述方法包括
a.用免疫原免疫接种非人动物；
b.从所述非人动物中获得包含抗体分泌细胞(ASC)的血液样品；以及
c.单独地测定在该血液样品或其级分中存在的ASC的选定抗体产生。
2.一种在非人动物中指导抗体产生以产生选定抗体的方法，所述方法包括：
a.用免疫原对非人动物进行初始免疫接种；
b.从所述非人动物中获得包含抗体分泌细胞(ASC)的血液样品；
c.单独地测定在该血液样品或其级分中存在的ASC的选定抗体产生；以及
d.当产生选定抗体的ASC的百分比低于阈值时，执行步骤循环，其中该循环包括：
i.当产生选定抗体的ASC的百分比低于阈值时，用免疫原对非人动物进行后续免疫接种，
ii.从所述非人动物中获得包含ASC的血液样品，
iii.单独地测定在该血液样品或其级分中存在的ASC的选定抗体产生。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中该测定包括单细胞活细胞测定。
4.如权利要求3所述的方法，其中同时测定多个ASC。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，该方法包括将该血液样品或其级分施加到基质，并且将该基质的唯一地址分配给每一ASC。
6.如权利要求5所述的方法，其中该测定的结果是对产生选定抗体的每一ASC的鉴定。
7.如权利要求6所述的方法，其中该结果包括对产生选定抗体的每一ASC的唯一地址的鉴定。
8.如权利要求2-7中任一项所述的方法，其中该循环被执行至少一次。
9.如权利要求8所述的方法，其中重复该循环，直到如(iii)中所测定的，产生选定抗体的ASC的数量等于或高于该阈值。
10.如权利要求9所述的方法，其中该循环被重复至少两次。
11.如权利要求2-10中任一项所述的方法，其中该后续免疫接种的免疫原不同于该初始免疫接种的免疫原。
12.如权利要求2-11中任一项所述的方法，其中每次后续免疫接种与先前免疫接种的不同之处在于：(A)将不同的免疫原、佐剂和/或免疫调节剂施用至该非人动物，(B)将不同剂量的该免疫原施用至该非人动物，(C)该免疫原、该佐剂、该免疫调节剂的每次施用之间的时间不同，和/或(D)该免疫原、该佐剂、该免疫调节剂的每次施用的施用途径不同。
13.如权利要求2-12中任一项所述的方法，其中每次免疫接种该非人动物时使用不同的免疫原。
14.一种在非人动物中产生选定抗体的方法，该方法包括
a.用免疫原对非人动物进行初始免疫接种；
b.从所述非人动物中获得包含抗体分泌细胞(ASC)的血液样品；
c.单独地测定在该血液样品或其级分中存在的ASC的选定抗体产生；
d.当产生选定抗体的ASC的百分比低于阈值时，执行步骤循环，其中该循环包括：
i.当产生选定抗体的ASC的百分比低于阈值时，用免疫原对非人动物进行后续免疫接种，
ii.从所述非人动物中获得包含ASC的血液样品，
iii.单独地测定在该血液样品或其级分中存在的ASC的选定抗体产生，以及
e.分离这些选定抗体和/或产生这些选定抗体的ASC。
15.如权利要求14所述的方法，该方法包括确定编码由ASC产生的选定抗体的重链可变区的核苷酸序列和编码由该ASC产生的选定抗体的轻链可变区的核苷酸序列，将包含该编码选定抗体的重链可变区的核苷酸序列的第一载体和包含该编码选定抗体的轻链可变区的核苷酸序列的第二载体引入宿主细胞中，以及分离由该宿主细胞产生的抗体。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该测定包括：
a.将该基质内的这些ASC与(i)结合至这些选定抗体并且包含固体支持物的捕获试剂、(ii)结合至这些选定抗体并且包含第一可检测标记的检测试剂以及(iii)与这些选定抗体结合的经标记的靶标组合，其中该经标记的靶标包含与该第一可检测标记不同的第二可检测标记；
b.测定该第一可检测标记和该第二可检测标记；以及，
c.鉴定在该基质内检测到该第一可检测标记和该第二可检测标记两者的位置，其中每个所鉴定位置定位产生选定抗体的单独ASC。
17.如权利要求16所述的方法，其中该捕获剂包含结合至与固体支持物附接的抗体Fc结构域的抗体。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中该检测剂包含结合至与第一可检测标记附接的抗体Fc结构域的抗体。
19.如权利要求18所述的方法，其中结合至该捕获剂的抗体Fc结构域的抗体与该检测剂的抗体相同。
20.如权利要求16-19中任一项所述的方法，其中该组合发生在孔中，并且该捕获剂在该孔中形成单层，任选地其中首先将这些ASC暴露于该捕获试剂、该检测试剂和/或该经标记的靶标，该捕获试剂、该检测试剂和/或该经标记的靶标处于该孔中或紧接着之后被添加到该孔中。
21.如权利要求20所述的方法，其中该方法包括鉴定在该孔内检测到该第一可检测标记和该第二可检测标记两者的位置，其中每个所鉴定位置定位产生选定抗体的单独ASC。
22.如权利要求16-19中任一项所述的方法，其中该组合发生在微流体室或纳米流体室、微孔装置或纳米孔装置、微毛细管或纳米毛细管、或纳米流体芯片的纳米笔中。
23.如权利要求22所述的方法，其中该组合发生在纳米流体芯片的纳米笔中。
24.如权利要求23所述的方法，其中该方法包括鉴定在该纳米流体芯片内检测到该第一可检测标记和该第二可检测标记两者的每个笔的位置，其中每个所鉴定位置定位产生选定抗体的单独ASC。
25.如权利要求23或24所述的方法，其中该血液样品的单一ASC通过光电定位(OEP)被移动到该纳米流体芯片的笔中。
26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中这些选定抗体结合至与用于免疫接种该非人动物的免疫原相同或相似的靶标。
27.如权利要求26所述的方法，其中这些选定抗体在一种或多种竞争性结合剂的存在下与该靶标结合。
28.如权利要求27所述的方法，其中在该测定期间，将这些竞争性结合剂与这些ASC、该捕获试剂、该检测试剂和该经标记的靶标组合。
29.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中这些选定抗体以目标亲和力结合靶标，任选地其中这些选定抗体对该靶标的KD为约10-11M至约10-9M。
30.如权利要求29所述的方法，其中在第一轮中用第一量的该经标记的靶标且在第二轮中用第二量的该经标记的靶标执行该测定，其中该第一量大于该第二量，任选地其中进一步在第三轮中用第三量的该经标记的靶标执行该测定并且该第三量小于该第二量，其中当该ASC在每一轮中与该经标记的靶标结合时，该ASC产生选定抗体。
31.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中这些选定抗体与靶标及其直系同源物或旁系同源物结合，任选地其中该靶标是人蛋白质并且该直系同源物是食蟹猴蛋白质。
32.如权利要求31所述的方法，其中将第二经标记的靶标与这些ASC、该捕获试剂、该检测试剂和该经标记的靶标组合，其中该第二经标记的靶标包含与不同于该第一可检测标记和该第二可检测标记的第三可检测标记附接的直系同源物，其中该方法进一步包括测定该第三可检测标记并且鉴定检测到该第一可检测标记、该第二可检测标记和该第三可检测标记的一个或多个位置，其中每个所鉴定位置定位产生选定抗体的单独ASC。
33.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中这些选定抗体与靶标结合，而不与其直系同源物或旁系同源物结合。
34.如权利要求33所述的方法，其中将第二经标记的靶标与这些ASC、该捕获试剂、该检测试剂和该经标记的靶标组合，其中该第二经标记的靶标包含与不同于该第一可检测标记和该第二可检测标记的第三可检测标记附接的直系同源物，其中该方法进一步包括测定该第三可检测标记并且鉴定仅检测到该第一可检测标记和该第二可检测标记而未检测到该第三可检测标记的一个或多个位置，其中每个所鉴定位置定位产生选定抗体的单独ASC。
35.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中这些选定抗体与该靶标的一部分结合。
36.如权利要求35所述的方法，其中将第二经标记的靶标与这些ASC、该捕获试剂、该检测试剂和该经标记的靶标组合，其中该第二经标记的靶标包含与不同于该第一可检测标记和该第二可检测标记的第三可检测标记附接的该靶标的该部分，并且其中该方法进一步包括测定该第三可检测标记并且鉴定检测到该第一可检测标记、该第二可检测标记和该第三可检测标记的一个或多个位置，其中每个所鉴定位置定位产生选定抗体的单独ASC。
37.如权利要求36所述的方法，其中该靶标是包含多个结构域的蛋白质，并且这些选定抗体仅与该靶标的一个结构域结合，其中该经标记的靶标包含与该第二可检测标记附接的该靶标的胞外结构域，并且该第二经标记的靶标包含与该第三可检测标记附接的一个结构域。
38.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中这些选定抗体结合至在该靶标二聚化或多聚化后形成的构象表位，并且该靶标包含二聚化结构域或多聚化结构域。
39.如权利要求38所述的方法，其中该经标记的靶标包含与该第二可检测标记附接的免疫原的胞外结构域，其中将该第二经标记的靶标与这些ASC、该捕获试剂、该检测试剂和该经标记的靶标组合，其中该第二经标记的靶标包含与不同于该第一可检测标记和该第二可检测标记的第三可检测标记附接的该免疫原的二聚化结构域或多聚化结构域，并且其中该方法进一步包括测定该第三可检测标记并且鉴定检测到该第一可检测标记、该第二可检测标记和该第三可检测标记的一个或多个位置，其中每个所鉴定位置定位产生选定抗体的单独ASC。
40.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该血液样品在该免疫接种步骤后约3天至约7天从该非人动物中获得。
41.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中从该非人动物中获得的该血液样品小于或为约500μL。
42.如权利要求41所述的方法，其中该血液样品为约100μL至约250μL。
43.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中这些ASC是CD138+B细胞。
44.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中这些ASC包含迁移性浆母细胞。
45.如前述权利要求中任一项所述的方法，该方法进一步包括在测定之前去除从该非人动物中获得的该血液样品的一种或多种组分。
46.如权利要求45所述的方法，其中从该血液样品中去除红细胞、血浆和/或血小板。
47.如权利要求45或46所述的方法，其中通过选择CD138+细胞来制备该血液样品的级分。
48.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该非人动物既不经历一个或多个次级淋巴器官的切除，也不经历安乐死。
49.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中来自该血液样品的ASC不用于制造杂交瘤。
50.如权利要求2至49中任一项所述的方法，其中该非人动物是一系列非人动物中的一只，并且该测定的结果是对产生选定抗体的ASC的数量低于阈值和/或需要进一步免疫接种的非人动物的鉴定。
51.如权利要求2至50中任一项所述的方法，其中该方法的步骤在一系列非人动物上执行，并且该方法包括对该系列中的每只非人动物的血液样品的B细胞库进行谱分析并且选择该系列中具有靶B细胞谱的亚组。
52.如前述权利要求中任一项所述的方法，该方法包括当产生选定抗体的ASC的百分比等于或高于阈值时，处死该非人动物并且从该非人动物中收获组织。
53.如权利要求52所述的方法，该方法包括从该非人动物中收获脾。
54.如权利要求53所述的方法，该方法包括筛选该脾的B细胞和/或从该脾的细胞产生杂交瘤。
55.一种筛选一系列非人动物的产生选定抗体的抗体分泌细胞(ASC)的方法，所述方法包括：
根据前述权利要求中任一项所述的方法监测一系列非人动物中的非人动物中的选定抗体产生，
其中针对这些系列的每只非人动物，鉴定产生这些选定抗体的ASC的数量。
56.如权利要求55所述的方法，其中当动物的产生选定抗体的ASC的百分比低于阈值时，该方法包括进行后续免疫接种。
57.如权利要求56所述的方法，其中当动物的产生选定抗体的ASC的百分比等于或高于阈值时，该方法进一步包括从该动物中收获次级淋巴器官。
58.一种选择经免疫接种的非人动物进行后续免疫接种的方法，所述方法包括：
根据前述权利要求中任一项所述的方法监测非人动物中的选定抗体产生，
其中针对每只非人动物，鉴定产生这些选定抗体的ASC的数量，以及
当动物的产生选定抗体的ASC的百分比低于阈值时，选择该动物进行后续免疫接种。
59.一种选择经免疫接种的非人动物进行安乐死和次级淋巴收获的方法，所述方法包括：
根据前述权利要求中任一项所述的方法监测非人动物中的选定抗体产生，
其中针对每只非人动物，鉴定产生这些选定抗体的ASC的数量，以及
当动物的产生选定抗体的ASC的百分比等于或高于阈值时，选择该动物进行安乐死和次级淋巴收获。
60.一种测定产生选定抗体的ASC的方法，所述方法包括：
a.在孔中组合(i)从用免疫原免疫接种的非人动物中获得的血液样品或其级分，其中该血液样品包含抗体分泌细胞(ASC)，(ii)结合至这些选定抗体并且包含第一可检测标记的检测试剂，和(iii)与这些选定抗体结合的靶标，
其中：
(A)该靶标是经标记的靶标，该经标记的靶标包含与该第一可检测标记不同的第二可检测标记，并且在该孔中进一步组合与这些选定抗体结合并且包含固体支持物的捕获试剂以在该孔中形成单层，
或者
(B)该靶标在细胞表面上表达，并且在该孔中组合这些细胞以在该孔中形成单层，
b.当该靶标是经标记的靶标时，测定该第一可检测标记和任选地测定该第二可检测标记；
c.鉴定在该孔内检测到该第一可检测标记或者检测到该第一可检测标记和该第二可检测标记的位置，其中每个所鉴定位置定位产生选定抗体的单独ASC。
61.如权利要求60所述的方法，其中首先将这些ASC暴露于该检测试剂和/或该靶标，该检测试剂和/或该靶标处于该孔中或紧接着之后被添加到该孔中。
62.如权利要求60或61所述的方法，其中这些选定抗体结合至与用于免疫接种该非人动物的免疫原相同或相似的靶标。
63.如权利要求60-62中任一项所述的方法，其中该检测试剂包含结合至与固体支持物附接的抗体Fc结构域的抗体，并且/或者该检测试剂包含结合至与第一可检测标记附接的抗体Fc结构域的抗体。
64.如权利要求63所述的方法，其中结合至该捕获剂的抗体Fc结构域的抗体与该检测剂的抗体相同。
65.如权利要求60-64中任一项所述的方法，其中该血液样品在该免疫接种步骤后约3天至约7天从该非人动物中获得。
66.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中从该非人动物中获得的该血液样品小于或为约500μL，任选地约100μL至约250μL。
67.如权利要求60-66中任一项所述的方法，其中这些ASC是CD138+B细胞。
68.如权利要求60-67中任一项所述的方法，其中这些ASC包含迁移性浆母细胞。
69.如权利要求60-68中任一项所述的方法，该方法进一步包括在该孔中组合之前去除从该非人动物中获得的该血液样品的一种或多种组分。
70.如权利要求69所述的方法，其中从该血液样品中去除红细胞、血浆和/或血小板。
71.如权利要求69或70所述的方法，其中通过选择CD138+细胞来制备该血液样品的级分。
72.如权利要求60-71中任一项所述的方法，其中这些选定抗体在一种或多种竞争性结合剂的存在下与该靶标结合。
73.如权利要求72所述的方法，其中在该测定期间，将这些竞争性结合剂与这些ASC、该检测试剂和表达该靶标的细胞组合。
74.如权利要求60-73中任一项所述的方法，其中这些选定抗体以目标亲和力结合靶标，任选地其中这些选定抗体对该靶标的KD为约10-11M至约10-9M。
75.如权利要求74所述的方法，其中在第一轮中用第一量的表达该靶标的细胞且在第二轮中用第二量的表达该靶标的细胞执行该测定，其中该第一量大于该第二量，任选地其中进一步在第三轮中用第三量的表达该靶标的细胞执行该测定并且该第三量小于该第二量，其中当该ASC在每一轮中与该经标记的靶标结合时，该ASC产生选定抗体。
76.如权利要求60-75中任一项所述的方法，其中这些选定抗体与靶标及其直系同源物或旁系同源物结合，任选地其中该靶标是人蛋白质并且该直系同源物是食蟹猴蛋白质。
77.如权利要求76所述的方法，其中该细胞表达该靶标及其直系同源物或旁系同源物。
78.如权利要求60-77中任一项所述的方法，其中这些选定抗体与靶标结合，而不与其直系同源物或旁系同源物结合。
79.如权利要求60-78中任一项所述的方法，其中这些选定抗体与该靶标的一部分结合。
80.如权利要求79所述的方法，其中该靶标是包含多个结构域的蛋白质，并且这些选定抗体仅与该靶标的一个结构域结合，其中该经标记的靶标包含与该第二可检测标记附接的该靶标的胞外结构域，并且该第二经标记的靶标包含与该第三可检测标记附接的一个结构域。
81.如权利要求60-80中任一项所述的方法，其中这些选定抗体结合至在该靶标二聚化或多聚化后形成的构象表位，并且该靶标包含二聚化结构域或多聚化结构域。
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