JP2023543049A - 細胞表面部分の発現又はクラスター化を検出するための方法 - Google Patents

細胞表面部分の発現又はクラスター化を検出するための方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、患者試料中の少なくとも第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分の発現を検出及び／又は定量化するための方法、並びに試料中の第２の細胞表面部分との少なくとも第１の細胞表面部分のクラスター化を検出及び／又は定量化するための方法に関し、試料が、少なくとも第１及び第２の細胞表面部分に対する結合特異性を有する分子に曝露される。本開示は更に、そのような結合分子に対する対象の応答性を予測するための方法、そのような結合分子の有効性を決定するための方法、そのような結合分子の作用様式を確認するための方法、対象を治療するための方法、及び第２の細胞表面部分との第１の細胞表面部分のクラスター化を誘導する能力について１つ以上の試験薬剤をスクリーニングするための方法に関する。

Description

本開示は、好ましくは、患者の腫瘍試料における、少なくとも第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分の発現、又はクラスター化を検出及び／又は定量化するための方法に関する。ある特定の実施形態では、本開示の方法は、患者が、両方の細胞表面部分に結合する結合剤による治療から利益を得る可能性が高いかどうかを予測するために、又はそのような結合剤の作用様式を確認するために使用することができる。
がんの治療のための治療用抗体の開発は、ここ数年で急速に増加している。様々ながんの種類に関して、ある特定の患者が、特定の薬物による治療から利益を得るかどうかを評価するために診断アッセイが使用されており、その結果、それが安全及び／又は有効である可能性が高いと予測することができる。生物学的製剤又は大分子治療薬とともに使用されてきた診断アッセイの１つのカテゴリーは、患者の組織試料中の生物学的製剤によって標的化された抗原の発現レベルの試験を含む。例えば、組織生検は、患者の腫瘍から採取され、定量アッセイに供され得る。このような定量アッセイの例としては、免疫組織化学（ＩＨＣ）、二重インサイツハイブリダイゼーションアッセイ、発色性インサイツハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）アッセイ、及び蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイが挙げられる。
ＩＨＣは、例えば、乳がんにおける、例えば、ＨＥＲ２発現の評価のための標準的な試験方法であった。ＩＨＣ試験は、細胞表面上のＨＥＲ２タンパク質に結合する特定のモノクローナル又はポリクローナル抗体を利用する。レポーター機能を有する二次タグ付き抗体の付加、続いて酵素反応は、存在するＨＥＲ２タンパク質の量に比例するシグナルをもたらす。しかしながら、ＩＨＣ発現レベルのグレーディング及びスコアリングに関するガイドラインにもかかわらず、実験室間のばらつきを完全に防ぐことはできない。
ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ、及び銀増強インサイツハイブリダイゼーションアッセイは、単一又は二重プローブ技術を使用して細胞当たりの遺伝子コピー数を定量化する。ＦＩＳＨは、例えば、ＨＥＲ２試験において広く受け入れられているプラットフォームになっている。しかしながら、ＦＩＳＨアッセイは、高価で、労働集約的であり、蛍光顕微鏡検査及び高度なトレーニングを必要とする。ＣＩＳＨ及び銀増強インサイツハイブリダイゼーションなどの明視野インサイツハイブリダイゼーションアッセイは、蛍光顕微鏡検査を必要とせず、より安価である。
別の開発は、例えば、乳がんにおける総ＨＥＲ２、ＨＥＲ２ホモ二量体、又はｐ９５ＨＥＲ２発現を測定するための方法として検証されたアッセイであり、これは、タンパク質発現、二量体化、及びタンパク質間相互作用を定量化するように設計された近接ベースのアッセイである（Ｄｉａｇｎ Ｍｏｌ Ｐａｔｈｏｌ ２００９；１８：１１－２１；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．に詳細に記載されている）。
今まで、当該技術分野は、多重特異性薬剤の存在下でクラスター化する２つ以上の抗原の能力を実証するロバストな方法を欠いており、このような抗原は、通常、体細胞条件下で会合しない。ここで、本発明者らは、このようなアッセイ、及びその使用の例示的な用途を実証する。
本発明者らは、Ｔ細胞上で発現された細胞表面部分であるＣＤ１３７、及び腫瘍細胞上で発現された細胞表面部分であるＰＤ－Ｌ１の発現レベルを検出及び定量化するためのアッセイを開発した。これにより、特定の患者が、これらの２つの細胞表面部分に結合する治療に応答し、それから利益を得る可能性が高いかどうかの予測が可能になる。ある特定の実施形態では、本明細書で使用されるアッセイのように、２つの細胞表面部分が、同じ試料中に存在するときに産生されるシグナルを測定することに基づく、他の適用可能な方法が使用され得る。この文脈において、シグナルは、シグナルの存在又は不在であり得る。ある特定の実施形態では、両方のそのような読み出しは、細胞表面部分の発現レベルに関する情報を提供する。また、この方法を使用して、例えば、二重特異性又は三重特異性抗体のような多重特異性薬剤などの特定の薬物によって結合され得る任意の２つ以上の細胞表面部分の発現レベルを検出及び／又は定量化することができる。
本発明者らは、ＣＤ１３７、及びＰＤ－Ｌ１とのＣＤ１３７のクラスター化の検出及び定量化に使用されるアッセイを更に開発した。ＣＤ１３７及びＰＤ－Ｌ１は、同種の受容体－リガンド対を形成せず、それらは、タンパク質間の直接的な相互作用を自然にクラスター化又は形成しない。しかしながら、例えば、二重特異性又は三重特異性抗体のような多重特異性薬剤などの細胞表面部分の両方に同時に結合する薬物によって標的化される場合、これらの２つの細胞表面部分は、互いに近接してもたらされ、それによって、検出され得るシグナルを産生する。同様に、例えば、単一特異性抗体のような単一特異性二価薬剤、又は二重特異性若しくは三重特異性抗体のような多重特異性薬剤などの同じ細胞表面部分のうちの少なくとも２つに結合する多価薬物によって標的化される場合、少なくとも２つの細胞表面部分が、互いに近接してもたらされ、それによって、検出され得るシグナルを産生する。
ある特定の実施形態では、本開示は、腫瘍細胞及び／又は免疫系からの細胞の細胞表面上の２つ以上の標的抗原に同時に結合する、二重又は三重特異性抗体などの多重特異性薬剤の治療的使用に基づく。多重特異性薬剤は、それとともに、２つ以上の標的抗原のクラスター化を誘導する。したがって、２つ以上の抗原のクラスター化は、多重特異性薬剤の存在下でのみ生じるか、又は多重特異性薬剤が存在しない場合と比較して増加したレベルで生じる。
ある特定の実施形態では、これは、患者が処置されている薬物が、実際に２つの細胞表面部分に同時に結合し、その予測される作用様式を示すかどうかの評価を可能にする。ある特定の実施形態では、本明細書で使用されるアッセイのように、２つの細胞表面部分が、近接しているときに産生されるシグナルを測定することに基づく、他の適用可能な方法を使用することができる。この文脈において、シグナルは、アッセイのレポーター又は特徴の存在又は不在であり得る。ある特定の実施形態では、両方のそのような読み出し（レポーターの存在又は喪失）は、細胞表面部分の近接に関する情報を提供する。また、この方法を使用して、二重特異性又は三重特異性抗体のような、例えば、多重特異性薬剤などの特定の薬物に同時に結合され得る任意の２つ以上の細胞表面部分のクラスター化を検出及び／又は定量化することができる。
ある特定の実施形態では、本開示は、試料における、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分を含む、少なくとも２つの細胞表面部分のクラスター化の存在を検出及び／又は定量化するための方法であって、その方法が、
第１及び第２の細胞表面部分が、少なくとも第１及び第２の細胞表面部分に対する結合特異性を有する薬剤に曝露されている試料を、第１の細胞表面部分に特異的に結合する第１の結合分子、及び第２の細胞表面部分に特異的に結合する第２の結合分子と接触させることであって、第１及び第２の細胞表面部分が、互いに近接していない限り、第１の結合分子及び第２の結合分子のうちの少なくとも１つが、検出されない分子タグを含む、接触させること、並びに
分子タグの存在又は不在を検出して、試料における、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分のクラスター化の存在を検出すること、を含む、方法に関する。
本開示はまた、試料における、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分を含む、少なくとも２つの細胞表面部分の発現を検出及び／又は定量化するための方法であって、その方法が、
がんを有する対象由来の腫瘍生検試料を、第１の細胞表面部分を検出する少なくとも１つの結合分子、及び第２の細胞表面部分を検出する少なくとも１つの結合分子と接触させることであって、
第１の細胞表面部分を検出する少なくとも１つの結合分子、及び第２の細胞表面部分を検出する少なくとも１つの結合分子が、分子タグを含む、接触させること、
並びに
分子タグの存在又は不在を検出及び／又は定量化して、試料における、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分の発現を検出すること、を含む、方法に関する。
本開示は更に、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分、特に、免疫エフェクター細胞上で発現された部分、及び腫瘍細胞上で発現された部分に結合する薬剤又は複数の薬剤に対する、対象、特に、がん患者の応答性を予測するための方法であって、その方法が、
－対象由来の生体試料中の第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分の発現レベルを検出及び／又は定量すること、
－対象の試料中の第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分の発現レベルが、閾値レベルを上回っているか、又は下回っているかを決定すること、並びに
－対象の試料中の第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分の発現レベルが、閾値レベル以上である場合、対象が、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分に結合する薬剤又は複数の薬剤に応答する可能性が高いと予測すること、を含む、方法に関する。
本開示は更に、がんを有する、治療を必要とする対象を治療するための方法であって、その方法が、
－本明細書に記載の第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分に結合する薬剤又は複数の薬剤に対する、対象、特に、がんを有する対象の応答性を予測すること、並びに
第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分に結合する薬剤又は複数の薬剤を、応答する可能性が高い対象に投与すること、を含む、方法に関する。
本開示は更に、薬剤の有効性を決定するための方法であって、その薬剤が、第１の細胞表面部分に特異的に結合する結合ドメイン、及び第２の細胞表面部分に特異的に結合する結合ドメインを少なくとも含む結合分子を含み、その方法が、本明細書に記載されるように、薬剤で治療中の対象の生体試料中の第２の細胞表面部分との第１の細胞表面部分のクラスター化を検出及び／又は定量化することを含む、方法に関する。
本開示は更に、薬剤の作用様式を確認するための方法であって、その薬剤が、第１の細胞表面部分に特異的に結合する結合ドメイン、及び第２の細胞表面部分に特異的に結合する結合ドメインを少なくとも含む結合分子を含み、その方法が、本明細書に記載されるように、薬剤で治療中の対象の生体試料中の第２の細胞表面部分との第１の細胞表面部分のクラスター化を検出及び／又は定量化することを含む、方法に関する。
本開示は更に、治療を必要とする対象、特に、がんを有する対象を治療するための方法であって、その方法が、
－第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分に結合する薬剤で、治療を必要とする対象を治療すること、
－本明細書に記載されるように、薬剤の有効性又は薬剤の作用様式を分析すること、を含む、方法に関する。
本開示は更に、第２の細胞表面部分との第１の細胞表面部分のクラスター化を誘導する能力について１つ以上の試験薬剤をスクリーニングするための方法であって、その方法が、
－１つ以上の試験細胞培養物を、試験薬剤と接触させることであって、
試験細胞培養物が、第１の細胞表面部分を発現する細胞、及び第２の細胞表面部分を発現する細胞を含む、接触させること、
本明細書に記載されるように、第１及び第２の細胞表面部分のクラスター化のレベルを検出すること、並びに
クラスター化のレベルを、試験薬剤と接触していないか、又は参照薬剤と接触していない対照細胞培養物中でクラスター化について検出されたクラスター化のレベルと比較すること、を含み、
対照細胞培養物が、第１の細胞表面部分、及び第２の細胞表面部分を含む、方法に関する。
本開示のある特定の実施形態に従って使用されるＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイの概念の概略図である。この図におけるＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイ形式は、１つ又は２つの特定の抗原に結合する２つの一次抗体を利用し、一次抗体のうちの一方はタグを含み、他方は切断誘導部分（はさみの記号）を含む。光活性化により、抗体のうちの１つから切断誘導部分が放出すると、切断誘導部分が、他の抗体からのタグの切断を誘導する。タグによって産生されたシグナルは、その後、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって測定される。 しかしながら、本明細書に示される開示は、この図に提示されるアッセイ形式に限定されない。 一次抗体を使用したＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイの形式の例の概略図である。この図において、第１及び第２の細胞表面部分は、異なる細胞表面部分である。しかしながら、本開示はまた、第１及び第２の細胞表面部分が同じである実施形態も含む。 Ａ）細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、並びに細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子であり、第１の結合分子が、切断可能なリンカーを介して第１の結合分子に結合した第１の分子タグを含み、第２の結合分子が、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第３の結合分子が、切断可能なリンカーを介して第３の結合分子に結合した第２の分子タグを含み、第４の結合分子が、切断誘導部分（はさみの記号）を含む。 Ｂ）細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、並びに細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子であり、第２の結合分子が、切断可能なリンカーを介して第２の結合分子に結合した第１の分子タグを含み、第１の結合分子が、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第４の結合分子が、切断可能なリンカーを介して第４の結合分子に結合した第２の分子タグを含み、第３の結合分子が、切断誘導部分（はさみの記号）を含む。 Ｃ）細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、並びに細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子であり、第１の結合分子が、切断可能なリンカーを介して第１の結合分子に結合した第１の分子タグを含み、第２の結合分子が、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第４の結合分子が、切断可能なリンカーを介して第４の結合分子に結合した第２の分子タグを含み、第３の結合分子が、切断誘導部分（はさみの記号）を含む。 Ｄ）細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、並びに細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子であり、第２の結合分子が、切断可能なリンカーを介して第２の結合分子に結合した第１の分子タグを含み、第１の結合分子が、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第３の結合分子が、切断可能なリンカーを介して第３の結合分子に結合した第２の分子タグを含み、第４の結合分子が、切断誘導部分（はさみの記号）を含む。 各標的についての２つの一次抗体及び二次抗体を使用するＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイの形式の例の概略図である。この図において、第１及び第２の細胞表面部分は、異なる細胞表面部分である。しかしながら、本開示はまた、第１及び第２の細胞表面部分が同じである実施形態も含む。 Ａ）細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子であり、 第１及び第３の結合分子が、それぞれ、切断可能なリンカーを介してそれらに結合した第１及び第２の分子タグを含み、第５の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第６の結合分子が、第４の結合分子に結合し、切断誘導部分（はさみの記号）を含む。 Ｂ）細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子であり、 第２及び第４の結合分子が、それぞれ、切断可能なリンカーを介してそれらに結合した第１及び第２の分子タグを含み、第５の結合分子が、第１の結合分子に結合し、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第６の結合分子が、第３の結合分子に結合し、切断誘導部分（はさみの記号）を含む。 Ｃ）細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子であり、 第１及び第３の結合分子が、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第５の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介して第５の結合分子に結合した第１の分子タグを含み、第６の結合分子が、第４の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介して第６の結合分子に結合した第２の分子タグを含む。 Ｄ）細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子であり、 第２及び第４の結合分子が、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第５の結合分子が、第１の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介して第５の結合分子に結合した第１の分子タグを含み、第６の結合分子が、第３の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介して第６の結合分子に結合した第２の分子タグを含む。 Ｅ）細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子であり、 第１の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第４の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含み、第５の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第６の結合分子が、第３の結合分子に結合し、切断誘導部分（はさみの記号）を含む。 Ｆ）細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子であり、 第１の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第３の結合分子が、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第５の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第６の結合分子が、第４の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含む。 Ｇ）細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子であり、 第１の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第４の結合分子が、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第５の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第６の結合分子が、第３の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含む。 Ｈ）細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子であり、 第２の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第３の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含み、第５の結合分子が、第１の結合分子に結合し、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第６の結合分子が、第４の結合分子に結合し、切断誘導部分（はさみの記号）を含む。 Ｉ）細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子であり、 第２の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第３の結合分子が、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第５の結合分子が、第１の結合分子に結合し、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第６の結合分子が、第４の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含む。 Ｊ）細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子であり、 第２の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第４の結合分子が、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第５の結合分子が、第１の結合分子に結合し、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第６の結合分子が、第３の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含む。 Ｋ）細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子であり、 第１の結合分子が、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第３の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含み、第５の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第６の結合分子が、第４の結合分子に結合し、切断誘導部分（はさみの記号）を含む。 Ｌ）細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子であり、 第１の結合分子が、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第４の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含み、第５の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第６の結合分子が、第３の結合分子に結合し、切断誘導部分（はさみの記号）を含む。 Ｍ）細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子であり、 第１の結合分子及び第４の結合分子が、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第５の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第６の結合分子が、第３の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含む。 Ｎ）細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子であり、 第２の結合分子が、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第３の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含み、第５の結合分子が、第１の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第６の結合分子が、第４の結合分子に結合し、切断誘導部分（はさみの記号）を含む。 Ｏ）細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子であり、 第２の結合分子が、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第４の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含み、第５の結合分子が、第１の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第６の結合分子が、第３の結合分子に結合し、切断誘導部分（はさみの記号）を含む。 Ｐ）細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子であり、 第２及び第３の結合分子が、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第５の結合分子が、第１の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第６の結合分子が、第４の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含む。 各標的についての２つの一次抗体及び２つの二次抗体を使用するＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイの形式の例の概略図である。この図において、第１及び第２の細胞表面部分は、異なる細胞表面部分である。しかしながら、本開示はまた、第１及び第２の細胞表面部分が同じである実施形態も含む。 Ａ）細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、第６の結合分子、第７の結合分子、並びに第８の結合分子であり、 第５の結合分子が、第１の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第７の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第６の結合分子が、第３の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含み、第８の結合分子が、第４の結合分子に結合し、切断誘導部分（はさみの記号）を含む。 Ｂ）細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、第６の結合分子、第７の結合分子、並びに第８の結合分子であり、 第５の結合分子が、第１の結合分子に結合し、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第７の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第６の結合分子が、第３の結合分子に結合し、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第８の結合分子が、第４の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含む。 Ｃ）細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、第６の結合分子、第７の結合分子、並びに第８の結合分子であり、 第５の結合分子が、第１の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第７の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第６の結合分子が、第３の結合分子に結合し、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第８の結合分子が、第４の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含む。 Ｄ）細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、第６の結合分子、第７の結合分子、並びに第８の結合分子であり、 第５の結合分子が、第１の結合分子に結合し、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第７の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第６の結合分子が、第３の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含み、第８の結合分子が、第４の結合分子に結合し、切断誘導部分（はさみの記号）を含む。 各標的についての１つの一次抗体及び一次抗体のうちの１つに対する１つの二次抗体を使用するＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイの形式の例の概略図である。この形式は、ＤＴＴを媒介した分子タグの放出を使用する。この図において、第１及び第２の細胞表面部分は、異なる細胞表面部分である。しかしながら、本開示はまた、第１及び第２の細胞表面部分が同じである実施形態も含む。 Ａ）細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第２の結合分子、及び第１の結合分子に結合する第３の結合分子であり、 第２の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第３の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含む。 Ｂ）細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第２の結合分子、及び第２の結合分子に結合する第３の結合分子であり、 第１の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第３の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含む。 標的のクラスター化を検出及び／又は定量化するための、各標的についての１つの一次抗体を使用するＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイの形式の例の概略図である。この図において、第１及び第２の細胞表面部分は、異なる細胞上で発現された異なる細胞表面部分である。しかしながら、本開示は、第１及び第２の細胞表面部分が、同じ細胞上に存在する実施形態も含む。また、この図において、第１及び第２の細胞表面部分に対する結合特異性を有する分子は、二価二重特異性抗体である。しかしながら、本開示はまた、細胞表面部分に対する結合特異性を有する分子が、多価二重特異性抗体又は多重特異性抗体、例えば、三重特異性抗体又は四重特異性抗体である状況を包含する。 Ａ）第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分に結合し、それによって、第１及び第２の細胞表面部分が互いに近接する二重特異性抗体（１００）、第１の細胞表面部分に特異的に結合する第１の結合分子、並びに第２の細胞表面部分に特異的に結合する第２の結合分子であり、 第１の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した分子タグを含み、第２の結合分子が、切断誘導部分（はさみの記号）を含む。 Ｂ）第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分に結合し、それによって、第１及び第２の細胞表面部分が互いに近接する二重特異性抗体（１００）、第１の細胞表面部分に特異的に結合する第１の結合分子、並びに第２の細胞表面部分に特異的に結合する第２の結合分子であり、 第２の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した分子タグを含み、第１の結合分子が、切断誘導部分を含む。 標的のクラスター化を検出及び／又は定量化するための、各標的についての１つの一次抗体及び一次抗体のうちの１つに対する二次抗体を使用するＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイの形式の例の概略図である。この図において、第１及び第２の細胞表面部分は、異なる細胞上で発現された異なる細胞表面部分である。しかしながら、本開示は、第１及び第２の細胞表面部分が、同じ細胞上に存在する実施形態も含む。また、この図において、第１及び第２の細胞表面部分に対する結合特異性を有する分子は、二価二重特異性抗体である。しかしながら、本開示はまた、細胞表面部分に対する結合特異性を有する分子が、多価二重特異性抗体又は多重特異性抗体、例えば、三重特異性抗体又は四重特異性抗体である状況を包含する。 Ａ）第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分に結合し、それによって、第１及び第２の細胞表面部分が互いに近接する二重特異性抗体（１００）、第１の細胞表面部分に特異的に結合する第１の結合分子、第２の細胞表面部分に特異的に結合する第２の結合分子、並びに第３の結合分子であり、第１の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した分子タグを含み、第３の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断誘導部分（はさみの記号）を含む。 Ｂ）第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分に結合し、それによって、第１及び第２の細胞表面部分が互いに近接する二重特異性抗体（１００）、第１の細胞表面部分に特異的に結合する第１の結合分子、第２の細胞表面部分に特異的に結合する第２の結合分子、並びに第３の結合分子であり、第２の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した分子タグを含み、第３の結合分子が、第１の結合分子に結合し、切断誘導部分（はさみの記号）を含む。 Ｃ）第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分に結合し、それによって、第１及び第２の細胞表面部分が互いに近接する二重特異性抗体（１００）、第１の細胞表面部分に特異的に結合する第１の結合分子、第２の細胞表面部分に特異的に結合する第２の結合分子、並びに第３の結合分子であり、第１の結合分子が、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第３の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した分子タグを含む。 Ｄ）第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分に結合し、それによって、第１及び第２の細胞表面部分が互いに近接する二重特異性抗体（１００）、第１の細胞表面部分に特異的に結合する第１の結合分子、第２の細胞表面部分に特異的に結合する第２の結合分子、並びに第３の結合分子であり、第２の結合分子が、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第３の結合分子が、第１の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した分子タグを含む。 標的のクラスター化を検出及び／又は定量化するための、各標的についての１つの一次抗体及び一次抗体に対する２つの二次抗体を使用するＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイの形式の概略図である。この図において、第１及び第２の細胞表面部分は、異なる細胞上で発現された異なる細胞表面部分である。しかしながら、本開示は、第１及び第２の細胞表面部分が、同じ細胞上に存在する場所にも及ぶ。また、この図において、第１及び第２の細胞表面部分に対する結合特異性を有する分子は、二価二重特異性抗体である。しかしながら、本開示はまた、細胞表面部分に対する結合特異性を有する分子が、多価二重特異性抗体又は多重特異性抗体、例えば、三重特異性抗体又は四重特異性抗体である状況を包含する。 Ａ）第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分に結合し、それによって、第１及び第２の細胞表面部分が互いに近接する二重特異性抗体（１００）、第１の細胞表面部分に特異的に結合する第１の結合分子、第２の細胞表面部分に特異的に結合する第２の結合分子、第３の結合分子、並びに第４の結合分子であり、第３の結合分子が、第１の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した分子タグを含み、第４の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断誘導部分（はさみの記号）を含む。 Ｂ）第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分に結合し、それによって、第１及び第２の細胞表面部分が互いに近接する二重特異性抗体（１００）、第１の細胞表面部分に特異的に結合する第１の結合分子、第２の細胞表面部分に特異的に結合する第２の結合分子、第３の結合分子、並びに第４の結合分子であり、第３の結合分子が、第１の結合分子に結合し、切断誘導部分（はさみの記号）を含み、第４の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した分子タグを含む。 ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイを使用して測定した、相対ピーク面積（ＲＰＡ）におけるＰＤ－Ｌ１発現レベルを示す図である。試料Ａ：抗ＣＤ１３７陽性対照抗体とのインキュベーションによって調製された細胞ペレット、試料Ｂ：ＣＤ１３７及びＰＤ－Ｌ１に結合する二重特異性抗体とのインキュベーションによって調製された細胞ペレット、試料Ｃ：ＲＳＶに結合する陰性対照抗体とのインキュベーションによって調製された細胞ペレット。 ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイを使用して測定した、相対ピーク面積（ＲＰＡ）におけるＣＤ１３７発現レベルを示す図である。左：抗ＣＤ１３７アッセイ抗体ＢＢＫ２とのインキュベーション、右：抗ＣＤ１３７アッセイ抗体Ｍ１２７とのインキュベーション。試料Ａ：抗ＣＤ１３７陽性対照抗体とのインキュベーションによって調製された細胞ペレット、試料Ｂ：ＣＤ１３７及びＰＤ－Ｌ１に結合する二重特異性抗体とのインキュベーションによって調製された細胞ペレット、試料Ｃ：ＲＳＶに結合する陰性対照抗体とのインキュベーションによって調製された細胞ペレット。 ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイを使用して測定した、相対ピーク面積（ＲＰＡ）におけるＣＤ１３７クラスター化を示すグラフである。左：抗ＣＤ１３７アッセイ抗体ＢＢＫ２とのインキュベーション、右：抗ＣＤ１３７アッセイ抗体Ｍ１２７とのインキュベーション。試料Ａ：ＲＳＶに結合する陰性対照抗体とのインキュベーションによって調製された細胞ペレット、試料Ｂ：ＣＤ１３７及びＰＤ－Ｌ１に結合する二重特異性抗体とのインキュベーションによって調製された細胞ペレット、試料Ｃ：抗ＣＤ１３７陽性対照抗体とのインキュベーションによって調製された細胞ペレット。 ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイを使用して測定した、相対ピーク面積（ＲＰＡ）におけるＰＤ－Ｌ１－ＣＤ１３７クラスター化を示す図である。左：抗ＣＤ１３７アッセイ抗体ＢＢＫ２とのインキュベーション、右：抗ＣＤ１３７アッセイ抗体Ｍ１２７とのインキュベーション。試料Ａ：ＲＳＶに結合する陰性対照抗体とのインキュベーションによって調製された細胞ペレット、試料Ｂ：ＣＤ１３７及びＰＤ－Ｌ１に結合する二重特異性抗体とのインキュベーションによって調製された細胞ペレット、試料Ｃ：抗ＣＤ１３７陽性対照抗体とのインキュベーションによって調製された細胞ペレット。このアッセイにおけるクラスター化のレベルを、アイソタイプ対照実験（ＩＴＣ）で測定したレベルと比較する。 Ａ－細胞膜上に存在する受容体（抗原１）の発現を検出するための本明細書に記載のアッセイ、Ｂ－同じ細胞上の受容体（抗原１）のクラスター化を検出するための本明細書に記載の近接アッセイ、及びＣ－別の細胞上に受容体（抗原２）を有する１つの細胞上の受容体（抗原１）のクラスター化を検出し、それによって、免疫学的シナプスを形成するための本明細書に記載の近接アッセイ。
一態様では、本開示は、試料中の少なくとも第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分の発現を検出及び／又は定量化するための方法であって、その方法が、第１及び第２の細胞表面部分が、同じ試料中で発現されるときに産生されるシグナルを検出することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、好ましくは、各細胞表面部分の発現を定量化することが可能であるように、２つの異なるシグナルが産生される。あるいは、ある特定の実施形態では、シグナル産生部分は、組み合わされたシグナルが、各細胞表面部分の発現レベルに関する情報を提供するように選択される。
シグナルは、限定されないが、第１及び第２の細胞表面部分に、好ましくは、異なる蛍光分子タグを提供すること、第１及び第２の細胞表面部分に、好ましくは、異なる発色性分子タグを提供すること、第１及び第２の細胞表面部分に、好ましくは、異なる放射性分子タグを提供すること、並びに第１及び第２の細胞表面部分に、好ましくは、異なる同位体的に純粋な金属キレート剤分子タグを提供することを含む、様々な方法で産生することができる。クエンチングは、使用できる別の方法である。ある特定の実施形態では、好ましくは、第２のクエンチャーとの相互作用によって引き起こされるシグナル放出剤からの１つのフルオロフォア又はシグナルの蛍光の強度の減少の測定を可能にするために、各細胞表面部分に対して異なるフルオロフォアが使用される。
本開示による方法は、異なる形式で実行することができる。１つの形式において、本開示は、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分を含む、少なくとも２つの細胞表面部分の試料中の発現を検出及び／又は定量化するための方法であって、その方法が、
ａ）試料を、第１の細胞表面部分を検出する少なくとも１つの結合分子、及び第２の細胞表面部分を検出する少なくとも１つの結合分子と接触させることであって、
第１の細胞表面部分を検出する少なくとも１つの結合分子、及び第２の細胞表面部分を検出する少なくとも１つの結合分子が、分子タグを含み、任意選択で、第１の細胞表面部分を検出する結合分子に結合した分子タグが、第２の細胞表面部分を検出する結合分子に結合した分子タグとは異なる、接触させること、並びに
ｂ）分子タグの存在若しくは不在を検出するか、又はその量を測定して、試料中の第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分の発現を検出及び／又は定量化すること、を含む、方法が提供される。
別の形式において、本開示は、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分を含む、少なくとも２つの細胞表面部分の試料中の発現を検出及び／又は定量化するための方法であって、その方法が、
ａ）試料を、第１の細胞表面部分を検出する少なくとも２つの結合分子、及び第２の細胞表面部分を検出する少なくとも２つの結合分子と接触させることであって、
第１の細胞表面部分を検出する結合分子の１つ、及び第２の細胞表面部分を検出する結合分子の１つが、好ましくは、切断可能なリンカーを介してそれに結合した分子タグを含み、任意選択で、第１の細胞表面部分を検出する結合分子の別のもの、及び第２の細胞表面部分を検出する結合分子の別のものが、切断誘導部分を含む、接触させること、
ｂ）任意選択で、分子タグの切断を誘導すること、並びに
ｃ）分子タグの存在若しくは不在を検出するか、又はその量を測定して、試料中の第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分の発現を検出及び／又は定量化すること、を含む、方法が提供される。
ある特定の実施形態では、本開示による方法は、単一の試料、好ましくは、患者試料中の少なくとも２つの異なる細胞表面部分の共発現を測定するために使用され得る。したがって、これは、少なくとも２つの異なる細胞表面部分に結合する薬剤又は複数の薬剤による治療に対する、患者、好ましくは、がん患者の応答を予測するために特に有用である。そのような薬剤の例は、例えば、多重特異性抗体である。
ある特定の実施形態では、本開示で使用される方法は、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイを含む。ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイは、当該技術分野で周知であり、例えば、ＷＯ２０１７／１６１０３０及びその中で引用される参考文献に記載されており、それらは、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイは、異なる形式で行うことができる。１つの形式は、各標的部分についての２つの一次結合分子を使用する近接アッセイであり、各標的部分への一次結合分子の一方は、分子タグを含み、他方は、切断誘導部分を含む。
したがって、一実施形態では、本開示は、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分を含む、少なくとも２つの細胞表面部分の試料中の発現を検出及び／又は定量化するための方法であって、その方法が、
ａ１）試料を、細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、並びに細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子と接触させることであって、
第１の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第２の結合分子が、切断誘導部分を含み、第３の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含み、第４の結合分子が、切断誘導部分を含む、接触させること、又は
ａ２）試料を、細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、並びに細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子と接触させることであって、
第２の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第１の結合分子が、切断誘導部分を含み、第４の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含み、第３の結合分子が、切断誘導部分を含む、接触させること、又は
ａ３）試料を、細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、並びに細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子と接触させることであって、
第１の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第２の結合分子が、切断誘導部分を含み、第４の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含み、第３の結合分子が、切断誘導部分を含む、接触させること、又は
ａ４）試料を、細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、並びに細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子と接触させることであって、
第２の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第１の結合分子が、切断誘導部分を含み、第３の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含み、第４の結合分子が、切断誘導部分を含み、
第１の細胞表面部分を検出する結合分子に結合した分子タグが、第２の細胞表面部分を検出する結合分子に結合した分子タグとは異なる、接触させること、
ｂ）第１及び第２の分子タグの切断を誘導すること、並びに
ｃ）放出された第１及び第２の分子タグの存在又は不在を検出して、試料中の第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分の発現を検出及び／又は定量化すること、を含む、方法が提供される。
別の形式は、各標的部分についての２つの一次結合分子、及び一次結合分子のうちの１つに対する二次結合分子を使用する近接アッセイである。
したがって、一実施形態では、本開示は、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分を含む、少なくとも２つの細胞表面部分の試料中の発現を検出及び／又は定量化するための方法であって、その方法が、
ａ１）試料を、細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子と接触させることであって、
第１及び第３の結合分子が、それぞれ、切断可能なリンカーを介してそれらに結合した第１及び第２の分子タグを含み、第５の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断誘導部分を含み、第６の結合分子が、第４の結合分子に結合し、切断誘導部分を含む、接触させること、又は
ａ２）試料を、細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子と接触させることであって、
第２及び第４の結合分子が、それぞれ、切断可能なリンカーを介してそれらに結合した第１及び第２の分子タグを含み、第５の結合分子が、第１の結合分子に結合し、切断誘導部分を含み、第６の結合分子が、第３の結合分子に結合し、切断誘導部分を含む、接触させること、又は
ａ３）試料を、細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子と接触させることであって、
第１及び第３の結合分子が、切断誘導部分を含み、第５の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第６の結合分子が、第４の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含む、接触させること、又は
ａ４）試料を、細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子と接触させることであって、
第２及び第４の結合分子が、切断誘導部分を含み、第５の結合分子が、第１の結合分子、及び切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグに結合し、第６の結合分子が、第３の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含む、接触させること、又は
ａ５）試料を、細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子と接触させることであって、
第１の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第４の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含み、第５の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断誘導部分を含み、第６の結合分子が、第３の結合分子に結合し、切断誘導部分を含む、接触させること、又は
ａ６）試料を、細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子と接触させることであって、
第１の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第３の結合分子が、切断誘導部分を含み、第５の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断誘導部分を含み、第６の結合分子が、第４の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含む、接触させること、又は
ａ７）試料を、細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子と接触させることであって、
第１の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第４の結合分子が、切断誘導部分を含み、第５の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断誘導部分を含み、第６の結合分子が、第３の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含む、接触させること、又は
ａ８）試料を、細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子と接触させることであって、
第２の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第３の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含み、第５の結合分子が、第１の結合分子に結合し、切断誘導部分を含み、第６の結合分子が、第４の結合分子に結合し、切断誘導部分を含む、接触させること、又は
ａ９）試料を、細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子と接触させることであって、
第２の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第３の結合分子が、切断誘導部分を含み、第５の結合分子が、第１の結合分子に結合し、切断誘導部分を含み、第６の結合分子が、第４の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含む、接触させること、又は
ａ１０）試料を、細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子と接触させることであって、
第２の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第４の結合分子が、切断誘導部分を含み、第５の結合分子が、第１の結合分子に結合し、切断誘導部分を含み、第６の結合分子が、第３の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含む、接触させること、又は
ａ１１）試料を、細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子と接触させることであって、
第１の結合分子が、切断誘導部分を含み、第３の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含み、第５の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第６の結合分子が、第４の結合分子に結合し、切断誘導部分を含む、接触させること、又は
ａ１２）試料を、細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子と接触させることであって、
第１の結合分子が、切断誘導部分を含み、第４の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含み、第５の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第６の結合分子が、第３の結合分子に結合し、切断誘導部分を含む、接触させること、又は
ａ１３）試料を、細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子と接触させることであって、
第１の結合分子及び第４の結合分子が、切断誘導部分を含み、第５の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第６の結合分子が、第３の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含む、接触させること、又は
ａ１４）試料を、細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子と接触させることであって、
第２の結合分子が、切断誘導部分を含み、第３の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含み、第５の結合分子が、第１の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第６の結合分子が、第４の結合分子に結合し、切断誘導部分を含む、接触させること、又は
ａ１５）試料を、細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子と接触させることであって、
第２の結合分子が、切断誘導部分を含み、第４の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含み、第５の結合分子が、第１の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第６の結合分子が、第３の結合分子に結合し、切断誘導部分を含む、接触させること、又は
ａ１６）試料を、細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、並びに第６の結合分子と接触させることであって、
第２及び第３の結合分子が、切断誘導部分を含み、第５の結合分子が、第１の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第６の結合分子が、第４の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含み、
第１の細胞表面部分を検出する結合分子に結合した分子タグが、第２の細胞表面部分を検出する結合分子に結合した分子タグとは異なる、接触させること、
ｂ）第１及び第２の分子タグの切断を誘導すること、並びに
ｃ）放出された第１及び第２の分子タグの存在又は不在を検出して、試料中の第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分の発現を検出及び／又は定量化すること、を含む、方法が提供される。
別の形式は、各標的部分についての２つの一次結合分子、及び一次結合分子の各々に対する二次結合分子を使用する近接アッセイであり、各標的部分についての二次結合分子のうちの一方は、分子タグを含み、他方は、切断誘導部分を含む。
したがって、一実施形態では、本開示は、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分を含む、少なくとも２つの細胞表面部分の試料中の発現を検出及び／又は定量化するための方法であって、その方法が、
ａ１）試料を、細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、第６の結合分子、第７の結合分子、並びに第８の結合分子と接触させることであって、
第５の結合分子が、第１の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第７の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断誘導部分を含み、第６の結合分子が、第３の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含み、第８の結合分子が、第４の結合分子に結合し、切断誘導部分を含む、接触させること、又は
ａ２）試料を、細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、第６の結合分子、第７の結合分子、並びに第８の結合分子と接触させることであって、
第５の結合分子が、第１の結合分子に結合し、切断誘導部分を含み、第７の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第６の結合分子が、第３の結合分子に結合し、切断誘導部分を含み、第８の結合分子が、第４の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含む、接触させること、又は
ａ３）試料を、細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、第６の結合分子、第７の結合分子、並びに第８の結合分子と接触させることであって、
第５の結合分子が、第１の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第７の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断誘導部分を含み、第６の結合分子が、第３の結合分子に結合し、切断誘導部分を含み、第８の結合分子が、第４の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含む、接触させること、又は
ａ４）試料を、細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１及び第２の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第３及び第４の結合分子、第５の結合分子、第６の結合分子、第７の結合分子、並びに第８の結合分子と接触させることであって、
第５の結合分子が、第１の結合分子に結合し、切断誘導部分を含み、第７の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、第６の結合分子が、第３の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含み、第８の結合分子が、第４の結合分子に結合し、切断誘導部分を含み、
第１の細胞表面部分を検出する結合分子に結合した分子タグが、第２の細胞表面部分を検出する結合分子に結合した分子タグとは異なる、接触させること、
ｂ）第１及び第２の分子タグの切断を誘導すること、並びに
ｃ）放出された第１及び第２の分子タグの存在又は不在を検出して、試料中の第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分の発現を検出及び／又は定量化すること、を含む、方法が提供される。
別の形式は、ＤＴＴ媒介性放出であり、試料中の少なくとも第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分の発現を検出及び／又は定量化するための方法が、
ａ）試料を、第１の細胞表面部分を検出する少なくとも１つの結合分子、及び第２の細胞表面部分を検出する少なくとも１つの結合分子と接触させることであって、
第１の細胞表面部分を検出する少なくとも１つの結合分子、及び第２の細胞表面部分を検出する少なくとも１つの結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した分子タグを含み、
第１の細胞表面部分を検出する結合分子に結合した分子タグが、第２の細胞表面部分を検出する結合分子に結合した分子タグとは異なる、接触させること、
ｂ）分子タグの切断を誘導すること、並びに
ｃ）放出された分子タグの存在又は不在を検出して、試料中の第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分の発現を検出及び／又は定量化すること、を含む。
１つの形式において、ＤＴＴ媒介性放出アッセイは、分子タグを含む各標的部分についての一次結合分子を使用する。
したがって、一実施形態では、本開示は、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分を含む、少なくとも２つの細胞表面部分の試料中の発現を検出及び／又は定量化するための方法であって、その方法が、
ａ）試料を、細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１の結合分子、及び細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第２の結合分子と接触させることであって、
第１の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、
第２の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含み、
第１の細胞表面部分を検出する結合分子に結合した分子タグが、第２の細胞表面部分を検出する結合分子に結合した分子タグとは異なる、接触させること、
ｂ）第１及び第２の分子タグの切断を誘導すること、並びに
ｃ）放出された分子タグの存在又は不在を検出して、試料中の第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分の発現を検出及び／又は定量化すること、を含む、方法を提供する。
別の形式は、各標的部分についての一次結合分子及び二次結合分子を使用するＤＴＴ媒介性放出アッセイであり、二次結合分子は、分子タグを含む。
したがって、一実施形態では、本開示は、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分を含む、少なくとも２つの細胞表面部分の試料中の発現を検出及び／又は定量化するための方法であって、その方法が、
ａ）試料を、細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第２の結合分子、第１の結合分子に特異的に結合する第３の結合分子、及び第２の結合分子に特異的に結合する第４の結合分子と接触させることであって、
第３の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、
第４の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含み、
第１の細胞表面部分を検出する結合分子に結合した分子タグが、第２の細胞表面部分を検出する結合分子に結合した分子タグとは異なる、接触させること、
ｂ）第１及び第２の分子タグの切断を誘導すること、並びに
ｃ）放出された分子タグの存在又は不在を検出して、試料中の第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分の発現を検出及び／又は定量化すること、を含む、方法を提供する。
別の形式は、各標的部分についての一次結合分子、及び一次結合分子のうちの１つに結合し、分子タグを含む二次結合分子を使用するＤＴＴ媒介性放出アッセイである。
したがって、一実施形態では、本開示は、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分を含む、少なくとも２つの細胞表面部分の試料中の発現を検出及び／又は定量化するための方法であって、その方法が、
ａ１）試料を、細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第２の結合分子、及び第１の結合分子に特異的に結合する第３の結合分子と接触させることであって、
第２の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、
第３の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含む、接触させること、又は
ａ２）試料を、細胞表面上で発現された第１の部分に特異的に結合する第１の結合分子、細胞表面上で発現された第２の部分に特異的に結合する第２の結合分子、及び第２の結合分子に特異的に結合する第３の結合分子と接触させることであって、
第１の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第１の分子タグを含み、
第３の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した第２の分子タグを含み、
第１の細胞表面部分を検出する結合分子に結合した分子タグが、第２の細胞表面部分を検出する結合分子に結合した分子タグとは異なる、接触させること、
ｂ）第１及び第２の分子タグの切断を誘導すること、並びに
ｃ）放出された分子タグの存在又は不在を検出して、試料中の第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分の発現を検出及び／又は定量化すること、を含む、方法を提供する。
一次結合分子及び二次結合分子が使用される上記の例示された形式の各々において、１つ以上の結合分子が、一次結合分子と二次結合分子との間に存在し得る。
本開示による方法は、近接アッセイ及びＤＴＴ媒介性放出アッセイの組み合わせを含んでもよく、近接アッセイを使用して第１の細胞表面部分を検出し、ＤＴＴ媒介性放出アッセイを使用して第２の細胞表面部分を検出する。
本開示による方法を使用して、単一試料中の少なくとも２つの異なる細胞表面部分の共発現を測定することができる。それから得られた知識を使用して、２つの異なる細胞表面部分に結合する薬剤又は複数の薬剤に対する、患者、特に、がん患者の応答性を予測することができる。
したがって、本開示は、少なくとも第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分、特に、免疫エフェクター細胞上で発現された部分、及び腫瘍細胞上で発現された部分に結合する薬剤又は複数の薬剤に対する、患者、特に、がん患者の応答性を予測するための方法であって、その方法が、
ａ）本開示による方法を使用して、対象由来、特に、対象の腫瘍由来の生体試料中の第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面メンバーの発現レベルを検出すること、
ｂ）対象の試料中の第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分の発現レベルが、閾値レベルを上回っているか、又は下回っているかを決定すること、並びに
ｃ）対象の試料中の第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分の発現レベルが、閾値レベル以上である場合、対象が、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分に結合する薬剤又は複数の薬剤に応答する可能性が高いと予測すること、を含む、方法を提供する。薬剤又は複数の薬剤は、本明細書で更に定義される薬剤を含む。この方法は、本明細書において「予測方法」とも称される。
本開示はまた、治療を必要とする対象、特に、がんを有する対象を治療するための方法であって、その方法が、
ａ）上記の予測方法を使用して、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分に結合する薬剤又は複数の薬剤に対する対象の応答性を予測すること、並びに
ｂ）第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面に結合する薬剤又は複数の薬剤を、予測に従って応答する可能性が高い対象に投与すること、を含む、方法を提供する。薬剤又は複数の薬剤は、本明細書で更に定義される薬剤を含む。
本開示は、対象、特に、がんを有する対象の治療のための、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分に結合する薬剤又は複数の薬剤であって、治療が、
ａ）上記の予測方法を使用して、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分に結合する薬剤又は複数の薬剤に対する対象の応答性を予測すること、並びに
ｂ）第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面に結合する薬剤又は複数の薬剤を、予測に従って応答する可能性が高い対象に投与すること、を含む、薬剤又は複数の薬剤を更に提供する。薬剤又は複数の薬剤は、本明細書で更に定義される薬剤を含む。
本開示は、試料における、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分を含む、少なくとも２つの細胞表面部分のクラスター化の存在を検出及び／又は定量化するための方法であって、その方法が、シグナルの存在又は不在を検出することを含み、そのシグナルは、第１及び第２の細胞表面部分が、少なくとも第１及び第２の細胞表面部分に対する結合特異性を有する薬剤に曝露されている試料中で、第１及び第２の細胞表面部分が互いに近接していない限り、検出されない、方法を更に提供する。この方法を使用して、２つ以上の細胞表面部分が互いに近接しているかどうかを示すことができる。２つ以上の細胞表面部分が互いに近接している場合、それらは、本明細書に記載のシグナルを生成する場合、クラスター化すると考えられる。少なくとも２つの細胞表面部分の近接性は、例えば、多重特異性抗体などの、少なくとも２つの細胞表面部分に対する結合特異性を有する薬剤によって引き起こされるか、又は誘導される。したがって、ある特定の実施形態では、この方法はまた、第１及び第２の細胞表面部分が、少なくとも２つの細胞表面部分に対する結合特異性を有する薬剤によって同時に結合されたときに産生されたシグナルを検出することを含むと定義することもできる。
本開示による方法は、近接アッセイの異なる形式を含む、異なる手段で実施することができる。この方法を実施する１つの手段は、細胞表面部分のうちの１つを検出する結合分子に結合したフルオロフォアからのシグナルのクエンチを伴い、クエンチは、細胞表面部分のうちの別の部分を検出する結合分子に結合したクエンチャーによって引き起こされる。この方法を実施する別の手段は、細胞表面部分のうちの１つを、細胞表面部分のうちの別の部分を検出する結合分子に結合した別の異なるフルオロフォアとともに検出する、結合分子に結合したフルオロフォアの干渉によって産生されたシグナルを伴う。
近接アッセイの１つの形式において、２つの一次結合分子が使用され、１つは各標的部分についてであり、一次結合分子のうちの一方は、分子タグを含み、他方の一次結合分子は、切断誘導部分を含む。
したがって、一実施形態では、本開示は、試料における、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分を含む、少なくとも２つの細胞表面部分のクラスター化の存在を検出及び／又は定量化するための方法であって、その方法が、
ａ１）第１及び第２の細胞表面部分が、少なくとも第１及び第２の細胞表面部分に対する結合特異性を有する薬剤に曝露されている試料を、第１の細胞表面部分に特異的に結合する第１の結合分子、及び第２の細胞表面部分に特異的に結合する第２の結合分子と接触させることであって、
第１の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した分子タグを含み、第２の結合分子が、切断誘導部分を含む、接触させること、又は
ａ２）第１及び第２の細胞表面部分が、少なくとも第１及び第２の細胞表面部分に対する結合特異性を有する薬剤に曝露されている試料を、第１の細胞表面部分に特異的に結合する第１の結合分子、及び第２の細胞表面部分に特異的に結合する第２の結合分子と接触させることであって、
第２の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した分子タグを含み、第１の結合分子が、切断誘導部分を含む、接触させること、並びに
ｂ）分子タグの切断を誘導すること、並びに
ｃ）放出された分子タグの存在又は不在を検出して、試料中の第２の細胞表面部分との第１の細胞表面部分のクラスター化を検出及び／又は定量化すること、を含む、方法を提供する。
別の形式において、一次結合分子は、各標的部分に対して使用され、二次結合分子は、一次結合分子のうちの１つに対して使用され、二次結合分子によって結合されていない一次結合分子は、分子タグを含み、二次結合分子は、切断誘導部分を含むか、又は二次結合分子によって結合されていない一次結合分子は、切断誘導部分を含み、二次結合分子は、分子タグを含む。
したがって、一実施形態では、本開示は、試料における、第２の細胞表面部分とともに第１の細胞表面部分を含む、少なくとも２つの細胞表面部分のクラスター化の存在を検出及び／又は定量化するための方法であって、その方法が、
ａ１）第１及び第２の細胞表面部分が、少なくとも第１及び第２の細胞表面部分に対する結合特異性を有する薬剤に曝露されている試料を、第１の細胞表面部分に特異的に結合する第１の結合分子、第２の細胞表面部分に特異的に結合する第２の結合分子、及び第３の結合分子と接触させることであって、
第１の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した分子タグを含み、第３の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断誘導部分を含む、接触させること、又は
ａ２）第１及び第２の細胞表面部分が、少なくとも第１及び第２の細胞表面部分に対する結合特異性を有する薬剤に曝露されている試料を、第１の細胞表面部分に特異的に結合する第１の結合分子、第２の細胞表面部分に特異的に結合する第２の結合分子、及び第３の結合分子と接触させることであって、
第２の結合分子が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した分子タグを含み、第３の結合分子が、第１の結合分子に結合し、切断誘導部分を含む、接触させること、又は
ａ３）第１及び第２の細胞表面部分が、少なくとも第１及び第２の細胞表面部分に対する結合特異性を有する薬剤に曝露されている試料を、第１の細胞表面部分に特異的に結合する第１の結合分子、第２の細胞表面部分に特異的に結合する第２の結合分子、及び第３の結合分子と接触させることであって、
第１の結合分子が、切断誘導部分を含み、第３の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した分子タグを含む、接触させること、又は
ａ４）第１及び第２の細胞表面部分が、少なくとも第１及び第２の細胞表面部分に対する結合特異性を有する薬剤に曝露されている試料を、第１の細胞表面部分に特異的に結合する第１の結合分子、第２の細胞表面部分に特異的に結合する第２の結合分子、及び第３の結合分子と接触させることであって、
第２の結合分子が、切断誘導部分を含み、第３の結合分子が、第１の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した分子タグを含む、接触させること、
ｂ）分子タグの切断を誘導すること、並びに
ｃ）放出された分子タグの存在又は不在を検出して、試料中の第２の細胞表面部分との第１の細胞表面部分のクラスター化を検出及び／又は定量化すること、を含む、方法を提供する。
別の形式において、一次結合分子は、各標的部分に対して使用され、二次結合分子は、一次結合分子の両方に対して使用され、二次結合分子の一方は、分子タグを含み、他方は、切断誘導部分を含む。
したがって、一実施形態では、本開示は、試料における、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分を含む、少なくとも２つの細胞表面部分のクラスター化の存在を検出及び／又は定量化するための方法であって、その方法が、
ａ１）第１及び第２の細胞表面部分が、少なくとも第１及び第２の細胞表面部分に対する結合特異性を有する薬剤に曝露されている試料を、第１の細胞表面部分に特異的に結合する第１の結合分子、第２の細胞表面部分に特異的に結合する第２の結合分子、第３の結合分子、及び第４の結合分子と接触させることであって、
第３の結合分子が、第１の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した分子タグを含み、第４の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断誘導部分を含む、接触させること、又は
ａ２）第１及び第２の細胞表面部分が、少なくとも第１及び第２の細胞表面部分に対する結合特異性を有する薬剤に曝露されている試料を、第１の細胞表面部分に特異的に結合する第１の結合分子、第２の細胞表面部分に特異的に結合する第２の結合分子、第３の結合分子、及び第４の結合分子と接触させることであって、
第３の結合分子が、第１の結合分子に結合し、切断誘導部分を含み、第４の結合分子が、第２の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介してそれに結合した分子タグを含む、接触させること、
ｂ）分子タグの切断を誘導すること、並びに
ｃ）放出された分子タグを検出して、試料中の第２の細胞表面部分との第１の細胞表面部分のクラスター化を検出及び／又は定量化すること、を含む、方法を提供する。
一次結合分子及び二次結合分子が使用される上記の例示された形式の各々において、１つ以上の結合分子が、一次結合分子と二次結合分子との間に存在し得る。
本開示は、試料における、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分を含む、少なくとも２つの細胞表面部分のクラスター化の存在を検出及び／又は定量化するための方法であって、その方法が、
第１及び第３の細胞表面部分が、少なくとも第１及び第３の細胞表面部分に対する結合特異性を有する薬剤に曝露されている試料を、第１の細胞表面部分に特異的に結合する第１の結合分子、第２の細胞表面部分に特異的に結合する第２の結合分子と接触させることであって、第１の結合分子及び第２の結合分子のうちの少なくとも１つが、第１及び第２の細胞表面部分が互いに近接していない限り、検出されない分子タグを含む、接触させること、並びに
分子タグの存在又は不在を検出して、試料における、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分のクラスター化の存在を検出すること、を含む、方法を更に提供する。
この文脈において、少なくとも第１及び第３の細胞表面部分は、好ましくは、異なる細胞表面部分である。ある特定の実施形態では、第１の細胞表面部分は、ＣＤ１３７又は別の共刺激分子であり、第３の細胞表面部分は、腫瘍関連部分又は免疫チェックポイント部分、好ましくは、ＰＤ－Ｌ１などの別の細胞上の部分である。第１及び第２の細胞表面部分は、好ましくは、同じ細胞表面部分である。ある特定の実施形態では、第１及び第２の細胞表面部分は、ＣＤ１３７である。
本開示による方法は、単一の試料中の２つ以上の異なる細胞表面部分のクラスター化を測定するために使用することができ、特に、クラスター化が、２つ以上の異なる細胞表面部分に対する結合特異性を有する薬剤によって誘導される場合、本開示に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、それから得られた知識を使用して、２つ以上の異なる細胞表面部分に対する結合特異性を有する薬剤による治療が有効であるか否かを判定することができ、この判定は、それらの部分への２つの異なる細胞表面部分に対する結合特異性を有する薬剤の同時結合の確認に基づく。
薬剤は、少なくとも２つの細胞表面部分に同時に結合することができる任意の単一部分であり得る。ある特定の実施形態では、薬剤は、第１の細胞表面部分に特異的に結合する結合ドメイン、及び第２の細胞表面部分に特異的に結合する結合ドメインを少なくとも含む。例えば、好適な薬剤には、例えば、二重特異性及び三重特異性抗体などの多重特異性抗体、抗体断片、抗体由来ドメインを含む分子、及び融合タンパク質を含む、抗体などの結合分子が含まれる。薬剤は、薬物とも称され得る。
したがって、本開示は、薬剤の有効性を決定するための方法であって、その薬剤が、第１の細胞表面部分に特異的に結合する結合ドメイン、及び第２の細胞表面部分に特異的に結合する結合ドメインを少なくとも含み、その方法が、本開示による方法を使用することによって、薬剤で治療中の対象の生体試料中の第２の細胞表面部分との第１の細胞表面部分のクラスター化を検出及び／又は定量化することを含む、方法を提供する。薬剤は、本明細書で更に定義される薬剤である。この方法は、本明細書において「モニタリング方法」とも称される。
本開示はまた、薬剤の作用様式を確認するための方法であって、その薬剤が、少なくとも第１の細胞表面部分に特異的に結合する結合ドメイン、及び第２の細胞表面部分に特異的に結合する結合ドメインを少なくとも含み、その方法が、本開示による方法を使用することによって、薬剤で治療中の対象の生体試料中の第２の細胞表面部分との第１の細胞表面部分のクラスター化を検出及び／又は定量化することを含む、方法を提供する。薬剤は、本明細書で更に定義される薬剤である。作用様式は、例えば、第１及び第２の細胞表面部分への薬剤の同時結合である。この文脈において、第１及び第２の細胞表面部分は、好ましくは、異なる細胞表面部分であり、薬剤は、多重特異性抗体である。別の作用様式は、例えば、２つ以上の細胞表面部分のクラスター化である。この文脈において、一実施形態では、少なくとも第１及び第２の細胞表面部分は、同じであり、薬剤は、単一特異性抗体であり、別の実施形態では、少なくとも第１及び第２の細胞表面部分は、異なる細胞表面部分であり、薬剤は、多重特異性抗体である。この方法は、本明細書において「確認方法」とも称される。例えば、それは、薬剤、好ましくは、免疫エフェクター細胞、好ましくは、ＣＤ１３７又は任意の他の免疫エフェクター細胞共刺激部分上で発現された細胞表面部分、及び腫瘍細胞、好ましくは、ＰＤ－Ｌ１又は任意の他の腫瘍関連部分若しくは免疫チェックポイント上で発現された細胞表面部分に対する特異性を有する多重特異性抗体が、免疫エフェクター細胞、好ましくは、１つ以上のＣＤ１３７、又は任意の他の免疫エフェクター細胞共刺激タンパク質上で発現された細胞表面部分のうちの２つ以上のクラスター化を誘導するかどうかを決定することができる。
本開示は、治療を必要とする対象、特に、がんを有する対象を治療するための方法であって、その方法が、
ａ）第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分に結合する薬剤で対象を治療すること、
ｂ）本明細書に記載のモニタリング方法を使用して薬剤の有効性を分析すること、又は本明細書に記載の確認方法を使用して薬剤の作用様式を確認すること、を含む、方法を更に提供する。薬剤は、本明細書で更に定義される薬剤である。ある特定の実施形態では、この方法は、分析又は確認の結果に基づいて治療を継続又は適応させることを更に含み得、適応させることは、用量を増加若しくは減少させること、及び／又は薬剤の投与頻度を増加若しくは減少させること、又は治療を終了することを含むが、これらに限定されない。
本開示は、対象、特に、がんを有する対象の治療に使用するための、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分に結合する薬剤であって、その治療が、
ａ）第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分に結合する薬剤で対象を治療すること、
ｂ）本明細書に記載のモニタリング方法を使用して薬剤の有効性を分析すること、又は本明細書に記載の確認方法を使用して薬剤の作用様式を確認すること、を含む、薬剤を更に提供する。薬剤は、本明細書で更に定義される薬剤である。ある特定の実施形態では、治療は、分析又は確認の結果に基づいて治療を継続又は適応させることを更に含み得、適応させることは、用量を増加若しくは減少させること、及び／又は薬剤の投与頻度を増加若しくは減少させること、又は治療を終了することを含むが、これらに限定されない。
本開示による方法を更に使用して、第２の細胞表面部分との少なくとも第１の細胞表面部分のクラスター化を誘導する能力について１つ以上の試験薬剤をスクリーニングすることができる。
したがって、本開示は、第２の細胞表面部分との少なくとも第１の細胞表面部分のクラスター化を誘導する能力について１つ以上の試験薬剤をスクリーニングするための方法であって、その方法が、
ａ）１つ以上の試験細胞培養物を、試験薬剤と接触させることであって、
試験細胞培養物が、少なくとも第１の細胞表面部分を発現する細胞、及び第２の細胞表面部分を発現する第２の細胞を含む、接触させること、
ｂ）本開示による方法を使用して、第１及び第２の細胞表面部分のクラスター化のレベルを検出すること、並びに
ｃ）ステップｂ）で検出されたクラスター化のレベルを、試験薬剤と接触していないか、又は参照薬剤と接触していない対照細胞培養物中でクラスター化について検出されたクラスター化のレベルと比較すること、を含み、
対照細胞培養物が、第１の細胞表面部分、及び第２の細胞表面部分を含む、方法を更に提供する。ある特定の実施形態では、この方法は、対照細胞培養物中のクラスター化のレベルと等しいか、又はそれより高いクラスター化のレベルを誘導する試験薬剤を選択することを更に含み得る。
この方法を使用して、既知のものに加えて、２つ以上の異なる細胞表面部分に対する結合特異性を有する、新規の更なる、又は代替の結合分子を同定することができる。例えば、この方法を使用して、ＣＤ１３７、又は任意の他の免疫エフェクター細胞共刺激部分、及びＰＤ－Ｌ１、又は任意の他の腫瘍関連部分若しくは免疫チェックポイント部分に対する結合特異性を有する更なる又は代替の結合分子を同定することができる。
本開示は、パーツのキットを更に提供する。ある特定の実施形態では、キットは、本明細書に記載される方法に従って、少なくとも第１及び第２の細胞表面部分に特異的に結合する結合分子を含む。一実施形態では、パーツのキットは、第１及び第２の細胞表面部分に特異的に結合する少なくとも２つの結合分子であって、任意選択で、結合分子のうちの一方が、切断可能なリンカーを介してそれに結合した分子タグを含み、他方の結合分子が、切断誘導部分を含む、結合分子と、患者試料を少なくとも２つの結合分子と接触させて、任意選択で、分子タグの切断を誘導し、患者試料を、少なくとも２つの結合分子と接触させることによって誘導されたシグナルを測定するための説明書と、を含む。
以下は、本明細書に記載の方法の特徴の更なる説明である。明確化及び簡潔な説明のために、特徴は、同じ又は別個の実施形態の一部として本明細書に記載されるが、本開示の範囲は、記載される特徴の全て又は一部の組み合わせを有する実施形態を含み得ることは理解されるであろう。
本開示による方法を使用して、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分の発現を検出することができる。本開示は、２つの細胞表面部分が、互いに近接しているかどうかを示すために使用することができる方法を更に提供する。使用される検出方法である、細胞表面部分（のうちの１つ）に結合した結合分子からの分子タグの放出は、第１及び第２の細胞表面部分（の複合体）の発現の定量化も可能にする。
ある特定の実施形態では、本開示による方法は、単一の試料中の第１及び第２の細胞表面部分の検出及び／又は定量化を可能にする。このため、第１の細胞表面部分に結合する抗体に結合した分子タグは、第２の細胞表面部分に結合する抗体に結合した分子タグとは異なる。ある特定の実施形態では、この方法を使用して、第１及び第２の細胞部分が、ある特定の試料中で共発現されるかどうかを決定することができる。
本開示のある特定の実施形態による方法における試料は、限定されないが、組織試料、血液試料、又は培養細胞であり得る。好ましくは、試料は、対象又は患者由来の組織試料、血液試料又は培養細胞である。対象又は患者由来の組織試料は、新鮮試料若しくはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料、又はその他の固定された試料であってもよい。この方法は、がんを有する対象由来の腫瘍生検試料中の第１及び第２の細胞表面部分（のクラスター）の検出及び／又は定量化に特に有用である。
ある特定の実施形態では、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分は、好ましくは、異なる部分であり、例えば、腫瘍細胞若しくは免疫細胞などの同じ細胞型上、同じ細胞上、又は異なる細胞上で発現され得る。ある特定の実施形態では、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分は、好ましくは、異なる細胞型上に発現される。
ある特定の実施形態では、本開示の方法は、２つ以上の細胞表面部分の共発現を測定することが目的である場合、及び／又は同じ若しくは別個の細胞上の２つ以上の細胞表面部分のクラスター化の決定が目的である場合の任意の用途に有用である。
ある特定の実施形態では、少なくとも２つの細胞表面部分のうちの１つは、好ましくは、免疫エフェクター細胞、特に、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞又は好中性顆粒球、好ましくは、Ｔ細胞上で発現される。
ある特定の実施形態では、少なくとも２つの細胞表面部分のうちの１つは、例えば、限定されないが、腫瘍細胞、Ｂ細胞、骨髄細胞、樹状細胞、又は好中球などの腫瘍由来又は免疫細胞起源由来であり得る細胞上で発現される。
ある特定の実施形態では、少なくとも２つの細胞表面部分のうちの一方は、免疫エフェクター細胞、特に、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞又は好中性顆粒球、好ましくは、Ｔ細胞上で発現され、少なくとも２つの細胞表面部分のうちの他方は、例えば、限定されないが、腫瘍細胞、Ｂ細胞、骨髄細胞、樹状細胞、又は好中球などの腫瘍由来又は免疫細胞起源由来であり得る細胞上で発現される。
ある特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、又は好中性顆粒球、好ましくは、Ｔ細胞であり得る。
ある特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞共刺激部分は、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０Ｌ、又はＬＩＧＨＴ、好ましくは、ＣＤ１３７であり得る。
ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント部分又は腫瘍関連部分は、限定されないが、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＴＩＭ３、ＣＤ４７又はＣＤ７０、好ましくは、ＰＤ－Ｌ１から選択することができる。
第１及び第２の細胞表面部分は、両方の細胞表面部分を互いに近接させる薬剤に応答してクラスター化する任意の細胞表面部分であり得る。ある特定の実施形態では、第１及び第２の細胞表面部分は、同じであり得、この方法を使用して、薬剤に応答する、これらの細胞表面部分のクラスター化、例えば、二量体化又は三量体化を検出及び／又は定量化する。これは、例えば、少なくとも２つのＣＤ１３７分子のクラスター化のために本明細書に例示される。
ある特定の実施形態では、第１の細胞表面部分は、ＣＤ１３７であり、第２の細胞表面部分は、ＰＤ－Ｌ１である。
ＨＥＲ２ホモ二量体、並びにＨＥＲ１／ＨＥＲ２ヘテロ二量体、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体、ＨＧＦ－ｃ－Ｍｅｔ複合体、ＨＥＲ３－ＰＩ３Ｋ複合体、ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１複合体を測定するための方法は、本開示の一部ではない。
したがって、本開示は、第１及び第２の細胞表面部分が、ＨＥＲ２、ＨＥＲ１及びＨＥＲ２、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３、ＨＧＦ及びｃ－Ｍｅｔ、ＨＥＲ３及びＰＩ３Ｋ、又はＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１ではないように、本明細書に記載されるように、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分を含む、少なくとも２つの細胞表面部分の試料中の発現を検出及び／又は定量化するための方法を提供する。
本開示はまた、第１及び第２の細胞表面部分が、ＨＥＲ２、ＨＥＲ１及びＨＥＲ２、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３、ＨＧＦ及びｃ－Ｍｅｔ、ＨＥＲ３及びＰＩ３Ｋ、又はＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１ではないように、本明細書に記載されるように、試料における、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分を含む、少なくとも２つの細胞表面部分のクラスター化の存在を検出及び／又は定量化して検出するための方法を提供する。
本開示の方法のある特定の実施形態では、試料は、第１及び第２の細胞表面部分に結合する結合分子と接触する。これらは、アッセイ結合分子とも称される。
本開示による方法のある特定の形式において、２つの結合分子が、各部分に対して使用される。本開示は、第１の結合分子及び第２の結合分子として第１の細胞表面部分に結合する２つの結合分子を指す。第２の細胞表面部分に結合する２つの結合分子は、本明細書において、第３の結合分子及び第４の結合分子と称される。これらの結合分子を参照する際に使用される番号は、結合分子が、結合特異性に関して、及び／又は有用なアッセイ形式の例の可視化を容易にするために、互いに異なることを示す。番号は、結合分子のうちの１つ以上の任意の特定の順序又は必要な存在を指すものではない。また、一次結合分子及び１つ以上の二次結合分子を使用する形式において、他の結合分子が、一次結合分子、すなわち、細胞表面部分に直接結合する結合分子と、二次結合分子、すなわち、分子タグ又は切断誘導部分を含む結合分子との間に存在してもよい。
本開示による方法のある特定の形式において、第１の細胞表面部分に結合する２つの結合分子は、異なるエピトープに結合する結合分子であり、それらが、第１の細胞表面部分への互いの結合を妨げないように選択される。同様に、第２の細胞表面部分に結合する２つの結合分子は、異なるエピトープに結合する結合分子であり、それらが、第２の細胞表面部分への互いの結合を妨げないように選択される。第１、第２、第３、及び／又は第４の結合分子は、細胞表面部分の細胞外ドメインに結合することができるが、細胞表面部分の細胞内ドメインに結合することも可能である。これらの組み合わせも可能である。例えば、第１の細胞表面部分に結合する２つの結合分子は、その細胞外ドメインに向けられてもよく、一方、第２の細胞表面部分に結合する２つの結合分子は、その細胞内ドメインに結合してもよいか、又は第１の細胞表面部分に結合する結合分子の一方は、細胞外ドメインに結合してもよく、他方は、その細胞内ドメインに結合してもよく、第２の細胞表面部分に対して同じであるか、又は第１の細胞表面部分に結合する結合分子の一方は、細胞外ドメインに結合してもよく、他方は、その細胞内ドメインに結合してもよく、一方、第２の細胞表面部分に結合する両方の結合分子は、その細胞外若しくは細胞内ドメインに結合してもよいか、又はその逆であってもよい。
ある特定の実施形態では、１つの一次結合分子が、各部分に対して使用される。本開示は、第１の結合分子及び第２の結合分子として第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分に結合する２つの一次結合分子を指す。これらの結合分子を参照する際に使用される番号は、結合分子が、結合特異性に関して、及び／又は有用なアッセイ形式の例の可視化を容易にするために、互いに異なることを示す。番号は、結合分子のうちの１つ以上の任意の特定の順序又は必要な存在を指すものではない。また、これらは、本開示の他の実施形態に関して言及される第１及び第２の結合分子と同じであることを示すものではない。また、一次結合分子及び１つ以上の二次結合分子を使用する形式において、他の結合分子が、一次結合分子、すなわち、細胞表面部分に直接結合する結合分子と、二次結合分子、すなわち、分子タグ又は切断誘導部分を含む結合分子との間に存在してもよい。
ある特定の実施形態では、第１及び第２の細胞表面部分に結合する２つの結合分子は、異なる細胞表面部分に結合する結合分子である。第１及び第２の結合分子は、細胞表面部分の細胞外ドメインに結合することができるが、細胞表面部分の細胞内ドメインに結合することも可能である。これらの組み合わせも可能である。例えば、第１の細胞表面部分に結合する結合分子は、その細胞外ドメインに結合してもよく、一方、第２の細胞表面部分に結合する結合分子は、その細胞内ドメインに結合してもよく、又はその逆であってもよい。
本開示による方法のある特定の実施形態で使用される結合分子は、好ましくは、抗体、又はその抗原結合断片である。この文脈において、第１及び第２の細胞表面部分は、抗原とみなすことができる。抗原に特異的に結合する抗体、又はその抗原結合断片は、当該技術分野で公知であり、多数の異なる抗原に対して利用可能である。それらは市販されているか、又は容易に製造することができる。このような抗体、又はその抗原結合断片は、通常、抗原に結合するが、そうでなければ、例えば、抗原とそのリガンドとの間の相互作用を遮断するか、又は細胞殺傷活性を誘導するなどの生物学的機能を示さない。
本開示による方法のある特定の形式において、各細胞表面部分に対する一次結合分子のうちの１つは、分子タグ又は切断誘導部分を含む。本開示の方法のある特定の形式において、一次結合分子のうちの一方は、分子タグを含み、他方は、切断誘導部分を含む。そのような分子タグ又は切断誘導部分は、当該技術分野の標準的な技法を使用して、一次結合分子、特に、抗体に結合させることができる。いくつかの場合、分子タグ又は切断誘導部分を、ある特定の結合分子に結合させることは困難であり得る。その場合、分子タグ又は切断誘導部分が結合する、二次結合分子、通常、抗体を使用することができる。分子タグ又は切断誘導部分を含む、このような二次結合分子は、典型的には、一次結合分子のＦｃ領域に向けられ、一般に、市販されている。
分子タグは、検出され得る、任意の分子部分、例えば、分子であり得る。ある特定の事例において、放出時に、分子部分は、測定可能なシグナルを提供する。分子タグは、それを他の部分と区別するその特性のうちの１つ以上に基づいて選択されてもよく、その特性は、電気泳動移動度、分子量、形状、溶解度、ｐＫａ、疎水性、電荷、電荷／質量比、及び極性を含むが、これらに限定されない。これらの特性のうちの少なくとも１つにおける差異は、単一の試料中で複数の細胞表面部分を測定するアッセイにおける分子タグの分離を可能にする。ある特定の実施形態では、分子タグは、検出部分、例えば、限定されないが、蛍光標識、発色標識、放射性標識、又は電気化学標識などを含む。例示的な蛍光色素には、以下の参考文献に開示されるように、水溶性ローダミン色素、フルオレセイン、４，７－ジクロロフルオレセイン、ベンゾキサンテン色素、及びエネルギー移動色素が含まれる：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅａｇｅｎｔｓ，８ｔｈ ｅｄ．（２００２），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．、ＷＯ ２００１／３２７８３、米国特許出願公開第２００２－００８１６１６号、同第２００２－００８６９８５号、及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：２８１６－２８２２。好適な分子タグの例には、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子が含まれるが、これに限定されない。ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子は、当該技術分野において周知である。好ましい分子タグは、例えば、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子Ｐｒｏ１１及びＰｒｏ１２５である。Ｐｒｏ１１は、光放出可能タグの一例であり、Ｐｒｏ１２５は、ＤＴＴ放出可能タグの一例である。他のＶｅｒａＴａｇ（登録商標）分子は、例えば、米国特許出願公開第２００４－０１６６５２９号、同第２００４－０１２６８１８号、同第２００３－００１３１２６号、同第２００５－００７９５６５号、及び同第２０１１－０１８０４０８号に記載されており、これらの各々及びそれらに引用される参考文献は、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
切断誘導部分は、切断可能なリンカーを介して分子タグが結合している結合分子から分子タグの切断を直接的又は間接的に誘導することができる任意の部分であり得る。ある特定の実施形態では、切断誘導部分は、例えば、切断可能なリンカーを切断することができる活性種を産生する部分である。例示的な活性種には、一重項酸素、過酸化水素、ＮＡＤＨ、及びヒドロキシルラジカル、フェノキシラジカル、スーパーオキシドなどが含まれる。酸化を引き起こす活性種の例示的なクエンチャーには、ポリエン、カロテノイド、ビタミンＥ、ビタミンＣ、チロシン、ヒスチジン及びグルタチオンのアミノ酸ピロールＮ－コンジュゲートが含まれる。例えば、Ｂｅｕｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１９：２２６－２４１を参照されたい。一例は、結合分子にコンジュゲートされたビオチンを、ストレプトアビジンコンジュゲートメチレンブルーと接触させ、光に曝露し、切断可能なリンカーを切断することができる一重項酸素の放出をもたらすものである。
ある特定のアッセイ形式において、分子タグは、切断可能なリンカーを介して結合分子に結合される。切断可能なリンカーは、一重項酸素若しくは過酸化水素、又はＤＴＴによって切断され得るリンカーを含むが、これらに限定されない、任意の切断可能なリンカーであり得る。ＤＴＴによって切断することができるリンカーは、ＳＳリンカーである。切断可能な結合はまた、塩基不安定性結合、光切断可能な結合、還元により切断可能な結合、酸化により切断された結合、酸不安定性結合、及び特定のプロテアーゼにより切断可能なペプチド結合などの、反応混合物全体で作用する薬剤に対して不安定である結合を含み得る。多くのこのような結合を説明している参考文献には、Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｗｕｔｓ，１９９１，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｈｅｎｎａｎｓｏｎ，１９９６，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、及び米国特許出願公開第２００３－０１１９０５９が含まれる。
結合分子からの分子タグの切断は、光誘導及びＤＴＴ媒介性放出の使用を含むが、これらに限定されない、当該技術分野で公知の方法によって誘導され得る。光誘導は、光によって活性化されるときに分子酸素を一重項酸素に変換する光吸収分子の活性化を誘導する。ＤＴＴを使用することによって切断を誘導することは、還元によって切断可能であり、分子タグを結合分子に連結するジスルフィドリンカーのＤＴＴ誘導切断を伴う。
ある特定の実施形態では、本開示の方法で測定されるシグナルは、放出される分子タグの量である。本開示の方法のある特定の形式において、少なくとも２つの異なる分子タグが使用される。ある特定の実施形態では、これらは、分子量、形状、溶解度、ｐＫａ、疎水性、電荷、電荷／質量比、及び極性の差に基づく電気泳動又は方法を含むが、これらに限定されない、当該技術分野で公知の方法によって、検出前に分離され得る。検出方法は、分子タグに依存する。
本開示の文脈において、「近接性」とは、結合した分子タグを含む結合分子、及び切断誘導部分を含む結合分子が、切断誘導部分によって誘導される分子タグの切断を可能にする距離内にあることを意味する。ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイでは、これは、約１０００ｎｍであり、好ましくは、互いの約２０～２００ｎｍ又は３０～１００ｎｍ以内である。近接性のための他の範囲は、使用される分子タグの性質に応じて適用され、当業者によって容易に決定することができ、市販のタグ、クエンチャー及びレポーター部分の供給者によって提供される情報である。本開示で特定の近接アッセイを適用するために当業者に必要な情報は、当該技術分野で入手可能である。例えば、Ｎａｔｈａｎ Ｐ．２０２０，Ａｓｓａｙ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｍｐｏｕｎｄ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｓｓａｙ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ａｓｓａｙｓ（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）は、とりわけ、ＦＲＥＴアッセイにおいて使用され得るドナーフルオロフォア及びアクセプターフルオロフォアに関する情報を提供し、これには、ドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォアとの間の最適な距離の説明が含まれる（例えば、表２及び３を参照されたい）。
本開示による方法を使用して、単一試料中の２つの異なる細胞表面部分の共発現を測定することができる。それから得られた知識を使用して、患者の治療計画を決定することができる。例えば、２つの細胞表面部分が、患者の組織又は血液試料中で共発現される場合、これらの２つの細胞表面部分を標的とする薬剤又は複数の薬剤で患者を治療することを決定することができる。そのような状況の一例は、がん患者の腫瘍生検試料が、腫瘍細胞上で２つの腫瘍関連抗原の共発現を示す場合である。次いで、患者は、これらの腫瘍関連抗原に結合し、腫瘍関連抗原のシグナル伝達経路を妨げ、かつ／又はＴ細胞媒介性腫瘍細胞殺傷を誘導する１つ以上の薬剤で首尾よく治療され得る。患者の腫瘍試料が、そのような腫瘍関連抗原の共発現を示さない場合、患者がそのような治療から利益を得る可能性は低いと治療医師によって判断され得る。別の状況は、例えば、腫瘍生検が、腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原、及び免疫エフェクター細胞上で発現された抗原の共発現を示す場合である。これは、例えば、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞などの免疫エフェクター細胞が、腫瘍微小環境中に存在することを示す。このような患者は、腫瘍細胞に近接して免疫細胞をもたらす、かつ／又は腫瘍細胞が、選択的に殺傷されるように免疫エフェクター細胞を活性化する薬剤による治療から利益を得ることができる。したがって、ある特定の実施形態では、本開示の方法は、２つの異なる細胞表面部分に結合する薬剤又は複数の薬剤による治療に対する、患者、好ましくは、がん患者の応答を予測するために使用され得る。
２つの異なる細胞表面部分に結合する薬剤の例は、例えば、多重特異性抗体である。このような多重特異性抗体は、両方の細胞表面部分に同時に結合する、二重特異性若しくは三重特異性抗体、又はその抗原結合断片であり得る。このような多重特異性抗体は、多重特異性抗体が、各細胞表面部分について単一の抗原結合断片を含むように、両方の細胞表面部分に対して一価の結合を示すことができる。細胞表面部分は、本明細書に開示されるような第１及び第２の細胞表面部分のいずれかであり得る。
２つの異なる細胞表面部分に結合し、本開示の方法が有用であることに関連する多重特異性抗体の具体例は、腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１及びＴ細胞上のＣＤ１３７に結合する多重特異性抗体である。このような多重特異性抗体は、配列番号４、８、１２、１６、１９、２３、２７、３０、３４、３８、４２、４５、４８、又は５２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含むＣＤ１３７結合ドメインを含み得、それらの中で１、２、又は３個のアミノ酸置換が許容され得る。ある特定の実施形態では、ＣＤ１３７結合ドメインは、配列番号４、８、１２、１６、１９、２３、２７、３０、３４、３８、４２、４５、４８、又は５２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む。ＣＤ１３７結合ドメインは、配列番号２、６、１０、１４、１８、２１、２５、３２、３６、４０、４４、若しくは５０のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を更に含んでもよく、それらの中で１、２、若しくは３個のアミノ酸置換を可能にし、かつ／又は配列番号３、７、１１、１５、２２、２６、２９、３３、３７、４１、４７、若しくは５１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を更に含んでもよく、それらの中で１、２、若しくは３個のアミノ酸置換を可能にする。ある特定の実施形態では、ＣＤ１３７結合ドメインは、配列番号２、６、１０、１４、１８、２１、２５、３２、３６、４０、４４、若しくは５０のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、及び／又は配列番号３、７、１１、１５、２２、２６、２９、３３、３７、４１、４７、若しくは５１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含んでもよい。ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３の任意の組み合わせが可能である。好ましいＣＤ１３７結合ドメインは、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４；配列番号６、配列番号７、及び配列番号８；配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２；配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６；配列番号１８、配列番号３、及び配列番号１９；配列番号２１、配列番号２２、及び配列番号２３；配列番号２５、配列番号２６、及び配列番号２７；配列番号１０、配列番号２９、及び配列番号３０；配列番号３２、配列番号３３、及び配列番号３４；配列番号３６、配列番号３７、及び配列番号３８；配列番号４０、配列番号４１、及び配列番号４２；配列番号４４、配列番号４１、及び配列番号４５；配列番号２、配列番号４７、及び配列番号４８；又は配列番号５０、配列番号５２、及び配列番号５２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３の組み合わせを含む。このような多重特異性抗体のＣＤ１３７結合ドメインは、配列番号１、５、９、１３、１７、２０、２４、２８、３１、３５、３９、４３、４６、若しくは４９のうちのいずれか１つを有するか、又はそれらのフレームワーク領域に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％、好ましくは、９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含み得る。ある特定の実施形態では、このような多重特異性抗体のＣＤ１３７結合ドメインは、ＣＨ１ドメインも含む。任意のＣＨ１ドメインを使用してもよい。好適なＣＨ１ドメインの例は、配列番号１１６として提供されるアミノ酸配列によって提供される。
多重特異性抗体は、配列番号５６、５８、６１、７２、７６、８０、８４、８８、９１、９５、９９、１０２、又は１０６のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含むＰＤ－Ｌ１結合ドメインを更に含んでもよく、それらの中で１、２、又は３個のアミノ酸置換を可能にする。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、配列番号５６、５８、６１、７２、７６、８０、８４、８８、９１、９５、９９、１０２、又は１０６のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む。ＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、配列番号５４、６０、６５、６８、７０、７４、７８、８２、８６、９０、若しくは９３のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を更に含んでもよく、それらの中で１、２、若しくは３個のアミノ酸置換を可能にし、かつ／又は配列番号５５、３、６３、６６、７１、７５、７９、８３、８７、９４、９８、１０１、１０５、若しくは１０８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を更に含んでもよく、それらの中で１、２、若しくは３個のアミノ酸置換を可能にする。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、配列番号５４、６０、６５、６８、７０、７４、７８、８２、８６、９０、若しくは９３のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、及び／又は配列番号５５、３、６３、６６、７１、７５、７９、８３、８７、９４、９８、１０１、１０５、若しくは１０８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む。ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３の任意の組み合わせが可能である。好ましいＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、配列番号５４、配列番号５５、及び配列番号５６；配列番号５４、配列番号５５、及び配列番号５８；配列番号６０、配列番号３、及び配列番号６１；配列番号６０、配列番号６３、及び配列番号５６；配列番号６５、配列番号６６、及び配列番号５６；配列番号６８、配列番号５５、及び配列番号５６；配列番号７０、配列番号７１、及び配列番号７２；配列番号７４、配列番号７５、及び配列番号７６；配列番号７８、配列番号７９、及び配列番号８０；配列番号８２、配列番号８３、及び配列番号８４；配列番号８６、配列番号８７、及び配列番号８８；配列番号９０、配列番号７９、及び配列番号９１；配列番号９３、配列番号９４、及び配列番号９５；配列番号６８、配列番号５５、及び配列番号５６；配列番号７０、配列番号９８、及び配列番号９９；配列番号９３、配列番号１０１、及び配列番号１０２；配列番号７４、配列番号１０５、及び配列番号１０６；又は配列番号８６、配列番号１０８、及び配列番号８８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３の組み合わせを含む。このような多重特異性抗体のＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、配列番号５３、５７、５９、６２、６４、６７、６９、７３、７７、８１、８５、８９、９２、９６、９７、１００、１０３、１０４、若しくは１０７のうちのいずれか１つを有するか、又はそれらのフレームワーク領域に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、好ましくは、９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含み得る。ある特定の実施形態では、このような多重特異性抗体のＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、ＣＨ１ドメインも含む。任意のＣＨ１ドメインを使用してもよい。好適なＣＨ１ドメインの例は、配列番号１１６として提供されるアミノ酸配列によって提供される。
ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は、本明細書に開示されるＣＤ１３７及びＰＤ－Ｌ１結合ドメインの任意の組み合わせを含んでもよく、例えば、表１を参照されたい。このような多重特異性抗体の１つは、ＭＣＬＡ－１４５である。
ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は、任意の軽鎖を更に含んでもよい。好適な軽鎖の例は、配列番号１１３に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含み、それらの中で１、２、又は３個のアミノ酸置換を可能にする軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１１３に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む。軽鎖可変領域は、配列番号１１１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）を更に含んでもよく、それらの中で１、２、若しくは３個のアミノ酸置換を可能にし、かつ／又は配列番号１１２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を更に含んでもよく、それらの中で１、２、若しくは３個のアミノ酸置換を可能にする。特定の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１１１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、及び／又は配列番号１１２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を含む。多重特異性抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１１０を有するか、又はそのフレームワーク領域に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含み得る。ある特定の実施形態では、このような多重特異性抗体の軽鎖は、ＣＬドメインも含む。任意のＣＬドメインを使用してもよい。好適なＣＬドメインの例は、配列番号１１５として提供されるアミノ酸配列によって提供される。
ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は、Ｆｃ領域又はその一部を更に含んでもよい。このようなＦｃ領域は、例えば、限定されないが、Ｆｃエフェクター機能を除去若しくは低減させるための修飾、及び／又は異なるＣＨ３ドメインのヘテロ二量体化を促進する修飾などの、当該技術分野で公知の任意の修飾を含み得る。任意のＦｃ領域を使用してもよい。好適なＦｃ領域の例は、配列番号１１６～１２０として提供されるアミノ酸配列によって提供される。
本開示による方法は、単一の試料中の少なくとも２つの異なる細胞表面部分のクラスター化を検出するために使用することができ、特に、クラスター化が、少なくとも２つの異なる細胞表面部分に対する結合特異性を有する薬剤によって誘導される場合、本開示に従って使用することができる。それから得られた知識を使用して、患者が、２つの異なる細胞表面部分に対する結合特異性を有する薬剤による治療から利益を得ているかどうか、したがって、治療を継続するか、適応させるか、又は終了するかどうかを決定することができる。例えば、治療剤が投与されるが、クラスター化が観察されない場合、又はある特定の閾値レベル未満である場合、治療を終了すると決定することができる。又はいくつかのクラスター化が観察されるが、所望のレベルではない場合、治療用量及び／若しくは治療間隔を増加させることを決定することができる。したがって、ある特定の実施形態では、本開示による方法は、特定の治療に対する患者の応答をモニタリングする方法とみなすことができる。
２つの異なる細胞表面部分に対する結合特異性を有する薬剤の例は、例えば、多重特異性抗体である。このような多重特異性抗体は、両方の細胞表面部分に同時に結合する、二重特異性若しくは三重特異性抗体、又はその抗原結合断片であり得る。このような多重特異性抗体は、多重特異性抗体が、各細胞表面部分について単一の抗原結合断片を含むように、両方の細胞表面部分に対して一価の結合を示すことができる。本開示の方法は、２つ以上の細胞表面部分が、それらの２つ以上の細胞表面部分に対する結合特異性を有する薬剤によってクラスター化される任意の状況で使用することができる。したがって、２つの異なる細胞表面部分に対する結合特異性を有する薬剤は、本明細書に開示されるものなどの任意の細胞表面部分に結合することができるが、これらに限定されない。
２つの異なる細胞表面部分に結合し、本開示の方法が有用であることに関連する多重特異性抗体の具体例は、腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１及びＴ細胞上のＣＤ１３７に結合する多重特異性抗体である。このような多重特異性抗体は、配列番号４、８、１２、１６、１９、２３、２７、３０、３４、３８、４２、４５、４８、又は５２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含むＣＤ１３７結合ドメインを含んでもよく、それらの中で１、２、又は３個のアミノ酸置換を可能にする。ある特定の実施形態では、ＣＤ１３７結合ドメインは、配列番号４、８、１２、１６、１９、２３、２７、３０、３４、３８、４２、４５、４８、又は５２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む。ＣＤ１３７結合ドメインは、配列番号２、６、１０、１４、１８、２１、２５、３２、３６、４０、４４、若しくは５０のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を更に含んでもよく、それらの中で１、２、若しくは３個のアミノ酸置換を可能にし、かつ／又は配列番号３、７、１１、１５、２２、２６、２９、３３、３７、４１、４７、若しくは５１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を更に含んでもよく、それらの中で１、２、若しくは３個のアミノ酸置換を可能にする。ある特定の実施形態では、ＣＤ１３７結合ドメインは、配列番号２、６、１０、１４、１８、２１、２５、３２、３６、４０、４４、若しくは５０のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、及び／又は配列番号３、７、１１、１５、２２、２６、２９、３３、３７、４１、４７、若しくは５１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む。ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３の任意の組み合わせが可能である。好ましいＣＤ１３７結合ドメインは、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４；配列番号６、配列番号７、及び配列番号８；配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２；配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６；配列番号１８、配列番号３、及び配列番号１９；配列番号２１、配列番号２２、及び配列番号２３；配列番号２５、配列番号２６、及び配列番号２７；配列番号１０、配列番号２９、及び配列番号３０；配列番号３２、配列番号３３、及び配列番号３４；配列番号３６、配列番号３７、及び配列番号３８；配列番号４０、配列番号４１、及び配列番号４２；配列番号４４、配列番号４１、及び配列番号４５；配列番号２、配列番号４７、及び配列番号４８；又は配列番号５０、配列番号５２、及び配列番号５２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３の組み合わせを含む。このような多重特異性抗体のＣＤ１３７結合ドメインは、配列番号１、５、９、１３、１７、２０、２４、２８、３１、３５、３９、４３、４６、若しくは４９のうちのいずれか１つを有するか、又はそれらのフレームワーク領域に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％、好ましくは、９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含み得る。ある特定の実施形態では、このような多重特異性抗体のＣＤ１３７結合ドメインは、ＣＨ１ドメインも含む。任意のＣＨ１ドメインを使用してもよい。好適なＣＨ１ドメインの例は、配列番号１１６として提供されるアミノ酸配列によって提供される。
多重特異性抗体は、配列番号５６、５８、６１、７２、７６、８０、８４、８８、９１、９５、９９、１０２、又は１０６のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含むＰＤ－Ｌ１結合ドメインを更に含んでもよく、それらの中で１、２、又は３個のアミノ酸置換を可能にする。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、配列番号５６、５８、６１、７２、７６、８０、８４、８８、９１、９５、９９、１０２、又は１０６のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む。ＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、配列番号５４、６０、６５、６８、７０、７４、７８、８２、８６、９０、若しくは９３のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を更に含んでもよく、それらの中で１、２、若しくは３個のアミノ酸置換を可能にし、かつ／又は配列番号５５、３、６３、６６、７１、７５、７９、８３、８７、９４、９８、１０１、１０５、若しくは１０８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を更に含んでもよく、それらの中で１、２、若しくは３個のアミノ酸置換を可能にする。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、配列番号５４、６０、６５、６８、７０、７４、７８、８２、８６、９０、若しくは９３のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、及び／又は配列番号５５、３、６３、６６、７１、７５、７９、８３、８７、９４、９８、１０１、１０５、若しくは１０８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む。ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３の任意の組み合わせが可能である。好ましいＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、配列番号５４、配列番号５５、及び配列番号５６；配列番号５４、配列番号５５、及び配列番号５８；配列番号６０、配列番号３、及び配列番号６１；配列番号６０、配列番号６３、及び配列番号５６；配列番号６５、配列番号６６、及び配列番号５６；配列番号６８、配列番号５５、及び配列番号５６；配列番号７０、配列番号７１、及び配列番号７２；配列番号７４、配列番号７５、及び配列番号７６；配列番号７８、配列番号７９、及び配列番号８０；配列番号８２、配列番号８３、及び配列番号８４；配列番号８６、配列番号８７、及び配列番号８８；配列番号９０、配列番号７９、及び配列番号９１；配列番号９３、配列番号９４、及び配列番号９５；配列番号６８、配列番号５５、及び配列番号５６；配列番号７０、配列番号９８、及び配列番号９９；配列番号９３、配列番号１０１、及び配列番号１０２；配列番号７４、配列番号１０５、及び配列番号１０６；又は配列番号８６、配列番号１０８、及び配列番号８８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３の組み合わせを含む。このような多重特異性抗体のＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、配列番号５３、５７、５９、６２、６４、６７、６９、７３、７７、８１、８５、８９、９２、９６、９７、１００、１０３、１０４、若しくは１０７のうちのいずれか１つを有するか、又はそれらのフレームワーク領域に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、好ましくは、９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含み得る。ある特定の実施形態では、このような多重特異性抗体のＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、ＣＨ１ドメインも含む。任意のＣＨ１ドメインを使用してもよい。好適なＣＨ１ドメインの例は、配列番号１１６として提供されるアミノ酸配列によって提供される。
ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は、本明細書に開示されるＣＤ１３７及びＰＤ－Ｌ１結合ドメインの任意の組み合わせを含んでもよく、例えば、表１を参照されたい。このような多重特異性抗体の１つは、ＭＣＬＡ－１４５である。
ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は、任意の軽鎖を更に含んでもよい。好適な軽鎖の例は、配列番号１１３に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含み、それらの中で１、２、又は３個のアミノ酸置換を可能にする軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１１３に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む。軽鎖可変領域は、配列番号１１１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）を更に含んでもよく、それらの中で１、２、若しくは３個のアミノ酸置換を可能にし、かつ／又は配列番号１１２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を更に含んでもよく、それらの中で１、２、若しくは３個のアミノ酸置換を可能にする。特定の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１１１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、及び／又は配列番号１１２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を含む。多重特異性抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１１０を有するか、又はそのフレームワーク領域に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含み得る。ある特定の実施形態では、このような多重特異性抗体の軽鎖は、ＣＬドメインも含む。任意のＣＬドメインを使用してもよい。好適なＣＬドメインの例は、配列番号１１５として提供されるアミノ酸配列によって提供される。
ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は、Ｆｃ領域、又はその一部を更に含んでもよい。このようなＦｃ領域は、例えば、限定されないが、Ｆｃエフェクター機能を除去若しくは低減させるための修飾、及び／又は異なるＣＨ３ドメインのヘテロ二量体化を促進する修飾などの、当該技術分野で公知の任意の修飾を含み得る。任意のＦｃ領域を使用してもよい。好適なＦｃ領域の例は、配列番号１１６～１２０として提供されるアミノ酸配列によって提供される。
本明細書で使用される場合、「含む」及びその活用は、その単語の前の項目が含まれることを意味するようにその非限定的な意味で使用されるが、具体的に言及されていない項目は除外されない。
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、冠詞の文法的対象の１つ又は１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。例として、「要素」は、１つの要素又は１つより多い要素を意味する。
本明細書における特許文献又は他の事項への言及は、その文献若しくは事項が知られていたこと、又はそれに含まれる情報が、請求項のいずれかの優先日における共通の一般的な知識の一部であったことを認めるものとはみなされない。
本明細書で引用される全ての特許及び文献の参照は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、以下の実施例に例示される。これらの実施例は、本開示の範囲を限定するものではない。
実施例１－ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイのための細胞ペレットの調製
Ｔ７５フラスコを、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１６－００３７－８５）で一晩コーティングした。次に、ＣＤ１３７を発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ＿ＣＤ１３７Ｋ）を、５０ｍＬの培地（９％のＦＢＳ－ＨＩ ＲＰＭＩ １６４０、２ｍＭのＬ－グルタミン）中に１．８×１０６細胞／ｍＬの濃度で添加し、３７℃で４時間インキュベートした。次いで、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、５０ｍＬの培地中で０．４５×１０６細胞／ｍＬの濃度でＰＤ－Ｌ１を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１）と共培養した（ＪｕｒｋａｔからＣＨＯ）。細胞を４時間相互作用させ、次いでＣＤ１３７及びＰＤ－Ｌ１に結合する二重特異性抗体、抗ＣＤ１３７陽性対照抗体、又はＲＳＶに結合する陰性対照抗体（１０μｇ／ｍＬ）を、更に２時間添加した。次いで、細胞を、再懸濁及び擦り取ることによってフラスコから収集し、以下のように固定した：１，２００ｒｐｍ（１２５×ｇ）、４℃で１０分間遠心分離した後、培地を注ぎ出し、細胞ペレットをほぐし、氷冷ＰＢＳ中に再懸濁した。遠心分離を２回繰り返し、これによりＰＢＳを注ぎ出し、細胞ペレットをボルテックスによってほぐした。２回目の洗浄後、ペレットを、３０ｍＬの１０％中性緩衝ホルマリン（１０％のＮＢＦ、カタログ番号５７０１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁し、４℃で一晩穏やかに回転させた。１，５００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した後、ホルマリンを除去し、細胞ペレットを、２５×１０６細胞／ｍＬで８０％エタノール中に再懸濁し、４℃で保存した後、前述のように処理した（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ、２００９）。
ＣＤ１３７及びＰＤ－Ｌ１に結合する好適な二重特異性抗体は、例えば、本明細書に具体的に開示されているものである。
実施例２－ＰＤ－Ｌ１発現ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイ
実施例１で調製した細胞ペレットを、このアッセイに使用した。４．５×１０５個の細胞を、正荷電スライドガラス（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に置き、以下に簡潔に記載されるようにＶｅｒａＴａｇ（登録商標）技術を使用して分析した。
抗原回復を、圧力鍋（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）を使用して加熱により行った。抗原回復後、抗体対を添加し、ＤＴＴ媒介性の放出された蛍光ＶｅｒａＴａｇｓを、キャピラリー電気泳動によって検出した。放出されたＶｅｒａＴａｇｓを、試料緩衝体積に正規化して、４．５×１０５個の細胞当たりの相対蛍光の単位を得た。
使用した抗体は、ジスルフィド結合を介して蛍光ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーターで標識した、抗ＰＤ－Ｌ１ウサギｍＡｂ Ｅ１Ｌ３Ｎ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃａｔ＃１３６８４）及びヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ｃａｔ＃４０５２－０１）のペプシン消化物であった。アイソタイプ対照実験において、ＰＤ－Ｌ１抗体は、ウサギＩｇＧ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃａｔ＃３９００）に置き換えられる。
結果を図９に示す。ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイは、ＰＤ－Ｌ１の発現レベルを検出するための好適な手段のようである。ＰＤ－Ｌ１の同様の量を、３つ全ての試料中で測定した。
実施例３－ＣＤ１３７発現ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイ
実施例１で調製した細胞ペレットを、このアッセイに使用した。４．５×１０５個の細胞を、正荷電スライドガラス（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に置き、以下に簡潔に記載されるようにＶｅｒａＴａｇ（登録商標）技術を使用して分析した。
抗原回復を、圧力鍋（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）を使用して加熱により行った。抗原回復後、抗体対を添加し、ＤＴＴ媒介性の放出された蛍光ＶｅｒａＴａｇｓを、キャピラリー電気泳動によって検出した。放出されたＶｅｒａＴａｇｓを、試料緩衝体積に正規化して、４．５×１０５個の細胞当たりの相対蛍光の単位を得た。
２つの異なる一次抗体を評価した：抗ＣＤ１３７マウスｍＡｂ Ｍ１２７（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ｃａｔ＃５５２５３２）及び抗ＣＤ１３７マウスｍＡｂ ＢＢＫ２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ｃａｔ＃ＭＳ－６２１）。ＶｅｒａＴａｇにコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃａｔ＃１１５－００５－１４６）を、一次抗体と対合した。アイソタイプ対照実験において、ＣＤ１３７抗体は、マウスＩｇＧ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ｃａｔ＃５５４１２１）によって置き換えられる。
結果を図１０に示す。ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイは、ＣＤ１３７の発現レベルを検出するための好適な手段のようである。同様の量のＣＤ１３７を、両方の一次アッセイ抗体について、３つ全ての試料中で測定した。
実施例４－ＣＤ１３７クラスター化ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイ
実施例１で調製した細胞ペレットを、このアッセイに使用した。４．５×１０５個の細胞を、正荷電スライドガラス（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に置き、以下に簡潔に記載されるようにＶｅｒａＴａｇ（登録商標）技術を使用して分析した。
抗原回復を、圧力鍋（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）を使用して加熱により行った。抗原回復後、抗体対を添加し、放出された蛍光ＶｅｒａＴａｇｓを、キャピラリー電気泳動によって検出した。放出されたＶｅｒａＴａｇｓを、試料緩衝体積に正規化して、４．５×１０５個の細胞当たりの相対蛍光の単位を得た。
２つの異なる一次抗体を評価した：抗ＣＤ１３７マウスｍＡｂ Ｍ１２７（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ｃａｔ＃５５２５３２）及び抗ＣＤ１３７マウスｍＡｂ ＢＢＫ２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ｃａｔ＃ＭＳ－６２１）。等濃度の抗ＣＤ１３７抗体を、蛍光ＶｅｒａＴａｇレポーター又はビオチンのいずれかで標識した。
結果を図１１に示す。ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイは、ＣＤ１３７のクラスター化を検出するための好適な手段のようである。ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）シグナルは、ＢＢＫ抗体を一次アッセイ抗体として使用する場合、Ｍ１２７抗体と比較してより強力に現れる。
実施例５－ＣＤ１３７－ＰＤ－Ｌ１近接ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイ
実施例１で調製した細胞ペレットを、このアッセイに使用した。４．５×１０５個の細胞を、正荷電スライドガラス（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に置き、以下に簡潔に記載されるようにＶｅｒａＴａｇ（登録商標）技術を使用して分析した。
抗原回復を、圧力鍋（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）を使用して加熱により行った。抗原回復後、抗体対を添加し、放出された蛍光ＶｅｒａＴａｇｓを、キャピラリー電気泳動によって検出した。放出されたＶｅｒａＴａｇｓを、試料緩衝体積に正規化して、４．５×１０５個の細胞当たりの相対蛍光の単位を得た。
ＣＤ１３７－ＰＤ－Ｌ１近接性は、抗ＣＤ１３７マウスｍＡｂ Ｍ１２７（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ｃａｔ＃５５２５３２、外部ドメイン）、又は抗ＰＤ－Ｌ１ウサギｍＡｂ Ｅ１Ｌ３Ｎ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃａｔ＃１３６８４、ｃ末端）及びビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｃａｔ＃６１１－１０１－１２２）と対合したマウスｍＡｂ ＢＢＫ２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ｃａｔ＃ＭＳ－６２１、外部ドメイン）からのＶｅｒａＴａｇレポーターの近接性依存的放出によって測定した。アイソタイプ対照実験において、ＰＤ－Ｌ１抗体を、ウサギＩｇＧ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃａｔ＃３９００）に置き換えた。結果を図１２に示す。ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイは、ＣＤ１３７－ＰＤ－Ｌ１複合体を検出するための好適な手段のようである。試料Ｂは、両方の一次アッセイ抗体について最も強いＶｅｒａＴａｇシグナルを示す。これは、ＣＤ１３７×ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体が、ＣＤ１３７及びＰＤ－Ｌ１に同時に結合し、これらの抗原、したがって、これらの抗原を発現する細胞をクラスター化することを示す。
配列
配列番号１：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＦＡＭＮＷＶＲＲＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＮＴＧＮＰＴＹＡＱＧＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＮＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＷＧＶＩＧＧＨＹＭＤＶＷＧＫＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号：２：配列番号１からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ１
ＮＦＡＭＮ
配列番号３：配列番号１からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ２
ＷＩＮＴＮＴＧＮＰＴＹＡＱＧＦＴＧ
配列番号４：配列番号１からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ３
ＤＷＧＶＩＧＧＨＹＭＤＶ
配列番号５：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＳＡＹＮＧＮＴＮＹＡＱＫＬＱＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＳＤＧＹＧＰＫＡＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号６：配列番号５からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ１
ＳＹＧＩＳ
配列番号７：配列番号５からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ２
ＷＩＳＡＹＮＧＮＴＮＹＡＱＫＬＱＧ
配列番号８：配列番号５からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ３
ＤＳＤＧＹＧＰＫＡＦＤＹ
配列番号９：重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＳＹＷＩＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＩＩＹＰＤＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＳＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＳＦＹＴＧＩＶＧＡＴＧＡＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号１０：配列番号９からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ１
ＳＹＷＩＧ
配列番号１１：配列番号９からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ２
ＩＩＹＰＤＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧ
配列番号１２：配列番号９からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ３
ＦＹＴＧＩＶＧＡＴＧＡＦＤＶ
配列番号１３：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＤＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＭＩＰＩＬＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＲＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＧＡＴＹＹＹＧＳＧＴＹＹＳＩＮＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１４：配列番号１３からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ１
ＳＤＡＩＳ
配列番号１５：配列番号１３からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ２
ＧＭＩＰＩＬＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ
配列番号１６：配列番号１３からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ３
ＧＡＴＹＹＹＧＳＧＴＹＹＳＩＮＷＦＤＰ
配列番号１７：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＲＡＳＧＹＴＦＴＮＦＡＭＴＷＶＲＱＡＰＧＱＧＰＥＹＭＧＷＩＮＴＮＴＧＮＰＴＹＡＱＧＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＮＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＷＡＳＶＭＶＲＧＤＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１８：配列番号１７からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ１
ＮＦＡＭＴ
配列番号１９：配列番号１７からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ３
ＤＷＡＳＶＭＶＲＧＤＬＤＹ
配列番号２０：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＶＳＧＹＴＬＳＥＬＳＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＶＥＷＭＧＧＦＹＰＥＤＶＥＰＩＹＡＲＫＦＱＧＲＶＴＭＴＥＤＴＳＴＤＴＡＹＭＥＬＮＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＥＧＦＤＮＹＧＳＧＩＲＧＮＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２１：配列番号２０からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ１
ＥＬＳＩＨ
配列番号２２：配列番号２０からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ２
ＧＦＹＰＥＤＶＥＰＩＹＡＲＫＦＱＧ
配列番号２３：配列番号２０からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ３
ＥＧＦＤＮＹＧＳＧＩＲＧＮＷＦＤＰ
配列番号２４：重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＶＳＧＹＴＬＴＥＬＳＭＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＭＧＳＦＹＰＥＤＧＥＴＩＹＡＱＫＦＱＧＲＩＴＭＴＥＤＴＳＡＤＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＥＧＶＧＶＩＲＧＮＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２５：配列番号２４からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ１
ＥＬＳＭＨ
配列番号２６：配列番号２４からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ２
ＳＦＹＰＥＤＧＥＴＩＹＡＱＫＦＱＧ
配列番号２７：配列番号２４からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ３
ＥＧＶＧＶＩＲＧＮＷＦＤＰ
配列番号：２８：重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＳＹＷＩＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＩＩＦＰＤＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＰＳＤＴＡＭＹＹＣＶＲＬＧＧＹＳＧＹＡＥＤＦＶＤＦＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２９：配列番号２８からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ２
ＩＩＦＰＤＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧ
配列番号３０：配列番号２８からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ３
ＬＧＧＹＳＧＹＡＥＤＦＶＤＦ
配列番号３１：重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＶＳＧＹＴＬＴＫＬＳＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＧＦＥＰＥＤＧＥＴＩＮＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＥＤＴＳＴＤＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＤＬＲＬＧＡＳＹＹＹＳＹＭＤＶＷＧＲＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号３２：配列番号３１からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ１
ＫＬＳＭＨ
配列番号３３：配列番号３１からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ２
ＧＦＥＰＥＤＧＥＴＩＮＡＱＫＦＱＧ
配列番号３４：配列番号３１からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ３
ＤＬＲＬＧＡＳＹＹＹＳＹＭＤＶ
配列番号３５：重鎖可変領域
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＳＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＳＶＧＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＬＩＹＷＮＤＤＫＹＦＳＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＬＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＨＴＬＷＧＳＤＤＶＦＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号３６：配列番号３５からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ１
ＴＳＧＭＳＶＧ
配列番号３７：配列番号３５からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ２
ＬＩＹＷＮＤＤＫＹＦＳＰＳＬＫＳ
配列番号３８：配列番号３５からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ３
ＴＬＷＧＳＤＤＶＦＤＶ
配列番号３９：重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＶＳＧＹＳＦＴＮＹＷＩＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＩＩＹＰＧＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＨＴＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＨＱＧＹＳＦＳＧＳＨＩＤＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４０：配列番号３９からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ１
ＮＹＷＩＧ
配列番号４１：配列番号３９からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ２
ＩＩＹＰＧＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧ
配列番号４２：配列番号３９からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ３
ＨＱＧＹＳＦＳＧＳＨＩＤＤＹ
配列番号４３：重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＲＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＴＹＷＩＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＩＩＹＰＧＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＶＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＨＡＧＦＩＩＴＳＱＮＩＤＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４４：配列番号４３からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ１
ＴＹＷＩＧ
配列番号４５：配列番号４３からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ３
ＨＡＧＦＩＩＴＳＱＮＩＤＤＹ
配列番号４６：重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＦＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＮＴＧＮＰＴＹＡＱＤＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＧＮＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＷＧＬＶＡＩＧＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４７：配列番号４６からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ２
ＷＩＮＴＮＴＧＮＰＴＹＡＱＤＦＴＧ
配列番号４８：配列番号４６からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ３
ＤＷＧＬＶＡＩＧＹＦＤＹ
配列番号４９：重鎖可変領域
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＴＧＶＧＶＮＷＩＲＱＰＰＧＥＡＬＥＷＬＡＬＩＹＷＮＤＤＴＹＹＳＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＨＥＧＩＩＧＦＬＧＧＮＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５０：配列番号４９からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ１
ＴＴＧＶＧＶＮ
配列番号５１：配列番号４９からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ２
ＬＩＹＷＮＤＤＴＹＹＳＰＳＬＫＳ
配列番号５２：配列番号４９からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ３
ＥＧＩＩＧＦＬＧＧＮＷＦＤＰ
配列番号５３：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＨＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＴＧＮＰＴＹＡＱＧＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＫＹＶＴＮＷＶＦＡＥＤＦＱＨＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５４：配列番号５３からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ１
ＳＨＡＭＮ
配列番号５５：配列番号５３からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ２
ＷＩＮＰＮＴＧＮＰＴＹＡＱＧＦＴＧ
配列番号５６：配列番号５３からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ３
ＤＲＫＹＶＴＮＷＶＦＡＥＤＦＱＨ
配列番号５７：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＨＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＴＧＮＰＴＹＡＱＧＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＩＤＲＧＹＭＳＮＷＶＦＡＥＹＦＰＨＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５８：配列番号５７からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ３
ＤＲＧＹＭＳＮＷＶＦＡＥＹＦＰＨ
配列番号５９：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＮＴＧＮＰＴＹＡＱＧＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＤＲＧＹＩＳＳＷＶＦＡＥＤＦＱＨＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号６０：配列番号５９からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ１
ＳＹＡＭＮ
配列番号６１：配列番号５９からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ３
ＤＲＧＹＩＳＳＷＶＦＡＥＤＦＱＨ
配列番号６２：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＴＡＳＧＹＴＦＴＳＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＡＣＶＮＰＮＴＧＳＰＴＹＡＱＧＳＴＧＲＦＶＶＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＫＹＶＴＮＷＶＦＡＥＤＦＱＨＷＧＨＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号：６３：配列番号６２からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ２
ＣＶＮＰＮＴＧＳＰＴＹＡＱＧＳＴＧ
配列番号６４：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＭＮＰＮＴＧＮＰＴＹＡＱＧＳＴＧＲＦＶＶＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＫＹＶＴＮＷＶＦＡＥＤＦＱＨＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号６５：配列番号６４からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ１
ＮＹＡＭＮ
配列番号６６：配列番号６４からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ２
ＷＭＮＰＮＴＧＮＰＴＹＡＱＧＳＴＧ
配列番号６７：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＴＧＮＰＴＹＡＱＧＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＫＹＶＴＮＷＶＦＡＥＤＦＱＨＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号６８：配列番号６７からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ１
ＮＹＡＩＮ
配列番号６９：重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＤＴＦＮＴＹＳＩＴＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＳＩＶＰＩＦＧＴＩＮＮＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＡＮＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＮＴＭＶＲＧＶＤＹＹＹＭＤＶＷＧＫＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号７０：配列番号６９からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ１
ＴＹＳＩＴ
配列番号７１：配列番号６９からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ２
ＳＩＶＰＩＦＧＴＩＮＮＡＱＫＦＱＧ
配列番号７２：配列番号６９からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ３
ＤＮＴＭＶＲＧＶＤＹＹＹＭＤＶ
配列番号７３：重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＩＦＳＴＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＤＴＰＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＤＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＶＲＧＹＳＡＹＤＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号７４：配列番号７３からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ１
ＴＹＡＩＳ
配列番号７５：配列番号７３からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ２
ＧＩＩＰＩＦＤＴＰＮＹＡＱＫＦＱＧ
配列番号７６：配列番号７３からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ３
ＮＶＲＧＹＳＡＹＤＬＤＹ
配列番号７７：重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＮＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＴＧＧＴＦＮＴＹＧＴＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＴＴＡＹＭＥＶＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＡＤＭＧＴＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号７８：配列番号７７からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ１
ＴＹＧＴＮ
配列番号７９：配列番号７７からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ２
ＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ
配列番号８０：配列番号７７からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ３
ＧＧＡＤＭＧＴＬＤＹ
配列番号８１：重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＭＲＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＩＦＮＴＹＴＩＩＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＤＴＰＮＦＡＱＫＦＱＧＲＬＴＩＴＡＤＫＳＴＮＴＡＹＭＥＬＴＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＣＮＨＧＶＣＹＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号８２：配列番号８１からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ１
ＴＹＴＩＩ
配列番号８３：配列番号８１からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ２
ＧＩＩＰＩＦＤＴＰＮＦＡＱＫＦＱＧ
配列番号８４：配列番号８１からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ３
ＥＧＣＮＨＧＶＣＹＰＹ
配列番号８５：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＤＴＦＲＳＹＧＩＴＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＲＧＹＳＮＰＨＷＬＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号８６：配列番号８５からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ１
ＳＹＧＩＴ
配列番号８７：配列番号８５からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ２
ＧＩＩＰＩＦＧＴＴＮＹＡＱＫＦＱＧ
配列番号８８：配列番号８５からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ３
ＲＲＧＹＳＮＰＨＷＬＤＰ
配列番号８９：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＴＹＧＩＬＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＩＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＧＮＹＹＥＦＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号９０：配列番号８９からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ１
ＴＹＧＩＬ
配列番号９１：配列番号８９からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ３
ＧＧＧＮＹＹＥＦＶＹ
配列番号９２：重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＲＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＮＴＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＶＧＲＩＩＰＩＦＤＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＳＡＤＫＳＴＴＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＦＹＣＡＫＤＥＴＧＹＳＳＳＮＦＱＨＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号９３：配列番号９２からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ１
ＴＹＡＩＮ
配列番号９４：配列番号９２からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ２
ＲＩＩＰＩＦＤＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ
配列番号９５：配列番号９２からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ３
ＤＥＴＧＹＳＳＳＮＦＱＨ
配列番号９６：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＴＧＮＰＴＹＡＱＧＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＫＹＶＴＮＷＶＦＡＥＤＦＱＨＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号９７：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＲＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＮＴＹＳＩＴＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＶＦＧＴＳＫＹＡＱＫＦＱＤＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＮＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＳＦＳＳＳＳＧＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号９８：配列番号９７からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ２
ＧＩＩＰＶＦＧＴＳＫＹＡＱＫＦＱＤ
配列番号９９：配列番号９７からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ３
ＤＰＳＦＳＳＳＳＧＷＦＤＰ
配列番号１００：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＮＴＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＤＴＡＮＹＡＱＲＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＫＤＱＴＧＹＳＳＴＬＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１０１：配列番号１００からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ２
ＧＩＩＰＩＦＤＴＡＮＹＡＱＲＦＱＧ
配列番号１０２：配列番号１００からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ３
ＤＱＴＧＹＳＳＴＬＦＤＹ
配列番号１０３：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＨＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＴＧＮＰＴＹＡＱＧＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＩＤＲＧＹＭＳＮＷＶＦＡＥＹＦＰＨＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１０４：重鎖可変領域
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＴＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＩＰＩＦＤＴＧＮＹＡＱＫＩＱＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＴＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＨＤＹＴＮＴＶＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号１０５：配列番号１０４からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ２
ＷＩＩＰＩＦＤＴＧＮＹＡＱＫＩＱＧ
配列番号１０６：配列番号１０４からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ３
ＨＤＹＴＮＴＶＤＡＦＤＩ
配列番号１０７：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＤＴＦＲＳＹＧＩＴＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＶＦＧＴＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＶＦＭＥＬＮＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＲＧＹＳＮＰＨＷＬＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１０８：配列番号１０７からのＫＡＢＡＴによるＨＣＤＲ２
ＧＩＩＰＶＦＧＴＴＮＹＡＱＫＦＱＧ
配列番号１０９：ヒト共通軽鎖ＩＧＫＶ１－３９／ｊｋ１のアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号１１０：共通軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号１１１：配列番号１１０からのＫＡＢＡＴによるＬＣＤＲ１
ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ
配列番号１１２：配列番号１１０からのＫＡＢＡＴによるＬＣＤＲ２
ＡＡＳＳＬＱＳ
配列番号１１３：配列番号１１０からのＫＡＢＡＴによるＬＣＤＲ３
ＱＱＳＹＳＴＰＰＴ
配列番号１１４：共通軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号１１５：軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号１１６：ＣＨ１のアミノ酸配列
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶ
配列番号１１７：ヒンジのアミノ酸配列
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ
配列番号１１８：ＣＨ２のアミノ酸配列
ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ
配列番号１１９：ＫＫ変異を有するＣＨ３のアミノ酸配列
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＫＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＫＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１２０：ＤＥ変異を有するＣＨ３のアミノ酸配列
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＤＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＥＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

Claims (47)

  1. 試料における、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分を含む、少なくとも２つの細胞表面部分のクラスター化の存在を検出するための方法であって、前記方法が、
    前記第１及び第２の細胞表面部分が、少なくとも前記第１及び第２の細胞表面部分に対する結合特異性を有する薬剤に曝露されている試料を、前記第１の細胞表面部分に特異的に結合する第１の結合分子、及び前記第２の細胞表面部分に特異的に結合する第２の結合分子と接触させることであって、前記第１の結合分子及び前記第２の結合分子のうちの少なくとも１つが、前記第１及び第２の細胞表面部分が互いに近接していない限り、検出されない分子タグを含む、接触させることと、
    前記分子タグの存在又は不在を検出して、前記試料における、前記第１の細胞表面部分及び前記第２の細胞表面部分のクラスター化の前記存在を検出することと、を含む、方法。
  2. 試料における、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分を含む、少なくとも２つの細胞表面部分のクラスター化の存在を定量化するための方法であって、前記方法が、
    前記第１及び第２の細胞表面部分が、少なくとも前記第１及び第２の細胞表面部分に対する結合特異性を有する薬剤に曝露されている試料を、前記第１の細胞表面部分に特異的に結合する第１の結合分子、及び前記第２の細胞表面部分に特異的に結合する第２の結合分子と接触させることであって、前記第１の結合分子及び前記第２の結合分子のうちの少なくとも１つが、前記第１及び第２の細胞表面部分が互いに近接していない限り、検出されない分子タグを含む、接触させることと、
    前記分子タグの量を測定して、前記試料における、前記第１の細胞表面部分及び前記第２の細胞表面部分のクラスター化の前記存在を定量化することと、を含む、方法。
  3. 前記方法が、
    －ａ）前記試料を、前記第１の細胞表面部分に特異的に結合する第１の結合分子、及び前記第２の細胞表面部分に特異的に結合する第２の結合分子と接触させることであって、
    前記第１の結合分子が、切断可能なリンカーを介して前記第１の結合分子に結合した分子タグを含み、前記第２の結合分子が、切断誘導部分を含む、接触させること、又は
    ｂ）前記試料を、前記第１の細胞表面部分に特異的に結合する第１の結合分子、及び前記第２の細胞表面部分に特異的に結合する第２の結合分子と接触させることであって、
    前記第２の結合分子が、切断可能なリンカーを介して前記第２の結合分子に結合した分子タグを含み、前記第１の結合分子が、切断誘導部分を含む、接触させることと、
    －前記分子タグの切断を誘導することと、
    －放出された分子タグの前記存在若しくは不在を検出するか、又はその量を測定することにより、前記試料における前記第２の細胞表面部分との前記第１の細胞表面部分のクラスター化を検出又は定量化することと、を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記方法が、
    －ａ）前記試料を、前記第１の細胞表面部分に特異的に結合する第１の結合分子、前記第２の細胞表面部分に特異的に結合する第２の結合分子、及び第３の結合分子と接触させることであって、
    前記第１の結合分子が、切断可能なリンカーを介して前記第１の結合分子に結合した分子タグを含み、前記第３の結合分子が、前記第２の結合分子に結合し、切断誘導部分を含む、接触させること、又は
    ｂ）前記試料を、前記第１の細胞表面部分に特異的に結合する第１の結合分子、前記第２の細胞表面部分に特異的に結合する第２の結合分子、及び第３の結合分子と接触させることであって、
    前記第２の結合分子が、切断可能なリンカーを介して前記第２の結合分子に結合した分子タグを含み、前記第３の結合分子が、前記第１の結合分子に結合し、切断誘導部分を含む、接触させること、又は
    ｃ）前記試料を、前記第１の細胞表面部分に特異的に結合する第１の結合分子、前記第２の細胞表面部分に特異的に結合する第２の結合分子、及び第３の結合分子と接触させることであって、
    前記第１の結合分子が、切断誘導部分を含み、前記第３の結合分子が、前記第２の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介して前記第３の結合分子に結合した分子タグを含む、接触させること、又は
    ｄ）前記試料を、前記第１の細胞表面部分に特異的に結合する第１の結合分子、前記第２の細胞表面部分に特異的に結合する第２の結合分子、及び第３の結合分子と接触させることであって、
    前記第２の結合分子が、切断誘導部分を含み、前記第３の結合分子が、前記第１の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介して前記第３の結合分子に結合した分子タグを含む、接触させることと、
    －前記分子タグの切断を誘導することと、
    －放出された分子タグの前記存在若しくは不在を検出するか、又はその量を測定することにより、前記試料における前記第２の細胞表面部分との前記第１の細胞表面部分のクラスター化を検出又は定量化することと、を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  5. 前記方法が、
    －ａ）前記試料を、前記第１の細胞表面部分に特異的に結合する第１の結合分子、前記第２の細胞表面部分に特異的に結合する第２の結合分子、第３の結合分子、及び第４の結合分子と接触させることであって、
    前記第３の結合分子が、前記第１の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介して前記第３の結合分子に結合した分子タグを含み、前記第４の結合分子が、前記第２の結合分子に結合し、切断誘導部分を含む、接触させること、又は
    ｂ）前記試料を、前記第１の細胞表面部分に特異的に結合する第１の結合分子、前記第２の細胞表面部分に特異的に結合する第２の結合分子、第３の結合分子、及び第４の結合分子と接触させることであって、
    前記第３の結合分子が、前記第１の結合分子に結合し、切断誘導部分を含み、前記第４の結合分子が、前記第２の結合分子に結合し、切断可能なリンカーを介して前記第４の結合分子に結合した分子タグを含む、接触させることと、
    －前記分子タグの切断を誘導することと、
    －放出された分子タグの不在の前記存在を検出するか、又はその量を測定することにより、前記試料における前記第２の細胞表面部分との前記第１の細胞表面部分のクラスター化を検出又は定量化することと、を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  6. 前記試料が、好ましくは、対象又は患者由来の組織試料、血液試料、又は培養細胞である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記試料が、新鮮試料又は固定された試料である、請求項６に記載の方法。
  8. 前記試料が、がんを有する対象由来の腫瘍生検試料である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 試料における、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分を含む、少なくとも２つの細胞表面部分の発現を検出するための方法であって、前記方法が、
    がんを有する対象由来の腫瘍生検試料を、第１の細胞表面部分を検出する少なくとも１つの結合分子、及び第２の細胞表面部分を検出する少なくとも１つの結合分子と接触させることであって、
    前記第１の細胞表面部分を検出する少なくとも１つの結合分子、及び前記第２の細胞表面部分を検出する少なくとも１つの結合分子が、分子タグを含む、接触させることと、
    前記分子タグの存在又は不在を検出して、前記試料における前記第１の細胞表面部分及び前記第２の細胞表面部分の前記発現を検出することと、を含む、方法。
  10. 試料における、第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分を含む、少なくとも２つの細胞表面部分の発現を定量化するための方法であって、前記方法が、
    がんを有する対象由来の腫瘍生検試料を、第１の細胞表面部分を検出する少なくとも１つの結合分子、及び第２の細胞表面部分を検出する少なくとも１つの結合分子と接触させることであって、
    前記第１の細胞表面部分を検出する少なくとも１つの結合分子、及び前記第２の細胞表面部分を検出する少なくとも１つの結合分子が、分子タグを含む、接触させることと、
    前記分子タグの量を測定して、前記試料における前記第１の細胞表面部分及び前記第２の細胞表面部分の前記発現を定量化することと、を含む、方法。
  11. 前記第１及び第２の細胞表面部分が、同じ細胞又は同じ型の細胞によって発現される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記第１及び第２の細胞表面部分が、異なる細胞又は異なる型の細胞によって発現される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記第１の細胞表面部分が、免疫エフェクター細胞、特に、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞又は好中性顆粒球によって発現され、前記第２の細胞表面部分が、腫瘍細胞又は免疫細胞によって発現される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  14. 少なくとも１つの細胞表面部分が、ＣＤ１３７又は別の免疫エフェクター細胞共刺激部分である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 少なくとも１つの細胞表面部分が、ＰＤ－Ｌ１又は別の腫瘍関連部分若しくは免疫チェックポイント部分である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 少なくとも１つの細胞表面部分が、ＣＤ１３７又は別の免疫エフェクター細胞共刺激部分であり、少なくとも１つの細胞表面部分が、ＰＤ－Ｌ１又は別の腫瘍関連部分若しくは免疫チェックポイント部分である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記細胞表面部分に対する結合特異性を有する前記薬剤が、二重特異性又は三重特異性抗体などの多重特異性抗体である、請求項１～８及び１１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記多重特異性抗体が、ＣＤ１３７又は別の免疫エフェクター細胞共刺激分子、及びＰＤ－Ｌ１又は別の腫瘍関連部分若しくは免疫チェックポイント部分に結合する二重特異性抗体である、請求項１７に記載の方法。
  19. ＣＤ１３７に結合する前記二重特異性抗体の結合ドメインが、１、２、又は３個のアミノ酸置換、好ましくは、１個のアミノ酸置換を許容する、配列番号４、８、１２、１６、１９、２３、２７、３０、３４、３８、４２、４５、４８、又は５２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を有する重鎖可変領域を含む、請求項１８に記載の方法。
  20. ＣＤ１３７に結合する前記二重特異性抗体の前記結合ドメインが、１、２、若しくは３個のアミノ酸置換、好ましくは、１個のアミノ酸置換を許容する、配列番号２、６、１０、１４、１８、２１、２５、３２、３６、４０、４４、若しくは５０のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を含み、かつ／又は１、２、若しくは３個のアミノ酸置換、好ましくは、１個のアミノ酸置換を許容する、配列番号３、７、１１、１５、２２、２６、２９、３３、３７、４１、４７、若しくは５１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
  21. ＣＤ１３７に結合する前記二重特異性抗体の前記結合ドメインが、配列番号１、５、９、１３、１７、２０、２４、２８、３１、３５、３９、４３、４６、若しくは４９のうちのいずれか１つを有するか、又はそれらに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％の配列同一性を有し、特に、それらのフレームワーク領域に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. ＰＤ－Ｌ１に結合する前記二重特異性抗体の前記結合ドメインが、１、２、又は３個のアミノ酸置換、好ましくは、１個のアミノ酸置換を許容する、配列番号５６、５８、６１、７２、７６、８０、８４、８８、９１、９５、９９、１０２、又は１０６のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を有する重鎖可変領域を含む、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. ＰＤ－Ｌ１に結合する前記二重特異性抗体の前記結合ドメインが、１、２、若しくは３個のアミノ酸置換、好ましくは、１個のアミノ酸置換を許容する、配列番号５４、６０、６５、６８、７０、７４、７８、８２、８６、９０、若しくは９３のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を含み、かつ／又は１、２、若しくは３個のアミノ酸置換、好ましくは、１個のアミノ酸置換を許容する、配列番号５５、３、６３、６６、７１、７５、７９、８３、８７、９４、９８、１０１、１０５、若しくは１０８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. ＰＤ－Ｌ１に結合する前記二重特異性抗体の前記結合ドメインが、配列番号５３、５７、５９、６２、６４、６７、６９、７３、７７、８１、８５、８９、９２、９６、９７、１００、１０３、１０４、若しくは１０７のうちのいずれか１つを有するか、又はそれらに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％の配列同一性を有し、特に、それらのフレームワーク領域に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、請求項１８～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分、特に、免疫エフェクター細胞上で発現された部分、及び腫瘍細胞又は免疫細胞上で発現された部分に結合する薬剤又は複数の薬剤に対する、対象、特に、がん患者の応答性を予測するための方法であって、前記方法が、
    －対象由来の生体試料中の第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面メンバーの発現レベルを検出することと、
    －前記対象の試料中の前記第１の細胞表面部分及び前記第２の細胞表面部分の前記発現レベルが、閾値レベルを上回っているか、又は下回っているかを決定することと、
    －前記対象の試料中の前記第１の細胞表面部分及び前記第２の細胞表面部分の前記発現レベルが、前記閾値レベル以上である場合、前記対象が、前記第１の細胞表面部分及び前記第２の細胞表面部分に結合する薬剤又は複数の薬剤に応答する可能性が高いと予測することと、を含む、方法。
  26. 第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面メンバーの前記発現レベルが、請求項９～１６のいずれか一項に記載の方法を使用して測定される、請求項２５に記載の方法。
  27. 治療を必要とする対象、特に、がんを有する対象を治療するための方法であって、前記方法が、
    －請求項２５又は２６に記載の方法を使用して、第１の細胞表面部分及び第２の細胞面部分に結合する薬剤又は複数の薬剤に対する対象の応答性を予測することと、
    －前記第１の細胞表面部分及び前記第２の細胞表面に結合する薬剤又は複数の薬剤を、応答する可能性が高い対象に投与することと、を含む、方法。
  28. 少なくとも１つの細胞表面部分が、ＣＤ１３７又は別の免疫エフェクター細胞共刺激部分である、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 少なくとも１つの細胞表面部分が、ＰＤ－Ｌ１又は別の腫瘍関連部分若しくは免疫チェックポイント部分である、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の方法
  30. 少なくとも１つの細胞表面部分が、ＣＤ１３７であり、少なくとも１つの細胞表面部分が、ＰＤ－Ｌ１である、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記細胞表面部分に結合する前記薬剤が、請求項１７～２４のいずれか一項に記載の、ＣＤ１３７若しくは別の免疫エフェクター細胞共刺激部分、及びＰＤ－Ｌ１又は別の腫瘍関連部分若しくは免疫チェックポイント部分に特異的に結合する、二重特異性又は三重特異性抗体、特に、二重特異性抗体などの多重特異性抗体である、請求項２５～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 薬剤の有効性を決定するための方法であって、前記薬剤が、第１の細胞表面部分に特異的に結合する結合ドメイン、及び第２の細胞表面部分に特異的に結合する結合ドメインを少なくとも含み、前記方法が、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法を使用することによって、前記薬剤で治療中の対象の生体試料中の第２の細胞表面部分との第１の細胞表面部分のクラスター化を検出することを含む、方法。
  33. 薬剤の有効性を決定するための方法であって、前記薬剤が、第１の細胞表面部分に特異的に結合する結合ドメイン、及び第２の細胞表面部分に特異的に結合する結合ドメインを少なくとも含み、前記方法が、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法を使用することによって、前記薬剤で治療中の対象の生体試料中の第２の細胞表面部分との第１の細胞表面部分のクラスター化を定量化することを含む、方法。
  34. 薬剤の作用様式を確認するための方法であって、前記薬剤が、第１の細胞表面部分に特異的に結合する結合ドメイン、及び第２の細胞表面部分に特異的に結合する結合ドメインを少なくとも含み、前記方法が、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法を使用することによって、前記薬剤で治療中の対象の生体試料中の第２の細胞表面部分との第１の細胞表面部分のクラスター化を検出することを含む、方法。
  35. 薬剤の作用様式を確認するための方法であって、前記薬剤が、第１の細胞表面部分に特異的に結合する結合ドメイン、及び第２の細胞表面部分に特異的に結合する結合ドメインを少なくとも含み、前記方法が、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法を使用することによって、前記薬剤で治療中の対象の生体試料中の第２の細胞表面部分との第１の細胞表面部分のクラスター化を定量化することを含む、方法。
  36. 前記作用様式が、前記第１及び第２の細胞表面部分への前記薬剤の同時結合である、請求項３４又は３５に記載の方法。
  37. 前記作用様式が、２つ以上の細胞表面部分のクラスター化である、請求項３４又は３５に記載の方法。
  38. 前記クラスター化が、免疫エフェクター細胞上で発現された２つ以上の細胞表面部分のもの、特に、２つ以上のＣＤ１３７タンパク質の前記クラスター化である、請求項３７に記載の方法。
  39. 治療を必要とする対象、特に、がんを有する対象を治療するための方法であって、前記方法が、
    －第１の細胞表面部分及び第２の細胞表面部分に結合する薬剤で対象を治療すること、
    －請求項３２～３８のいずれか一項に記載の方法を使用して、前記薬剤の前記有効性、又は前記薬剤の前記作用様式を分析すること、を含む、方法。
  40. 前記分析又は確認の結果に基づいて、前記治療を継続又は適応させることを更に含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 第２の細胞表面部分との少なくとも第１の細胞表面部分のクラスター化を誘導する能力について、１つ以上の試験薬剤をスクリーニングするための方法であって、前記方法が、
    －１つ以上の試験細胞培養物を、試験薬剤と接触させることであって、
    前記試験細胞培養物が、第１の細胞表面部分を発現する細胞、及び第２の細胞表面部分を発現する細胞を含む、接触させることと、
    －請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法を使用して、前記第１及び第２の細胞表面部分のクラスター化のレベルを検出又は定量化することと、
    －クラスター化の前記レベルを、前記試験薬剤と接触していないか、又は参照薬剤と接触していない対照細胞培養物中で前記クラスター化について検出されたクラスター化の前記レベルと比較することと、を含み、
    前記対照細胞培養物が、前記第１の細胞表面部分、及び前記第２の細胞表面部分を含む、方法。
  42. 前記対照細胞培養物におけるクラスター化の前記レベルと等しいか、又はそれより高いクラスター化のレベルを誘導する試験薬剤を選択することを更に含む、請求項４１に記載の方法。
  43. 少なくとも１つの細胞表面部分が、ＣＤ１３７又は別の免疫エフェクター共刺激部分である、請求項４１又は４２に記載の方法。
  44. 少なくとも１つの細胞表面部分が、ＰＤ－Ｌ１又は別の腫瘍関連部分若しくは免疫チェックポイント分子である、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 少なくとも１つの細胞表面部分が、ＣＤ１３７であり、少なくとも１つの細胞表面部分が、ＰＤ－Ｌ１である、請求項４１～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記参照薬剤が、請求項１７～２４のいずれか一項に記載の、ＣＤ１３７若しくは別の免疫エフェクター共刺激部分、及びＰＤ－Ｌ１又は別の腫瘍関連部分若しくは免疫チェックポイント部分に特異的に結合する多重特異性抗体である、請求項４１～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 第１及び第２の細胞表面部分に特異的に結合する少なくとも２つの結合分子であって、任意選択で、前記結合分子のうちの一方が、切断可能なリンカーを介して前記一方に結合した分子タグを含み、他方の結合分子が、切断誘導部分を含む、少なくとも２つの結合分子と、患者試料を前記少なくとも２つの結合分子と接触させて、任意選択で、前記分子タグの切断を誘導し、前記患者試料を、前記少なくとも２つの結合分子と接触させることによって誘導されたシグナルの存在又は不在を検出するための説明書と、を含む、パーツのキット。
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