KR20240007162A - Magec2 면역원성 펩티드, magec2 면역원성 펩티드를 인식하는 결합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

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앤드류 피. 페레티
이판 왕
가빈 맥베스
치카이 수
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티스캔 테라퓨틱스, 인크.
아카데미슈 지켄후이스 라이덴
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Abstract

MAGEC2 면역원성 펩티드, MAGEC2 면역원성 펩티드를 인식하는 결합 단백질, 및 이의 용도가 본원에 제공된다.

Description

MAGEC2 면역원성 펩티드, MAGEC2 면역원성 펩티드를 인식하는 결합 단백질 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 4월 14일에 출원된 미국 가출원 번호 63/174,808, 및 2022년 4월 11일에 출원된 미국 가출원 번호 63/329,523의 이익을 주장하며; 각각의 상기 출원의 전체 내용은 이 참조로서 그 전체가 본원에 포함된다.
발명의 배경
조작된 T 세포를 사용한 입양 세포 전달(ACT)은 특정 유형의 액체 종양을 치료하는데 큰 효능을 입증했고 고형 종양을 치료하는데 대한 가능성을 보유한다. T 세포 수용체-조작된 T 세포(TCR-T)는 암세포에 존재하는 항원을 인식하는 외인성 TCR을 발현하는 T 세포이다. TCR-항원 상호작용은 TCR-T 세포가 암세포를 죽일 수 있게 하는 표적화 메커니즘의 핵심 구성요소이다. TCR-T 치료법의 광범위한 테스트 및 채택에 대한 과제 중 하나는 광범위한 환자 및 적응증에 적용할 수 있는 TCR-항원 쌍의 결여이다. 여러 TCR과 항원이 임상 시험에서 탐색되었지만 대부분의 추구된 항원은 하나의 HLA 대립유전자, 즉 HLA-A*02:01로 제한되어 치료법에 적합한 환자 수를 제한하고 HLA-A*02:01 대립유전자를 돌연변이시킴에 의해 암 세포가 잠재적 내성을 발달하도록 허용한다.
부가하여, 일반적으로 MHC 제시 에피토프의 예측이 필요한 신규한 TCR-항원 쌍을 발견하는 것이 어렵기 때문에 추구된 항원의 수가 제한된다. 그러나, 그러한 에피토프는 면역원성이 아니어서 반응성 TCR을 식별하기 어렵게 만들거나, 에피토프가 암 세포에 의해 생리학적으로 처리 및 제시되지 않을 수 있다. 따라서, 항원의 발현을 특징으로 하는 장애에 관련된 작용제를 진단, 예후, 처리 및 스크리닝하기 위한 유용한 시약을 개발하기 위해 널리 적용가능한 다양한 HLA 대립유전자의 맥락에서 TCR-항원 쌍을 식별하기 위한 큰 필요성이 당업계에 있다.
발명의 개요
본 발명은 적어도 부분적으로, MAGEC2 면역원성 펩티드 및 MAGEC2 발현과 연관된 장애가 있는 대상체(예를 들어, 흑색종, 두경부암, 폐암, 자궁경부암, 전립선암, 다발성 골수종, 간세포 암종, 유방 침윤성 암종, 또는 방광 요로상피 암종)로부터 식별된 TCR 클론형의 항원을 발견하는데 사용되는 비편향된 기능적 스크린에 기초하여 이러한 MAGEC2 면역원성 펩티드를 인식하는 결합 단백질의 발견에 기초한다. 식별된 TCR은 다양한 HLA 대립유전자(예를 들어, HLA-B*07:02 및 HLA-A*24:02)와 관련하여 표 1에 열거된 것과 같은 MAGEC2 면역원성 펩티드를 인식했다. MAGEC2는 암과 고환 조직에서 선택적으로 발현되지만 정상적인 체세포 조직에서는 발현되지 않는 것으로 입증되어 이를 ACT의 이상적인 표적으로 한다. MAGEC2 면역원성 펩티드에 결합하고 MAGEC2를 발현하는 세포(예를 들어, 암세포)를 죽이는 면역 반응을 유도하는 MAGEC2 결합 단백질(예를 들어, 본원에 기술된 TCR)의 능력은 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애와 관련된 작용제의 진단, 예후, 처리 및 스크리닝의 방법을 포함하여 다양한 용도에서 이러한 결합 단백질의 유용성을 입증한다.
일 양태에서, 표 1에 열거된 펩티드 서열로부터 선택된 펩티드 에피토프를 포함하는 면역원성 펩티드가 제공된다.
또 다른 양태에서, 표 1에 열거된 펩티드 서열로부터 선택된 펩티드 에피토프로 구성된 면역원성 펩티드가 제공된다.
본 발명에 포함되고/되거나 본원에 기술된 임의의 다른 구체예와 조합될 수 있는 다양한 구체예가 추가로 제공된다. 예를 들어, 한 구체예에서, 면역원성 펩티드는 MAGEC2 단백질로부터 유래되고, 선택적으로 면역원성 펩티드는 길이가 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 아미노산이다. 또 다른 구체예에서, 면역원성 펩티드는 대상체에서 MAGEC2 및/또는 MAGEC2-발현 세포에 대한 면역 반응을 유도할 수 있으며, 선택적으로 면역 반응은 i) T 세포 반응 및/또는 CD8+ T 세포 반응이고/이거나 ii) T 세포 확장, 사이토카인 방출 및/또는 세포독성 사멸로 구성된 군에서 선택된다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 적어도 하나의 면역원성 펩티드를 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다.
본 발명에 포함되고/되거나 본원에 기술된 임의의 다른 구체예와 조합될 수 있는 다양한 구체예가 추가로 제공된다. 예를 들어, 한 구체예에서, 면역원성 조성물은 애주반트를 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 면역원성 조성물은 대상체에서 MAGEC2 및/또는 MAGEC2-발현 세포에 대한 면역 반응을 유도할 수 있으며, 선택적으로 면역 반응은 i) T 세포 반응 및/또는 CD8+ T 세포 반응이고/이거나 ii) T 세포 확장, 사이토카인 방출 및/또는 세포독성 사멸로 구성된 군에서 선택된다.
또 다른 양태에서, 표 1에 열거된 펩티드 서열로부터 선택된 펩티드 에피토프 및 MHC 분자를 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명에 포함되고/되거나 본원에 기술된 임의의 다른 구체예와 조합될 수 있는 다양한 구체예가 추가로 제공된다. 예를 들어, 한 구체예에서, MHC 분자는 MHC 다량체이고, 선택적으로 MHC 다량체는 사량체이다. 다른 구체예에서, MHC 분자는 MHC 클래스 I 분자이다. 또 다른 구체예에서, MHC 분자는 HLA-A*02, HLA-A*03, HLA-A*01, HLA-A*11, HLA-A*24 및/또는 HLA-B*07로 구성된 군으로부터 선택된 HLA 혈청형인 MHC 알파 사슬을 포함하며, 선택적으로 HLA 대립유전자는 HLA-A*0201, HLA-A*0202, HLA-A*0203, HLA-A*0204, HLA-A*0205, HLA-A*0206, HLA-A*0207, HLA-A*0210, HLA-A*0211, HLA-A*0212, HLA-A*0213, HLA-A*0214, HLA-A*0216, HLA-A*0217, HLA-A*0219, HLA-A*0220, HLA-A*0222, HLA-A*0224, HLA-A*0230, HLA-A*0242, HLA-A*0253, HLA-A*0260, HLA-A*0274 대립유전자, HLA-A*0301, HLA-A*0302, HLA-A*0305, HLA-A*0307, HLA-A*0101, HLA-A*0102, HLA-A*0103, HLA-A*0116 대립유전자, HLA-A*1101, HLA-A*1102, HLA-A*1103, HLA-A*1104, HLA-A*1105, HLA-A*1119 대립유전자, HLA-A*2402, HLA-A*2403, HLA-A*2405, HLA-A*2407, HLA-A*2408, HLA-A*2410, HLA-A*2414, HLA-A*2417, HLA-A*2420, HLA-A*2422, HLA-A*2425, HLA-A*2426, HLA-A*2458 대립유전자, HLA-B*0702, HLA-B*0704, HLA-B*0705, HLA-B*0709, HLA-B*0710, HLA-B*0715, 및 HLA-B*0721 대립유전자로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, MHC 분자와 관련하여 본원에 기술된 면역원성 펩티드를 포함하는 안정한 MHC-펩티드 복합체가 제공된다.
본 발명에 포함되고/되거나 본원에 기술된 임의의 다른 구체예와 조합될 수 있는 다양한 구체예가 추가로 제공된다. 예를 들어, 한 구체예에서, MHC 분자는 MHC 다량체이고, 선택적으로 MHC 다량체는 사량체이다. 다른 구체예에서, MHC 분자는 MHC 클래스 I 분자이다. 또 다른 구체예에서, MHC 분자는 HLA-A*02, HLA-A*03, HLA-A*01, HLA-A*11, HLA-A*24 및/또는 HLA-B*07로 구성된 군으로부터 선택된 HLA 혈청형인 MHC 알파 사슬을 포함하며, 선택적으로 HLA 대립유전자는 HLA-A*0201, HLA-A*0202, HLA-A*0203, HLA-A*0204, HLA-A*0205, HLA-A*0206, HLA-A*0207, HLA-A*0210, HLA-A*0211, HLA-A*0212, HLA-A*0213, HLA-A*0214, HLA-A*0216, HLA-A*0217, HLA-A*0219, HLA-A*0220, HLA-A*0222, HLA-A*0224, HLA-A*0230, HLA-A*0242, HLA-A*0253, HLA-A*0260, HLA-A*0274 대립유전자, HLA-A*0301, HLA-A*0302, HLA-A*0305, HLA-A*0307, HLA-A*0101, HLA-A*0102, HLA-A*0103, HLA-A*0116 대립유전자, HLA-A*1101, HLA-A*1102, HLA-A*1103, HLA-A*1104, HLA-A*1105, HLA-A*1119 대립유전자, HLA-A*2402, HLA-A*2403, HLA-A*2405, HLA-A*2407, HLA-A*2408, HLA-A*2410, HLA-A*2414, HLA-A*2417, HLA-A*2420, HLA-A*2422, HLA-A*2425, HLA-A*2426, HLA-A*2458 대립유전자, HLA-B*0702, HLA-B*0704, HLA-B*0705, HLA-B*0709, HLA-B*0710, HLA-B*0715, 및 HLA-B*0721 대립유전자로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 펩티드 에피토프와 MHC 분자는 공유적으로 연결되고/되거나 MHC 분자의 알파 및 베타 사슬은 공유적으로 연결된다. 또 다른 구체예에서, 안정한 MHC-펩티드 복합체는 검출가능한 표지를 포함하며, 선택적으로 검출가능한 표지는 형광단이다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 안정한 MHC-펩티드 복합체 및 애주반트를 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 면역원성 펩티드 또는 그의 상보체를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 단리된 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다.
또 다른 양태에서, a) 본원에 기술된 단리된 핵산을 포함하고, b) 본원에 기술된 벡터를 포함하고, 및/또는 c) 본원에 기술된 하나 이상의 면역원성 펩티드를 생산하고/하거나 세포 표면에 본원에 기술된 하나 이상의 안정한 MHC-펩티드 복합체를 제시하는 세포가 제공되며, 선택적으로 여기서 세포는 유전적으로 조작된다.
또 다른 양태에서, a) 본원에 기술된 하나 이상의 면역원성 펩티드 및/또는 b) 본원에 기술된 하나 이상의 안정한 MHC-펩티드 복합체를 포함하는 장치 또는 키트가 제공되며, 상기 장치 또는 키트는 선택적으로 결합 단백질에 a) 및 /또는 b)의 결합을 검출하는 시약을 포함하며, 선택적으로 여기서 결합 단백질은 항체, 항체의 항원-결합 단편, TCR, TCR의 항원-결합 단편, 단일 사슬 TCR(scTCR), 키메라 항원 수용체(CAR), 또는 TCR과 이펙터 도메인을 포함하는 융합 단백질이다.
또 다른 양태에서, a) T 세포를 포함하는 샘플을 본원에 기술된 안정한 MHC-펩티드 복합체와 접촉시키는 단계; 및 b) 안정한 MHC-펩티드 복합체에 대한 T 세포의 결합을 검출하고, 선택적으로 안정한 MHC-펩티드 복합체에 결합하는 안정한 MHC-펩티드-특이적 T 세포의 백분율을 추가로 결정하는 단계를 포함하는, 안정한 MHC-펩티드 복합체에 결합하는 T 세포를 검촐하는 방법이 제공되며, 선택적으로 여기서 샘플은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 포함한다.
본 발명에 포함되고/되거나 본원에 기술된 임의의 다른 구체예와 조합될 수 있는 다양한 구체예가 추가로 제공된다. 예를 들어, 한 구체예에서, T 세포는 CD8+ T 세포이다. 다른 구체예에서, 검출 및/또는 결정하는 것은 형광 활성화된 세포 분류(FACS), 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사면역 검정(RIA), 면역화학, 웨스턴 블롯 또는 세포내 유동 검정을 사용하여 수행된다. 또 다른 구체예에서, 샘플은 하나 이상의 MAGEC2 단백질 또는 이의 단편과 접촉되었거나 접촉된 것으로 의심되는 T 세포를 포함한다.
또 다른 양태에서, a) T 세포를 포함하는 세포 집단을 본원에 기술된 면역원성 펩티드 또는 본원에 기술된 안정한 MHC-펩티드 복합체와 인큐베이션하는 단계; 및 b) 반응성의 존재 또는 수준을 검출하는 단계를 포함하는 T 세포가 MAGEC2에 노출되었는지 여부를 결정하는 방법이 제공되며, 여기서 대조군 수준과 비교하여 반응성의 존재 또는 더 높은 수준은 T 세포가 MAGEC2에 노출되었음을 나타내고, 선택적으로 T 세포를 포함하는 세포 집단은 대상체로부터 수득된다.
또 다른 양태에서, a) 대상체로부터 얻은 T 세포와 본원에 기술된 하나 이상의 면역원성 펩티드 또는 본원에 기술된 하나 이상의 안정한 MHC-펩티드 복합체 간의 반응성의 존재 또는 수준을 검출하는 단계; 및 b) 반응성의 존재 또는 수준을 대조군으로부터의 것과 비교하는 단계를 포함하는 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애로부터 고통을 받는 대상체의 임상적 결과를 예측하는 방법이 제공되며, 여기서 대조군은 양호한 임상적 결과를 갖는 대상체로부터 얻어지며, 대조군과 비교하여 대상체 샘플에서의 반응성의 존재 또는 더 높은 수준은 양호한 임상적 결과를 가진다.
또 다른 양태에서, a) 대상체에게 치료법의 적어도 일부를 제공하기 이전에 대상체로부터 얻은 제1 샘플에서, 대상체로부터 얻은 T 세포와 본원에 기술된 하나 이상의 면역원성 펩티드 또는 본원에 기술된 하나 이상의 안정한 MHC-펩티드 복합체 사이의 반응성의 존재 또는 수준을 결정하는 단계, 및 b) 대상체에게 치료법의 제공에 이어서 대상체로부터 얻은 제2 샘플에 존재하는 대상체로부터 얻은 T 세포와, 본원에 기술된 하나 이상의 면역원성 펩티드, 또는 본원에 기술된 하나 이상의 안정한 MHC-펩티드 복합체 사이의 반응성의 존재 또는 수준을 결정하는 단계를 포함하는 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애에 대한 치료법의 효능을 평가하는 방법이 제공되며, 여기서 제1 샘플과 비교하여 제2 샘플에서의 반응성의 존재 또는 더 높은 수준은 치료법이 대상체에서 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 치료하는데 효과적이다는 표시이다.
본 발명에 포함되고/되거나 본원에 기술된 임의의 다른 구체예와 조합될 수 있는 다양한 구체예가 추가로 제공된다. 예를 들어, 한 구체예에서, 반응성의 수준은 a) 결합의 존재 및/또는 b) T 세포 활성화 및/또는 이펙터 기능에 의해 표시되며, 선택적으로 여기서 T 세포 활성화 또는 이펙터 기능은 T 세포 증식, 사멸, 또는 사이토카인 방출이다. 또 다른 구체예에서, 방법은 후속 시점에서 단계 a) 및 b)를 반복하는 것을 추가로 포함하며, 선택적으로 여기서 대상체는 제1 시점과 후속 시점 사이에 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 개선하기 위한 치료를 받았다. 또 다른 구체예에서, T 세포 결합, 활성화 및/또는 이펙터 기능은 형광 활성화된 세포 분류(FACS), 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사면역 검정(RIA), 면역화학, 웨스턴 블롯 또는 세포내 유동 검정을 사용하여 검출된다. 또 다른 실시예에서, 대조군 수준은 기준 수이다. 또 다른 구체예에서, 대조군 수준은 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애가 없는 대상체의 수준이다.
또 다른 양태에서, 대상체에게 치료적으로 유효한 양의 본원에 기술된 조성물을 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 예방 및/또는 치료하는 방법.
또 다른 양태에서, a) 세포의 표면 상에 MHC 분자와 관련하여 표 1에 열거된 펩티드 서열로부터 선택된 펩티드 에피토프를 제시하는 세포를 제공하는 단계; b) 세포 상의 MHC 분자와 관련하여 복수의 후보 펩티드-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편의 펩티드 에피토프에 대한 결합을 결정하는 단계; 및 c) MHC 분자와 관련하여 펩티드 에피토프에 결합하는 하나 이상의 펩티드-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편을 식별하는 단계를 포함하는 표 1에 열거된 펩티드 서열로부터 선택된 펩티드 에피토프에 결합하는 펩티드-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편을 식별하는 방법이 제공된다.
본 발명에 포함되고/되거나 본원에 기술된 임의의 다른 구체예와 조합될 수 있는 다양한 구체예가 추가로 제공된다. 예를 들어, 한 구체예에서, 단계 a)는 세포의 표면 상의 MHC 분자를 표 1에 열거된 펩티드 서열로부터 선택된 펩티드 에피토프와 접촉시키는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 단계 a)는 펩티드 에피토프를 인코딩하는 이종 서열을 포함하는 벡터를 사용하여 세포에서 표 1에 열거된 펩티드 서열로부터 선택된 펩티드 에피토프를 발현시키는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, a) 단독으로 또는 MHC 분자의 맥락에서, 표 1에 열거된 펩티드 서열로부터 선택된 펩티드 에피토프를 포함하는, 펩티드 에피토프를 단독으로 또는 안정한 MHC-펩티드 복합체로 제공하는 단계; b) 펩티드 또는 안정한 MHC-펩티드 복합체에 대한 복수의 후보 펩티드-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편의 결합을 결정하는 단계; 및 c) 펩티드 에피토프 또는 안정한 MHC-펩티드 복합체에 결합하는 하나 이상의 펩티드-결합 분자 또는 그의 항원-결합 단편을 식별하는 단계를 포함하는, 표 1에 열거된 펩티드 서열로부터 선택된 펩티드 에피토프에 결합하는 펩티드-결합 분자 또는 그의 항원-결합 단편을 식별하는 방법이 제공되며, 선택적으로 여기서 MHC 또는 MHC-펩티드 복합체는 본원에 기술된 바와 같다.
본 발명에 포함되고/되거나 본원에 기술된 임의의 다른 구체예와 조합될 수 있는 다양한 구체예가 추가로 제공된다. 예를 들어, 한 구체예에서, 복수의 후보 펩티드 결합 분자는 항체, 항체의 항원-결합 단편, TCR, TCR의 항원-결합 단편, 단일 사슬 TCR(scTCR), 키메라 항원 수용체(CAR), 또는 TCR과 이펙터 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 다른 구체예에서, 복수의 후보 펩티드 결합 분자는 적어도 2, 5, 10, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109개 이상의 서로 다른 후보 펩티드 결합 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 복수의 후보 펩티드 결합 분자는 대상체 또는 대상체의 집단으로부터의 샘플로부터 얻은 하나 이상의 후보 펩티드 결합 분자를 포함하며; 또는 복수의 후보 펩티드 결합 분자는 대상체로부터의 샘플로부터 얻은 모 스캐폴드 펩티드 결합 분자에 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 후보 펩티드 결합 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 대상체 또는 대상체의 집단은 a) MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 앓고 있지 않고/않거나 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애로부터 회복되었거나, 또는 b) MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 앓고 있다. 또 다른 구체예에서, 대상체 또는 대상체의 집단에는 본원에 기술된 조성물이 투여되었다. 또 다른 구체예에서, 대상체는 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애의 동물 모델 및/또는 포유동물이고, 선택적으로 여기서 포유동물은 인간, 영장류 또는 설치류이다. 또 다른 구체예에서, 대상체는 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애의 동물 모델, HLA-형질전환 마우스 및/또는 인간 TCR 형질전환 마우스이다. 다른 구체예에서, 샘플은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), T 세포 및/또는 CD8+ 기억 T 세포를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 방법에 따라 식별된 펩티드-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되며, 선택적으로 여기서 펩티드-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편은 항체, 항체의 항원-결합 단편, TCR, TCR의 항원-결합 단편, 단일 사슬 TCR(scTCR), 키메라 항원 수용체(CAR), 또는 TCR과 이펙터 도메인을 포함하는 융합 단백질이다.
또 다른 양태에서, i) 표 1에 열거된 서열로부터 선택된 펩티드 에피토프에 결합하며, ii) 본원에 기재된 방법에 따라 식별되고/되거나 iii) MHC 분자의 맥락에서 표 1에 열거된 서열로부터 선택된 펩티드 에피토프를 포함하는 안정한 MHC-펩티드 복합체에 결합하는 펩티드-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편을 발현하는 유전적으로 조작된 T 세포의 치료적으로 유효한 양을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 치료하는 방법이 제공되며, 선택적으로 여기서 펩티드-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편은 항체, 항체의 항원-결합 단편, TCR, TCR의 항원-결합 단편, 단일 사슬 TCR(scTCR), 키메라 항원 수용체(CAR), 또는 TCR 및 이펙터 도메인을 포함하는 융합 단백질이며, 선택적으로 여기서 MHC 또는 MHC-펩티드 복합체는 본원에 기술된 바와 같다.
본 발명에 포함되고/되거나 본원에 기술된 임의의 다른 구체예와 조합될 수 있는 다양한 구체예가 추가로 제공된다. 예를 들어, 한 구체예에서, T 세포는 a) 대상체, b) MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 앓고 있지 않은 공여자, 또는 c) MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애로부터 회복된 공여자로부터 단리된다.
또 다른 양태에서, 항원-특이적 T 세포를 대상체에게 수혈하는 것을 포함하는 대상체에서 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 항원-특이적 T 세포는 a) 본원에 기술된 조성물로 대상체로부터의 면역 세포를 자극하는 단계 및 b) 시험관 내 또는 생체외에서 항원-특이적 T 세포를 확장하단 단계, 선택적으로 i) 면역 세포를 자극하기 전에 대상으로부터 면역 세포를 단리하는 단계에 의해 생성되고 및/또는 ii) 여기서 면역 세포는 PBMC, T 세포, CD8+ T 세포, 나이브 T 세포, 중심 기억 T 세포, 및/또는 이펙터 기억 T 세포를 포함한다.
본 발명에 포함되고/되거나 본원에 기술된 임의의 다른 구체예와 조합될 수 있는 다양한 구체예가 추가로 제공된다. 예를 들어, 한 구체예에서, 작용제는 펩티드 에피토프, 면역원성 펩티드, 안정한 MHC-펩티드 복합체, T 세포 수용체 및/또는 면역 세포 사이에 적어도 하나의 면역 복합체의 형성에 적합한 조건 및 시간 동안 접촉하여 위치된다. 다른 구체예에서, 펩티드 에피토프, 면역원성 펩티드, 안정한 MHC-펩티드 복합체 및/또는 T 세포 수용체는 세포에 의해 발현되고, 세포는 하나 이상의 단계 동안 확장 및/또는 단리된다. 또 다른 구체예에서, MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애는 암 또는 그의 재발이고, 선택적으로 여기서 암은 흑색종, 두경부암, 폐암, 자궁경부암, 전립선암, 다발성 골수종, 간세포 암종, 유방 침윤성 암종 및 방광 요로 상피 암종으로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 대상체는 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애의 동물 모델 및/또는 포유동물이고, 선택적으로 여기서 포유동물은 인간, 영장류 또는 설치류이다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 면역원성 펩티드 서열, 본원에 기술된 면역원성 펩티드 및/또는 본원에 기술된 안정한 MHC-펩티드 복합체를 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 결합 단백질이 제공되며, 선택적으로 여기서 결합 단백질은 항체, 항체의 항원-결합 단편, TCR, TCR의 항원-결합 단편, 단일 사슬 TCR(scTCR), 키메라 항원 수용체(CAR), 또는 TCR과 이펙터 도메인을 포함하는 융합 단백질이다.
본 발명에 포함되고/되거나 본원에 기술된 임의의 다른 구체예와 조합될 수 있는 다양한 구체예가 추가로 제공된다. 예를 들어, 한 구체예에서, 결합 단백질은 a) 표 2에 열거된 TCR 알파 사슬 CDR 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR 알파 사슬 CDR 서열과 적어도 약 80% 동일성을 갖는 T 세포 수용체(TCR) 알파 사슬 CDR 서열; 및/또는 b) 표 2에 열거된 TCR 베타 사슬 CDR 서열로 구성된 군으로부터 선택된 TCR 베타 사슬 CDR 서열과 적어도 약 80% 동일성을 갖는 TCR 베타 사슬 CDR 서열을 포함하며, 여기서 결합 단백질은 MAGEC2 면역원성 펩티드-MHC(pMHC) 복합체에 결합할 수 있으며, 선택적으로 여기서 결합 친화성은 약 5x10-4M 이하의 Kd를 갖는다. 또 다른 구체예에서, 결합 단백질은 a) 표 2에 열거된 TCR 알파 사슬 가변(Vα) 도메인 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR Vα 도메인 서열에 대해 적어도 약 80% 동일성을 갖는 TCR Vα 도메인 서열 및/또는 b) 표 2에 열거된 TCR 베타 사슬 가변(Vβ) 도메인 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR Vβ 도메인 서열에 대해 적어도 약 80% 동일성을 갖는 TCR Vβ 도메인 서열을 포함하며, 여기서 결합 단백질은 MAGEC2 면역원성 펩티드-MHC(pMHC) 복합체에 결합할 수 있고, 선택적으로 결합 친화성이 약 5x10-4 M 이하의 Kd를 갖는다. 여전히 또 다른 구체예에서, 결합 단백질은 a) 표 2에 열거된 TCR 알파 사슬 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR 알파 사슬 서열에 대해 적어도 약 80% 동일성을 갖는 TCR 알파 사슬 서열; 및/또는 b) 표 2에 열거된 TCR 베타 사슬 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR 베타 사슬 서열에 대해 적어도 약 80% 동일성을 갖는 TCR 베타 사슬 서열을 포함하며, 결합 단백질은 MAGEC2 면역원성 펩티드-MHC(pMHC) 복합체에 결합할 수 있고, 선택적으로 결합 친화성이 약 5x10-4 M 이하의 Kd를 갖는다. 또 다른 구체예에서, 결합 단백질은 a) 표 2에 열거된 TCR 알파 사슬 CDR 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR 알파 사슬 CDR 서열; 및/또는 b) 표 2에 열거된 TCR 베타 사슬 CDR 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR 베타 사슬 CDR 서열을 포함하며, 여기서 결합 단백질은 MAGEC2 면역원성 펩티드-MHC(pMHC) 복합체에 결합할 수 있고, 선택적으로 결합 친화성은 약 5x10-4 M 이하의 Kd를 갖는다. 또 다른 구체예에서, 결합 단백질은 a) 표 2에 열거된 TCR 알파 사슬 가변(Vα) 도메인 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR Vα 도메인 서열; 및/또는 b) 표 2에 열거된 TCR 베타 사슬 가변(Vβ) 도메인 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR Vβ 도메인 사슬 서열을 포함하며, 여기서 결합 단백질은 MAGEC2 면역원성 펩티드-MHC(pMHC) 복합체에 결합할 수 있고, 선택적으로 결합 친화성은 약 5x10-4 M 이하의 Kd를 갖는다. 여전히 또 다른 양태에서, 결합 단백질은 a) 표 2에 열거된 TCR 알파 사슬 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR 알파 사슬 서열; 및/또는 b) 표 2에 열거된 TCR 베타 사슬 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR 베타 사슬 서열을 포함하며, 여기서 결합 단백질은 MAGEC2 면역원성 펩티드-MHC(pMHC) 복합체에 결합할 수 있고, 선택적으로 결합 친화성은 약 5x10-4 M 이하의 Kd를 갖는다. 다른 구체예에서, 1) TCR 알파 사슬 CDR, TCR Vα 도메인 및/또는 TCR 알파 사슬은 표 2에 열거된 TRAV, TRAJ 및 TRAC 유전자의 군으로부터 선택되는 TRAV, TRAJ 및/또는 TRAC 유전자 또는 이의 단편에 의해 인코딩되고/거나 2) TCR 베타 사슬 CDR, TCR Vβ 도메인 및/또는 TCR 베타 사슬은 표 2에 열거된 TRBV, TRBJ 및 TRBC 유전자의 군으로부터 선택되는 TRBV, TRBJ 및/또는 TRBC 유전자 또는 이의 단편에 의해 인코딩되고/거나 3) 결합 단백질의 각각의 CDR은 표 2에 열거된 동족 기준 CDR 서열과 비교하여 5개 이하의 아미노산 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 갖는다. 여전히 또 다른 구체예에서, 결합 단백질은 키메라, 인간화 또는 인간 결합 단백질이다. 또 다른 구체예에서, 결합 단백질은 막횡단 도메인 및 세포내에 있는 이펙터 도메인을 갖는 결합 단백질을 포함한다. 또 다른 구체예에서, TCR 알파 사슬 및 TCR 베타 사슬은 공유적으로 연결되고, 임의적으로 TCR 알파 사슬 및 TCR 베타 사슬은 링커 펩티드를 통해 공유적으로 연결된다. 또 다른 구체예에서, TCR 알파 사슬 및/또는 TCR 베타 사슬은 모이어티에 공유적으로 연결되며, 임의적으로 공유적으로 연결된 모이어티는 친화성 태그 또는 표지를 포함한다. 추가의 또 다른 구체예에서, 친화성 태그는 aCD34 농축 태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 칼모듈린 결합 단백질(CBP), 단백질 C 태그, Myc 태그, HaloTag, HA 태그, Flag 태그, His 태그, 비오틴 태그 및 V5 태그로 구성된 군으로부터 선택되고/거나 표지는 형광 단백질이다. 또 다른 구체예에서, 공유적으로 연결된 모이어티는 염증제, 사이토카인, 독소, 세포독성 분자, 방사성 동위원소 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가의 또 다른 구체예에서, 결합 단백질은 세포 표면 상의 pMHC 복합체에 결합한다. 추가의 또 다른 구체예에서, MHC 또는 MHC-펩티드 복합체는 본원에 기술된 바와 같다. 또 다른 구체예에서, MAGEC2 펩티드-MHC(pMHC) 복합체에 대한 결합 단백질의 결합은 면역 반응을 유발하며, 선택적으로 면역 반응은 i) T 세포 반응 및 /또는 CD8+ T 세포 반응이고/이거나, ii) T 세포 확장, 사이토카인 방출 및/또는 세포독성 사멸로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가의 또 다른 구체예에서, 결합 단백질은 약 1x10-4 M 이하, 약 5x10-5 M 이하, 약 1x10-5 M 이하, 약 5x10-6 M 이하, 약 1x10-6 M 이하, 약 5x10-7 M 이하, 약 1x10-7 M 이하, 약 5x10-8 M 이하, 약 1x10-8 M 이하, 약 5x10-9 M 이하, 약 1x10-9 M 이하, 약 5x10-10 M 이하, 약 1x10-10 M 이하, 약 5x10-11 M 이하, 약 1x10-11 M 이하, 약 5x10-12 M, 또는 약 1x10-12 M 이하의 Kd로 MAGEC2 면역원성 펩티드-MHC(pMHC) 복합체에 특이적으로 및/또는 선택적으로 결합할 수 있다. 추가의 또 다른 구체예에서, 결합 단백질은 공지된 T-세포 수용체보다 펩티드-MHC(pMHC)에 대해 더 높은 결합 친화성을 가지고, 선택적으로 더 높은 결합 친화성은 적어도 1.05배 더 높다. 또 다른 구체예에서, 결합 단백질은 MAGEC2의 이형접합성 발현을 갖는 표적 세포와 접촉되는 경우 공지된 T-세포 수용체보다 더 높은 T 세포 확장, 사이토카인 방출 및/또는 세포독성 사멸을 유도하며, 선택적으로 유도는 적어도 1.05배 더 높다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 배수 변화에 대한 언급은 일부 구체예에서, 임의의 관심 기준 양식과의 비교, 예컨대, 상이한 결합 단백질과의 비교; 본원에 기재된 다른 제제와 조합하여 상이한 수준의 상이한 면역 세포에서의 동일한 결합 단백질의 발현과 같이 상이한 맥락 하에 동일한 결합 단백질과의 비교; 등일 수 있다. 추가의 또 다른 구체예에서, 세포독성 사멸은 표적 암세포의 것이다. 추가의 또 다른 구체예에서, 암은 흑색종, 두경부암, 폐암, 자궁경부암, 전립선암, 다발성 골수종, 간세포 암종, 유방 침윤성 암종 및 방광 요로상피 암종으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 결합 단백질은 ALKDVEERV/HLA-A*02, LLFGLALIEV/HLA-A*02, SESIKKKVL/HLA-B*44, 및 ASSTLYLVF/HLA-B*57로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드-MHC(pMHC) 복합체에 결합하지 않는다.
추가의 또 다른 양태에서, 표 2에 열거된 TCR 알파 사슬 및 베타 사슬 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR 알파 사슬 및/또는 베타 사슬이 제공된다.
또 다른 양태에서, i) 엄격한 조건 하에, 표 2에 열거된 폴리펩티드 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 상보체와 혼성화되는 분리된 핵산 분자, ii) 표 2에 열거된 폴리펩티드 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산에 대해 적어도 약 80% 상동성을 갖는 서열, 및/또는 iii) 표 2에 열거된 핵산 인코딩과 적어도 약 80% 상동성을 갖는 ii) 서열이 제공되며, 선택적으로 분리된 핵산 분자는 1) 표 2에 열거된 TRAV, TRAJ 및/또는 TRAC 유전자의 군으로부터 선택되는 TRAV, TRAJ 및 TRAC 유전자 또는 이의 단편 및/또는 2) 표 2에 열거된 TRBV, TRBJ 및 TRBC 유전자의 군으로부터 선택되는 TRBV, TRBJ 및/또는 TRBC 유전자 또는 이의 단편을 포함한다.
본 발명에 의해 포함되는 임의의 양태에 적용되고/거나 본원에 기재된 임의의 다른 구체예와 조합될 수 있는 다수의 구체예가 추가로 제공된다. 예를 들어, 일 구체예에서, 핵산은 숙주 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화된다.
추가의 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 분리된 핵산을 포함하는 벡터가 제공되며, 선택적으로 i) 벡터는 클로닝 벡터, 발현 벡터 또는 바이러스 벡터이고/이거나 ii) 벡터는 표 3에 열거된 벡터 서열을 포함한다.
본 발명에 의해 포함되는 임의의 양태에 적용되고/거나 본원에 기재된 임의의 다른 구체예와 조합될 수 있는 다수의 구체예가 추가로 제공된다. 예를 들어, 일 구체예에서, 벡터는 CD8α 및/또는 CD8β을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, CD8α 또는 CD8β를 인코딩하는 핵산 서열은 태그를 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결된다. 추가의 다른 구체예에서, 태그를 인코딩하는 핵산은 태그가 CD8α 또는 CD8β의 N-말단에 융합되도록 CD8α 또는 CD8β를 인코딩하는 핵산 서열의 5' 업스트림에 있다. 추가의 다른 구체예에서, 태그는 CD34 농축 태그이다. 또 다른 구체예에서, 본원에 기재된 분리된 핵산, 및 CD8α 및/또는 CD8β를 인코딩하는 핵산 서열은 내부 리보솜 진입 부위 또는 자가-절단 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열과 상호연결된다. 추가의 다른 구체예에서, 자가-절단 펩티드는 P2A, E2A, F2A 또는 T2A이다.
추가의 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 분리된 핵산을 포함하고/거나 본원에 기재된 벡터를 포함하고/거나 본원에 기재된 결합 단백질을 발현하는 숙주 세포로서, 임의적으로 세포가 유전자 조작되는, 숙주 세포가 제공된다.
본 발명에 의해 포함되는 임의의 양태에 적용되고/거나 본원에 기재된 임의의 다른 구체예와 조합될 수 있는 다수의 구체예가 추가로 제공된다. 예를 들어, 일 구체예에서, 숙주 세포는 TCR 유전자, HLA 유전자 또는 이 둘 모두의 염색체 유전자 녹아웃을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 숙주 세포는 α1 마크로글로불린 유전자, α2 마크로글로불린 유전자, α3 마크로글로불린 유전자, β1 마이크로글로불린 유전자, β2 마이크로글로불린 유전자 및 이들의 조합으로부터 선택되는 HLA 유전자의 녹아웃을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 숙주 세포는 TCRα 가변 영역 유전자, TCRβ 가변 영역 유전자, TCR 불변 영역 유전자 및 이들의 조합으로부터 선택되는 TCR 유전자의 녹아웃을 포함한다. 추가의 또 다른 구체예에서, 숙주 세포는 CD8α 및/또는 CD8β를 발현하고, 선택적으로 CD8α 및/또는 CD8β는 CD34 농축 태그에 융합된다. 또 다른 구체예에서, 숙주 세포는 CD34 농축 태그를 사용하여 농축된다. 추가의 또 다른 구체예에서, 숙주 세포는 조혈 간세포, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 제대혈 세포 또는 면역 세포이다. 추가의 다른 구체예에서, 면역 세포는 T 세포, 세포독성 림프구, 세포독성 림프구 전구 세포, 세포독성 림프구 간세포, 세포독성 림프구 줄기 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4/CD8 이중 음성 T 세포, 감마 델타(γδ) T 세포, 자연 살해(NK) 세포, NK-T 세포, 수지상 세포 또는 이들의 조합이다. 추가의 다른 구체예에서, T 세포는 나이브 T 세포, 중심 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포 또는 이들의 조합이다. 또 다른 구체예에서, T 세포는 일차 T 세포 또는 T 세포주의 세포이다. 추가의 또 다른 구체예에서, T 세포는 내인성 TCR을 발현하지 않거나 이의 더 낮은 표면 발현을 갖는다. 추가의 다른 구체예에서, 숙주 세포는 MHC 분자의 맥락에서 MAGEC2 펩티드 에피토프를 포함하는 펩티드-MHC(pMHC) 복합체를 포함하는 표적 세포와 접촉되는 경우 사이토카인 또는 세포독성 분자를 생산할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 숙주 세포는 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 표적 세포와 접촉된다. 추가의 또 다른 구체예에서, 사이토카인은 TNF-α, IL-2 및/또는 IFN-γ이다. 추가의 또 다른 구체예에서, 세포독성 분자는 퍼포린 및/또는 그랜자임이며, 임의적으로 세포독성 분자는 그랜자임 B이다. 또 다른 구체예에서, 숙주 세포는 MAGEC2의 이형접합성 발현을 갖는 표적 세포와 접촉되는 경우 더 높은 수준의 사이토카인 또는 세포독성 분자를 생산할 수 있다. 추가의 또 다른 구체예에서, 숙주 세포는 적어도 1.05배 더 높은 수준의 사이토카인 또는 세포독성 분자를 생산할 수 있다. 추가의 또 다른 구체예에서, 숙주 세포는 MHC 분자의 맥락에서 MAGEC2 펩티드 에피토프를 포함하는 펩티드-MHC(pMHC) 복합체를 포함하는 표적 세포를 사멸시킬 수 있다. 또 다른 구체예에서, 사멸은 사멸 검정에 의해 결정된다. 추가의 또 다른 구체예에서, 사멸 검정에서 숙주 세포와 표적 세포의 비는 20:1 내지 1:4이다. 또 다른 구체예에서, 표적 세포는 1 μg/mL 내지 50 pg/mL의 MAGEC2 펩티드로 펄싱된 표적 세포이며, 선택적으로 표적 세포는 MAGEC2 펩티드에 일치하는 MHC에 대한 세포 단일대립유전자이다. 또 다른 구체예에서, 숙주 세포는 MAGEC2의 이형접합성 발현을 갖는 표적 세포와 접촉되는 경우 더 많은 수의 표적 세포를 사멸시킬 수 있으며, 선택적으로 세포 사멸은 적어도 1.05배 더 높다. 또 다른 구체예에서, 표적 세포는 세포주 또는 일차 세포이고, 선택적으로 표적 세포는 HEK293 유래된 세포주, 암 세포주, 원발암 세포, 형질전환된 세포주, 및 불멸의 세포주로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, MAGEC2 면역원성 펩티드는 본원에 기재된 바와 같고/거나 MHC 또는 MHC-펩티드 복합체는 본원에 기재된 바와 같다. 또 다른 구체예에서, 숙주 세포는 ALKDVEERV/HLA-A*02, LLFGLALIEV/HLA-A*02, SESIKKKVL/HLA-B*44 및 ASSTLYLVF/HLA-B*57로 구성된 군으로부터 선택되는 펩티드-MHC(pMHC) 복합체를 포함하는 표적 세포와 접촉할 때 T 세포 확장, 사이토카인 방출 또는 세포독성 사멸을 유도하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 숙주 세포는 MAGEC2 항원을 발현하지 않고, 본원에 기재된 결합 단백질에 의해 인식되지 않고, 혈청형 HLA-B*07이 아니고, HLA-B*07 대립유전자를 발현하지 않고, 혈청형 HLA-A*24가 아니고, 및/또는 HLA-A*24 대립유전자를 발현하지 않는다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 숙주 세포의 집단이 제공된다.
추가의 또 다른 양태에서, a) 본원에 기재된 결합 단백질, b) 본원에 기재된 분리된 핵산, c) 본원에 기재된 벡터, d) 본원에 기재된 숙주 세포 및/또는 e) 본원에 기재된 숙주 세포의 집단, 및 담체를 포함하는 조성물이 제공된다.
추가의 또 다른 양태에서, a) 본원에 기재된 결합 단백질, b) 본원에 기재된 분리된 핵산, c) 본원에 기재된 벡터, d) 본원에 기재된 숙주 세포 및/또는 e) 본원에 기재된 숙주 세포의 집단을 포함하는 장치 또는 키트로서, 상기 장치 또는 키트는 임의적으로 pMHC 복합체에의 a), d) 및/또는 e)의 결합을 검출하기 위한 시약을 포함하는, 장치 또는 키트가 제공된다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 결합 단백질을 생산하는 방법으로서, 방법은 (i) 상기 결합 단백질의 발혈을 허용하기에 적합한 조건 하에 본원에 기재된 결합 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산에 의해 형질전환된 형질전환된 세포를 배양하는 단계; 및 (ii) 발현된 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다.
추가의 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 결합 단백질을 발현하는 숙주 세포를 생산하는 방법으로서, 방법은 (i) 본원에 기재된 결합 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (ii) 상기 결합 단백질의 발현을 허용하기에 적합한 조건 하에 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다.
추가의 또 다른 양태에서, MAGEC2 항원 및/또는 MAGEC2를 발현하는 세포의 존재 또는 부재를 검출하는 방법으로서, 임의적으로 세포가 과증식성 세포이며, 본원에 기재된 적어도 하나의 결합 단백질, 본원에 기재된 적어도 하나의 숙주 세포, 또는 본원에 기재된 숙주 세포의 집단을 사용하여 샘플에서 상기 MAGEC2 항원의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하며, MAGEC2 항원의 검출이 MAGEC2 항원 및/또는 MAGEC2를 발현하는 세포의 존재를 나타내는, 방법이 제공된다.
본 발명에 의해 포함되는 임의의 양태에 적용되고/거나 본원에 기재된 임의의 다른 구체예와 조합될 수 있는 다수의 구체예가 추가로 제공된다. 예를 들어, 일 구체예에서, 적어도 하나의 결합 단백질 또는 적어도 하나의 숙주 세포는 MHC 분자의 맥락에서 MAGEC2 펩티드와 복합체를 형성하고, 복합체는 형광 활성화된 세포 분류(FACS), 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사면역 검정(RIA), 면역화학, 웨스턴 블롯 또는 세포내 유동 검정의 형태로 검출된다. 또 다른 구체예에서, 방법은 대상체로부터 샘플을 수득하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애의 수준을 검출하는 방법으로서, a) 대상체로부터 수득된 샘플을 본원에 기재된 적어도 하나의 결합 단백질, 본원에 기재된 적어도 하나의 숙주 세포 또는 본원에 기재된 숙주 세포의 집단과 접촉시키는 단계; 및 b) 반응성의 수준을 검출하는 단계를 포함하며, 대조군 수준과 비교하여 반응성의 존재 또는 더 높은 수준은 대상체에서 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애의 수준을 나타내는, 방법이 제공된다.
본 발명에 의해 포함되는 임의의 양태에 적용되고/거나 본원에 기재된 임의의 다른 구체예와 조합될 수 있는 다수의 구체예가 추가로 제공된다. 예를 들어, 일 구체예에서, 대조군 수준은 참조 번호이다. 또 다른 구체예에서, 대조군 수준은 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애가 없는 대상체로부터 수준이다.
추가의 또 다른 양태에서, 대상체에서 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애의 진행을 모니터링하기 위한 방법으로서, 방법이 a) 대상체 샘플에서 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플과 본원에 기술된 적어도 하나의 결합 단백질, 본원에 기술된 적어도 하나의 숙주 세포, 또는 본원에 기술된 숙주 세포의 집단 사이의 반응성의 존재 또는 수준을 검출하는 단계; b) 후속 시점에서 단계 a)를 반복하는 단계; c) 단계 a) 및 b)에서 검출된 MAGEC2 또는 MAGEC2를 발현하는 관심 세포의 수준을 비교하여 대상체에서 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애의 진행을 모니터링하는 단계를 포함하며, 단계 a)와 비교하여 단계 b)에서 검출된 MAGEC2 수준 또는 MAGEC2를 발현하는 관심 세포의 부재 또는 감소는 대상체에서 MAGEC2 발현을 특징으로 장애의 진행을 나타내고, 단계 a)와 비교하여 단계 b)에서 검출된 MAGEC2 수준 또는 MAGEC2 발현 관심 세포의 존재 또는 증가는 대상체에서 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애의 진행을 나타내는, 방법이 제공된다.
본 발명에 의해 포함되는 임의의 양태에 적용되고/거나 본원에 기재된 임의의 다른 구체예와 조합될 수 있는 다수의 구체예가 추가로 제공된다. 예를 들어, 일 구체예에서, 대상체는 제1 시점과 후속 시점 사이에 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 치료하기 위한 치료를 받았다.
추가의 또 다른 양태에서, MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 앓고 있는 대상체의 임상 결과를 예측하는 방법으로서, a) 대상체로부터 얻은 샘플과 본원에 기술된 적어도 하나의 결합 단백질, 본원에 기술된 적어도 하나의 숙주 세포, 또는 본원에 기술된 숙주 세포의 집단 사이의 반응성의 존재 또는 수준을 결정하는 단계; 및 b) 반응성의 존재 또는 수준을 대조군으로부터의 것과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 대조군은 양호한 임상 결과를 갖는 대상체로부터 얻어지고; 여기서 대조군과 비교하여 대상체 샘플에서 반응성의 부재 또는 감소된 수준은 대상체가 양호한 임상 결과를 갖는다는 것을 나타내는, 방법이 제공된다.
또 다른 양태에서, MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애의 재발에 대한 요법의 효능을 평가하는 방법으로서, a)
MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애에 대한 요법의 적어도 일부를 대상체에게 제공하기 전에 대상체로부터 수득된 샘플과 본원에 기술된 적어도 하나의 결합 단백질, 본원에 기술된 적어도 하나의 숙주 세포 또는 본원에 기술된 숙주 세포의 집단 사이의 반응성의 존재 또는 수준을 대상체로부터 수득된 제1 샘플에서 결정하는 단계, 및 b) MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애에 대한 요법을 제공한 후 대상체로부터 수득된 샘플과 본원에 기술된 적어도 하나의 결합 단백질, 본원에 기술된 적어도 하나의 숙주 세포 또는 본원에 기술된 숙주 세포의 집단 사이의 반응성의 존재 또는 수준을 대상체로부터 수득된 제2 샘플에서 결정하는 단계를 포함하며, 제1 샘플과 비교하여 제2 샘플에서의 반응성의 부재 또는 감소된 수준은 상기 요법이 대상체에서 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 치료하는데 효과적임을 나타내고, 제1 샘플과 비교하여 제2 샘플에서의 반응성의 존재 또는 증가된 수준은 상기 요법이 대상체에서 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 치료하는데 효과적이 아님을 나타내는, 방법이 제공된다.
본 발명에 의해 포함되는 임의의 양태에 적용되고/거나 본원에 기재된 임의의 다른 구체예와 조합될 수 있는 다수의 구체예가 추가로 제공된다. 예를 들어, 일 구체예에서, 반응성의 수준은 a) 결합의 존재 및/또는 b) T 세포 활성화 및/또는 이펙터 기능에 의해 표시되며, 선택적으로 T 세포 활성화 또는 이펙터 기능은 T 세포 증식, 사멸 또는 사이토카인 방출이다. 또 다른 구체예에서, T 세포 결합, 활성화 및/또는 이펙터 기능은 형광 활성화된 세포 분류(FACS), 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사면역 검정(RIA), 면역화학, 웨스턴 블롯 또는 세포내 유동 검정을 사용하여 검출된다.
추가의 또 다른 양태에서, MAGEC2를 발현하는 표적 세포를 본원에 기재된 적어도 하나의 결합 단백질을 발현하는 세포를 포함하는 조성물의 치료학적 유효량과 접촉시키는 것을 포함하는, MAGEC2 발현을 특징으로 장애를 예방 및/또는 치료하는 방법으로서, 선택적으로, 조성물은 대상체에게 투여되는, 방법이 제공된다.
본 발명에 의해 포함되는 임의의 양태에 적용되고/거나 본원에 기재된 임의의 다른 구체예와 조합될 수 있는 다수의 구체예가 추가로 제공된다. 예를 들어, 일 구체예에서, 세포는 동종이계 세포, 동계 세포 또는 자가 세포이다. 또 다른 구체예에서, 세포는 본원에 기술된 숙주 세포 또는 본원에 기술된 숙주 세포의 집단이다. 또 다른 구체예에서, 표적 세포는 MAGEC2를 발현하는 암세포이다. 또 다른 구체예에서, 세포 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 세포 조성물은 대상체에서 MAGEC2를 발현하는 표적 세포에 대한 면역 반응을 유도한다. 또 다른 구체예에서, 세포 조성물은 대상체에서 MAGEC2를 발현하는 표적 세포에 대한 항원-특이적 T 세포 면역 반응을 유도한다. 또 다른 구체예에서, 항원-특이적 T 세포 면역 반응은 CD4+ 헬퍼 T 림프구(Th) 반응 및 CD8+ 세포독성 T 림프구(CTL) 반응 중 적어도 하나를 포함한다. 다른 구체예에서, 방법은 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애에 대한 적어도 하나의 추가 치료를 투여하는 것을 추가로 포함하며, 선택적으로 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애에 대한 적어도 하나의 추가 치료는 조성물과 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 또 다른 구체예에서, MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애는 암 또는 그의 재발이고, 선택적으로 암은 흑색종, 두경부암, 폐암, 자궁경부암, 전립선암, 다발성 골수종, 간세포 암종, 유방 침윤성 암종 및 방광 요로 상피 암종으로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 대상체는 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애의 동물 모델 및/또는 포유동물이고, 선택적으로 포유동물은 인간, 영장류 또는 설치류이다.
도면의 간단한 설명
도 1a 및 도 1b는 광범위한 패널의 종양 유형 및 정상 조직에서(도 1a), 뿐만 아니라 대표적인 종양 유형의 세트에 걸쳐 종양-연관된 바이오마커 MAGEA4 및 NY-ESO-1과 관련하여(도 1b) MAGEC2의 핵산 유전자 발현을 보여준다.
도 2a - 도 2c는 MAGEC2 항원성 펩티드의 식별을 입증한다. MAGEC2로부터의 중첩하는 펩티드 서열을 HLA-B*07:02에 대한 예측된 결합에 대해 평가하였다. 상위 예측된 MHC 결합 펩티드를 합성하고 HLA-B*07:02 발현 HEK293T 세포를 펄스하는데 사용했다. TCR-형질도입된 T 세포 풀의 반응성은 활성화 마커인 CD137 및 CD69를 사용하여 측정되었다. 도 2a는 그랜자임-활성화된 형광 리포터를 발현하는 HLA-B*07:02 단일대립유전자 HEK293T 세포와 1,670개의 암 고환 항원에 걸쳐 있는 60-량체 펩티드의 중복 라이브러리와 공동-배양된 TCR-형질도입된 T 세포 풀의 결과를 보여준다. 기저 공유 유전자에 해당하는 점으로 강조표시된 동일한 중첩 펩티드 서열 영역을 갖는 배수 농축 >4를 갖는 타일. 도 2b는 스크리닝 데이터에서 식별된 MAGEC2 펩티드의 대표적인 서열을 보여준다. HLA-B*07:02-예측된 결합에 대해 중첩 서열(실선 상자)을 분석하여 서열 RAREFMELL("RAR" 펩티드로 지칭됨, 점선 상자)을 갖는 상위 예측 결합제를 식별했다. 도 2c는 스크리닝 데이터에서 상위 2개의 농축된 유전자에 대해 식별된 HLA-B*07:02 결합 펩티드에 대한 TCR-형질도입된 T 세포 풀의 반응성을 보여준다.
도 3a 및 도 3b는 TCR-형질도입된 T 세포의 풀에서 MAGEC2-반응성 TCR의 식별을 보여준다. 표적 세포를 MAGEC2(RAR)로부터의 펩티드로 펄싱하고 TCR-형질도입된 T 세포의 풀과 공동-배양했다. 반응성 TCR은 분류된 CD137/CD69 이중-양성 세포로부터 외인성 TCR을 서열분석함에 의해 식별되었다. 도 3a는 입력 라이브러리에 걸쳐서 RAR- 및 SPQ-펄싱된 세포에 반응하는 분류된 TCR의 농축 배수에서 차이를 보여준다. 도 3b는 분류된 세포에서 표시된 TCR을 발현하는 세포의 비율을 보여준다(자홍색: TCR 8-3, 보라색: TCR 4-1, 연한 녹청색: TCR 11-2).
도 4a 및 도 4b는 TCR 8-3이 RAR 펩티드-펄싱된 세포를 인식하고 사멸한다는 것을 보여준다. 도 4a는 RAR 펩티드의 연속 희석액으로 펄싱되고 TCR 8-3으로 형질도입된 T 세포와 공동-배양된 야생형 HEK293T 세포의 결과를 보여준다. TCR의 반응성은 IFNγ 방출에 의해 측정되었다. 도 4b는 표시된 농도의 RAR 펩티드로 펄싱되고 TCR 8-3으로 형질도입된 T 세포와 공동-배양된 그랜자임-활성화된 형광 리포터를 발현하는 HLA-B*07:02 단일대립유전자 HEK293T 세포의 결과를 보여준다.
도 5a - 도 5e는 TCR 8-3이 MAGEC2를 발현하는 흑색종 세포를 인식한다는 것을 보여준다. 도 5a는 표시된 흑색종 세포주에서 MAGEC2 단백질 수준을 예시하는 웨스턴 블롯을 보여준다. 도 5b는 GAPDH에 비해 MAGEC2의 단백질 수준의 정량화를 보여준다. 도 5c는 공개적으로 이용가능한 데이터세트(TRON 세포주 포털)로부터 MAGEC2 mRNA 발현 데이터와 MAGEC2 단백질 수준의 일치성을 보여준다. 도 5d는 IFNγ 방출에 의해 측정된 바와 같은 흑색종 세포주에 대한 8-3 TCR의 반응성을 입증한다. 도 5e는 8-3 TCR의 반응성이 MAGEC2 발현에 상응함을 보여준다.
도 6은 TCR 8-3이 MAGEC2-발현 흑색종 세포주를 사멸시킨다는 것을 보여준다. 표시된 세포주를 Incucyte® NucLight™ Red로 형질도입하고 TCR 8-3과 공동-배양하거나(자홍색) MHC-불일치된 대조군 TCR과 공동-배양하거나(파란색), T 세포 없이 배양했다(노란색). 검정의 시작 시 T 세포를 2:1의 E:T 비율로 첨가했다. 빨간색 형광은 Incucyte® 장비를 사용하여 시간 경과에 따라 측정되었고 시점 0으로 정규화된 총 빨간색 객체 계수로 표시되었다.
도 7a - 도 7c는 MAGEC2 항원성 펩티드의 식별을 입증한다. MAGEC2로부터의 중첩하는 펩티드 서열을 HLA-A*24:02에 대한 예측된 결합에 대해 평가하였다. 상위 예측된 MHC 결합 펩티드를 합성하여 HLA-A*24:02 발현 HEK293T 세포를 펄싱하는데 사용했다. TCR-형질도입된 T 세포 풀의 반응성은 활성화-유도된 마커(AIM), CD137 및 CD69(즉, AIM 이중-양성 세포의 백분율; 추가 검정 세부사항은 도 2 참조)를 사용하여 측정되었다. 도 7a는 그랜자임-활성화된 형광 리포터를 발현하는 HLA-A*24:02 단일대립유전자 HEK293T 세포 및 1,670개의 암 고환 항원에 걸쳐 있는 60-량체 펩티드의 중첩하는 라이브러리와 공동-배양된 TCR-형질도입된 T 세포 풀의 결과를 보여준다. 기저 공유 유전자에 해당하는 점으로 강조표시된 동일한 중첩 펩티드 서열 영역을 갖는 배수 농축 >4를 갖는 타일. 도 7b는 스크리닝 데이터에서 식별된 MAGEC2 펩티드의 대표적인 서열을 보여준다. HLA-A*24:02-예측된 결합에 대해 중첩 서열을 분석하여 상위 예측된 결합제 서열을 식별했다. 도 7c는 VGPDHFCVF 서열을 갖는 펩티드("VGP" 펩티드로 지칭됨)를 포함하는 스크리닝 데이터에서 식별된 펩티드에 대해 식별된 HLA-A*24:02 결합 펩티드에 대한 TCR-형질도입된 T 세포 풀의 반응성을 보여준다(또한 표 1B 참조).
도 8a - 도 8c는 TCR-형질도입된 T 세포 풀로부터 MAGEC2-반응성 TCR의 식별을 보여준다. 표적 세포를 MAGEC2(VGP)로부터의 펩티드로 펄싱하고 TCR-형질도입된 T 세포의 풀과 공동-배양했다. 반응성 TCR은 분류된 CD137/CD69 이중-양성 세포로부터 외인성 TCR을 서열분석함에 의해 식별되었다. 도 8a는 입력 라이브러리에 걸쳐서 VGO-펄싱 및 비펄싱된 세포에 반응하는 분류된 TCR의 배수 농축에서 차이를 보여준다. 도 8b는 분류된 세포에서 표시된 TCR을 발현하는 세포의 비율을 보여준다. 도 8c는 활성화-유도된 마커(AIM), CD137 및 CD69(즉, AIM 이중-양성 세포의 백분율, 추가 검정 세부사항은 도 2 참조)를 사용하여 측정된 TCR 4-58-형질도입된 T 세포의 반응성을 보여준다.
도 9a 및 도 9b는 TCR 4-58이 VGP 펩티드-펄싱된 세포를 인식하고 사멸시킨다는 것을 보여준다. 도 9a는 VGP 펩티드의 연속 희석액으로 펄싱되고 TCR 4-58로 형질도입된 T 세포와 공동-배양된 야생형 HEK293T 세포의 결과를 보여준다. TCR의 반응성은 IFP+ 리포터-기반 세포 사멸에 의해 측정되었다. 도 9b는 흑색종 세포주와 같은 TCR 4-58 MAGEC2-발현 세포주의 결과를 보여준다. 표시된 세포주를 Incucyte® NucLight™ Red로 형질도입하고 TCR 4-58과 공동-배양하거나(자홍색) 형질도입되지 않은 대조군 T 세포와 공동-배양하거나(보라색), 또는 T 세포 없이 배양했다(파란색). 검정 시작 시 T 세포를 4:1의 E:T 비율로 첨가했다. 빨간색 형광은 Incucyte® 장비를 사용하여 시간에 걸쳐서 측정되었으며 시점 0으로 정규화된 총 빨간색 객체 계수로 표시되었다.
범례와 관련된 막대 히스토그램, 곡선 또는 다른 데이터를 보여주는 임의의 도면에 있어서, 각 표시에 대해 왼쪽에서 오른쪽으로 제시된 막대, 곡선 또는 다른 데이터는 범례의 위에서 아래로 또는 왼쪽에서 오른쪽으로 박스 순서대로 직접적으로 상응한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 적어도 부분적으로 MAGEC2 면역원성 펩티드(예를 들어, 표 1에 열거된 서열을 포함하거나 이로 구성된 것), MAGEC2 항원을 인식하는 결합 단백질(예를 들어, 표 2에 열거된 서열을 갖는 것) 및 이의 용도의 발견에 기초한다. 관심 있는 T 세포의 초기 풀에서 인식되는 정확한 T 세포 표적을 매핑하기 위해 체계적이고 포괄적인 조사가 수행되었다.
따라서, 본 발명은 부분적으로 치료적으로 관련한 MAGEC2 단백질 및 관련된 조성물(예를 들어, 면역우세 펩티드, 백신 등)의 확인된 에피토프(면역우세 펩티드), 면역원성 펩티드를 단독으로 또는 MHC 분자인, 안정한 MHC- 펩티드 복합체와 함께 포함하는 조성물, MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애에 대한 면역 반응을 진단, 예측 및 모니터링하는 방법, 및 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 부분적으로 확인된 결합 단백질(예를 들어, TCR), 결합 단백질(예를 들어, TCR)을 발현하는 숙주 세포, 결합 단백질(예를 들어, TCR)을 포함하는 조성물 및 결합 단백질(예를 들어, TCR)을 발현하는 숙주 세포, MAGEC2를 발현하는 세포에 대한 T 세포 반응을 진단, 예측 및 모니터링하는 방법, 및 MAGEC2 발현을 특징으로 장애를 예방 및/또는 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.
I. 정의
편의를 위해, 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에 사용된 특정 용어가 여기에 수집된다.
관사 "a" 및 "an"은 본원에서 관사의 문법적 대상의 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 지칭하는 데 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다. 부가하여, 본원에 제공된 표에 대한 참조는 달리 명시하지 않는 한 표의 모든 하위-표를 포함한다.
용어 "투여하는"은 약제 또는 조성물을 대상체에게 제공하는 것을 의미하고, 의료 전문가에 의한 투여 및 자가-투여를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이는 당업자에게 공지된 임의의 다양한 방법 및 전달 시스템을 사용하여 치료제를 포함하는 조성물을 대상체에게 물리적으로 도입하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 결합 단백질에 대한 투여 경로는, 예를 들어, 주사 또는 주입에 의한 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로를 포함한다. 본원에서 사용되는 어구 "비경구 투여"는 일반적으로 주사에 의한 장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 비제한적으로 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 림프내, 병변내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 기관간, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입뿐만 아니라 생체내 전기천공을 포함한다. 대안적으로, 본원에 기재된 결합 단백질은 비-비경구 경로, 예컨대, 국소, 표피 또는 점막 투여 경로, 예를 들어, 비내, 경구, 질, 직장, 설하 또는 국소로 투여될 수 있다. 투여는 또한, 예를 들어, 1회, 복수회, 및/또는 하나 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "항원"은 임의의 천연 또는 합성 면역원성 물질, 예컨대, 단백질, 펩티드 또는 합텐을 지칭한다. 항원은 보호 또는 치료 면역 반응이 요망되는 MAGEC2 항원 또는 이의 단편일 수 있다. "에피토프"는 천연 또는 합성 물질에 의해 결합된 항원의 일부이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "애주번트"는 항원의 투여 전, 이와 함께 또는 후에 투여될 때 항원 단독 투여와 비교하여 항원에 대한 면역 반응의 질 및/또는 강도를 가속화, 연장 및/또는 강화하는 물질을 지칭한다. 애주번트는 백신접종에 의해 유도된 면역 반응의 크기 및 지속기간을 증가시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "항체"는 전체 항체 및 이의 임의의 항원 결합 단편(즉, "항원-결합 부분") 또는 단일 사슬을 포함한다. 일 구체예에서, "항체"는 디설파이드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질, 또는 이의 항원 결합 부분을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 특정 자연 발생 항체에서, 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 특정 자연 발생 항체에서, 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 지칭되는 보다 보존된 영역이 산재된 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역 시스템의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
용어 "항원 제시 세포" 또는 "APC"는 전문 항원 제시 세포(예를 들어, B 림프구, 단핵구, 수지상 세포, 랑게르한스 세포) 뿐만 아니라 다른 항원 제시 세포(예를 들어, 케라티노사이트, 내피 세포, 성상세포, 섬유아세포 및 희소돌기아교세포)를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 결합 단백질, 예컨대, TCR의 "항원-결합 부분"이라는 용어는 항원(예를 들어, MAGEC2 항원)에 (예를 들어, 특이적으로 및/또는 선택적으로) 결합하는 능력을 보유하는 TCR의 하나 이상의 부분을 지칭한다. 이러한 부분은, 예를 들어, 약 8 내지 약 1,500개 아미노산 길이, 적합하게는 약 8 내지 약 745개 아미노산 길이, 적합하게는 약 8 내지 약 300개, 예를 들어, 약 8 내지 약 200개 아미노산, 또는 약 10개 내지 약 50개 또는 100개 아미노산 길이이다. TCR의 항원-결합 기능은 전장 TCR의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. TCR의 용어 "항원-결합 부분" 내에 포함되는 결합 부분의 예는 (i) TCR의 Vα 및 Vβ 도메인으로 구성된 Fv 단편, (ii) 분리된 상보성 결정 영역(CDR) 또는 (iii) 합성 링커에 의해 임의적으로 연결될 수 있는 2개 이상의 분리된 CDR의 조합물을 포함한다. 또한, Vα 및 Vβ는 별도의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여 Vα 및 Vβ 영역이 쌍을 이루어 일가 분자(단일 사슬 TCR(scTCR)로 알려짐)를 형성하는 단일 단백질 사슬로 만들어 질 수 있게 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다. 이러한 단일 사슬 TCR은 또한 TCR의 용어 "항원-결합 부분" 내에 포함되는 것으로 의도된다. 이러한 TCR 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득될 수 있고, 단편은 완전한 결합 단백질과 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다. 항원-결합 부분은 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 온전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다.
용어 "상보성 결정 영역" 및 "CDR"은 "초가변 영역" 또는 "HVR"과 동의어이고, 특정 결합 단백질, 예컨대, TCR 가변 영역 내의 아미노산의 비-인접한 서열을 지칭하는 것으로 당 분야에 공지되어 있고, 이는 항원 특이성 및/또는 결합 친화성을 부여한다. TCR의 경우, 일반적으로, 각 α-사슬 가변 영역(αCDR1, αCDR2, 및 αCDR3)에 3개의 CDR 및 각 β-사슬 가변 영역(βCDR1, βCDR2 및 βCDR3)에 3개의 CDR이 존재한다. CDR3은 가공된 항원을 인식하는 주요 CDR인 것으로 여겨진다. CDR1 및 CDR2는 주로 MHC와 상호작용한다.
용어 "체액"은 신체로부터 배설되거나 분비되는 체액 뿐만 아니라 신체로부터 정상적으로 배설되거나 분비되지 않는 체액을 지칭한다(예를 들어, 양수, 방수, 담즙, 혈액 및 혈장, 뇌척수액, 귀지 및 이구, 카우퍼액 또는 사정전액, 유미, 유미즙, 대변, 여성 사정액, 간질액, 세포내액, 림프, 월경, 모유, 점액, 흉막액, 고름, 타액, 피지, 정액, 혈청, 땀, 활액, 눈물, 소변, 질 윤활, 유리체액, 구토). 일부 구체예에서, 체액은 면역 세포를 포함하고, 임의적으로 면역 세포는 세포독성 T 세포 및/또는 NK 세포, CD4+ T 세포 등과 같은 세포독성 림프구이다.
용어 "코딩 영역"은 아미노산 잔기로 번역되는 코돈을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 영역을 지칭하는 반면, 용어 "비코딩 영역"은 아미노산으로 번역되지 않는 뉴클레오티드 서열의 영역(예를 들어, 5' 및 3' 비번역 영역)을 지칭한다.
용어 "상보적"은 2개의 핵산 가닥의 영역 사이 또는 동일한 핵산 가닥의 2개 영역 사이의 서열 상보성의 광범위한 개념을 지칭한다. 제1 핵산 영역의 아데닌 잔기는 제2 핵산 영역의 잔기와 특정 수소 결합("염기쌍 형성")을 형성할 수 있는데, 이는 잔기가 티민 또는 우라실인 경우 제1 영역과 역평행인 것으로 공지되어 있다. 유사하게는, 제1 핵산 가닥의 시토신 잔기는 제2 핵산 가닥의 잔기와 염기쌍을 형성할 수 있는데, 이는 잔기가 구아닌인 경우 제1 가닥에 역평행인 것으로 알려져 있다. 핵산의 제1 영역은, 2개의 영역이 역평행 방식으로 배열될 때, 제1 영역의 적어도 하나의 뉴클레오티드 잔기가 제2 영역의 잔기와 염기 쌍을 형성할 수 있는 경우 동일하거나 상이한 핵산의 제2 영역에 상보적이다. 일부 구체예에서, 제1 영역은 제1 부분을 포함하고, 제2 영역은 제2 부분을 포함하고, 이에 의해, 제1 및 제2 부분이 역평행 방식으로 배열될 때, 제1 부분의 뉴클레오티드 잔기의 적어도 약 50%, 및 다른 구체예에서, 적어도 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91% , 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상, 또는 이들 사이의 임의의 포괄적 범위, 예를 들어, 적어도 약 80%-100%는 제2 부분의 뉴클레오티드 잔기와 염기쌍을 형성할 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 부분의 모든 뉴클레오티드 잔기는 제2 부분의 뉴클레오티드 잔기와 염기쌍을 형성할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "공동자극"은 활성화된 면역 세포와 관련하여 증식 또는 이펙터 기능을 유도하는 제2의 비-활성화 수용체 매개 신호("공동자극 신호")를 제공하는 공동자극 분자의 능력을 포함한다. 예를 들어, 공동자극 신호는, 예를 들어, T 세포-수용체-매개 신호를 수용한 T 세포에서 사이토카인 분비를 야기할 수 있다. 예를 들어, 활성화 수용체를 통해 세포-수용체 매개 신호를 받은 면역 세포는 본원에서 "활성화된 면역 세포"로 지칭된다.
"CD3"은 6개 사슬의 다중-단백질 복합체로서 당 분야에 공지되어 있다(문헌 [Abbas and Lichtman, Cellular and Molecular Immunology (9th Edition) (2018); Janeway 등 (Immunobiology) (9th Edition) (2016)] 참조). 포유동물에서, 복합체는 CD3γ 사슬, CD3δ 사슬, 2개의 CD3ε 사슬 및 CD3ζ 사슬의 동종이량체를 포함한다. CD3γ, CD3δ 및 CD3ε 사슬은 단일 면역글로불린 도메인을 함유하는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 관련 세포 표면 단백질이다. CD3γ, CD3δ 및 CD3ε 사슬의 막횡단 영역은 음으로 하전되며, 이는 이러한 사슬이 T 세포 수용체 사슬의 양으로 하전된 영역 또는 잔기와 회합할 수 있게 하는 것으로 여겨지는 특성이다. CD3γ, CD3δ 및 CD3ε 사슬의 세포내 꼬리는 각각 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 IT AM으로 공지된 단일 보존 모티프를 함유하는 반면, 각각의 CD3ζ 사슬은 3개의 ITAM을 갖는다. 이론에 국한시키려는 것은 아니지만, IT AM은 TCR 복합체의 신호전달 능력에 중요한 것으로 여겨진다. 본 발명에 따라 사용되는 CD3은 인간, 마우스, 래트 또는 다른 포유동물을 포함하는 다양한 동물 종으로부터 유래될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "TCR 복합체의 성분"은 TCR 사슬(즉, TCRα, TCRβ, TCRγ 또는 TCRδ), CD3 사슬(즉, CD3γ, CD3δ, CD3ε 또는 CD3ζ), 또는 2개 이상의 TCR 사슬 또는 CD3 사슬에 의해 형성된 복합체(예를 들어, TCRα와 TCRβ의 복합체, TCRγ과 TCRδ의 복합체, CD3ε과 CD3δ의 복합체, CD3γ와 CD3ε의 복합체, 또는 TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ 및 2개의 CD3ε 사슬의 서브-TCR 복합체)를 지칭한다.
용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 자연적으로 발생하지 않거나 숙주 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 방식으로 함께 연결된 2개 이상의 아미노산 서열을 함유하도록 조작된 융합 단백질을 지칭하며, 이 융합 단백질은 세포의 표면에 존재하는 경우 수용체로서 기능할 수 있다. 본 발명에 의해 포함되는 CAR은 막횡단 도메인 및 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인(예컨대, 임의적으로 공동-자극 도메인(들)을 함유하는 이펙터 도메인)에 연결된 항원-결합 도메인(즉, 면역글로불린 또는 면역글로불린-유사 분자, 예컨대, MAGEC2 항원에 특이적인 TCR, 단일 사슬 TCR-유래된 결합 단백질, 항체로부터 유래된 scFv, NK 세포로부터의 킬러 면역수용체로부터 유래되거나 수득된 항원 결합 도메인 등으로부터 수득되거나 유래됨)을 포함하는 세포외 부분을 포함한다(예를 들어, 문헌[Sadelain 등 (2013) Cancer Discov. 3:388; 또한 [Harris and Kranz (2016) Trends Pharmacol. Sci. 37: 220; Stone 등 (2014) Cancer Immunol. Immunother. 63:1163] 참조).
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "세포독성 T 림프구(CTL) 반응"은 세포독성 T 세포에 의해 유도된 면역 반응을 지칭한다. CTL 반응은 주로 CD8+ T 세포에 의해 매개된다.
용어 "필수적으로 구성되는"은 "포함하는"과 동등하지 않고 청구범위의 특정 물질 또는 단계를 지칭하거나 청구된 주제의 기본 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들을 지칭한다. 예를 들어, 단백질 도메인, 영역 또는 모듈(예를 들어, 결합 도메인, 힌지 영역, 링커 모듈) 또는 단백질(이는 하나 이상의 도메인, 영역 또는 모듈을 가질 수 있음)은 도메인, 영역, 모듈 또는 단백질의 아미노산 서열이 조합하여, 도메인, 영역, 모듈 또는 단백질의 길이의 최대 20%(예를 들어, 최대 15%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%)에 기여하거나 도메인(들), 영역(들), 모듈(들) 또는 단백질의 활성(예를 들어, 결합 단백질의 표적 결합 친화성)에 실질적으로 영향을 미치지 않는(즉, 활성을 50% 초과만큼 감소시키지 않음, 예를 들어, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1% 이하) 연장, 결실, 변이 또는 이들의 조합(예를 들어, 아미노- 또는 카르복시-말단 또는 도메인 사이의 아미노산)을 포함하는 경우 특정 아미노산 서열을 필수적 요소로 하여 구성된다.
용어 "대상체에 적합한 치료 요법을 결정하는 것"은 발명에 따른 분석의 결과를 기반으로 하거나 필수적으로 기반으로 하거나 적어도 부분적으로 기반으로 시작, 수정 및/또는 종료되는 대상체에 대한 치료 요법(즉, 대상체에서 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료를 위해 사용되는 단일 요법 또는 다양한 요법의 조합)의 결정을 의미하는 것으로 간주된다. 한 가지 예는 재발 위험을 감소시키는 것이 목적인 수술 후 애주번트 요법을 시작하는 것이고, 다른 예는 특정 화학요법의 투여량을 변경하는 것일 것이다. 결정은, 본 발명에 따른 분석의 결과에 더하여, 치료될 대상체의 개인적 특성에 기초할 수 있다. 대부분의 경우, 대상체에 적합한 치료 요법의 실제 결정은 주치의 또는 의사에 의해 수행될 것이다.
본원에서 사용되는 "조혈 간세포"는 조혈 줄기 세포 또는 태아 조직으로부터 유래될 수 있고, 성숙한 세포 유형(예를 들어, 면역계 세포)으로 추가 분화될 수 있는 세포이다. 예시적인 조혈 간세포는 CD24Lo Lin-CD117+ 표현형을 갖는 것들 또는 흉선에서 발견되는 것들(흉선 간세포로 지칭됨)을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "상동성"은 동일한 핵산 가닥의 2개의 영역 사이 또는 2개의 상이한 핵산 가닥의 영역 사이의 뉴클레오티드 서열 유사성을 지칭한다. 두 영역 모두의 뉴클레오티드 잔기 위치가 동일한 뉴클레오티드 잔기에 의해 점유될 때, 영역은 그 위치에서 상동성이다. 각 영역의 적어도 하나의 뉴클레오티드 잔기 위치가 동일한 잔기에 의해 점유되는 경우, 제1 영역은 제2 영역에 대해 상동성이다. 2개의 영역 사이의 상동성은 동일한 뉴클레오티드 잔기가 차지하는 2개의 영역의 뉴클레오티드 잔기 위치의 비율로 표현된다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열 5'-ATTGCC-3'를 갖는 영역 및 뉴클레오티드 서열 5'-TATGGC-3'를 갖는 영역은 50% 상동성을 공유한다. 일부 구체예에서, 제1 영역은 제1 부분을 포함하고, 제2 영역은 제2 부분을 포함하고, 이에 의해, 각 부분의 뉴클레오티드 잔기 위치의 적어도 약 50%, 및 다른 구체예에서, 적어도 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상, 또는 이들 사이의 임의의 포괄적 범위, 예를 들어, 적어도 약 80%-100%는 동일한 뉴클레오티드 잔기에 의해 점유된다. 일부 구체예에서, 각 부분의 모든 뉴클레오티드 잔기 위치는 동일한 뉴클레오티드 잔기에 의해 점유된다.
용어 "면역 반응"은 T 세포 매개 및/또는 B 세포 매개 면역 반응을 포함한다. 예시적인 면역 반응은 T 세포 반응, 예를 들어, 사이토카인 생산 및 세포 세포독성을 포함한다. 또한, 용어 면역 반응은 T 세포 활성화, 예를 들어, 항체 생산(체액 반응) 및 사이토카인 반응성 세포, 예를 들어, 대식세포의 활성화에 의해 간접적으로 영향을 받는 면역 반응을 포함한다.
면역 반응 또는 면역 시스템을 자극하는 증가된 능력은 T 세포 공동자극 수용체의 향상된 효능제 활성 및/또는 억제 수용체의 향상된 길항제 활성으로부터 야기될 수 있다. 면역 반응 또는 면역 시스템을 자극하는 증가된 능력은 면역 반응을 측정하는 검정, 예를 들어, 사이토카인 또는 케모카인 방출, 세포용해 활성(표적 세포에 대해 직접적으로 또는 CD107a 또는 그랜자임 검출을 통해 간접적으로 결정됨) 및 증식의 변화를 측정하는 검정에서 EC50 또는 최대 활성 수준의 배수 증가에 의해 반영될 수 있다. 면역 반응 또는 면역 시스템 활성을 자극하는 능력은 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 500% 이상 향상될 수 있다.
용어 "면역치료제"는 대상체에서 바이러스 감염에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 숙주 면역 시스템을 자극할 수 있는 임의의 분자, 펩티드, 항체 또는 다른 제제를 포함할 수 있다. 다양한 면역치료제가 본원에 기재된 조성물 및 방법에 유용하다.
용어 "면역 세포"는 골수의 조혈 줄기 세포로부터 기원하는 면역 시스템의 임의의 세포를 지칭하며, 이는 2개의 주요 계통을 발생시킨다: 골수 전구 세포(이는 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 거핵구 및 과립구와 같은 골수 세포를 발생시킴); 및 림프성 간세포(이는 림프계 세포, 예컨대, T 세포, B 세포 및 자연 살해(NK) 세포를 발생시킴). 예시적인 면역 시스템 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4 CD8 이중 음성 T 세포, gd T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 세포 및 수지상 세포를 포함한다. 대식세포 및 수지상 세포는 "항원 제시 세포" 또는 "APC"로 지칭될 수 있으며, 이는 펩티드와 복합체화된 APC의 표면 상의 주요 조직적합성 복합체(MHC) 수용체가 T 세포 표면 상의 TCR과 상호작용하는 경우 T 세포를 활성화시킬 수 있는 특정화된 세포이다.
"분리된 단백질"은 세포로부터 분리되거나 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 때 다른 단백질, 세포 물질, 분리 배지, 및 배양 배지, 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 단백질을 지칭한다. "분리된" 또는 "정제된" 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분은 결합 단백질, 항체, 폴리펩티드, 펩티드 또는 융합 단백질이 유래된 세포 또는 조직 공급원으로부터의 세포 물질 또는 다른 오염성 단백질을 실질적으로 함유하지 않거나, 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물질로부터 실질적으로 함유하지 않는다. "세포 물질을 실질적으로 함유하지 않는"이라는 용어는 단백질이 분리되거나 재조합적으로 생산되는 세포의 세포 성분으로부터 분리된 바이오마커 폴리펩티드 또는 이의 단편의 제조물을 포함한다. 일 구체예에서, 언어 "세포 물질이 실질적으로 없는"은 약 30% 미만(건조 중량으로)의 비-바이오마커 단백질(본원에서 "오염성 단백질"로도 지칭됨) 또는 일부 구체예에서, 약 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% 미만, 또는 이들 사이의 임의의 포괄적 범위, 예컨대, 약 1% 내지 5% 미만의, 비-바이오마커 단백질을 갖는 바이오마커 단백질 또는 이의 단편의 제조물을 포함한다. 결합 단백질, 항체, 폴리펩티드, 펩티드 또는 융합 단백질 또는 이의 단편, 예를 들어, 이의 생물학적 활성 단편이 재조합적으로 생산될 경우, 이는 배양 배지가 실질적으로 없을 수 있으며, 즉, 배양 배지는 단백질 제조물의 약 20%, 15%, 10%, 5%, 1% 미만, 또는 이들 사이의 임의의 포괄적 범위, 예를 들어, 약 1% 내지 5% 미만의 부피 미만을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "아이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 항체 부류(예를 들어, IgM, IgG1, IgG2C 등)를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "KD"는 특정 결합 단백질-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭하는 것으로 의도된다. 본 발명에 포함되는 결합 단백질의 결합 친화성은 표준 결합 단백질-표적 결합 검정, 예를 들어, 경쟁 검정, 포화 검정 또는 표준 면역검정, 예컨대, ELISA 또는 RIA에 의해 측정되거나 결정될 수 있다. 상대적으로 더 낮은 Kd 값은 상대적으로 더 높은 결합 친화성을 나타낸다(예를 들어, 약 5x10-4 M(500 uM) 이하의 Kd 값은 1x10-4 M(100 uM)의 Kd 값을 포함하고, 100 uM Kd는 500 uM Kd와 비교하여 비교적 더 높은 결합 친화성을 나타낸다).
"키트"는 본 발명에 포함되는 마커의 발현을 검출하고/거나 이에 영향을 미치기 위한 적어도 하나의 시약, 예를 들어, 프로브 또는 소분자를 포함하는 임의의 제조물(예를 들어, 패키지 또는 용기)이다. 키트는 본 발명에 포함되는 방법을 수행하기 위한 단위로서 홍보, 배포 또는 판매될 수 있다. 키트는 본 발명에 포함되는 방법에 유용한 조성물을 발현시키는데 필요한 하나 이상의 시약을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 키트는 참조 표준, 예를 들어, 세포 성장, 분열, 이동, 생존 또는 아폽토시스를 제어하는 신호전달 경로에 영향을 미치지 않거나 조절하지 않는 단백질을 인코딩하는 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 당업자는 공통의 분자 태그(예를 들어, 녹색 형광 단백질 및 베타-갈락토시다제), GeneOntology 참조에 의한 세포 성장, 분열, 이동, 생존 또는 아폽토시스를 포함하는 임의의 경로로 분류되지 않은 단백질, 또는 유비쿼터스 하우스키핑 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않는 많은 이러한 대조군 단백질을 구상할 수 있다. 키트의 시약은 개별 용기에 제공되거나 단일 용기에 2개 이상의 시약의 혼합물로 제공될 수 있다. 또한, 키트 내의 조성물의 사용을 설명하는 설명서 자료가 포함될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "연결된"은 2개 이상의 분자의 회합을 지칭한다. 연결은 공유 또는 비공유일 수 있다. 연결은 또한 유전적일 수 있다(즉, 재조합적으로 융합됨). 이러한 연결은 화학적 컨쥬게이션 및 재조합 단백질 생산과 같은 다양한 당 분야에서 인정된 기술을 사용하여 달성될 수 있다.
일부 구체예에서, "링커"는 2개의 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 도메인, 영역 또는 모티프를 연결하는 아미노산 서열을 지칭할 수 있고, 2개의 하위-결합 도메인의 상호작용과 양립 가능한 스페이서 기능을 제공하여 생성된 폴리펩티드는 표적 분자에 대한 특이적 결합 친화성을 유지하거나(예를 들어, scTCR) 신호전달 활성을 유지한다(예를 들어, TCR 복합체). 일부 구체예에서, 링커는 예를 들어, 약 2 내지 약 35개의 아미노산, 또는 약 4 내지 약 20개의 아미노산 또는 약 8 내지 약 15개의 아미노산 또는 약 15 내지 약 25개의 아미노산으로 구성된다.
용어 "MAGEC2"는 암/고환 항원 10(CT10), 간세포 암 항원 587(HCA587) 및 흑색종 항원, 계열 E, 1, 암/고환 특이적(MAGEE1)로도 알려진 인간 염색체 Xq26-q27에 클러스터된 흑색종 항원 유전자 계열의 특정 구성원을 지칭한다(Gure 등 (2000) Int. J. Cancer 85:726-732; Li 등 (2003) Lab Invest. 83:1185-1192; Ma 등 (2004) Int. J. Cancer 109:698-702; Godelaine 등 (2007) Cancer Immunol. Immunother. 56:753-759; Reiner 등 (2009) Int. J. Cancer 124:352-357; Doyle 등 (2010) Mol. Cell 39:93-974; von Boehmer 등 (2011) PLoS One 6, e21366; Wen 등 (2011) Cancer Sci. 102:1455-1461; de Carvalho 등 (2013) Cancer Immunol. Immunother. 62:191-195; Bhatia 등 (2013) J. Invest. Dermatol. 133:759-767); Yang 등 (2014) Breast Cancer Res. Treat. 145:23-32; and Kunert 등 (2016) J. Immunol. 197:2541-2552). MAGEC2는 E3:기질 복합체에서 Ubl-접합 효소(E2)를 모집 및/또는 안정화함에 의한 것과 같이, RING-유형 징크 핑거-함유 E3 유비퀴틴-단백질 리가제의 유비퀴틴 리가제 활성을 향상시키는 것으로 여겨진다. MAGEC2는 TRIM28의 시험관내 유비퀴틴 리가제 활성을 향상시키고 Ubl-결합 효소 UBE2H의 존재에서 p53/TP53 유비퀴틴화를 자극하여 p53/TP53 분해를 유도한다. MAGEC2는 고환을 제외한 정상 조직에서는 발현되지 않으며, 흑색종, 두경부암, 폐암, 자궁경부암, 전립선암, 다발성 골수종, 간세포 암종, 유방 침윤성 암종, 방광 요로상피 암종과 같은 다양한 조직학적 유형의 종양에서 발현된다.
용어 "MAGEC2"는 이의 단편, 변이체(예를 들어, 대립유전자 변이체) 및 유도체를 포함하도록 의도된다. 대표적인 인간 MAGEC2 cDNA 및 인간 MAGEC2 단백질 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며 국립 생명공학 정보 센터(NCBI)에서 공개적으로 이용가능하다(예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/gene/51438 참조). 예를 들어 인간 MAGEC2(NP_057333.1)는 전사체(NM_016249.4)에 의해 인코딩가능하다. 인간 이외의 유기체에서 MAGEC2 오솔로그의 핵산 및 폴리펩티드 서열은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 침팬지 MAGEC2(NM_001302428.1, NP_001289357.1, XM_016942653.1, 및 XP_016798142.1) 및 붉은털 원숭이 MAGEC2(NM_001265825.1, NP_001252754.1, XM_028841693.1 및 XP_028697526.1)를 포함한다. MAGEC2 서열의 대표적인 서열도 아래 표 3에 제시되어 있다.
MAGEC2 단백질을 검출하는데 적합한 항-MAGEC2 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 항체 TA315476 및 TA342769(OriGene, Rockville, MD); 항체 orb353181 및 orb 125944(Biorbyt, Cambridge, United Kingdom); 항체 A05335 및 AO5335-1(Boster Bio, Pleasanton, CA); 및 항체 ABIN2788251 및 ABIN2706502(Antibodies-online, Limerick, PA)를 포함한다. 부가하여, MAGEC2 발현을 검출하는 시약도 잘 알려져 있다. 더욱이, MAGEC2 발현을 조절하기 위한 다중 siRNA, shRNA, CRISPR 작제물은 오픈 리딩 프레임(ORF) 클론 SC07208 및 RN211555(OriGene, Rockville, MD) 및 CRISPR 녹아웃 GA109805 및 KN403064(OriGene, Rockville, MD)와 같은 다양한 회사의 상용 제품 목록에서 찾을 수 있다. 용어는 MAGEC2 분자에 관해 본원에 기술된 특징의 임의의 조합을 지칭하기 위해 추가로 사용될 수 있다는 점에 유의해야 한다. 예를 들어, 서열 조성, 식별 백분율, 서열 길이, 도메인 구조, 기능적 활성 등의 임의의 조합을 사용하여 본 발명에 포함되는 MAGEC2 분자를 기술할 수 있다.
용어 "MAGEC2 항원" 또는 "MAGEC2 펩티드 항원" 또는 "MAGEC2-함유 펩티드 항원" 또는 "MAGEC2 에피토프" 또는 "MAGEC2 펩티드 에피토프" 또는 "MAGEC2 펩티드"는 MAGEC2의 천연 또는 합성으로 생성된 면역원성 부분을 지칭한다. 일부 구체예에서, MAGEC2 항원 단백질의 길이는 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 아미노산 또는 그 사이의 임의의 범위일 수 있고, 예컨대 8-15개 아미노산을 포함한다. 일부 구체예에서, MAGEC2 항원 단백질은 MHC(예를 들어, HLA) 분자와 복합체를 형성하여 MAGEC2 펩티드:MHC(예를 들어, HLA) 복합체를 인식하는 본 개시내용의 결합 단백질이 그러한 복합체에 (예를 들어, 특이적으로 및/또는 선택적으로) 결합할 수 있다. 대표적인 MAGEC2 펩티드 항원 서열은 표 1에 나타나 있다.
용어 "주요 조직적합성 복합체"(MHC)는 펩티드 항원을 세포 표면에 전달하는 당단백질을 지칭한다. MHC 클래스 I 분자는 사슬(3개의 a 도메인을 가짐)에 걸친 막 및 비공유적으로 회합된 b2 마이크로글로불린을 갖는 헤테로다이머이다. MHC 클래스 II 분자는 2개의 막횡단 당단백질 a 및 b로 구성되며, 둘 모두는 막에 걸쳐 있다. 각 사슬은 2개의 도메인을 갖는다. MHC 클래스 I 분자는 시토졸에서 기원하는 펩티드를 세포 표면으로 전달하며, 여기서 펩티드 항원-MHC(pMHC) 복합체는 CD8+ T 세포에 의해 인식된다. MHC 클래스 II 분자는 소포 시스템에서 기원하는 펩티드를 세포 표면으로 전달하며, 여기서 이들은 CD4+ T 세포에 의해 인식된다. 인간 MHC는 인간 백혈구 항원(HLA)으로 지칭된다.
용어 "예방하다", "예방하는", "예방", "예방적 치료" 등은 질환, 장애 또는 병태를 갖고 있지 않거나, 질병, 장애 또는 병태가 발병할 위험이 있거나 발병하기 쉬운 대상체에서 질병, 장애 또는 병태가 발병할 가능성을 감소시키는 것을 지칭한다.
용어 "예후"는 바이러스 감염의 가능한 경과 및 결과 또는 질병으로부터의 회복 가능성의 예측을 포함한다. 일부 구체예에서, 통계적 알고리즘의 사용은 개체에서 바이러스 감염의 예후를 제공한다. 예를 들어, 예후는 수술, 바이러스 감염의 임상 서브타입의 발달, 하나 이상의 임상 인자의 발달 또는 질병으로부터의 회복일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 아미노산 서열 사이의 "백분율 동일성"은 "백분율 상동성"과 동의어이며, 이는 문헌[Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modified by Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 언급된 알고리즘은 문헌 [Altschul 등 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 포함된다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 NBLAST 프로그램, 점수 = 100, 단어 길이 = 12로 수행되어 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 수득한다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 단어 길이 = 3으로 수행되어 참조 폴리펩티드에 상동성인 아미노산 서열을 수득한다. 비교 목적을 위한 갭 정렬을 얻기 위해, Gapped BLAST가 문헌 [Altschul 등 (1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402]에 기재된 바와 같이 사용된다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각각의 프로그램의 디폴트 파라미터(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)가 사용될 수 있다.
어구 "약학적으로 허용되는 담체"는 대상 화합물을 하나의 기관 또는 신체의 일부로부터 또 다른 기관 또는 신체의 일부로 운반 또는 수송하는데 관여하는 약학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클, 예를 들어, 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제 또는 용매 캡슐화 물질을 의미한다.
용어 "비율"은 두 숫자(예를 들어, 점수, 합계 등) 사이의 관계를 지칭한다. 비율은 특정 순서(예를 들어, a 대 b 또는 a:b)로 표현될 수 있지만, 당업자는 비율을 기반으로한 추세의 관찰과 상관관계는 역전될 수 있지만, 숫자 사이의 기저 관계가 기저 비율의 의미를 잃지 않고 임의의 순서로 표현될 수 있음을 인식할 것이다.
용어 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")는 세포에 자연적으로 존재하지 않는 핵산을 포함하는 세포, 예컨대, 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭한다. 본 발명에 따른 세포는 특정 대상 세포를 지칭할 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손을 포함하는 것으로 의도된다. 특정 변형이 돌연변이 또는 환경 영향으로 인해 후속 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본 발명에 따른 용어 세포의 범위 내에 포함된다.
용어 "암 반응", "면역요법에 대한 반응" 또는 "T-세포 매개 세포독성/면역요법 조합 요법의 조절제에 대한 반응"은 T-세포 매개된 세포독성의 조절제와 같은 암 제제, 및 면역요법에 대한 과증식성 장애(예를 들어, 암)의 임의의 반응, 바람직하게는 신애주번트 또는 애주번트 요법의 개시 후 종양 질량 및/또는 부피의 변화에 관한 것이다. 용어 "신애주번트 요법"은 일차 치료 전에 제공된 치료를 지칭한다. 신애주번트 요법의 예는 화학요법, 방사선 요법 및 호르몬 요법을 포함할 수 있다. 과증식성 장애 반응은, 예를 들어, 효능에 대해 또는 신애주번트 또는 애주번트 상황에서 평가될 수 있으며, 여기서 전신 개입 후 종양의 크기는 CT, PET, 유방조영상, 초음파 또는 촉진(palpation)에 의해 측정시 초기 크기 및 치수와 비교될 수 있다. 반응은 또한 생검 또는 외과적 절제 후 종양의 캘리퍼 측정 또는 병리학적 검사에 의해 평가될 수 있다. 반응은 종양 부피의 백분율 변화와 같은 정량적 방식으로 또는 "병리학적 완전 반응"(pCR), "임상 완전 관해"(cCR), "임상 부분 관해"(cPR), "임상 안정 질환"(cSD), "임상 진행성 질환"(cPD) 또는 다른 정성적 기준과 같은 정성적 방식으로 기록될 수 있다. 과증식성 장애 반응의 평가는 신애주번트 또는 애주번트 요법의 개시 후 조기에, 예를 들어, 수 시간, 수일, 수주 후 또는 바람직하게는 수개월 후에 수행될 수 있다. 반응 평가에 대한 전형적인 종점은 신애주번트 화학요법의 종료시 또는 잔류 종양 세포 및/또는 종양 베드의 외과적 제거시이다. 이는 전형적으로 신애주번트 요법의 개시 후 3개월이다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 치료적 치료의 임상 효능은 임상 이익률(CBR)을 측정함으로써 결정될 수 있다. 임상 이익률은 요법 종료로부터 적어도 6개월 시점에 완전 관해에 있는 환자의 백분율(CR), 부분 관해에 있는 환자의 수(PR) 및 안정한 질환을 갖는 환자의 수(SD)의 합을 결정함으로써 측정된다. 이 공식의 속기는 6개월에 걸친 CBR=CR+PR+SD이다. 일부 구체예에서, 특정 암 치료 요법에 대한 CBR은 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 그 초과이다. 암 요법에 대한 반응을 평가하기 위한 추가 기준은 "생존"과 관련되며, 이는 하기 모두를 포함한다: 전체 생존으로도 알려진 사망까지의 생존(상기 사망은 원인 또는 종양과 무관할 수 있음); "무재발 생존"(여기서, 용어 재발은 국소 재발 및 원격 재발 둘 모두를 포함할 것임); 무전이 생존; 무질병 생존(여기서, 질병이라는 용어는 암 및 이와 관련된 질병을 포함할 것임). 상기 생존 기간은 정의된 시작점(예를 들어, 진단 시점 또는 치료 시작) 및 종료점(예를 들어, 사망, 재발 또는 전이)을 참조하여 계산될 수 있다. 또한, 치료 효능에 대한 기준은 화학요법에 대한 반응, 생존 확률, 주어진 기간 내의 전이 확률, 및 종양 재발 확률을 포함하도록 확장될 수 있다. 예를 들어, 적절한 역치 값을 결정하기 위해, 특정 암 치료 요법이 대상체의 집단에 투여될 수 있고, 결과는 임의의 암 요법의 투여 전에 결정된 바이오마커 측정치와 상관관계가 있을 수 있다. 결과 측정은 신애주번트 환경에서 제공된 요법에 대한 병리학적 반응일 수 있다. 대안적으로, 전체 생존 및 무질병 생존과 같은 결과 측정은 바이오마커 측정 값이 공지된 암 요법 후 대상체에 대해 일정 기간에 걸쳐 모니터링될 수 있다. 특정 구체예에서, 투여되는 용량은 암 치료제에 대해 당 분야에 공지된 표준 용량이다. 대상체가 모니터링되는 기간은 다양할 수 있다. 예를 들어, 대상체는 적어도 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60개월 동안 모니터링될 수 있다. 암 요법의 결과와 상관관계가 있는 바이오마커 측정 임계값은 실시예 섹션에 기재된 것과 같은 당 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
나타낸된 바와 같이, 이 용어는 또한 예를 들어, 재발의 증거가 없는 제1 사건 또는 사망으로서 제2 원발성 암에 대한 제1 재발 검열까지의 기간인 재발에 대한 증가된 시간, 또는 치료로부터 어떠한 원인으로 인한 사망까지의 기간이 증가된 생존 기간에 의해 반영되는 바와 같은 개선된 예후를 지칭할 수 있다. 반응하거나 반응을 갖는다는 것은 자극에 노출될 때 달성되는 유익한 종말점이 있음을 의미한다. 대안적으로, 음성 또는 유해한 증상은 자극에 노출시 최소화, 완화 또는 약화된다. 종양 또는 대상체가 유리한 반응을 나타낼 가능성을 평가하는 것은 종양 또는 대상체가 유리한 반응을 나타내지 않을 (즉, 반응의 결여를 나타내거나 무반응일) 가능성을 평가하는 것과 동등하다는 것이 이해될 것이다.
용어 "내성"은 암 샘플 또는 포유동물의 암 요법에 대한 후천적 또는 자연적 내성(즉, 치료적 치료에 대해 무반응성이거나 감소된 또는 제한된 반응을 가짐), 예컨대, 치료적 치료에 대해 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 또는 그 초과, 예컨대, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배, 15-배, 20-배 또는 그 초과, 또는 이들 사이의 임의의 포괄적 범위만큼 감소된 반응을 가짐을 지칭한다. 반응의 감소는 내성이 획득되기 전에 동일한 암 샘플 또는 포유동물과 비교함으로써, 또는 치료학적 치료에 대해 내성이 없는 것으로 공지된 상이한 암 샘플 또는 포유동물과 비교함으로써 측정될 수 있다. 화학요법에 대한 전형적인 후천적 내성을 "다중약물 내성"이라고한다. 다중약물 내성은 P-당단백질에 의해 매개될 수 있거나, 다른 기전에 의해 매개될 수 있거나, 포유동물이 다중-약물-내성 미생물 또는 미생물의 조합으로 감염될 때 발생할 수 있다. 치료적 치료에 대한 내성의 결정은 당 분야에서 통상적으로 숙련된 임상의의 기술내에 관례적이며, 예를 들어, "감작"으로서 본원에 기재된 바와 같은 세포 증식 검정 및 세포 사멸 검정에 의해 측정될 수 있다. 일부 구체예에서, 용어 "내성을 역전시킨다"는 일차 암 요법(예를 들어, 화학요법 또는 방사선 요법) 단독이 비처리된 종양의 종양 부피와 비교하여 종양 부피의 통계학적 유의한 감소를 생성할 수 없는 상황에서 일차 암 요법(예를 들어, 화학요법 또는 방사선 요법)과 함께 제2 제제의 사용이 비처리된 종양의 종양 부피와 비교하여 통계학적 유의한 수준(예를 들어, p<0.05)으로 종양 부피의 유의한 감소를 유도할 수 있음을 의미한다. 이는 일반적으로 치료되지 않은 종양이 대수적으로 성장할 때 이루어진 종양 부피 측정에 적용된다.
적어도 하나의 바이오마커의 부재, 존재 또는 수준을 검출하거나 결정하는데 사용되는 용어 "샘플"은 전형적으로 뇌 조직, 뇌척수액, 전혈, 혈장, 혈청, 타액, 소변, 대변(예를 들어, 대변), 눈물 및 임의의 다른 체액(예를 들어, "체액"의 정의 하에 상기 기재된 바와 같음), 또는 조직 샘플(예를 들어, 생검), 예컨대, 피부, 결장 샘플 또는 외과적 절제 조직이다. 일부 구체예에서, 본 발명에 포함되는 방법은 샘플 중 적어도 하나의 마커의 부재, 존재 또는 수준을 검출하거나 결정하기 전에 개체로부터 샘플을 수득하는 것을 추가로 포함한다.
용어 "감작시키다"는 암 요법(예를 들어, 항-면역 체크포인트, 화학요법 및/또는 방사선 요법)으로 관련된 암의 보다 효과적인 치료를 가능하게 하는 방식으로 암 세포 또는 종양 세포를 변경하는 것을 의미한다. 일부 구체예에서, 정상 세포는 정상 세포가 요법에 의해 과도하게 손상되게 하는 정도로 영향을 받지 않는다. 치료적 치료에 대한 증가된 감수성 또는 감소된 감수성은 세포 증식 검정(Tanigawa 등 (1982) Cancer Res. 42:2159-2164) 및 세포 사멸 검정(Weisenthal 등 (1984) Cancer Res. 94:161-173; Weisenthal 등 (1985) Cancer Treat Rep. 69:615-632; Weisenthal 등, In: Kaspers G J L, Pieters R, Twentyman P R, Weisenthal L M, Veerman A J P, eds. Drug Resistance in Leukemia and Lymphoma. Langhorne, P A: Harwood Academic Publishers, 1993:415-432; Weisenthal (1994) Contrib. Gynecol. Obstet. 19:82-90)을 포함하나 이에 제한되지 않는 하기 본원에 기술된 특정 치료 및 방법에 대해 당 분야에 공지된 방법에 따라 측정된다. 감수성 또는 내성은 또한 일정 기간, 예를 들어, 인간의 경우 6개월 및 마우스의 경우 4-6주에 걸쳐 종양 크기 감소를 측정함으로써 동물에서 측정될 수 있다. 조성물 또는 방법은 치료 감수성의 증가 또는 내성의 감소가 이러한 조성물 또는 방법의 부재하의 치료 감수성 또는 내성과 비교하여 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 또는 그 초과, 예를 들어, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배, 15-배, 20-배 이상, 또는 이들 사이의 임의의 포괄적 범위인 경우 치료적 치료에 대한 반응을 감작시킨다. 치료적 치료에 대한 감수성 또는 내성의 결정은 당 분야에서 통상적으로 숙련된 임상의의 기술 범위 내에 있다. 암 요법의 효능을 향상시키기 위한 본원에 기재된 임의의 방법은 과증식성 또는 그렇지 않으면 암성 세포(예를 들어, 내성 세포)를 암 요법에 감작시키기 위한 방법에 동일하게 적용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "소분자"는 당 분야의 용어이며, 약 1000 분자량 미만 또는 약 500 분자량 미만의 분자를 포함한다. 일 구체예에서, 소분자는 펩티드 결합을 배타적으로 포함하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 소분자는 올리고머가 아니다. 활성에 대해 스크리닝될 수 있는 예시적인 소분자 화합물은 펩티드, 펩티드모방체, 핵산, 탄수화물, 소 유기 분자(예를 들어, 폴리케타이드)(Cane 등 (1998) Science 282:63-68) 및 천연 생성물 추출물 라이브러리를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또 다른 구체예에서, 화합물은 작은 유기 비펩티드 화합물이다. 추가 구체예에서, 소분자는 생합성이 아니다.
용어 "특이적 결합"은 소정의 항원에 결합하는 결합 단백질을 지칭한다. 전형적으로, 결합 단백질은 관심 항원을 분석물로 사용하고 결합 단백질을 리간드로 사용하여 BIAcore™ 검정 장비의 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술과 같은 결합 검정에 의해 결정될 경우 약 5x10-4 M 이하, 약 1x10-4 M 이하, 약 5x10-5 M 이하, 약 1x10-5 M 이하, 약 5x10-6 M 이하, 약 1x10-6 M 이하, 약 5x10-7 M 이하, 약 1x10-7 M 이하, 약 5x10-8 M 이하, 약 1x10-8 M 이하, 약 5x10-9 M 이하, 약 1x10-9 M 이하, 약 5x10-10 M 이하, 약 1x10-10 M 이하, 약 5x10-11 M 이하, 약 1x10-11 M 이하, 약 5x10-12 M 이하, 약 1x10-12 M 이하, 또는 심지어 그 미만, 또는 이들 사이의 임의의 포괄적 범위, 예를 들어, 약 1-50 마이크로몰, 1-100 마이크로몰, 0.1-500 마이크로몰 등의 친화성(KD)으로 결합한다. 일부 구체예에서, 결합 단백질은 소정의 항원 또는 밀접하게 관련된 항원 이외의 비-특이적 항원(예를 들어, BSA, 카세인)의 결합에 대한 이의 친화성보다 적어도 1.1-, 1.2-, 1.3-, 1.4-, 1.5-, 1.6-, 1.7-, 1.8-, 1.9-, 2.0-, 2.5-, 3.0-, 3.5-, 4.0-, 4.5-, 5.0-, 6.0-, 7.0-, 8.0-, 9.0- 또는 10.0-배 이상의 친화도로 소정의 항원에 결합한다. 어구 "항원을 인식하는 결합 단백질" 및 "항원에 특이적인 결합 단백질"은 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 결합 단백질"과 상호교환적으로 사용된다. 선택적 결합은 관련 패밀리 구성원 또는 항원 표적에 비해 특정 패밀리 구성원 또는 항원 표적과 같은 다른 항원에 비해 한 항원의 결합을 구별하는 결합 단백질의 능력을 지칭하는 상대적인 용어이다. 예를 들어, 실시예 섹션에 제공된 분석 데이터는 본원에 기재된 결합 단백질이 MAGEC2 면역원성 에피토프에 특이적으로 결합하고/거나 다수의 관련 에피토프(예를 들어, MAGEC2 면역원성 에피토프 및 밀접하게 관련된 서열)에 선택적으로 결합하여 이러한 표적을 인간 게놈에서 이용 가능한 대다수의 다른 가능한 에피토프로부터 구별함을 입증한다.
용어 "대상체"는 임의의 건강한 동물, 포유동물 또는 인간, 또는 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 앓고 있는 임의의 동물, 포유동물 또는 인간을 지칭한다. 용어 "대상체"는 "환자"와 상호교환가능하다.
용어 "생존"은 하기 모두를 포함한다: 전체 생존으로도 알려진 사망까지의 생존(상기 사망은 원인 또는 종양과 무관할 수 있음); "무재발 생존"(여기서, 용어 재발은 국소 재발 및 원격 재발 둘 모두를 포함할 것임); 무전이 생존; 무질병 생존(여기서, 질병이라는 용어는 암 및 이와 관련된 질병을 포함할 것임). 상기 생존 기간은 정의된 시작점(예를 들어, 진단 시점 또는 치료 시작) 및 종료점(예를 들어, 사망, 재발 또는 전이)을 참조하여 계산될 수 있다. 또한, 치료 효능에 대한 기준은 화학요법에 대한 반응, 생존 확률, 주어진 기간 내의 전이 확률, 및 종양 재발 확률을 포함하도록 확장될 수 있다.
용어 "상승작용적 효과"는 암 제제/요법 단독의 개별 효과의 합보다 더 큰 2개 이상의 제제(예를 들어, 본원에 기재된 MAGEC2-관련 제제 및 MAGEC2 발현과 연관된 장애를 치료하기 위한 또 다른 요법)의 조합된 효과를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "T 세포-매개된 반응"은 이펙터 T 세포(예를 들어, CD8+ 세포) 및 헬퍼 T 세포(예를 들어, CD4+ 세포)를 포함하는 T 세포에 의해 매개되는 반응을 지칭한다. T 세포 매개된 반응은, 예를 들어, T 세포 세포독성 및 증식을 포함한다.
"전사된 폴리뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드 전사체"는 바이오마커 핵산의 전사 및 존재하는 경우, RNA 전사체의 정상적인 전사-후 프로세싱(예를 들어, 스플라이싱), 및 RNA 전사체의 역전사에 의해 제조된 성숙한 mRNA의 전부 또는 일부에 상보적이거나 상동성인 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA, hnRNA, cDNA, 또는 이러한 RNA 또는 cDNA의 유사체)이다.
"T 세포"는 흉선에서 성숙하고 T 세포 수용체(TCR)를 생산하는 면역계 세포이다. T 세포는 나이브(항원에 노출되지 않음; TCM과 비교하여 CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD127 및 CD45RA의 발현 증가, 및 CD45RO의 발현 감소), 기억 T 세포(TM)(항원-경험 및 긴 수명), 및 이펙터 세포(항원-경험, 세포독성)일 수 있다. TM은 중심 기억 T 세포(TCM, 나이브 T 세포와 비교하여 CD62L, CCR7, CD28, CD127, CD45RO 및 CD95의 발현 증가, 및 CD54RA의 발현 감소) 및 이펙터 기억 T 세포(TEM , 나이브 T 세포 또는 TCM과 비교하여 CD62L, CCR7, CD28, CD45RA의 발현 감소, 및 CD127의 발현 증가)의 서브세트로 추가로 분할될 수 있다. 이펙터 T 세포(TE)는 CD62L, CCR7, CD28의 발현이 감소하고, TCM과 비교하여 그랜자임 및 퍼포린에 대해 양성인 항원-경험된 CD8+ 세포독성 T 림프구를 지칭한다. 다른 예시적인 T 세포는 조절 T 세포, 예를 들어, CD4+ CD25+(Foxp3+) 조절 T 세포 및 Treg17 세포, 뿐만 아니라 Trl, Th3, CD8+CD28, 및 Qa-1 제한된 T 세포를 포함한다.
Tconv 또는 Teffs로도 공지된 통상적인 T 세포는 하나 이상의 T 세포 수용체의 발현으로 인해 면역 반응을 증가시키는 이펙터 기능(예를 들어, 사이토카인 분비, 세포독성 활성, 항-자가-인지 등)을 갖는다. Tcons 또는 Teff는 일반적으로 Treg가 아니며, 예를 들어, 나이브 T 세포, 활성화된 T 세포, 기억 T 세포, 휴지기 Tcons, 또는 예를 들어, Th1 또는 Th2 계통으로 분화된 Tcons를 포함하는 임의의 T 세포 집단으로 정의된다. 일부 구체예에서, Teff는 비-Treg T 세포의 서브세트이다. 일부 구체예에서, Teff는 CD4+ Teff 또는 CD8+ Teff, 예를 들어, CD4+ 헬퍼 T 림프구(예를 들어, Th0, Th1, Tfh, 또는 Th17) 및 CD8+ 세포독성 T 림프구이다. 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 세포독성 T 세포는 CD8+ T 림프구이다. "나이브 Tcon"은 골수에서 분화되었고, 흉선에서 양성 및 음성 중심 선택 과정을 성공적으로 거쳤지만, 항원에 대한 노출에 의해 아직 활성화되지 않은 CD4+ T 세포이다. 나이브 Tcon은 일반적으로 L-셀렉틴(CD62L)의 표면 발현, CD25, CD44 또는 CD69와 같은 활성화 마커의 부재, 및 CD45RO와 같은 기억 마커의 부재를 특징으로한다. 따라서, 나이브 Tcon은 정지하고 비분할되어 항상성 생존을 위해 인터루킨-7(IL-7) 및 인터루킨-15(IL-15)를 필요로 하는 것으로 여겨진다(적어도 WO 2010/101870호 참조). 이러한 세포의 존재 및 활성은 면역 반응을 억제하는 맥락에서 바람직하지 않다. Treg와 달리, Tcons는 비활동성이 아니며, 항원-기반 T 세포 수용체 활성화에 반응하여 증식할 수 있다(Lechler 등 (2001) Philos. Trans. R. Soc. Lond. Biol. Sci. 356:625-637).
"T 이펙터"("Teff" 또는 "TE") 세포는 세포용해 활성을 갖는 T 세포(예를 들어, CD4+ 및 CD8+ T 세포) 뿐만 아니라 사이토카인을 분비하고 다른 면역 세포를 활성화 및 지시하는 T 헬퍼(Th) 세포를 지칭하나, 조절 T 세포(Treg 세포)는 포함하지 않는다.
"T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 MHC 수용체에 결합된 항원 펩티드에 (예를 들어, 예를 들어, 특이적으로 및/또는 선택적으로) 결합할 수 있는 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원(가변 결합 도메인, 불변 도메인, 막횡단 영역, 및 짧은 세포질 꼬리를 가짐; 예를 들어, 문헌[Janeway 등 (1997) Curr. Biol Publ. 4:33] 참조)을 지칭한다. TCR은 세포의 표면에서 또는 가용성 형태로 발견될 수 있고, 일반적으로 알파 및 베타 사슬(각각 TCRα 및 TCRβ로도 공지됨), 또는 γ 및 δ 사슬(각각 TCRγ 및 TCRδ로도 공지됨)을 갖는 헤테로다이머로 구성된다. 면역글로불린(예를 들어, 항체)과 마찬가지로, TCR 사슬(예를 들어, α-사슬 및 β-사슬)의 세포외 부분은 2개의 면역글로불린 도메인을 함유한다: N-말단에서 가변 도메인(예를 들어, α-사슬 가변 도메인 또는 Vα 및 β-사슬 가변 도메인 또는 Vβ; 일반적으로 Kabat 넘버링에 기반한 아미노산 1 내지 116(Kabat 등 (1991) "서열s of Proteins of lmmunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 5th ed.) 및 세포 막에 인접하고 C-말단의 하나의 불변 도메인(예를 들어, α-사슬 불변 도메인 또는 Cα, 전형적으로 Kabat 기반의 아미노산 117 내지 259, β-사슬 불변 도메인 또는 Cβ, 전형적으로 Kabat 기반의 아미노산 117 내지 295). 또한 면역글로불린과 마찬가지로, 가변 도메인은 프레임워크 영역("FR")에 의해 분리된 상보성 결정 영역("CDR", 초가변 영역 또는 "HVR"이라고도 함)을 함유한다(예를 들어, 문헌[Fores 등 (1990) Proc. Natl. Acad Sci. US.A. 87:9138; Chothia 등 (1988) EMBO J. 7:3745; Lefranc 등 (2003) Dev. Comp. Immunol. 27:55] 참조). 일부 구체예에서, TCR은 T 세포(또는 T 림프구)의 표면에서 발견되고 CD3 복합체와 회합한다. 본 발명에 포함되는 TCR의 공급원은 다양한 동물 종, 예컨대, 인간, 마우스, 래트, 토끼 또는 다른 포유동물로부터 유래될 수 있다.
용어 "T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 완전한 TCR 뿐만 아니라 이의 항원-결합 부분 또는 항원-결합 단편을 포함하는 것으로 이해되어야한다. 일부 구체예에서, TCR은 αβ 형태 또는 γδ 형태의 TCR을 포함하는 온전한 또는 전장 TCR이다. 일부 구체예에서, TCR은 전장 TCR보다 작지만 MHC 분자에 결합된 특정 펩티드에 결합하는, 예를 들어, MHC-펩티드 복합체에 결합하는 항원-결합 부분이다. 일부 경우에, TCR의 항원-결합 부분 또는 단편은 전장 또는 온전한 TCR의 구조적 도메인의 일부만을 함유할 수 있지만, 전장 TCR이 결합하는 MHC-펩티드 복합체와 같은 펩티드 에피토프에 여전히 결합할 수 있다. 일부 경우에, 항원-결합 부분은 특정 MHC-펩티드 복합체에 결합하기 위한 결합 부위를 형성하기에 충분한 TCR의 가변 도메인, 예를 들어, TCR의 가변 α 사슬 및 가변 β 사슬을 함유한다. 일반적으로, TCR의 가변 사슬은 펩티드, MHC 및/또는 MHC-펩티드 복합체의 인식과 관련된 상보성 결정 영역(CDR)을 함유한다.
국제 면역유전학 정보 시스템(International Immunogenetics Information System, IMGT)에 의해 확립된 명명법(또한 Scaviner and Lefranc (2000) Exp. Clin. Immunogenet. 17:83-96 and 97-106; Folch and Lefranc (2000) Exp. Clin. Immunogenet, 17: 107-114; T Cell Receptor Factsbook", (2001) LeFranc and LeFranc, Academic Press, ISBN 0-12-441352-8 참조). IMGT는 TCR을 기술하는데 사용되는 고유한 서열을 제공하고, 본원에 기재된 서열은 본원에 제공된 이러한 고유한 서열을 참조하여 확인될 수 있다. TCR 서열은 imgt.org의 IMGT 데이터베이스에서 공개적으로 이용 가능하다.
상기 기재된 바와 같이, 나이브 알파/베타 헤테로다이머 TCR은 알파 사슬 및 베타 사슬을 갖는다. 광범위하게, 각각의 사슬은 가변, 연결 및 불변 영역을 포함하고, 베타 사슬은 또한 일반적으로 가변 및 연결 영역 사이에 짧은 다양성 영역을 포함하지만, 이러한 다양성 영역은 종종 연결 영역의 일부로 간주된다. 각각의 가변 영역은 프레임워크 서열에 내장된 3개의 초가변 CDR(상보성 결정 영역)을 포함한다. CDR3은 항원 인식의 주요 매개체로 잘 알려져 있다. 프레임워크, CDR1 및 CDR2 서열에 의해 및 부분적으로 정의된 CDR3 서열에 의해 구별되는 여러 유형의 알파 사슬 가변(Vα) 영역 및 여러 유형의 베타 사슬 가변(Vβ) 영역이 존재한다. Vα 유형은 IMGT 명명법에서 고유한 TRAV 번호로 지칭된다. 예를 들어, "TRAV4"는 고유한 프레임워크 및 CDR1 및 CDR2 서열, 및 TCR에서 TCR로 보존되지만 TCR에서 TCR로 변화되는 아미노산 서열을 또한 포함하는 아미노산 서열에 의해 부분적으로 정의되는 CDR3 서열을 갖는 TCR Vα 영역을 정의한다. 유사하게, "TRBV2"는 고유한 프레임워크 및 CDR1 및 CDR2 서열을 갖지만 부분적으로 정의된 CDR3 서열만을 갖는 TCR Vβ 영역을 정의한다. 알파 및 베타 유전자좌 내에 각각 54개의 알파 가변 유전자(이 중 44개는 기능적임), 및 67개 베타 가변 유전자(이 중 42개는 기능적임)가 존재하는 것으로 알려져 있다.
TCR의 연결 영역은 고유한 IMGT TRAJ 및 TRBJ 명명법에 의해 유사하게 정의되고, 불변 영역은 IMGT TRAC 및 TRBC 명명법에 의해 정의된다. 베타 사슬 다양성 영역은 IMGT 명명법에서 약어 TRBD로 지칭되며, 언급된 바와 같이, 연결된 TRBD/TRBJ 영역은 종종 연결 영역으로서 함께 고려된다.
TCR 알파 및 베타 사슬을 인코딩하는 유전자 풀은 상이한 염색체 상에 위치하고, T 세포 발달 동안 재배열에 의해 함께 모인 별도의 V, (D), J 및 C 유전자 세그먼트를 함유한다. 이는 54개의 TCR 알파 가변 유전자와 61개의 알파 J 유전자 사이 또는 67개의 베타 가변 유전자, 2개의 베타 D 유전자 및 13개의 베타 J 유전자 사이에서 발생하는 많은 수의 잠재적인 재조합 이벤트로 인해 T 세포 알파 및 베타 사슬의 배우 높은 다양성으로 이어진다. 재조합 과정은 정확하지 않으며 CDR3 영역 내에 추가 다양성을 도입한다. 각각의 알파 및 베타 가변 유전자는 또한 IMGT 명명법에서 각각 TRAVxx*01 및 *02, 또는 TRBVx-x*01 및 *02로 지정된 대립유전자 변이체를 포함할 수 있어, 변이의 양을 추가로 증가시킬 수 있다. 동일한 방식으로, 일부 TRBJ 서열은 2개의 공지된 변이를 갖는다. ("*" 수식어의 부재는 관련 서열에 대해 단지 하나의 대립유전자만이 알려져 있음을 의미함을 유의한다). 재조합 및 흉선 선택으로부터 생성된 인간 TCR의 자연 레퍼토리는 CDR3 다양성으로부터 결정된 대략 106개의 고유한 베타 사슬 서열을 포함하는 것으로 추정되었고(Arstila 등 (1999) Science 286:958-961), 훨씬 더 높을 수 있다(Robins 등 (2009) Blood 114:4099-4107). 각각의 베타 사슬은 적어도 25개의 상이한 알파 사슬과 쌍을 이루는 것으로 추정되어, 추가 다양성을 생성한다(Arstila 등 (1999) Science 286:958-961).
따라서, 용어 "TCR 알파 가변 도메인"은 TRAV 및 TRAJ 영역; TRAV 영역 단독; 또는 TRAV 및 부분 TRAJ 영역의 연결을 지칭하고, 및 용어 TCR 알파 불변 도메인은 세포외 TRAC 영역 또는 C-말단 절두된 또는 전장 TRAC 서열을 지칭한다. 마찬가지로, 용어 "TCR 베타 가변 도메인"은 TRBV 및 TRBD/TRBJ 영역; TRBV 및 TRBD 영역 단독; TRBV 및 TRBJ 영역 단독; 또는 TRBV 및 부분적 TRBD 및/또는 TRBJ 영역에이 연결을 지칭하고, 용어 TCR 베타 불변 도메인은 세포외 TRBC 영역, 또는 C-말단 절두된 또는 전장 TRBC 서열을 지칭한다. 이러한 TCR 알파 가변 도메인 및 TCR 베타 가변 도메인 명명법은 감마/델타 TCR에 대해 각각 TCR 감마 및 TCR 델타 사슬의 가변 도메인에 유사하게 적용된다. 당업자는, 예컨대, 공개적으로 이용 가능한 IMGT 데이터베이스를 통해 TRAV, TRAJ, TRAC, TRBV, TRBJ 및 TRBC 유전자 서열을 수득할 수 있다.
용어 "TCR 복합체"는 CD3과 TCR의 회합에 의해 형성된 복합체를 지칭한다. 예를 들어, TCR 복합체는 CD3γ 사슬, CD3δ 사슬, 2개의 CD3ε 사슬, CD3ζ 사슬의 동종이량체, TCRα 사슬 및 TCRβ 사슬로 구성될 수 있다. 대안적으로, TCR 복합체는 CD3γ 사슬, CD3δ 사슬, 2개의 CD3ε 사슬, CD3ζ 사슬의 동종이량체, TCRγ 사슬, 및 TCRδ 사슬로 구성될 수 있다.
용어 "치료 효과"는 약리학적 활성 물질에 의해 유발되는 동물, 특히 포유동물, 및 보다 특히 인간에서의 국소 또는 전신 효과를 지칭한다. 따라서, 용어는 질병의 진단, 치유, 완화, 치료 또는 예방 또는 동물 또는 인간의 바람직한 신체적 또는 정신적 발달 및 상태의 향상에 사용하기 위한 임의의 물질을 의미한다.
용어 "치료학적 유효량" 및 "유효량"은 동물에서 세포의 적어도 하위-집단에서 임의의 치료에 적용 가능한 합리적인 이익/위험 비율로 일부 요망되는 효과, 예컨대, 요망되는 국소 또는 전신 치료 효과를 생성하는 물질의 양을 의미한다. 일부 구체예에서, 물질의 치료학적 유효량은 물질의 치료 지수, 용해도, 약동학, 반감기 등에 의존할 것이다. 대상 화합물의 독성 및 치료 효능은, 예를 들어, LD50 및 ED50을 결정하기 위해 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 일부 구체예에서, 큰 치료 지수를 나타내는 조성물이 사용된다. 일부 구체예에서, LD50(치사 투여량)은 측정될 수 있고, 예를 들어, 제제가 투여되지 않은 것과 비교하여 제제에 대해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 또는 그 초과로 감소될 수 있다. 유사하게, ED50(즉, 증상의 최대 억제의 반을 달성하는 농도)은 측정될 수 있고, 예를 들어, 제제가 투여되지 않은 것과 비교하여 제제에 대해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 또는 그 초과로 증가될 수 있다. 또한, 유사하게, IC50은 측정될 수 있고, 예를 들어, 제제가 투여되지 않은 것과 비교하여 제제에 대해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 또는 그 초과로 증가될 수 있다. 일부 구체예에서, 검정에서 T 세포 면역 반응은 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 심지어 100%만큼 증가될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 바이러스 로드에서 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 심지어 100% 감소가 달성될 수 있다.
용어 "치료하다"는 관심 병태(예를 들어, 질병 또는 장애)의 치료적 관리 또는 개선을 지칭한다. 치료는 제제 또는 조성물(예를 들어, 약학적 조성물)을 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 치료는 전형적으로 대상체에게 유리한 방식으로 질병(이 용어는 치료를 보증하거나 잠재적으로 보증하는 임의의 질병, 장애, 증후군 또는 바람직하지 않은 병태를 나타내기 위해 사용됨)의 경과를 변경하기 위한 노력으로 수행된다. 치료 효과는 질병 또는 질병의 하나 이상의 증상 또는 징후를 역전, 완화, 중증도 감소, 발병 지연, 치유, 진행 억제 및/또는 발생 또는 재발의 가능성 감소를 포함할 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질병의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 질병의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 예방, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 치료제는 질병을 갖거나 일반 집단의 구성원에 비해 질병이 발병할 위험이 증가된 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 치료제는 질병을 앓았지만 더 이상 질병의 증거를 나타내지 않는 대상체에게 투여될 수 있다. 제제는, 예를 들어, 명백한 질병의 재발 가능성을 감소시키기 위해 투여될 수 있다. 치료제는 예방적으로, 즉, 질병의 임의의 증상 또는 징후의 발달 전에 투여될 수 있다. "예방적 치료"는, 예를 들어, 질병이 발생할 가능성을 감소시키거나 발생한 질병의 중증도를 감소시키기 위해 질병이 발병하지 않았거나 질병의 증거를 나타내지 않는 대상체에게 의학적 및/또는 외과적 관리를 제공하는 것을 지칭한다. 대상체는 질병이 발병할 위험이 있는 것으로(예를 들어, 일반 집단에 비해 증가된 위험) 또는 질병이 발병할 가능성을 증가시키는 위험 인자를 갖는 것으로 확인될 수 있다.
용어 "무반응성"은 요법에 대한 암 세포의 난치성 또는 자극, 예를 들어, 활성화 수용체 또는 사이토카인을 통한 자극에 대한 치료 세포, 예컨대 번역 세포의 난치성을 포함한다. 무반응은, 예를 들어, 면역억제제에 대한 노출 또는 고용량의 항원에 대한 노출로 인해 발생할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "비활동성" 또는 "내성"은 수용체-매개된 자극 활성화에 대한 난치성을 포함한다. 이러한 난치성은 일반적으로 항원-특이적이며, 관용 항원에 대한 노출이 중단된 후에도 지속된다. 예를 들어, T 세포에서의 비활동성(무반응과 대조적으로)는 사이토카인 생산, 예를 들어, IL-2의 결여를 특징으로 한다. T 세포 비활동성은 T 세포가 항원에 노출되고 제2 신호(공동자극 신호)의 부재 하에 제1 신호(T 세포 수용체 또는 CD-3 매개된 신호)를 수신할 때 발생한다. 이러한 조건 하에, 동일한 항원에 대한 세포의 재노출(재노출이 공동자극 폴리펩티드의 존재하에서 발생하더라도)은 사이토카인 생산 실패 및 이에 따른 증식 실패를 초래한다. 그러나, 비활동성 T 세포는 사이토카인(예를 들어, IL-2)과 함께 배양되는 경우 증식할 수 있다. 예를 들어, T 세포 비활동성은 또한 ELISA에 의해 또는 지표 세포주를 사용한 증식 검정에 의해 측정된 바와 같이 T 림프구에 의한 IL-2 생산의 부족에 의해 관찰될 수 있다. 대안적으로, 리포터 유전자 작제물이 사용될 수 있다. 예를 들어, 비활동성 T 세포는 5' IL-2 유전자 인핸서의 제어 하에 이종성 프로모터에 의해 또는 인핸서 내에서 발견될 수 있는 AP1 서열의 다량체에 의해 유도된 IL-2 유전자 전사를 개시하지 못한다(Kang 등 (1992) Science 257:1134).
용어 "백신"은 관심 항원에 대한 면역 반응을 이끌어 내는 약학적 조성물을 지칭한다. 백신은 또한 대상체에게 보호 면역을 부여할 수도 있다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 면역글로불린 슈퍼패밀리 결합 단백질(예를 들어, TCR)의 항원에 대한 결합에 관여하는 면역글로불린 슈퍼패밀리 결합 단백질(예를 들어, TCRα-사슬 또는 β-사슬(또는 γδ TCR의 경우 γ 사슬 및 δ 사슬)의 도메인을 지칭한다. 천연 TCR의 α-사슬 및 β-사슬의 가변 도메인(각각 Vα 및 Vβ)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 CDR을 포함한다. Vα 도메인은 2개의 개별 DNA 세그먼트, 가변 유전자 세그먼트 및 연결 유전자 세그먼트(V-J)에 의해 인코딩되고; Vβ 도메인은 3개의 개별 DNA 세그먼트, 가변 유전자 세그먼트, 다양성 유전자 세그먼트, 및 연결 유전자 세그먼트(V-D-J)에 의해 인코딩된다. 단일 Vα 또는 Vβ 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 TCR은 각각 상보적인 Vα 또는 Vβ 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 TCR로부터 Vα 또는 Vβ 도메인을 사용하여 분리될 수 있다.
용어 "벡터"는 이것이 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 일부 구체예에서, 벡터는 에피솜, 즉, 염색체외 복제가 가능한 핵산이다. 일부 구체예에서, 벡터는 이들이 연결된 핵산의 자율 복제 및/또는 발현이 가능한 것들이다. 벡터가 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 일반적으로 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"의 형태이며, 이는 벡터 형태에서 염색체에 결합되지 않는다. 본원에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 벡터의 가장 일반적으로 사용되는 형태이기 때문에 상호교환적으로 사용된다. 그러나, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 발명은 동등한 기능을 제공하고 이후 당 분야에 공지되는 이러한 다른 형태의 발현 벡터를 포함하는 것으로 의도된다.
유전자 코드(하기 도시됨)에 의해 정의된 바와 같이, 특정 단백질의 아미노산 서열과 단백질을 코딩할 수 있는 뉴클레오티드 서열 사이에는 공지되고 명확한 상응성이 존재한다. 마찬가지로, 유전자 코드에 의해 정의된 바와 같이, 특정 핵산의 뉴클레오티드 서열과 해당 핵산에 의해 인코딩되는 아미노산 서열 사이에는 공지되고 명확한 상응성이 존재한다.
유전자 코드
알라닌 (Ala, A) GCA, GCC, GCG, GCT
아르기닌 (Arg, R) AGA, ACG, CGA, CGC, CGG, CGT
아스파라긴 (Asn, N) AAC, AAT
아스파르트산 (Asp, D) GAC, GAT
시스테인 (Cys, C) TGC, TGT
글루탐산 (Glu, E) GAA, GAG
글루타민 (Gln, Q) CAA, CAG
글리신 (Gly, G) GGA, GGC, GGG, GGT
히스티딘 (His, H) CAC, CAT
이소류신 (Ile, I) ATA, ATC, ATT
류신 (Leu, L) CTA, CTC, CTG, CTT, TTA, TTG
리신 (Lys, K) AAA, AAG
메티오닌 (Met, M) ATG
페닐알라닌 (Phe, F) TTC, TTT
프롤린 (Pro, P) CCA, CCC, CCG, CCT
세린 (Ser, S) AGC, AGT, TCA, TCC, TCG, TCT
트레오닌(Thr, T) ACA, ACC, ACG, ACT
트립토판 (Trp, W) TGG
티로신 (Tyr, Y) TAC, TAT
발린 (Val, V) GTA, GTC, GTG, GTT
종료 신호(종료) TAA, TAG, TGA
유전자 코드의 중요하고 잘 알려진 특징은 이의 중복성이며, 이에 의해 단백질을 제조하는데 사용되는 대부분의 아미노산에 대해, 하나 초과의 코딩 뉴클레오티드 삼중항이 사용될 수 있다(상기 예시됨). 따라서, 다수의 상이한 뉴클레오티드 서열이 주어진 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 모든 유기체에서 동일한 아미노산 서열을 생산하기 때문에 기능적으로 동등한 것으로 간주된다(비록 특정 유기체는 일부 서열을 다른 것보다 더 효율적으로 번역할 수 있음). 또한, 때때로, 퓨린 또는 피리미딘의 메틸화된 변이체는 주어진 뉴클레오티드 서열에서 발견될 수 있다. 이러한 메틸화는 트리뉴클레오티드 코돈과 상응하는 아미노산 사이의 코딩 관계에 영향을 미치지 않는다.
전술한 바와 같이, 바이오마커 핵산(또는 이의 임의의 부분)을 인코딩하는 DNA 또는 RNA의 뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA를 아미노산 서열로 번역하기 위해 유전자 코드를 사용하여 폴리펩티드 아미노산 서열을 유도하는데 사용될 수 있다. 마찬가지로, 폴리펩티드 아미노산 서열의 경우, 폴리펩티드를 인코딩할 수 있는 상응하는 뉴클레오티드 서열은 유전자 코드로부터 추론될 수 있다(이의 중복성으로 인해, 임의의 주어진 아미노산 서열에 대한 다중 핵산 서열을 생성할 것임). 따라서, 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 본원의 설명 및/또는 개시는 또한 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열의 설명 및/또는 개시를 포함하는 것으로 간주되어야한다. 유사하게, 본원의 폴리펩티드 아미노산 서열의 설명 및/또는 개시는 또한 아미노산 서열을 인코딩할 수 있는 모든 가능한 뉴클레오티드 서열의 설명 및/또는 개시를 포함하는 것으로 간주되어야한다.
II. 펩티드
특정 양태에서, MAGEC2 면역원성 펩티드, 이를 인코딩하는 핵산, 및 /또는 본원에 기술된 것을 발현하는 세포의 투여와 관련하여 MAGEC2 또는 MAGEC2를 발현하는 세포에 대한 면역 반응의 유도를 통해 MAGEC2 발현과 연관된 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 방법 및 조성물이 본원에 제공된다.
특정 구체예에서, MAGEC2 면역원성 펩티드는 표 1A 및 표 1B와 같은 표 1에 열거된 펩티드 서열로부터 선택된 펩티드 에피토프를 포함한다(예를 들어, 이로 구성된다). 본원에 기술된 펩티드 에피토프는 특정 HLA 알파 사슬 대립유전자를 갖는 특정 HLA 분자와 같은 MHC 분자와 조합될 수 있다. 예를 들어, 표 1A 펩티드는 실시예 섹션에 추가로 기술된 바와 같이, HLA-B*0702, HLA-B*0704, HLA-B*0705, HLA-B*0709, HLA-B*0710, HLA-B*0715 및/또는 HLA-B*0721 대립유전자에 의해 인코딩된 것과 같은 HLA-B*07 혈청형을 갖는 알파 사슬을 갖는 MHC와 연관하여 확인되었다. 유사하게, 표 1B 펩티드는 실시예 섹션에서 추가로 기술된 바와 같이, HLA-A*2402, HLA-A*2403, HLA-A*2405, HLA-A*2407, HLA-A*2408, HLA-A*2410, HLA-A*2414, HLA-A*2417, HLA-A*2420, HLA-A*2422, HLA-A*2425, HLA-A* 2426, HLA-A*2458 대립유전자에 의해 인코딩된 것과 같은 HLA-A*24 혈청형을 갖는 알파 사슬을 갖는 MHC와 연관하여 확인되었다. 일부 구체예에서, MAGEC2 면역원성 펩티드는 MHC 분자와 조합될 수 있으며, 여기서 MHC 분자는 HLA-A*02, HLA-A*03, HLA-A*01, HLA-A*11, HLA-A*24 및/또는 HLA-B*07로 구성된 군으로부터 선택된 HLA 혈청형인 MHC 알파 사슬을 포함하며, 선택적으로 HLA 대립유전자는 HLA-A*0201, HLA-A*0202, HLA-A*0203, HLA-A*0204, HLA-A*0205, HLA-A*0206, HLA-A*0207, HLA-A*0210, HLA-A*0211, HLA-A*0212, HLA-A*0213, HLA-A*0214, HLA-A*0216, HLA-A*0217, HLA-A*0219, HLA-A*0220, HLA-A*0222, HLA-A*0224, HLA-A*0230, HLA-A*0242, HLA-A*0253, HLA-A*0260, HLA-A*0274 대립유전자, HLA-A*0301, HLA-A*0302, HLA-A*0305, HLA-A*0307, HLA-A*0101, HLA-A*0102, HLA-A*0103, HLA-A*0116 대립유전자, HLA-A*1101, HLA-A*1102, HLA-A*1103, HLA-A*1104, HLA-A*1105, HLA-A*1119 대립유전자, HLA-A*2402, HLA-A*2403, HLA-A*2405, HLA-A*2407, HLA-A*2408, HLA-A*2410, HLA-A*2414, HLA-A*2417, HLA-A*2420, HLA-A*2422, HLA-A*2425, HLA-A*2426, HLA-A*2458 대립유전자, HLA-B*0702, HLA-B*0704, HLA-B*0705, HLA-B*0709, HLA-B*0710, HLA-B*0715, 및 HLA-B*0721 대립유전자로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, MAGEC2 면역원성 펩티드는 인간 MAGEC2 단백질 및/또는 표 3에 제시된 MAGEC2 단백질로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 MAGEC2 면역원성 펩티드는 단독으로 또는 애주반트와 조합하여 투여된다.
특정 양태에서, 본원에 기술된 하나 이상의 MAGEC2 면역원성 펩티드 및 애주반트를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
표 1: MAGEC2 에피토프
표 1A
HLA 혈청형 HLA-B * 07에 의해 제시되는 MAGEC2 에피토프
표 1B
HLA 혈청형 HLA-A * 24에 의해 제시되는 MAGEC2 에피토프
* 표 1A 및 표 1B와 같은 표 1에는 펩티드 에피토프뿐만 아니라 표 1A 및 표 1B와 같은 표 1에 열거된 임의의 서열의 아미노산 서열, 또는 이의 일부와 그 전장에 걸쳐 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 분자가 포함되어 있다. 이러한 폴리펩티드는 본원에 추가로 기술된 전장 펩티드 또는 폴리펩티드의 기능을 가질 수 있다.
일부 구체예에서, MAGEC2 폴리펩티드 및/또는 MAGEC2 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산이 본원에 제공된다. 일부 구체예에서, MAGEC2 폴리펩티드는 MAGEC2-특이적 면역 반응을 유도하기에 충분한 길이의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 특정 구체예에서, MAGEC2 폴리펩티드는 또한 아미노산 서열에 상응하지 않는 아미노산(예를 들어, MAGEC2 아미노산 서열 및 비-MAGEC2 단백질 또는 폴리펩티드에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질)을 포함한다. 일부 구체예에서, MAGEC2 폴리펩티드는 MAGEC2 단백질 또는 이의 단편에 상응하는 아미노산 서열만을 포함한다.
일부 구체예에서, MAGEC2 폴리펩티드는 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 373 이상 또는 그 사이의 포괄적인 임의의 범위(예를 들어, 7-25, 8-22, 9-22 등)의 표 3에 제시된 것과 같은 MAGEC2 단백질 아미노산 서열의 연속적인 아미노산 산을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 구성되는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 연속적인 아미노산은 표 3에 제시된 MAGEC2의 아미노산 서열과 동일하다. 일부 구체예에서, MAGEC2 폴리펩티드는 표 1A 및 표 1B와 같은 표 1에 열거된 MAGEC2 펩티드 에피토프로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩티드 에피토프를 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 구성된다.
당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 실질적인 서열 유사성을 갖는 폴리펩티드는 숙주 동물에서 동일하거나 매우 유사한 면역 반응을 일으킬 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 본원에 기술된 MAGEC2 면역원성 펩티드 또는 이의 단편의 유도체, 등가물, 변이체, 단편, 돌연변이체도 본원에 제공된 방법 및 조성물에 적합할 수 있다.
일부 구체예에서, MAGEC2 면역원성 폴리펩티드의 변이체 또는 유도체가 본원에 제공된다. 변경된 폴리펩티드는 예를 들어 보존적 치환에 의해 변경된 아미노산 서열을 가질 수 있지만 여전히 변경되지 않은 단백질 항원과 반응하는 면역 반응을 유도하고 기능적 등가물로 간주된다. 본원에 사용된 용어 "보존적 치환"은 아미노산 잔기가 생물학적으로 유사한 다른 잔기로의 대체를 의미한다. 동일한 보존기 내의 아미노산은 전형적으로 단백질의 기능에 실질적으로 영향을 주지 않으면서 서로를 대체할 수 있다는 것이 당업계에 잘 알려져 있다. 특정 구체예에 따르면, MAGEC2 면역원성 펩티드의 리간드-결합 도메인의 유도체, 등가물, 변이체 또는 돌연변이체는 본원에 기재된 MAGEC2 면역원성 펩티드 또는 이의 단편의 서열과 적어도 85% 상동성인 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, 상동성은 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 그 이상이다.
본 발명에 포함되는 면역원성 펩티드는 표 1A 및 표 1B와 같은 표 1에 열거된 것과 같은 MAGEC2 단백질로부터 유래된 펩티드 에피토프를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 면역원성 펩티드의 길이는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산이다. 일부 구체예에서, 펩티드 아미노산 서열은 변형되며, 이는 보존적 또는 비-보존적 돌연변이를 포함할 수 있다. 펩티드는 최대 1개, 2개, 3개, 4개 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 펩티드는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 펩티드는 화학적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 검출성, 안정성, 생체분포, 약동학, 반감기, 표면 전하, 소수성, 접합 부위, pH, 기능 등과 같은 펩티드 특성을 변형하기 위해 돌연변이될 수 있다. N-메틸화는 본 개시내용의 펩티드에서 발생할 수 있는 메틸화의 한 예이다. 일부 구체예에서, 펩티드는 포름알데히드 및 나트륨 시아노보로하이드라이드를 사용한 환원적 메틸화에 의해서와 같이 유리 아민에 대한 메틸화에 의해 변형될 수 있다.
화학적 변형은 중합체, 폴리에테르, 폴리에틸렌 글리콜, 생체고분자, 양쪽이온성 중합체, 폴리아미노산, 지방산, 덴드리머, Fc 영역, 팔미테이트 또는 미리스톨레이트와 같은 단순 포화 탄소 사슬, 또는 알부민을 포함할 수 있다. Fc 영역을 갖는 펩티드의 화학적 변형은 융합 Fc-펩티드일 수 있다. 폴리아미노산은 예를 들어, 반복되는 단일 아미노산(예를 들어, 폴리글리신)을 갖는 폴리 아미노산 서열, 패턴을 따르거나 따르지 않을 수 있는 혼합된 폴리 아미노산 서열을 갖는 폴리 아미노산 서열, 또는 전술한 것의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시내용에 포함되는 펩티드는 변형이 펩티드의 안정성 및/또는 반감기를 증가시키도록 변형될 수 있다. 일부 구체예에서, N-말단, C-말단 또는 내부 아미노산과 같은 소수성 모이어티의 부착을 사용하여 본 개시내용에 포함되는 펩티드의 반감기를 연장할 수 있다. 다른 구체예에서, 펩티드는 예를 들어 혈청 반감기에 영향을 미칠 수 있는 번역-후 변형(예를 들어, 메틸화 및/또는 아미드화)을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 단순 탄소 사슬(예를 들어, 미리스토일화 및/또는 팔미틸화에 의함)이 융합 단백질 또는 펩티드에 접합될 수 있다. 일부 구체예에서, 단순 탄소 사슬은 융합 단백질 또는 펩티드를 비접합된 물질로부터 쉽게 분리할 수 있게 만들 수 있다. 예를 들어, 비접합된 물질로부터 융합 단백질 또는 펩티드를 분리하는데 사용될 수 있는 방법에는 용매 추출 및 역상 크로마토그래피가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 친유성 모이어티는 혈청 알부민에 대한 가역적 결합을 통해 반감기를 연장할 수 있다. 접합된 모이어티는 혈청 알부민에 대한 가역적 결합을 통해 펩티드의 반감기를 연장하는 친유성 모이어티일 수 있다. 일부 구체예에서, 친유성 모이어티는 콜레스테롤 또는 콜레스텐, 콜레스탄, 콜레스타디엔 및 옥시스테롤을 포함하는 콜레스테롤 유도체일 수 있다. 일부 구체예에서, 펩티드는 미리스트산(테트라데칸산) 또는 이의 유도체에 접합될 수 있다. 다른 구체예에서, 펩티드는 반감기 변형제에 커플링(예를 들어, 접합)될 수 있다. 반감기 조절제의 예에는 중합체, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 하이드록시에틸 전분, 폴리비닐 알코올, 수용성 중합체, 양쪽이온성 수용성 중합체, 수용성 폴리(아미노산), 프롤린, 알라닌 및 세린의 수용성 중합체, 글리신, 글루탐산 및 세린을 함유하는 수용성 중합체, Fc 영역, 지방산, 팔미트산 또는 알부민에 결합하는 분자가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구체예에서, 스페이서 또는 링커는 다른 분자에 대한 접합 또는 융합을 촉진하기 위해서 뿐만 아니라 이러한 접합 또는 융합된 분자로부터 펩티드의 절단을 촉진하기 위해 스페이서 또는 링커 역할을 하는 1, 2, 3, 4개 이상의 아미노산 잔기와 같은 펩티드에 커플링될 수도 있다. 일부 구체예에서, 융합 단백질 또는 펩티드는 예를 들어 펩티드의 특성을 변형하거나 변경을 일으킬 수 있는 다른 모이어티에 접합될 수 있다.
일부 구체예에서, 펩티드는 모이어티에 공유적으로 연결될 수 있다. 일부 구체예에서, 공유적으로 연결된 모이어티는 친화성 태그 또는 표지를 포함한다. 친화성 태그는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 칼모듈린 결합 단백질(CBP), 단백질 C 태그, Myc 태그, HaloTag, HA 태그, Flag® 태그, His 태그, 비오틴 태그 및 V5 태그로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 표지는 형광 단백질일 수 있다. 일부 구체예에서, 공유적으로 연결된 모이어티는 염증제, 항-염증제, 사이토카인, 독소, 세포독성 분자, 방사성 동위원소, 또는 단일-사슬 Fv와 같은 항체로 구성된 군으로부터 선택된다.
펩티드는 영상화, 연구, 치료, 치료진단, 의약품, 화학요법, 킬레이트화 요법, 표적화된 약물 전달 및 방사선요법에 사용되는 제제에 접합될 수 있다. 일부 구체예에서, 펩티드는 형광단, 근적외선 염료, 조영제, 나노입자, 금속-함유 나노입자, 금속 킬레이트, X-선 조영제, PET 제제, 금속, 방사성동위원소, 염료, 방사성핵종 킬레이트제, 또는 영상화에 사용될 수 있는 다른 적합한 물질과 같은 검출가능한 제제에 접합되거나 융합될 수 있다. 일부 구체예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 검출가능한 모이어티가 펩티드에 연결될 수 있다. 방사성동위원소의 비-제한적인 예에는 알파 방출체, 베타 방출체, 양전자 방출체 및 감마 방출체가 포함된다. 일부 구체예에서, 금속 또는 방사성 동위원소는 악티늄, 아메리슘, 비스무스, 카드뮴, 세슘, 코발트, 유로뮴, 가돌리늄, 이리듐, 납, 루테튬, 망간, 팔라듐, 폴로늄, 라듐, 루테늄, 사마륨, 스트론튬, 테크네튬, 탈륨 및 이트륨으로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 금속은 악티늄, 비스무트, 납, 라듐, 스트론튬, 사마륨 또는 이트륨이다. 일부 구체예에서, 방사성 동위원소는 악티늄-225 또는 납-212이다. 일부 구체예에서, 근적외선 염료는 생물학적 조직 및 체액에 의해 쉽게 켄칭되지 않는다. 일부 구체예에서, 형광단은 650nm 내지 4000nm 사이의 파장에서 전자기 방사선을 방출하는 형광제이며, 이러한 방출은 이러한 제제를 검출하는데 사용된다. 접합 분자로 사용될 수 있는 형광 염료의 비-제한적인 예는 DyLight®-680, DyLight®-750, VivoTag®-750, DyLight®-800, IRDye®-800, VivoTag®-680, Cy5.5, ZQ800 또는 인도시아닌 그린(ICG)을 포함한다. 일부 구체예에서, 근적외선 염료는 종종 시아닌 염료(예를 들어, Cy7, Cy5.5 및 Cy5)를 포함한다. 본 개시내용에서 접합 분자로 사용하기 위한 형광 염료의 추가적인 비-제한적 예는 아크라딘 오렌지 또는 옐로우, Alexa Fluors®(예를 들어, Alexa Fluor® 790, 750, 700, 680, 660 및 647) 및 이의 임의의 유도체, 7-액티노마이신 D, 8-아닐리노나프탈렌-1-술폰산, ATTO 염료 및 이의 유도체, 아우라민-로다민 염색 및 이의 임의의 유도체, 벤산트론, 비만, 9-10-비스(페닐에티닐)안트라센, 5,12-비스 (페닐에티닐)나트타센, 비스벤즈이미드, 브레인보우, 칼세인, 카르바디플루오레세인 및 이의 임의의 유도체, 1-클로로-9,10-비스(페닐에티닐)안트라센 및 이의 임의의 유도체, DAPI, DiOC6, DyLight Fluors 및 이의 임의의 유도체, 에피코코논, 에티듐 브로마이드, FlAsH-EDT2, Fluo 염료 및 이의 임의의 유도체, FluoProbe 및 이의 임의의 유도체, Fluorescein 및 이의 임의의 유도체, Fura 및 이의 임의의 유도체, GelGreen 및 이의 임의의 유도체, GelRed 및 이의 임의의 유도체, 형광 단백질 및 이의 임의의 유도체, m 이소폼 단백질 및 그의 임의의 유도체 예컨대 예를 들어 mCherry, 헤타메틴 염료 및 이의 임의의 유도체, 호쉬스트 염색, 이미노쿠마린, 인디안 옐로우, 인도-1 및 그의 임의의 유도체, 라우르단, 루시퍼 옐로우 및 이의 임의의 유도체, 루시페린 및 이의 임의의 유도체, 루시퍼라제 및 이의 임의의 유도체, 메르코시아닌 및 이의 임의의 유도체, 나일 염료 및 이의 임의의 유도체, 페릴렌, 플록신, 피코 염료 및 이의 임의의 유도체, 프로피움 요오다이드, 피라닌, 로다민 및 이의 임의의 유도체, 리보그린, RoGFP, 루브렌, 스틸벤 및 이의 임의의 유도체, 설포로다민 및 이의 임의의 유도체, SYBR™ 및 이의 임의의 유도체, 시냅토-pHluorin, 테트라페닐 부타디엔, 테트라나트륨 트리스, 텍사스 레드, 타이탄 옐로우, TSQ, 움벨리페론, 비올란트론, 황색 형광 단백질 및 YOYO-1을 포함한다. 다른 적합한 형광 염료는 플루오레세인 및 플루오레세인 염료(예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아닌 또는 FITC, 나프토플루오레세인, 4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인, 6-카르복시플루오레세인 또는 FAM 등), 카르보시아닌, 메로시아닌, 스티릴 염료, 옥소놀 염료, 피코에리트린, 에리트로신, 에오신, 로다민 염료(예를 들어 카르복시테트라메틸-로다민 또는 TAMRA, 카르복시로다민 6G, 카르복시-X-로다민(ROX), 리사민 로다민 B, 로다민 6G, 로다민 그린 , 로다민 레드, 테트라메틸로다민(TMR) 등), 쿠마린 및 쿠마린 염료(예를 들어 메톡시쿠마린, 디알킬아미노쿠마린, 하이드록시쿠마린, 아미노메틸쿠마린(AMCA) 등), Oregon Green® 염료(예를 들어 Oregon Green® 488, Oregon Green® 500, Oregon Green® 514. 등), Texas Red, Texas Red-X, SPECTRUM RED, SPECTRUM GREEN, 시아닌 염료(예를 들어 CY-3, Cy-5, CY-3.5, CY-5.5 등) , ALEXA FLUOR® 염료(예를 들어 ALEXA FLUOR® 350, ALEXA FLUOR® 488, ALEXA FLUOR® 532, ALEXA FLUOR® 546, ALEXA FLUOR® 568, ALEXA FLUOR® 594, ALEXA FLUOR® 633, ALEXA FLUOR® 660, ALEXA FLUOR® 680 등), BODIPY® 염료(예를 들어 BODIPY® FL, BODIPY® R6G, BODIPY® TMR, BODIPY® TR, BODIPY® 530/550, BODIPY® 558/568, BODIPY® 564/570, BODIPY® 576 /589, BODIPY® 581/591, BODIPY® 630/650, BODIPY® 650/665 등), IRDyes(예를 들어 IRD40, IRD 700, IRD 800 등) 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 추가로 적합한 검출가능한 제제는 PCT/US14/56177에 기술되어 있다. 방사성동위원소의 비-제한적인 예는 알파 방출체, 베타 방출체, 양전자 방출체 및 감마 방출체를 포함한다. 일부 구체예에서, 금속 또는 방사성동위원소는 악티늄, 아메리슘, 비스무스, 카드뮴, 세슘, 코발트, 유로뮴, 가돌리늄, 이리듐, 납, 루테튬, 망간, 팔라듐, 폴로늄, 라듐, 루테늄, 사마륨, 스트론튬, 테크네튬, 탈륨 및 이트륨으로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 금속은 악티늄, 비스무트, 납, 라듐, 스트론튬, 사마륨 또는 이트륨이다. 일부 구체예에서, 방사성동위원소는 악티늄-225 또는 납-212이다.
펩티드는 방사선감작제 또는 감광제에 접합될 수 있다. 방사선감작제의 예는 ABT-263, ABT-199, WEHI-539, 파클리탁셀, 카보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 젬시타빈, 에타니다졸, 미소니다졸, 티라파자민 및 핵산 염기 유도체(예를 들어 할로겐화된 퓨린 또는 피리미딘, 예컨대 5-플루오로데옥시우리딘)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 감광제의 예는 조명 시 열을 생성하는 형광 분자 또는 비드, 나노입자, 포르피린 및 포르피린 유도체(예를 들어 클로린, 박테리오클로린, 이소박테리오클로린, 프탈로시아닌 및 나프탈로시아닌), 메탈로포르피린, 메탈로프탈로시아닌, 안젤리신, 칼코게나피릴륨 염료, 클로로필, 쿠마린, 플라빈 및 관련된 화합물 예컨대 알록사진 및 리보플라빈, 풀러렌, 페오포르비드, 피로페오포르비드, 시아닌(예를 들어 메로시아닌 540), 페오피틴, 사피린, 텍사피린, 퍼푸린, 포르피센, 페노티아지늄, 메틸렌 블루 유도체, 나프탈이미드, 나일 블루 유도체, 퀴논, 페릴렌퀴논(예를 들어 하이페리신, 히포크렐린 및 세르코스포린), 소랄렌, 퀴논, 레티노이드, 로다민, 티오펜, 베르딘, 크산텐 염료(예를 들어 에오신, 에리트로신, 로즈 벵갈), 이량체 및 올리고머 형태의 포르피린, 및 전구약물 예컨대 5-아미노레불린산을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 유리하게도, 이 접근방식은 치료제(예를 들어 약물)와 전자기 에너지(예를 들어 방사선 또는 빛) 둘 모두를 동시에 사용하여 관심 세포(예를 들어 면역 세포)의 매우 구체적인 표적화를 허용한다. 일부 구체예에서, 펩티드는 예를 들어 직접적으로 또는 링커를 통해 제제와 융합되거나 제제에 공유적으로 또는 비-공유적으로 연결된다.
일부 구체예에서, 결합 단백질은 화학적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 결합 단백질은 검출성, 안정성, 생체분포, 약동학, 반감기, 표면 전하, 소수성, 접합 부위, pH, 기능 등과 같은 펩티드 특성을 변형시키기 위해 돌연변이될 수 있다. N-메틸화는 본 발명에 포함되는 결합 단백질에서 발생할 수 있는 메틸화의 한 예이다. 일부 구체예에서, 결합 단백질은 포름알데히드 및 나트륨 시아노보로하이드라이드로의 환원적 메틸화와 같은 유리 아민에 대한 메틸화에 의해 변형될 수 있다.
화학적 변형은 중합체, 폴리에테르, 폴리에틸렌 글리콜, 생체고분자, 양쪽이온성 중합체, 폴리아미노산, 지방산, 덴드리머, Fc 영역, 팔미테이트 또는 미리스톨레이트와 같은 단순 포화된 탄소 사슬, 또는 알부민을 포함할 수 있다. Fc 영역을 갖는 결합 단백질의 화학적 변형은 융합 Fc-단백질일 수 있다. 폴리아미노산은 예를 들어, 반복된 단일 아미노산(예를 들어 폴리글리신)을 갖는 폴리 아미노산 서열, 및 패턴을 따르거나 따르지 않을 수 있는 혼합된 폴리 아미노산 서열을 갖는 폴리 아미노산 서열, 또는 전술한 것의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명에 포함되는 결합 단백질은 변형될 수 있다. 일부 구체예에서, 모 결합 단백질의 하나 이상의 생물물리학적 및/또는 생물학적 활성을 유지하는(예를 들어, pMHC 결합 특이성을 유지하는) 기능적 변이체를 생성하기 위해 모 결합 단백질에 대해 실질적 또는 유의한 서열 동일성을 갖는 변형. 일부 구체예에서, 돌연변이는 보존적 아미노산 치환이다.
일부 구체예에서, 본 발명에 포함되는 결합 단백질은 하나 이상의 자연적으로-발생하는 아미노산 대신에 합성 아미노산을 포함할 수 있다. 이러한 합성 아미노산은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 아미노사이클로헥산 카복실산, 노르류신, a-아미노 n-데칸산, 호모세린, S-아세틸아미노메틸-시스테인, 트랜스-3- 및 트랜스-4-하이드록시프롤린, 4-아미노페닐알라닌, 4-니트로페닐알라닌, 4-클로로페닐알라닌, 4-카르복시페닐알라닌, β-페닐세린 β-하이드록시페닐알라닌, 페닐글리신, a-나프틸알라닌, 시클로헥실알라닌, 시클로헥실글리신, 인돌린-2-카르복실산, 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-카르복실산, 아미노말론산, 아미노말론산 모노아미드, N'-벤질-N'-메틸-리신, N',N'-디벤질-리신, 6-하이드록시리신, 오르니틴, a-아미노시클로펜탄카르복실산, oc-아미노시클로헥산 카르복실산, a-아미노시클로헵탄 카르복실산, a-(2-아미노-2-노르보르난)-카르복실산, α,γ-디아미노부티르산, ,β-디아미노프로피온산, 호모페닐알라닌 및 oc-tert-부틸글리신을 포함한다.
본 발명에 포함되는 결합 단백질은 글리코실화, 아미드화, 카르복실화, 인산화, 에스테르화, N-아실화, 고리화(예를 들어, 이황화 가교를 통해)되거나, 산부가염으로 전환되고/되거나 선택적으로 이량체화되거나 중합되거나 접합될 수 있다.
일부 구체예에서, N-말단, C-말단 또는 내부 아미노산과 같은 소수성 모이어티의 부착을 사용하여 본 발명에 포함되는 펩티드의 반감기를 연장할 수 있다. 다른 구체예에서, 결합 단백질은 예를 들어 혈청 반감기에 영향을 미칠 수 있는 번역-후 변형(예를 들어, 메틸화 및/또는 아미드화)을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 단순 탄소 사슬(예를 들어, 미리스토일화 및/또는 팔미틸화에 의함)이 결합 단백질에 접합될 수 있다. 일부 구체예에서, 단순 탄소 사슬은 결합 단백질을 비접합된 물질로부터 쉽게 분리할 수 있게 만들 수 있다. 예를 들어, 결합 단백질을 비접합된 물질로부터 분리하는데 사용될 수 있는 방법에는 용매 추출 및 역상 크로마토그래피가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 친유성 모이어티는 혈청 알부민에 대한 가역적 결합을 통해 반감기를 연장할 수 있다. 접합된 모이어티는 혈청 알부민에 대한 가역적 결합을 통해 펩티드의 반감기를 연장하는 친유성 모이어티일 수 있다. 일부 구체예에서, 친유성 모이어티는 콜레스테롤 또는 콜레스텐, 콜레스탄, 콜레스타디엔 및 옥시스테롤을 포함하는 콜레스테롤 유도체일 수 있다. 일부 구체예에서, 결합 단백질은 미리스트산(테트라데칸산) 또는 이의 유도체에 접합될 수 있다. 다른 구체예에서, 결합 단백질은 반감기 변형제에 커플링(예를 들어, 접합)될 수 있다. 반감기 변형제의 예에는 중합체, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 하이드록시에틸 전분, 폴리비닐 알코올, 수용성 중합체, 양쪽이온성 수용성 중합체, 수용성 폴리(아미노산), 프롤린, 알라닌 및 세린의 수용성 중합체, 글리신, 글루탐산 및 세린을 함유하는 수용성 중합체, Fc 영역, 지방산, 팔미트산 또는 알부민에 결합하는 분자가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구체예에서, 스페이서 또는 링커는 다른 분자에 대한 접합 또는 융합을 촉진하기 위해서 뿐만 아니라 이러한 접합 또는 융합된 분자로부터 펩티드의 절단을 촉진하기 위해 스페이서 또는 링커 역할을 하는 1, 2, 3, 4개 이상의 아미노산 잔기와 같은 결합 단백질에 커플링될 수도 있다. 일부 구체예에서, 결합 단백질은 예를 들어 결합 단백질의 특성을 변형하거나 변경시킬 수 있는 다른 모이어티에 접합될 수 있다.
펩티드와 같은 단백질은 재조합적으로 또는 합성적으로, 예컨대 고체상 펩티드 합성 또는 용액상 펩티드 합성에 의해 생산될 수 있다. 단백질 합성은 공지된 합성 방법, 예컨대 플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc) 화학에 의해 또는 부틸옥시카르보닐(Boc) 화학에 의해 수행될 수 있다. 단백질 단편은 효소적으로 또는 합성적으로 함께 조합될 수 있다.
본 발명에 포함되는 양태에서, (i) 본원에 기술된 결합 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산에 의해 형질전환된 형질전환된 숙주 세포를 상기 결합 단백질의 발현을 허용하기에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계; 및 (ii) 발현된 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 본원에 기술된 단백질을 생산하는 방법이 본원에 제공된다.
예로서, 재조합적으로 생성된 결합 단백질을 단리하고 정제하는데 유용한 방법은 결합 단백질을 배양 배지 안으로 분비하는 적합한 숙주 세포/벡터 시스템으로부터 상등액을 얻은 다음, 상업적으로 이용가능한 필터를 사용하여 배지를 농축하는 것을 포함할 수 있다. 농축에 이어서, 농축물은 단일 적합한 정제 매트릭스 또는 친화성 매트릭스 또는 이온 교환 수지와 같은 일련의 적합한 매트릭스에 적용될 수 있다. 하나 이상의 역상 HPLC 단계를 이용하여 재조합 폴리펩티드를 추가로 정제할 수 있다. 이들 정제 방법은 그 자연 환경에서 면역원을 분리할 때 이용될 수도 있다. 본원에 기술된 하나 이상의 결합 단백질의 대규모 생산을 위한 방법은 회분식 세포 배양을 포함하며, 이는 적절한 배양 조건을 유지하기 위해 모니터링되고 제어된다. 결합 단백질의 정제는 본원에 기술되고 당업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 MAGEC2 면역원성 펩티드 또는 그의 단편을 인코딩하는 핵산, 예컨대 MAGEC2 면역원성 펩티드를 인코딩하는 DNA 분자가 본원에 제공된다. 일부 구체예에서, 조성물은 본원에 기재된 MAGEC2 면역원성 펩티드 또는 그의 단편을 인코딩하는 개방 판독 프레임을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산은 개방 판독 프레임의 발현에 필요한 조절 요소를 포함한다. 이러한 요소에는 예를 들어 프로모터, 개시 코돈, 정지 코돈 및 폴리아데닐화 신호가 포함될 수 있다. 부가하여, 강화제도 포함될 수 있다. 이들 요소는 MAGEC2 면역원성 폴리펩티드 또는 이의 단편을 인코딩하는 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 펩티드와 같은 단백질을 발현하는데 유용한 대표적인 벡터, 프로모터, 조절 요소 등은 아래에 추가로 기술되어 있다.
III. MHC-펩티드 복합체
특정 양태에서, 본원에 기술된 MAGEC2 면역원성 펩티드 및 MHC 분자를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구체예에서, MAGEC2 면역원성 펩티드는 MHC 분자와 안정한 복합체를 형성한다.
MHC 단백질은 검출 모이어티, 방사선감작제, 감광제 등과 같은 제제에 접합될 수 있고/있거나 펩티드에 관해 상기에서 기술된 바와 같이 화학적으로 변형될 수 있다.
본 개시내용에 포함된 조성물 및 방법에 제공되고 사용되는 MHC 단백질은 당업계에 공지된 임의의 적합한 MHC 분자일 수 있다. 일반적으로, 이는 식 (α-β-P)n을 가지며, 여기서 n은 적어도 2, 예를 들어 2-10 사이, 예를 들어 4이다. α는 클래스 I 또는 클래스 II MHC 단백질의 α 사슬이다. β는 β 사슬이며, 여기서는 클래스 II MHC 단백질의 β 사슬 또는 MHC 클래스 I 단백질에 대한 β2 마이크로글로불린으로 정의된다. P는 펩티드 항원이다.
일부 구체예에서, MHC 단백질은 HLA I 복합체와 같은 MHC 클래스 I 복합체이다.
MHC 단백질은 임의의 포유동물 또는 조류 종, 예를 들어 영장류 종, 특히 인간; 마우스, 랫트 및 햄스터를 포함한 설치류; 토끼들; 말, 소, 개과, 고양이과; 등으로부터의 것일 수 있다. 예를 들어, MHC 단백질은 인간 HLA 단백질 또는 뮤어라인 H-2 단백질에서 유래될 수 있다. HLA 단백질은 클래스 II 하위단위 HLA-DPα, HLA-DPβ, HLA-DQα, HLA-DQβ, HLA-DRα 및 HLA-DRβ, 및 클래스 I 단백질 HLA-A, HLA-B, HLA-C 및 β2-마이크로글로불린을 포함한다. H-2 단백질은 클래스 I 하위단위 H-2K, H-2D, H-2L, 클래스 II 하위단위 I-Aα, I-Aβ, I-Eα 및 I-Eβ, β2-마이크로글로불린을 포함한다. 일부 대표적인 MHC 단백질의 서열은 Kabat 등 서열s of Proteins of Immunological Interest, NIH Publication No. 91-3242, pp724-815에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 MHC 단백질 하위단위는 정상적으로 막-결합된 단백질의 가용성 형태이며, 이는 예를 들어 막횡단 도메인 및 세포질 도메인의 결실에 의해 당업계에 공지된 바와 같이 제조된다.
클래스 I 단백질의 경우 가용성 형태는 α1, α2 및 α3 도메인을 포함할 수 있다. 가용성 클래스 II 하위단위는 α 하위단위에 대한 α1 및 α2 도메인과 β 하위단위에 대한 β1 및 β2 도메인을 포함할 수 있다.
α 및 β 하위 단위는 별도로 생산되어 시험관내에서 연관되어 안정한 이종이중 복합체를 형성할 수 있거나, 두 하위단위 모두 단일 세포에서 발현될 수 있다. MHC 하위단위를 생산하는 방법은 당업계에 알려져 있다.
특정 구체예에서, MHC-펩티드 복합체는 표 1(예컨대 표 1A 및 표 1B)로부터 선택된 펩티드 에피토프 및 MHC를 포함한다. 일부 구체예에서, MHC 분자는 HLA-A*02, HLA-A*03, HLA-A*01, HLA-A*11, HLA-A*24 및/또는 HLA-B*07로 구성된 군으로부터 선택된 HLA 혈청형인 MHC 알파 사슬을 포함하며, 선택적으로 HLA 대립유전자는 HLA-A*0201, HLA-A*0202, HLA-A*0203, HLA-A*0204, HLA-A*0205, HLA-A*0206, HLA-A*0207, HLA-A*0210, HLA-A*0211, HLA-A*0212, HLA-A*0213, HLA-A*0214, HLA-A*0216, HLA-A*0217, HLA-A*0219, HLA-A*0220, HLA-A*0222, HLA-A*0224, HLA-A*0230, HLA-A*0242, HLA-A*0253, HLA-A*0260, HLA-A*0274 대립유전자, HLA-A*0301, HLA-A*0302, HLA-A*0305, HLA-A*0307, HLA-A*0101, HLA-A*0102, HLA-A*0103, HLA-A*0116 대립유전자, HLA-A*1101, HLA-A*1102, HLA-A*1103, HLA-A*1104, HLA-A*1105, HLA-A*1119 대립유전자, HLA-A*2402, HLA-A*2403, HLA-A*2405, HLA-A*2407, HLA-A*2408, HLA-A*2410, HLA-A*2414, HLA-A*2417, HLA-A*2420, HLA-A*2422, HLA-A*2425, HLA-A*2426, HLA-A*2458 대립유전자, HLA-B*0702, HLA-B*0704, HLA-B*0705, HLA-B*0709, HLA-B*0710, HLA-B*0715, 및 HLA-B*0721 대립유전자로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, MHC-펩티드 복합체는 표 1A로부터 선택된 펩티드 에피토프 및 그의 알파 사슬이 HLA-B*07 혈청형, 예컨대 HLA-B*0702, HLA-B*0704, HLA-B*0705, HLA-B*0709, HLA-B*0710, HLA-B*0715 및/또는 HLA-B*0721 대립유전자에 의해 인코딩되는 것을 갖는 MHC를 포함한다. 일부 구체예에서, MHC-펩티드 복합체는 표 1B로부터 선택된 펩티드 에피토프 및 그의 알파 사슬이 HLA-A*24 혈청형, 예컨대 HLA-A*2402, HLA-A*2403, HLA-A*2405, HLA-A*2407, HLA-A*2408, HLA-A*2410, HLA-A*2414, HLA-A*2417, HLA-A*2420, HLA-A*2422, HLA- A*2425, HLA-A*2426 및/또는 HLA-A*2458 대립유전자에 의해 인코딩되는 것을 갖는 MHC를 포함한다.
MHC-펩티드 복합체를 제조하기 위해, 하위단위를 항원성 펩티드와 조합하고 시험관내에서 접혀 사슬내 이황화 결합된 도메인과 안정한 이종이량체 복합체를 형성하도록 할 수 있다. 펩티드는 초기 접힘 반응에 포함될 수 있거나, 이후 단계에서 빈 이종이량체에 첨가될 수 있다. 본 발명에 포함되는 조성물 및 방법에서, 이는 MAGEC2 면역원성 펩티드 또는 이의 단편이다. 하위단위와 펩티드의 접힘 및 연합을 허용하는 조건은 당업계에 공지되어 있다. 일 예로서, 대략 등몰량의 용해된 α 및 β 하위단위가 요소의 용액에 혼합될 수 있다. 재접힘은 요소가 없는 완충 용액 안으로 희석 또는 투석에 의해 시작된다. 펩티드는 약 1 내지 3일 동안 약 pH 5 내지 5.5에서 빈 클래스 II 이종이량체에 장입된 후 중화, 농축 및 완충액 교환이 이어질 수 있다. 그러나, 특정 접힘 조건은 발명의 실시에 중요하지 않다.
단량체 복합체(α-β-P)(본원에서 단량체)는 예를 들어 MHC 사량체에 대해 다량체화될 수 있다. 생성된 다량체는 장기간에 걸쳐 안정적이다. 바람직하게는, 다량체는 당업계에 공지된 바와 같이(예를 들어, 미국 특허 번호 5,635,363에 기술된 바와 같이) α 또는 β 하위단위 상의 특정 부착 부위를 통해 단량체를 다가 실체에 결합시킴에 의해 형성될 수 있다. 그 단량체 또는 다량체 형태에서의 MHC 단백질은 또한 비드 또는 임의의 기타 지지체에 접합될 수 있다.
다량체 복합체는 면역염색 또는 당업계에 공지된 다른 방법에서 사용될 때 직접적으로 검출가능하도록 표지될 수 있거나, 당업계에 공지된 바와 같이 복합체에 특이적으로 및/또는 선택적으로 결합하는(예를 들어, MHC 단백질 하위단위에 결합하는) 2차 표지된 면역시약과 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 표지는 형광단 예컨대 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민, 텍사스 레드, 피코에리트린(PE), 알로피코시아닌(APC), Brilliant Violet™ 421, Brilliant UV™ 395, Brilliant Violet™ 480, Brilliant Violet™ 421(BV421), Brilliant Blue™ 515, APC-R700 또는 APC-Fire750일 수 있다. 일부 구체예에서, 다량체 복합체는 다른 모이어티에 특이적으로 및/또는 선택적으로 결합할 수 있는 모이어티에 의해 표지된다. 예를 들어, 표지는 비오틴, 스트렙타비딘, 올리고뉴클레오티드 또는 리간드일 수 있다. 관심 있는 다른 표지는 형광 색소, 염료, 효소, 화학발광물질, 입자, 방사성동위원소 또는 기타 직접 또는 간접적으로 검출가능한 제제를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 세포 표면 상의 MHC 분자의 맥락에서 면역원성 펩티드를 제시하는 세포는 재조합 또는 이종 항원을 세포 안으로 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터)로 세포를 형질감염 또는 형질도입함에 의해 생성된다. 일부 구체예에서, 벡터는 일부 경우에 발현된 이종 단백질의 하나 이상의 펩티드 항원을 포함하는 하나 이상의 펩티드 항원이 세포에 의해 발현되고, 처리되어 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 분자의 맥락에서 세포의 표면 상에 제시되는 조건 하에서 세포 안으로 도입된다.
일반적으로, 벡터가 접촉되는 세포는 MHC를 발현하는 세포, 즉 MHC-발현 세포이다. 세포는 세포 표면에서 MHC를 정상적으로 발현하거나, 세포 표면에서 MHC를 발현하고/하거나 그 발현을 상향조절하도록 유도되거나 세포 표면에서 MHC 분자를 발현하도록 조작된 세포일 수 있다. 일부 구체예에서, MHC는 일부 경우에 세포 기구에 의해 처리되는 펩티드 항원을 포함한 폴리펩티드의 펩티드 항원과 복합체를 형성할 수 있는 다형성 펩티드 결합 부위 또는 결합 홈을 함유한다. 일부 경우에, MHC 분자는 T 세포 상의 TCR 또는 다른 펩티드 결합 분자에 의해 인식될 수 있는 형태로 항원의 제시를 위해 펩티드와의 복합체, 즉 MHC-펩티드 복합체를 포함하여 세포 표면에 디스플레이되거나 발현될 수 있다.
일부 구체예에서, 세포는 유핵 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 항원-제시 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 대식세포, 수지상 세포, B 세포, 내피 세포 또는 섬유아세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 내피 세포주 또는 일차 내피 세포와 같은 내피 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 섬유아세포 세포주 또는 일차 섬유아세포 세포와 같은 섬유아세포이다.
일부 구체예에서, 세포는 인공 항원 제시 세포(aAPC)이다. 전형적으로, aAPC는 MHC 분자, 자극 및 공동자극 분자(들), Fc 수용체, 접착 분자(들)의 발현 및/또는 사이토카인(예를 들어 IL-2)을 생성하거나 분비하는 능력을 포함하는 천연 APC의 특징을 포함한다. 정상적으로, aAPC는 상기 중 하나 이상의 발현을 결하는 세포주이고, MHC 분자, 저친화도 Fc 수용체(CD32), 고친화도 Fc 수용체(CD64), 하나 이상의 공동자극 신호(예를 들어 CD7, B7-1(CD80), B7-2(CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ICOS-L, ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림프톡신 베타 수용체, ILT3, ILT4, 3/TR6 또는 B7-H3의 리간드; 또는 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, Toll 리간드 수용체 또는 CD83의 리간드에 특이적으로 결합하는 항체), 세포 접착 분자(예를 들어 ICAM-1 또는 LFA-3) 및/또는 사이토카인(예를 들어 IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-21, 인터페론-알파(IFN.alpha.), 인터페론-베타(IFN.beta.), 인터페론-감마(IFN.gamma.), 종양 괴사 인자-알파(TNF.alpha.), 종양 괴사 인자-베타(TNF.beta.), 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF) 및 과립구 집락 자극 인자(GCSF)) 중에서 누락된 요소 중 하나 이상의 도입에 의해(예를 들어, 형질감염 또는 형질도입에 의해) 생성된다. 일부 경우에, aAPC는 정상적으로 MHC 분자를 발현하지 않지만, MHC 분자를 발현하도록 조작될 수 있거나, 일부 경우에는 사이토카인을 이용한 자극에 의해서와 같이 MHC 분자를 발현하도록 유도되거나 유도될 수 있다. 일부 경우에, aAPC에는 또한 자극 리간드가 장입될 수 있으며, 이는 예를 들어 항-CD3 항체, 항-CD28 항체 또는 항-CD2 항체를 포함할 수 있다. aAPC를 생성하기 위한 백본으로 사용될 수 있는 예시적인 세포주는 K562 세포주 또는 섬유아세포 세포주이다. 다양한 aAPC가 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 번호 8,722,400, 공개된 출원 번호 US2014/0212446; Butler and Hirano (2014) Immunol Rev. 257:10. 1111/imr.12129; Suhoshki 등 (2007) Mol. Ther. 15:981-988을 참조한다).
세포에 의해 발현되는 특정 MHC 또는 대립유전자를 결정하거나 식별하는 것은 당업자의 수준 내에 있다. 일부 구체예에서, 세포를 벡터와 접촉시키기 이전에, 특정 MHC 분자의 발현은 특정 MHC 분자에 특이적인 항체를 사용함에 의한 것과 같이 평가되거나 식별될 수 있다. MHC 분자에 대한 항체는 아래 기술된 것과 같이 당업계에 알려져 있다.
일부 구체예에서, 세포는 원하는 MHC 제한의 MHC 대립유전자를 발현하도록 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포주와 같은 세포의 MHC 유형화는 당업계에 잘 알려져 있다. 일부 구체예에서, 대상체로부터 얻은 일차 세포와 같은 세포의 MHC 유형화는 분자 일배체형 검정을 사용한 조직 유형화를 수행함에 의한 것과 같이 당업계에 잘 알려져 있는 절차를 사용하여 결정될 수 있다(BioTest ABC SSPtray, BioTest Diagnostics Corp., Denville, N.J.; SeCore Kits, Life Technologies, Grand Island, N.Y.). 일부 경우에, 서열-기반 유형화(SBT)를 사용함에 의한 것과 같이 HLA 유전자형을 결정하기 위해 세포의 표준 유형화를 수행하는 것은 당업자의 수준 내에 있다(Adams 등 (2004) J. Transl. Med., 2:30; Smith (2012) Methods Mol Biol., 882:67-86). 일부 경우에, 섬유아세포 세포와 같은 세포의 HLA 유형화는 알려져 있다. 예를 들어, 인간 태아 폐 섬유아세포 세포주 MRC-5는 HLA-A*0201, A29, B13, B44 Cw7(C*0702)이고; 인간 포피 섬유아세포 세포주 Hs68은 HLA-A1, A29, B8, B44, Cw7, Cw16이고; WI-38 세포주는 A*6801, B*0801이다(Solache 등 (1999) J Immunol, 163:5512-5518; Ameres 등 (2013) PloS Pathog. 9:e1003383). 인간 형질감염 섬유아세포 세포주 M1DR1/Ii/DM은 HLA-DR 및 HLA-DM을 발현한다(Karakikes 등 (2012) FASEB J., 26:4886-96).
일부 구체예에서, 벡터가 접촉되거나 도입되는 세포는 MHC 분자를 발현하도록 조작되거나 형질감염된 세포이다. 일부 구체예에서, 세포주는 모 세포주를 유전적으로 변형함으로써 제조될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 정상적으로 특정 MHC 분자가 결핍되어 있으며 이러한 특정 MHC 분자를 발현하도록 조작된다. 일부 구체예에서, 세포는 재조합 DNA 기술을 사용하여 유전적으로 조작된다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 안정한 MHC-펩티드 복합체는 안정한 MHC-펩티드 복합체에 결합하는 T 세포를 검출하는데 사용된다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 안정한 MHC-펩티드 복합체는 예를 들어 형광으로 표지된 MHC-펩티드 복합체에 특이적으로 및/또는 선택적으로 결합하는 T 세포(예를 들어, CD8+ T 세포)의 양 및/또는 백분율을 검출함으로써 대상체에서 T 세포 반응을 모니터링하는데 사용된다. MHC-펩티드 복합체-특이적 T 세포를 검출하기 위해 MHC-펩티드 복합체(예를 들어, MHC-펩티드 사량체)를 생성하고, 표지하고, 사용하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 추가적인 설명은 예를 들어 미국 특허 번호 7,776,562; 미국 특허 번호 8,268,964; 및 미국 특허 공개 2019/0085048에서 찾아볼 수 있다.
IV. 면역원성 조성물
일부 양태에서, MAGEC2 면역원성 펩티드 및/또는 MAGEC2 면역원성 펩티드를 인코딩하는 핵산 및 애주반트를 포함하는 약학적 조성물(예를 들어, 백신 조성물)이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, MHC 분자의 맥락에서 MAGEC2 면역원성 펩티드를 포함하는 안정한 MHC-펩티드 복합체 및 애주반트를 포함하는 약학적 조성물(예를 들어, 백신 조성물)이 본원에 제공된다. 일부 구체예에서, 조성물은 다중(예를 들어, 2개 이상) MAGEC2 면역원성 펩티드 또는 핵산과 애주반트의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 MHC 분자의 맥락에서 MAGEC2 면역원성 펩티드를 포함하는 다중(예를 들어, 2개 이상)의 안정한 MHC-펩티드 복합체 및 애주반트의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 기재된 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
본원에 개시된 약학적 조성물은 다음에 적합하게 된 것을 포함하여, 고체 또는 액체 형태로 투여하기 위해 특별히 제형화될 수 있다: (1) 경구 투여, 예를 들어 드렌치(수성 또는 비-수성 용액 또는 현탁액), 정제, 예를 들어 구강, 설하 및 전신 흡수를 목표로 하는 것들, 볼루스, 분말, 과립, 혀에 적용하는 페이스트; 또는 (2) 예를 들어, 멸균 용액 또는 현탁액, 또는 지속-방출 제형으로서, 예를 들어, 피하, 근육내, 정맥내 또는 경막외 주사에 의한 비경구 투여.
이들 제형 또는 조성물을 제조하는 방법은 본원에 기재된 MAGEC2 면역원성 펩티드 및/또는 핵산을 애주반트, 담체 및 선택적으로 하나 이상의 보조 성분과 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 본원에 기술된 제제를 액체 담체, 미분된 고체 담체, 또는 둘 모두와 균일하고 긴밀하게 회합시킨 다음, 필요한 경우 제품을 성형함으로써 제조된다.
비경구 투여에 적합한 약학적 조성물은 애주반트와 조합하여 본원에 기술된 MAGEC2 면역원성 펩티드 및/또는 핵산뿐만 아니라 하나 이상의 약학적으로-허용되는 멸균 등장성 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 또는 사용 직전에 멸균 주사용 용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는 멸균 분말을 포함하며, 여기에는 당, 알코올, 항산화제, 완충제, 정균제, 제형을 의도된 수용자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질 또는 현탁제 또는 증점제를 함유할 수 있다.
약학적 조성물에 이용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 및 에틸 올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
선택된 투여 경로에 관계없이, 적합한 수화된 형태로 사용될 수 있는 본원에 제공된 제제 및/또는 본원에 개시된 약학적 조성물은 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 약학적으로-허용되는 복용량 형태로 제형화된다.
일부 구체예에서, 기재된 약학적 조성물은 대상체에게 투여될 때 MAGEC2에 의해 감염된 세포에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 이러한 약학적 조성물은 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애의 예방적 및/또는 치료적 치료를 위한 백신 조성물로서 유용할 수 있다.
일부 구체예에서, 약학적 조성물은 생리학적으로 허용되는 애주반트를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 이용된 애주반트는 약학적 조성물의 증가된 면역원성을 제공한다. 이러한 추가적인 면역 반응 자극 화합물 또는 애주반트는 (i) 상기에서 정의한 바와 같은 펩티드를 재구성하고 선택적으로 오일-기반 애주반트를 사용하여 유화시킨 후 발명에 따른 약학적 조성물에 혼합될 수 있거나, (ii) 상기 정의된 발명의 재구성 조성물의 일부일 수 있거나, (iii) 재구성되는 펩티드(들)에 물리적으로 연결될 수 있거나 또는 (iv) 치료되는 대상체, 포유동물 또는 인간에게 별도로 투여될 수 있다. 애주반트는 항원의 느린 방출을 제공하는 것일 수 있거나(예를 들어, 애주반트는 리포솜일 수 있음), 그 자체로 면역원성이어서 항원(즉, MAGEC2 면역원성 펩티드에 존재하는 항원)과 상승적으로 작용하는 애주반트일 수 있다. 예를 들어, 애주반트는 항원 흡수를 촉진하거나, 투여의 부위에 면역계 세포를 동원하거나, 반응하는 림프 세포의 면역 활성화를 촉진하는 공지된 애주반트 또는 기타 물질일 수 있다. 애주반트는 면역조절 분자(예를 들어 사이토카인), 오일 및 물 에멀젼, 수산화알루미늄, 글루칸, 황산덱스트란, 산화철, 알긴산나트륨, 박토-애주반트, 합성 중합체 예컨데 폴리아미노산 및 아미노산의 공-중합체, 사포닌, 파라핀 오일, 및 무라밀 디펩티드를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구체예에서, 애주반트는 애주반트 65, α-GalCer, 인산알루미늄, 수산화알루미늄, 인산칼슘, β-글루칸 펩티드, CpG DNA, GM-CSF, GPI-0100, IFA, IFN-γ, IL-17, 지질 A, 지질다당류, Lipovant, Montanide, N-아세틸-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민, Pam3CSK4, quil A, 트레할로스 디미콜레이트 또는 자이모산이다.
일부 구체예에서, 애주반트는 면역조절 분자이다. 예를 들어, 면역조절 분자는 재조합 단백질 사이토카인, 케모카인, 또는 면역자극제 또는 사이토카인, 케모카인을 인코딩하는 핵산, 또는 면역학적 반응을 향상시키도록 설계된 면역자극제일 수 있다.
면역조절 사이토카인의 예는 인터페론(예를 들어, IFNα, IFNβ 및 IFNγ), 인터루킨(예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-17 및 IL-20), 종양 괴사 인자(예를 들어 TNFα 및 TNFβ), 에리스로포이에틴(EPO), FLT-3 리간드, gIp10, TCA-3, MCP-1, MIF, MIP-1.alpha., MIP-1β, Rantes, 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)뿐만 아니라 임의의 전술한 것의 기능적 단편을 포함한다.
일부 구체예에서, 케모카인 수용체, 즉 CXC, CC, C 또는 CX3C 케모카인 수용체에 결합하는 면역조절 케모카인도 본원에 제공된 조성물에 포함될 수 있다. 케모카인의 예는 Mip1α, Mip-1β, Mip-3α(Larc), Mip-3β, Rantes, Hcc-1, Mpif-1, Mpif-2, Mcp-1, Mcp-2, Mcp-3, Mcp-4, Mcp-5, Eotaxin, Tarc, Elc, I309, IL-8, Gcp-2 Gro-α, Gro-β, Gro-γ, Nap-2, Ena-78, Gcp-2 , Ip-10, Mig, I-Tac, Sdf-1 및 Bca-1(Blc)뿐만 아니라 임의의 전술한 것의 기능적 단편을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 구체예에서, 조성물은 MAGEC2 면역원성 펩티드를 인코딩하는 DNA 분자와 같이 본원에 기술된 MAGEC2 면역원성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 MAGEC2 면역원성 펩티드를 인코딩하는 개방 판독 프레임을 포함하는 발현 벡터를 포함한다.
세포(예를 들어 숙주 세포, 항원-제시 세포(APC) 예컨대 수지상 세포, 대식세포 등)에 의해 흡수될 때, DNA 분자는 염색체외 분자로 세포에 존재할 수 있고/있거나 염색체 안으로 통합될 수 있다. DNA는 별도의 유전 물질로 남아 있을 수 있는 플라스미드의 형태로 세포 안으로 도입될 수 있다. 대안적으로, 염색체 안으로 통합될 수 있는 선형 DNA가 세포 안으로 도입될 수 있다. 선택적으로, DNA를 세포 안으로 도입할 때 염색체 안으로 DNA 통합을 촉진하는 시약이 첨가될 수 있다.
V. 결합 단백질
일부 양태에서, 본원에 기술된 펩티드 및/또는 본원에 기술된 안정한 MHC-펩티드 복합체에 결합하는 결합 모이어티가 제공된다. 예를 들어, 약 10-4 M(예를 들어, 약 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 약 10-8, 약 10-9, 약 1010, 약 10-11, 약 10-12, 약 10-13, 약 10-14, 등) 이하의 Kd로 펩티드 및/또는 안정한 MHC-펩티드 복합체에 특이적으로 및/또는 선택적으로 결합하는 T 세포 수용체(TCR), 항체 등과 같은 결합 단백질이 제공된다.
본 발명에 포함되는 양태에서, MHC 분자(예를 들어, MHC 클래스 I 분자)의 맥락에서 MAGEC2 면역원성 펩티드를 포함하는 펩티드-MHC(pMHC) 복합체에 (예를 들어, 특이적으로 및/또는 선택적으로) 결합하는 결합 단백질이 본원에서 제공된다. 일부 구체예에서, 결합 단백질은 MAGEC2 펩티드-MHC (pMHC) 복합체에 약 5x10-4 M 이하, 약 1x10-4 M 이하, 약 5x10-5 M 이하, 또는 약 1x10-5 M 이하, 약 5x10-6 M 이하, 약 1x10-6 M 이하, 약 5x10-7 M 이하, 약 1x10-7 M 이하, 약 5x10-8 M 이하, 약 1x10-8 M 이하, 약 5x10-9 M 이하, 약 1x10-9 M 이하, 약 5x10-10 M 이하, 약 1x10-10 M 이하, 약 5x10-11 M 이하, 약 1x10-11 M 이하, 약 5x10-12 M 이하, 약 1x10-12 M 이하, 또는 심지어 그 미만, 또는 이들 사이의 임의의 포괄적 범위, 예를 들어, 약 1-50 마이크로몰, 1-100 마이크로몰, 0.1-500 마이크로몰 등의 Kd로 (예를 들어, 특이적으로 및/또는 선택적으로) 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, MHC 분자는 HLA-A*02, HLA-A*03, HLA-A*01, HLA-A*11, HLA-A*24 및/또는 HLA-B*07로 구성된 군으로부터 선택된 HLA 혈청형인 MHC 알파 사슬을 포함하며, 선택적으로 HLA 대립유전자는 HLA-A*0201, HLA-A*0202, HLA-A*0203, HLA-A*0204, HLA-A*0205, HLA-A*0206, HLA-A*0207, HLA-A*0210, HLA-A*0211, HLA-A*0212, HLA-A*0213, HLA-A*0214, HLA-A*0216, HLA-A*0217, HLA-A*0219, HLA-A*0220, HLA-A*0222, HLA-A*0224, HLA-A*0230, HLA-A*0242, HLA-A*0253, HLA-A*0260, HLA-A*0274 대립유전자, HLA-A*0301, HLA-A*0302, HLA-A*0305, HLA-A*0307, HLA-A*0101, HLA-A*0102, HLA-A*0103, HLA-A*0116 대립유전자, HLA-A*1101, HLA-A*1102, HLA-A*1103, HLA-A*1104, HLA-A*1105, HLA-A*1119 대립유전자, HLA-A*2402, HLA-A*2403, HLA-A*2405, HLA-A*2407, HLA-A*2408, HLA-A*2410, HLA-A*2414, HLA-A*2417, HLA-A*2420, HLA-A*2422, HLA-A*2425, HLA-A*2426, HLA-A*2458 대립유전자, HLA-B*0702, HLA-B*0704, HLA-B*0705, HLA-B*0709, HLA-B*0710, HLA-B*0715, 및 HLA-B*0721 대립유전자로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, HLA 혈청형은 HLA-B*07이고/이거나 HLA 대립유전자는 HLA-B*0702, HLA-B*0704, HLA-B*0705, HLA-B*0709, HLA-B*0710, HLA-B*0715 및 HLA-B*0721 대립유전자로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, HLA 대립유전자는 HLA-B*0702이다. 일부 구체예에서, HLA 혈청형은 HLA-A*24이고/이거나 HLA 대립유전자는 HLA-A*2402, HLA-A*2403, HLA-A*2405, HLA-A*2407, HLA-A*2408, HLA-A*2410, HLA-A*2414, HLA-A*2417, HLA-A*2420, HLA-A*2422, HLA-A*2425, HLA-A*2426 및 HLA-A*2458 대립유전자로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, HLA 대립유전자는 HLA-A*2402이다. 일부 구체예에서, 본원에 제공된 결합 단백질은 유전자 조작되고/거나 분리되고/거나 정제된다.
일부 구체예에서, 결합 단백질은 공지된 T-세포 수용체(예를 들어, van Kunert 등 (2016) J. Immunol. 197:2541-2552 또는 본원에 기재된 기타로부터의 TCR)보다 MAGEC2 펩티드-MHC(pMHC)에 대해 더 높은 결합 친화성을 갖는다. 예를 들어, 결합 단백질은 공지된 T-세포 수용체보다 MAGEC2 펩티드-MHC(pMHC)에 대한 적어도 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2.0배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 5.5배, 6배, 6.5배, 7배, 7.5배, 8배, 8.5배, 9배, 9.5배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배 19배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 1000배, 5000배, 10000배 , 50000배, 100000배, 500000배, 1000000배 이상, 또는 이들 사이의 임의의 포괄적 범위, 예를 들어, 1.2배 내지 2배 더 높은 결합 친화성을 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 결합 단백질은 특정 수준 이하로 MAGEC2의 발현을 갖는 표적 세포와 접촉될 때 공지된 T-세포 수용체보다 더 높은 T 세포 확장, 사이토카인 방출 및/또는 세포독성 사멸을 유도한다(예를 들어, 다양한 수준에서 MAGEC2를 발현하는 대표적인 세포주에 대한 실시예 섹션을 참조한다). 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 양태의 일부 구체예에서, MAGEC2 수준은 백만 당 전사체의 관점에서 표현될 수 있고, 예를 들어, 백만 전사체 당 약 1,000 전사체(TPM: transcript per million transcripts), 950 TPM, 900 TPM, 850 TPM, 800 TPM, 750 TPM, 700 TPM, 650 TPM, 600 TPM, 550 TPM, 500 TPM, 450 TPM, 400 TPM, 350 TPM, 300 TPM, 250 TPM, 200 TPM, 150 TPM, 100 TPM, 95 TPM, 90 TPM, 85 TPM, 80 TPM, 75 TPM, 70 TPM, 65 TPM, 60 TPM, 55 TPM, 50 TPM, 45 TPM, 40 TPM, 35 TPM, 34 TPM, 33 TPM, 32 TPM, 31 TPM, 30 TPM, 29 TPM, 28 TPM, 27 TPM, 26 TPM, 25 TPM, 24 TPM, 23 TPM, 22 TPM, 21 TPM, 20 TPM, 19 TPM, 18 TPM, 17 TPM, 16 TPM, 15 TPM 14 TPM, 13 TPM, 12 TPM, 11 TPM, 10 TPM, 9 TPM, 8 TPM, 7 TPM, 6 TPM, 5 TPM, 4 TPM, 3 TPM, 2 TPM, 및 1 TPM, 또는 이들 사이의 임의의 포괄적 범위, 예컨대, 약 1,000 TPM 이하 내지 약 73 TPM 이하일 수 있다. 본원에 추가로 기재된 바와 같이, TPM은 RNA-Seq와 같은 널리 공지된 기술에 따라 측정되고, 유전자 발현 TPM 데이터는 다양한 세포주, 조직 유형 등에 대해 당 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, The Broad Institute Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) on the World Wide Web at portals.broadinstitute.org 참조). 일부 구체예에서, 결합 단백질은 MAGEC2의 이형접합성 발현을 갖는 표적 세포와 접촉될 경우, 공지된 T-세포 수용체보다 적어도 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2.0배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 5.5배, 6배, 6.5배, 7배, 7.5배, 8배, 8.5배, 9배, 9.5배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배 19배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 1000배 이상, 또는 이들 사이의 임의의 포괄적 범위, 예를 들어, 1.2배 내지 2배 T 세포 확장, 사이토카인 방출 및/또는 세포독성 사멸 증가를 유도할 수 있다.
일부 구체예에서, MAGEC2의 발현은 RNA-시퀀싱(RNA-seq)을 사용하여 검출된다. RNA-seq는 일반적으로 하기 단계를 포함한다: 유전 물질을 함유하는 샘플을 수득하는 단계, 수득된 샘플로부터 총 RNA를 분리하는 단계, 총 RNA로부터 증폭된 cDNA 라이브러리를 제조하는 단계, 증폭된 cDNA 라이브러리를 시퀀싱하는 단계, 및 증폭된 cDNA를 분석 및 프로파일링하여 다양한 전사체의 발현 수준을 평가하는 단계. 샘플은 세포의 집단, 조직 샘플, 생검 샘플, 세포 배양물 또는 단일 세포일 수 있다. 총 RNA는 당 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 생물학적 샘플로부터 분리될 수 있다. 특정 구체예에서, 총 RNA는 혈장으로부터 추출된다. 혈장 RNA 추출은 문헌[Enders 등, "The Concentration of Circulating Corticotropin-Releasing Homer mRNA in Material Plasma Is Incclined in Preclampsia," Clinr]에 기술되어 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 원심분리 단계 후에 수집된 혈장을 Trizol LS 시약(Invitrogen) 및 클로로포름과 혼합한다. 혼합물을 원심분리하고 수성 층을 새로운 튜브로 옮긴다. 에탄올을 이 수성 층에 첨가한다. 이어서, 혼합물을 RNeasy 미니 컬럼(Qiagen)에 넣고 제조업체의 권고에 따라 가공한다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 RNA-seq는 총 RNA로부터 증폭된 cDNA를 제조하는 단계를 포함한다. 예를 들어, cDNA를 제조하고 분리된 RNA 샘플을 희석 없이 무작위로 증폭시키거나, 분리된 RNA에서 유전 물질의 혼합물을 개별 반응 샘플에 분산시킨다. 특정 구체예에서, 증폭은 mRNA 및 비-폴리아데닐화된 전사체 둘 모두를 증폭시키기 위해 샘플의 3' 말단에서 및 전체 전사체에 걸쳐 무작위로 개시된다. 이러한 방식으로, 이중-가닥 cDNA 증폭 생성물은 차세대 시퀀싱 플랫폼을 위한 시퀀싱 라이브러리의 생성에 최적화된다. 본 발명에 포함되는 방법에 의한 cDNA의 증폭에 적합한 키트는, 예를 들어, Ovation® RNA-Seq System을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 RNA-seq는 증폭된 cDNA를 시퀀싱하는 단계를 포함한다. 임의의 공지된 시퀀싱 방법을 사용하여 단일 분자 시퀀싱 방법을 포함하는 증폭된 cDNA 혼합물을 시퀀싱할 수 있다. 특정 구체예에서, 증폭된 cDNA는 전체 전사체 샷건 시퀀싱에 의해 시퀀싱된다. 전체 전사체 샷건 시퀀싱은 Illumina® Genome Analyzer 플랫폼, ABI SOLiD™ 시퀀싱 플랫폼, 또는 Life Science의 454 시퀀싱 플랫폼과 같은 다양한 차세대 시퀀싱 플랫폼을 사용하여 수행될 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 RNA-seq는 cDNA에 대한 디지털 카운팅 및 분석을 수행하는 것을 추가로 포함한다. 증폭된 샘플에서 각각의 전사체에 대한 증폭된 서열의 수는 서열 판독(증폭된 가닥 당 하나의 판독)에 의해 정량화될 수 있다. 일부 구체예에서, 백만 당 전사체(TPM)는 특정 전사체의 발현 수준을 정량화하는데 사용된다. TPM은 문헌 [Wagner 등 (2012) Theory in Biosciences 131:281-285]에 제시된 바와 같이 계산될 수 있으며, 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
특정 구체예에서, 결합 단백질은 특정 HLA 알파 사슬 대립유전자를 갖는 특정 HLA 분자와 같은 MHC 분자와의 복합체에서 MAGEC2 면역원성 펩티드를 인식한다. 예를 들어, 표 2A에 열거된 결합 단백질은 그 알파 사슬이 실시예 섹션에 추가로 기술된 바와 같이 HLA-B*0702, HLA-B*0704, HLA-B*0705, HLA-B*0709, HLA-B*0710, HLA-B*0715 및/또는 HLA-B*0721 대립유전자에 의해 인코딩되는 것과 같은 HLA-B*07 혈청형을 갖는 MHC와 회합하여 MAGEC2 면역원성 펩티드의 결합제로 식별되었다. 유사하게, 표 2B에 열거된 결합 단백질은 그 알파 사슬이 실시예 섹션에 추가로 기술된 바와 같이 HLA-A*2402, HLA-A*2403, HLA-A*2405, HLA-A*2407, HLA-A*2408, HLA-A*2410, HLA-A*2414, HLA-A*2417, HLA-A*2420, HLA-A*2422, HLA-A*2425, HLA-A*2426 및/또는 HLA-A*2458 대립유전자에 의해 인코딩되는 것과 같은 HLA-A*24 혈청형을 갖는 MHC와 회합하여 MAGEC2 면역원성 펩티드의 결합제로 식별되었다. 일부 구체예에서, 결합 단백질은 MAGEC2 면역원성 펩티드와 MHC 분자의 복합체를 인식하며, 여기서 MHC 분자는 HLA-A*02, HLA-A*03, HLA-A*01, HLA-A*11, HLA-A*24 및/또는 HLA-B*07로 구성된 군으로부터 선택된 HLA 혈청형인 MHC 알파 사슬을 포함하며, 선택적으로 HLA 대립유전자는 HLA-A*0201, HLA-A*0202, HLA-A*0203, HLA-A*0204, HLA-A*0205, HLA-A*0206, HLA-A*0207, HLA-A*0210, HLA-A*0211, HLA-A*0212, HLA-A*0213, HLA-A*0214, HLA-A*0216, HLA-A*0217, HLA-A*0219, HLA-A*0220, HLA-A*0222, HLA-A*0224, HLA-A*0230, HLA-A*0242, HLA-A*0253, HLA-A*0260, HLA-A*0274 대립유전자, HLA-A*0301, HLA-A*0302, HLA-A*0305, HLA-A*0307, HLA-A*0101, HLA-A*0102, HLA-A*0103, HLA-A*0116 대립유전자, HLA-A*1101, HLA-A*1102, HLA-A*1103, HLA-A*1104, HLA-A*1105, HLA-A*1119 대립유전자, HLA-A*2402, HLA-A*2403, HLA-A*2405, HLA-A*2407, HLA-A*2408, HLA-A*2410, HLA-A*2414, HLA-A*2417, HLA-A*2420, HLA-A*2422, HLA-A*2425, HLA-A*2426, HLA-A*2458 대립유전자, HLA-B*0702, HLA-B*0704, HLA-B*0705, HLA-B*0709, HLA-B*0710, HLA-B*0715, 및 HLA-B*0721 대립유전자로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, MAGEC2 면역원성 펩티드는 인간 MAGEC2 단백질 및/또는 표 3에 제시된 MAGEC2 단백질로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 MAGEC2 면역원성 펩티드는 단독으로 또는 애주반트와 조합하여 투여된다.
일부 구체예에서, 본원에 제공된 결합 단백질은 a) 표 2에 열거된 TCR 알파 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR 알파 사슬 서열에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 갖는 TCR 알파 사슬 서열; 및/또는 b) 표 2에 열거된 TCR 베타 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR 베타 사슬 서열에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 갖는 TCR 베타 사슬 서열을 포함한다 (예를 들어, 포함하거나, 필수적 요소로 하여 구성되거나, 구성된다).
일부 구체예에서, 본원에 제공된 결합 단백질은 a) 표 2에 열거된 TCR 알파 사슬 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR 알파 사슬 서열; 및/또는 b) 표 2에 열거된 TCR 베타 사슬 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR 베타 사슬 서열을 포함한다(예를 들어, 포함하거나, 필수적 요소로 하여 구성되거나, 구성된다).
일부 구체예에서, 본원에 제공된 결합 단백질은 a) 표 2에 열거된 TCR 알파 사슬 가변(Vα) 도메인 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR 알파 사슬 가변(Vα) 도메인 서열에 대해 적어도 약 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 갖는 TCR Vα 도메인 서열; 및/또는 b) 표 2에 열거된 TCR 베타 사슬 가변(Vβ) 도메인 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR 베타 사슬 가변(Vβ) 도메인 서열에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 갖는 TCR Vβ 도메인 서열을 갖는 TCR Vβ 도메인 서열을 포함한다 (예를 들어, 포함하거나, 필수적 요소로 하여 구성되거나, 구성된다).
일부 구체예에서, 본원에 제공된 결합 단백질은 a) 표 2에 열거된 TCR 알파 사슬 가변(Vα) 도메인 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR Vα 도메인 서열; 및/또는 b) 표 2에 열거된 TCR 베타 사슬 가변(Vβ) 도메인 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR Vβ 도메인 서열을 포함한다(예를 들어, 포함하거나, 필수적 요소로 하여 구성되거나, 구성된다).
일부 구체예에서, 본원에 제공된 결합 단백질은 표 2에 열거된 TCR 알파 사슬 상보성 결정 영역(CDR) 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR 알파 사슬 CDR 서열에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 동일성을 갖는 TCR 알파 사슬 CDR 서열을 (예를 들어, 적어도 하나(예를 들어, 1개, 2개 또는 3개, 예를 들어, CDR3 단독 또는 CDR1 및 CDR2와 조합하여) 포함하거나, 필수적 요로소 하여 구성되거나, 구성됨)을 포함한다. CDR3은 처리된 항원을 인식하는 주요 CDR인 것으로 여겨지며, CDR1 및 CDR2는 주로 MHC와 상호작용하는 것으로 여겨지며, 따라서 일부 구체예에서, 표 2에 열거된 TCR 알파 사슬로부터의 CDR3 단독 및/또는 TCR 베타로부터의 CDR3 단독을 포함하는 결합 단백질이 제공되며, 각각의 CDR3은 이 단락에서 인용된 바와 같은 서열 상동성을 갖는다.
일부 구체예에서, 본원에 제공된 결합 단백질은 표 2에 열거된 TCR 베타 사슬 상보성 결정 영역(CDR) 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR 베타 사슬 CDR 서열에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 동일성을 갖는 TCR 베타 사슬 CDR 서열을 (예를 들어, 적어도 하나(예를 들어, 1개, 2개 또는 3개, 예를 들어, CDR3 단독 또는 CDR1 및 CDR2와 조합하여)를 포함하거나, 필수적 요로소 하여 구성되거나, 구성됨) 또한 포함할 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, CDR3은 처리된 항원을 인식하는 주요 CDR인 것으로 여겨지며, CDR1 및 CDR2는 주로 MHC와 상호작용하는 것으로 여겨지며, 따라서 일부 구체예에서, 표 2에 열거된 TCR 베타 사슬로부터의 CDR3 단독 및/또는 TCR 알파 사슬로부터의 CDR3 단독을 포함하는 결합 단백질이 제공되며, 각각의 CDR3은 이 단락에서 인용된 바와 같은 서열 상동성을 갖는다.
일부 구체예에서, 본원에 제공된 결합 단백질은 표 2에 열거된 TCR 알파 사슬 상보성 결정 영역(CDR)을 (예를 들어, 적어도 하나(예를 들어, 1개, 2개 또는 3개) 포함하거나, 필수적 요소로 하여 구성되거나, 구성된다) 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에 제공된 결합 단백질은 표 2에 열거된 TCR 베타 사슬 상보성 결정 영역(CDR)을 (예를 들어, 적어도 하나(예를 들어, 1개, 2개 또는 3개) 포함하거나, 필수적 요소로 하여 구성되거나, 구성됨) 또한 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 제공된 결합 단백질은 표 2에 열거된 TCR 알파-사슬 불변 영역(Cα) 서열에 대한 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 동일성을 갖는 TCR Cα 서열을 포함한다(예를 들어, 포함하거나, 필수적 요소로 구성되거나, 구성된다).
일부 구체예에서, 본원에 제공된 결합 단백질은 표 2에 열거된 TCR 베타 사슬 불변 Cβ 서열에 대한 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 동일성을 갖는 TCR Cβ 서열을 또한 포함할 수 있다(예를 들어, 포함하거나, 필수적 요소로 하여 구성되거나, 구성된다).
일부 구체예에서, 본원에 제공된 결합 단백질은 표 2에 열거된 TCR 알파 사슬 불변 영역(Cα) 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR Cα 서열을 포함한다(예를 들어, 포함하거나, 필수적 요소 하여 구성되거나, 구성된다).
일부 구체예에서, 본원에 제공된 결합 단백질은 표 2에 열거된 TCR 베타 사슬 불변 영역(Cβ) 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR Cβ 서열을 또한 포함할 수 있다(예를 들어, 포함하거나, 필수적 요소 하여 구성되거나, 구성된다).
표 2: MAGEC2 항원을 인식하는 TCR 서열
표 2A
HLA 혈청형 HLA-B*07로 제시된 MAGEC2 항원을 인식하는 TCR 서열
MAGEC2 TCR 8-3 야생형 서열
알파 사슬:
TRAV24*01 F/TRAJ32*02/TRAC
알파 사슬 DNA 서열
ATGGAGAAGAATCCTTTGGCAGCCCCACTTCTTATCCTCTGGTTTCATCTTGACTGCGTGAGCAGCATTCTGAACGTGGAACAAAGTCCTCAGTCACTGCATGTTCAGGAGGGAGACAGCACCAATTTCACCTGCAGCTTCCCT TCCAGCAATTTTTATGCC CTTCACTGGTACAGATGGGAAACTGCAAAAAGCCCCGAGGCCTTGTTTGTT ATGACTCTTAATGGGGATGAA AAGAAGAAAGGACGCATTAGTGCCACTCTTAATACCAAGGAGGGTTACAGCTATTTGTATATCAAAGGATCCCAGCCTGAGGACTCAGCCACATACCTCTGT GCCTCCGGAAGTGGTGGTGCTACAAACAAGCTCATC TTTGGAACTGGCACTCTGCTTGCTGTCCAGCCAAatatccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctgagagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactgtgctagacatgaggtctatggacttcaagagcaacagtgctgtggcctggagcaacaaatctgactttgcatgtgcaaacgccttcaacaacagcattattccagaagacaccttcttccccagcccagaaagttcctgtgatgtcaagctggtcgagaaaagctttgaaacagatacgaacctaaactttcaaaacctgtcagtgattgggttccgaatcctcctcctgaaagtggccgggtttaatctgctcatgacgctgcggctgtggtccagc
알파 사슬 단백질 서열
MEKNPLAAPLLILWFHLDCVSSILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFP SSNFYA LHWYRWETAKSPEALFV MTLNGDE KKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPEDSATYLC ASGSGGATNKLI FGTGTLLAVQPniqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss
베타 사슬:
TRBV16*01/TRBJ1-1*01/TRBC1
베타 사슬 DNA 서열
ATGAGCCCAATTTTCACCTGCATCACAATCCTTTGTCTGCTGGCTGCAGGTTCTCCTGGTGAAGAAGTCGCCCAGACTCCAAAACATCTTGTCAGAGGGGAAGGACAGAAAGCAAAACTTTATTGTGCCCCAATT AAAGGACACAGTTAT GTTTTCTGGTACCAACAGGTCCTGAAAAACGAGTTCAAGTTCTTGATTTCC TTCCAGAATGAAAATGTC TTTGATGAAACAGGTATGCCCAAGGAAAGATTTTCAGCTAAGTGCCTCCCAAATTCACCCTGTAGCCTTGAGATCCAGGCTACTAAGCTTGAGGATTCAGCAGTGTATTTTTGT GCCAGCAGCCAATCACGGAGCCTTAGGGGCACTGAAGCTTTC TTTGGACAAGGCACCAGACTCACAGTTGTTGaggacctgaacaaggtgttcccacccgaggtcgctgtgtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggccacactggtgtgcctggccacaggcttcttccctgaccacgtggagctgagctggtgggtgaatgggaaggaggtgcacagtggggtcagcacggacccgcagcccctcaaggagcagcccgccctcaatgactccagatactgcctgagcagccgcctgagggtctcggccaccttctggcagaacccccgcaaccacttccgctgtcaagtccagttctacgggctctcggagaatgacgagtggacccaggatagggccaaacccgtcacccagatcgtcagcgccgaggcctggggtagagcagactgtggctttacctcggtgtcctaccagcaaggggtcctgtctgccaccatcctctatgagatcctgctagggaaggccaccctgtatgctgtgctggtcagcgcccttgtgttgatggccatggtcaagagaaaggatttc
베타 사슬 단백질 서열
MSPIFTCITILCLLAAGSPGEEVAQTPKHLVRGEGQKAKLYCAPI KGHSY VFWYQQVLKNEFKFLIS FQNENV FDETGMPKERFSAKCLPNSPCSLEIQATKLEDSAVYFC ASSQSRSLRGTEAF FGQGTRLTVVEdlnkvfppevavfepseaeishtqkatlvclatgffpdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgradcgftsvsyqqgvlsatilyeillgkatlyavlvsalvlmamvkrkdf
MAGEC2 TCR 8-3 HM 코돈 최적화된 서열
알파 사슬:
TRAV24*01 F/TRAJ32*02/코돈-최적화된 마우스 TRAC
알파 사슬 DNA 서열
ATGGAGAAGAATCCTTTGGCAGCCCCACTTCTTATCCTCTGGTTTCATCTTGACTGCGTGAGCAGCATTCTGAACGTGGAACAAAGTCCTCAGTCACTGCATGTTCAGGAGGGAGACAGCACCAATTTCACCTGCAGCTTCCCT TCCAGCAATTTTTATGCC CTTCACTGGTACAGATGGGAAACTGCAAAAAGCCCCGAGGCCTTGTTTGTT ATGACTCTTAATGGGGATGAA AAGAAGAAAGGACGCATTAGTGCCACTCTTAATACCAAGGAGGGTTACAGCTATTTGTATATCAAAGGATCCCAGCCTGAGGACTCAGCCACATACCTCTGT GCCTCCGGAAGTGGTGGTGCTACAAACAAGCTCATC TTTGGAACTGGCACTCTGCTTGCTGTCCAGCCAAacattcaaaacccagaacccgccgtctaccagctgaaagacccgaggtctcaagactctacgttgtgcttgttcaccgatttcgacagtcagataaatgtgcctaagaccatggagagtggcactttcatcactgacaaatgtgtgttggacatgaaggctatggacagcaagtcaaacggcgcgattgcttggtccaaccaaacttctttcacgtgccaggacatcttcaaggagacaaacgccacctatccatcctctgatgttccgtgcgatgcgactcttaccgagaaaagcttcgagacggacatgaacttgaacttccaaaacctgcttgtgatggtactgcgaatacttcttcttaaggtggcgggcttcaatttgctcatgacactcagactttggtctagc
알파 사슬 단백질 서열
MEKNPLAAPLLILWFHLDCVSSILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFP SSNFYA LHWYRWETAKSPEALFV MTLNGDE KKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPEDSATYLC ASGSGGATNKLI FGTGTLLAVQPNiqnpepavyqlkdprsqdstlclftdfdsqinvpktmesgtfitdkcvldmkamdsksngaiawsnqtsftcqdifketnatypssdvpcdatlteksfetdmnlnfqnllvmvlrilllkvagfnllmtlrlwss
베타 사슬:
TRBV16*01/TRBJ1-1*01/코돈-최적화된 마우스 TRBC
베타 사슬 DNA 서열
ATGAGCCCAATTTTCACCTGCATCACAATCCTTTGTCTGCTGGCTGCAGGTTCTCCTGGTGAAGAAGTCGCCCAGACTCCAAAACATCTTGTCAGAGGGGAAGGACAGAAAGCAAAACTTTATTGTGCCCCAATT AAAGGACACAGTTA TGTTTTCTGGTACCAACAGGTCCTGAAAAACGAGTTCAAGTTCTTGATTTCC TTCCAGAATGAAAATGTC TTTGATGAAACAGGTATGCCCAAGGAAAGATTTTCAGCTAAGTGCCTCCCAAATTCACCCTGTAGCCTTGAGATCCAGGCTACTAAGCTTGAGGATTCAGCAGTGTATTTTTGT GCCAGCAGCCAATCACGGAGCCTTAGGGGCACTGAAGCTTTC TTTGGACAAGGCACCAGACTCACAGTTGTTGaagatcttcgaaacgtaacccctccaaaagtgagtctctttgaaccgagtaaggctgagatcgcgaacaaacaaaaggcgaccctcgtctgtcttgcgcgaggattttttcccgaccacgtggagttgtcttggtgggtaaacggtaaggaagtacacagcggtgtttgcaccgaccctcaagcctacaaggaatctaactattcatactgcctttcatcccgacttagggtttctgctaccttttggcacaatccgaggaatcactttaggtgtcaagtacagttccacggattgtcagaggaggataaatggccggagggctccccgaagccggttacgcagaacattagtgcggaagcctggggacgagcagactgcggtatcacgtctgccagctatcagcaaggcgttctgtcagcgacaattctgtacgaaatacttttgggtaaggctacattgtatgcggtattggtgtctacgctggtagtcatggccatggtgaaacgaaaaaactca
베타 사슬 단백질 서열
MSPIFTCITILCLLAAGSPGEEVAQTPKHLVRGEGQKAKLYCAPI KGHSY VFWYQQVLKNEFKFLIS FQNENV FDETGMPKERFSAKCLPNSPCSLEIQATKLEDSAVYFC ASSQSRSLRGTEAF FGQGTRLTVVEdlrnvtppkvslfepskaeiankqkatlvclargffpdhvelswwvngkevhsgvctdpqaykesnysyclssrlrvsatfwhnprnhfrcqvqfhglseedkwpegspkpvtqnisaeawgradcgitsasyqqgvlsatilyeillgkatlyavlvstlvvmamvkrkns
완전 베타 및 알파 ORF DNA 서열 ("Furin-P2A" 부위에서 밑줄 친 이탤릭체 영역은 단일 카세트에서 2개의 폴리펩티드 사슬의 발현을 허용하는 서열을 인코딩한다")
ATGAGCCCAATTTTCACCTGCATCACAATCCTTTGTCTGCTGGCTGCAGGTTCTCCTGGTGAAGAAGTCGCCCAGACTCCAAAACATCTTGTCAGAGGGGAAGGACAGAAAGCAAAACTTTATTGTGCCCCAATT AAAGGACACAGTTAT GTTTTCTGGTACCAACAGGTCCTGAAAAACGAGTTCAAGTTCTTGATTTCC TTCCAGAATGAAAATGTC TTTGATGAAACAGGTATGCCCAAGGAAAGATTTTCAGCTAAGTGCCTCCCAAATTCACCCTGTAGCCTTGAGATCCAGGCTACTAAGCTTGAGGATTCAGCAGTGTATTTTTGT GCCAGCAGCCAATCACGGAGCCTTAGGGGCACTGAAGCTTTC TTTGGACAAGGCACCAGACTCACAGTTGTTGaagatcttcgaaacgtaacccctccaaaagtgagtctctttgaaccgagtaaggctgagatcgcgaacaaacaaaaggcgaccctcgtctgtcttgcgcgaggattttttcccgaccacgtggagttgtcttggtgggtaaacggtaaggaagtacacagcggtgtttgcaccgaccctcaagcctacaaggaatctaactattcatactgcctttcatcccgacttagggtttctgctaccttttggcacaatccgaggaatcactttaggtgtcaagtacagttccacggattgtcagaggaggataaatggccggagggctccccgaagccggttacgcagaacattagtgcggaagcctggggacgagcagactgcggtatcacgtctgccagctatcagcaaggcgttctgtcagcgacaattctgtacgaaatacttttgggtaaggctacattgtatgcggtattggtgtctacgctggtagtcatggccatggtgaaacgaaaaaactca agagccaaaagaagcgggagcggtgcgacaaactttagcctgttgaaacaagccggcgacgttgaagagaaccccggacct ATGGAGAAGAATCCTTTGGCAGCCCCACTTCTTATCCTCTGGTTTCATCTTGACTGCGTGAGCAGCATTCTGAACGTGGAACAAAGTCCTCAGTCACTGCATGTTCAGGAGGGAGACAGCACCAATTTCACCTGCAGCTTCCCT TCCAGCAATTTTTATGCC CTTCACTGGTACAGATGGGAAACTGCAAAAAGCCCCGAGGCCTTGTTTGTT ATGACTCTTAATGGGGATGAA AAGAAGAAAGGACGCATTAGTGCCACTCTTAATACCAAGGAGGGTTACAGCTATTTGTATATCAAAGGATCCCAGCCTGAGGACTCAGCCACATACCTCTGT GCCTCCGGAAGTGGTGGTGCTACAAACAAGCTCATC TTTGGAACTGGCACTCTGCTTGCTGTCCAGCCAAacattcaaaacccagaacccgccgtctaccagctgaaagacccgaggtctcaagactctacgttgtgcttgttcaccgatttcgacagtcagataaatgtgcctaagaccatggagagtggcactttcatcactgacaaatgtgtgttggacatgaaggctatggacagcaagtcaaacggcgcgattgcttggtccaaccaaacttctttcacgtgccaggacatcttcaaggagacaaacgccacctatccatcctctgatgttccgtgcgatgcgactcttaccgagaaaagcttcgagacggacatgaacttgaacttccaaaacctgcttgtgatggtactgcgaatacttcttcttaaggtggcgggcttcaatttgctcatgacactcagactttggtctagc
완전 베타 및 알파 ORF 단백질 서열 ("Furin-P2A" 부위의 밑줄 친 이탤릭체 영역은 단일 카세트에서 2개의 폴리펩티드 사슬의 발현을 허용한다")")
MSPIFTCITILCLLAAGSPGEEVAQTPKHLVRGEGQKAKLYCAPI KGHSY VFWYQQVLKNEFKFLISFQNENVFDETGMPKERFSAKCLPNSPCSLEIQATKLEDSAVYFC ASSQSRSLRGTEAF FGQGTRLTVVEdlrnvtppkvslfepskaeiankqkatlvclargffpdhvelswwvngkevhsgvctdpqaykesnysyclssrlrvsatfwhnprnhfrcqvqfhglseedkwpegspkpvtqnisaeawgradcgitsasyqqgvlsatilyeillgkatlyavlvstlvvmamvkrkns rakrsgsgatnfsllkqagdveenpgp MEKNPLAAPLLILWFHLDCVSSILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFP SSNFYA LHWYRWETAKSPEALFV MTLNGDE KKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPEDSATYLC ASGSGGATNKLI FGTGTLLAVQPNiqnpepavyqlkdprsqdstlclftdfdsqinvpktmesgtfitdkcvldmkamdsksngaiawsnqtsftcqdifketnatypssdvpcdatlteksfetdmnlnfqnllvmvlrilllkvagfnllmtlrlwss
MAGEC2 TCR 8-3 MGTM 코돈 최적화된 서열
알파 사슬:
TRAV24*01 F/TRAJ32*02/MGTM 변형된 TRAC
알파 사슬 DNA 서열
ATGGAGAAGAATCCTTTGGCAGCCCCACTTCTTATCCTCTGGTTTCATCTTGACTGCGTGAGCAGCATTCTGAACGTGGAACAAAGTCCTCAGTCACTGCATGTTCAGGAGGGAGACAGCACCAATTTCACCTGCAGCTTCCCT TCCAGCAATTTTTATGCC CTTCACTGGTACAGATGGGAAACTGCAAAAAGCCCCGAGGCCTTGTTTGTT ATGACTCTTAATGGGGATGAA AAGAAGAAAGGACGCATTAGTGCCACTCTTAATACCAAGGAGGGTTACAGCTATTTGTATATCAAAGGATCCCAGCCTGAGGACTCAGCCACATACCTCTGT GCCTCCGGAAGTGGTGGTGCTACAAACAAGCTCATC TTTGGAACTGGCACTCTGCTTGCTGTCCAGCCAAacatccagaaccccgaccccgccgtgtaccagctgagggactccaagtccagcgacaagagcgtgtgtctgtttacggacttcgacagccagaccaacgtgagtcaaagcaaggacagcgacgtctacataacggataagaccgtgctggacatgcggagcatggacttcaagagcaacagcgccgtggcctggtccaacaagagcgacttcgcctgcgccaacgccttcaacaacagcatcatccccgaggacaccttcttccccagcagcgacgtgccctgcgacgtgaaactggtggagaagtccttcgagacagacaccaatctgaactttcagaacctgctggtgatcgtgctgcggattctgctgctgaaagtggccggcttcaatctgctgatgaccctgcggctgtggagcagc
알파 사슬 단백질 서열
MEKNPLAAPLLILWFHLDCVSSILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFP SSNFYA LHWYRWETAKSPEALFV MTLNGDE KKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPEDSATYLC ASGSGGATNKLI FGTGTLLAVQPNiqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpssdvpcdvklveksfetdtnlnfqnllvivlrilllkvagfnllmtlrlwss
베타 사슬:
TRBV16*01/TRBJ1-1*01/ MGTM 변형된 TRBC
베타 사슬 DNA 서열
ATGAGCCCAATTTTCACCTGCATCACAATCCTTTGTCTGCTGGCTGCAGGTTCTCCTGGTGAAGAAGTCGCCCAGACTCCAAAACATCTTGTCAGAGGGGAAGGACAGAAAGCAAAACTTTATTGTGCCCCAATT AAAGGACACAGTTA TGTTTTCTGGTACCAACAGGTCCTGAAAAACGAGTTCAAGTTCTTGATTTCC TTCCAGAATGAAAATGTC TTTGATGAAACAGGTATGCCCAAGGAAAGATTTTCAGCTAAGTGCCTCCCAAATTCACCCTGTAGCCTTGAGATCCAGGCTACTAAGCTTGAGGATTCAGCAGTGTATTTTTGT GCCAGCAGCCAATCACGGAGCCTTAGGGGCACTGAAGCTTTC TTTGGACAAGGCACCAGACTCACAGTTGTTGaagatctgaacaaggtgttccctccagaggtggccgtgttcgagccttctaaggccgagatcgcccacacacaaaaagccaccctcgtgtgcctggccaccggctttttccccgaccacgtggaactgtcttggtgggtcaacggcaaagaggtgcactccggcgtgtcaacggatccccagcctctgaaagaacagcctgccctgaacgacagccggtactgcctgagctccagactgagagtgtccgccaccttctggcagaacccccggaaccacttcagatgccaggtgcagttttacggcctgagcgagaacgacgagtggacccaggacagagccaagcccgtgacacaaatcgtgtctgccgaagcctggggaagagccgattgcggcatcaccagcgcctcctatcaccagggcgtgctgagcgccacaatcctgtacgaaatcctgctgggcaaggccaccctgtacgccgtgctggtgtctgctctggtgctgatggccatggtcaagcggaaggacttt
베타 사슬 단백질 서열
MSPIFTCITILCLLAAGSPGEEVAQTPKHLVRGEGQKAKLYCAPI KGHSY VFWYQQVLKNEFKFLIS FQNENV FDETGMPKERFSAKCLPNSPCSLEIQATKLEDSAVYFC ASSQSRSLRGTEAF FGQGTRLTVVEdlnkvfppevavfepskaeiahtqkatlvclatgffpdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgradcgitsasyhqgvlsatilyeillgkatlyavlvsalvlmamvkrkdf
완전 베타 및 알파 ORF DNA 서열
ATGAGCCCAATTTTCACCTGCATCACAATCCTTTGTCTGCTGGCTGCAGGTTCTCCTGGTGAAGAAGTCGCCCAGACTCCAAAACATCTTGTCAGAGGGGAAGGACAGAAAGCAAAACTTTATTGTGCCCCAATT AAAGGACACAGTTAT GTTTTCTGGTACCAACAGGTCCTGAAAAACGAGTTCAAGTTCTTGATTTCC TTCCAGAATGAAAATGTC TTTGATGAAACAGGTATGCCCAAGGAAAGATTTTCAGCTAAGTGCCTCCCAAATTCACCCTGTAGCCTTGAGATCCAGGCTACTAAGCTTGAGGATTCAGCAGTGTATTTTTGT GCCAGCAGCCAATCACGGAGCCTTAGGGGCACTGAAGCTTTC TTTGGACAAGGCACCAGACTCACAGTTGTTGaagatctgaacaaggtgttccctccagaggtggccgtgttcgagccttctaaggccgagatcgcccacacacaaaaagccaccctcgtgtgcctggccaccggctttttccccgaccacgtggaactgtcttggtgggtcaacggcaaagaggtgcactccggcgtgtcaacggatccccagcctctgaaagaacagcctgccctgaacgacagccggtactgcctgagctccagactgagagtgtccgccaccttctggcagaacccccggaaccacttcagatgccaggtgcagttttacggcctgagcgagaacgacgagtggacccaggacagagccaagcccgtgacacaaatcgtgtctgccgaagcctggggaagagccgattgcggcatcaccagcgcctcctatcaccagggcgtgctgagcgccacaatcctgtacgaaatcctgctgggcaaggccaccctgtacgccgtgctggtgtctgctctggtgctgatggccatggtcaagcggaaggactttggcagcggc agagccaaaagaagcgggagcggtgcgacaaactttagcctgttgaaacaagccggcgacgttgaagagaaccccggacct ATGGAGAAGAATCCTTTGGCAGCCCCACTTCTTATCCTCTGGTTTCATCTTGACTGCGTGAGCAGCATTCTGAACGTGGAACAAAGTCCTCAGTCACTGCATGTTCAGGAGGGAGACAGCACCAATTTCACCTGCAGCTTCCCT TCCAGCAATTTTTATGCC CTTCACTGGTACAGATGGGAAACTGCAAAAAGCCCCGAGGCCTTGTTTGTT ATGACTCTTAATGGGGATGAA AAGAAGAAAGGACGCATTAGTGCCACTCTTAATACCAAGGAGGGTTACAGCTATTTGTATATCAAAGGATCCCAGCCTGAGGACTCAGCCACATACCTCTGT GCCTCCGGAAGTGGTGGTGCTACAAACAAGCTCATC TTTGGAACTGGCACTCTGCTTGCTGTCCAGCCAAacatccagaaccccgaccccgccgtgtaccagctgagggactccaagtccagcgacaagagcgtgtgtctgtttacggacttcgacagccagaccaacgtgagtcaaagcaaggacagcgacgtctacataacggataagaccgtgctggacatgcggagcatggacttcaagagcaacagcgccgtggcctggtccaacaagagcgacttcgcctgcgccaacgccttcaacaacagcatcatccccgaggacaccttcttccccagcagcgacgtgccctgcgacgtgaaactggtggagaagtccttcgagacagacaccaatctgaactttcagaacctgctggtgatcgtgctgcggattctgctgctgaaagtggccggcttcaatctgctgatgaccctgcggctgtggagcagc
완전 베타 및 알파 ORF 단백질 서열
MSPIFTCITILCLLAAGSPGEEVAQTPKHLVRGEGQKAKLYCAPI KGHSY VFWYQQVLKNEFKFLIS FQNENV FDETGMPKERFSAKCLPNSPCSLEIQATKLEDSAVYFC ASSQSRSLRGTEAF FGQGTRLTVVEdlnkvfppevavfepskaeiahtqkatlvclatgffpdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgradcgitsasyhqgvlsatilyeillgkatlyavlvsalvlmamvkrkdf gsgrakrsgsgatnfsllkqagdveenpgp MEKNPLAAPLLILWFHLDCVSSILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFP SSNFYA LHWYRWETAKSPEALFV MTLNGDE KKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPEDSATYLC ASGSGGATNKLI FGTGTLLAVQPNiqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpssdvpcdvklveksfetdtnlnfqnllvivlrilllkvagfnllmtlrlwss
표 2B
HLA 혈청형 HLA-A*24에 의해 제시된 MAGEC2 항원을 인식하는 TCR 서열
MAGEC2 TCR 4-58 야생형 서열
알파 사슬:
TRAV10/TRAJ39/TRAC
알파 사슬 DNA 서열
ATGAAAAAGCATCTGACGACCTTCTTGGTGATTTTGTGGCTTTATTTTTATAGGGGGAATGGCAAAAACCAAGTGGAGCAGAGTCCTCAGTCCCTGATCATCCTGGAGGGAAAGAACTGCACTCTTCAATGCAATTATACA GTGAGCCCCTTCAGCAAC TTAAGGTGGTATAAGCAAGATACGGGGAGAGGTCCTGTTTCCCTGACAATC ATGACTTTCAGTGAGAACACA AAGTCGAACGGAAGATATACAGCAACTCTGGATGCAGACACAAAGCAAAGCTCTCTGCACATCACAGCCTCCCAGCTCAGCGATTCAGCCTCCTACATC tgcGTCGTGTCTGCCCGCAACGCAGGTAACATGCTTACATTC GGAGGGGGAACAAGGTTAATGGTCAAACCCCatatccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctgagagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactgtgctagacatgaggtctatggacttcaagagcaacagtgctgtggcctggagcaacaaatctgactttgcatgtgcaaacgccttcaacaacagcattattccagaagacaccttcttccccagcccagaaagttcctgtgatgtcaagctggtcgagaaaagctttgaaacagatacgaacctaaactttcaaaacctgtcagtgattgggttccgaatcctcctcctgaaagtggccgggtttaatctgctcatgacgctgcggctgtggtccagc
알파 사슬 단백질 서열
MKKHLTTFLVILWLYFYRGNGKNQVEQSPQSLIILEGKNCTLQCNYT VSPFSN LRWYKQDTGRGPVSLTI MTFSENT KSNGRYTATLDADTKQSSLHITASQLSDSASYI CVVSARNAGNMLTF GGGTRLMVKPHiqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss
베타 사슬:
TRBV27/TRAB2-1/TRBC1
베타 사슬 DNA 서열
ATGGGCCCCCAGCTCCTTGGCTATGTGGTCCTTTGCCTTCTAGGAGCAGGCCCCCTGGAAGCCCAAGTGACCCAGAACCCAAGATACCTCATCACAGTGACTGGAAAGAAGTTAACAGTGACTTGTTCTCAGAAT ATGAACCATGAGTAT ATGTCCTGGTATCGACAAGACCCAGGGCTGGGCTTAAGGCAGATCTACTAT TCAATGAATGTTGAGGTG ACTGATAAGGGAGATGTTCCTGAAGGGTACAAAGTCTCTCGAAAAGAGAAGAGGAATTTCCCCCTGATCCTGGAGTCGCCCAGCCCCAACCAGACCTCTCTGTACTTCTGTGCC tgCGCTAGTAGCTTCGGCACCAGCGGTCGCGGTGAACAGTTTTTC GGGCCAGGGACACGGCTCACCGTGCTAGaggacctgaacaaggtgttcccacccgaggtcgctgtgtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggccacactggtgtgcctggccacaggcttcttccctgaccacgtggagctgagctggtgggtgaatgggaaggaggtgcacagtggggtcagcacggacccgcagcccctcaaggagcagcccgccctcaatgactccagatactgcctgagcagccgcctgagggtctcggccaccttctggcagaacccccgcaaccacttccgctgtcaagtccagttctacgggctctcggagaatgacgagtggacccaggatagggccaaacccgtcacccagatcgtcagcgccgaggcctggggtagagcagactgtggctttacctcggtgtcctaccagcaaggggtcctgtctgccaccatcctctatgagatcctgctagggaaggccaccctgtatgctgtgctggtcagcgcccttgtgttgatggccatggtcaagagaaaggatttc
베타 사슬 단백질 서열
MGPQLLGYVVLCLLGAGPLEAQVTQNPRYLITVTGKKLTVTCSQN MNHEY MSWYRQDPGLGLRQIYY SMNVEV TDKGDVPEGYKVSRKEKRNFPLILESPSPNQTSLYFCA CASSFGTSGRGEQFF GPGTRLTVLEdlnkvfppevavfepseaeishtqkatlvclatgffpdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgradcgftsvsyqqgvlsatilyeillgkatlyavlvsalvlmamvkrkdf
MAGEC2 TCR 4-58 HM 코돈 최적화된 서열
알파 사슬:
TRAV10/TRAJ39/코돈-최적화된 마우스 TRAC
알파 사슬 DNA 서열
ATGAAAAAGCATCTGACGACCTTCTTGGTGATTTTGTGGCTTTATTTTTATAGGGGGAATGGCAAAAACCAAGTGGAGCAGAGTCCTCAGTCCCTGATCATCCTGGAGGGAAAGAACTGCACTCTTCAATGCAATTATACA GTGAGCCCCTTCAGCAAC TTAAGGTGGTATAAGCAAGATACGGGGAGAGGTCCTGTTTCCCTGACAATC ATGACTTTCAGTGAGAACACA AAGTCGAACGGAAGATATACAGCAACTCTGGATGCAGACACAAAGCAAAGCTCTCTGCACATCACAGCCTCCCAGCTCAGCGATTCAGCCTCCTACATC tgcGTCGTGTCTGCCCGCAACGCAGGTAACATGCTTACATTC GGAGGGGGAACAAGGTTAATGGTCAAACCCCatattcaaaacccagaacccgccgtctaccagctgaaagacccgaggtctcaagactctacgttgtgcttgttcaccgatttcgacagtcagataaatgtgcctaagaccatggagagtggcactttcatcactgacaaatgtgtgttggacatgaaggctatggacagcaagtcaaacggcgcgattgcttggtccaaccaaacttctttcacgtgccaggacatcttcaaggagacaaacgccacctatccatcctctgatgttccgtgcgatgcgactcttaccgagaaaagcttcgagacggacatgaacttgaacttccaaaacctgcttgtgatggtactgcgaatacttcttcttaaggtggcgggcttcaatttgctcatgacactcagactttggtctagc
알파 사슬 단백질 서열
MKKHLTTFLVILWLYFYRGNGKNQVEQSPQSLIILEGKNCTLQCNYT VSPFSN LRWYKQDTGRGPVSLTI MTFSENT KSNGRYTATLDADTKQSSLHITASQLSDSASYI CVVSARNAGNMLTF GGGTRLMVKPHiqnpepavyqlkdprsqdstlclftdfdsqinvpktmesgtfitdkcvldmkamdsksngaiawsnqtsftcqdifketnatypssdvpcdatlteksfetdmnlnfqnllvmvlrilllkvagfnllmtlrlwss
베타 사슬:
TRBV27/TRAB2-1/코돈-최적화된 마우스 TRBC
베타 사슬 DNA 서열
ATGGGCCCCCAGCTCCTTGGCTATGTGGTCCTTTGCCTTCTAGGAGCAGGCCCCCTGGAAGCCCAAGTGACCCAGAACCCAAGATACCTCATCACAGTGACTGGAAAGAAGTTAACAGTGACTTGTTCTCAGAAT ATGAACCATGAGTAT ATGTCCTGGTATCGACAAGACCCAGGGCTGGGCTTAAGGCAGATCTACTAT TCAATGAATGTTGAGGTG ACTGATAAGGGAGATGTTCCTGAAGGGTACAAAGTCTCTCGAAAAGAGAAGAGGAATTTCCCCCTGATCCTGGAGTCGCCCAGCCCCAACCAGACCTCTCTGTACTTCTGTGCC tgCGCTAGTAGCTTCGGCACCAGCGGTCGCGGTGAACAGTTTTTC GGGCCAGGGACACGGCTCACCGTGCTAGaagatcttcgaaacgtaacccctccaaaagtgagtctctttgaaccgagtaaggctgagatcgcgaacaaacaaaaggcgaccctcgtctgtcttgcgcgaggattttttcccgaccacgtggagttgtcttggtgggtaaacggtaaggaagtacacagcggtgtttgcaccgaccctcaagcctacaaggaatctaactattcatactgcctttcatcccgacttagggtttctgctaccttttggcacaatccgaggaatcactttaggtgtcaagtacagttccacggattgtcagaggaggataaatggccggagggctccccgaagccggttacgcagaacattagtgcggaagcctggggacgagcagactgcggtatcacgtctgccagctatcagcaaggcgttctgtcagcgacaattctgtacgaaatacttttgggtaaggctacattgtatgcggtattggtgtctacgctggtagtcatggccatggtgaaacgaaaaaactca
베타 사슬 단백질 서열
MGPQLLGYVVLCLLGAGPLEAQVTQNPRYLITVTGKKLTVTCSQN MNHEY MSWYRQDPGLGLRQIYY SMNVEV TDKGDVPEGYKVSRKEKRNFPLILESPSPNQTSLYFCA CASSFGTSGRGEQFF GPGTRLTVLEdlrnvtppkvslfepskaeiankqkatlvclargffpdhvelswwvngkevhsgvctdpqaykesnysyclssrlrvsatfwhnprnhfrcqvqfhglseedkwpegspkpvtqnisaeawgradcgitsasyqqgvlsatilyeillgkatlyavlvstlvvmamvkrkns
완전 베타 및 알파 ORF DNA 서열 ("Furin-P2A" 부위의 밑줄 친 이탤릭체 영역은 단일 카세트에서 2개의 폴리펩티드 사슬의 발현을 허용하는 서열을 인코딩한다")
ATGGGCCCCCAGCTCCTTGGCTATGTGGTCCTTTGCCTTCTAGGAGCAGGCCCCCTGGAAGCCCAAGTGACCCAGAACCCAAGATACCTCATCACAGTGACTGGAAAGAAGTTAACAGTGACTTGTTCTCAGAAT ATGAACCATGAGTAT ATGTCCTGGTATCGACAAGACCCAGGGCTGGGCTTAAGGCAGATCTACTAT TCAATGAATGTTGAGGTG ACTGATAAGGGAGATGTTCCTGAAGGGTACAAAGTCTCTCGAAAAGAGAAGAGGAATTTCCCCCTGATCCTGGAGTCGCCCAGCCCCAACCAGACCTCTCTGTACTTCTGTGCC tgCGCTAGTAGCTTCGGCACCAGCGGTCGCGGTGAACAGTTTTTC GGGCCAGGGACACGGCTCACCGTGCTAGaagatcttcgaaacgtaacccctccaaaagtgagtctctttgaaccgagtaaggctgagatcgcgaacaaacaaaaggcgaccctcgtctgtcttgcgcgaggattttttcccgaccacgtggagttgtcttggtgggtaaacggtaaggaagtacacagcggtgtttgcaccgaccctcaagcctacaaggaatctaactattcatactgcctttcatcccgacttagggtttctgctaccttttggcacaatccgaggaatcactttaggtgtcaagtacagttccacggattgtcagaggaggataaatggccggagggctccccgaagccggttacgcagaacattagtgcggaagcctggggacgagcagactgcggtatcacgtctgccagctatcagcaaggcgttctgtcagcgacaattctgtacgaaatacttttgggtaaggctacattgtatgcggtattggtgtctacgctggtagtcatggccatggtgaaacgaaaaaactca agagccaaaagaagcgggagcggtgcgacaaactttagcctgttgaaacaagccggcgacgttgaagagaaccccggacct ATGAAAAAGCATCTGACGACCTTCTTGGTGATTTTGTGGCTTTATTTTTATAGGGGGAATGGCAAAAACCAAGTGGAGCAGAGTCCTCAGTCCCTGATCATCCTGGAGGGAAAGAACTGCACTCTTCAATGCAATTATACA GTGAGCCCCTTCAGCAAC TTAAGGTGGTATAAGCAAGATACGGGGAGAGGTCCTGTTTCCCTGACAATC ATGACTTTCAGTGAGAACACA AAGTCGAACGGAAGATATACAGCAACTCTGGATGCAGACACAAAGCAAAGCTCTCTGCACATCACAGCCTCCCAGCTCAGCGATTCAGCCTCCTACATC tgcGTCGTGTCTGCCCGCAACGCAGGTAACATGCTTACATTC GGAGGGGGAACAAGGTTAATGGTCAAACCCCatattcaaaacccagaacccgccgtctaccagctgaaagacccgaggtctcaagactctacgttgtgcttgttcaccgatttcgacagtcagataaatgtgcctaagaccatggagagtggcactttcatcactgacaaatgtgtgttggacatgaaggctatggacagcaagtcaaacggcgcgattgcttggtccaaccaaacttctttcacgtgccaggacatcttcaaggagacaaacgccacctatccatcctctgatgttccgtgcgatgcgactcttaccgagaaaagcttcgagacggacatgaacttgaacttccaaaacctgcttgtgatggtactgcgaatacttcttcttaaggtggcgggcttcaatttgctcatgacactcagactttggtctagc
완전 베타 및 알파 ORF 단백질 서열 ("Furin-P2A" 부위의 밑줄 친 이탤릭체 영역은 단일 카세트에서 2개의 폴리펩티드 사슬의 발현을 허용한다")")
MGPQLLGYVVLCLLGAGPLEAQVTQNPRYLITVTGKKLTVTCSQN MNHEY MSWYRQDPGLGLRQIYY SMNVEV TDKGDVPEGYKVSRKEKRNFPLILESPSPNQTSLYFCA CASSFGTSGRGEQFF GPGTRLTVLEdlrnvtppkvslfepskaeiankqkatlvclargffpdhvelswwvngkevhsgvctdpqaykesnysyclssrlrvsatfwhnprnhfrcqvqfhglseedkwpegspkpvtqnisaeawgradcgitsasyqqgvlsatilyeillgkatlyavlvstlvvmamvkrkns rakrsgsgatnfsllkqagdveenpgp MKKHLTTFLVILWLYFYRGNGKNQVEQSPQSLIILEGKNCTLQCNYT VSPFSN LRWYKQDTGRGPVSLTI MTFSENT KSNGRYTATLDADTKQSSLHITASQLSDSASYI CVVSARNAGNMLTF GGGTRLMVKPHiqnpepavyqlkdprsqdstlclftdfdsqinvpktmesgtfitdkcvldmkamdsksngaiawsnqtsftcqdifketnatypssdvpcdatlteksfetdmnlnfqnllvmvlrilllkvagfnllmtlrlwss
MAGEC2 TCR 4-58 MGTM 코돈 최적화된 서열
알파 사슬:
TRAV10/TRAJ39/MGTM 변형된 TRAC
알파 사슬 DNA 서열
ATGAAAAAGCATCTGACGACCTTCTTGGTGATTTTGTGGCTTTATTTTTATAGGGGGAATGGCAAAAACCAAGTGGAGCAGAGTCCTCAGTCCCTGATCATCCTGGAGGGAAAGAACTGCACTCTTCAATGCAATTATACA GTGAGCCCCTTCAGCAAC TTAAGGTGGTATAAGCAAGATACGGGGAGAGGTCCTGTTTCCCTGACAATC ATGACTTTCAGTGAGAACACA AAGTCGAACGGAAGATATACAGCAACTCTGGATGCAGACACAAAGCAAAGCTCTCTGCACATCACAGCCTCCCAGCTCAGCGATTCAGCCTCCTACATC tgcGTCGTGTCTGCCCGCAACGCAGGTAACATGCTTACATTC GGAGGGGGAACAAGGTTAATGGTCAAACCCCatatccagaaccccgaccccgccgtgtaccagctgagggactccaagtccagcgacaagagcgtgtgtctgtttacggacttcgacagccagaccaacgtgagtcaaagcaaggacagcgacgtctacataacggataagaccgtgctggacatgcggagcatggacttcaagagcaacagcgccgtggcctggtccaacaagagcgacttcgcctgcgccaacgccttcaacaacagcatcatccccgaggacaccttcttccccagcagcgacgtgccctgcgacgtgaaactggtggagaagtccttcgagacagacaccaatctgaactttcagaacctgctggtgatcgtgctgcggattctgctgctgaaagtggccggcttcaatctgctgatgaccctgcggctgtggagcagc
알파 사슬 단백질 서열
MKKHLTTFLVILWLYFYRGNGKNQVEQSPQSLIILEGKNCTLQCNYT VSPFSN LRWYKQDTGRGPVSLTI MTFSENT KSNGRYTATLDADTKQSSLHITASQLSDSASYI CVVSARNAGNMLTF GGGTRLMVKPHiqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpssdvpcdvklveksfetdtnlnfqnllvivlrilllkvagfnllmtlrlwss
베타 사슬:
TRBV27/TRAB2-1/ MGTM 변형된 TRBC
베타 사슬 DNA 서열
ATGGGCCCCCAGCTCCTTGGCTATGTGGTCCTTTGCCTTCTAGGAGCAGGCCCCCTGGAAGCCCAAGTGACCCAGAACCCAAGATACCTCATCACAGTGACTGGAAAGAAGTTAACAGTGACTTGTTCTCAGAAT ATGAACCATGAGTAT ATGTCCTGGTATCGACAAGACCCAGGGCTGGGCTTAAGGCAGATCTACTAT TCAATGAATGTTGAGGTG ACTGATAAGGGAGATGTTCCTGAAGGGTACAAAGTCTCTCGAAAAGAGAAGAGGAATTTCCCCCTGATCCTGGAGTCGCCCAGCCCCAACCAGACCTCTCTGTACTTCTGTGCC tgCGCTAGTAGCTTCGGCACCAGCGGTCGCGGTGAACAGTTTTTC GGGCCAGGGACACGGCTCACCGTGCTAGaagatctgaacaaggtgttccctccagaggtggccgtgttcgagccttctaaggccgagatcgcccacacacaaaaagccaccctcgtgtgcctggccaccggctttttccccgaccacgtggaactgtcttggtgggtcaacggcaaagaggtgcactccggcgtgtcaacggatccccagcctctgaaagaacagcctgccctgaacgacagccggtactgcctgagctccagactgagagtgtccgccaccttctggcagaacccccggaaccacttcagatgccaggtgcagttttacggcctgagcgagaacgacgagtggacccaggacagagccaagcccgtgacacaaatcgtgtctgccgaagcctggggaagagccgattgcggcatcaccagcgcctcctatcaccagggcgtgctgagcgccacaatcctgtacgaaatcctgctgggcaaggccaccctgtacgccgtgctggtgtctgctctggtgctgatggccatggtcaagcggaaggacttt
베타 사슬 단백질 서열
MGPQLLGYVVLCLLGAGPLEAQVTQNPRYLITVTGKKLTVTCSQN MNHEY MSWYRQDPGLGLRQIYY SMNVEV TDKGDVPEGYKVSRKEKRNFPLILESPSPNQTSLYFCA CASSFGTSGRGEQFF GPGTRLTVLEdlnkvfppevavfepskaeiahtqkatlvclatgffpdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgradcgitsasyhqgvlsatilyeillgkatlyavlvsalvlmamvkrkdf
완전 베타 및 알파 ORF DNA 서열
ATGGGCCCCCAGCTCCTTGGCTATGTGGTCCTTTGCCTTCTAGGAGCAGGCCCCCTGGAAGCCCAAGTGACCCAGAACCCAAGATACCTCATCACAGTGACTGGAAAGAAGTTAACAGTGACTTGTTCTCAGAAT ATGAACCATGAGTAT ATGTCCTGGTATCGACAAGACCCAGGGCTGGGCTTAAGGCAGATCTACTAT TCAATGAATGTTGAGGTG ACTGATAAGGGAGATGTTCCTGAAGGGTACAAAGTCTCTCGAAAAGAGAAGAGGAATTTCCCCCTGATCCTGGAGTCGCCCAGCCCCAACCAGACCTCTCTGTACTTCTGTGCC tgCGCTAGTAGCTTCGGCACCAGCGGTCGCGGTGAACAGTTTTTC GGGCCAGGGACACGGCTCACCGTGCTAGaagatctgaacaaggtgttccctccagaggtggccgtgttcgagccttctaaggccgagatcgcccacacacaaaaagccaccctcgtgtgcctggccaccggctttttccccgaccacgtggaactgtcttggtgggtcaacggcaaagaggtgcactccggcgtgtcaacggatccccagcctctgaaagaacagcctgccctgaacgacagccggtactgcctgagctccagactgagagtgtccgccaccttctggcagaacccccggaaccacttcagatgccaggtgcagttttacggcctgagcgagaacgacgagtggacccaggacagagccaagcccgtgacacaaatcgtgtctgccgaagcctggggaagagccgattgcggcatcaccagcgcctcctatcaccagggcgtgctgagcgccacaatcctgtacgaaatcctgctgggcaaggccaccctgtacgccgtgctggtgtctgctctggtgctgatggccatggtcaagcggaaggacttt ggcagcggcagagccaaaagaagcgggagcggtgcgacaaactttagcctgttgaaacaagccggcgacgttgaagagaaccccggacct ATGAAAAAGCATCTGACGACCTTCTTGGTGATTTTGTGGCTTTATTTTTATAGGGGGAATGGCAAAAACCAAGTGGAGCAGAGTCCTCAGTCCCTGATCATCCTGGAGGGAAAGAACTGCACTCTTCAATGCAATTATACA GTGAGCCCCTTCAGCAAC TTAAGGTGGTATAAGCAAGATACGGGGAGAGGTCCTGTTTCCCTGACAATC ATGACTTTCAGTGAGAACACA AAGTCGAACGGAAGATATACAGCAACTCTGGATGCAGACACAAAGCAAAGCTCTCTGCACATCACAGCCTCCCAGCTCAGCGATTCAGCCTCCTACATC tgcGTCGTGTCTGCCCGCAACGCAGGTAACATGCTTACATTC GGAGGGGGAACAAGGTTAATGGTCAAACCCCatatccagaaccccgaccccgccgtgtaccagctgagggactccaagtccagcgacaagagcgtgtgtctgtttacggacttcgacagccagaccaacgtgagtcaaagcaaggacagcgacgtctacataacggataagaccgtgctggacatgcggagcatggacttcaagagcaacagcgccgtggcctggtccaacaagagcgacttcgcctgcgccaacgccttcaacaacagcatcatccccgaggacaccttcttccccagcagcgacgtgccctgcgacgtgaaactggtggagaagtccttcgagacagacaccaatctgaactttcagaacctgctggtgatcgtgctgcggattctgctgctgaaagtggccggcttcaatctgctgatgaccctgcggctgtggagcagc
완전 베타 및 알파 ORF 단백질 서열
MGPQLLGYVVLCLLGAGPLEAQVTQNPRYLITVTGKKLTVTCSQN MNHEY MSWYRQDPGLGLRQIYY SMNVEV TDKGDVPEGYKVSRKEKRNFPLILESPSPNQTSLYFCA CASSFGTSGRGEQFF GPGTRLTVLEdlnkvfppevavfepskaeiahtqkatlvclatgffpdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgradcgitsasyhqgvlsatilyeillgkatlyavlvsalvlmamvkrkdf gsgrakrsgsgatnfsllkqagdveenpgp MKKHLTTFLVILWLYFYRGNGKNQVEQSPQSLIILEGKNCTLQCNYT VSPFSN LRWYKQDTGRGPVSLTI MTFSENT KSNGRYTATLDADTKQSSLHITASQLSDSASYI CVVSARNAGNMLTF GGGTRLMVKPHiqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpssdvpcdvklveksfetdtnlnfqnllvivlrilllkvagfnllmtlrlwss
* 표 2A 및 표 2B와 같은 표 2는 부분적으로, MHC 혈청형 제시에 따라 그룹화되고 MHC 혈청형에 의해 제시되고 하위-그룹화된 TCR에 의해 결합되는 다양한 펩티드에 따라 하위-그룹화된 대표적인 TCR 서열을 제공한다. 표에 대표적으로 예시된 것과 같은 개별 TCR 뿐만 아니라, 단독으로 또는 본원에 제공된 표에 그룹화된 것들과 같은 MHC와의 복합체로 본원에 기재된 펩티드 에피토프 서열에 결합하는 결합 단백질의 속이 기재되고 청구된다. 또한, 본원에 기재된 각각의 TCR 알파 사슬에 대한 TRAV, TRAJ 및 TRAC 유전자, 및 본원에 기재된 각각의 TCR 베타 사슬에 대한 TRBV, TRBJ 및 TRBC 유전자가 제공된다. 본원에 기재된 각각의 TCR에 대한 서열은 각각의 명명된 TCR에 대한 동족 알파 사슬 및 베타 사슬의 쌍으로서 제공된다. 본원에 기재된 TCR 서열은 주석이 달린다. 가변 도메인 서열은 대문자로 표시된다. 불변 도메인 서열은 소문자이다. CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 굵은체 및 밑줄친 텍스트를 사용하여 주석 처리된다. CDR1, CDR2 및 CDR3은 왼쪽(N-말단)에서 오른쪽(C-말단)으로의 표준 제시 순서로 제시되어 있다. 본원에 기재된 각각의 TCR 알파 사슬에 대한 TRAV, TRAJ 및 TRAC 유전자, 및 본원에 기재된 각각의 TCR 베타 사슬에 대한 TRBV, TRBJ 및 TRBC 유전자는 본원에 기재된 잘 공지된 IMGT 명명법에 따라 주석 처리된다.
표 3
대표적인 인간 MAGEC2 cDNA 서열
atgcctcccgttccaggcgttccattccgcaacgttgacaacgactccccgacctcagttgagttagaagactgggtagatgcacagcatcccacagatgaggaagaggaggaagcctcctccgcctcttccactttgtacttagtattttccccctcttctttctccacatcctcttctctgattcttggtggtcctgaggaggaggaggtgccctctggtgtgataccaaatcttaccgagagcattcccagtagtcctccacagggtcctccacagggtccttcccagagtcctctgagctcctgctgctcctctttttcatggagctcattcagtgaggagtccagcagccagaaaggggaggatacaggcacctgtcagggcctgccagacagtgagtcctctttcacatatacactagatgaaaaggtggccgagttagtggagttcctgctcctcaaatacgaagcagaggagcctgtaacagaggcagagatgctgatgattgtcatcaagtacaaagattactttcctgtgatactcaagagagcccgtgagttcatggagcttctttttggccttgccctgatagaagtgggccctgaccacttctgtgtgtttgcaaacacagtaggcctcaccgatgagggtagtgatgatgagggcatgcccgagaacagcctcctgattattattctgagtgtgatcttcataaagggcaactgtgcctctgaggaggtcatctgggaagtgctgaatgcagtaggggtatatgctgggagggagcacttcgtctatggggagcctagggagctcctcactaaagtttgggtgcagggacattacctggagtatcgggaggtgccccacagttctcctccatattatgaattcctgtggggtccgagagcccattcagaaagcatcaagaagaaagtactagagtttttagccaagctgaacaacactgttcctagttcctttccatcctggtacaaggatgctttgaaagatgtggaagagagagtccaggccacaattgataccgcagatgatgccactgtcatggccagtgaaagcctcagtgtcatgtccagcaacgtctccttttctgagtga
대표적인 인간 MAGEC2 단백질 서열(밑줄쳐진 대표적이고 비-제한적인 에피토프)
MPPVPGVPFRNVDNDSPTSVELEDWVDAQHPTDEEEEEASSASSTLYLVFSPSSFSTSSSLILGGPEEEEVPSGVIPNLTESIPSSPPQGPPQGPSQSPLSSCCSSFSWSSFSEESSSQKGEDTGTCQGLPDSESSFTYTLDEKVAELVEFLLLKYEAEEPVTEAEMLMIVIKYKDYFPVILKRAREFMELLFGLALIEVGPDHFCVFANTVGLTDEGSDDEGMPENSLLIIILSVIFIKGNCASEEVIWEVLNAVGVYAGREHFVYGEPRELLTKVWVQGHYLEYREVPHSSPPYYEFLWGPRAHSESIKKKVLEFLAKLNNTVPSSFPSWYKDALKDVEERVQATIDTADDATVMASESLSVMSSNVSFSE
대표적인 인간 HLA-B*07:02 DNA 서열
atgctggtcatggcgccccgaaccgtcctcctgctgctctcggcggccctggccctgaccgagacctgggccggctcccactccatgaggtatttctacacctccgtgtcccggcccggccgcggggagccccgcttcatctcagtgggctacgtggacgacacccagttcgtgaggttcgacagcgacgccgcgagtccgagagaggagccgcgggcgccgtggatagagcaggaggggccggagtattgggaccggaacacacagatctacaaggcccaggcacagactgaccgagagagcctgcggaacctgcgcggctactacaaccagagcgaggccgggtctcacaccctccagagcatgtacggctgcgacgtggggccggacgggcgcctcctccgcgggcatgaccagtacgcctacgacggcaaggattacatcgccctgaacgaggacctgcgctcctggaccgccgcggacacggcggctcagatcacccagcgcaagtgggaggcggcccgtgaggcggagcagcggagagcctacctggagggcgagtgcgtggagtggctccgcagatacctggagaacgggaaggacaagctggagcgcgctgaccccccaaagacacacgtgacccaccaccccatctctgaccatgaggccaccctgaggtgctgggccctgggtttctaccctgcggagatcacactgacctggcagcgggatggcgaggaccaaactcaggacactgagcttgtggagaccagaccagcaggagatagaaccttccagaagtgggcagctgtggtggtgccttctggagaagagcagagatacacatgccatgtacagcatgaggggctgccgaagcccctcaccctgagatgggagccgtcttcccagtccaccgtccccatcgtgggcattgttgctggcctggctgtcctagcagttgtggtcatcggagctgtggtcgctgctgtgatgtgtaggaggaagagttcaggtggaaaaggagggagctactctcaggctgcgtgcagcgacagtgcccagggctctgatgtgtctctcacagcttga
대표적인 인간 HLA-B*07:02 단백질 서열
MLVMAPRTVLLLLSAALALTETWAGSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPREEPRAPWIEQEGPEYWDRNTQIYKAQAQTDRESLRNLRGYYNQSEAGSHTLQSMYGCDVGPDGRLLRGHDQYAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQRRAYLEGECVEWLRRYLENGKDKLERADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQSTVPIVGIVAGLAVLAVVVIGAVVAAVMCRRKSSGGKGGSYSQAACSDSAQGSDVSLTA
대표적인 인간 HLA-A*24:02 DNA 서열
atggccgtcatggcgccccgaaccctcgtcctgctactctcgggggccctggccctgacccagacctgggcaggctcccactccatgaggtatttctccacatccgtgtcccggcccggccgcggggagccccgcttcatcgccgtgggctacgtggacgacacgcagttcgtgcggttcgacagcgacgccgcgagccagaggatggagccgcgggcgccgtggatagagcaggaggggccggagtattgggacgaggagacagggaaagtgaaggcccactcacagactgaccgagagaacctgcggatcgcgctccgctactacaaccagagcgaggccggttctcacaccctccagatgatgtttggctgcgacgtggggtcggacgggcgcttcctccgcgggtaccaccagtacgcctacgacggcaaggattacatcgccctgaaagaggacctgcgctcttggaccgcggcggacatggcagctcagatcaccaagcgcaagtgggaggcggcccatgtggcggagcagcagagagcctacctggagggcacgtgcgtggacgggctccgcagatacctggagaacgggaaggagacgctgcagcgcacggacccccccaagacacatatgacccaccaccccatctctgaccatgaggccactctgagatgctgggccctgggcttctaccctgcggagatcacactgacctggcagcgggatggggaggaccagacccaggacacggagcttgtggagaccaggcctgcaggggatggaaccttccagaagtgggcagctgtggtggtaccttctggagaggagcagagatacacctgccatgtgcagcatgagggtctgcccaagcccctcaccctgagatgggagccatcttcccagcccaccgtccccatcgtgggcatcattgctggcctggttctccttggagctgtgatcactggagctgtggtcgctgctgtgatgtggaggaggaacagctcagatagaaaaggagggagctactctcaggctgcaagcagtgacagtgcccagggctctgatgtgtctctcacagcttgtaaagtgtga
대표적인 인간 HLA-A*24:02 단백질 서열
MAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAGSHSMRYFSTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDEETGKVKAHSQTDRENLRIALRYYNQSEAGSHTLQMMFGCDVGSDGRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQITKRKWEAAHVAEQQRAYLEGTCVDGLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQPTVPIVGIIAGLVLLGAVITGAVVAAVMWRRNSSDRKGGSYSQAASSDSAQGSDVSLTACKV
* 본원의 표 1-3에는 적어도 표 1-3에 열거된 임의의 서열의 아미노산 서열 또는 이의 일부와 전장에 걸쳐 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 그 초과의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 분자뿐만 아니라 펩티드 에피토프가 포함된다. 이러한 폴리펩티드는 본원에 추가로 기재된 바와 같은 전장 펩티드 또는 폴리펩티드의 기능을 가질 수 있다.
* 표 2 및 3에는 표 2 및 3에 열거된 임의의 서열의 핵산 서열 또는 이의 일부와 전장에 걸쳐 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 그 초과의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA 핵산 서열뿐만 아니라 RNA 핵산 분자(예를 들어, 티민이 우레딘으로 대체됨), 인코딩된 단백질의 오르톨로그를 인코딩하는 핵산 분자가 포함된다. 이러한 핵산 분자는 본원에 추가로 기재된 바와 같은 전장 핵산의 기능을 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 제공된 결합 단백질은 키메라, 인간화, 인간, 영장류 또는 설치류(예를 들어, 랫트 또는 마우스)인 불변 영역을 포함한다. 예를 들어, 인간 가변 영역은 뮤어라인 불변 영역으로 키메라화될 수 있거나, 뮤어라인 가변 영역은 인간 불변 영역 및/또는 인간 프레임워크 영역으로 인간화될 수 있다. 일부 구체예에서, 불변 영역은 기능성을 변형하기 위해 돌연변이될 수 있다(예를 들어, TCR 알파 및 베타 사슬 사이의 친화도를 증가시키는데 유용한 이황화 결합을 제공하기 위해 TCR 알파 및 베타 사슬에서의 반대 잔기 위치에 비-천연 발생 시스테인 치환의 도입). 유사하게, 기능성을 변경하기 위해(예를 들어, 소수성 아미노산으로 잔기의 비-천연 발생 치환을 도입함으로써 소수성을 증가시키기 위해) 불변 영역의 막횡단 도메인에서 돌연변이가 이루어질 수 있다. 일부 구체예에서, 결합 단백질의 각각의 CDR은 참조 CDR 서열과 비교하여 최대 5개의 아미노산 치환, 삽입, 결실 또는 이의 조합을 갖는다. 일부 구체예에서, 세포 표면 발현을 증가시키기 위해 불변 영역에 돌연변이가 이루어질 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 결합 단백질은 조작된 단백질 스캐폴드, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, TCR-모방 항체 등일 수 있다. 이러한 결합 모이어티는 숙주 면역화, 항체-생산 세포 및/또는 이의 항체 획득 및 단클론성 항체 생산에 유용한 하이브리도마 생성과 같은 일상적인 면역학적 방법을 사용하여 본원에 기술된 펩티드 및/또는 MHC-펩티드 복합체에 대해 설계 및/또는 생성될 수 있다(예를 들어, Watt 등 (2006) Nat. Biotechnol. 24:177-183; Gebauer and Skerra (2009) Curr. Opin. Chem Biol. 13:245-255; Skerra 등 (2008) FEBS J. 275:2677-2683; Nygren 등 (2008) FEBS J. 275:2668-2676; Dana 등 (2012) Exp. Rev. Mol. Med. 14:e6; Sergeva 등 (2011) Blood 117:4262-4272; PCT 공개 번호 WO 2007/143104, PCT/US86/02269 및 WO 86/01533; 미국 특허 번호 4,816,567; Better 등 (1988) Science 240:1041-1043; Liu 등 (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:3439-3443; Liu 등 (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun 등 (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:214-218; Nishimura 등 (1987) Cancer Res. 47:999-1005; Wood 등 (1985) Nature 314:446-449; Shaw 등 (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207; Oi 등 (1986) Biotechniques 4:214; 미국 특허 번호 5,225,539; Jones 등 (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan 등 (1988) Science 239:1534; 및 Beidler 등 (1988) J. Immunol. 141:4053-4060. 원하는 경우, 결합 부분은 예를 들어 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 친화성 크로마토그래피, 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 렉틴 크로마토그래피 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)와 같은 통상적인 절차를 사용하여 단리 또는 정제될 수 있다(예를 들어, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y.).
용어 "항체" 및 "항체들"은 자연 발생 형태의 항체(예를 들어 IgG, IgA, IgM, IgE)와 단일-사슬 항체, 키메라 및 인간화된 항체 및 다중-특이적 항체와 같은 재조합 항체뿐만 아니라 전술한 모든 것의 단편 및 유도체를 광범위하게 포함하며, 단편 및 유도체는 적어도 항원 결합 부위를 갖는다. 항체 유도체는 항체에 접합된 단백질 또는 화학적 모이어티를 포함할 수 있다.
부가하여, 인트라바디는 항체의 특성을 갖지만 관심 있는 세포내 표적에 결합 및/또는 억제하기 위해 세포 내에서 발현될 수 있는 잘 알려진 항원-결합 분자이다(Chen 등 (1994) Human Gene Ther 5:595-601). 단일-사슬 항체(scFv)의 사용, 과안정성을 위한 면역글로불린 VL 도메인의 변형, 환원성 세포내 환경에 저항하기 위한 항체의 변형, 세포내 안정성을 증가시키고/시키거나 세포내 국지화를 조절하는 융합 단백질 생성 등과 같은 세포내 모이어티를 표적화(예를 들어, 억제)하기 위해 항체를 적응시키기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 세포내 항체는 또한 예를 들어 예방 및/또는 치료적 목적(예를 들어 유전자 요법)을 위해 다세포 유기체의 하나 이상의 세포, 조직 또는 기관에 도입되고 발현될 수 있다(적어도 PCT 공개 번호 WO 08/020079, WO 94/02610, WO 95/22618 및 WO 03/014960; 미국 특허 번호 7,004,940; Cattaneo and Biocca (1997)　Intracellular Antibodies: Development and Applications (Landes and Springer-Verlag publs.); Kontermann (2004) Methods 34:163-170; Cohen 등 (1998) Oncogene 17:2445-2456; Auf der Maur 등 (2001) FEBS Lett. 508:407-412; Shaki-Loewenstein 등 (2005) J. Immunol. Meth. 303:19-39 참조).
본원에 사용된 용어 "항체"에는 또한 항체의 "항원-결합 부분"(또는 간단히 "항체 부분")도 포함된다. 본원에 사용된 용어 "항원-결합 부분"은 항원(예를 들어, 본원에 기재된 펩티드 및/또는 MHC-펩티드 복합체)에 특이적으로 및/또는 선택적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 일가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 팔의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward 등, (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 더욱이, Fv 단편의 두 도메인인 VL과 VH는 별도의 유전자에 의해 코딩되지만 재조합 방법을 사용하여 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 일가 폴리펩티드를 형성하는 단일 단백질 사슬로 만들어질 수 있는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다(단일 사슬 Fv(scFv)로 알려짐; 예를 들어 Bird 등 (1988) Science 242:423-426; 및 Huston 등 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; 및 Osbourn 등 1998, Nature Biotechnology 16: 778 참조). 이러한 단일 사슬 항체는 또한 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포함되도록 의도된다. 특정 scFv의 임의의 VH 및 VL 서열은 완전한 IgG 폴리펩티드 또는 다른 이소형을 인코딩하는 발현 벡터를 생성하기 위해 인간 면역글로불린 불변 영역 cDNA 또는 게놈 서열에 연결될 수 있다. VH 및 VL은 또한 단백질 화학이나 재조합 DNA 기술을 사용하여 Fab, Fv 또는 기타 면역글로불린의 단편을 생성하는데 사용될 수 있다. 디아바디와 같은 다른 형태의 단일 사슬 항체가 또한 포함된다. 디아바디는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 사슬에서 발현되지만 너무 짧은 링커를 사용하여 동일한 사슬의 두 도메인 사이의 쌍을 이룰 수 없어 도메인이 상보적인 도메인과 쌍을 이루도록 하고 2개의 항원 결합 부위를 생성하는 2가, 이중특이적 항체이다(예를 들어, Holliger 등 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448; Poljak 등 (1994) Structure 2:1121-1123 참조).
더욱이, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 항체 또는 항체 부분과 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비공유 회합에 의해 형성된 더 큰 면역부착 폴리펩티드의 일부일 수 있다. 이러한 면역부착 폴리펩티드의 예는 4량체 scFv 폴리펩티드를 만들기 위한 스트렙타비딘 코어 영역의 사용(Kipriyanov 등 (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) 및 2가 및 비오틴화된 scFv 폴리펩티드를 만들기 위한 시스테인 잔기, 단백질 하위단위 펩티드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그의 사용(Kipriyanov 등 (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058)을 포함한다. Fab 및 F(ab')2 단편과 같은 항체 부분은 각각 전체 항체의 파파인 또는 펩신 분해와 같은 통상적인 기술을 사용하여 전체 항체로부터 제조될 수 있다. 더욱이, 항체, 항체 부분 및 면역부착 폴리펩티드는 본원에 기술된 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 얻을 수 있다.
항체는 다클론성 또는 단클론성; 이종계, 동종이계 또는 동계; 또는 이의 변형된 형태(예를 들어 인간화, 키메라 등)일 수 있다. 항체는 또한 완전하게 인간일 수도 있다. 바람직하게는, 발명의 항체는 본원에 기술된 펩티드 및/또는 MHC-펩티드 복합체에 특이적으로 및/또는 선택적으로 또는 실질적으로 특이적으로 및/또는 선택적으로 결합한다. 본원에 사용된 용어 "단클론성 항체" 및 "단클론성 항체 조성물"은 항원의 특정 에피토프와 면역반응할 수 있는 항원 결합 부위의 단 한 종만을 함유하는 항체 폴리펩티드의 집단을 지칭하는 반면, 용어 "다클론성 항체" 및 "다클론성 항체 조성물"은 특정 항원과 상호작용할 수 있는 다중 종의 항원 결합 부위를 함유하는 항체 폴리펩티드의 집단을 지칭한다. 단클론성 항체 조성물은 전형적으로 그것이 면역반응하는 특정 항원에 대해 단일 결합 친화성을 나타낸다.
본원에 기술된 다른 결합 모이어티와 유사하게, 항체는 또한 "인간화"될 수 있으며, 이는 인간 세포에 의해 만들어지는 항체를 보다 밀접하게 유사하도록 변경된 가변 및 불변 영역을 갖는 비-인간 세포에 의해 만들어진 항체를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 인간 생식계열 면역글로불린 서열에서 발견되는 아미노산을 통합하기 위해 비-인간 항체 아미노산 서열을 변경함에 의함. 발명의 인간화된 항체는, 예를 들어 CDR에서 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내/체외에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "인간화된 항체"는 또한 다른 포유동물 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 접목된 항체를 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 결합 단백질은 T 세포 수용체(TCR), TCR의 항원-결합 단편, 또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 결합 단백질은 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있고, 이들 각각은 TCR 알파 사슬의 CDR3 및 TCR 베타 사슬의 CDR3, 또는 TCR 알파 사슬 및 TCR 베타 사슬 둘 모두의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 결합 단백질은 TCR Vα 및 TCR Vβ 도메인 둘 모두를 포함하지만, 단지 단일 TCR 불변 도메인(Cα 또는 Cβ)을 포함하는 단일 사슬 TCR(scTCR)을 포함한다. 용어 "키메라 항원 수용체"(CAR)은 자연적으로 발생하지 않거나 숙주 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 방식으로 함께 연결된 2개 이상의 자연 발생 아미노산 서열을 함유하도록 조작된 융합 단백질을 지칭하며, 이 융합 단백질은 세포의 표면에 존재하는 경우 수용체로서 기능할 수 있다. 본 발명에 포함되는 CAR은 막횡단 도메인 및 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인(임의적으로 공동-자극 도메인(들)을 함유함)에 연결된 항원-결합 도메인(즉, 면역글로불린 또는 면역글로불린-유사 분자, 예컨대, 항체 또는 TCR, 또는 NK 세포로부터의 킬러 면역수용체로부터 유래되거나 수득된 항원 결합 도메인으로부터 수득되거나 유래됨)을 포함하는 세포외 부분을 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[Sadelain 등 (2013) Cancer Discov. 3:388, Harris and Kranz (2016) Trends Pharmacol. Sci. 37:220, and Stone 등 (2014) Cancer Immunol. Immunother. 63:1163] 참조).
일부 구체예에서, 1) TCR 알파 사슬 CDR, TCR Vα 도메인 및/또는 TCR 알파 사슬은 표 2에 열거된 TRAV, TRAJ 및 TRAC 유전자의 군으로부터 선택되는 TRAV, TRAJ 및/또는 TRAC 유전자 또는 이의 단편에 의해 인코딩되고/거나 2) TCR 베타 사슬 CDR, TCR Vβ 도메인 및/또는 TCR 베타 사슬은 표 2에 열거된 TRBV, TRBJ 및 TRBC 유전자의 군으로부터 선택되는 TRBV, TRBJ 및/또는 TRBC 유전자 또는 이의 단편에 의해 인코딩되고/거나 3) 결합 단백질의 각각의 CDR은 표 2에 열거된 동족 기준 CDR 서열과 비교하여 최대 5개의 아미노산 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 갖는다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 결합 단백질(예를 들어, TCR, TCR의 항원-결합 단편, 또는 키메라 항원 수용체(CAR))은 키메라(예를 들어, 하나 초과의 공여자 또는 종들로부터의 아미노산 잔기 또는 모티프를 포함함), 인간화된(예를 들어, 인간에서 면역원성의 위험을 감소시키도록 변경되거나 치환된 비-인간 유기체로부터의 잔기를 포함함), 또는 인간 결합 단백질이다.
조작된 결합 단백질, 예를 들어, TCR, CAR 및 이의 항원-결합 단편을 생산하기 위한 방법은 당 분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, Bowerman 등 (2009) Mol. Immunol. 5:3000; 미국 특허 번호 6,410,319; 미국 특허 번호 7,446,191; US 특허 공개 번호 2010/065818; US 특허 번호 8,822,647; PCT 공개 번호 WO 2014/031687; 미국 특허 번호 7,514,537; 및 Brentjens 등 (2007) Clin.. Cancer Res. 73:5426).
일부 구체예에서, 본원에 기재된 결합 단백질은 세포 표면에서 발현된 TCR 또는 이의 항원-결합 단편이고, 여기서 세포 표면-발현된 TCR은 내인성 TCR과 비교하여 CD3 단백질과 더 효율적으로 회합할 수 있다. 본 발명에 포함되는 결합 단백질, 예를 들어, TCR은 또한 T 세포와 같은 세포의 표면에서 발현되는 경우 내인성 TCR과 같은 내인성 결합 단백질과 비교하여 세포 상에서 더 많은 표면 발현을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, CAR의 결합 도메인이 항원-특이적 TCR 결합 도메인을 포함하는 CAR이 본원에 제공된다(예를 들어, Walseng 등 (2017) Scientific Reports 7:10713).
또한, 출발 결합 단백질로부터의 특성을 변경할 수 있는 변형된 결합 단백질을 조작하기 위해 본원에 개시된 Vα 및/또는 Vβ 서열 중 하나 이상을 갖는 결합 단백질을 출발 물질로서 사용하여 널리 공지된 방법에 따라 제조될 수 있는 변형된 결합 단백질(예를 들어, TCR, TCR의 항원-결합 단편 또는 CAR)이 제공된다. 결합 단백질은 하나 또는 둘 모두의 가변 영역(즉, Vα 및/또는 Vβ), 예를 들어, 하나 이상의 CDR 영역 내에 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 내에서 하나 이상의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 결합 단백질은 불변 영역(들) 내의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다.
또 다른 유형의 가변 영역 변형은 Vα 및/또는 Vβ CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 관심 결합 단백질의 하나 이상의 결합 특성(예를 들어, 친화성)을 개선시키는 것이다. 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발은 돌연변이(들)를 도입하기 위해 수행될 수 있고, 단백질 결합에 대한 효과, 또는 관심 있는 다른 기능적 특성은 본원에 기재되고 실시예에 제공된 바와 같이 시험관내, 생체외 또는 생체내 검정에서 평가될 수 있다. 일부 구체예에서, 보존적 변형(상기 논의된 바와 같음)이 도입될 수 있다. 돌연변이는 아미노산 치환, 첨가 또는 결실일 수 있다. 일부 구체예에서, 돌연변이는 치환이다. 또한, 전형적으로 CDR 영역 내의 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 잔기가 변형된다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 결합 단백질(예를 들어, TCR, TCR의 항원-결합 단편 또는 CAR)은 자연 발생 TCR에 비해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 결합 단백질의 각각의 CDR은 표 2에 열거된 동족 참조 CDR 서열과 비교하여 최대 5개의 아미노산 치환, 삽입, 결실, 또는 이들의 조합을 갖는다. 아미노산의 보존적 치환은 잘 알려져 있으며, 자연적으로 발생할 수 있거나 결합 단백질이 재조합적으로 생산되는 경우 도입될 수 있다. 아미노산 치환, 결실 및 부가는 당 분야에 공지된 돌연변이유발 방법을 사용하여 단백질에 도입될 수 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook 등 (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 참조). 올리고뉴클레오티드-지정 부위-특이적(또는 세그먼트 특이적) 돌연변이유발 절차는 원하는 치환, 결실 또는 삽입에 따라 변경된 특정 코돈을 갖는 변경된 폴리뉴클레오티드를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 무작위 또는 포화 돌연변이유발 기술, 예컨대, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발, 오류 경향이 있는 중합체라제 연쇄 반응 돌연변이유발 및 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발은 면역원 폴리펩티드 변이체를 제조하는데 사용될 수 있다(예를 들어, Sambrook 등 상기 참조).
당업자에게 공지된 다양한 기준은 펩티드 또는 폴리펩티드의 특정 위치에서 치환된 아미노산이 보존적(또는 유사)인지 여부를 나타낸다. 예를 들어, 유사한 아미노산 또는 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 아미노산이 하기 카테고리에 포함될 수 있다: 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘); 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산); 하전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 히스티딘); 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판); 베타-분지형 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신), 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판). 분류하기 더 어려운 것으로 간주되는 프롤린은 지방족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 류신, 발린, 이소류신 및 알라닌)과 특성을 공유한다. 일부 구체예에서, 글루탐산에 대한 글루타민 또는 아스파르트산에 대한 아스파라긴의 치환은 글루타민 및 아스파라긴이 각각 글루탐산 및 아스파라긴산의 아미드 유도체라는 점에서 유사한 치환으로 간주될 수 있다. 당 분야에서 이해되는 바와 같이, 2개의 폴리펩티드 사이의 "유사성"은 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 이에 대한 보존된 아미노산 치환기를 제2 폴리펩티드의 서열과 비교함으로써 결정된다(예를 들어, GENEWORKS™, Align, BLAST 알고리즘, 또는 다른 본원에 기술되고 당 분야에서 실시되는 알고리즘).
일부 구체예에서, 인코딩된 결합 단백질(예를 들어, TCR, TCR의 항원-결합 단편 또는 CAR)은 "신호 펩티드"(리더 서열, 리더 펩티드 또는 전이 펩티드로도 공지됨)를 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 새로 합성된 폴리펩티드를 세포 내부 또는 외부의 적절한 위치로 표적화한다. 신호 펩티드는 국소화 또는 분비가 완료되는 동안 또는 완료되면 폴리펩티드로부터 제거될 수 있다. 신호 펩티드를 갖는 폴리펩티드는 본원에서 "예비-단백질"로 지칭되고, 이들의 신호 펩티드가 제거된 폴리펩티드는 본원에서 "성숙" 단백질 또는 폴리펩티드로 지칭된다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 결합 단백질(예를 들어, TCR, TCR의 항원-결합 단편 또는 CAR)은 성숙 Vα 도메인, 성숙 Vβ 도메인, 또는 이 둘 모두를 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 결합 단백질(예를 들어, TCR, TCR의 항원-결합 단편 또는 CAR)은 성숙 TCR β-사슬, 성숙 TCR α-사슬 또는 이 둘 모두를 포함한다.
일부 구체예에서, 결합 단백질은 (a) TCR 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 세포외 성분; (b) 이펙터 도메인 또는 이의 기능적 부분을 포함하는 세포내 성분; 및 (c) 세포외 및 세포내 성분을 연결하는 막횡단 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구체예에서, 융합 단백질은 MHC 분자(예를 들어, MHC 클래스 I 분자)의 맥락에서 MAGEC2 면역원성 펩티드를 포함하는 펩티드-MHC(pMHC) 복합체에 (예를 들어, 특이적으로 및/또는 선택적으로) 결합할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "이펙터 도메인" 또는 "면역 이펙터 도메인"은 적절한 신호를 수신할 때 세포에서 면역 반응을 직접 또는 간접적으로 촉진할 수 있는 융합 단백질 또는 수용체의 세포내 부분 또는 도메인이다. 일부 구체예에서, 면역 세포 단백질 또는 이의 일부 또는 면역 세포 단백질 복합체가 표적 분자에 직접적으로 결합하고 면역 세포에서 이펙터 도메인으로부터 신호 전단을 촉발하는 경우 또는 결합되는 경우(예를 들어, CD3ζ) 이펙터 도메인은 신호를 수용하는 면역 세포 단백질 또는 이의 일부 또는 면역 세포 단백질 복합체로부터 유래된다.
이펙터 도메인은 공동자극 분자에서 발견되는 것과 같은 세포내 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)와 같은 하나 이상의 신호전달 도메인 또는 모티프를 함유할 때 세포 반응을 직접적으로 촉진할 수 있다. 이론으로 국한시키려는 것은 아니지만, ITAM은, T 세포 수용체에 의해 또는 T 세포 이펙터 도메인을 포함하는 융합 단백질에 의해 리간드 결합 후 T 세포 활성화에 유용한 것으로 여겨진다. 일부 구체예에서, 세포내 성분 또는 이의 기능적 부분은 ITAM을 포함한다. 예시적인 면역 이펙터 도메인은 CD3ε, CD3δ, CD3ζ, CD25, CD79A, CD79B, CARD11, DAP10, FcRα, FcRβ, FcRγ, Fyn, HVEM, ICOS, Lck, LAG3, LAT, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, Wnt, ROR2, Ryk, SLAMF1, Slp76, pTα, TCRα, TCRβ, TRIM, Zap70, PTCH2 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 이펙터 도메인은 림프구 수용체 신호전달 도메인(예를 들어, CD3ζ 또는 이의 기능적 부분 또는 변이체)을 포함한다.
추가 구체예에서, 융합 단백질의 세포내 성분은 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40(CD134), CD2, CD5, ICAM-1(CD54), LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278), GITR, CD30, CD40, BAFF-R, HVEM, LIGHT, MKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, CD83과 (예를 들어, 특이적으로 및/또는 선택적으로) 결합하는 리간드로부터 선택된 공동자극 도메인 또는 이의 기능적 부분, 또는 이의 기능적 변이체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포내 성분은 CD28 공동자극 도메인 또는 이의 기능적 부분 또는 변이체(이는 임의적으로 천연 CD28 단백질의 위치 186-187에서 LL-GG 돌연변이를 포함할 수 있음(예를 들어, Nguyen 등 (2003) Blood 702:4320), 4-1BB 공동자극 도메인 또는 이의 기능적 부분 또는 변이체, 또는 이 둘 둘 모두를 포함한다.
일부 구체예에서, 이펙터 도메인은 CD3ε 엔도도메인 또는 이의 기능적(예를 들어, 신호전달) 부분, 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 추가 구체예에서, 이펙터 도메인은 CD27 엔도도메인 또는 이의 기능적(예를 들어, 신호전달) 부분, 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 추가 구체예에서, 이펙터 도메인은 CD28 엔도도메인 또는 이의 기능적(예를 들어, 신호전달) 부분, 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 추가 구체예에서, 이펙터 도메인은 4-1BB 엔도도메인 또는 이의 기능적(예를 들어, 신호전달) 부분, 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 추가 구체예에서, 이펙터 도메인은 OX40 엔도도메인 또는 이의 기능적(예를 들어, 신호전달) 부분, 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 추가 구체예에서, 이펙터 도메인은 CD2 엔도도메인 또는 이의 기능적(예를 들어, 신호전달) 부분, 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 추가 구체예에서, 이펙터 도메인은 CD5 엔도도메인 또는 이의 기능적(예를 들어, 신호전달) 부분, 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 추가 구체예에서, 이펙터 도메인은 ICAM-l 엔도도메인 또는 이의 기능적(예를 들어, 신호전달) 부분, 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 추가 구체예에서, 이펙터 도메인은 LFA-l 엔도도메인 또는 이의 기능적(예를 들어, 신호전달) 부분, 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 추가 구체예에서, 이펙터 도메인은 ICOS 엔도도메인 또는 이의 기능적(예를 들어, 신호전달) 부분, 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
본 발명에 포함되는 세포외 성분 및 세포내 성분은 막횡단 도메인에 의해 연결된다. 본원에서 사용되는 "막횡단 도메인"은 세포막에 삽입되거나 세포막에 걸쳐 있을 수 있는 막횡단 단백질의 일부이다. 막횡단 도메인은 세포막에서 열역학적으로 안정하고 일반적으로 약 15개 아미노산 내지 약 30개 아미노산의 길이 범위인 3차원 구조를 갖는다. 막횡단 도메인의 구조는 알파 나선, 베타 배럴, 베타 시트, 베타 나선 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 막횡단 도메인은 공지된 막횡단 단백질(예를 들어, CD4 막횡단 도메인, CD8 막횡단 도메인, CD27 막횡단 도메인, CD28 막횡단 도메인, 또는 이들의 임의의 조합)을 포함하거나 이로부터 유래된다.
일부 구체예에서, 융합 단백질의 세포외 성분은 결합 도메인과 막횡단 도메인 사이에 배치된 링커를 추가로 포함한다. 결합 및 막횡단 도메인을 연결하는 융합 단백질의 성분을 언급할 때 본원에서 사용되는 바와 같은 "링커"는 약 2개의 아미노산 내지 약 500개의 아미노산을 갖는 아미노산 서열일 수 있으며, 이는 링커에 의해 연결된 2개의 영역, 도메인, 모티프, 단편 또는 모듈 사이의 배좌 운동에 대한 유연성 및 공간을 제공할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 포함되는 링커는 숙주 세포와 표적 세포 사이의 적절한 접촉, 항원 결합 및 활성화를 가능하게 하기 위해 융합 단백질을 발현하는 숙주 세포의 표면으로부터 멀리 결합 도메인을 위치시킬 수 있다(Patel 등 (1999) Gene Therapy 6:412-419). 링커 길이는 선택된 표적 분자, 선택된 결합 에피토프, 또는 항원 결합 도메인 크기 및 친화성에 기반하여 항원 인식을 최대화하기 위해 다양할 수 있다(예를 들어, 문헌[Guest 등 (2005) Immunother. 28:203-11] 및 PCT 공개 번호 WO 2014/031687 참조). 예시적인 링커는 GlyxSery의 1 내지 약 10개의 반복부를 갖는 글리신-세린 아미노산 사슬을 갖는 것들을 포함하며, 여기서 x 및 y는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수이며, 단, x 및 y는 둘 모두 0이 아니다(예를 들어, (Gly4Ser)2, (Gly3Ser)2, Gly2Ser 또는 이들의 조합, 예컨대, ((Gly3Ser)2Gly2Ser)).
결합 단백질은 검출 모이어티, 방사선감작제, 감광제 등에 컨쥬게이션될 수 있고/있거나 펩티드에 관해 상기에서 기술된 바와 같이 화학적으로 변형될 수 있다.
본원에 개시된 임의의 구체예에서, 인코딩된 결합 단백질은 MHC 분자(예를 들어, MHC 클래스 I 분자)의 맥락에서 MAGEC2 면역원성 펩티드를 포함하는 펩티드-MHC(pMHC) 복합체에 결합할 수 있다.
결합 친화성을 평가하고/하거나 결합 분자가 특정 리간드(예를 들어, 펩티드 항원-MHC 복합체)에 (예를 들어, 특이적으로 및/또는 선택적으로) 결합하는지 여부를 결정하기 위한 다양한 검정이 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 당해분야에 잘 알려진 다수의 결합 검정 중 임의의 것을 사용하여 표적 폴리펩티드의 T 세포 펩티드 에피토프와 같은 표적에 대한 결합 단백질의 결합 친화성을 결정하는 것은 당업자의 수준 내에 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, Biacore™ 기계는 2개의 단백질 사이의 복합체의 결합 상수를 결정하는데 사용될 수 있다. 복합체에 대한 해리 상수(KD)는 완충제가 칩 위로 통과함에 따라 시간에 대한 굴절률의 변화를 모니터링함으로써 결정될 수 있다. 한 단백질의 또 다른 단백질에 대한 결합을 측정하기 위한 다른 적합한 검정은, 예를 들어, 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA) 및 방사성면역법(RIA)과 같은 면역검정, 또는 형광, UV 흡수, 원형 이색성, 또는 핵 자기 공명(NMR)을 통해 단백질의 분광 또는 광학 특성의 변화를 모니터링함에 의한 결합의 결정을 포함한다. 다른 예시적인 검정은 웨스턴 블롯, ELISA, 분석용 초원심분리, 분광법 및 표면 플라즈몬 공명(Biacore™) 분석(예를 들어, 문헌[Scatchard 등 (1949) Ann. NY Acad. Sci. 51: 660, Wilson (2002) Science 295:2103, Wolff 등 (1993) Cancer Res. 53:2560] 참조 및 미국 특허 번호 5,283,173 및 5,468,614), 유세포 분석, 시퀀싱 및 발현된 핵산의 검출을 위한 다른 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 한 예에서, 표적에 대한 겉보기 친화성은 다양한 농도의 테트라머에 대한 결합을, 예를 들어, 표지된 다량체, 예컨대, MHC-항원 테트라머를 사용하는 유동 세포 분석에 의해 평가함으로써 측정된다. 하나의 대표적인 예에서, 결합 단백질의 겉보기 KD는 다양한 농도에서 표지된 테트라머의 2-배 희석액을 사용하여 측정한 후, 비선형 회귀에 의해 결합 곡선을 결정하고, 겉보기 KD는 반-최대 결합을 산출하는 리간드의 농도로서 결정된다.
VI. 핵산 및 벡터
본 발명에 포함되는 양태에서, 본원에 기재된 단백질, 예컨대 MAGEC2 면역원성 펩티드 및 이의 단편, MHC 분자, 결합 단백질(예를 들어, TCR, TCR의 항원-결합 단편, CAR 등) 등을 인코딩하는 핵산 분자가 본원에 제공된다.
일부 구체예에서, 핵산 분자는 엄격한 조건 하에 표 1-3에 열거된 폴리펩티드 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산에 대해 예컨대, 전장에 걸쳐 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 동일성을 갖는 서열의 상보체와 혼성화된다.
일부 구체예에서, 핵산 분자는 엄격한 조건 하에 표 1-3에 열거된 폴리펩티드 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 상보체와 혼성화된다.
일부 구체예에서, 핵산 분자는 표 1-3에 열거된 폴리펩티드 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다(예를 들어, 포함하거나, 필수적 요소로 하여 구성되거나, 구성된다).
일부 구체예에서, 핵산 서열은 본원에 기재된 MAGEC2 면역원성 펩티드를 인코딩한다.
일부 구체예에서, 핵산은 표 2에 제시된 바와 같은 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 또는 3개)의 TCR α-사슬 CDR을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다(예를 들어, 포함하거나, 필수적 요소로 하여 구성되거나, 구성된다). 일부 구체예에서, 핵산은 표 2에 제시된 TCR Vα 도메인 서열에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 동일성인 아미노산 서열을 갖는 TCR Vα 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다(예를 들어, 포함하거나, 필수적 요소로 하여 구성되거나, 구성된다). 일부 구체예에서, 핵산은 표 2에 제시된 TCR α-사슬 서열에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 동일성인 아미노산 서열을 갖는 TCR α-사슬을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다(예를 들어, 포함하거나, 필수적 요소로 하여 구성되거나, 구성된다).
일부 구체예에서, 핵산은 표 2에 제시된 바와 같은 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 또는 3개)의 TCR β-사슬 CDR을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다(예를 들어, 포함하거나, 필수적 요소로 하여 구성되거나, 구성된다). 일부 구체예에서, 핵산은 표 2에 제시된 TCR Vβ 도메인 서열에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 동일성인 아미노산 서열을 갖는 TCR Vβ 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다(예를 들어, 포함하거나, 필수적 요소로 하여 구성되거나, 구성된다). 일부 구체예에서, 핵산은 표 2에 제시된 TCR β-사슬 서열에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 동일성인 아미노산 서열을 갖는 TCR β-사슬을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다(예를 들어, 포함하거나, 필수적 요소로 하여 구성되거나, 구성된다).
용어 "핵산"은 "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드" 및 "핵산 분자"를 포함하고, 일반적으로 DNA 또는 RNA의 중합체를 의미하며, 이는 단일-가닥 또는 이중-가닥의 합성되거나 자연원으로부터 수득(예를 들어, 분리 및/또는 정제)될 수 있으며, 이는 천연, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오티드를 함유할 수 있으며, 천연, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오티드간 연결, 예컨대, 비변경된 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 간에 발견된 포스포디에스테르 대신에 포스포로아미데이트 연결 또는 포스포로티오에이트 연결을 함유할 수 있다. 구체예에서, 핵산은 상보적 DNA(cDNA)를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명에 포함되는 핵산은 재조합체이다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "재조합"은 (i) 천연 또는 합성 핵산 세그먼트를 생 세포에서 복제될 수 있는 핵산 분자에 연결함으로써 생 세포 외부에서 작제된 분자, 또는 (ii) 상기 (i)에 기재된 것들의 복제로부터 발생한 분자를 지칭한다. 본원의 목적을 위해, 복제는 시험관내, 생체외, 또는 생체내 복제일 수 있다.
핵산은 당 분야에 공지된 절차를 사용하여 화학적 합성 및/또는 효소적 리게이션 반응에 기반하여 작제될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Green and Sambrook 등 상기]을 참조한다. 예를 들어, 핵산은 자연 발생 뉴클레오티드 또는 분자의 생물학적 안정성을 증가시키거나 혼성화시 형성된 듀플렉스의 물리적 안정성을 증가시키도록 설계된 다양하게 변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘 치환된 뉴클레오티드)를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 핵산을 생성하기 위해 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오티드의 예는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-아이오도우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시하이드록시메틸)우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실퀘오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-치환된 아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 와이부톡소신, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필)우라실, 및 2,6-디아미노푸린을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, 본 발명에 포함되는 하나 이상의 핵산은 Integrated DNA Technologies(Coralville, IA)와 같은 회사로부터 구입할 수 있다.
일 구체예에서, 핵산은 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 이론 또는 메커니즘에 구속됨이 없이, 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화는 mRNA 전사체의 번역 효율을 증가시키는 것으로 여겨진다. 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화는 동일한 아미노산을 인코딩하지만 세포 내에서 보다 용이하게 이용 가능한 tRNA에 의해 번역될 수 있는 천연 코돈을 또 다른 코돈으로 치환하여 번역 효율을 증가시키는 것을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 최적화는 또한 번역을 방해하는 이차 mRNA 구조를 감소시켜 번역 효율을 증가시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열은 숙주 세포(예를 들어, T 세포와 같은 면역 세포)에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 핵산의 뉴클레오티드 서열 또는 엄격한 조건 하에 본원에 기재된 임의의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
엄격한 조건하에서 혼성화하는 뉴클레오티드 서열은 높은 엄격성 조건하에서 혼성화될 수 있다. "높은 엄격성 조건"은 뉴클레오티드 서열이 비특이적 혼성화보다 검출 가능하게 더 강한 양으로 표적 서열(본원에 기재된 임의의 핵산의 뉴클레오티드 서열)에 특이적으로 및/또는 선택적으로 혼성화되는 것을 의미한다. 높은 엄격성 조건은 정확한 상보적 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 구별하거나, 뉴클레오티드 서열과 일치하는 소수의 작은 영역(예를 들어, 3-10개 염기)을 갖는 무작위 서열로부터 단지 소수의 산재된 미스매치를 함유하는 조건을 포함한다. 이러한 작은 상보성 영역은 14-17개 이상의 염기의 전장 상보체보다 더 쉽게 용융되며, 높은 엄격성 혼성화로 인해 이들을 쉽게 구별할 수 있다. 비교적 높은 엄격성 조건은, 예를 들어, 약 50-70℃의 온도에서 약 0.02-0.1 M NaCl 또는 등가물에 의해 제공되는 것과 같은 저염 및/또는 고온 조건을 포함할 것이다. 이러한 높은 엄격성 조건은 뉴클레오티드 서열과 주형 또는 표적 가닥 사이의 미스매치가 존재한다면, 거의 허용되지 않으며, 본 발명의 임의의 TCR의 발현을 검출하는데 특히 적합하다. 조건은 증가하는 양의 포름아미드의 첨가에 의해 더욱 엄격해질 수 있는 것으로 일반적으로 이해된다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 핵산에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 동일성인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
전형적으로, 상기 핵산은 플라스미드, 코스미드, 에피솜, 인공 염색체, 파지 또는 바이러스 벡터와 같은 적합한 벡터에 포함될 수 있는 DNA 또는 RNA 분자이다.
용어 "벡터", "클로닝 벡터" 및 "발현 벡터"는 DNA 또는 RNA 서열(예를 들어, 외래 유전자)이 숙주 세포 내로 도입되어 숙주를 형질전환시키고 도입된 서열의 발현(예를 들어, 전사 및 번역)을 촉진시킬 수 있는 비히클을 의미한다. 따라서, 본 발명에 의해 포함되는 추가의 목적은 본 발명에 의해 포함되는 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
이러한 벡터는 대상체에 투여시 상기 폴리펩티드의 발현을 유발하거나 지시하기 위해 프로모터, 인핸서, 종결인자 등과 같은 조절 요소를 포함할 수 있다. 동물 세포용 발현 벡터에 사용되는 프로모터 및 인핸서의 예는 SV40의 초기 프로모터 및 인핸서(Mizukami T. 등 1987), 몰로니(Moloney) 마우스 백혈병 바이러스의 LTR 프로모터 및 인핸서(Kuwana Y 등 1987), 면역글로불린 H 사슬의 프로모터( Mason J O 등 1985) 및 인핸서(Gillies S D 등 1983) 등을 포함한다.
동물 세포에 대한 임의의 발현 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예는 pAGE107(Miyaji H 등 1990), pAGE103(Mizukami T 등 1987), pHSG274(Brady G 등 1984), pKCR(O'Hare K 등 1981), pSG1 베타 d2-4-(Miyaji H 등 1990) 등을 포함한다. 플라스미드의 다른 대표적인 예는 복제 기점을 포함하는 복제 플라스미드, 또는 통합 플라스미드, 예를 들어, pUC, pcDNA, pBR 등을 포함한다. 바이러스 벡터의 대표적인 예는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 바이러스 및 AAV 벡터를 포함한다. 이러한 재조합 바이러스는 당업계에 공지된 기술에 의해, 예컨대 패키징 세포를 형질감염시키거나 헬퍼 플라스미드 또는 바이러스로의 일시적인 형질감염에 의해 생산될 수 있다. 바이러스 패키징 세포의 전형적인 예는 PA317 세포, PsiCRIP 세포, GPenv-양성 세포, 293 세포 등을 포함한다. 이러한 복제-결함 재조합 바이러스를 생산하기 위한 상세한 프로토콜은 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, PCT 공개 WO 95/14785, PCT 공개 WO 96/22378, 미국 특허 번호 5,882,877, 미국 특허 번호 6,013,516, 미국 특허 번호 4,861,719, 미국 특허 번호 5,278,056 및 PCT 공개 WO 94/19478에서 찾을 수 있다.
일부 구체예에서, 조성물은 본원에 기재된 결합 단백질 또는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산은 오픈 리딩 프레임의 발현에 필요한 조절 요소를 포함한다. 이러한 요소는, 예를 들어, 프로모터, 개시 코돈, 정지 코돈 및 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다. 또한, 인핸서가 포함될 수 있다. 이러한 요소는 결합 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 단편을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
일부 구체예에서, 벡터는 CD8α 및/또는 CD8β을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, CD8α 또는 CD8β를 인코딩하는 핵산 서열은 태그(예를 들어, CD34 농축 태그)를 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결된다. 특정 구체예에서, CD8α 및/또는 CD8β를 인코딩하는 핵산 서열은 내부 리보솜 진입 부위 또는 P2A, E2A, F2A 또는 T2A 등과 같은 자가-절단 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열과 상호연결된다.
일부 구체예에서, 본원에 제공된 발현 벡터는 표 1-3에 제시된 임의의 핵산에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 동일성인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
상기에 기술된 바와 같이 프로모터의 대표적인 예는 Simian 바이러스 40(SV40), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 예를 들어, HIV 장말단 반복(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, 사이토메갈로바이러스(CMV), 예를 들어, CMV 즉시 초기 프로모터, 엡스타인 바르 바이러스(Epstein Barr Virus: EBV), 라우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus: RSV) 뿐만 아니라 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴, 및 인간 메탈로티오네인과 같은 인간 유전자로부터의 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 폴리아데닐화 신호의 예는 SV40 폴리아데닐화 신호 및 LTR 폴리아데닐화 신호를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
발현에 필요한 조절 요소 이외에, 다른 요소가 또한 핵산 분자에 포함될 수 있다. 이러한 추가 요소는 인핸서를 포함한다. 인핸서는 본원에 기재된 프로모터를 포함한다. 일부 구체예에서, 인핸서/프로모터는, 예를 들어, 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 및 CMV, RSV 및 EBV로부터의 것들과 같은 바이러스 인핸서를 포함한다.
일부 구체예에서, 핵산은 하기에 추가로 기재된 바와 같이 담체 또는 전달 벡터에 작동 가능하게 혼입될 수 있다. 유용한 전달 벡터는 생분해성 마이크로캡슐, 면역-자극 복합체(ISCOM) 또는 리포좀, 및 바이러스 또는 박테리아와 같은 유전자 조작된 약독화된 생 담체를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 구체예에서, 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 백시니아 바이러스, 바큘로바이러스, 계두, AV-폭스, 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 및 다른 재조합 바이러스이다. 예를 들어, 렌티바이러스 벡터는 T 세포를 감염시키기 위해 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 재조합 발현 벡터는 폴리뉴클레오티드를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, T 세포 또는 항원-제시 세포, 즉, 이의 세포 표면에 펩티드/MHC 복합체를 표시하며, CD8이 결여되어 있는 세포(예를 들어, 수지상 세포)에 전달할 수 있다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 조혈 간세포 또는 인간 면역계 세포이다. 예를 들어, 면역계 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4/CD8 이중 음성 T 세포, gd T 세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. T 세포가 숙주인 일부 구체예에서, T 세포는 나이브, 중심 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 따라서, 재조합 발현 벡터는 또한, 예를 들어, B 림프구, T 림프구 또는 수지상 세포 특이적 TRE와 같은 림프 조직-특이적 전사 조절 요소(TRE)를 포함할 수 있다. 림프 조직 특이적 TRE는 당 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Thompson 등 (1992) Mol. Cell. Biol. 72:1043, Todd 등 (1993) J. Exp. Med. 777:1663, and Penix. 등 (1993) J. Exp. Med. 775:1483] 참조).
일부 구체예에서, 재조합 발현 벡터는 TCRα 사슬, TCRβ 사슬 및/또는 링커 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 재조합 발현 벡터는 이들 사이에 위치한 링커를 갖는 결합 단백질의 전장 TCR 알파 및 TCR 베타 사슬을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 베타 사슬을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 알파 사슬을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치한다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 사이에 위치된 링커와 함께 전장 TCR 알파 및 TCR 베타 사슬을 인코딩하고, 여기서 TCR 베타 사슬을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 TCR 알파 사슬을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한다. 일부 구체예에서, 전장 TCR 알파 및/또는 TCR 베타 사슬은 이의 단편으로 대체된다.
하기에 추가로 기재된 바와 같이, 본 발명에 포함되는 또 다른 양태는 본 발명에 따른 핵산 및/또는 벡터에 의해 형질감염, 감염 또는 형질전환된 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 벡터 또는 핵산 및/또는 단백질의 혼입 뿐만 아니라 임의의 자손 세포를 수용할 수 있는 임의의 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함할 수 있다. 상기 용어는 또한 유전적으로 또는 표현형적으로 동일하거나 상이한 숙주 세포의 자손을 포함한다. 적합한 숙주 세포는 벡터에 의존적일 수 있고, 포유동물 세포, 동물 세포, 인간 세포, 원숭이 세포, 곤충 세포, 효모 세포 및 박테리아 세포를 포함할 수 있다. 이러한 세포는 바이러스 벡터, 칼슘 포스페이트 침전을 통한 형질전환, DEAE-덱스트란, 전기천공, 미세주입 또는 다른 방법의 사용에 의해 벡터 또는 다른 물질을 혼입시키도록 유도될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Sambrook 등 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2d ed.(Cold Spring Harbor Laboratory)] 참조). 용어 "형질전환"은 숙주 세포에 "이종"(즉, 외부 또는 세포외) 유전자, DNA 또는 RNA 서열을 도입하여, 숙주 세포가 도입된 유전자 또는 서열을 발현시켜, 요망되는 물질 전형적으로, 도입된 유전자 또는 서열에 의해 코딩되는 단백질 또는 효소를 생성할 것임을 의미한다. 도입된 DNA 또는 RNA를 수용하고 발현하는 숙주 세포는 "형질전환"되었다.
본 발명에 포함되는 핵산은 적합한 발현 시스템에서 본 발명에 포함되는 재조합 폴리펩티드를 생산하는데 사용될 수 있다. 용어 "발현 시스템"은, 예를 들어, 벡터에 의해 운반되고 숙주 세포에 도입된 외래 DNA에 의해 코딩된 단백질의 발현을 위한 적합한 조건하의 숙주 세포 및 양립가능한 벡터를 의미한다.
일반적인 발현 시스템은 E. 콜라이 숙주 세포 및 플라스미드 벡터, 곤충 숙주 세포 및 바큘로바이러스 벡터, 및 포유동물 숙주 세포 및 벡터를 포함한다. 숙주 세포의 다른 예는 비제한적으로 원핵 세포(예를 들어, 박테리아) 및 진핵 세포(예를 들어, 효모 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등)를 포함한다. 특정 예는 E. 콜라이, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 또는 사카로마이세스(Saccharomyces) 효모, 포유동물 세포주(예를 들어, Vero 세포, CHO 세포, 3T3 세포, COS 세포 등) 뿐만 아니라 일차 또는 확립된 포유동물 세포 배양물(예를 들어, 림프모세포, 섬유모세포, 배아 세포, 상피 세포, 신경계 세포, 지방세포 등으로부터 생산됨)을 포함한다. 예는 또한 마우스 SP2/0-Ag14 세포(ATCC CRL1581), 마우스 P3X63-Ag8.653 세포(ATCC CRL1580), 디하이드로폴레이트 리덕타제 유전자(이하 "DHFR 유전자"로 지칭됨)에 결함이 있는 CHO 세포(Urlaub G 등 (1980), 래트 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포(ATCC CRL 1662, 이하 "YB2/0 세포"로 지칭됨) 등을 포함한다. 일부 구체예에서, YB2/0 세포는 키메라 또는 인간화 결합 단백질의 ADCC 활성이 이 세포에서 발현될 때 향상되기 때문에 사용된다.
본 발명은 또한 본 발명에 포함되는 결합 단백질, 펩티드 및 이의 단편을 발현하는 재조합 숙주 세포를 생산하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 (i) 상기 기술된 바와 같은 재조합 핵산 또는 벡터를 시험관내 또는 생체외에서 적격 숙주 세포에 도입하는 단계, (ii) 수득된 재조합 숙주 세포를 시험관내 또는 생체외에서 배양하는 단계, (iii) 임의적으로, 상기 결합 단백질, 펩티드 및 이의 단편을 발현하는 세포를 선택하는 단계로 구성된 단계들을 포함한다. 이러한 재조합 숙주 세포는 본 발명에 포함되는 진단, 예후, 및/또는 치료 방법에 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 상기 기술된 바와 같이, 본 발명은 선택적 혼성화 조건 하에 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 분리된 핵산을 제공한다. 따라서, 이러한 구체예의 폴리뉴클레오티드는 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 분리, 검출 및/또는 정량하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 포함되는 폴리뉴클레오티드는 기탁된 라이브러리에서 부분 또는 전장 클론을 확인, 분리 또는 증폭하는데 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 인간 또는 포유동물 핵산 라이브러리로부터 분리된 게놈 또는 cDNA이거나 달리 상보적인 게놈 또는 cDNA 서열이다. 일부 구체예에서, cDNA 라이브러리는 적어도 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 또는 이들 사이의 임의의 포괄적 범위, 예컨대 적어도 약 80%-100% 전장 서열을 포함한다. cDNA 라이브러리는 희귀 서열의 표현을 증가시키기 위해 표준화될 수 있다. 낮거나 중간 정도의 엄격성 혼성화 조건은 전형적으로 상보적인 서열에 비해 감소된 서열 동일성을 갖는 서열과 함께, 그러나 배타적이지 않게 사용된다. 중간 및 높은 엄격성 조건은 임의적으로 더 큰 동일성의 서열에 사용될 수 있다. 낮은 엄격성 조건은 약 70%의 서열 동일성을 갖는 서열의 선택적 혼성화를 가능하게 하고, 이종상동성 또는 유사상동 서열을 확인하는데 사용될 수 있다. 임의적으로, 본 발명에 포함되는 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 결합 단백질의 적어도 일부를 인코딩할 것이다. 본 발명에 포함되는 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 포함되는 결합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대한 선택적 혼성화에 사용될 수 있는 핵산 서열을 포함한다(예를 들어, 상기 Ausubel 및 상기 Colligan 참조).
VII. 조작된 세포
본 발명에 포함되는 양태에서, 본원에 기재된 단백질, 예컨대 본원에 기재된 MAGEC2 면역원성 펩티드, MAGEC2 면역원성 펩티드-MHC(pMHC) 복합체, MAGEC2 결합 단백질(예를 들어, TCR, TCR의 항원-결합 단편, CAR, 또는 TCR 및 이펙터 도메인을 포함하는 융합 단백질) 등을 발현하는 숙주 세포가 본원에 제공된다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 본원에 기재된 핵산 또는 벡터를 포함한다.
일부 구체예에서, 결합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 입양 전이 요법에 사용하기 위해 숙주 세포(예를 들어, T 세포)를 형질전환, 형질감염 또는 형질도입하는데 사용된다. 핵산 시퀀싱 및 특정 TCR 시퀀싱의 발전이 기술되었으며(예를 들어, Robins 등 (2009) Blood 114:4099; Robins 등 (2010) Sci. Translat. Med. 2:47ra64, Robins 등 (2011) J. Imm. Meth., and Warren 등 (2011) Genome Res. 21:790)에 기재되어 있으며, 본 발명에 포함되는 구체예를 실시하는 과정에서 사용될 수 있다. 유사하게, 요망되는 핵산으로 T 세포를 형질감염시키거나 형질도입시키는 방법은 요망되는 항원-특이성의 T 세포를 사용하여 입양 전달 절차를 갖는 것으로 당 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, US 특허 공개 번호 US 2004/0087025호) (예를 들어, Schmitt 등 (2009) Hum. Gen. 20:1240, Dossett 등 (2009) Mol. Ther. 77:742, Till 등 (2008) Blood 772:2261, Wang 등 (2007) Hum. Gene Ther. 18:112, Kuball 등 (2007) Blood 709:2331, 미국 특허 공개 2011/0243972, 미국 특허 공개 2011/0189141, 및 Leen 등, (2007) Ann. Rev. Immunol. 25:243).
임의의 적합한 면역 세포는, 예를 들어, T 세포, NK 세포 또는 NK-T 세포를 포함하는 본 발명에 포함되는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 변형될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 일차 세포 또는 세포주의 세포일 수 있다. 일부 구체예에서, 변형된 면역 세포는 CD4+T 세포, CD8+ T 세포, 또는 둘 모두를 포함한다. 본원의 목적을 위해, T 세포는 임의의 T 세포, 예를 들어, 배양된 T 세포, 예를 들어, 일차 T 세포, 또는 배양된 T 세포주, 예를 들어, Jurkat, SupT1 등으로부터의 T 세포, 또는 포유동물로부터 수득된 T 세포일 수 있다. 포유동물로부터 수득되는 경우, T 세포는 혈액, 골수, 림프절, 흉선 또는 다른 조직 또는 유체를 포함하나 이에 제한되지 않는 수많은 공급원으로부터 수득될 수 있다. T 세포는 또한 농축되거나 정제될 수 있다. 일부 구체예에서, T 세포는 인간 T 세포이다. 일부 구체예에서, T 세포는 인간으로부터 분리된 T 세포이다. T 세포는 임의의 유형의 T 세포일 수 있고, 세포독성 림프구, 세포독성 림프구 전구체 세포, 세포독성 림프구 간세포, 세포독성 림프구 줄기 세포, CD4+/CD8+ 이중 양성 T 세포, CD4+ 헬퍼 T 세포, 예를 들어, Th1 및 Th2 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포(예를 들어, 세포독성 T 세포), 종양 침윤 림프구(TIL), 기억 T 세포(예를 들어, 중심 기억 T 세포 및 이펙터 기억 T 세포), 나이브 T 세포 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 개발 단계일 수 있다.
임의의 적절한 방법을 사용하여 세포(예를 들어, T 세포)를 형질감염 또는 형질도입하거나, 본원에 기재된 방법에 포함되는 뉴클레오티드 서열 또는 조성물을 투여하는데 사용할 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 전달하기 위한 방법은, 예를 들어, 양이온성 중합체, 지질-유사 분자, 및 예를 들어, 생체내-jetPEI®와 같은 특정 상업적 제품의 사용을 포함한다. 다른 방법은 생체외 형질도입, 주사, 전기천공, DEAE-덱스트란, 초음파처리 로딩, 리포좀-매개 형질감염, 수용체-매개된 형질도입, 미세발사체 충격, 트랜스포존-매개 전이 등을 포함한다. 숙주 세포를 형질감염 또는 형질도입하는 추가의 방법은 본원에 추가로 상세히 기재된 벡터를 사용한다.
본원에 기재된 바와 같은 변형된 면역 세포는 T 세포 결합, 활성화 또는 유도의 결정을 포함하며, 또한 항원-특이적인 T 세포 반응의 결정을 포함하는 T 세포 활성을 검정하기 위한 방법론을 사용하여 기능적으로 특성규명될 수 있다. 예는 T 세포 증식, T 세포 사이토카인 방출, 항원-특이적 T 세포 자극, MHC 제한된 T 세포 자극, CTL 활성(예를 들어, 미리-로딩된 표적 세포로부터 51Cr 방출을 검출함으로써), T 세포 표현형 마커 발현의 변화 및 T-세포 기능의 다른 측정의 결정을 포함한다.
이들 및 유사한 검정을 수행하기 위한 절차는, 예를 들어, 문헌[Lefkovits (Immunology Methods Manual: Hie Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998)] 뿐만 아니라 [Current Protocols in Immunology, Weir, (1986) Handbook of Experimental Immunology, Blackwell Scientific, Boston, MA; Mishell and Shigii (eds.) (1979) Selected Methods in Cellular Immunology, Freeman Publishing, San Francisco, CA; Green and Reed (1998) Science 281:1309] 및 그 안에 인용된 참고문헌에서 찾아볼 수 있다.
일부 구체예에서, TCR 또는 이의 항원-결합 부분과 같은 결합 단백질에 대한 겉보기 친화성은 다양한 농도의 MHC 멀티머에 대한 결합을 평가함으로써 측정될 수 있다. "MHC-펩티드 멀티머 염색"은 항원-특이적 T 세포를 검출하는데 사용되는 검정을 지칭하며, 이는 일부 구체예에서, MHC 분자의 테트라머를 특징으로 하며, 각각은 동족 (예를 들어, 동일하거나 관련된)인 적어도 하나의 항원(예를 들어, MAGEC2 면역원성 펩티드)인 아미노산 서열을 갖는 동일한 펩티드를 포함하며, 여기서 복합체는 동족 항원을 인식하는 결합 단백질, 예컨대, TCR 또는 이의 항원-결합 부분에 결합할 수 있다. 각각의 MHC 분자는 비오틴 분자로 태깅될 수 있다. 비오티닐화된 MHC/펩티드는 형광 표지될 수 있는 스트렙타비딘의 첨가에 의해 멀티머화(예를 들어, 테트라머화)될 수 있다.
멀티머는 형광 표지를 통한 유세포 분석에 의해 검출될 수 있다. 일부 구체예에서, pMHC 멀티머 검정은 본 발명에 포함되는 TCR 또는 이의 항원-결합 부분과 같은 향상된 친화성 결합 단백질을 검출하거나 선택하는데 사용된다. 일부 예에서, 결합 단백질, 예컨대 TCR 또는 이의 항원-결합 부분의 겉보기 KD는 다양한 농도에서 표지된 멀티머의 2-배 희석액을 사용하여 측정한 후, 비선형 회귀에 의해 결합 곡선을 결정되고, 겉보기 KD는 반-최대 결합을 산출하는 리간드의 농도로서 결정된다.
사이토카인의 수준은 본원에 기재된 방법, 예를 들어, ELISA, ELISPOT, 세포내 사이토카인 염색, 및 유세포 분석 및 이들의 조합(예를 들어, 세포내 사이토카인 염색 및 유세포 분석)을 사용하여 결정될 수 있다.
면역 반응의 항원-특이적 유도 또는 자극으로 인한 면역 세포 증식 및 클론 확장은 림프구, 예컨대 말초 혈액 세포의 샘플에서 순환 림프구 또는 림프절로부터의 세포를 분리하고, 항원으로 세포를 자극하고, 예를 들어, 삼중수소화 티미딘 또는 비-방사성 검정, 예를 들어, MTT 검정 등의 혼입에 의한 사이토카인 생산, 세포 증식 및/또는 세포 생존을 측정함으로써 결정될 수 있다. Th1 면역 반응과 Th2 면역 반응 사이의 균형에 대한 본원에 기재된 면역원의 효과는, 예를 들어, Th1 사이토카인, 예컨대, IFN-g, IL-12, IL-2 및 TNF-b, 및 유형 2 사이토카인, 예컨대 IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 및 IL-13의 수준을 결정함으로써 조사될 수 있다.
본 발명에 의해 포함되는 숙주 세포는 본원에 기재된 바와 같은 결합 단백질을 인코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있거나, 결합 단백질은 하나 초과의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있다. 다시 말해서, 결합 단백질의 성분 또는 부분은 2개 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있고, 이는 단일 핵산 분자에 함유될 수 있거나 2개 이상의 핵산 분자에 함유될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명에 포함되는 결합 단백질의 2개 이상의 성분 또는 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 단일 오픈 리딩 프레임에서 작동적으로 회합된 2개 이상의 코딩 서열을 포함한다. 이러한 배열은 유리하게는, 예를 들어, TCR의 알파- 및 베타-사슬의 동시 발현과 같은 요망되는 유전자 생성물의 조정된 발현을 허용하여, 이들이 약 1:1 비율로 생산되도록 할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명에 포함되는 결합 단백질, 예를 들어, TCR(예를 들어, 알파- 및 베타-사슬) 또는 CAR의 2개 이상의 치환기 유전자 생성물은 별도의 분자로서 발현되고 번역 후 회합된다. 추가 구체예에서, 본 발명에 포함되는 결합 단백질의 2개 이상의 치환기 유전자 생성물은 절단 가능한 또는 제거 가능한 세그먼트에 의해 분리된 부분을 갖는 단일 펩티드로서 발현된다. 예를 들어, 단일 폴리뉴클레오티드 또는 벡터에 의해 인코딩된 분리 가능한 폴리펩티드의 발현에 유용한 자가-절단 펩티드는 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 돼지 테스코바이러스-1 2 A(P2A) 펩티드, 토세아시그나 바이러스 2A(T2A) 펩티드, 말 비염 A 바이러스(ERAV) 2A(E2A) 펩티드, 및 구제역 vims 2A(F2A) 펩티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명에 포함되는 결합 단백질은 하나 이상의 접합 아미노산을 포함한다. "접합 아미노산" 또는 "접합 아미노산 잔기"는 폴리펩티드의 2개의 인접한 모티프, 영역 또는 도메인 사이, 예를 들어, 결합 도메인과 인접한 불변 도메인 사이 또는 TCR 사슬과 인접한 자가-절단 펩티드 사이의 하나 이상(예를 들어, 2 내지 약 10개)의 아미노산 잔기를 지칭한다. 접합 아미노산은 융합 단백질을 인코딩하는 작제물의 설계로부터(예를 들어, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자의 작제 동안 제한 효소 부위의 사용으로부터 생성된 아미노산 잔기), 또는 예를 들어, 본 발명에 의해 포함되는 인코딩된 결합 단백질의 하나 이상의 도메인에 인접한 자가-절단 펩티드의 절단으로부터(예를 들어, TCR a-사슬과 TCR β-사슬 사이에 배치된 P2A 펩티드, 이의 자가-절단은 a-사슬, TCR β-사슬, 또는 둘 모두에 하나 이상의 접합 아미노산을 남길 수 있음) 발생할 수 있다.
본 발명에 포함되는 조작된 면역 세포는, 예를 들어, MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애에 대한 요법으로서 투여될 수 있다. 일부 상황에서, 세포 면역요법과 관련된 활성을 감소 또는 중지시키는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명에 의해 포함되는 조작된 면역 세포는 결합 단백질 및 안전 스위치 단백질과 같은 부속 단백질을 인코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 이는 동족 약물 또는 다른 화합물을 사용하여 표적화되어 바람직한 경우 이러한 세포의 활성을 선택적으로 조절(예를 들어, 감소 또는 제거)할 수 있다. 이와 관련하여 사용되는 안전성 스위치 단백질은 예를 들어, 세포외 N-말단 리간드 결합 도메인 및 세포내 수용체 티로신 키나제 활성이 없지만 천연 아미노산 서열, 타입 I 막횡단 세포 표면 국소화, 및 약학적 등급 항-EGFR 모노클로날 항체에 대한 형태적으로 손상되지 않은 결합 에피토프를 유지하는 절두된 EGF 수용체 폴리펩티드(huEGFRt), 세툭시맙 (Erbitux) tEGF 수용체 (tEGFr; Wang 등 (2011) Blood 118:1255-1263), 카스파제 폴리펩티드(예를 들어, iCasp9; Straathof 등 (2005) Blood 105:4247-4254, Di Stasi 등 (2011) N. Engl. J. Med. 365:1673-1683, Zhou and Brenner (2016) Hematol. pii:S0301-472X:30513-30516), RQR8 (Philip 등 (2014) Blood 124:1277-1287), 및 인간 c-myc 단백질 태그 (Kieback 등 (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:623-628)를 포함한다.
치료 세포에 유용한 다른 부속 성분은 세포가 확인, 분류, 분리, 농축 또는 추적될 수 있게 하는 태그 또는 선택 마커(예를 들어, CD34 농축 태그)를 포함한다. 예를 들어, 원하는 특징(예를 들어, 항원-특이적 TCR 및 안전성 스위치 단백질)을 갖는 표시된 면역 세포는 샘플에서 표지되지 않은 세포로부터 분류되고, 원하는 순도의 치료 제품에 포함시키기 위해 보다 효율적으로 활성화되고 확장될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "선택 마커"는 선택 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 형질도입된 면역 세포의 검출 및 양성 선택을 허용하는 세포에 식별 가능한 변화를 부여하는 핵산 작제물을 포함한다. 예를 들어, RQR은 CD20의 주요 세포외 루프 및 2개의 최소 CD34 결합 부위를 포함하는 선택 마커이다. 일부 구체예에서, RQR-인코딩 폴리뉴클레오티드는 16개 아미노산 CD34 최소 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본원의 예에서 제공된 특정 구체예와 같은 일부 구체예에서, CD34 최소 에피토프는 CD8 줄기 도메인(Q8)의 아미노 말단 위치에 혼입된다. 추가 구체예에서, CD34 최소 결합 부위 서열은 CD20에 대한 표적 에피토프와 조합되어 T 세포(RQR8)에 대한 콤팩트 마커/자살 유전자를 형성할 수 있다(Philip 등 2014). 이러한 작제물은 조작된 T 세포를 발현하는 전이유전자의 선택적 결실을 허용하는 임상적으로 허용되는 약학적 항체, 리툭시맙을 사용하며, 자성 비드(Miltenyi)에 결합된 예를 들어, CD34-특이적 항체와의 작제물을 발현하는 면역 세포의 선택을 허용한다(예를 들어, Philip 등 (2014) Blood 124:1277-1287, 미국 특허 공개 2015-0093401, 및 미국 특허 공개 2018-0051089).
추가의 예시적인 선택 마커는 T 세포 상에서 정상적으로 발현되지 않는 여러 절두된 유형 I 막횡단 단백질을 포함한다: 절두된 저-친화성 신경 성장 인자, 절두된 CD19 및 절두된 CD34(예를 들어, Di Stasi 등 (2011) N. Engl. J. Med. 365:1673-1683, Mavilio 등 (1994) Blood 83:1988-1997, 및 Fehse 등 (2000) Mol. Ther. 7:448-456). CD19 및 CD34의 특히 매력적인 특징은 임상-등급 분류를 위해 이들 마커를 표적화할 수 있는 기성품 Miltenyi CliniMAC™ 선택 시스템의 이용가능성이다. 그러나, CD19 및 CD34는 벡터 패키징 능력 및 통합 벡터의 전사 효율에 부담을 줄 수 있는 비교적 큰 표면 단백질이다. 세포외, 비-신호전달 도메인 또는 다양한 단백질(예를 들어, CD19, CD34, LNGFR 등)을 함유하는 표면 마커가 또한 사용될 수 있다. 임의의 선택 마커가 사용될 수 있고 우수 제조 관행을 위해 허용되어야한다. 일부 구체예에서, 선택 마커는 관심 유전자 생성물(예를 들어, 본 발명에 포함되는 결합 단백질, 예컨대, TCR 또는 CAR, 또는 이의 항원-결합 단편)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 발현된다. 선택 마커의 추가 예는, 예를 들어, 리포터, 예를 들어, GFP, EGFP, β-gal 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT)를 포함한다. 일부 구체예에서, 선택 마커, 예를 들어, CD34는 세포에 의해 발현되고, CD34는 본원에 기재된 방법에 사용하기 위해 형질도입된 관심 세포를 선택, 농축 또는 분리하는데(예를 들어, 면역자기 선택에 의해) 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 CD34 마커는 항-CD34 항체, 또는, 예를 들어, scFv, TCR 또는 CD34에 결합하는 다른 항원 인식 모이어티와 구별된다.
일부 구체예에서, 선택 마커는 RQR 폴리펩티드, 절두된 저-친화성 신경 성장 인자(tNGFR), 절두된 CD19(tCD19), 절두된 CD34(tCD34), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
배경으로, 면역요법 세포 생성물에 CD4+ T 세포의 포함은 항원-유도된 IL-2 분비를 제공하고 전이된 세포독성 CD8+ T 세포의 지속성 및 기능을 증가시킬 수 있다(예를 들어, Kennedy 등 (2008) Immunol. Rev. 222 :129 및 Nakanishi 등 Nature (2009) 52:510). 일부 구체예에서, CD4+ T 세포에서 클래스 I-제한된 TCR은 클래스 I HLA 펩티드 복합체에 대한 TCR의 민감성을 향상시키기 위해 CD8 공동-수용체의 전달을 필요로 할 수 있다. CD4 공동-수용체는 CD8과 구조가 상이하며, CD8 공동-수용체를 효과적으로 대체할 수 없다(예를 들어, Stone & Kranz (2013) Front. Immunol. 4:244 and Cole 등 (2012) Immunology 737:139). 따라서, 본 발명에 포함되는 조성물 및 방법에 사용하기 위한 또 다른 부속 단백질은 CD8 공동-수용체 또는 이의 성분을 포함한다. 본 발명에 포함되는 결합 단백질을 인코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조작된 면역 세포는, 일부 구체예에서, CD8 공동-수용체 단백질, 또는 이의 베타-사슬 또는 알파-사슬 성분을 인코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다.
숙주 세포는 결합 단백질, 안전성 스위치 단백질, 선택 마커 및 CD8 공동-수용체 단백질을 인코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드를 함유하도록 효율적으로 형질도입될 수 있고, 효율적으로 발현될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명에 의해 포함되는 숙주 세포는 변형된 T 세포가 공동-자극 분자를 발현하도록 공동-자극 분자를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 공동-자극 도메인은 CD3, CD27, CD28, CD83, CD86, CD127, 4-1BB, 4-1BBL, PD1 및 PD1L로부터 선택된다.
임의의 전술한 구체예에서, 본원에 기재된 결합 단백질을 발현하는 숙주 세포는 보편적인 면역 세포일 수 있다. "보편적인 면역 세포"는 PD-1, LAG-3, CTLA4, TIM3, TIGIT, HLA 분자, TCR 분자, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 폴리펩티드 생성물을 인코딩하는 하나 이상의 내인성 유전자의 발현을 감소시키거나 제거하도록 변형된 면역 세포를 포함한다. 이론에 국한시키려는 것은 아니지만, 특정 내인적으로 발현된 면역 세포 단백질은 변형된 면역 세포(예를 들어, PD-1, LAG-3, CTLA4, TIGIT)의 면역 활성을 하향조절할 수 있거나, 본 발명에 포함된 이종성으로 발현된 결합 단백질(예를 들어, 비-MAGEC2 항원에 결합하며, MHC 분자의 맥락에서 MAGEC2 면역원성 펩티드와 같은 MAGEC2 항원을 발현하는 표적 세포에의 변형된 면역 세포 결합을 방해하는 내인성 TCR)의 결합 활성을 방해할 수 있다. 또한, 공여자 면역 세포에서 발현된 내인성 단백질(예를 들어, HLA 대립유전자와 같은 면역 세포 단백질)은 동종이계 숙주에 의해 외래인 것으로 인식될 수 있으며, 이는 동종이계 숙주에 의해 변형된 공여자 면역 세포의 제거 또는 억제를 초래할 수 있다.
따라서, 이러한 내인성 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 감소시키거나 제거하는 것은 자가 또는 동종이계 숙주 환경에서 변형된 면역 세포의 활성, 내성 또는 지속성을 개선할 수 있고, (예를 들어, HLA 유형에 관계없이 모든 수신체에게) 세포의 보편적인 투여를 허용한다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따른 세포는 동계이며, 이는 이들이 이식을 가능하게 하도록 유전적으로 동일하거나 충분히 동일하고 면역학적으로 양립가능함을 의미한다. 일부 구체예에서, 보편적인 면역 세포는 공여자 세포(예를 들어, 동종이계) 또는 자가 세포이다. 일부 구체예에서, 본 발명에 의해 포함되는 변형된 면역 세포(예를 들어, 보편적인 면역 세포)는 PD-1, LAG-3, CTLA4, TIM3, TIGIT, HLA 성분(예를 들어, α1 마크로글로불린, α2 마크로글로불린, α3 마크로글로불린, β1 마이크로글로불린, 또는 β2 마이크로글로불린)을 인코딩하는 유전자, 또는 TCR 성분을 인코딩하는 유전자(예를 들어, TCR 가변 영역 또는 TCR 불변 영역을 인코딩하는 유전자) 중 하나 이상의 염색체 유전자 녹아웃을 포함한다(예를 들어, 문헌[Torikai 등 (2016) Nature Sci. Rep. 6:21757; Torikai 등 (2012) Blood 179:5697; and Torikai 등 (2013) Blood 722 :1341] 참조, 또한 본 발명에 따라 유용한 대표적인 예시적인 유전자 편집 기술, 조성물 및 입양 세포 요법을 제공함).
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "염색체 유전자 녹아웃"은 숙주 세포에 의한 기능적으로 활성인 내인성 폴리펩티드 생성물의 생산을 방지(예를 들어, 감소, 지연, 억제 또는 폐지)하는 숙주 세포에서 유전자 변경 또는 도입된 억제제를 지칭한다. 염색체 유전자 녹아웃을 초래하는 변경은, 예를 들어, 도입된 넌센스 돌연변이(조기 정지 코돈의 형성 포함), 미스센스 돌연변이, 유전자 결실 및 가닥 파손 뿐만 아니라 숙주 세포에서 내인성 유전자 발현을 억제하는 억제 핵산 분자의 이종성 발현을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 염색체 유전자 녹아웃 또는 유전자 녹인은 숙주 세포의 염색체 편집에 의해 만들어질 수 있다. 염색체 편집은, 예를 들어, 엔도뉴클레아제를 사용하여 수행될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "엔도뉴클레아제"는 폴리뉴클레오티드 사슬 내의 포스포디에스테르 결합의 절단을 촉매할 수 있는 효소를 지칭한다. 일부 구체예에서, 엔도뉴클레아제는 표적화된 유전자를 절단함으로써 표적화된 유전자를 불활성화시키거나 "녹아웃"시킬 수 있다. 엔도뉴클레아제는 자연 발생, 재조합, 유전자 변형된 또는 융합 엔도뉴클레아제일 수 있다. 엔도뉴클레아제에 의해 야기된 핵산 가닥 파손은 통상적으로 상동 재조합 또는 비-상동 말단 연결(NHEJ)의 별개의 메커니즘을 통해 복구된다. 상동성 재조합 동안, 공여자 핵산 분자는 공여자 유전자 "녹-인", 표적 유전자 "녹-아웃", 및 임의적으로 공여자 유전자 녹인 또는 표적 유전자 녹아웃 이벤트를 통해 표적 유전자를 불활성화시키는데 사용될 수 있다. NHEJ는 종종 절단 부위에서 DNA 서열의 변화, 예를 들어, 적어도 하나의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 첨가를 초래하는 오류-유발 복구 과정이다. NHEJ는 표적 유전자를 "녹-아웃"시키기 위해 사용될 수 있다. 엔도뉴클레아제의 예는 징크 핑거 뉴클레아제, TALE-뉴클레아제, CRISPR-Cas 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 및 megaTAL을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "아연 핑거 뉴클레아제"(ZFN)는 Fokl 엔도뉴클레아제와 같은 비특이적 DNA 절단 도메인에 융합된 아연 핑거 DNA-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 지칭한다. 약 30개 아미노산의 각각의 아연 핑거 모티프는 약 3개의 염기쌍의 DNA에 결합하고, 특정 잔기의 아미노산은 삼중항 서열 특이성을 변경하기 위해 변화될 수 있다(예를 들어, Desjarlais 등 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:2256-2260 및 Wolfe 등 (1999) J. Mol. Biol. 255:1917-1934). 다수의 아연 핑거 모티프는 약 9 내지 약 18개의 염기쌍 범위의 길이를 갖는 영역과 같은 요망되는 DNA 서열에 대한 결합 특이성을 생성하기 위해 나란히 연결될 수 있다. 배경으로, ZFN은 게놈에서 부위-특이적 DNA 이중 가닥 파손(DSB)의 형성을 촉매화함으로써 게놈 편집을 매개하고, DSB의 부위에서 게놈에 상동성인 측접 서열을 포함하는 전이유전자의 표적화된 통합은 상동성 지시 수복에 의해 촉진된다. 대안적으로, ZFN에 의해 생성된 DSB는 절단 부위에서 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실을 초래하는 오류-유발 세포 수복 경로인 비-상동성 말단 연결(NHEJ)에 의한 수복을 통해 표적 유전자의 녹아웃을 초래할 수 있다. 일부 구체예에서, 유전자 녹아웃은 ZFN 분자를 사용하여 만들어진 삽입, 결실, 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "전사 활성제-유사 이펙터 뉴클레아제"(TALEN)는 TALE DNA-결합 도메인 및 DNA 절단 도메인, 예를 들어, Fokl 엔도뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질을 지칭한다. "TALE DNA 결합 도메인" 또는 "TALE"는 하나 이상의 TALE 반복 도메인/단위로 구성되며, 각각은 일반적으로 분기되는 12번째 및 13번째 아미노산을 갖는 고도로 보존된 33-35개의 아미노산 서열을 갖는다. TALE 반복 도메인은 표적 DNA 서열에 대한 TALE의 결합에 관여한다. 반복 가변 이잔기(RVD)로 지칭되는 분기형 아미노산 잔기는 특정 뉴클레오티드 인식과 상관관계가 있다. 이러한 TALE의 DNA 인식을 위한 천연(표준) 코드는, TALE의 위치 12 및 13에서 HD(히스틴-아스파르트산) 서열이 시토신(C)에 대한 TALE 결합을 유도하고, NG(아스파라긴-글리신)는 T 뉴클레오티드에 결합하고, NI(아스파라긴-이소류신)은 A에 결합하고, NN(아스파라긴-아스파라긴)은 G 또는 A 뉴클레오티드에 결합하고, NG(아스파라긴-글리신)은 T 뉴클레오티드에 결합하도록 결정되었다. 비정형(비정형) RVD는 또한 당 분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, 비정형 RVD는 전문이 본원에 참조로서 포함되는 US 특허 공개 번호 2011/0301073). TALEN은 T 세포의 게놈에서 부위-특이적 이중-가닥 파손(DSB)을 지시하는데 사용될 수 있다. 비-상동성 말단 연결(NHEJ)은 어닐링을 위한 서열 중첩이 거의 또는 전혀 없는 이중-가닥 파손의 양쪽으로부터 DNA를 결찰시켜, 유전자 발현을 녹아웃시키는 오류를 도입한다. 대안적으로, 상동성 지시 복구는 상동성 측접 서열이 전이유전자에 존재하는 경우 DSB의 부위에 전이유전자를 도입할 수 있다. 일부 구체예에서, 유전자 녹아웃은 TALEN 분자를 사용하여 만들어진 삽입, 결실, 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "클러스터링된 규칙적으로 이격된 짧은 회문 반복부/Cas"(CRISPR/Cas) 뉴클레아제 시스템은 염기쌍 상보성을 통해 게놈(프로토스페이서로 공지됨) 내의 표적 부위를 인식하고, 짧은 보존된 프로토스페이서 관련 모티프(PAM)가 상보적 표적 서열의 3' 바로 다음에 오는 경우 DNA를 절단하기 위해 CRISPR RNA(crRNA)-가이드된 Cas 뉴클레아제를 사용하는 시스템을 지칭한다. CRISPR/Cas 시스템은 Cas 뉴클레아제의 서열 및 구조에 기초하여 3개의 유형(즉, 유형 I, 유형 II, 및 유형 III)으로 분류된다. 유형 I 및 III의 crRNA-유도된 감시 복합체는 다수의 Cas 서브유닛을 필요로한다. 가장 많이 연구된 유형 II 시스템은 적어도 3개의 성분: RNA-가이드된 Cas9 뉴클레아제, crRNA, 및 트랜스-작용 crRNA(tracrRNA)를 포함한다. tracrRNA는 듀플렉스 형성 영역을 포함한다. crRNA 및 tracrRNA는 Cas9 뉴클레아제와 상호작용할 수 있고, PAM으로부터의 상류의 표적 DNA 상의 프로토스페이서 및 crRNA 상의 스페이서 사이의 Watson-Crick 염기-쌍형성을 통해 표적 DNA 상의 특이적 부위로 Cas9/crRNA:tracrRNA 복합체를 안내할 수 있는 듀플렉스를 형성한다. Cas9 뉴클레아제는 crRNA 스페이서에 의해 정의된 영역 내에서 이중-가닥 파손을 절단한다. NHEJ에 의한 수복은 표적화된 유전자좌의 발현을 방해하는 삽입 및/또는 결실을 초래한다. 대안적으로, 상동성 측접 서열을 갖는 전이유전자는 상동성 지시 수복을 통해 DSB의 부위에 도입될 수 있다. crRNA 및 tracrRNA는 단일 가이드 RNA(sgRNA 또는 gRNA)로 조작될 수 있다(예를 들어, Jinek 등 (2012) Science 337:816-821). 또한, 표적 부위에 상보적인 가이드 RNA의 영역은 요망되는 서열을 표적화하기 위해 변경되고 프로그래밍될 수 있다(Xie 등 (2014) PLOS One 9:el00448, 미국 특허 공개 번호 US 2014/0068797, 미국 특허 공개 번호 US 2014/0186843, 미국 특허 번호 8,697,359, 및 PCT 공개 번호 WO 2015/071474). 일부 구체예에서, 유전자 녹아웃은 삽입, 결실, 돌연변이 또는 이의 조합을 포함하며, CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템을 사용하여 이루어진다.
면역 세포 단백질을 인코딩하는 내인성 유전자를 녹아웃하기 위한 예시적인 gRNA 서열 및 이를 사용한 방법은 문헌 [Ren 등 (2017) Clin. Cancer Res. 23:2255-2266]에 기재된 것들을 포함하며, 이는 대표적이고 예시적인 gRNA, CAS9 DNA, 벡터 및 유전자 녹아웃 기술을 제공한다.
본원에 사용된 바와 같은 "호밍 엔도뉴클레아제"라고도 하는 "메가뉴클레아제"는 큰 인식 부위(약 12 내지 약 40개 염기쌍의 이중 가닥 DNA 서열)를 특징으로 하는 엔도데옥시리보뉴클레아제를 지칭한다. 메가뉴클레아제는 서열 및 구조 모티프에 따라 5가지 패밀리로 나눌 수 있다: LAGLIDADG, GIY-YIG, HNH, His-Cys box, 및 PD-(D/E)XK. 예시적인 메가뉴클레아제는 I-Scel, I-Ceul, PI-PspI, RI-Sce, I-ScelV, I-Csml, I-Panl, I-Scell, I-Ppol, I-SceIII, I-Crel, I-Tevl, I-TevII 및 I-TevIII을 포함하며, 이의 인식 서열은 잘 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 5,420,032 및 6,833,252, Belfort 등 (1997) Nucl. Acids Res. 25:3379-3388, Dujon 등 (1989) Gene 52:115-118, Perler 등 (1994) Nucl. Acids Res. 22:1125-1127, Jasin (1996) Trends Genet. 72:224-228, Gimble 등 (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180, 및 Argast 등 (1998) J. Mol. Biol. 280: 345-353).
일부 구체예에서, 자연 발생 메가뉴클레아제는 관심 표적, 예컨대 면역 체크포인트, HLA-인코딩 유전자 또는 TCR 요소-인코딩 유전자의 부위-특이적 게놈 변형을 촉진하는데 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, 표적 유전자에 대한 신규한 결합 특이성을 갖는 조작된 메가뉴클레아제는 부위-특이적 게놈 변형을 위해 사용된다(예를 들어, 문헌[Porteus 등 (2005) Nat. Biotechnol. 23:967-73, Sussman 등 (2004) J. Mol. Biol. 342:31-41, Epinat 등 (2003) Nucl. Acids Res. 37:2952-2962, Chevalier 등 (2002) Mol. Cell 70:895-905, Ashworth 등 (2006) Nature 441:656-659, Paques 등 (2007) Curr. Gene Ther. 7:49-66] 및 US 특허 공개 번호 US 2007/0117128, US 2006/0206949, US 2006/0153826, US 2006/0078552, 및 US 2004/0002092 참조). 추가 구체예에서, 염색체 유전자 녹아웃은 megaTAL로서 공지된 융합 단백질을 제조하기 위해 TALEN의 모듈식 DNA 결합 도메인으로 변형된 호밍 엔도뉴클레아제를 사용하여 생성된다. MegaTAL은 하나 이상의 표적 유전자를 녹아웃시킬 뿐만 아니라 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 공여자 주형과 조합하여 사용될 때 이종성 또는 외인성 폴리뉴클레오티드를 도입(녹인)시키기 위해 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 염색체 유전자 녹아웃은 MAGEC2 항원에 (예를 들어, 특이적으로 및/또는 선택적으로) 결합하는 항원-특이적 수용체를 인코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포(예를 들어, 면역 세포)에 도입되는 억제 핵산 분자를 포함하며, 여기서 억제 핵산 분자는 표적-특이적 억제제를 인코딩하며, 인코딩된 표적-특이적 억제제는 숙주 면역 세포에서 (즉, PD-l, TIM3, LAG3, CTLA4, TIGIT, HLA 성분, 또는 TCR 성분, 또는 이의 임의의 조합의) 내인성 유전자 발현을 억제한다.
염색체 유전자 녹아웃은 녹아웃 절차 또는 제제의 사용 후 숙주 면역 세포의 DNA 시퀀싱에 의해 직접 확인될 수 있다.
염색체 유전자 녹아웃은 또한 녹아웃 후 유전자 발현의 부재(예를 들어, 유전자에 의해 인코딩되는 mRNA 또는 폴리펩티드 생성물의 부재)로부터 추론될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명에 의해 포함되는 숙주 세포는 MHC 분자의 맥락에서 MAGEC2 면역원성 펩티드를 포함하는 펩티드-MHC(pMHC) 복합체를 포함하는 표적 세포 중 50% 이상을 특이적으로 및/또는 선택적으로 사멸할 수 있다.
일부 구체예에서, 변형된 면역 세포는 MHC 분자의 맥락에서 MAGEC2 면역원성 펩티드를 포함하는 펩티드-MHC(pMHC) 복합체를 포함하는 표적 세포와 접촉될 경우 사이토카인을 생산할 수 있다.
일부 구체예에서, 사이토카인은 IFN-γ 또는 IL2를 포함한다. 일부 구체예에서, 사이토카인은 TNF-α를 포함한다.
일부 구체예에서, 숙주 세포는 백만 전사체 당 약 1,000개 전사체(TPM) 이하, 950 TPM, 900 TPM, 850 TPM, 800 TPM, 750 TPM, 700 TPM, 650 TPM, 600 TPM, 550 TPM, 500 TPM, 450 TPM, 400 TPM, 350 TPM, 300 TPM, 250 TPM, 200 TPM, 150 TPM, 100 TPM, 95 TPM, 90 TPM, 85 TPM, 80 TPM, 75 TPM, 70 TPM, 65 TPM, 60 TPM, 55 TPM, 50 TPM, 45 TPM, 40 TPM, 35 TPM, 34 TPM, 33 TPM, 32 TPM, 31 TPM, 30 TPM, 29 TPM, 28 TPM, 27 TPM, 26 TPM, 25 TPM, 24 TPM, 23 TPM, 22 TPM, 21 TPM, 20 TPM, 19 TPM, 18 TPM, 17 TPM, 16 TPM, 15 TPM 14 TPM, 13 TPM, 12 TPM, 11 TPM, 10 TPM, 9 TPM, 8 TPM, 7 TPM, 6 TPM, 5 TPM, 4 TPM, 3 TPM, 2 TPM, 및 1 TPM, 또는 이들 사이의 임의의 포괄적 범위 , 예컨대, 약 1,000 TPM 이하 내지 약 35 TPM 이하 수준의 MAGEC2의 발현을 갖는 표적 세포와 접촉시킬 경우 더 높은 수준의 사이토카인 또는 세포독성 분자를 생산할 수 있다. 일부 구체예에서, 낮은 MAGEC2 발현 수준은 약 1 TPM 내지 약 35 TPM, 또는 이들 사이의 임의의 포괄적 범위, 예를 들어, 1-32 TPM을 의미하는 "이형접합성 발현"으로 지칭된다. 예를 들어, 숙주 세포는 적어도 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2.0배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 5.5배, 6배, 6.5배, 7배, 7.5배, 8배, 8.5배, 9배, 9.5배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배 19배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 1000배 이상, 또는 이들 사이의 임의의 포괄적 범위, 예를 들어, 1.2배 내지 2배 더 높은 수준의 사이토카인 또는 세포독성 분자를 생산할 수 있다.
일부 구체예에서, 숙주 세포는 MAGEC2를 발현하는 표적 세포(예를 들어, MAGEC2를 발현하는 과증식성 세포)를 특이적으로 및/또는 선택적으로 사멸시킬 수 있다. 특정 구체예에서, 표적 세포는 MHC 분자(예를 들어, 일치하는 MHC 분자)의 맥락에서 MAGEC2 면역원성 펩티드를 발현한다.
일부 구체예에서, 숙주 세포는 MAGEC2 항원을 발현하지 않고, 본원에 기술된 결합 단백질에 의해 인식되지 않고, 혈청형 HLA-B*07이 아니고/아니거나 HLA-B*07 대립유전자, 예컨대 HLA-B*0702, HLA-B*0704, HLA-B*0705, HLA-B*0709, HLA-B*0710, HLA-B*0715 또는 HLA-B*0721 대립유전자를 발현하지 않는다. 예를 들어, 환자는 MAGEC2-음성이거나 본원에 기술된 MAGEC2 면역원성 펩티드를 제시하는 MHC에 대해 음성(예를 들어 HLA-B*07:02-음성 및/또는 HLA-A*24:02-음성)인 건강한 공여자로부터 숙주 세포 또는 더욱이 선택 및/또는 조작된 자가 세포를 받을 수 있다. 해당 공여자로부터 단리된 세포는 이식 물질의 공급원으로 사용될 수 있다. 동시에, 동일한 공여자로부터 단리된 T 세포는 예컨대 본원에 기술된 MAGEC2 결합 단백질을 발현함으로써 MAGEC2를 인식하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 공여자 세포는 세포 집단을 환자에게 이식하는데 사용될 수 있으며(예를 들어 면역계를 재구성하는데 사용되는 조혈 줄기 세포), 숙주 세포는 고도로 특이적인 항종양 효과를 이끌어내기 위한 목적으로 환자에게 주입될 수 있다. 조작된 공여자 T 세포는 환자의 MAGEC2-양성을 인식하고 제거하여 재발을 방지하고 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애의 완전한 치유를 촉진하도록 설계될 수 있다. 이식된 세포는 공여자로부터 유래되고 따라서 MAGEC2-음성, 본원에 기술된 MAGEC2 면역원성 펩티드를 제공하는 MHC에 대한 혈청형 음성(예컨대 HLA-B*07 혈청형 음성 및/또는 HLA-A*24:02 혈청형 음성 및/또는 본원에 기술된 MAGEC2 면역원성 펩티드를 제공하는 MHC에 대해 음성(예컨대 HLA-B*07:02-음성 및/또는 HLA-A*24:02-음성)이기 때문에, 본원에 기술된 조작된 세포는 최소의 독성 부작용을 가질 수 있다. 이러한 환자-매칭된 숙주 세포 및 치료 방법은 하기에 추가로 기재된 치료 방법에 따라 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 사멸은 사멸 검정에 의해 결정된다. 일부 구체예에서, 사멸 검정은 숙주 세포와 표적 세포를 20:1 내지 0.625:1, 예를 들어, 15:1 내지 1.25:1, 10:1 내지 1.5:1, 8:1 내지 3:1, 6:1 내지 5:1, 20:1 내지 5:1, 10:1 내지 2.5:1 등의 비로 공동 배양함에 의해 수행된다. 일부 구체예에서, 표적 세포는 1 μg/mL 내지 50 pg/mL의 MAGEC2 펩티드, 예를 들어, 1 ug/mL 내지 10 ng/mL, 500 ng/mL 내지 0.5 ng/mL, 10 ng/mL 내지 10 pg/mL, 250 ng/mL 내지 1 ng/mL, 50 ng/mL 내지 5 ng/mL, 20 ng/mL 내지 10 ng/mL 등으로 펄싱된다.
일부 구체예에서, 숙주 세포는 백만 전사체 당 약 1,000 전사체(TPM) 이하, 950 TPM, 900 TPM, 850 TPM, 800 TPM, 750 TPM, 700 TPM, 650 TPM, 600 TPM, 550 TPM, 500 TPM, 450 TPM, 400 TPM, 350 TPM, 300 TPM, 250 TPM, 200 TPM, 150 TPM, 100 TPM, 95 TPM, 90 TPM, 85 TPM, 80 TPM, 75 TPM, 70 TPM, 65 TPM, 60 TPM, 55 TPM, 50 TPM, 45 TPM, 40 TPM, 35 TPM, 34 TPM, 33 TPM, 32 TPM, 31 TPM, 30 TPM, 29 TPM, 28 TPM, 27 TPM, 26 TPM, 25 TPM, 24 TPM, 23 TPM, 22 TPM, 21 TPM, 20 TPM, 19 TPM, 18 TPM, 17 TPM, 16 TPM, 15 TPM 14 TPM, 13 TPM, 12 TPM, 11 TPM, 10 TPM, 9 TPM, 8 TPM, 7 TPM, 6 TPM, 5 TPM, 4 TPM, 3 TPM, 2 TPM, 및 1 TPM, 또는 이들 사이의 임의의 포괄적 범위, 예컨대, 약 1,000 TPM 이하 내지 약 73 TPM 이하의 MAGEC2의 수준을 갖는 표적 세포와 접촉시킬 경우 더 높은 수의 표적 세포를 사멸시킬 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 적어도 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2.0배, 2.2배, 2.5배, 2.8배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 5.5배, 6배, 6.5배, 7배, 7.5배, 8배, 8.5배, 9배, 9.5배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배 19배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 1000배 이상, 또는 이들 사이의 임의의 포괄적 범위, 예를 들어, 1.2배 내지 2배 더 높은 수의 표적 세포를 사멸시킬 수 있다.
본 발명은 본원에 기재된 적어도 하나의 숙주 세포를 포함하는 세포의 집단을 추가로 제공한다. 세포의 집단은 적어도 하나의 다른 세포, 예를 들어, 숙주 세포(예를 들어, T 세포) 외에 기재된 임의의 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함하는 이종 집단일 수 있으며, 이는 재조합 발현 벡터, 또는 T 세포 이외의 세포, 예를 들어, B 세포, 대식세포, 호중구, 적혈구, 간세포, 내피 세포, 상피 세포, 근육 세포, 뇌 세포 등을 포함하지 않는다. 대안적으로, 세포의 집단은 실질적으로 균질한 집단일 수 있으며, 여기서 집단은 주로 재조합 발현 벡터를 포함하는 (예를 들어, 이들로 필수적 요소로 하여 포함하는) 숙주 세포를 주로 포함한다. 집단은 또한 세포의 클론 집단일 수 있고, 여기서 집단의 모든 세포는 재조합 발현 벡터를 포함하는 단일 숙주 세포의 클론이며, 따라서 집단의 모든 세포는 재조합 발현 벡터를 포함한다. 본 발명에 포함되는 일 구체예에서, 세포의 집단은 본원에 기재된 바와 같은 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함하는 클론 집단이다.
본 발명에 포함되는 구체예에서, 집단에서 세포의 수는 빠르게 확장될 수 있다. T 세포의 수의 확장은 당 분야에 널리 공지된 임의의 다수의 방법에 의해 달성될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 8,034,334 및 8,383,099, 미국 특허 공개 번호 2012/0244133, Dudley 등 (2003) J. Immunother. 26:332-242, 및 Riddell 등 (1990) J. Immunol. Methods 128:189-201). 예를 들어, T 세포의 수의 확장은 T 세포를 OKT3 항체, IL-2, 및 피더 PBMC(예를 들어, 조사된 동종이계 PBMC)와 함께 배양함으로써 수행될 수 있다.
VIII . 약학적 조성물
본 발명에 포함되는 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 조성물(예를 들어, 결합 단백질, 핵산, 세포 등) 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물은 본원에 제공된다.
용어 "약학적으로 허용되는"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제나 합병증 없이 합리적인 이익/위험 비율에 상응하게 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 제제, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다.
본 발명에 포함되는 제제 및 다른 조성물은 상기 화합물을 함유하는 예를 들어, (1) 경구 투여, 예를 들어, 드렌치(drenches)(수성 또는 비수성 용액 또는 현탁액), 정제, 볼루스, 분말, 과립, 페이스트; (2) 예를 들어, 멸균 용액 또는 현탁액으로서, 예를 들어, 피하, 근육내 또는 정맥내 주사에 의한 비경구 투여; (3) 국소 적용, 예를 들어, 피부에 적용되는 크림, 연고 또는 스프레이; (4) 질내 또는 직장내, 예를 들어, 페서리, 크림 또는 포말로서; 또는 (5) 에어로졸, 예를 들어, 수성 에어로졸, 리포좀 제제 또는 고체 입자와 같은 다양한 투여 경로에 적합한 것을 포함하는, 고체 또는 액체 형태의 투여를 위해 특정하게 제형화될 수 있다. 비제한적으로, 정제, 캡슐, 액체 시럽, 연질 겔, 좌제 및 관장제와 같은, 본원에 기재된 제제 또는 조성물에 대한 임의의 적절한 폼 팩터가 고려된다.
본 발명에 포함되는 약학적 조성물은 개별 투여 형태, 예컨대, 캡슐, 사쉐 또는 정제, 또는 액체 또는 에어로졸 스프레이로서 제공될 수 있으며, 이들 각각은 미리 결정된 양의 활성 성분을 분말 또는 과립, 용액, 또는 수성 또는 비수성 액체 중 현탁액, 수중유 에멀젼, 유중수 액체 에멀젼, 재구성용 분말, 경구 소비용 분말, 병(병 내의 분말 또는 액체 포함), 경구 용해 필름, 로젠지, 페이스트, 튜브, 검, 및 팩으로서 함유한다. 이러한 투여 형태는 임의의 약학적 방법에 의해 제조될 수 있다.
적합한 부형제는 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤 등 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 바와 같은 숙주 세포, 결합 단백질 또는 융합 단백질을 포함하는 조성물은 적합한 주입 매질을 추가로 포함한다. 적합한 주입 매질은 임의의 등장성 매질 제형일 수 있고, 전형적으로 생리 식염수, Normosol™-R(Abbott) 또는 Plasma-Lyte™ A(Baxter), 물 중 5% 덱스트로스, 링거 락테이트가 이용될 수 있다. 주입 배지는 인간 혈청 알부민 또는 다른 인간 혈청 성분으로 보충될 수 있다. 유효량의 숙주 세포 또는 조성물을 포함하는 단위 용량이 또한 고려된다.
또한 유효량의 숙주 세포 또는 숙주 세포를 포함하는 조성물을 포함하는 단위 용량이 본원에 제공된다. 본원에 기재된 바와 같이, 숙주 세포는 면역 세포, T 세포(CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포), 세포독성 림프구(예를 들어, 세포독성 T 세포 및/또는 자연 살해(NK) 세포) 등을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 단위 용량은 단독으로 또는 다른 세포와 조합하여, 예를 들어, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%의 다른 세포를 포함하는 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%의 조작된 세포를 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 구체예에서, 원하지 않는 세포는 감소된 양으로 존재하거나 실질적으로 존재하지 않으며, 예를 들어, 조성물 중에 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 또는 약 1% 미만의 세포 집단이다.
조성물 또는 단위 용량에서 세포의 양은 적어도 하나의 세포(예를 들어, 적어도 하나의 조작된 CD8+ T 세포, 조작된 CD4+ T 세포, 및/또는 NK 세포)이거나 보다 전형적으로 102개 초과의 세포이고, 예를 들어, 최대 106개, 최대 107개, 최대 108개 세포, 최대 109개 세포, 또는 1010개 초과의 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 약 106 내지 약 1010개 세포/m2의 범위, 예를 들어, 약 105 내지 약 109개 세포/m2의 범위로 투여된다. 세포의 수는 조성물이 의도되는 궁극적인 용도 뿐만 아니라 이에 포함된 세포의 유형에 의존적일 것이다. 예를 들어, 특정 항원에 특이적인 결합 단백질을 함유하도록 변형된 세포는 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 초과의 이러한 세포를 함유하는 세포 집단을 포함할 것이다. 본원에 제공된 용도를 위해, 세포는 일반적으로 1 리터 이하, 500 ml 이하, 250 ml 이하, 또는 100 ml 이하의 부피이다. 구체예에서, 원하는 세포의 밀도는 전형적으로 104개 초과 세포/ml이고, 일반적으로 107개 초과 세포/ml, 일반적으로 108개 이상 세포/ml이다. 세포는 단일 주입으로 또는 일정 범위의 시간에 걸쳐 다중 주입으로 투여될 수 있다. 임상적으로 관련된 수의 면역 세포는 누적적으로 106, 107, 108, 109, 1010, 또는 1011개 세포와 같거나 초과하는 다중 주입으로 배분될 수 있다. 일부 구체예에서, 조작된 면역 세포의 단위 용량은 동종이계 공여자로부터의 조혈 줄기 세포와 (예를 들어, 동시에 또는 동시에) 공동-투여될 수 있다.
약학적 조성물은 의료 분야의 숙련가에 의해 결정되는 바와 같이 치료(또는 예방)될 질환 또는 병태에 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 조성물의 적절한 용량 및 적절한 투여 기간 및 빈도는 환자의 건강 상태, 환자의 크기(즉, 체중, 질량, 또는 신체 면적), 환자의 상태의 유형 및 중증도, 활성 성분의 특정 형태, 및 투여 방법과 같은 인자에 의해 결정될 것이다. 일반적으로, 적절한 용량 및 치료 요법은 치료적 및/또는 예방적 이점(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 보다 빈번한 완전 또는 부분 관해, 더 긴 무질병 및/또는 전체 생존, 또는 증상 중증도의 감소와 같은 개선된 임상 결과를 포함함)을 제공하기에 충분한 양의 조성물(들)을 제공한다.
약학적 조성물의 유효량은 본원에 기재된 바와 같은 요망되는 임상 결과 또는 유익한 치료를 달성하기에 필요한 투여량 및 기간 동안의 충분한 양을 지칭한다. 유효량은 하나 이상의 투여로 전달될 수 있다. 투여가 질병 또는 질병-상태를 갖는 것으로 이미 공지되거나 확인된 대상체에 대한 것이라면, 용어 "치료학적 유효량"은 치료와 관련하여 사용될 수 있는 반면, "예방학적 유효량"은 유효량을 예방 과정으로서 질병 또는 질병-상태(예를 들어, 재발)에 걸리기 쉬우거나 발병할 위험이 있는 대상체에게 투여하는 것을 기술하는데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 약학적 조성물은 단위-용량 또는 다중-용량 용기, 예컨대, 밀봉된 앰풀 또는 바이알로 제공될 수 있다. 이러한 용기는 환자에게 주입될 때까지 제형의 안정성을 보존하기 위해 동결될 수 있다. 일부 구체예에서, 단위 용량은 약 107개 세포/㎡ 내지 약 1011개 세포/㎡의 용량으로 본원에 기재된 바와 같은 숙주 세포를 포함한다. 예를 들어, 비경구 또는 정맥내 투여 또는 제형을 포함하는 다양한 치료 요법에서 본원에 기재된 특정 조성물을 사용하기 위한 적합한 투여량 및 치료 요법의 개발.
대상 조성물이 비경구적으로 투여되는 경우, 조성물은 또한 멸균 수성 또는 유지성 용액 또는 현탁액을 포함할 수 있다. 적합한 비독성 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매는 물, 링거 용액, 등장성 염 용액, 1,3-부탄디올, 에탄올, 프로필렌 글리콜 또는 물과의 혼합물의 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 수용액 또는 현탁액은 하나 이상의 완충제, 예컨대, 소듐 아세테이트, 소듐 시트레이트, 소듐 보레이트 또는 소듐 타르트레이트를 추가로 포함할 수 있다. 물론, 임의의 투여 단위 제형을 제조하는데 사용되는 임의의 물질은 사용되는 양으로 약학적으로 순수하고 실질적으로 무독성이어야한다. 또한, 활성 화합물은 서방형 제조물 및 제형에 혼입될 수 있다. 본원에서 사용되는 투여량 단위 형태는 치료될 대상체에 대한 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 유닛을 지칭한다; 각각의 유닛은 적절한 약학적 담체와 관련하여 원하는 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 조작된 면역 세포 또는 활성 화합물을 함유할 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 기재되고 펩티드에 대해 대표적으로 예시된 면역원성 조성물에 대해 상기에 기술된 바와 같은 약학적 조성물은 대상체에게 투여될 때, MAGEC2를 발현하는 관심 세포에 대한 면역 반응을 유발할 수 있다. 이러한 약학적 조성물은 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애의 예방적 및/또는 치료적 치료를 위한 백신으로서 유용할 수 있다.
IX . 용도 및 방법
본원에 기재된 조성물은 다양한 진단, 예후 및 치료 적용에 사용될 수 있다. 진단 방법, 예후 방법, 치료 방법 또는 이들의 조합과 같은 본원에 기재된 임의의 방법에서, 방법의 모든 단계는 단일 행위자에 의해 또는 대안적으로 한 명 초과의 행위자에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 진단은 치료적 치료를 제공하는 행위자에 의해 직접 수행될 수 있다. 대안적으로, 치료제를 제공하는 사람은 진단 검정의 수행을 요청할 수 있다. 진단의 및/또는 치료적 중재자는 진단 검정 결과를 해석하여 치료 전략을 결정할 수 있다. 유사하게, 이러한 대안적인 공정은 예후 검정과 같은 다른 검정에 적용될 수 있다.
본 발명에 포함되는 일부 용도 및 방법에서, 대상체 또는 대상체 샘플이 이용된다. 일부 구체예에서, 대상체는 동물이다. 동물은 어느 한 성별일 수 있고 임의의 발달 단계에 있을 수 있다. 일부 구체예에서, 동물은 포유동물과 같은 척추동물이다. 일부 구체예에서, 대상체는 비-인간 포유동물이다. 일부 구체예에서, 대상체는 개, 고양이, 소, 돼지, 말, 양 또는 염소와 같은 가축이다. 일부 구체예에서, 대상체는 개 또는 고양이와 같은 반려 동물이다. 일부 구체예에서, 대상체는 소, 돼지, 말, 양 또는 염소와 같은 가축이다. 일부 구체예에서, 대상체는 동물원 동물이다. 일부 구체예에서, 대상체는 연구 동물, 예컨대, 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트), 개, 돼지, 또는 비-인간 영장류이다. 일부 구체예에서, 동물은 유전적으로 조작된 동물이다. 일부 구체예에서, 동물은 유전자전이 동물(예를 들어, 유전자전이 마우스 및 유전자전이 돼지)이다. 일부 구체예에서, 대상체는 어류 또는 파충류이다.
일부 구체예에서, 대상체는 마우스와 같은 설치류이다. 이러한 일부 구체예에서, 마우스는 유전자전이 마우스, 예를 들어, HLA-B72와 같은 인간 MHC(즉, HLA) 분자를 발현하는 마우스이다(예를 들어, Nicholson 등 (2012) Adv. Hematol. 2012:404081). 일부 구체예에서, 대상체는 인간 TCR을 발현하는 유전자전이 마우스 또는 항원-음성 마우스이다(예를 들어, Li 등 (2010) Nat. Med. 16:1029-1034 and Obenaus 등 (2015) Nat. Biotechnol. 33:402-407). 일부 구체예에서, 대상체는 인간 HLA 분자 및 인간 TCR을 발현하는 유전자전이 마우스이다. 일부 구체예에서, 예를 들어, 대상체가 유전자전이 HLA 마우스인 경우, 확인된 TCR은, 예를 들어, 키메라 또는 인간화되도록 변형된다. 일부 구체예에서, TCR 스캐폴드는, 예를 들어, 공지된 결합 단백질 인간화 방법과 유사하게 변형된다.
일부 구체예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구체예에서, 대상체는 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애, 예컨대 암의 동물 모델이다. 예를 들어, 동물 모델은 인간-유래 암의 동소 이종이식 동물 모델일 수 있다.
일부 구체예에서, 대상체는 인간, 예컨대 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 갖는 인간이다.
본원에 기재된 방법은 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "이를 필요로 하는 대상체"는 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애, MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애의 재발, 및/또는 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애에 걸리기 쉬운 임의의 대상체를 포함한다.
본 발명에 포함되는 방법의 일부 구체예에서, 대상체는 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애에 대한 치료 예컨대, 화학요법, 방사선 요법, 표적화된 요법 및/또는 면역요법을 받지 않았다. 일부 구체예에서, 대상체는 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애에 대한 치료, 예컨대, 화학요법, 방사선 요법, 표적화된 요법 및/또는 면역요법을 받았다.
일부 구체예에서, 대상체는 암성 또는 전암성 조직을 제거하기 위한 수술을 받았다. 일부 구체예에서, 암성 조직은 제거되지 않았으며, 예를 들어, 암성 조직은 신체의 수술 불가능한 영역, 예를 들어, 생명에 필수적인 조직, 또는 외과적 절차가 환자에게 상당한 해를 끼칠 위험이 있는 영역에 위치할 수 있다.
일부 구체예에서, 대상체 또는 이의 세포는 관련 요법, 예를 들어, 표준 치료 요법, 면역 체크포인트 억제제 요법 등에 내성이다. 예를 들어, 본 발명에 포함되는 하나 이상의 바이오마커를 조절하는 것은 면역 체크포인트 억제제 요법에 대한 내성을 극복할 수 있다.
일부 구체예에서, 대상체는 원치 않는 부재하는, 존재하는 또는 비정상적인 MAGEC2 발현을 갖는 것으로 확인된 것과 같이, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 따른 조절을 필요로 한다.
a. 진단 방법
본 발명에 포함되는 양태에서, MAGEC2 항원, MAGEC2 항원-MHC 복합체, MAGEC2를 발현하는 관심 세포 및/또는 MAGEC2에 대한 발현을 갖는 세포의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 진단 방법으로서, 본원에 기술된 적어도 하나의 결합 단백질 또는 적어도 하나의 숙주 세포의 사용에 의해 샘플 중 상기 MAGEC2 항원의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구체예에서, 방법은 (예를 들어, 대상체로부터의) 샘플을 수득하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 결합 단백질 또는 적어도 하나의 숙주 세포는 MHC 분자의 맥락에서 MAGEC2 펩티드 에피토프와 복합체를 형성하고, 복합체는 형광 활성화된 세포 분류(FACS), 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사면역 검정(RIA), 면역화학, 웨스턴 블롯 또는 세포내 유동 검정의 형태로 검출된다.
본 발명에 의해 포함되는 양태에서, 대상체에서 MAGEC2 또는 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애의 수준을 검출하기 위한 진단 방법으로서, a) 대상체로부터 수득된 샘플을 적어도 하나의 제제(예를 들어 본원에 기재된 MAGEC2 면역원성 펩티드, MAGEC2 면역원성 펩티드-MHC 복합체(pMHC), 결합 단백질, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단)과 접촉시키는 단계; 및 b) 반응성의 수준을 검출하는 단계를 포함하며, 대조군 수준과 비교하여 더 높은 수준의 반응성은 대상체에서 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애의 수준을 나타내는, 진단 방법이 본원에 제공된다.
일부 구체예에서, 반응성의 수준은 T 세포 활성화 또는 이펙터 기능, 예를 들어, 비제한적으로 T 세포 증식, 사멸, 또는 사이토카인 방출에 의해 표시된다. 대조군 수준은 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애에 노출되지 않은 건강한 대상체의 참조 넘버 또는 수준일 수 있다.
생물학적 샘플은 본원에 기재된 바와 같은 제제에 대한 면역 반응의 존재 및 수준을 결정하기 위해 대상체로부터 수득될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "생물학적 샘플"은 혈액 샘플(이로부터 혈청 또는 혈장이 제조될 수 있음), 생검 표본, 체액(예를 들어, 혈액, 분리된 PBMC, 분리된 T 세포, 폐 세척액, 복수, 점막 세척액, 활액, 체액 등), 골수, 림프절, 조직 외식편, 장기 배양물 또는 대상체 또는 생물학적 공급원으로부터의 임의의 다른 조직 또는 세포 제조물일 수 있다. 생물학적 샘플은 또한 임의의 약학적 조성물을 수용하기 전에 대상체로부터 수득될 수 있으며, 이 생물학적 샘플은 기준선 데이터를 확립하기 위한 대조군으로서 유용하다.
항원-특이적 T 세포 반응은 전형적으로 구조적으로 별개의 또는 관련이 없는 대조군 항원에 대신 노출되는 동일한 공급원 집단으로부터의 T 세포 및 적절한 맥락에서 동족 항원(예를 들어, 면역적합성 항원-제시 세포에 의해 제시되는 경우, T 세포를 프라이밍 또는 활성화시키는데 사용되는 항원)에 노출되는 T 세포 사이에 만들어질 수 있는 본원에 기술된 임의의 T 세포 기능성 파라미터에 따른 관찰된 T 세포 반응(예를 들어, 증식, 사이토킨 방출, CTL 활성, 변경된 세포 표면 마커 표현형 등)의 비교에 의해 결정된다. 대조군 항원에 대한 반응보다 통계적으로 유의하게 더 큰 동족 항원에 대한 반응은 항원-특이성을 의미한다.
면역 반응, 예컨대, 세포독성 T 림프구(CTL)의 수준은 본원에 기술되고 당 분야에서 통상적으로 실시되는 수많은 면역학적 방법 중 임의의 하나에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, CTL 면역 반응의 수준은, 예를 들어, T 세포에 의해 발현된 본원에 기재된 결합 단백질 중 어느 하나의 투여 전 및 후에 결정될 수 있다. CTL 활성을 결정하기 위한 세포독성 검정은 당 분야에서 통상적으로 실시되는 여러 기술 및 방법 중 임의의 하나를 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어, [Henkart 등, "Cytotoxic T-Lymphocytes" in Fundamental Immunology, Paul (ed.) (2003 Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA), 1127-50], 및 여기에 인용된 참고문헌).
본 발명은 부분적으로 생물학적 샘플이 MAGEC2와 같은 관심 표적의 발현과 같이 관심 출력과 연관되어 있는지 여부를 정확하게 분류하기 위한 방법, 시스템 및 코드를 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 통계적 알고리즘 및/또는 경험적 데이터를 사용하여 MAGEC2 발현과 연관된 장애에 대한 요법에 반응하거나 반응하지 않는 것으로 관련 또는 위험 (예를 들어, 대상체로부터의) 샘플을 분류하는 데 유용하다.
MAGEC2의 양 또는 활성을 검출하고, 따라서 샘플이 MAGEC2 발현과 연관된 장애에 대한 요법에 반응할 가능성이 있는지 여부를 분류하는데 유용한 예시적인 방법은 생물학적 샘플을 제제, 예컨대 생물학적 샘플에서 MAGEC2의 양 또는 활성을 검출할 수 있는 본원에 기재된 MAGEC2 면역원성 펩티드 또는 결합제와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은, 예를 들어, 시험 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 제제가 사용되며, 여기서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 이러한 제제는 조합하여(예를 들어, 샌드위치 ELISA에서) 또는 연속적으로 사용될 수 있다. 특정 예에서, 통계 알고리즘은 단일 학습 통계 분류기 시스템이다. 예를 들어, 단일 학습 통계적 분류기 시스템은 예측 또는 확률 값 및 바이오마커의 존재 또는 수준에 기초하여 샘플을 분류하는데 사용될 수 있다. 단일 학습 통계적 분류기 시스템의 사용은 전형적으로 적어도 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 민감도, 특이성, 양성 예측 값, 음성 예측 값 및/또는 전체 정확도로 샘플을 분류한다.
다른 적합한 통계적 알고리즘은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 학습 통계적 분류기 시스템은 복잡한 데이터 세트(예를 들어, 관심 마커의 패널)에 적응하고 이러한 데이터 세트에 기초하여 결정을 내릴 수 있는 기계 학습 알고리즘 기술을 포함한다. 일부 구체예에서, 분류 트리(예를 들어, 랜덤 포레스트)와 같은 단일 학습 통계적 분류기 시스템이 사용된다. 다른 구체예에서, 바람직하게는 나란히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 학습 통계적 분류기 시스템의 조합이 사용된다. 학습 통계적 분류기 시스템의 예는 비제한적으로, 귀납적 학습(예를 들어, 결정/분류 트리, 예컨대, 랜덤 포레스트, 분류 및 회귀 트리(C&RT), 부스팅 트리 등), 아마도 대략적으로 정확한(PAC) 학습, 연결주의 학습(예를 들어, 신경망(NN), 인공 신경망(ANN), 신경 퍼지 네트워크(NFN), 네트워크 구조, 다층 퍼셉트론과 같은 퍼셉트론, 다층 피드-포워드 네트워크, 신경망의 응용 네트워크, 믿음 네트워크에서의 베이지안 학습 등), 강화 학습(예를 들어, 나이브 학습, 적응 동적 학습, 및 시간차 학습과 같은 공지된 환경에서의 수동 학습, 미지의 환경에서의 수동 학습, 미지의 환경에서의 능동적 학습, 학습 작용-가치 함수, 강화 학습의 적용 등), 및 유전 알고리즘 및 진화 프로그래밍을 포함한다. 다른 학습 통계적 분류기 시스템은 지원 벡터 머신(예를 들어, 커널 방법), 다변수 적응 회귀 스플라인(MARS), 레번버그-마르쿠르트(Levenberg-Marquardt) 알고리즘, 가우스-뉴턴(Gauss-Newton) 알고리즘, 가우시안의 혼합물, 경사 하강 알고리즘, 및 학습 벡터 양자화(LVQ)를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명에 포함되는 방법은 샘플 분류 결과를 임상의, 예를 들어, 종양 전문의에게 보내는 것을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 대상체의 진단에 이어서 진단에 기초하여 정의된 치료의 치료학적 유효량을 개체에게 투여한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 대조군 생물학적 샘플(예를 들어, MAGEC2 발현과 연관된 장애가 없는 대상체, 관해 상태인 대상체, 치료에 민감한 장애의 대상체, 장애가 진행 중인 대상체, 또는 다른 관심 대상체로부터의 생물학적 샘플)을 수득하는 것을 추가로 포함한다.
본원에 기재된 분석 방법의 일부 구체예에서, (예를 들어, 대상체로부터의 샘플에서) MAGEC2 발현은 미리 결정된 대조군(표준) 샘플과 비교된다. 대상체로부터의 샘플은 전형적으로 암 세포 또는 조직과 같은 병에 걸린 조직으로부터의 것이다. 대조군 샘플은 동일한 대상체로부터 또는 상이한 대상체로부터 유래될 수 있다. 대조군 샘플은 전형적으로 정상의 비-질환 샘플이다. 그러나, 질병의 병기결정을 위해 또는 치료의 효능을 평가하기 위한 것과 같은 일부 구체예에서, 대조군 샘플은 질병에 걸린 조직으로부터 유래될 수 있다. 대조군 샘플은 여러 상이한 대상체로부터의 샘플의 조합일 수 있다. 일부 구체예에서, 대상체로부터의 MAGEC2 발현 측정(들)은 소정의 수준과 비교된다. 이러한 소정의 수준은 전형적으로 정상 샘플로부터 수득된다. 본원에 기재된 바와 같이, "소정의" 발현은 단지 예로서, 치료를 위해 선택될 수 있는 대상체를 평가하고/거나 암에 대한 반응을 평가하고/거나 조합 암 요법에 대한 반응을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 소정의 바이오마커 양 및/또는 활성 측정(들)은 MAGEC2 발현과 연관된 장애가 있거나 없는 환자의 집단에서 결정될 수 있다. 소정의 바이오마커 양 및/또는 활성 측정(들)은 모든 환자에게 동일하게 적용 가능한 단일 숫자일 수 있거나, 소정의 바이오마커 양 및/또는 활성 측정(들)은 환자의 특정 하위 집단에 따라 달라질 수 있다. 대상체의 연령, 체중, 신장 및 다른 인자는 개체의 소정의 바이오마커 양 및/또는 활성 측정(들)에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 소정의 바이오마커 양 및/또는 활성은 각 대상체에 대해 개별적으로 결정될 수 있다. 일 구체예에서, 본원에 기재된 방법에서 결정되고/거나 비교되는 양은 절대 측정치를 기반으로 한다.
또 다른 구체예에서, 본원에 기재된 방법에서 결정되고/거나 비교되는 양은 상대적 측정, 예를 들어, 비율(예를 들어, 바이오마커 복사체 수, 수준 및/또는 치료 전 대 치료 후의 활성, 스파이크 또는 인공 대조군에 비해 이러한 바이오마커 측정, 하우스키핑 유전자의 발현에 비해 이러한 바이오마커의 측정, 등)을 기반으로한다. 예를 들어, 상대적 분석은 치료 후 바이오마커 측정과 비교하여 치료 전 바이오마커 측정의 비율에 기반할 수 있다. 치료전 바이오마커 측정은 요법의 개시 전 임의의 시점에 이루어질 수 있다. 치료 후 바이오마커 측정은 요법 개시 후 임의의 시점에 이루어질 수 있다. 일부 구체예에서, 치료 후 바이오마커 측정은 지속적인 모니터링을 위해 치료 개시 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20주 이상 및 심지어 무기한으로 더 오랫 동안 이루어진다. 치료는 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 단독으로 또는 다른 제제, 예컨대, 항암제, 예를 들어, 화학요법 또는 면역 체크포인트 억제제와 조합하여 치료하기 위한 요법을 포함할 수 있다.
소정의 MAGEC2 발현은 임의의 적합한 표준일 수 있다. 예를 들어, 소정의 MAGEC2 발현은 대상체 선택이 평가되는 동일하거나 상이한 대상체로부터 수득될 수 있다. 일 구체예에서, 소정의 바이오마커 양 및/또는 활성 측정(들)은 동일한 환자의 이전 평가로부터 얻어질 수 있다. 이러한 방식으로, 환자의 선택의 진행은 시간 경과에 따라 모니터링될 수 있다. 또한, 대조군은 대상체가 인간인 경우, 또 다른 인간 또는 다수의 인간, 예를 들어, 인간의 선택된 그룹의 평가로부터 수득될 수 있다. 이러한 방식으로, 선택이 평가되고 있는 인간의 선택 정도는 적합한 다른 인간, 예를 들어, 관심 인간과 유사한 상황에 있는 다른 인간, 예를 들어, 유사한 또는 동일한 병태(들)의 인간 및/또는 동일한 민족 그룹과 비교될 수 있다.
본 발명에 포함된 일부 구체예에서, 소정의 수준으로부터 MAGEC2 발현의 변화는 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5 또는 5.0배 이상 또는 그 사이의 포괄적 범위이다. 이러한 컷-오프 값은 측정이 치료 후 바이오마커 측정과 비교하여 치료 전 바이오마커 측정의 비율에 기반하는 것과 같이 상대적 변화에 기반할 때 동일하게 적용된다.
일부 구체예에서, MAGEC2 발현은, MAGEC2 폴리펩티드 또는 이의 제제를 검출하거나 정량함으로써, 예컨대, 본원에 기재된 조성물을 사용함으로써 검출 및/또는 정량될 수 있다. 폴리펩티드는 당업자에게 널리 공지된 임의의 다수의 수단, 예를 들어, 면역확산, 면역전기영동, 방사면역검정(RIA), 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 면역형광 검정, 웨스턴 블롯팅, 결합제-리간드 검정, 면역조직화학 기술, 응집, 보체 검정, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 박층 크로마토그래피(TLC), 과확산 크로마토그래피 등에 의해 검출되고 정량화될 수 있다(예를 들어, Basic and Clinical Immunology, Sites and Terr, eds. , Appleton and Lange, Norwalk, Conn. pp 217-262, 1991).
b. 치료 방법
본 발명에 포함되는 양태에서, MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 예방 및/또는 치료하고/거나 MAGEC2를 발현하는 과증식성 세포와 같은 관심 세포에 대한 면역 반응을 유도하는 단계를 포함하는, 방법이 본원에 제공된다. 일부 구체예에서, 방법은 본원에 기재된 조성물, 예컨대 면역원성 조성물, 적어도 하나의 결합 단백질을 발현하는 세포 등의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명에 포함되는 방법은 또한 본원에 기재된 것과 같은 대상체에서 많은 상이한 암의 암 요법에 대한 반응성을 결정하는데 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애는 암이다. 용어 "암" 또는 "종양" 또는 "과다증식성"은 조절되지 않는 증식, 불멸성, 침습성 또는 전이 가능성, 빠른 성장 및 특정 특징적인 형태학적 특징과 같은 암-유발 세포의 전형적인 특징을 보유하는 세포의 존재를 지칭한다. 일부 구체예에서, 이러한 세포는 PD-1, PD-L1, PD-L2 및/또는 CTLA-4와 같은 면역 체크포인트 단백질의 발현 및 활성으로 인해 부분적으로 또는 전체적으로 이러한 특징을 나타낸다.
암세포는 종종 종양의 형태이지만, 이러한 세포는 동물 내에서 단독으로 존재할 수도 있고, 백혈병 같은 혈액암에서와 같이 비-종양성 암 세포일 수도 있다. 본원에 사용된 용어 "암"은 악성 암뿐만 아니라 전암성암도 포함한다. 암은 다양한 암, 방광암(가속성 및 전이성 방광암 포함), 유방암, 결장암(결장직장암 포함), 신장, 간, 폐암(소형 및 비-소형 세포 폐암 및 폐 선암종 포함), 난소, 전립선, 고환, 비뇨생식기, 림프계, 직장, 후두, 췌장(외분비 췌장암종 포함), 식도, 위, 담낭, 자궁경부, 갑상선, 피부(편평 세포 암종 포함)의 것을 포함한 암종; 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 모상 세포 림프종, 조직구 림프종 및 버킷 림프종을 포함하는 림프 계통의 조혈 종양; 급성 및 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군, 골수성 백혈병 및 전골수구성 백혈병을 포함하는 골수 계통의 조혈 종양; 성상세포종, 신경모세포종, 신경아교종 및 신경초종을 포함하는 중추 및 말초 신경계의 종양; 섬유육종, 횡문근육종 및 골육종을 포함하는 중간엽 기원의 종양; 흑색종, 색소성 건피증, 각화극세포종, 정상피종, 갑상선 여포암 및 기형암종을 포함한 기타 종양; 흑색종, 절제불가능한 III기 또는 IV기 악성 흑색종, 편평세포암종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 신경교종, 위장암, 신장암, 난소암, 간암, 직장결장암, 자궁내막암, 신장암, 전립선암, 갑상선암, 신경모세포종, 췌장암, 다형성 교모세포종, 자궁경부암, 위암, 방광암, 간암, 유방암, 대장 암종, 두경부암, 위암, 생식세포종양, 골암, 골종양, 성인 뼈의 악성 섬유성 조직구종; 소아기, 뼈의 악성 섬유성 조직구종, 육종, 소아 육종, 부비동 자연 살해자, 신생물, 형질 세포 신생물; 골수이형성증후군; 신경모세포종; 고환 생식세포 종양, 안구내 흑색종, 골수이형성 증후군; 골수이형성/골수증식성 질환, 윤활막 육종, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 필라델피아 염색체 양성 급성 림프구성 백혈병(Ph+ ALL), 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 비만세포증 및 비만세포증과 연관된 임의의 증상 및 이의 전이를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 또한, 질환은 색소성 두드러기, 비만세포증 예컨대 미만성 피부 비만세포증, 인간의 고립성 비만세포증뿐만 아니라 개 비만세포종 및 수포성, 적혈구 및 혈관확장성 비만세포증과 같은 일부 희귀 아형, 골수증식성 또는 골수이형성 증후군과 같은 연관된 혈액 질환을 동반한 비만세포증, 또는 급성 백혈병, 비만세포증과 연관된 골수증식성 질환, 비만 세포 백혈병, 이에 부가하여 기타 암을 포함한다. 기타 암도 다음을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 장애의 범주 내에 포함된다: 방광암종, 요로상피암종, 유방, 대장, 신장, 간, 폐, 난소, 췌장, 위, 자궁경부암종, 갑상선, 고환, 특히 고환 정상피종 및 피부의 것을 포함한 암종; 편평 세포 암종 포함; 위장 간질 종양("GIST"); 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 모상 세포 림프종 및 버킷 림프종을 포함하는 림프 계통의 조혈 종양; 급성 및 만성 골수성 백혈병 및 전골수구성 백혈병을 포함하는 골수 계통의 조혈 종양; 섬유육종 및 횡문근육종을 포함하는 중간엽 기원의 종양; 흑색종, 정상피종, 사분암종, 신경모세포종 및 신경교종을 포함하는 기타 종양; 성상세포종, 신경모세포종, 신경아교종 및 신경초종을 포함하는 중추 및 말초 신경계의 종양; 섬유육종, 횡문근육종, 골육종을 포함하는 중간엽 기원의 종양; 흑색종, 색소성 건피증, 각화극세포종, 정상피종, 갑상선 여포암, 기형암종, 화학요법 불응성 비-고정종성 생식세포 종양, 및 카포시 육종을 포함하는 기타 종양 및 이의 임의의 전이. 본 발명에 포함되는 방법에 적용할 수 있는 암 유형의 다른 비-제한적 예는 인간 육종 및 암종, 예를 들어 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골형성 육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 윤활막종, 중피종, 유잉종양, 평활근육종, 횡문근육종, 편평세포암종, 기저세포암종, 선암종, 땀샘암종, 피지선암종, 유두암종, 유두선암종, 낭선암종, 수질암종, 기관지성 암종, 신세포암종, 간종, 담관암종, 융모막암종, 정상피종, 배아암종, 윌름스종양, 골암, 뇌종양, 폐암종(폐선암종 포함), 소세포폐암종, 방광암종, 상피암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희돌기교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 망막모세포종; 백혈병, 예를 들어 급성 림프구성 백혈병 및 급성 골수성 백혈병(골수모세포, 전골수구성, 골수단구성, 단핵구 및 적백혈병); 만성 백혈병(만성 골수성(과립구) 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병); 및 진성적혈구증가증, 림프종(호지킨병 및 비-호지킨병), 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 및 중쇄병을 포함한다. 일부 구체예에서, 암은 본질적으로 상피암이고, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 부인과암, 신장암, 후두암, 폐암, 구강암, 두경부암, 난소암, 췌장암, 전립선암 또는 피부암을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구체예에서, 상피암은 비-소세포 폐암, 비유두상 신장 세포 암종, 자궁경부 암종, 난소 암종(예를 들어 장액성 난소 암종) 또는 유방암종이다. 상피암은 장액성, 자궁내막, 점액성, 투명세포, 브레너 또는 미분화를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 다른 방식으로 특성화될 수 있다. 일부 구체예에서, 암은 (진행된) 비-소세포폐암, 흑색종, 두경부 편평 세포암, (진행된) 요로상피 방광암, (진행된) 신장암(RCC), 미세부수체 불안정성-고암, 고전적 호지킨 림프종, (진행된) 위암, (진행된) 자궁경부암, 원발성 종격동 B-세포 림프종, (진행된) 간세포 암종, 유방 침윤성 암종, 방광 요로상피 암종 및 (진행된) 메르켈 세포 암종으로 구성된 군으로부터 선택된다.
또한, 본원에 기재된 조성물은 또한 요망되는 활성을 추가로 조절하기 위해 조합 요법으로 투여될 수 있다. 추가 제제는 화학요법제, 호르몬, 항혈관형성제, 방사성 표지된 화합물, 또는 수술, 냉동요법, 및/또는 방사선요법을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 선행하는 치료 방법은 통상적인 요법의 다른 형태(예를 들어, 당업자에게 잘 알려진 암에 대한 표준 치유 치료)와 함께, 통상적인 요법 전 또는 이후에 연속적으로 시행될 수 있다. 예를 들어, 이러한 조절제는 치료적 유효량의 화학요법제와 함께 투여될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이러한 조절제는 화학요법제의 활성 및 효능을 향상시키기 위해 화학요법과 함께 투여된다. 의사용 탁상 편람(PDR)은 다양한 암의 치료에 사용된 화학요법제의 투여량을 개시한다. 치료적으로 효과적인 이러한 전술한 화학요법 약물의 투여 요법 및 투여량은 치료되는 특정 흑색종, 질병의 정도 및 당업자에게 친숙한 다른 인자에 의존할 것이고, 의사에 의해 결정될 수 있다.
단독으로 또는 다른 요법, 예를 들어, 암 요법과 조합하여 본원에 기재된 하나 이상의 조성물을 사용하는 요법은 MAGEC2-발현 세포를 접촉시키기 위해 사용될 수 있고/있거나 치료에 대한 가능한 반응자로서 지시된 대상체와 같은 요망되는 대상체에게 투여될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이러한 요법은 일단 대상체가 요법(예를 들어, 본원에 기재된 진단 또는 예후 방법에 따라 평가됨)에 대한 반응자가 아닌 것으로 표시되면 피할 수 있으며, 대안적인 치료 요법, 예컨대 표적화된 및/또는 비표적화된 암 요법이 권장 및/또는 투여될 수 있다.
용어 "표적화된 요법"은 선택된 생체분자와 선택적으로 상호작용하여 암을 치료하는 제제의 투여를 지칭한다. 예를 들어, 면역 체크포인트 억제제의 억제에 관한 표적 요법은 본 발명에 포함되는 방법과 조합하여 유용하다.
용어 "면역요법" 또는 "면역요법들"은 일반적으로 유익한 방식으로 면역 반응을 조절하기 위한 임의의 전략을 지칭하며, 면역 반응을 유도, 향상, 억제 또는 달리 변형시키는 것 뿐만 아니라 암과 같은 질병과 싸우기 위해 대상체의 면역 시스템의 특정 부분을 사용하는 임의의 치료를 포함하는 방법에 의해 질병에 걸렸거나 질병에 걸리거나 재발할 위험이 있는 대상체를 치료하는 것을 포함한다. 대상체 자신의 면역 시스템은 이러한 목적을 위한 하나 이상의 제제의 투여와 함께 또는 투여 없이 자극(또는 억제)된다. 면역 반응을 유도하거나 증폭시키도록 설계된 면역요법은 "활성화 면역요법"으로 지칭된다. 면역 반응을 감소시키거나 억제하도록 설계된 면역요법은 "억제 면역요법"으로 지칭된다. 일부 구체예에서, 면역요법은 암 세포와 같은 관심 세포에 특이적이다. 일부 구체예에서, 면역요법은 "비표적화"될 수 있으며, 이는 면역계 세포와 선택적으로 상호작용하지 않지만 면역계 기능을 조절하는 제제의 투여를 지칭한다. 비표적화 요법의 대표적인 예는 화학요법, 유전자 요법 및 방사선 요법을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 형태의 면역요법은, 예를 들어, 암 백신 및/또는 감작된 항원 제시 세포의 사용을 포함할 수 있는 표적화된 요법이다. 예를 들어, 종양용해 바이러스는 정상 세포를 손상시키지 않으면서 암 세포를 감염시키고 용해시킬 수 있어 이들이 암 요법에 잠재적으로 유용하게 할 수 있는 바이러스이다. 종양용해 바이러스의 복제는 종양 세포 파괴를 촉진하고 또한 종양 부위에서 용량 증폭을 일으킨다. 이들은 또한 항암 유전자에 대한 벡터로서 작용하여 이들이 종양 부위에 특이적으로 전달되도록 할 수 있다. 면역요법은 암 항원 또는 질병 항원에 대해 지시된 사전-형성된 항체의 투여(예를 들어, 화학요법제 또는 독소, 종양 항원에 임의적으로 연결된 모노클로날 항체의 투여)에 의해 달성된 숙주의 단기 보호를 위한 수동 면역을 포함할 수 있다. 면역요법은 또한 암 세포주의 세포독성 림프구-인식 에피토프를 사용하는 데 초점을 맞출 수 있다. 대안적으로, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 리보자임, RNA 간섭 분자, 삼중 나선 폴리뉴클레오티드 등은 종양 또는 암의 개시, 진행 및/또는 병리와 관련된 생체분자를 선택적으로 조절하는데 사용될 수 있다. 유사하게, 면역요법은 세포-기반 요법의 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 입양 세포 면역요법은 생성된 후 암 환자에 다시 전이되는 환자의 암에 대한 자연 또는 유전자 조작된 반응성을 갖는 면역 세포, 예컨대 T 세포를 사용하는 면역요법의 한 유형이다. 다수의 활성화된 종양-특이적 T 세포의 주사는 암의 완전하고 지속적인 퇴행을 유도할 수 있다.
면역요법은 암 항원 또는 질병 항원에 대해 지시된 사전-형성된 항체의 투여(예를 들어, 화학요법제 또는 독소, 종양 항원에 임의적으로 연결된 모노클로날 항체의 투여)에 의해 달성된 숙주의 단기 보호를 위한 수동 면역을 포함할 수 있다. 면역요법은 또한 암 세포주의 세포독성 림프구-인식 에피토프를 사용하는 데 초점을 맞출 수 있다. 대안적으로, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 리보자임, RNA 간섭 분자, 삼중 나선 폴리뉴클레오티드 등은 종양 또는 암의 개시, 진행 및/또는 병리와 관련된 생체분자를 선택적으로 조절하는데 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 면역치료제는 면역-자극 분자의 효능제; 면역-억제 분자의 길항제; 케모카인의 길항제; T 세포 활성화를 자극하는 사이토카인의 효능제; T 세포 활성화를 억제하는 사이토카인을 길항하거나 억제하는 제제; 및/또는 B7 패밀리의 막 결합 단백질에 결합하는 제제이다. 일부 구체예에서, 면역치료제는 면역-억제 분자의 길항제이다. 일부 구체예에서, 면역치료제는 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자, 예를 들어, 종양 관련 사이토카인, 케모카인, 성장 인자 및 IL-10, TGF-β 및 VEGF를 포함하는 다른 가용성 인자의 억제 효과를 중화시키는 중화 항체일 수 있다.
일부 구체예에서, 면역요법은 하나 이상의 면역 체크포인트의 억제제를 포함한다. 용어 "면역 체크포인트"는 항암 면역 반응을 조절함으로써, 예컨대, 항-종양 면역 반응을 하향-조절 또는 억제함으로써 면역 반응을 미세 조정하는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 세포 표면 상의 분자 군을 지칭한다. 면역 체크포인트 단백질은 당 분야에 잘 알려져 있으며, 비제한적으로 CTLA-4, PD-1, VISTA, B7-H2, B7-H3, PD-L1, B7-H4, B7-H6, ICOS, HVEM, PD-L2, CD200R, CD160, gp49B, PIR-B, KRLG-1, KIR 패밀리 수용체, TIM-1, TIM-3, TIM-4, LAG-3(CD223), IDO, GITR, 4-IBB, OX-40, BTLA, SIRP알파(CD47), CD48, 2B4(CD244), B7.1, B7.2, ILT-2, ILT-4, TIGIT, HHLA2, 부티로필린, 및 A2aR(예를 들어, WO 2012/ 177624 참조)를 포함한다. 상기 용어는 생물학적으로 활성 단백질 단편 뿐만 아니라 전장 면역 체크포인트 단백질을 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
일부 면역 체크포인트는 면역 시스템의 기능(예를 들어, 면역 반응)을 억제, 하향-조절 또는 저지하는 분자(예를 들어, 단백질)를 포함하는 "면역-억제 면역 체크포인트"이다. 예를 들어, CD274 또는 B7-H1로도 알려진 PD-L1(프로그램된 사멸-리간드 1)은 면역 시스템을 억제하기 위해 T 세포의 증식을 감소시키는 억제 신호를 전달하는 단백질이다. CD152로도 알려진 CTLA-4(세포독성 T-림프구-관련 단백질 4)는 면역 반응을 하향조절하기 위해 면역 체크포인트("오프" 스위치)로 작용하는 항원-제시 세포의 표면 상의 단백질 수용체이다. HAVCR2로도 알려진 TIM-3(T-세포 면역글로불린 및 뮤신-도메인 함유-3)은 대식세포 활성화를 조절하기 위한 면역 체크포인트로서 작용하는 세포 표면 단백질이다. VISTA(T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제제)는 T 세포 이펙터 기능을 억제하고 말초 관용을 유지하기 위해 면역 체크포인트로서 기능하는 타입 I 막횡단 단백질이다. LAG-3(림프구-활성화 유전자 3)은 T 세포의 증식, 활성화 및 항상성을 부정적으로 조절하는 면역 체크포인트 수용체이다. BTLA(B- 및 T-림프구 감쇠기)는 종양 괴사 패밀리 수용체(TNF-R)와의 상호작용을 통해 T 세포 억제를 나타내는 단백질이다. KIR(킬러-세포 면역글로불린-유사 수용체)은 NK 세포, 및 NK 세포의 세포독성 활성을 억제하는 소수의 T 세포 상에서 발현되는 단백질 패밀리이다. 일부 구체예에서, 면역치료제는 T 세포 및 NK 세포를 억제하는 면역 체크포인트 단백질인 아르기나제(ARG) 및 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO)의 활성을 차단할 수 있는 억제제와 같은 면역억제 효소에 특이적인 제제일 수 있으며, 이는 면역억제성 종양 미세환경에서 아미노산 아르기닌 및 트립토판의 이화작용을 변화시킨다. 억제제는 비제한적으로, ARG 및 산화질소 신타제(NOS)를 동시에 차단하는 ARG-발현 M2 대식세포, 니트로아스피린 또는 실데나필(Viagra®)을 표적화하는 N-하이드록시-L-Arg(NOHA); 및 IDO 억제제, 예컨대, 1-메틸-트립토판을 포함할 수 있다. 상기 용어는 생물학적으로 활성 단백질 단편뿐만 아니라 전장 면역 체크포인트 단백질을 인코딩하는 핵산 및 이의 생물학적 활성 단백질 단편을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 용어는 본원에 제공된 상동성 설명에 따른 임의의 단편을 추가로 포함한다.
대조적으로, 다른 면역 체크포인트는 면역 시스템의 기능(예를 들어, 면역 반응)을 활성화, 자극 또는 촉진하는 분자(예를 들어, 단백질)를 포함하는 "면역-자극"이다. 일부 구체예에서, 면역-자극 분자는 CD28, CD80(B7.1), CD86(B7.2), 4-1BB(CD137), 4-1BBL(CD137L), CD27, CD70, CD40, CD40L, CD122, CD226, CD30, CD30L, OX40, OX40L, HVEM, BTLA, GITR 및 이의 리간드 GITRL, LIGHT, LTβR, LTαβ, ICOS(CD278), ICOSL(B7-H2), 및 NKG2D이다. CD40(분화 클러스터 40)은 이들의 활성화에 필요한 항원 제시 세포에서 발견되는 공동자극 단백질이다. 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 4(TNFRSF4) 또는 CD134로도 알려진 OX40은 T-세포 사멸을 방지하고 후속하여 사이토카인 생산을 증가시킴으로써 활성화 후 면역 반응의 유지에 관여한다. CD137은 활성화된 T 세포를 공동-자극하여 증식 및 T 세포 생존을 향상시키는 종양 괴사 인자 수용체(TNF-R) 패밀리의 구성원이다. CD122는 미성숙 T 세포의 조절, 이펙터 또는 기억 T 세포로의 분화를 촉진하는 인터루킨-2 수용체(IL-2) 단백질의 서브유닛이다. CD27은 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리의 구성원이며, 공동-자극 면역 체크포인트 분자로서 작용한다. CD28(분화 클러스터 28)은 T 세포 활성화 및 생존에 필요한 공동-자극 신호를 제공하는 T 세포 상에서 발현되는 단백질이다. TNFRSF18 및 AITR로도 알려진 GITR(글루코코르티코이드-유도된 TNFR-관련 단백질)은 조절 T 세포에 의해 유지되는 우세한 면역학적 자가-관용에서 핵심적인 역할을 하는 단백질이다. CD278로도 알려진 ICOS(유도성 T-세포 공동-자극제)는 활성화된 T 세포에서 발현되고 T 세포 신호전달 및 면역 반응에서 역할을 하는 CD28-슈퍼패밀리 공동자극 분자이다.
면역 체크포인트 및 이들의 서열은 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 대표적인 구체예가 하기에 추가로 기재된다. 면역 체크포인트는 일반적으로 억제 수용체 및 천연 결합 파트너(예를 들어, 리간드)의 쌍에 관한 것이다. 예를 들어, PD-1 폴리펩티드는 억제 신호를 면역 세포에 전달하여 면역 세포 이펙터 기능을 억제할 수 있거나 예를 들어, 가용성 단량체 형태로 존재하는 경우 면역 세포의 (예를 들어, 경쟁적 억제에 의한) 공동자극을 촉진할 수 있는 억제 수용체이다. 바람직한 PD-1 패밀리 구성원은 PD-1과 서열 동일성을 공유하고, 하나 이상의 B7 패밀리 구성원, 예를 들어, B7-1, B7-2, PD-1 리간드, 및/또는 항원 제시 세포 상의 다른 폴리펩티드에 결합한다. 용어 "PD-1 활성"은, 예를 들어, 항원 제시 세포 상의 천연 PD-1 리간드를 결합시킴으로써 활성화된 면역 세포에서 억제 신호를 조절하는 PD-1 폴리펩티드의 능력을 포함한다. 면역 세포에서 억제 신호의 조절은 면역 세포의 증식 및/또는 면역 세포에 의한 사이토카인 분비의 조절을 초래한다. 따라서, 용어 "PD-1 활성"은 PD-1 폴리펩티드가 이의 천연 리간드(들)에 결합하는 능력, 면역 세포 억제 신호를 조절하는 능력, 및 면역 반응을 조절하는 능력을 포함한다. 용어 "PD-1 리간드"는 PD-1 수용체의 결합 파트너를 지칭하며, PD-L1(Freeman 등 (2000) J. Exp. Med. 192:1027-1034) 및 PD-L2(Latchman 등 (2001) Nat. Immunol. 2:261) 둘 모두를 포함한다. 용어 "PD-1 리간드 활성"은 PD-1 리간드 폴리펩티드가 이의 천연 수용체(들)(예를 들어, PD-1 또는 B7-1)에 결합하는 능력, 면역 세포 억제 신호를 조절하는 능력, 및 면역 반응을 조절하는 능력을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "면역 체크포인트 요법"은 이들의 핵산 및/또는 단백질을 억제하는 것과 같은 면역-억제 면역 체크포인트를 억제하는 제제의 사용을 지칭한다. 하나 이상의 이러한 면역 체크포인트의 억제는 억제 신호전달을 차단하거나 달리 중화시켜 암을 보다 효과적으로 치료하기 위해 면역 반응을 상향조절할 수 있다. 면역 체크포인트를 억제하는데 유용한 예시적인 제제는 면역 체크포인트 단백질, 또는 이의 단편에 결합 및/또는 불활성화 또는 억제할 수 있는 항체, 소분자, 펩티드, 펩티드모방체, 천연 리간드, 및 천연 리간드의 유도체; 뿐만 아니라 면역 체크포인트 핵산, 또는 이의 단편의 발현 및/또는 활성을 하향조절할 수 있는 RNA 간섭, 안티센스, 핵산 앱타머 등을 포함한다. 면역 반응을 상향조절하기 위한 예시적인 제제는 단백질과 이의 천연 수용체(들) 사이의 상호작용을 차단하는 하나 이상의 면역 체크포인트 단백질에 대한 항체; 하나 이상의 면역 체크포인트 단백질(예를 들어, 우성 음성 폴리펩티드)의 비-활성화 형태; 하나 이상의 면역 체크포인트 단백질과 이의 천연 수용체(들) 사이의 상호작용을 차단하는 소분자 또는 펩티드; 천연 수용체(들)에 결합하는 융합 단백질(예를 들어, 항체 또는 면역글로불린의 Fc 부분에 융합된 면역 체크포인트 억제 단백질의 세포외 부분); 면역 체크포인트 핵산 전사 또는 번역을 차단하는 핵산 분자; 등을 포함한다. 이러한 제제는 억제 신호전달을 방지하고 면역 반응을 상향조절하기 위해 하나 이상의 면역 체크포인트와 이의 천연 수용체(들)(예를 들어, 항체) 사이의 상호작용을 직접 차단할 수 있다. 대안적으로, 제제는 억제 신호전달을 방지하고 면역 반응을 상향조절하기 위해 하나 이상의 면역 체크포인트 단백질과 이의 천연 수용체(들) 사이의 상호작용을 간접적으로 차단할 수 있다. 예를 들어, 안정화된 세포외 도메인과 같은 면역 체크포인트 단백질 리간드의 가용성 버전은 이의 수용체에 결합하여 적절한 리간드에 결합하는 수용체의 유효 농도를 간접적으로 감소시킬 수 있다. 일 구체예에서, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체 및/또는 항-PD-L2 항체는 단독으로 또는 조합하여 면역 체크포인트를 억제하는데 사용된다. PD-1 경로를 차단하는데 사용되는 치료제는 길항 항체 및 가용성 PD-L1 리간드를 포함한다. PD-1 및 PD-L1/2 억제 경로에 대한 길항제는 PD-1 또는 PD-L1/2에 대한 길항 항체(예를 들어, 17D8, 2D3, 4H1, 5C4(또한 니볼루맙 또는 BMS-936558로서 공지됨), 미국 특허 번호 8,008,449에 개시된 4A11, 7D3 및 5F4; AMP-224, 피딜리주맙(CT-011), 펨브롤리주맙 및 미국 특허 번호 8,779,105; 8,552,154; 8,217,149; 8,168,757; 8,008,449; 7,488,802; 7,943,743; 7,635,757; 및 6,808,710에 기재된 항체)를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 유사하게는, 추가의 대표적인 체크포인트 억제제는 억제 조절인자 CTLA-4(항-세포독성 T-림프구 항원 4 항-세포독성 T-림프구 항원 4)에 대한 항체, 예를 들어, 이필리무맙, 트레멜리무맙(완전히 인간화된), 항-CD28 항체, 항-CTLA-4 애드넥틴, 항-CTLA-4 도메인 항체, 단일 사슬 항-CTLA-4 항체 단편, 중쇄 항-CTLA-4 단편, 경쇄 항-CTLA-4 단편, 및 다른 항체, 예를 들어, 미국 특허 번호 8,748,815; 8,529,902; 8,318,916; 8,017,114; 7,744,875; 7,605,238; 7,465,446; 7,109,003; 7,132,281; 6,984,720; 6,682,736; 6,207,156; 및 5,977,318, 뿐만 아니라 EP 특허 번호 1212422, 미국 특허 공개 번호 2002/0039581 및 2002/086014, 및 문헌 [Hurwitz 등 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:10067-10071]에 기재된 것들일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
PD-1, PD-L1, PD-L2 및 CTLA-4에 대해 예시된 면역 체크포인트 활성, 리간드, 차단 등의 대표적인 정의는 일반적으로 다른 면역 체크포인트에 적용된다.
용어 "비표적화된 요법"은 암을 치료하기 위해 선택된 생체분자와 선택적으로 상호작용하지 않는 제제의 투여를 지칭한다. 비표적화 요법의 대표적인 예는 화학요법, 유전자 요법 및 방사선 요법을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일 구체예에서, 화학요법이 사용된다. 화학요법은 화학요법제의 투여를 포함한다. 이러한 화학요법제는 비제한적으로 하기 화합물의 군으로부터 선택된 것들일 수 있다: 백금 화합물, 세포독성 항생제, 항대사산물, 항-유사분열제, 알킬화제, 비소 화합물, DNA 토포이소머라제 억제제, 탁산, 뉴클레오시드 유사체, 식물 알칼로이드 및 독소; 및 이의 합성 유도체. 예시적인 제제는 비제한적으로, 알킬화제: 질소 머스타드(예를 들어, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 트로포스파미드, 클로람부실, 에스트라무스틴 및 멜팔란), 니트로소우레아(예를 들어, 카르무스틴(BCNU) 및 로무스틴(CCNU)), 알킬설포네이트(예를 들어, 부설판 및 트레오설판), 트리아젠(예를 들어, 다카르바진, 테모졸로미드), 시스플라틴, 트레오설판 및 트로포스파미드; 식물 알칼로이드: 빈블라스틴, 파클리탁셀, 도세탁솔; DNA 토포이소머라제 억제제: 테니포시드, 크리스나톨 및 미토마이신; 항-폴레이트: 메토트렉세이트, 미코페놀산 및 하이드록시우레아; 피리미딘 유사체: 5-플루오로우라실, 독시플루리딘 및 시토신 아라비노시드; 퓨린 유사체: 머캅토퓨린 및 티오구아닌; DNA 항대사산물: 2'-데옥시-5-플루오로우리딘, 아피디콜린 글리시네이트 및 피라졸로이미다졸; 및 항유사분열제: 할리콘드린, 콜히친 및 리족신을 포함한다. 유사하게는, 추가적인 예시적 제제는 백금-함유 화합물(예를 들어, 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴), 빈카 알칼로이드(예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 비노렐빈), 탁소이드(예를 들어, 파클리탁셀 또는 파클리탁셀 등가물, 예컨대, 나노입자 알부민-결합된 파클리탁셀(ABRAXANE), 도코사헥사엔산 결합-파클리탁셀(DHA-파클리탁셀, 탁소프렉신), 폴리글루타메이트 결합-파클리탁셀(PG-파클리탁셀, 파클리탁셀 폴리글루멕스, CT-2103, XYOTAX), 종양-활성화된 프로드럭(TAP) ANG1005(3개의 분자의 파클리탁셀에 결합된 안지오펩-2), 파클리탁셀-EC-1(erbB2-인식 펩티드 EC-1에 결합된 파클리탁셀) 및 글루코스-컨쥬게이션된 파클리탁셀, 예를 들어, 2'-파클리탁셀 메틸 2-글루코피라노실 석시네이트; 도세탁셀, 탁솔), 에피포도필린(예를 들어, 에토포시드, 에토포시드 포스페이트, 테니포시드, 토포테칸, 9-아미노캄프토테신, 캄프토이리노테칸, 이리노테칸, 크리스나톨, 마이토마이신 C), 항-대사산물, DHFR 억제제(예를 들어, 메토트렉세이트, 디클로로메토트렉세이트, 트리메트렉세이트, 에다트렉세이트), IMP 데하이드로게나제 억제제(예를 들어, 미코페놀산, 티아조푸린, 리바비린 및 EICAR), 리보뉴클로티드 리덕타제 억제제(예를 들어, 하이드록시우레아 및 데페록사민), 우라실 유사체(예를 들어, 5-플루오로우라실(5-FU), 플록수리딘, 독시플루리딘, 라티트렉세드, 테가푸르-우라실, 카페시타빈), 시토신 유사체(예를 들어, 시타라빈(ara C), 시토신 아라비노시드 및 플루다라빈), 퓨린 유사체(예를 들어, 메르캅토퓨린 및 티오구아닌), 비타민 D3 유사체(예를 들어, EB 1089, CB 1093 및 KH 1060), 이소프레닐화 억제제(예를 들어, 로바스타틴), 도파민성 신경독(예를 들어, 1-메틸-4-페닐피리디늄 이온), 세포 주기 억제제(예를 들어, 스타우로스포린), 악티노마이신(예를 들어, 악티노마이신 D, 닥티노마이신), 블레오마이신(예를 들어, 블레오마이신 A2, 블레오마이신 B2 , 페플로마이신), 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신, 독소루비신, 페길화된 리포좀 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 피라루비신, 조루비신, 미톡산트론), MDR 억제제(예를 들어, 베라파밀), Ca2+ ATP아제 억제제(예를 들어, 탑시가르긴), 이마티닙, 탈리도미드, 레날리도미드, 티로신 키아제 억제제(예를 들어,악시티닙(AG013736), 보수티닙(SKI-606), 세디라닙(RECENTINTM, AZD2171), 다사티닙(SPRYCEL®, BMS-354825), 에를로티닙(TARCEVA®), 제피티닙(IRESSA®), 이마티닙(Gleevec®, CGP57148B, STI-571), 라파티닙(TYKERB®, TYVERB®), 레스타우르티닙(CEP-701), 네라티닙(HKI-272), 닐로티닙(TASIGNA®), 세막사닙(세막시닙, SU5416), 수니티닙(SUTENT®, SU11248), 토세라닙(PALLADIA®), 반데타닙(ZACTIMA®, ZD6474), 바탈라닙(PTK787, PTK/ZK), 트라스투주맙(HERCEPTIN®), 베바시주맙(AVASTIN®), 리툭시맙(RITUXAN®), 세툭시맙(ERBITUX®), 파니투무맙(VECTIBIX®), 라니비주맙(Lucentis®), 닐로티닙(TASIGNA®), 소라페닙(NEXAVAR®), 에베롤리무스(AFINITOR®), 알렘투주맙(CAMPATH®), 젬투주맙 오조가미신(MYLOTARG®), 템시롤리무스(TORISEL®), ENMD-2076, PCI-32765, AC220, 도비티닙 락테이트(TKI258, CHIR-258), BIBW 2992(TOVOKTM), SGX523, PF-04217903, PF-02341066, PF-299804, BMS-777607, ABT-869, MP470, BIBF 1120 (VARGATEF®), AP24534, JNJ-26483327, MGCD265, DCC-2036, BMS-690154, CEP-11981, 티보자닙(AV-951), OSI-930, MM-121, XL-184, XL-647 및/또는 XL228), 프로테아좀 억제제(예를 들어, 보르테조밉(VELCADE®)), mTOR 억제제(예를 들어, 라파마이신, 템시롤리무스(CCI-779), 에베롤리무스(RAD-001), 리다포롤리무스, AP23573 (Ariad), AZD8055 (AstraZeneca), BEZ235 (Novartis), BGT226 (Norvartis), XL765 (Sanofi Aventis), PF-4691502 (Pfizer), GDC0980 (Genentech), SF1126 (Semafoe) 및 OSI-027 (OSI)), 오블리머센, 젬시타빈, 카르미노마이신, 류코보린, 페메트렉세드, 사이클로포스파미드, 다카르바진, 프로카르비진, 프레드니솔론, 덱사메타손, 캄파테신, 플리카마이신, 아스파라기나제, 아미노프테린, 메토프테린, 포르피로마이신, 멜팔란, 류로시딘, 류로신, 클로르암부실, 트라벡테딘, 프로카르바진, 디스코더몰리드, 카르미노마이신, 아미노프테린 및 헥사메틸 멜라민을 포함한다. 하나 이상의 화학요법제(예를 들어, FLAG, CHOP)를 포함하는 조성물이 또한 사용될 수 있다. FLAG는 플루다라빈, 시토신 아라비노시드(Ara-C) 및 G-CSF를 포함한다. CHOP는 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 독소루비신 및 프레드니손을 포함한다. 또 다른 구체예에서, PARP(예를 들어, PARP-1 및/또는 PARP-2) 억제제가 사용되고, 이러한 억제제는 당 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, Olaparib, ABT-888, BSI-201, BGP-15(N- Gene Research Laboratories, Inc.); INO-1001(Inotek Pharmaceuticals Inc.); PJ34(Soriano 등, 2001; Pacher 등, 2002b); 3-아미노벤즈아미드(Trevigen); 4-아미노-1,8- 나프탈이미드; (Trevigen); 6(5H)-페난트리디논 (Trevigen); 벤즈아미드 (미국 특허 Re. 36,397); 및 NU1025 (Bowman 등). 작용 기전은 일반적으로 PARP에 결합하여 이의 활성을 감소시키는 PARP 억제제의 능력과 관련이 있다. PARP는 베타-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+)의 니코틴아미드 및 폴리-ADP-리보스(PAR)로의 전환을 촉매화한다. 폴리(ADP-리보스) 및 PARP 둘 모두는 전사, 세포 증식, 게놈 안정성 및 발암의 조절과 관련이 있다(Bouchard et.al. (2003) Exp. Hematol. 31:446-454); Herceg (2001) Mut. Res. 477:97-110). 폴리(ADP-리보스) 중합체라제 1(PARP1)은 DNA 단일-가닥 파손(SSB)의 수복에서 핵심 분자이다(de Murcia J. 등 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:7303 -7307; Schreiber 등 (2006) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7:517-528; Wang 등 (1997) Genes Dev. 11:2347-2358). PARP1 기능의 억제에 의한 SSB 수복의 녹아웃은 결함 있는 상동성-지시된 DSB 수복을 갖는 암 세포에서 합성 치사를 유발할 수 있는 DNA 이중-가닥 파손(DSB)을 유도한다(Bryant 등 (2005) Nature 434:913-917; Farmer 등 (2005) Nature 434:913-917). al. (2005) Nature 434:917-921). 화학요법제의 전술한 예는 예시적인 것이며 제한하려는 것이 아니다.
또 다른 구체예에서, 방사선 요법이 사용된다. 방사선 요법에 사용되는 방사선은 이온화 방사선일 수 있다. 방사선 요법은 또한 감마선, X-선 또는 양성자 빔일 수 있다. 방사선 요법의 예는 비제한적으로, 외부-빔 방사선 요법, 방사성 동위원소(I-125, 팔라듐, 이리듐)의 간질 이식, 스트론튬-89와 같은 방사성 동위원소, 흉부 방사선 요법, 복강내 P-32 방사선 요법, 및/또는 전체 복부 및 골반 방사선 요법을 포함한다. 방사선 요법의 일반적인 개요는 문헌[Hellman, Chapter 16: Principles of Cancer Management: Radiation Therapy, 6th edition, 2001, DeVita 등, eds., J.B. Lippencott Company, Philadelphia]을 참조한다. 방사선 요법은 외부 빔 방사선 또는 원격요법으로서 투여될 수 있고, 여기서 방사선은 원격 소스로부터 지향된다. 방사선 치료는 또한 내부 요법 또는 근접요법으로서 투여될 수 있으며, 여기서 방사성 공급원은 암 세포 또는 종양 덩어리에 가깝게 체내에 배치된다. 또한, 감광제, 예컨대, 헤마토포르피린 및 이의 유도체, 베르토포르핀(Vertoporfin)(BPD-MA), 프탈로시아닌, 감광제 Pc4, 데메톡시-하이포크렐린 A; 및 2BA-2-DMHA의 투여를 포함하는 광역동 요법의 사용이 또한 포함된다.
또 다른 구체예에서, 호르몬 요법이 사용된다. 호르몬 치료학적 치료는 예를 들어, 호르몬 효능제, 호르몬 길항제(예를 들어, 플루타미드, 비칼루타미드, 타목시펜, 랄록시펜, 류프롤리드 아세테이트(LUPRON), LH-RH 길항제), 호르몬 생합성 및 프로세싱의 억제제, 및 스테로이드(예를 들어, 덱사메타손, 레티노이드, 델토이드, 베타메타손, 코르티솔, 코르티손, 프레드니손, 데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 미네랄로코르티코이드, 에스트로겐, 테스토스테론, 프로게스틴), 비타민 A 유도체(예를 들어, 올-트랜스 레티노산(ATRA)); 비타민 D3 유사체; 항게스타겐(예를 들어, 미페프리스톤, 오나프리스톤), 또는 항안드로겐(예를 들어, 사이프로테론 아세테이트)을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 신체 조직이 고온(최대 106℉)에 노출되는 절차인 온열요법이 사용된다. 열은 세포를 손상시키거나 세포가 살아가는 데 필요한 물질을 박탈함으로써 종양을 수축시키는데 도움이 될 수 있다. 온열요법은 외부 및 내부 가열 장치를 사용하는 국소, 지엽적 및 전신 온열요법일 수 있다. 온열요법은 효과를 증가시키기 위해 거의 항상 다른 형태의 요법(예를 들어 방사선 요법, 화학요법, 생물학적 요법)과 함께 사용된다. 국소 온열요법은 종양과 같은 아주 작은 부위에 열을 가하는 것을 지칭한다. 신체 외부의 장치로부터 종양을 겨냥한 고주파를 사용하여 해당 부위를 외부에서 가열할 수 있다. 내부 가열을 달성하기 위해, 얇고 가열된 와이어 또는 따뜻한 물로 충진된 중공의 튜브; 이식된 마이크로파 안테나; 및 무선주파 전극을 포함하여 여러 유형의 멸균 프로브 중 하나를 사용할 수 있다. 지엽적 온열요법에서는 장기나 사지가 가열된다. 높은 에너지를 생성하는 자석과 장치는 가열될 영역 위에 배치된다. 관류라고 하는 또 다른 접근법에서는 환자의 혈액 중 일부를 제거하고 가열한 다음 내부로 가열되어 지는 영역 안으로 펌핑(관류)한다. 전신 온열요법은 몸 전체에 퍼진 전이성 암을 치료하는데 사용된다. 따뜻한 물 담요, 뜨거운 왁스, 유도 코일(전기 담요에서의 것과 유사) 또는 열 챔버(대형 인큐베이터와 유사)를 사용하여 수행될 수 있다. 온열요법은 방사선 부작용이나 합병증을 현저하게 증가시키지 않는다. 그러나, 피부에 직접 열을 가하면 치료를 받은 환자의 약 절반에게 불편함이나 심각한 국소 통증이 발생할 수 있다. 또한 일반적으로 빠르게 치유되는 물집이 발생할 수도 있다.
또 다른 구체예에서, 광역학 요법(PDT, 광방사선 요법, 광선요법 또는 광화학요법이라고도 함)이 일부 유형의 암 치료에 사용된다. 이는 감광제로 알려진 특정 화학물질이 단세포 유기체가 특정 유형의 광에 노출될 때 유기체를 죽일 수 있다는 발견에 기초한다. PDT는 감광제와 조합하여 고정-주파수 레이저 광을 사용하여 암세포를 파괴한다. PDT에서는 감광제가 혈류로 주입되어 몸 전체에 걸쳐 세포에 흡수된다. 이 제제는 정상 세포에 비해 암세포에 더 오랜 시간 동안 남아 있다. 치료된 암세포가 레이저 광선에 노출되면 감광제는 광을 흡수하고 치료된 암세포를 파괴하는 활성 형태의 산소를 생성한다. 대부분의 감광제가 건강한 세포를 떠났지만 암세포에는 여전히 존재할 때 광 노출이 발생하도록 신중하게 시기가 조정되어야 한다. PDT에 사용되는 레이저 광은 광섬유(매우 얇은 유리 가닥)를 통해 지향될 수 있다. 광섬유는 암에 가깝게 배치되어 적절한 양의 광을 전달한다. 광섬유는 폐암 치료를 위해 기관지경을 통해 폐 안으로 지향되거나 식도암의 치료를 위해 내시경을 통해 식도 안으로로 지향될 수 있다. PDT의 이점은 건강한 조직에 최소한의 손상을 야기한다는 것이다. 그러나, 현재 사용되고 있는 레이저 광은 조직의 약 3센티미터 초과(1과 1/8인치 조금 넘는 크기)를 통과할 수 없기 때문에 PDT는 주로 피부 위나 바로 아래 또는 내부 장기의 내막에 있는 종양을 치료하는데 사용된다. 광역학요법은 치료 후 6주 이상 동안 피부와 눈을 광에 민감하게 만든다. 환자는 적어도 6주 동안 직사광선과 밝은 실내 조명을 피하는 것이 좋다. 환자가 야외로 나가야 하는 경우 선글라스를 포함한 보호복을 착용할 필요가 있다. PDT의 다른 일시적인 부작용은 특정 부위의 치료와 관련이 있으며 기침, 삼키기 어려움, 복통, 및 고통스러운 호흡 또는 호흡 곤란을 포함할 수 있다. 1995년 12월, 미국 식품의약국(FDA)은 폐색을 유발하는 식도암의 증상을 완화하고 레이저만으로는 만족스럽게 치료할 수 없는 식도암에 대한 증상을 완화하기 위해 포르피머 나트륨, 또는 Photofrin®이라는 광감작제를 승인했다. 1998년 1월, FDA는 폐암에 대한 일반적인 치료가 적합하지 않은 환자의 초기 비소세포폐암의 치료를 위해 포르피머 나트륨을 승인했다. 국립암연구소 및 기타 기관에서는 방광암, 뇌암, 후두암 및 구강암을 포함한 여러 유형의 암에 대한 광역학요법의 사용을 평가하기 위한 임상 시험(조사 연구)을 지원하고 있다.
또 다른 구체예에서, 레이저 요법은 고강도 광을 활용하여 암세포를 파괴하는데 사용된다. 이 기술은 특히 다른 치료법으로 암을 치유할 수 없는 경우 출혈이나 폐색과 같은 암의 증상을 완화하는데 자주 사용된다. 또한 종양을 축소하거나 파괴하여 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 용어 "레이저"는 방사선의 유도 방출에 의한 광의 증폭을 의미한다. 전구에서 나오는 광과 같은 일반적인 광은 많은 파장을 가지며 모든 방향으로 산란한다. 반면에 레이저 광은 특정 파장을 가지고 좁은 광선에 집중된다. 이 유형의 고강도 광은 다량의 에너지를 함유한다. 레이저는 매우 강력하고 강철을 절단하거나 다이아몬드 모양을 만드는데 사용될 수 있다. 레이저는 또한 눈의 손상된 망막을 복구하거나 (메스 대신) 조직을 통한 절단과 같은 매우 정밀한 수술 작업에 사용될 수 있다. 여러 가지 종류의 레이저가 있지만 의학에서 널리 사용되는 종류는 3가지뿐이다: 이산화탄소(CO2) 레이저 -- 이 유형의 레이저는 더 깊은 층에 침투하지 않고 피부 표면에서 얇은 층을 제거할 수 있다. 이 기술은 피부 안으로 깊숙이 퍼지지 않은 종양과 특정 전암성 질환을 치료하는데 특히 유용하다. 전통적인 메스 수술의 대안으로, CO2 레이저도 피부를 절단할 수 있다. 레이저는 이 방식으로 피부암을 제거하는데 사용된다. 네오디뮴:이트륨-알루미늄-가닛(Nd:YAG) 레이저 -- 이 레이저로부터의 광은 다른 유형의 레이저로부터의 광보다 조직 안으로 깊숙이 침투할 수 있고 혈액을 빠르게 응고시킬 수 있다. 이는 광섬유를 통해 신체의 접근하기 어려운 부분으로 전달될 수 있다. 이 유형의 레이저는 때때로 인후암을 치료하기 위해 사용된다. 아르곤 레이저 -- 이 레이저는 조직의 표면층만 통과할 수 있고 따라서 피부과 및 눈 수술에 유용하다. 또한 광역학요법(PDT)으로 알려진 절차에서 종양을 치료하기 위해 감광성 염료와 함께 사용된다. 레이저는 표준 수술 도구에 비해 다음을 포함한 몇 가지 장점이 있다: 레이저는 메스보다 더 정확하다. 주변 피부나 다른 조직과의 접촉이 거의 없기 때문에 절개 부근 조직이 보호된다. 레이저에서 발생하는 열은 수술 부위를 소독하고 따라서 감염 위험을 줄인다. 레이저의 정밀도로 인해 절개 부위가 작아 수술 시간이 단축될 수 있다. 치유 시간이 단축되는 경우가 많다; 레이저 열로 혈관을 봉합하기 때문에 출혈, 붓기, 또는 흉터가 적다. 레이저 수술은 덜 복잡할 수 있다. 예를 들어, 광섬유를 사용하면, 큰 절개를 하지 않고도 레이저 광을 신체 부위로 지향시킬 수 있다. 외래환자 기준으로 더 많은 절차를 수행할 수 있다. 레이저는 암을 치료하는데 2가지 방법으로 사용될 수 있다: 즉, 열로 종양을 축소시키거나 파괴함에 의해, 또는 암세포를 파괴하는 화학물질--감광제로 알려짐--을 활성화시킴에 의함. PDT에서, 감광제는 암세포에 남아 있어 광에 의해 자극되어 암세포를 죽이는 반응을 일으킬 수 있다. CO2 및 Nd:YAG 레이저는 종양을 축소시키거나 파괴하는데 사용된다. 그것은 의사가 방광과 같은 신체의 특정 부위를 볼 수 있도록 하는 관인, 내시경과 함께 사용될 수 있다. 일부 레이저로부터의 광은 광섬유가 장착된 유연한 내시경을 통해 전송될 수 있다. 이를 통해 의사는 수술 외에는 접근할 수 없는 신체 부위를 보고 작업할 수 있으므로 레이저 빔을 매우 정확하게 조준할 수 있다. 레이저는 또한 저배율 현미경과 함께 사용되어, 의사에게 치료되는 부위의 명확한 시야를 제공할 수 있다. 다른 장비와 함께 사용하면, 레이저 시스템은 직경이 200미크론만큼 작은--아주 가는 실의 너비보다 작은-- 절단 영역을 생성할 수 있다. 레이저는 많은 유형의 암을 치료하는데 사용된다. 레이저 수술은 성문(성대)암, 자궁경부암, 피부암, 폐암, 질암, 외음부암 및 음경암의 특정 단계에 대한 표준 치료법이다. 레이저 수술은 암을 파괴하는데 사용되는 것 외에도 암으로 인한 증상을 완화하는 데도 사용된다(완화 치유). 예를 들어, 레이저를 사용하여 환자의 기관(숨통)을 차단하고 있는 종양을 축소시키거나 파괴하여 호흡을 더 쉽게 만들 수 있다. 또한 때로는 결장직장암과 항문암의 완화에도 사용된다. 레이저-유도 간질성 온열치료(LITT)는 레이저 요법에서의 가장 최근 발전 중 하나이다. LITT는 열은 세포를 손상시키거나 세포가 살아가는데 필요한 물질을 박탈함으로써 종양을 수축시키는데 도움이 될 수 있다는: 온열요법이라는 암 치료법과 동일한 아이디어를 사용한다. 이 치료에서는 레이저가 신체에서의 간질 부위(장기 사이 부위)로 지향된다. 레이저 광은 그 다음 종양의 온도를 상승시켜 암세포를 손상시키거나 파괴한다.
일 양태에서, 대상체에서 MAGEC2 항원을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 유도하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구체예에서, 방법은 본원에 기재된 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 약학적 조성물은 대상체에게 투여될 때, MAGEC2 항원을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 유발한다.
일부 구체예에서, 면역 반응은 세포-매개 면역 반응을 포함할 수 있다. 세포 면역 반응은 T 세포를 포함하는 반응이며, 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 결정될 수 있다. 예를 들어, 일반적인 세포 면역 반응은 약학적 조성물의 투여 후 적합한 시간에 대상체로부터 샘플링된 세포(예를 들어, 말초 혈액 백혈구(PBL))에서의 T 세포 증식 활성으로서 결정될 수 있다. 적절한 기간 동안 자극제와 함께, 예를 들어, PBMC의 인큐베이션 후, [3H]티미딘 혼입이 결정될 수 있다. 증식하는 T 세포의 서브세트는 유세포 분석을 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명에 포함되는 또 다른 양태에서, 본원에 제공된 방법은 상기 기재된 바와 같은 인간 및 비인간 포유동물 둘 모두에 투여하는 것을 포함한다. 수의학적 적용이 또한 고려된다. 일부 구체예에서, 대상체는 면역 반응이 유도될 수 있는 임의의 살아있는 유기체일 수 있다.
일부 구체예에서, 약학적 조성물은 적절한 임의의 시간에 투여될 수 있다. 예를 들어, 투여는 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 갖는 대상체의 치료 전 또는 치료 동안 수행될 수 있고, 임상적으로 검출불가능해지는 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애 후에 연속될 수 있다. 투여는 또한 재발의 징후를 나타내는 대상체에서 계속될 수 있다.
일부 구체예에서, 약학적 조성물은 치료적 또는 예방적 유효량으로 투여될 수 있다. 대상체에게 약학적 조성물을 투여하는 것은 공지된 절차를 이용하여, 원하는 효과를 달성하기에 충분한 용량 및 기간 동안 수행될 수 있다.
일부 구체예에서, 약학적 조성물은 임의의 적합한 부위에서 대상체에게 투여될 수 있다. 투여는 당 분야에 일반적으로 공지된 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 세포를 포함하는 제제는 직접 주사에 의해, 또는 비제한적으로, 혈관내, 뇌내, 비경구, 복강내, 정맥내, 경막외, 척수내, 흉골내, 관절내, 활액내, 척수강내, 동맥내, 심장내 또는 근육내 투여를 포함하는 당 분야에서 사용되는 임의의 다른 수단에 의해 요망되는 부위에 도입될 수 있다. 예를 들어, 관심 대상체는 다양한 경로에 의해 이식된 세포로 생착될 수 있다. 이러한 경로는 비제한적으로, 정맥내 투여, 피하 투여, 특정 조직으로의 투여(예를 들어, 국소 이식), 대퇴골 골수강으로의 주사, 비장으로의 주사, 태아 간의 신피막하 투여, 및 등을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명에 포함되는 암 백신은 대상체에게 종양내 또는 피하 주사된다. 세포는 1회 주입으로, 또는 요망되는 효과를 발생시키기에 충분한 규정된 기간에 걸쳐 연속 주입을 통해 투여될 수 있다. 이식된 세포의 이식, 생착 평가 및 마커 표현형 분석을 위한 예시적인 방법은 당 분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Pearson 등 (2008) Curr. Protoc. Immunol. 81:15.21.1-15.21.21; Ito 등 (2002) Blood 100:3175-3182; Traggiai 등 (2004) Science 304:104-107; Ishikawa 등 Blood (2005) 106:1565-1573; Shultz 등(2005) J. Immunol. 174:6477-6489; and Holyoake 등 (1999) Exp. Hematol. 27:1418-1427] 참조). 일부 구체예에서, 용량은 원하는 반응을 일으키는데 효과적인 양과 기간 동안 투여될 수 있으며, 이는 MAGEC2 발현 및/또는 이와 관련된 증상을 특징으로 하는 장애의 면역 반응 또는 예방학적 또는 치료학적 치료를 유발한다.
약학적 조성물은 대상체에서 면역 반응을 또한 유발하는 요법을 포함하는 다른 요법에 이어서, 이전에, 또는 이와 동시에 제공될 수 있다. 예를 들어, 대상체는 다른 형태의 면역조절제에 의해 이전에 또는 동시에 치료될 수 있고, 이러한 다른 요법은 본원에 기재된 조성물의 면역원성을 방해하지 않는 방식으로 제공될 수 있다.
투여는 간병인(예를 들어, 의사, 수의사)에 의해 적절하게 신간 선택될 수 있고, 대상체의 임상 상태, 투여의 목적 및/또는 또한 고려되거나 투여되는 다른 요법에 의존적일 수 있다. 일부 구체예에서, 초기 용량이 투여될 수 있고, 대상체는 면역학적 및/또는 임상적 반응에 대해 모니터링된다. 면역학적 모니터링의 적합한 수단은 반응자로서 환자의 말초 혈액 림프구(PBL) 및 자극제로서 본원에 기재된 면역원성 펩티드 또는 펩티드-MHC 복합체를 사용하는 것을 포함한다. 면역학적 반응은 또한 투여 부위에서 지연된 염증 반응에 의해 결정될 수 있다. 초기 용량에 후속하는 하나 이상의 용량은 요망되는 효과가 달성될 때까지 전형적으로 매월, 반개월 또는 매주 기준으로 적절하게 제공될 수 있다. 그 후, 특히 면역학적 또는 임상적 이점이 가라앉는 것으로 보이는 경우, 추가 부스터 또는 유지 용량이 필요에 따라 제공될 수 있다.
일반적으로, 적절한 투여량 및 치료 요법은 이점을 제공하기에 충분한 양으로 활성 분자 또는 세포를 제공한다. 이러한 반응은 치료되지 않은 대상체와 비교하여 치료된 대상체에서 개선된 임상 결과(예를 들어, 더 빈번한 관해, 완전한 또는 부분적인, 또는 더 긴 무병 생존)를 확립함으로써 모니터링될 수 있다. 바이러스 단백질에 대한 기존의 면역 반응의 증가는 일반적으로 개선된 임상 결과와 상관관계가 있다. 이러한 면역 반응은 일반적으로 관례적인 일상적인 표준 증식, 세포독성 또는 사이토카인 검정을 사용하여 평가될 수 있다.
예방적 사용을 위해, 용량은 질병 또는 장애와 관련된 질병을 예방하거나, 발병을 지연시키거나, 중증도를 감소시키기에 충분해야한다. 본원에 기재된 방법에 따라 투여되는 면역원성 조성물의 예방적 이점은 전임상(시험관내, 생체외 및 생체내 동물 연구 포함) 및 임상 연구를 수행하고 이로부터 수득된 데이터를 적절한 통계적, 생물학적 및 임상 방법 및 기술에 의해 분석함으로써 결정될 수 있으며, 상기 기술은 당업자에 의해 용이하게 실시될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 조성물의 투여는 전달 경로 또는 방식에 관계없이 이를 대상체에게 전달하는 것을 지칭한다. 투여는 연속적으로 또는 간헐적으로, 및 비경구적으로 수행될 수 있다. 투여는 인지된 병태, 질병 또는 질병 상태를 갖는 것으로 이미 확인된 대상체를 치료하기 위한 것일 수 있거나, 이러한 병태, 질병 또는 질병 상태에 걸리기 쉽거나 발병할 위험이 있는 대상체를 치료하기 위한 것일 수 있다. 보조 요법과의 공동-투여는 임의의 순서 및 임의의 투여 스케줄로 다중 제제의 동시 및/또는 순차적 전달(예를 들어, 하나 이상의 사이토카인을 갖는 조작된 면역 세포; 칼시뉴린 억제제, 코르티코스테로이드, 미세소관 억제제, 저용량의 미코페놀산 프로드럭, 또는 이들의 임의의 조합과 같은 면역억제 요법)을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 복수의 용량의 숙주 세포(예를 들어, 조작된 면역 세포)가 대상체에게 투여되고, 이는 약 2 내지 약 4주의 투여 사이의 간격을 두고 투여될 수 있다.
본 발명에 포함되는 치료 또는 예방 방법은 바로 개시된 단위 용량, 세포 또는 조성물의 투여 전 또는 후에 추가 치료를 포함할 수 있는 치료 과정 또는 요법의 일부로서 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 단위 용량의 숙주 세포(예를 들어, 조작된 면역 세포)를 받은 대상체는 조혈 세포 이식(HCT; 골수파괴 및 비골수파괴 HCT 포함)을 받고 있거나 이전에 받은 적이 있다. 임의의 전술한 구체예에서, HCT에 사용되는 조혈 세포는 "범용 공여자" 세포일 수 있으며, 이는 (예를 들어, 본원에 기재된 방법에 따른 염색체 유전자 녹아웃에 의해) MHC, 항원, 및 결합 단백질로부터 선택되는 폴리펩티드 생성물을 인코딩하는 하나 이상의 내인성 유전자의 발현을 감소시키거나 제거하도록 변형된다. 일부 구체예에서,
세포 이식을 수행하기 위한 기술 및 요법은 당 분야에 공지되어 있으며, 임의의 적합한 공여자 세포, 예를 들어, 제대혈, 골수 또는 말초 혈액으로부터 유래된 세포, 조혈 줄기 세포, 동원된 줄기 세포, 또는 양수로부터의 세포의 이식을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명에 포함되는 숙주 세포(예를 들어, 조작된 면역 세포)는 줄기 세포 요법과 함께 또는 그 직후에 투여될 수 있다.
본 발명에 포함되는 방법은, 일부 구체예에서, 조합 요법에서 질환 또는 장애(예를 들어, MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애)를 치료하기 위해 하나 이상의 추가 제제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 조합 요법은 본 발명에 포함되는 숙주 세포 또는 결합 단백질을 항바이러스제와 (함께, 동시에 또는 순차적으로) 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 조합 요법은 로피나버/리토나버, 클로로퀸, 리바비린, 스테로이드 약물, 하이드록시클로로퀸, 및/또는 인터페론α와 본 발명에 포함되는 숙주 세포 또는 결합 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 조합 요법은 본 발명에 포함되는 숙주 세포, 조성물, 또는 단위 용량의 숙주 세포를 2차 요법, 예컨대, 수술, 항체, 백신, 또는 이들의 임의의 조합과 함께 투여하는 것을 포함한다.
c. 스크리닝 방법
본 발명에 포함되는 또 다른 양태는 스크리닝 검정을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 MAGEC2 면역원성 펩티드 또는 pMHC에 결합하는 제제를 선택하기 위한 방법이 제공된다. 예를 들어, a) 세포의 표면 상의 MHC 분자의 맥락에서 표 1에 열거된 펩티드 서열로부터 선택된 펩티드 에피토프를 제시하는 세포를 제공하는 단계; b) 세포 상의 MHC 분자의 맥락에서 복수의 후보 펩티드-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편의 펩티드 에피토프에 대한 결합을 결정하는 단계; 및 c) MHC 분자의 맥락에서 펩티드 에피토프에 결합하는 하나 이상의 펩티드-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편을 식별하는 단계를 포함하는, 표 1에 열거된 펩티드 서열로부터 선택된 펩티드 에피토프에 결합하는 펩티드-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편을 식별하는 방법이 제공된다.
일부 구체예에서, a) 표 1에 열거된 펩티드 서열로부터 선택된 펩티드 에피토프를 단독으로 또는 MHC 분자의 맥락에서 포함하는, 펩티드 에피토프를 단독으로 또는 안정한 MHC-펩티드 복합체 내에 제공하는 단계; b) 펩티드 또는 안정한 MHC-펩티드 복합체에 대한 복수의 후보 펩티드-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편의 결합을 결정하는 단계; 및 c) 펩티드 에피토프 또는 안정한 MHC-펩티드 복합체에 결합하는 하나 이상의 펩티드-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편을 식별하는 단계를 포함하는, 표 1에 열거된 펩티드 서열로부터 선택된 펩티드 에피토프에 결합하는 펩티드-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편을 식별하는 방법이 제공되며, 선택적으로 MHC 또는 MHC-펩티드 복합체는 본원에 기술된 바와 같다.
일부 구체예에서, 표 1로부터 선택된 펩티드 에피토프에 결합하는 펩티드-결합 분자 또는 그의 항원-결합 단편을 식별하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 구체예에서, 펩티드 결합 분자(예를 들어, MHC-펩티드 결합 분자)는 세포의 표면 상과 같은 MHC 분자(MHC-펩티드 복합체)의 맥락에서 제시되거나 표시되는 펩티드 에피토프에 (예를 들어, 특이적으로 및/또는 선택적으로) 결합하는 능력을 보유하는 분자 또는 이의 부분이다. 예시적인 펩티드 결합 분자는 MHC-펩티드 복합체에 결합하는 특이적 능력을 나타내는, T 세포 수용체 또는 항체, 또는 이의 단일 사슬 면역글로불린 가변 영역(예를 들어, scTCR, scFv)을 포함한 이의 항원-결합 부분을 포함한다. 일부 구체예에서, 펩티드 결합 분자는 TCR 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 펩티드 결합 분자는 TCR-유사 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 같은 항체이다. 일부 구체예에서, 펩티드 결합 분자는 MHC-펩티드 복합체에 결합하도록 조작된 것과 같은 TCR-유사 항체와 같은 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 함유하는 TCR-유사 CAR이다. 일부 구체예에서, 펩티드 결합 분자는 천연 공급원으로부터 유래될 수 있거나, 부분적으로 또는 전체적으로 합성 또는 재조합으로 생산될 수 있다.
일부 구체예에서, 펩티드 에피토프에 결합하는 결합 분자는 하나 이상의 후보 TCR 분자, 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 같은 하나 이상의 후보 펩티드 결합 분자를 MHC-펩티드 복합체와 접촉시키고, 하나 이상의 후보 결합 분자 각각이 MHC-펩티드 복합체에 (예를 들어, 특이적으로 및/또는 선택적으로) 결합하는지를 평가함에 의해 식별될 수 있다. 방법은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 미국 특허 공개 2020/0102553에 기술된 것과 같은 스크리닝 방법이 당업계에 잘 알려져 있다.
일부 구체예에서, 방법은 TCR 또는 항체의 복수 또는 라이브러리와 같은 결합 분자의 복수 또는 라이브러리를 MHC-제한 에피토프와 접촉시키는 단계 및 이러한 에피토프에 특이적으로 및/또는 선택적으로 결합하는 분자를 식별하거나 선택하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 서로 다른 TCR 또는 복수의 서로 다른 항체와 같은 복수의 서로 다른 결합 분자를 함유하는 라이브러리 또는 컬렉션은 MHC-제한 에피토프에 대한 결합에 대해 스크리닝되거나 평가될 수 있다. MHC-제한 펩티드에 특이적으로 및/또는 선택적으로 결합하는 결합 단백질을 선택하는 것과 같은 일부 구체예에서, 하이브리도마 방법이 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 후보 결합 분자의 라이브러리 또는 컬렉션과 같은 복수의 후보 결합 분자를 동시에 또는 순차적으로 펩티드 결합 분자와 개별적으로 접촉시키는 스크리닝 방법이 이용될 수 있다. 특정 MHC-펩티드 복합체에 특이적으로 및/또는 선택적으로 결합하는 라이브러리 구성원이 식별되거나 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 후보 결합 분자의 라이브러리 또는 컬렉션은 적어도 2, 5, 10, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109개 이상의 상이한 펩티드 결합 분자를 함유할 수 있다.
일부 구체예에서, 하나 초과의 MHC 일배체형 또는 하나 초과의 MHC 대립유전자에 대한 결합을 나타내는 TCR 또는 항체와 같은 펩티드 결합 분자를 식별하는 방법이 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, TCR 또는 항체와 같은 펩티드 결합 분자는 복수의 MHC 클래스 I 일배체형 또는 대립유전자의 맥락에서 제시된 펩티드 에피토프에 특이적으로 및/또는 선택적으로 결합하거나 인식한다. 일부 구체예에서, TCR 또는 항체와 같은 펩티드 결합 분자는 복수의 MHC 클래스 II 일배체형 또는 대립유전자의 맥락에서 제시된 펩티드 에피토프에 특이적으로 및/또는 선택적으로 결합하거나 인식한다.
결합 친화도를 평가하고/하거나 결합 분자가 특정 리간드(예를 들어, MHC-펩티드 복합체)에 특이적으로 및/또는 선택적으로 결합하는지 여부를 결정하는 다양한 검정이 알려져 있다. 당업계에 널리 공지된 임의의 다수의 결합 검정을 사용함에 의한 것과 같은, 표적 폴리펩티드의 T 세포 에피토프에 대한 TCR의 결합 친화도를 결정하는 것은 숙련된 기술자의 수준 내에 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, Biacore® 기계는 두 단백질 사이의 복합체의 결합 상수를 결정하는데 사용될 수 있다. 복합체에 대한 해리 상수(KD)는 완충액이 칩을 통과할 때 시간에 따른 굴절률의 변화를 모니터링함으로써 결정될 수 있다. 하나의 단백질과 다른 단백질의 결합을 측정하기 위한 다른 적합한 검정은, 예를 들어 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA) 및 방사면역검정(RIA)과 같은 면역검정, 또는 형광, UV 흡수, 원형 이색성 또는 핵자기공명(NMR)을 통해 단백질의 분광학적 또는 광학적 특성의 변화를 모니터링함에 의한 결합의 결정을 포함한다. 다른 예시적인 검정은 웨스턴 블롯, ELISA, 분석용 초원심분리, 분광학 및 표면 플라스몬 공명(Biacore®) 분석(예를 들어, Scatchard 등 (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660; Wilson (2002) Science 295:2103; Wolff 등 (1993) Cancer Res. 53:2560; 및 미국 특허 번호 5,283,173, 5,468,614 또는 등가물 참조), 유세포분석, 서열분석 및 발현된 핵산의 검출을 위한 기타 방법을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일 예에서, TCR에 대한 겉보기 친화성은 다양한 농도의 사량체에 대한 결합을 평가함으로써, 예를 들어 표지된 사량체를 사용하는 유세포분석에 의해 측정된다. 한 예에서, TCR의 겉보기 KD는 다양한 농도에서 표지된 사량체의 2-배수 희석을 사용하여 측정하고, 이어서 비선형 회귀분석에 의해 결합 곡선을 결정하여, 겉보기 KD는 최대-절반 결합을 생성하는 리간드의 농도로 결정된다.
일부 구체예에서, 특정 펩티드가 복합체에 존재하는 경우에만 결합하고, 특정 펩티드가 없거나 다른 비-중첩 또는 관련 없는 펩티드가 존재하는 경우에는 결합하지 않는 결합 분자를 식별하는 방법이 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 결합 분자는 결합된 펩티드의 부재에서 MHC에 실질적으로 결합하지 않고/않거나 MHC의 부재에서 펩티드에 실질적으로 결합하지 않는다. 일부 구체예에서, 결합 분자는 적어도 부분적으로 특이적이다. 일부 구체예에서, 예시적인 식별된 결합 분자는 특정 펩티드가 존재하는 경우 MHC-펩티드 복합체에 결합할 수 있고, 또한 특정 펩티드에 대해 1개 또는 2개의 치환을 갖는 관련 펩티드가 존재하는 경우에 결합할 수 있다.
일부 구체예에서, TCR-유사 항체와 같은 식별된 항체는 MHC-펩티드 복합체에 특이적으로 및/또는 선택적으로 결합하는 비-TCR 항체를 함유하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 생산하거나 생성하는데 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, TCR 또는 TCR-유사 항체 또는 TCR-유사 CAR과 같은 펩티드 결합 분자를 식별하는 방법은 펩티드 결합 분자를 발현하거나 함유하는 세포를 조작하는데 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포 또는 조작된 세포는 T 세포이다. 일부 구체예에서, T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포이다. 일부 구체예에서, 펩티드 결합 분자는 MHC 클래스 I 펩티드 복합체, MHC 클래스 II 펩티드 복합체 및/또는 MHC-E 펩티드 복합체를 인식한다. 일부 구체예에서, MHC 클래스 I의 맥락에서 펩티드를 특이적으로 및/또는 선택적으로 인식하는 TCR, 항체 또는 CAR과 같은 펩티드 결합 분자를 사용하여 CD8+ T 세포를 조작할 수 있다. 일부 구체예에서, MHC 클래스 I의 맥락에서 제시되는 펩티드의 인식을 위해 TCR, 항체 또는 CAR을 발현하거나 함유하는 조작된 CD8+ T 세포의 조성물이 또한 제공된다. 임의의 이러한 구체예에서, 세포는 입양 세포 요법의 방법에 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, TCR 라이브러리는 PBMC, 비장 또는 다른 림프 기관에 존재하는 세포를 포함하여 대상체로부터 단리된 T 세포로부터 Vα 및 Vβ 레퍼토리를 증폭시켜 생성될 수 있다. 일부 경우에는, T 세포가 종양-침윤 림프구(TIL)로부터 증폭될 수 있다. 일부 구체예에서, TCR 라이브러리는 CD4+ 또는 CD8+ 세포로부터 생성될 수 있다. 일부 구체예에서, TCR은 건강한 정상 대상체의 T 세포 공급원, 즉 정상 TCR 라이브러리로부터 증폭될 수 있다. 일부 구체예에서, TCR은 질환이 있는 대상체의 T 세포 공급원, 즉 질환이 있는 TCR 라이브러리로부터 증폭될 수 있다. 일부 구체예에서, 축퇴성 프라이머는 인간으로부터 얻은 T 세포와 같은 샘플에서 RT-PCR에 의한 것과 같이 Vα 및 VP의 유전자 레퍼토리를 증폭시키는데 사용된다. 일부 구체예에서, scTv 라이브러리는 증폭된 생성물이 클로닝되거나 조립되어 링커에 의해 분리되는 나이브 Vα 및 Vβ 라이브러리로부터 조립될 수 있다. 대상체 및 세포의 출처에 따라 라이브러리는 HLA 대립유전자-특이적일 수 있다.
대안적으로, 일부 구체예에서, TCR 라이브러리는 모체 또는 스캐폴드 TCR 분자의 돌연변이유발 또는 다양화에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 대상체, 예를 들어 인간 또는 설치류와 같은 다른 포유동물은 본 방법에 의해 식별된 펩티드와 같은 펩티드로 백신접종될 수 있다. 일부 구체예에서, 혈액 림프구를 함유하는 샘플과 같은 샘플은 대상체로부터 얻어질 수 있다. 일부 경우에, 결합 분자, 예를 들어 TCR이 샘플, 예를 들어 샘플에 함유된 T 세포의 외부로 증폭될 수 있다. 일부 구체예에서, 항원-특이적 T 세포는 예컨대 펩티드에 대한 CTL 활성을 평가하기 위한 스크리닝에 의해 선택될 수 있다. 일부 양태에서, 예를 들어 항원-특이적 T 세포 상에 존재하는 TCR은 예컨대 결합 활성, 예를 들어 항원에 대한 특정 친화도 또는 친화력에 의해 선택될 수 있다. 일부 양태에서, TCR은 예를 들어 α 또는 β 사슬의 돌연변이유발에 의한 것과 같이 방향성 진화를 거친다. 일부 양태에서, TCR의 CDR 내의 특정 잔기가 변경된다. 일부 구체예에서, 선택된 TCR은 친화도 성숙에 의해 변형될 수 있다. 일부 양태에서, 선택된 TCR은 항원에 대한 모체 스캐폴드 TCR로 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 대상체는 인간, 예컨대, MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 갖는 인간이다. 일부 구체예에서, 대상체는 마우스와 같은 설치류이다. 이러한 일부 구체예에서, 마우스는 유전자전이 마우스, 예를 들어, 인간 MHC(즉, HLA) 분자 예컨대, HLA-A2를 발현하는 마우스이다(예를 들어, Nicholson 등 (2012) Adv. Hematol. 2012:404081).
일부 구체예에서, 대상체는 인간 TCR을 발현하는 유전자전이 마우스 또는 항원-음성 마우스이다(예를 들어, Li 등 (2010) Nat. Med. 161029-1034; Obenaus 등 (2015) Nat. Biotechnol 33:402-407). 일부 구체예에서, 대상체는 인간 HLA 분자 및 인간 TCR을 발현하는 유전자전이 마우스이다.
일부 구체예에서, 예를 들어, 대상체가 유전자전이 HLA 마우스인 경우, 확인된 TCR은, 예를 들어, 키메라 또는 인간화되도록 변형된다. 일부 양태에서, TCR 스캐폴드는, 예를 들어, 공지된 항체 인간화 방법과 유사하게 변형된다.
일부 구체예에서, 이러한 스캐폴드 분자는 TCR의 라이브러리를 생성하는데 사용된다.
예를 들어, 일부 구체예에서, 라이브러리는 모체 또는 스캐폴드 TCR 분자와 비교하여 변형되거나 조작된 TCR 또는 이의 항원-결합 부분을 포함한다. 일부 구체예에서, 특정 MHC-펩티드 복합체에 대해 더 높은 친화성을 갖는 것과 같이 변경된 특성을 갖는 TCR을 생성하기 위해 방향성 진화 방법이 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 디스플레이 접근법은 알려진, 모체 또는 참조 TCR을 조작하거나 변형하는 것을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에 야생형 TCR이 CDR의 하나 이상의 잔기가 돌연변이된 돌연변이화된 TCR을 생성하기 위한 주형으로 사용될 수 있고, 원하는 변경된 특성, 예를 들어 원하는 표적 항원에 대한 더 높은 친화성을 갖는 돌연변이체가 선택된다. 일부 구체예에서, 방향성 진화는 효모 디스플레이(Holler 등 (2003) Nat. Immunol. 4:55-62; Holler 등 (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:5387-5392), 파지 디스플레이(Li 등 (2005) Nat. Biotechnol. 23:349-354), 또는 T 세포 디스플레이(Chervin 등 (2008) J. Immunol. Methods 339:175-184)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 디스플레이 방법에 의해 달성된다.
일부 구체예에서, 라이브러리는 가용성일 수 있다. 일부 구체예에서, 라이브러리는 TCR이 파지 또는 세포의 표면 상에 표시되거나 세포, 리보솜 또는 핵산, 예를 들어 RNA 또는 DNA와 같은 입자 또는 분자에 부착되는 디스플레이 라이브러리이다. 전형적으로, 정상 및 질환 TCR 라이브러리 또는 다양한 라이브러리를 포함하는 TCR 라이브러리는 이종이량체 또는 단일 사슬 형태를 포함하는 임의의 형태로 생성될 수 있다. 일부 구체예에서, TCR의 하나 이상의 구성원은 2-사슬 이종이량체일 수 있다. 일부 구체예에서, Vα 및 Vβ 사슬의 쌍은 이황화 결합의 도입에 의해 촉진될 수 있다. 일부 구체예에서, TCR 라이브러리의 구성원은 TCR 단일 사슬(scTv 또는 ScTCR)일 수 있으며, 이는 일부 경우에 링커에 의해 분리된 Vα 및 Vβ 사슬을 포함할 수 있다. 더욱이, 일부 경우에는 라이브러리에서 TCR의 스크리닝 및 선택 시, 선택된 구성원이 전장 TCR 이종이량체 또는 단일-사슬 형태 또는 이의 항원-결합 단편과 같은 임의의 형태로 생성될 수 있다.
MHC 분자의 맥락에서 펩티드에 결합하는 분자를 식별하는 다른 방법은 또한 미국 특허 출원 번호 2020/0182884에 기술되어 있다.
보다 일반적으로, 본 발명은 MAGEC2 또는 이의 항원에 결합하거나 이의 활성을 조절하는 시험 단백질과 같은 스크리닝 제제에 대한 검정을 포함한다. 이러한 제제는 비제한적으로 항체, 단백질, 융합 단백질, 소분자 및 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서, 면역 반응을 조절하는 제제를 확인하기 위한 방법은 MAGEC2 활성을 조절하고 관심 면역 반응, 예컨대, 조절된 세포독성 T 세포 활성화 및/또는 활성, 면역 체크포인트 요법에 대한 암 세포의 민감성 등을 추가로 조절하는 후보 제제의 능력을 결정하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 검정은 표적을 시험 제제와 접촉시키고, 예컨대 하기 기술된 바와 같이 직접 또는 간접 파라미터를 측정함으로써 표적의 양 및/또는 활성을 조절(예를 들어, 상향조절 또는 하향조절)하는 시험 제제의 능력을 결정하는 것을 포함하는 무세포 또는 세포-기반 검정이다.
일부 구체예에서, 검정은 세포-기반 검정, 예를 들어, (a) 관심 세포를 시험 제제와 접촉시키고, 결합 특징과 같은 상기 표적의 양 및/또는 활성을 조절하는 시험 제제의 능력을 결정하는 것을 포함하는 검정이다. 서로 결합하거나 상호작용하는 폴리펩티드의 능력을 결정하는 것은, 예를 들어, 직접 결합을 측정하거나 면역 세포 활성화 또는 기능의 파라미터를 측정함으로써 달성될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 검정은 세포, 예컨대, 암 세포를 면역 세포(예를 들어, 세포독성 T 세포) 및 시험 제제와 접촉시키고, 예컨대, 하기 기재된 바와 같은 직접 또는 간접 파라미터를 측정함으로써 표적의 양 및/또는 활성 및/또는 조절된 면역 반응을 조절하는 시험 제제의 능력을 결정하는 것을 포함하는 세포-기반 검정이다.
상기 및 본원에 기재된 방법은 또한 본원에 기재된 하나 이상의 바이오마커의 양 및/또는 활성을 조절하는 것으로 이미 공지된 하나 이상의 제제를 시험하여 하나 이상의 바이오마커의 조절을 확인하고/하거나 조절된 면역 반응, 면역 체크포인트 차단에 대한 민감성 등과 같은 요망되는 표현형의 판독에 대한 제제의 효과를 확인하도록 채택될 수 있다.
직접 결합 검정에서, 바이오마커 단백질(또는 이들 각각의 표적 폴리펩티드 또는 분자)은 방사성 동위원소 또는 효소 표지와 커플링될 수 있어 복합체 내의 표지된 단백질 또는 분자를 검출함으로써 결합이 결정될 수 있다. 예를 들어, 표적에는 125I, 35S, 14C, 또는 3H가 직접 또는 간접적으로 표지될 수 있고, 방사성방출을 직접 계수하거나 섬광 계수에 의해 방사성동위원소를 검출할 수 있다. 대안적으로, 표적은 예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 또는 루시퍼라제로 효소적으로 표지될 수 있고, 효소 표지는 적절한 기질의 생성물로의 전환을 결정함으로써 검출될 수 있다. 표적과 기질 사이의 상호작용을 결정하는 것은 또한 표준 결합 또는 효소적 분석 검정을 사용하여 성취될 수 있다. 상기 기재된 검정 방법의 하나 이상의 구체예에서, 단백질 또는 분자 중 하나 또는 둘 모두의 비복합체의 형태로부터 복합체화된 형태의 분리를 용이하게 할 뿐만 아니라 검정의 자동화를 수용하기 위해 폴리펩티드 또는 분자를 고정화시키는 것이 바람직할 수 있다.
표적에 대한 시험 제제의 결합은 반응물을 담기에 적합한 임의의 용기에서 달성될 수 있다. 이러한 용기의 비-제한적인 예는 미세역가 플레이트, 시험관 및 미세-원심분리관을 포함한다. 본 발명에 포함되는 항체의 고정된 형태는 다공성, 미세다공성(평균 기공 직경이 약 1 마이크론 미만) 또는 거대다공성(평균 기공 직경이 약 10 마이크론 초과) 물질과 같은 고체상, 예컨대 멤브레인, 셀룰로오스, 니트로셀룰로오스, 또는 유리 섬유; 아가로스, 폴리아크릴아미드 또는 라텍스로 만들어진 것과 같은 비드; 또는 폴리스티렌으로 만들어진 것과 같은 접시, 플레이트 또는 웰의 표면에 결합된 항체를 포함할 수도 있다.
예를 들어, 직접 결합 검정에서, 폴리펩티드는 방사성동위원소 또는 효소 표지와 커플링될 수 있어 폴리펩티드 상호작용 및/또는 활성 예컨대 결합 이벤트는 복합체에서 표지된 단백질을 검출함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 직접적으로 또는 간접적으로 125I, 35S, 14C 또는 3H로 표지될 수 있으며, 방사성방사성동위원소는 방출의 직접 계수 또는 섬광 계수에 의해 검출될 수 있다. 대안적으로, 폴리펩티드는 예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 또는 루시퍼라제로 효소적으로 표지될 수 있고, 효소 표지는 적절한 기질의 생성물로의 전환을 결정함으로써 검출될 수 있다.
임의의 상호작용 물질의 표지화 없이 관심 매개변수를 조절하는 제제의 능력을 결정하는 것 또한 본 발명의 범주 내에 있다. 예를 들어, 모니터링되는 폴리펩티드를 표지하지 않고 폴리펩티드 사이의 상호작용을 검출하기 위해 미세생리계를 사용할 수 있다(McConnell 등 (1992) Science 257:1906-1912). 본원에 사용된 "미세생리계"(예를 들어 Cytosensor®)는 광-주소지정 전위차 센서(LAPS)를 사용하여 세포가 그 환경을 산성화하는 속도를 측정하는 분석 기기이다. 이 산성화 속도의 변화는 화합물과 수용체 사이의 상호작용의 지표로 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 주어진 폴리펩티드 세트 사이의 상호작용을 조절하는 시험 제제(예를 들어, 항체, 융합 단백질, 펩티드 또는 소분자)의 능력을 결정하는 것은 폴리펩티드 세트의 하나 이상의 구성원의 활성을 결정함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 단백질 및/또는 하나 이상의 결합 파트너의 활성은 세포 제2 메신저(예를 들어, 세포내 신호전달)의 유도를 검출하거나, 적절한 기질의 촉매/효소 활성을 검출하거나, 리포터 유전자(검출 가능한 마커, 예를 들어, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제를 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 표적-반응성 조절 요소를 포함함)의 유도를 검출하거나, 단백질 및/또는 하나 이상의 결합 파트너에 의해 조절된 세포 반응을 검출함으로써 결정될 수 있다. 상기 폴리펩티드에 결합하거나 이와 상호작용하는 시험 제제의 능력을 결정하는 것은, 예를 들어, 증식 검정에서 면역 세포 공동자극 또는 억제를 조절하는 화합물의 능력을 측정함으로써, 또는 상기 폴리펩티드가 이의 일부를 인식하는 항체에 결합하는 능력을 방해함으로써 달성될 수 있다.
표적 양 및/또는 활성, 예컨대, 하나 이상의 결합 파트너와의 상호작용을 조절하는 제제는 시험관내 검정에 첨가되는 경우 면역 세포 증식 및/또는 이펙터 기능을 억제하거나, 비활동성, 클론 결실 및/또는 고갈을 유도하는 이들의 능력에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 세포는 활성화 수용체를 통해 신호 전달 변환을 자극하는 제제의 존재 하에 배양될 수 있다. 세포 활성화의 다수의 인지된 판독이 제제의 존재 하에 세포 증식 또는 이펙터 기능(예를 들어, 항체 생산, 사이토카인 생산, 포식작용)을 측정하는데 사용될 수 있다. 이러한 활성화를 차단하는 시험 제제의 능력은 당 분야에 공지된 기술을 사용하여 측정되는 증식 또는 이펙터 기능의 감소에 영향을 미치는 제제의 능력을 측정함으로써 용이하게 결정될 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 포함되는 제제는 문헌[Freeman 등 (2000) J. Exp. Med. 192:1027 and Latchman 등 (2001) Nat. Immunol. 2:261]에 기술된 바와 같이 T 세포 검정에서 동시자극을 억제하거나 향상시키는 능력에 대해 시험될 수 있다. CD4+ T 세포는 인간 PBMC로부터 분리되고 항-CD3 항체 활성화로 자극될 수 있다. T 세포의 증식은 3H 티미딘 혼입에 의해 측정될 수 있다. 검정은 검정에서 CD28 공동자극의 존재 또는 부재하에 수행될 수 있다. Jurkat T 세포 및 PBMC로부터의 PHA-모세포로 유사한 검정을 수행할 수 있다.
대안적으로, 본 발명에 포함되는 제제는 하나 이상의 바이오마커의 조절에 반응하여 면역 세포에서 생산되거나 생산이 향상되거나 억제되는 사이토카인의 세포 생산을 조절하는 능력에 대해 시험될 수 있다. 관심 면역 세포에 의해 방출되는 지표 사이토카인은 ELISA에 의해 또는 사이토카인에 의해 유도되는 면역 세포 증식 또는 다른 세포 유형, 예컨대, 실시예 섹션에 기재된 것들의 증식을 억제하는 사이토카인을 차단하는 항체의 능력에 의해 확인될 수 있다. 시험관내 면역 세포 공동자극 검정은 또한 하나 이상의 바이오마커의 조절에 의해 조절될 수 있는 사이토카인을 확인하기 위한 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 공동자극시 유도된 특정 활성, 예를 들어, 면역 세포 증식이 공지된 사이토카인에 대한 차단 항체의 첨가에 의해 억제될 수 없는 경우, 활성은 미지의 사이토카인의 작용으로부터 발생할 수 있다. 공동자극 후, 이 사이토카인은 통상적인 방법에 의해 배지로부터 정제될 수 있고 이의 활성은 면역 세포 증식을 유도하는 이의 능력에 의해 측정될 수 있다. 관용의 유도 역할을 할 수 있는 사이토카인을 확인하기 위해, 상기 기재된 바와 같은 시험관내 T 세포 공동자극 검정이 사용될 수 있다. 이 경우, T 세포에는 일차 활성화 신호가 제공되고 선택된 사이토카인과 접촉되지만, 공동자극 신호는 제공되지 않을 것이다. 면역 세포를 세척하고 휴지시킨 후, 세포는 일차 활성화 신호 및 공동자극 신호 둘 모두로 재도전될 것이다. 면역 세포가 반응(예를 들어, 사이토카인을 증식시키거나 생산)하지 않은 경우, 이들은 내성이 된 것이고 사이토카인은 내성의 유도를 방지하지 못하였다. 그러나, 면역 세포가 반응하는 경우, 관용의 유도는 사이토카인에 의해 방지되었다. 관용의 유도를 방지할 수 있는 사이토카인은 이식 수용자 또는 자가면역 질환을 갖는 대상체에서 관용을 유도하기 위한 보다 효율적인 수단으로서 B 림프구 항원을 차단하는 시약과 함께 생체내 차단을 위해 표적화될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명에 포함되는 검정은 바이오마커 및/또는 하나 이상의 결합 파트너 간의 상호작용을 조절하는 제제를 스크리닝하기 위한 세포 비함유 검정으로서, 폴리펩티드 및 하나 이상의 천연 결합 파트너 또는 이의 생물학적 활성 부분을 시험 제제와 접촉시키고, 폴리펩티드와 하나 이상의 천연 결합 파트너 또는 이의 생물학적 활성 부분의 상호작용을 조절하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 것을 포함하는 검정이다. 시험 화합물의 결합은 상기 기재된 바와 같이 직접적으로 또는 간접적으로 결정될 수 있다. 일 구체예에서, 검정은 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 활성 부분을 이의 결합 파트너와 접촉시켜 검정 혼합물을 형성하는 단계, 검정 혼합물을 시험 화합물과 접촉시키는 단계, 및 검정 혼합물 중 폴리펩티드와 상호작용하는 시험 제제의 능력을 결정하는 단계를 포함하며; 폴리펩티드와 상호작용하는 시험 제제의 능력을 결정하는 것은 결합 파트너와 비교하여 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 활성 단편에 우선적으로 결합하는 시험 제제의 능력을 결정하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 세포-기반 검정이든 무세포 검정이든, 시험 제제는 추가로 이것이 폴리펩티드 및 하나 이상의 결합 파트너와 다른 결합 파트너 사이의 결합 및/또는 상호작용의 활성에 영향을 미치는지의 여부를 결정하기 위해 추가로 검정될 수 있다. 다른 유용한 결합 분석 방법은 실시간 생체분자 상호작용 분석(BIA)의 사용을 포함한다(Sjolander and Urbaniczky (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345 and Szabo 등 (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705). 본원에서 사용되는 바와 같은 "BIA"는 임의의 상호작용제(예를 들어, Biacore®)를 표지화하지 않고 실시간으로 생물특이적 상호작용을 연구하기 위한 기술이다. 표면 플라즈몬 공명(SPR)의 광학 현상의 변화는 생물학적 폴리펩티드 사이의 실시간 반응의 지표로서 사용될 수 있다. 관심 폴리펩티드는 Biacore® 칩에 고정될 수 있고, 다수의 제제(차단 항체, 융합 단백질, 펩티드 또는 소분자)는 관심 폴리펩티드에 대한 결합에 대해 시험될 수 있다. BIA 기술을 사용하는 예는 문헌 [Fitz 등 (1997) Oncogene 15:613]에 기술되어 있다.
본 발명에 포함되는 무세포 검정은 가용성 및/또는 막-결합 형태의 단백질 둘 모두를 사용할 수 있다. 막-결합된 형태의 단백질이 사용되는 무세포 검정의 경우, 막-결합된 형태의 단백질이 용액에서 유지되도록 가용화제를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 가용화제의 예는 비이온성 세정제, 예컨대, n-옥틸글루코시드, n-도데실글루코시드, n-도데실말토시드, 옥타노일-N-메틸글루카미드, 데카노일-N-메틸글루카미드, Triton® X-100, Triton® X-114, Thesit®, 이소트리데사이폴리(에틸렌 글리콜 에테르)n, 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암미니오]-1-프로판 설포네이트(CHAPS), 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암미니오]-2-하이드록시-1-프로판 설포네이트(CHAPSO) 또는 N-도데실=N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판 설포네이트를 포함한다.
상기 기재된 검정 방법의 하나 이상의 구체예에서, 단백질의 하나 또는 둘 모두의 복합체화되지 않은 형태로부터 복합체의 분리를 용이하게 할 뿐만 아니라 검정의 자동화를 수용하기 위해 어느 하나의 폴리펩티드를 고정시키는 것이 바람직할 수 있다. 폴리펩티드에 대한 시험 화합물의 결합은 반응물을 함유하기에 적합한 임의의 용기에서 달성될 수 있다. 이러한 용기의 예는 미세역가 플레이트, 시험관 및 미세-원심분리 튜브를 포함한다. 일 구체예에서, 단백질 중 하나 또는 둘 모두가 매트릭스에 결합되도록 하는 도메인을 부가하는 융합 단백질이 제공될 수 있다. 예를 들어, 글루타티온-S-트랜스퍼라제-기반 폴리펩티드 융합 단백질, 또는 글루타티온-S-트랜스퍼라제/표적 융합 단백질은 글루타티온 세파로스 비드(Sigma Chemical, St. Louis, MO) 또는 글루타티온 유도체화된 미세역가 플레이트 상에 흡착될 수 있으며, 그 후, 시험 화합물과 조합되고, 혼합물을 복합체 형성에 도움이 되는 조건 하에(예를 들어, 염 및 pH에 대한 생리학적 조건에서) 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 비드 또는 미세역가 플레이트 웰을 세척하여 임의의 결합되지 않은 성분을 제거하고, 비드의 경우 매트릭스를 고정시키고, 예를 들어, 상기 기재된 바와 같이 복합체를 직접 또는 간접적으로 결정한다. 대안적으로, 복합체는 매트릭스로부터 해리될 수 있고, 폴리펩티드 결합 또는 활성의 수준은 표준 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명은 추가로 상기 기재된 스크리닝 검정에 의해 확인된 신규한 제제에 관한 것이다. 따라서, 적절한 모델 시스템에서 본원에 기재된 바와 같이 확인된 제제를 추가로 사용하는 것은 본 발명의 범위 내에 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 확인된 제제는 이러한 제제로의 치료의 효능, 독성 또는 부작용을 결정하기 위한 모델 시스템에서 사용될 수 있다. 대안적으로, 본원에 기재된 바와 같이 확인된 제제는 이러한 제제의 작용 기전을 결정하기 위한 모델 시스템에서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 치료를 위한 상기 기재된 스크리닝 검정에 의해 확인된 신규한 제제의 용도에 관한 것이다.
d. 예측 의학
본 발명은 또한 진단 검정, 예후 검정 및 모니터링 임상 시험이 예후(예측) 목적으로 사용되어 개체를 예방적으로 치료하는 예측 의학 분야에 관한 것이다. 따라서, 본 발명에 포함되는 한 양태는 생물학적 샘플(예를 들어, 혈액, 혈청, 세포 또는 조직)의 맥락에서 MAGEC2의 존재, 부재, 양 및/또는 활성 수준 또는 MAGEC2에 대한 반응성을 결정하여 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 앓고 있는 개체가 원래 상태에서 또는 재발 상태에서든 요법에 반응할 가능성이 있는지의 여부를 결정(예를 들어, 검출)하기 위한 진단 검정을 포함한다. 이러한 검정은 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애의 발병 전 또는 재발 후에 개체를 예방적으로 치료하기 위해 예후 또는 예측 목적으로 사용될 수 있다.
본원에 기재된 진단 방법은 또한 MAGEC2의 발현 또는 이의 결핍과 관련된 장애가 있거나 발병할 위험이 있는 대상체를 확인하는데 이용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "이상"은 정상 수준으로부터의 MAGEC2의 상향조절 또는 하향조절을 포함한다. 비정상적 발현 또는 활성은 증가되거나 감소된 발현 또는 활성, 뿐만 아니라 발현의 정상적인 발달 패턴 또는 발현의 세포하 패턴을 따르지 않는 발현 또는 활성을 포함한다. 예를 들어, 비정상적인 수준은 바이오마커 유전자 또는 조절 서열의 돌연변이, 또는 이의 염색체 유전자의 증폭이 관심 바이오마커의 상향조절 또는 하향조절을 야기하는 경우를 포함하는 것으로 의도된다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "원치 않는"은 면역 세포 활성과 같은 생물학적 반응과 관련된 원치 않는 현상을 포함한다.
본원에 기재된 검정, 예컨대, 선행하는 진단 검정 또는 하기 검정은 MAGEC2 조절장애와 관련된 장애를 갖거나 발병할 위험이 있는 대상체를 확인하는데 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 시험 샘플을 대상체로부터 수득하고 MAGEC2 발현을 검출하는 이상 또는 원치 않는 MAGEC2 조절과 관련된 장애를 확인하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 MAGEC2 발현의 존재는 이상 또는 원치 않는 MAGEC2 발현과 관련된 장애가 있거나 발병할 위험이 있는 대상체에 대해 진단적이다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "시험 샘플"은 관심 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플을 지칭한다. 예를 들어, 시험 샘플은 생물학적 유체(예를 들어, 뇌척수액 또는 혈청), 세포 샘플, 또는 조직, 예컨대, 종양 미세환경, 종양주위 영역, 및/또는 종양내 영역의 조직병리학적 슬라이드일 수 있다.
또한, 본원에 기재된 예후 검정은 이상 또는 원치 않는 MAGEC2 발현과 관련된 이러한 장애를 치료하기 위해 대상체가 본원에 기재된 제제를 투여받을 수 있는지의 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법은 대상체가 하나의 제제 또는 제제의 조합으로 효과적으로 치료될 수 있는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 대상체가 이상 또는 원치 않는 MAGEC2 발현과 관련된 장애를 치료하기 위해 본원에 기재된 하나 이상의 제제로 효과적으로 치료될 수 있는지의 여부를 결정하기 위한 방법을 제공한다.
본원에 기재된 방법은, 예를 들어, 본원에 기재된 적어도 하나의 항체 시약을 포함하는 사전-패키징된 진단 키트를 이용함으로써 수행될 수 있고, 이는, 예를 들어, 임상 환경에서 관심 바이오마커를 포함하는 질환 또는 질병의 가족력 또는 증상을 나타내는 환자를 진단하기 위해 편리하게 사용될 수 있다.
또한, 관심 바이오마커가 발현되는 임의의 세포 유형 또는 조직은 본원에 기재된 예후 검정에 이용될 수 있다.
e. 임상시험 중 효과 모니터링
T 세포 반응성(예를 들어 결합 및/또는 T 세포 활성화 및/또는 이펙터 기능의 존재)과 같은 면역 반응에 대한 MAGEC2 발현 요법(예를 들어 화합물, 약물, 백신, 세포 요법 등)을 특징으로 하는 장애의 영향을 모니터링하는 것은 기본 후보 MAGEC2 항원 결합 분자 스크리닝뿐만 아니라 임상 시험에도 적용될 수 있다. 예를 들어, MAGEC2를 발현하는 과다증식성 세포와 같은 관심 세포에 대한 면역 반응(예를 들어, T 세포 면역 반응)을 증가시키는 본원에 기술된 면역원성 펩티드, pMHC, 조작된 세포, 결합 단백질 및 관련된 조성물의 효과는 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 앓고 있는 대상체의 임상 시험에서 모니터링될 수 있다. 이러한 임상 시험에서 결합 및/또는 T 세포 활성화 및/또는 이펙터 기능(예를 들어 T 세포 증식, 사멸 및/또는 사이토카인 방출)의 존재는 특정 세포, 조직 또는 시스템의 표현형의 "판독" 또는 마커로 사용될 수 있다. 유사하게, MAGEC2를 발현하는 과증식성 세포와 같은 관심 세포에 대한 면역 반응을 증가시키기 위해 본원에 기술된 바와 같은 결합 단백질(예를 들어 TCR, TCR의 항원-결합 단편, CAR, 또는 TCR과 이펙터 도메인을 포함하는 융합 단백질)을 발현하도록 조작된 T 세포를 이용한 적응성 T 세포 요법의 효과는 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애가 있는 대상체의 임상 시험에서 모니터링될 수 있다. 이러한 임상 시험에서 결합 및/또는 T 세포 활성화 및/또는 이펙터 기능(예를 들어 T 세포 증식, 사멸 또는 사이토카인 방출)의 존재는 특정 세포, 조직 또는 시스템의 표현형의 "판독" 또는 마커로 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명은 a) MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애에 대한 요법의 적어도 일부를 대상체에게 제공하기 이전에 대상체로부터 얻은 제1 샘플에서 대상체로부터 얻은 샘플과 하나 이상의 결합 단백질 또는 관련된 조성물 사이의 반응성의 부재, 존재 또는 수준을 결정하는 단계, 및 b) 하나 이상의 결합 단백질 또는 관련된 조성물과, 요법의 일부 제공 후 대상체로부터 얻은 제2 샘플에 존재하는 대상체로부터 얻은 샘플 사이의 반응성의 부재, 존재 또는 수준을 결정하는 단계를 포함하는 요법(예를 들어, 화합물, 약물, 백신, 세포 요법 등)의 치료의 효과를 모니터링하는 방법을 제공하며, 여기서 제2 샘플에 비해 제1 샘플에서 반응성의 존재 또는 더 높은 수준은 요법이 대상체에서 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 치료하는데 효과적이라는 표시이고, 여기서 제2 샘플에 비해 제1 샘플에서 반응성의 부재 또는 더 낮은 수준은 요법이 대상체에서 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 치료하는데 효과적이지 않다는 표시이다.
일부 구체예에서, 본 발명은 (i) 제제를 투여하기 이전에 대상체로부터 투여-전 샘플을 얻는 단계; (ii) 투여전 샘플에서 MAGEC2 발현을 검출하는 단계; (iii) 대상체로부터 하나 이상의 투여-후 샘플을 얻는 단계; (iv) 투여-후 샘플에서 MAGEC2 발현을 검출하는 단계; (v) 투여-전 샘플의 MAGEC2 발현을 투여-후 샘플의 MAGEC2 발현과 비교하는 단계; 및 (vi) 그에 따라 대상체에 대한 제제의 투여를 변경하는 단계를 포함하는 제제(예를 들어, 항체, 효능제, 길항제, 펩티드모방체, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 소분자, 또는 본원에 기술된 스크리닝 검정에 의해 확인된 다른 약물 후보)로 대상체의 치료의 효과를 모니터링하는 방법을 제공한다. 면역조직화학(IHC)에 의한 것과 같은 바이오마커 폴리펩티드 분석을 사용하여 면역요법과 같은 요법을 받을 환자를 선택할 수도 있다.
또한, 본원에 기재된 예후 방법은 MAGEC2 발현과 연관된 장애를 치료하기 위해 대상체에게 치료제가 투여될 수 있는지의 여부를 결정하는데 사용될 수 있다.
f. 임상 효능
임상 효능은 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 요법에 대한 반응은 예컨대, 신애주번트 또는 애주번트 화학요법의 개시 후 바람직하게는 암 세포의 수, 종양 질량 및/또는 종양 부피를 변화시키기 위한 요법에 대한 MAGEC2 발현과 연관된 장애, 예를 들어, 종양의 임의의 반응에 관한 것이다. 종양 반응은 신애주번트 또는 애주번트 상황에서 평가될 수 있으며, 여기서 전신 개입 후 종양의 크기는 CT, PET, 유방조영상, 초음파 또는 촉진에 의해 측정된 초기 크기 및 치수와 비교될 수 있고 종양의 세포성이 조직학적으로 추정되고 치료 개시 전에 취해진 종양 생검의 세포성과 비교될 수 있다. 반응은 또한 생검 또는 외과적 절제 후 종양의 캘리퍼 측정 또는 병리학적 검사에 의해 평가될 수 있다. 반응은 종양 부피 또는 세포도의 백분율 변화와 같은 정량적 방식으로 또는 잔류 암 부하와 같은 반-정량적 스코어링 시스템을 사용하여(Symmans 등 (2007) J. Clin. Oncol. 25:4414-4422) 또는 "병리학적 완전 반응"(pCR), "임상 완전 관해"(cCR), " 임상 부분 관해"(cPR), "임상 안정 질환"(cSD), "임상 진행성 질환"(cPD) 또는 다른 정성적 기준과 같은 정성적 방식의 Miler-Payne 스코어(Ogston 등 (2003) Breast (Edinburgh, Scotland) 12:320-327)로 기록될 수 있다. 종양 반응의 평가는 신애주번트 또는 애주번트 요법의 개시 후 조기에 (예를 들어, 수 시간, 수일, 수주 후 또는 바람직하게는 수개월 후에) 수행될 수 있다. 반응 평가에 대한 전형적인 종점은 신애주번트 화학요법의 종료시 또는 잔류 종양 세포 및/또는 종양 베드의 외과적 제거시이다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 치료법의 임상적 효능은 임상적 이익률(CBR)을 측정함으로써 결정될 수 있다. 임상적 이익률은 완전 관해(CR)에 있는 환자의 백비율, 부분 관해(PR)에 있는 환자의 수, 및 안정 질환(SD)을 갖는 환자의 수를 치료의 종료 후 적어도 6개월이 지난 시점에서 합산을 결정함에 의해 측정한다. 이 공식의 약칭은 6개월에 걸친 CBR=CR+PR+SD이다. 일부 구체예에서, 표 1 치료 요법에 열거된 바이오마커의 특정 조절제에 대한 CBR은 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 그 초과이다.
암 요법에 대한 반응을 평가하기 위한 추가 기준은 다음 모두를 포함하는 "생존"과 관련된다: 전반적 생존이라고도 알려진 사망까지의 생존(여기서 상기 사망은 원인과 무관하거나 종양과 관련될 수 있음); "무재발 생존"(여기서, 용어 재발은 국소 재발과 원격 재발 둘 모두를 포함해야 함); 무전이 생존; 무질환 생존(여기서, 용어 질환은 암 및 이와 연관된 질환을 포함해야 함). 상기 생존의 기간은 정의된 시작점(예를 들어 진단의 시간 또는 치료의 시작 시간) 및 종료점(예를 들어 사망, 재발 또는 전이)을 참조하여 계산할 수 있다. 또한, 치료의 유효성에 대한 기준은 화학요법에 대한 반응, 생존 확률, 주어진 기간 내 전이 확률, 종양 재발 확률을 포함하도록 확장될 수 있다.
예를 들어, 적절한 역치 값을 결정하기 위해 특정 관심 제제를 대상체의 집단에 투여할 수 있고 결과는 임의의 요법의 투여 이전에 결정된 바이오마커 측정과 관련될 수 있다. 결과 측정은 네오애주반트 환경에서 제공된 요법에 대한 병리학적 반응일 수 있다. 대안적으로, 전반적인 생존 및 무질환 생존과 같은 결과 측정은 MAGEC2 발현 값이 알려진 요법에 이은 대상체에 대해 일정 기간에 걸쳐서 모니터링될 수 있다. 특정 구체예에서, 동일한 용량의 제제가 각 대상체에게 투여된다. 대상체를 모니터링하는 기간은 다를 수 있다. 예를 들어, 대상체는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60개월 또는 더 길게 모니터링될 수 있다. 요법의 결과와 상관관계가 있는 MAGEC2 측정 역치값은 실시예 섹션에 기술된 것과 같은 잘 알려진 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
X . 세포 요법
본 발명에 포함되는 또 다른 양태에서, 상기 방법은 입양 세포 요법을 포함하며, 이에 의해 MHC-제한된 에피토프를 표적화하는 제공된 분자(예를 들어, 결합 단백질(예를 들어, TCR 또는 CAR)를 발현하는 세포 또는 항원-결합 이의 단편)를 발현하는 유전자 조직된 세포가 대상체에게 투여된다. 이러한 투여는 MAGEC2를 발현하는 과증식성 세포와 같은 관심 세포가 파괴 대상이 되도록 항원-표적화 방식으로 면역 세포의 활성화(예를 들어, T 세포 활성화)를 촉진할 수 있다.
따라서, 제공된 방법 및 용도는 입양 세포 요법을 위한 방법 및 용도를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 질환, 병태 또는 장애를 가질 위험이 있거나 가질 것으로 의심되는 것과 같은 대상체, 조직 또는 세포에 세포 또는 세포를 함유하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포, 집단 및 조성물은 치료될 특정 질환 또는 병태를 갖는 대상체에게 투여된다(예를 들어, 입양 T 세포 요법과 같은 입양 세포 요법을 통해). 일부 구체예에서, 세포 또는 조성물은 질병 또는 병태를 갖거나 가질 위험이 있는 대상체와 같은 대상체에게 투여된다. 일부 구체예에서, 이에 의해 방법은 질병 또는 병태의 하나 이상의 증상을 치료, 예를 들어, 개선한다.
입양 세포 요법을 위한 세포의 투여 방법은 공지되어 있으며, 제공된 방법 및 조성물과 관련하여 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2003/0170238, 미국 특허 번호 4,690,915, Rosenberg (2011) Nat. Rev. Clin. Oncol. 8:577-585, Themeli 등 (2013) Nat. Biotechnol. 31:928-933, Tsukahara 등 (2013) Biochem. Biophys. Res. Commun. 438:84-89, 및 Davila 등 (2013) PLoS ONE 8:e61338).
일부 구체예에서, 세포 요법(예를 들어, 입양 세포 요법, 예를 들어, 입양 T 세포 요법)은 자가 전달에 의해 수행될 수 있으며, 여기서 세포는 세포 요법을 받을 대상체로부터 또는 이러한 대상체로부터 유래된 샘플로부터 분리되고/거나 달리 제조된다. 따라서, 일부 구체예에서, 세포는 치료를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 환자)로부터 유래되고, 분리 및 처리 후 세포는 동일한 대상체에게 투여된다.
일부 구체예에서, 세포 요법(예를 들어, 입양 세포 요법, 예를 들어, 입양 T 세포 요법)은 동종이계 전이에 의해 수행될 수 있으며, 여기서 세포는 세포 요법을 받거나 궁극적으로 받은 대상체이외의 대상체(예를 들어, 제1 대상체)로부터 분리되고/거나 달리 제조된다. 이러한 구체예에서, 그 후 세포는 동일한 종의 상이한 대상체(예를 들어, 제2 대상체)에게 투여된다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 동일하다(동계). 일부 구체예에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 유사하다. 일부 구체예에서, 제2 대상체는 제1 대상체와 동일한 HLA 부류 또는 슈퍼타입을 발현한다.
일부 구체예에서, 세포, 세포 집단 또는 조성물이 투여되는 대상체는 영장류, 예컨대 인간이다. 일부 구체예에서, 영장류는 원숭이 또는 유인원이다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있고, 유아, 미성년자, 청소년, 성인 및 노인 대상체를 포함하는 임의의 적합한 연령일 수 있다. 일부 구체예에서, 대상체는 비-영장류 포유동물, 예컨대 설치류이다. 일부 예에서, 환자 또는 대상체는 질병, 입양 세포 요법 및/또는 사이토카인 방출 증후군(CRS)과 같은 독성 결과를 평가하기 위한 검증된 동물 모델이다.
결합 분자, 예컨대, TCR, TCR의 항원-결합 단편(예를 들어, scTCR) 및 TCR을 함유하는 키메라 수용체(예를 들어, CAR), 및 이를 발현하는 세포는 임의의 적합한 수단, 예를 들어, 주사, 예를 들어, 정맥내 또는 피하 주사, 안내 주사, 안구주사, 망막하 주사, 유리체내 주사, 경중격 주사, 공막하 주사, 맥락막내 주사, 전방내 주사, 결막밑 주사, 결막하 주사, 테논하 주사, 안구후 주사, 안구주위 주사 또는 후방 공막 옆 전달에 의해 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 이들은 비경구, 폐내 및 비강내, 및 국소 치료에 요망되는 경우, 병변내 투여에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투약 및 투여는 투여가 단기인지 만성인지에 부분적으로 의존적일 수 있다. 다양한 투여 스케줄은 다양한 시점에 걸친 단일 또는 다중 투여, 일시 투여 및 펄스 주입을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
질병의 예방 또는 치료를 위해, 결합 분자 또는 세포의 적절한 투여량은 치료될 질병의 유형, 결합 분자의 유형, 질병의 중증도 및 경과, 결합 분자가 예방 또는 치료 목적을 위해 투여되는지의 여부, 이전 요법, 환자의 임상 이력 및 결합 분자에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 의존적일 수 있다. 조성물 및 분자 및 세포는 일부 구체예에서 적합하게는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 투여된다.
일부 구체예에서, 세포는 대상체 체중 킬로그램 당 0.1 x 106, 0.2 x 106, 0.3 x 106, 0.4 x 106, 0.5 x 106, 0.6 x 106, 0.7 x 106, 0.8 x 106, 0.9 x 106, 1.0 x 106, 5.0 x 106, 1.0 x 107, 5.0 x 107, 1.0 x 108, 5.0 x 108 이상 또는 이들 사이의 임의의 범위 또는 임의의 값의 세포로 투여될 수 있다. 이식된 세포의 수는 주어진 시간의 원하는 생착 수준에 기초하여 조정될 수 있다. 일반적으로, 1×105 내지 약 1×109개 세포/kg 체중, 약 1×106 내지 약 1×108 세포/kg 체중, 또는 약 1×107 세포/kg 체중, 또는 그 초과의 세포가 필요에 따라 이식될 수 있다. 일부 구체예에서, 평균 크기 마우스에 있어서 적어도 약 0.1x106, 0.5x106, 1.0x106, 2.0x106, 3.0x106, 4.0x106, 또는 5.0x106개의 총 세포의 이식이 효과적이다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 세포, 또는 세포의 서브-타입의 개별 집단은 약 백만 내지 약 1000억 개의 세포 범위 및/또는 체중 킬로그램 당 그 세포의 양, 예를 들어, 100만 내지 약 500억 개의 세포(예를 들어, 약 500만 개 세포, 약 2500만 개 세포, 약 5억 개 세포, 약 10억 개 세포, 약 50억 개 세포, 약 200억 개 세포, 약 300억 개 세포, 약 400억 개의 세포, 또는 전술한 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위), 예를 들어, 약 1천만 내지 약 1000억 개의 세포(예를 들어, 약 2천만 개의 세포, 약 3천만 개의 세포, 약 4천만 개의 세포, 약 6천만 개의 세포, 약 7천만 개의 세포, 약 8천만 개의 세포, 약 9천만 개의 세포, 약 100억 개의 세포, 약 250억 개의 세포, 약 500억 개의 세포, 약 750억 개의 세포, 약 900억 개의 세포, 또는 전술한 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위), 및 일부 경우에 약 1억 개 내지 약 500억개 세포(예를 들어, 약 1억 2천만 개의 세포, 약 2억 5천만 개의 세포, 약 3억 5천만 개의 세포, 약 4억 5천만 개의 세포, 약 6억 5천만 개의 세포, 약 8억 개의 세포, 약 9억 개의 세포, 약 30억 개의 세포, 약 300억 개의 세포, 약 450억 개의 세포) 또는 이들 범위 사이의 임의의 값 및/또는 체중 킬로그램 당으로 대상체에 투여될 수 있다. 투여량은 질환 또는 장애 및/또는 환자 및/또는 다른 치료에 대한 특정 속성에 따라 달라질 수 있다.
이식된 세포의 생착은 임의의 다양한 방법, 예를 들어, 비제한적으로, 종양 부피, 사이토카인 수준, 투여 시간, 이식 후 하나 이상의 시점에서 대상체로부터 수득된 관심 세포의 유세포 분석, 등에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28일 대기의 시간 기반 분석은 종양 수확을 위한 시간을 신호할 수 있다. 임의의 이러한 메트릭스는 항암 면역요법에 대한 반응에 대한 변수의 효과를 결정하기 위해 잘 알려진 파라미터에 따라 조정될 수 있는 변수이다. 또한, 이식된 세포는 사이토카인, 세포외 매트릭스, 세포 배양 지지체 등과 같은 다른 제제와 공동-이식될 수 있다.
세포는 또한 다른 항암제 전, 이와 동시에, 또는 후에 투여될 수 있다.
2개 이상의 세포 유형이 조합될 수 있으며, 예컨대, 세포-기반 요법 및 줄기 세포의 입양 세포 전이, 암 백신 및 세포-기반 요법 등으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 입양 세포-기반 면역요법은 본 발명에 포함되는 세포-기반 요법과 조합될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포-기반 제제는 단독으로 또는 추가적인 세포-기반 제제, 예컨대 입양 T 세포 요법(ACT)과 같은 면역요법과 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 소포 B 세포 림프종을 치료하는 데 사용되는 CD19를 인식하도록 유전자 조작된다. ACT에 대한 면역 세포는 수지상 세포, T 세포, 예컨대, CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포, 자연 살해(NK) 세포, NK T 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), 종양 침윤 림프구(TIL), 림포카인 활성화된 살해(LAK) 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포(Treg), 헬퍼 T 세포, 사이토카인-유도된 킬러(CIK) 세포, 및 이들의 임의의 조합일 수 있다. 비제한적으로, 방사선조사된 자가 또는 동종이계 종양 세포, 종양 용해물 또는 아폽토시스 종양 세포, 항원-제시 세포-기반 면역요법, 수지상 세포-기반 면역요법, 입양 T 세포 전이, 입양 CAR T 세포 요법, 자가 면역 증강 요법(AIET), 암 백신, 및/또는 항원 제시 세포를 포함하는 널리 공지된 입양 세포-기반 면역요법 양식. 이러한 세포-기반 면역요법은 GM-CSF와 같은 사이토카인을 발현하는 것과 같은 면역 반응을 추가로 조절하기 위해 및/또는 Mage-1, gp-100 등과 같은 종양-관련 항원(TAA) 항원을 발현하기 위해 하나 이상의 유전자 생성물을 발현하도록 추가로 변형될 수 있다. 본 발명에 포함되는 제제, 예컨대 암 세포 대 본 발명에 포함되는 또 다른 제제 또는 다른 조성물의 비율은 서로에 대해 1:1일 수 있으나(예를 들어, 동일한 양의 2개의 제제, 3개의 제제, 4개의 제제, 등), 원하는 임의의 양으로 조절될 수 있다(예를 들어, 1:1, 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 2:1, 2.5:1, 3:1, 3.5:1, 4:1, 4.5:1, 5:1, 5.5:1, 6:1, 6.5:1, 7:1, 7.5:1, 8:1, 8.5:1, 9:1, 9.5 :1, 10:1 이상).
일부 구체예에서, 예를 들어, 대상체가 인간인 경우, 용량은, 약 1x108개의 총 결합 단백질(예를 들어, TCR 또는 CAR)-발현 세포, T 세포 또는 말초혈 단핵 세포(PBMC), 예를 들어, 약 1x106 내지 1x108개의 이러한 세포의 범위, 예컨대, 2x106, 5x106, 1x107, 5x107, 또는 1x108 또는 총 이러한 세포, 또는 상기 값 중 임의의 2개 사이의 범위로 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 세포 또는 관련 조성물, 예컨대, 핵산, 숙주 세포, 약학적 제형 등은 조합 치료의 일부로서, 예컨대, 또 다른 치료적 개입, 예컨대 또 다른 항체 또는 조작된 세포 또는 수용제 또는 제제, 예컨대 세포독성제 또는 치료제와 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여될 수 있다.
일부 구체예에서, 세포 또는 관련 조성물은 하나 이상의 추가적인 치료제와 또는 또 다른 치료학적 개입과 함께 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 공동-투여될 수 있다. 일부 맥락에서, 세포 또는 관련 조성물은 세포 집단이 하나 이상의 추가 치료제의 효과를 향상시키도록, 또는 그 반대의 경우에 충분히 가까운 시기에 또 다른 요법과 공동-투여된다. 일부 구체예에서, 세포 또는 관련 조성물은 하나 이상의 추가 치료제 전에 투여된다. 일부 구체예에서, 세포 또는 관련 조성물은 하나 이상의 추가 치료제 후에 투여된다.
일부 구체예에서, 세포 또는 관련 조성물의 생물학적 활성은 일단 세포 또는 관련 조성물이 대상체(예를 들어, 인간)에게 투여되면 임의의 다수의 공지된 방법에 의해 측정된다. 평가할 파라미터는 생체내, 예를 들어, 영상화에 의해, 또는 시험관내/생체외에서 예를 들어, ELISA 또는 유세포 분석에 의한 항원에 대한 조작된 또는 천연 T 세포 또는 다른 면역 세포의 특이적 결합을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 세포를 파괴하는 세포의 능력(세포독성)은 당 분야에 공지된 임의의 적합한 검정 또는 방법을 사용하여 측정될 수 있다(예를 들어, Kochenderfer 등 (2009) J. Immunother. 32: 689-702 and Herman 등 (2004) J. Immunol. Meth. 285:25-40). 일부 구체예에서, 세포의 생물학적 활성은 또한 특정 사이토카인, 예컨대, CD107a, IFNγ, IL-2 및 TNF 알파의 발현 및/또는 분비를 검정함으로써 측정될 수 있다. 일부 구체예에서, 생물학적 활성은 바이러스 부하 또는 로드의 감소와 같은 임상 결과를 평가함으로써 측정된다.
일부 구체예에서, 세포는 이들의 치료 또는 예방 효능이 증가하도록 임의의 수의 방식으로 변형된다. 예를 들어, 집단에 의해 발현된 결합 단백질(예를 들어, 조작된 TCR, CAR, 또는 이의 항원-결합 단편)은 링커를 통해 표적화 모이어티에 직접적으로 또는 간접적으로 컨쥬게이션될 수 있다. 화합물을 표적화 모이어티에 컨쥬게이션시키는 관행은 당 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, Wadwa 등 (1995) J. Drug Targeting 3:111 및 미국 특허 번호 5,087,616).
세포독성 림프구와 같은 면역 세포는 말초 혈액, 비장 및 림프절과 같은 임의의 적합한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 면역 세포는 미정제 제조물 또는 부분적으로 정제된 또는 실질적으로 정제된 제조물로서 사용될 수 있으며, 이는 항체를 사용하는 면역자기 또는 유세포 분석 기술을 포함하는 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는 표준 기술에 의해 수득될 수 있다.
특정 양태에서, 본원에 기술된 MAGEC2 면역원성 펩티드 또는 이러한 MAGEC2 면역원성 펩티드를 인코딩하는 핵산은 MAGEC2-프라이밍된 항원-제시 세포 및/또는 이들 항원-제시 세포로 생성된 MAGEC2-특이적 림프구를 제공하기 위한 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 항원-제시 세포 및/또는 림프구는 MAGEC2 발현과 연관된 장애의 치료 및/또는 예방에 사용된다.
일부 양태에서, 항원-제시 세포를 본원에 기술된 MAGEC2 면역원성 펩티드, 또는 적어도 하나의 MAGEC2 면역원성 펩티드를 인코딩하는 핵산과, 단독으로 또는 애주반트와 조합하여, 적어도 하나의 MAGEC2 면역원성 폴리펩티드가 항원-제시 세포에 의해 제시되기에 충분한 조건 하에서 시험관내에서, 접촉시킴으로써 MAGEC2-프라이밍된 항원-제시 세포를 제조하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 구체예에서, MAGEC2 면역원성 폴리펩티드, 또는 MAGEC2 면역원성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 단독으로 또는 애주반트와 조합하여 항원-제시 세포를 포함하는 균질한, 실질적으로 균질한 또는 이종인 조성물과 접촉될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 전혈, 신선한 혈액, 또는 이의 분획, 예컨대 말초 혈액 단핵 세포, 전혈의 연막 분획, 충전 적혈구, 조사된 혈액, 수지상 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구, 림프구, 자연 살해 세포 및 자연 살해 T 세포를 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 선택적으로 항원-제시 세포의 전구체가 사용되는 경우, 전구체는 전구체를 항원-제시 세포로 분화하기에 충분한 적합한 배양 조건 하에서 배양될 수 있다. 일부 구체예에서, 항원-제시 세포(또는 이의 전구체)는 단핵구, 대식세포, 골수 계통의 세포, B 세포, 수지상 세포 또는 랑게르한스 세포로부터 선택된다.
항원-제시 세포와 접촉하여 배치되는 MAGEC2 면역원성 폴리펩티드, 또는 MAGEC2 면역원성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 양은 단독으로 또는 애주반트와 조합하여, 일상적인 실험에 의해 당업자에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 항원-제시 세포는 세포가 T 세포의 조절을 위해 처리된 형태의 항원을 제시하기에 충분한 기간 동안 MAGEC2 면역원성 폴리펩티드 또는 MAGEC2 면역원성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산과 단독으로 또는 애주반트와 조합하여 접촉된다. 일 구체예에서, 항원-제시 세포는 MAGEC2 면역원성 폴리펩티드 또는 MAGEC2 면역원성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 존재에서 단독으로 또는 애주반트와 조합하여 약 1주 미만 동안, 예시적으로는 약 1분 내지 약 48시간, 약 2분 내지 약 36시간, 약 3분 내지 약 24시간, 약 4분 내지 약 12시간, 약 6분 내지 약 8시간, 약 8분 내지 약 6시간, 약 10분 내지 약 5시간, 약 15분 내지 약 4시간, 약 20분 내지 약 3시간, 약 30분 내지 약 2시간, 및 약 40분 내지 약 1시간 동안 인큐베이션된다. 항원 제시 세포가 항원을 처리하고 제시하는데 필요한 MAGEC2 면역원성 폴리펩티드, 또는 MAGEC2 면역원성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 단독으로 또는 애주반트와 조합한 시간 및 양은 예를 들어 펄스-추적 방법을 사용하여 결정될 수 있으며 여기서 접촉 후에는 세정 기간 및 판독 시스템, 예를 들어 항원 반응성 T 세포에 대한 노출이 이어진다.
특정 구체예에서, 항원-제시 세포의 내인성 처리 경로로 항원을 전달하기 위한 임의의 적절한 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법에는 pH-민감성 리포솜, 애주반트에 대한 항원의 커플링, 세포자멸사 세포 전달, 수지상 세포 상에 세포 펄싱, 항원을 포함하는 재조합 키메라 바이러스-유사 입자(VLP)를 수지상 세포주의 MHC 클래스 I 처리 경로에 전달하는 것을 포함하는 방법이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
일 구체예에서, 가용성 MAGEC2 면역원성 폴리펩티드는 항원-제시 세포와 함께 인큐베이션된다. 일부 구체예에서, MAGEC2 면역원성 폴리펩티드는 MHC 클래스 I 경로로의 전달을 위해 항원-제시 세포의 세포질 안으로의 항원의 전달을 향상시키기 위해 세포용해소에 커플링될 수 있다. 예시적인 세포용해소에는 사포닌-함유 면역 자극 복합체(ISCOM5)와 같은 사포닌 화합물, 기공-형성 독소(예를 들어 알파-독소), 및 리스테리오용해소 O(LLO), 스트렙톨용해소 O(SLO) 및 퍼프린고용해소 O(PFO)와 같은 그람-양성 박테리아의 천연 세포용해소가 포함된다.
일부 구체예에서, 수지상 세포 및 대식세포와 같은 항원-제시 세포는 당업계에 공지된 방법에 따라 단리될 수 있고, MAGEC2 면역원성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 항원-제시 세포 안으로 도입하기 위한 당업계에 공지된 방법에 의해 폴리뉴클레오티드로 형질감염될 수 있다. 형질감염 시약 및 방법은 당업계에 공지되어 있으며 상업적으로 이용가능하다. 예를 들어, MAGEC2 면역원성 폴리펩티드를 인코딩하는 RNA는 적합한 배지에 제공될 수 있으며 항원-제시 세포와 접촉하기 이전에 지질(예를 들어 양이온성 지질)과 결합될 수 있다. 이러한 지질의 비-제한적인 예에는 LIPOFECTIN™ 및 LIPOFECTAMINE™이 포함된다. 생성된 폴리뉴클레오티드-지질 복합체는 그 다음 항원-제시 세포와 접촉될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드는 전기천공 또는 인산칼슘 형질감염과 같은 기술을 사용하여 항원-제시 세포 내로 도입될 수 있다. 그 다음 폴리뉴클레오티드-장입된 항원-제시 세포를 사용하여 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 T 림프구(예를 들어, 세포독성 T 림프구) 증식을 자극할 수 있다. 일 구체예에서, 생체외 확장된 T 림프구는 입양 면역요법의 방법으로 대상체에게 투여된다.
특정 양태에서, MAGEC2 면역원성 에피토프가 항원-제시 세포에 의해 제시되기에 충분한 조건 하에 MAGEC2 면역원성 폴리펩티드 또는 MAGEC2 면역원성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산과, 단독으로 또는 애주반트와 조합하여 시험관내에서 접촉시킨 항원-제시 세포를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
일부 양태에서, MAGEC2 단백질에 특이적인 림프구를 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 방법은 MAGEC2 바이러스에 의해 감염된 세포에 대해 면역 반응을 유도할 수 있는 MAGEC2 단백질-특이적 림프구를 생산하기에 충분한 조건 하에서 림프구를 상기에 기술된 항원-제시 세포와 접촉시키는 것을 포함한다. 따라서, 항원-제시 세포는 또한 MAGEC2 바이러스에 의해 감염된 세포에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 T 림프구 및 B 림프구를 포함한 림프구를 제공하는데 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, T 림프구의 제제는 항원-제시 세포에 의해 제시된 MAGEC2 면역원성 에피토프에 T 림프구를 프라이밍하기 위해 일정 기간(예를 들어, 적어도 약 24시간) 동안 상기에 기술된 항원-제시 세포와 접촉된다.
일부 구체예에서, 항원-제시 세포의 집단은 MAGEC2 면역원성 폴리펩티드, 또는 MAGEC2 면역원성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산과 함께, 단독으로 또는 애주반트와 조합하여 말초 혈액 T 림프구의 이종 집단과 공동-배양될 수 있다. 세포는 MAGEC2 폴리펩티드에 포함된 MAGEC2 에피토프가 항원-제시 세포에 의해 제시되기에 충분한 기간 동안 및 조건 하에서 공동-배양될 수 있고 세포에 반응하도록 T 림프구의 집단을 프라이밍하기 위해 항원-제시 세포는 MAGEC2 바이러스에 감염된다. 특정 구체예에서, MAGEC2 바이러스에 의해 감염된 세포에 반응하도록 프라이밍된 T 림프구 및 B 림프구가 본원에 제공된다.
T 림프구는 말초 혈액, 비장 및 림프절과 같은 적합한 공급원으로부터 얻을 수 있다. T 림프구는 미정제 제제로 사용될 수 있거나 부분적으로 정제되거나 실질적으로 정제된 제제로 사용될 수 있으며, 이는 항체를 사용하는 면역자기 또는 유세포분석 기술을 포함하는 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 표준 기술에 의해 얻어질 수 있다.
특정 양태에서, 상기 기재된 항원-제시 세포 또는 림프구, 및 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 조성물(예를 들어, 약학 조성물)이 본원에 제공된다. 일부 구체예에서, 조성물은 전술한 바와 같은 애주반트를 추가로 포함한다.
특정 양태에서, 그리고 상기에 추가로 기술된 바와 같이, MAGEC2 바이러스에 의해 감염된 세포에 대한 면역 반응을 유도하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 대상체에게 상기에 기술된 항원-제시 세포 또는 림프구를 면역 반응을 이끌어내기에 충분한 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애의 치료 또는 예방에 대한 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 대상체에게 유효량의 상기 기재된 항원-제시 세포 또는 림프구를 투여하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 항원-제시 세포 또는 림프구는 전신적으로, 바람직하게는 주사에 의해 투여된다. 대안적으로, 예를 들어 조직에 직접적으로 주사를 통해, 바람직하게는 데포 또는 서방형 제형으로 전신적으로 보다는 국소적으로 투여할 수 있다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 항원-프라이밍된 항원-제시 세포 및 이들 항원-제시 세포로 생성된 항원-특이적 T 림프구는 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애의 예방적 또는 치료적 치료를 위한 면역조절 조성물에서 활성 화합물로서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 MAGEC2-프라이밍된 항원-제시 세포는 대상체로의 입양 전달을 위한 CD8+ T 림프구, CD4+ T 림프구 및/또는 B 림프구를 생성하는데 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어 MAGEC2-특이적 림프구는 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 앓고 있는 대상체에서 치료 목적을 위해 입양 전달될 수 있다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 항원-제시 세포 및/또는 림프구는 면역 반응을 유도하기 위해, 특히 MAGEC2를 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 그 자체로 또는 조합하여 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 항원-제시 세포 및/또는 림프구는 대상체(즉, 자가 세포)로부터 또는 대상체와 MHC 일치 또는 불일치인 다른 대상체(예를 들어, 동종이계)로부터 유래될 수 있다.
항원-제시 세포 및 림프구의 단일 또는 다중 투여는 치유 제공자(예를 들어 의사)가 선택한 세포 수 및 치료로 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 항원-제시 세포 및/또는 림프구는 약학적으로 허용되는 담체에 투여된다. 적합한 담체는 세포가 성장한 성장 배지, 또는 인산염 완충 식염수와 같은 임의의 적합한 완충 배지일 수 있다. 세포는 단독으로 투여되거나 다른 치료제와 함께 보조 요법으로 투여될 수 있다.
본 발명에 포함되는 또 다른 양태에서, MAGEC2를 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 결합 단백질(예를 들어, 조작된 TCR, CAR 또는 이의 항원-결합 단편)을 발현하는 본원에 기재된 세포를 면역 반응을 유발하기에 충분한 유효량으로 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애의 치료 또는 예방하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 결합 단백질(예를 들어, 조작된 TCR, CAR, 또는 이의 항원-결합 단편)을 발현하는 본원에 기재된 세포를 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 세포는 예컨대, 주사에 의해 전신 투여된다. 대안적으로, 예를 들어, 데포(depot) 또는 서방형 제형과 같이 조직에 직접 주사를 통해 전신보다는 국소적으로 투여될 수 있다.
일부 구체예에서, 결합 단백질(예를 들어, 조작된 TCR, CAR, 또는 이의 항원-결합 단편)을 발현하는 본원에 기재된 세포는 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애의 예방적 또는 치료적 치료를 위한 면역조절 조성물에서 활성 화합물로서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, MAGEC2-프라이밍된 항원-제시 세포는 결합 단백질(예를 들어, 조작된 TCR, CAR, 또는 이의 항원-결합 단편)을 발현하는 본원에 기재된 세포와 함께 대상체로의 입양 전달에 추가로 사용하기 위한 림프구(예를 들어, CD8+ T 림프구, CD4+ T 림프구 및/또는 B 림프구)를 생성하는데 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 결합 단백질(예를 들어, 조작된 TCR, CAR, 또는 이의 항원-결합 단편)을 발현하는 본원에 기재된 세포는 단독으로 또는 림프구와 조합되어 면역 반응, 특히 MAGEC2를 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 유발하기 위해 대상체에 투여될 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 결합 단백질(예를 들어, 조작된 TCR, CAR 또는 이의 항원-결합 단편)을 발현하는 본원에 기재된 세포의 단독의 또는 림프구와 조합된 단일 또는 다중 투여는 치료 제공자(예를 들어, 의사)에 의해 선택되는 치료 및 세포 수로 수행될 수 있다. 유사하게, 세포는 단독으로 또는 림프구와 조합되어 약학적으로 허용되는 담체로 투여될 수 있다. 적합한 담체는 세포가 성장한 성장 배지, 또는 포스페이트 완충된 염수와 같은 임의의 적합한 완충 배지일 수 있다. 세포는 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 애주번트 요법으로서 투여될 수 있다.
XI . 키트 및 장치
본 발명은 또한 키트 및 장치를 포함한다. 예를 들어, 키트 또는 장치는 적합한 용기에 패키징된 결합 단백질, 핵산 또는 결합 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 벡터, 핵산 또는 벡터를 포함하고/거나 본원에 기재된 바와 같은 결합 단백질을 발현하는 숙주 세포, 안정한 MHC-펩티드 복합체, 애주번트, 검출 시약 및 이들의 조합물을 포함할 수 있으며, 이러산 시약을 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 또한 별도의 용기에 패키징된 투여 도구와 같은 다른 성분을 함유할 수 있다. 키트는 본 발명에 포함되는 방법을 수행하기 위한 단위로서 홍보, 배포 또는 판매될 수 있다.
본 개시는 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되는 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다.
실시예
실시예 1: 실시예 2의 재료 및 방법
a. 면역원성 에피토프 식별
(i) TCR 풀의 발견 및 설계
쌍을 이루는 TCR 알파 및 TCR 베타 서열은 Chromium™ 단일 세포 V(D)J 시약 키트(v1)(10X Genomics)에 대한 제조업체의 지침에 따라 TIL 요법 생성물의 단일 세포 시퀀싱(10X Genomics)에 의해 얻었다. 개별 쌍을 이루는 서열을 마우스 TRBC 및 TRAC 영역을 발현하는 단일 작제물로 클로닝하여 P2A에 의해 분리된 인간-마우스 TCR을 생성했다. TCR 작제물은 Lenti-X™ 세포(Takara Bio USA, Mountain View, CA)와 함께 패키징되었다. 간략하게, TCR 작제물을 패키징 플라스미드(pREV/pTAT/pVSVG/pGAGPOL)와 혼합하고 제조업체의 프로토콜에 따라 jetPRIME®(Polyplus, Illkirch, France) 시약과 함께 인큐베이션했다. 24시간 후, 배양물을 Opti-Pro™ SFM 배지(LifeTech)로 세정했다. 바이러스 상등액을 형질감염 48시간 후에 수확하고 Vivaspin® 20 원심분리 농축기(Sartorius, Bohemia, NY)를 사용하여 원하는 부피로 농축했다(Sartorius, Bohemia, NY). 렌티바이러스 역가는 TCR-/- Jurkat 세포주를 사용하여 GFP 또는 TCRα/β 발현에 의해 결정되었다. 바이러스 역가를 정량화하기 위해, 형질도입-후 48 내지 72시간에 유세포분석적 분석에 의해 GFP 발현을 평가했다. 샘플은 CytoFLEX™ 유세포분석기(Beckman Coulter)를 사용하여 분석되었다. 역가는 식: TU/ml = GFP+의 % x (형질도입에 사용된 세포 수) x (희석 인자) x 1000을 사용하여 GFP를 발현하는 세포의 백분율을 TU/ml로 계산했다.
(ii) T 세포 조작
제조업체의 지침(Miltenyi Biotec, cat. #130-117-019)에 따라 Miltenyi MultiMACS™ Cell24 Separator(Miltenyi Biotec) 및 StraightFrom® Leukopak® Human CD8 MicroBead Kit를 사용하여 백혈구로부터 CD8+ T 세포(T 세포)를 단리했다. >90% 순도의 단리된 CD8 T 세포를 CryoStor® CS10(StemCell Technologies, cat. #07930, Cambridge, MA)에 10 x 106 세포/mL로 재현탁하고 후속 실험을 위해 -170℃에 보관했다.
CD8 T 세포를 먼저 해동하고 10% 열-불활성화된 소 태아 혈청(HI-FBS)(ThermoFisher, cat. #A3840002), 1X 페니실린-스트렙토마이신(ThermoFisher, cat. #15140122), 50IU/mL 재조합 인간 IL-2(Peprotech, cat. #200-02), 5ng/uL 재조합 인간 IL-7(R&D, cat. #207-IL), 및 5ng/uL 재조합 인간 IL-15(R&D, cat. #247-ILB)가 보충된 RPMI-1640 배지(ATCC, cat. #30-2001)에 재현탁하고 5% CO2 하에 37℃에서 밤새 휴지시켰다. 다음날, 세포를 ImmunoCult™ 인간 CD3/CD28 T 세포 활성화제(StemCell Technologies, cat. #10971)로 16시간 동안 활성화한 다음 1 x 108 - 1 x 109 U/mL에서 렌티바이러스 안에 패키징된 개별 TCR로 형질도입했다. 72시간 후, 잔류 바이러스를 씻어내고 세포를 모아서 TCR 형질도입된 T 세포의 라이브러리를 생성하였다. 외인성 마우스-인간 TCR을 발현하는 세포를 비오틴-표지된 항-마우스 TCR 항체(BioLegend, cat. #109204)로 표지하고, 제조업체의 지침에 따라 항-비오틴-접합된 마이크로비드(Miltenyi, cat. #130-090485)를 사용하여 단리했다. 단리된 세포를 7일 동안 확장시키고, CryoStor® CS10(StemCell Technologies, cat. #07930, Cambridge, MA)에 재현탁하고 냉동시켰다.
(iii) 펩티드 라이브러리 설계
암 고환 항원(CTA) 펩티드 라이브러리를 생성하기 위해, 1,600개 고환 암 항원의 코딩 영역에 걸쳐있는 아미노산 서열을 20개 아미노산이 중첩하는 66-량체 아미노산 타일로 나누었다. 타일을 실리콘 칩(Twist Bioscience)에서 합성하고 렌티바이러스 발현 벡터에 클로닝했다. 유사하게, 인간 게놈 펩티드 라이브러리는 90-량체 아미노산 타일로 인간 게놈의 모든 단백질에 걸쳐있는 인간 게놈 코딩 서열에 걸쳐 타일링함에 의해 생성되었다.
(iv) 라이브러리 바이러스 패키징 및 적정
펩티드 라이브러리-발현 리포터 세포를 생성하기 위해 먼저 Lenti-X™ 세포(Takara Bio USA, Mountain View, CA)를 사용하여 펩티드 라이브러리 작제물을 패키징했다. 간략하게, Lenti-X™ 세포를 CellBIND® 폴리시렌 CellSTACK® 5-스택 챔버(Corning)에 75% 컨플루언시로 도말하고 jetPRIME® 형질감염 시약(Polyplus, Illkirch, France)을 사용하여 형질감염시켰다. 펩티드 라이브러리를 패키징 플라스미드(pREV/pTAT/pVSVG/pGAGPOL)와 혼합하고 제조업체의 프로토콜에 따라 jetPRIME® 시약과 함께 인큐베이션했다. Opti-Pro™ SFM 배지(LifeTech)를 형질감염-후 24시간에 추가했다. 바이러스 상등액을 형질감염 48시간 후에 수확하고 Vivaflow® 50 카세트(Sartorius, Bohemia, NY)를 사용하여 농축했다. 렌티바이러스 역가는 바이러스 상등액의 연속 희석을 사용하여 Lenti-X™ 세포를 사용하여 퓨로마이신 콜로니 형성에 의해 결정되었다. 바이러스 역가를 정량화하기 위해, 형질도입-후 48시간에 퓨로마이신 저항성 콜로니를 선택했다. 프루오마이신 저항성 콜로니를 크리스탈 바이올렛 염색으로 시각화하고 계수했다. 역가는 식: TU/ml = 퓨로마이신 저항성 콜로니의 수 x 희석 인자 x 1000을 사용하여 TU/ml로 콜로니 형성 단위로 계산되었다.
그랜자임-활성화된 형광 리포터를 발현하는 MHC-무효 HEK293T 세포는 HLA-B*07:02 단일대립유전자 리포터 세포, HLA-A*24:02 단일대립유전자 리포터 세포 등과 같이 본원에 기술된 MAGEC2 면역원성 펩티드를 제시하는 MHC를 발현하도록 조작되었다. 6x107(CTA 라이브러리의 경우) 또는 2.4x108(게놈 와이드 라이브러리의 경우) 단일대립유전자 리포터 세포를 Falcon® 875㎠ 직사각형 직선형 목의 세포 배양 다중-플라스크(Corning)에 도말하고 5의 MOI로 렌티바이러스를 패키징한 펩티드 라이브러리로 형질도입했다. 양성 대조군으로서, 안에 스파이킹된 TCR에 의해 인식되는 것으로 알려진 상기에 기술된 인간 게놈 라이브러리에서 유래된 단일 90-량체 아미노산 타일을 발현하는 세포를 세포 풀에 1:40,000의 비율로 추가했다.
(v) 그랜자임-사멸 세포의 공동-배양 및 농축
2.5x107 형질도입된 CD8+ T 세포를 해동하고 0.1mg/mL 항-CD3(OKT3, eBioscience) 및 50U/mL IL-2(Peprotech)가 보충된 배지에서 T 세포:PBMC 비율 1:20에서 조사된 PMBC 피더 세포로 재자극하였다. 7일 후, 펩티드 라이브러리로 형질도입된 리포터 세포에 T 세포를 E:T 비율 1:1로 첨가하고 4시간 동안 인큐베이션하였다. 모든 세포는 트립신화에 의해 수집하고 제조업체 지침에 따라 Annexin V-접합된 마이크로비드(Miltenyi)로 염색하고 autoMACS® Pro 분리기(Miltenyi)를 사용하여 분리했다. 형광 그랜자임 리포터에 양성인 세포를 MoFlo® Astrios™ Cell Sorter(Beckman Coulter)를 사용하여 분류하고 후속 분석을 위해 DNA/RNA Shield™(Zymo Research)에 보관했다.
(vi) 차세대 시퀀싱(NGS) 및 데이터 분석
GeneJET™ Genomic DNA 정제 키트(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 게놈 DNA를 추출하고 2 라운드의 PCR 증폭을 사용하여 NGS 시퀀싱을 위해 준비했다. 간단히 말하면, 첫 번째 라운드 PCR은 펩티드 카세트를 증폭시켰고 두 번째 라운드에서는 Illumina NextSeq™ 기기(Illumina, San Diego, CA)를 사용하여 시퀀싱 전에 시퀀싱 어댑터와 샘플 인덱스를 추가했다. 각 펩티드에 대한 매핑된 판독의 비율과 농축 배수는 입력 라이브러리에서의 펩티드 비율에 대해 계산되었다. 8개의 기술적 복제의 기하 평균이 계산되었으며 >2개의 동일한 서열에서 >4배수의 농축이 후속 분석을 위해 고려되었다.
b. TCR 발견
(i) 펩티드 예측 및 표적 검증
>4배수의 점수를 갖는 중첩하는 펩티드 서열을 사용하여 NetMHC4.0(월드와이드웹 cbs.dtu.dk에서 이용가능)과의 MHC 결합을 예측하고 상위 예측된 MHC 결합 펩티드를 합성했다(Genscript). 단일대립유전자 HEK293T 리포터 세포를 1uM의 각 펩티드 후보로 1시간 동안 펄싱한 다음 1:1의 E:T 비율로 TCR-형질도입된 T 세포의 풀과 공동-배양했다. 24시간 후, 배양물을 V-바닥 96-웰 플레이트로 옮기고, 2,000rpm에서 2분 동안 원심분리하고, 제조업체의 지침에 따라 Ella 3세대 IFNγ 카트리지(ProteinSimple)를 사용하여 상등액을 IFNγ에 대해 검정했다.
(ii) 상응하는 TCR의 식별
TCR-형질도입된 T 세포의 풀에서 상응하는 TCR을 식별하기 위해, MHC 단일대립유전자 HEK293T 세포를 1시간 동안 펩티드-펄싱하고 16-24시간 동안 1:1의 E:T 비율로 T 세포의 풀과 공동-배양했다. T 세포를 혼합하고, 피펫팅으로 수집하고, 제조업체의 지침에 따라 CD137 마이크로비드 키트(Miltenyi)로 표지했다. 간단히 말하면, T 세포를 먼저 PE-표지된 항-CD137 및 AF647-표지된 항-CD69(BioLegend)로 염색하고 세정한 다음 항-PE 마이크로비드로 표지했다. 표지된 세포를 autoMACS® Pro 분리기(Miltenyi)로 농축하고 그랜임 리포터에 대해 양성인 세포를 MoFlo® Astrios™ Cell Sorter(Beckman Coulter)에서 분류했다. 분류된 세포에서 게놈 DNA를 추출하고 TCR 발현 카세트를 PCR 증폭하여 차세대 시퀀싱(NGS)을 위해 준비했다.
c. TCR 특성화
(i) T 세포 인식 검정
TCR에 의한 식별된 펩티드의 인식을 특성화하기 위해, 야생형 HEK293 세포를 펩티드의 연속 희석액으로 펄싱하고 관심 TCR로 형질도입된 T 세포와 공동-배양했다. 24시간 후, 배양물을 피펫팅으로 혼합하고, 2,000rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 상등액을 수집하고 제조업체의 지시에 따라 인간 IFNγ 3세대 단일-플렉스 검정(Protein Simple)을 사용하여 IFNγ 분비에 대해 측정했다. 대안적으로, 그랜자임-활성화된 형광 리포터를 발현하는 단일대립유전자 HEK293T 세포를 펩티드의 연속 희석액으로 펄싱하고 관심 있는 개별 TCR로 형질도입된 T 세포와 공동-배양했다. 4시간 후, 피펫팅으로 배양물을 수확하고 CytoFLEX™ S 기기(Beckman Coulter)를 사용하여 리포터의 형광을 검출했다.
흑색종 세포주에 대한 반응성을 검출하기 위해, 야생형 흑색종 세포주를 96-웰 평평한 바닥 플레이트에 6x104개 세포로 시딩하고 5% CO2에서 37℃에서 16시간 동안 휴지시켰다. 다음 날, T 세포를 해동하고 완전 RPMI-1640 배지에서 세정하고, 이펙터 대 표적 비율이 1:1이 되도록 웰에 첨가했다. 공동-배양물을 16시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포를 피펫팅으로 수확하고 V-바닥 96웰 플레이트로 옮기고 2,000rpm에서 2분 동안 원심분리했다. 인간 IFNγ 3세대 단일-플렉스 검정(Protein Simple)을 사용한 IFNγ 측정을 위해 상등액을 수집했다. 유세포 분석(Cytoflex S™ 기기, Beckman Coulter)을 위해, 세포 펠릿을 FACS 완충액(PBS, 0.5% BSA, 2mM EDTA)으로 세정하고 PE-접합된 항-CD137(Miltenyi), AF647-접합된 항-CD69(Biolegend) 및 BV421-접합된 항-CD8(BioLegend)을 포함한 활성화-유도된 마커에 대해 염색했다.
(ii) 암세포 배양 및 Incucyte® NucLight™ Red 형질도입
흑색종 계통은 ATCC(Manassas, VA)에서 구입했고 HEK293T 세포는 원래 Takara Bio(Shiga, Japan)로부터의 것이다. 모든 배지에는 10% FBS와 1% 페니실린을 보충하고 5% CO2에서 37℃에서 인큐베이션했다. A101D, A2058, HT144 및 HEK293T 세포는 완전한 DMEM에서 유지되었다. SK-MEL-5는 완전 EMEM에서 배양된 반면, HMCB는 10mM HEPES를 갖는 완전 EMEM이 필요했다. T 세포 인식 검정을 준비하기 위해 형질도입되지 않은 암세포를 유지하고, 각 세포주의 106개 세포에 Incucyte® NucLight™ Red 렌티바이러스 시약(Sartorius, Gottingen, Germany)을 도입했다. 72시간에 걸쳐 1.5ug/mL의 퓨로마이신을 사용하여 양성으로-표지된 세포를 선택했다.
(iii) Incucyte® 세포독성 검정
Incucyte® NucLight™ 분석을 위해 선택된 흑색종 세포를, 5x103 세포로 도말된 HMCB 세포를 제외하고, 104 세포로 96-웰 평평한 바닥 플레이트(Corning, Flintshire, UK)에 시딩했다. 같은 날, T 세포를 해동하고 완전 RPMI-1640에서 세정하고, 50U/mL IL-2(PeproTech), 5ng/mL IL-7 및 5ng/mL IL-15(R&D Systems)을 갖는 배지에서 밤새 휴지하도록 하였다. 모든 세포를 5% CO2에서 37℃에서 16시간 동안 휴지시켰다. T 세포의 2-배수 연속 희석은 가장 높은 E:T가 4:1이고 가장 낮은 것은 1:2인 이펙터 대 표적 비율에 대해 수행되었다. 2개의 기술적 복제에서 전체 웰당 하나의 이미지를 72시간 과정에 걸쳐 2시간마다 취했다. 4x 대물렌즈를 활용한 이미징과 데이터를 Incucyte® 기본 소프트웨어를 사용하여 분석했다. 레드 채널 획득 시간은 400ms였으며 그 배경은 Top-Hat 분획화를 가능하게 함에 의하여 차감되었다. 설정이 없는 경우 소프트웨어가 밀접하게 간격을 둔 세포를 하나의 개체가 아닌 다중 개체로 인식할 수 있도록 가장자리 분할이 적용되었다.
도 7-9에 도시된 데이터는 상기에서 기술된 것과 유사한 재료, 방법 및 실험에 따라 생성되었다.
실시예 2: MAGEC2 면역원성 에피토프 및 이에 대한 결합 단백질의 식별
MHC 분자에 의해 제시된 면역원성 펩티드를 인식하는 흑색종을 갖는 자가 환자를 치료하는데 사용되는 입양 세포 요법 생성물에서 얻은 TCR의 풀에서 TCR의 신속한 식별을 가능하게 하는 고처리량 항원 발견 플랫폼이 개발되어 인식된 면역원성 펩티드를 식별하는데 적용되었다(실시예 1 참조). 그 발현이 암과 같은 특정 질환과 연관되어 있고 고환의 외부 조직에서는 일반적으로 발현되지 않는 유전자인 MAGEC2의 항원성 펩티드(도 1)가 HLA-B*07:02에 의한 제시에서 인식되는 것으로 식별되었다(도 2a). 검색된 서열 라이브러리의 타일을 중첩함에 의해 공유된 공통 서열과 생물정보학 분석을 통해 면역원성 MAGEC2 펩티드 서열을 식별할 수 있다(도 2b; "RAR"이라는 대표적인 면역원성 펩티드 검증에 대해서는 또한 도 2c 참조). 그런 다음 RAR 대표적인 면역원성 펩티드를 사용하여 TCR-형질도입된 T 세포의 풀을 스크리닝하고 TCR 8-3과 같은 히트를 식별했다(도 3a 및 3b). 대표적인 TCR 8-3은 펩티드 펄스-기반 세포독성 검정에서 RAR 펩티드-HLA-B*07:02(pMHC) 복합체를 발현하는 세포를 사멸시키는 것으로 입증되었다(도 4a 및 4b). 대표적인 TCR 8-3은 다양한 수준에서 MAGEC2를 발현하는 흑색종 세포를 포함하여 MAGEC2를 발현하는 암 세포를 사멸시키는 것으로 추가로 입증되었다(도 5a-5e 및 6). HLA-A*24:02와 같은 HLA-A*24 혈청형 및 이러한 펩티드-HLA 복합체를 인식하는 TCR에 의해 제시되는 추가적인 면역원성 MAGEC2 펩티드 서열을 식별하기 위해 유사한 실험이 수행되었다(도 7-9 참조).
따라서, MHC 분자의 맥락에서 생리학적으로 관련된 TCR-항원 쌍이 식별되었다.
참조에 의한 통합
본원에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조로서 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타낸 것처럼 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다. 상충하는 경우, 본원의 임의의 정의를 포함하는 본 출원이 우선할 것이다.
또한, 공개 데이터베이스의 항목, 예컨대 World Wide Web at tigr.org의 The Institute for Genomic Research (TIGR) 및/또는 World Wide Web at ncbi.nlm.nih.gov의 National Center for Biotechnology Information (NCBI)에 의해 관리되는 것들과 같은 공개 데이터베이스의 항목과 관련된 접근 번호를 참조하는 임의의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열이 전체적으로 참조로 포함된다.
등가물 및 범위
본 발명에 의해 포함되는 하나 이상의 구체예의 세부사항은 상기 설명에 기재되어 있다. 대표적인 예시적인 재료 및 방법이 상기에 기재되었지만, 본원에 기재된 것과 유사하거나 등가인 임의의 물질 및 방법이 본 발명에 포함되는 구체예의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 본 발명과 관련된 다른 특징, 목적 및 이점은 상세한 설명으로부터 명백하다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우, 상기 제공된 본 설명이 우선할 것이다.
당업자는 단지 관례적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 본 발명에 의해 포함되는 특정 구체예에 대한 많은 등가물을 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 본 발명에 의해 포함되는 범위는 본원에 제공된 설명으로 제한되도록 의도되지 않으며, 이러한 등가물은 첨부된 청구범위에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
용어 "포함하는"은 개방된 것으로 의도되고 추가 요소 또는 단계의 포함을 허용하지만 이를 필요로 하지 않는다는 것이 또한 주목된다. 따라서, 용어 "포함하는"이 본원에서 사용되는 경우, 따라서 용어 "구성된"이 또한 포함되고 개시된다.
범위가 주어지는 경우, 종말점이 포함된다. 또한, 당업자의 맥락 및 이해로부터 달리 지시되거나 달리 명백하지 않는 한, 범위로서 표현되는 값은 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한, 본 발명에 포함되는 다양한 구체예에서 언급된 범위 내의 임의의 특정 값 또는 하위범위에서 범위의 하한 단위의 10분의 1까지를 가정할 수 있다.
또한, 종래 기술에 속하는 본 발명에 의해 포함되는 임의의 특정 구체예는 임의의 하나 이상의 청구항으로부터 명시적으로 배제될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 구체예는 당업자에게 공지된 것으로 간주되기 때문에, 배제가 본원에 명시적으로 제시되지 않더라도 배제될 수 있다. 본 발명에 포함되는 조성물의 임의의 특정 구체예(예를 들어, 임의의 항생제, 치료적 또는 활성 성분; 임의의 생산 방법; 임의의 사용 방법 등)는 선행 기술의 존재 여부와 무관하게 임의의 이유로 하나 이상의 청구범위로부터 배제될 수 있다.
사용된 단어는 제한이 아니라 설명의 단어이며, 더 넓은 양태에서 본 발명에 의해 포함되는 진정한 범위 및 사상을 벗어나지 않으면서 첨부된 청구범위의 범위 내에서 변경될 수 있음이 이해되어야 한다.
본 발명은 몇몇 설명된 구체예와 관련하여 어느 정도의 길이로 일부 구체적으로 설명되었지만, 이는 임의의 그러한 특정 또는 구체예 또는 임의의 특정 구체예로 제한되는 것으로 의도하는 것은 아니며, 종래 기술의 관점에서 이러한 청구범위의 가능한 가장 넓은 해석을 제공하고, 따라서 본 발명에 포함되는 의도된 범위를 효과적으로 포함하도록 첨부된 청구범위를 참조하여 해석되어야 한다.
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ctgctacctt ttggcacaat 660 ccgaggaatc actttaggtg tcaagtacag ttccacggat tgtcagagga ggataaatgg 720 ccggagggct ccccgaagcc ggttacgcag aacattagtg cggaagcctg gggacgagca 780 gactgcggta tcacgtctgc cagctatcag caaggcgttc tgtcagcgac aattctgtac 840 gaaatacttt tgggtaaggc tacattgtat gcggtattgg tgtctacgct ggtagtcatg 900 gccatggtga aacgaaaaaa ctcaagagcc aaaagaagcg ggagcggtgc gacaaacttt 960 agcctgttga aacaagccgg cgacgttgaa gagaaccccg gacctatgga gaagaatcct 1020 ttggcagccc cacttcttat cctctggttt catcttgact gcgtgagcag cattctgaac 1080 gtggaacaaa gtcctcagtc actgcatgtt caggagggag acagcaccaa tttcacctgc 1140 agcttccctt ccagcaattt ttatgccctt cactggtaca gatgggaaac tgcaaaaagc 1200 cccgaggcct tgtttgttat gactcttaat ggggatgaaa agaagaaagg acgcattagt 1260 gccactctta ataccaagga gggttacagc tatttgtata tcaaaggatc ccagcctgag 1320 gactcagcca catacctctg tgcctccgga agtggtggtg ctacaaacaa gctcatcttt 1380 ggaactggca ctctgcttgc tgtccagcca aacattcaaa acccagaacc cgccgtctac 1440 cagctgaaag acccgaggtc tcaagactct acgttgtgct tgttcaccga tttcgacagt 1500 cagataaatg tgcctaagac catggagagt ggcactttca tcactgacaa atgtgtgttg 1560 gacatgaagg ctatggacag caagtcaaac ggcgcgattg cttggtccaa ccaaacttct 1620 ttcacgtgcc aggacatctt caaggagaca aacgccacct atccatcctc tgatgttccg 1680 tgcgatgcga ctcttaccga gaaaagcttc gagacggaca tgaacttgaa cttccaaaac 1740 ctgcttgtga tggtactgcg aatacttctt cttaaggtgg cgggcttcaa tttgctcatg 1800 acactcagac tttggtctag c 1821 <210> 31 <211> 607 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 31 Met Ser Pro Ile Phe Thr Cys Ile Thr Ile Leu Cys Leu Leu Ala Ala 1 5 10 15 Gly Ser Pro Gly Glu Glu Val Ala Gln Thr Pro Lys His Leu Val Arg 20 25 30 Gly Glu Gly Gln Lys Ala Lys Leu Tyr Cys Ala Pro Ile Lys Gly His 35 40 45 Ser Tyr Val Phe Trp Tyr Gln Gln Val Leu Lys Asn Glu Phe Lys Phe 50 55 60 Leu Ile Ser Phe Gln Asn Glu Asn Val Phe Asp Glu Thr Gly Met Pro 65 70 75 80 Lys Glu Arg Phe Ser Ala Lys Cys Leu Pro Asn Ser Pro Cys Ser Leu 85 90 95 Glu Ile Gln Ala Thr Lys 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aagatacctc atcacagtga ctggaaagaa gttaacagtg 120 acttgttctc agaatatgaa ccatgagtat atgtcctggt atcgacaaga cccagggctg 180 ggcttaaggc agatctacta ttcaatgaat gttgaggtga ctgataaggg agatgttcct 240 gaagggtaca aagtctctcg aaaagagaag aggaatttcc ccctgatcct ggagtcgccc 300 agccccaacc agacctctct gtacttctgt gcctgcgcta gtagcttcgg caccagcggt 360 cgcggtgaac agtttttcgg gccagggaca cggctcaccg tgctagagga cctgaacaag 420 gtgttcccac ccgaggtcgc tgtgtttgag ccatcagaag cagagatctc ccacacccaa 480 aaggccacac tggtgtgcct ggccacaggc ttcttccctg accacgtgga gctgagctgg 540 tgggtgaatg ggaaggaggt gcacagtggg gtcagcacgg acccgcagcc cctcaaggag 600 cagcccgccc tcaatgactc cagatactgc ctgagcagcc gcctgagggt ctcggccacc 660 ttctggcaga acccccgcaa ccacttccgc tgtcaagtcc agttctacgg gctctcggag 720 aatgacgagt ggacccagga tagggccaaa cccgtcaccc agatcgtcag cgccgaggcc 780 tggggtagag cagactgtgg ctttacctcg gtgtcctacc agcaaggggt cctgtctgcc 840 accatcctct atgagatcct gctagggaag gccaccctgt atgctgtgct ggtcagcgcc 900 cttgtgttga tggccatggt caagagaaag gatttc 936 <210> 41 <211> 312 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 41 Met Gly Pro Gln Leu Leu Gly Tyr Val Val Leu Cys Leu Leu Gly Ala 1 5 10 15 Gly Pro Leu Glu Ala Gln Val Thr Gln Asn Pro Arg Tyr Leu Ile Thr 20 25 30 Val Thr Gly Lys Lys Leu Thr Val Thr Cys Ser Gln Asn Met Asn His 35 40 45 Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Gln 50 55 60 Ile Tyr Tyr Ser Met Asn Val Glu Val Thr Asp Lys Gly Asp Val Pro 65 70 75 80 Glu Gly Tyr Lys Val Ser Arg Lys Glu Lys Arg Asn Phe Pro Leu Ile 85 90 95 Leu Glu Ser Pro Ser Pro Asn Gln Thr Ser Leu Tyr Phe Cys Ala Cys 100 105 110 Ala Ser Ser Phe Gly Thr Ser Gly Arg Gly Glu Gln Phe Phe Gly Pro 115 120 125 Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro 130 135 140 Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln 145 150 155 160 Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val 165 170 175 Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys 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atgactttca gtgagaacac aaagtcgaac 240 ggaagatata cagcaactct ggatgcagac acaaagcaaa gctctctgca catcacagcc 300 tcccagctca gcgattcagc ctcctacatc tgcgtcgtgt ctgcccgcaa cgcaggtaac 360 atgcttacat tcggaggggg aacaaggtta atggtcaaac cccatattca aaacccagaa 420 cccgccgtct accagctgaa agacccgagg tctcaagact ctacgttgtg cttgttcacc 480 gatttcgaca gtcagataaa tgtgcctaag accatggaga gtggcacttt catcactgac 540 aaatgtgtgt tggacatgaa ggctatggac agcaagtcaa acggcgcgat tgcttggtcc 600 aaccaaactt ctttcacgtg ccaggacatc ttcaaggaga caaacgccac ctatccatcc 660 tctgatgttc cgtgcgatgc gactcttacc gagaaaagct tcgagacgga catgaacttg 720 aacttccaaa acctgcttgt gatggtactg cgaatacttc ttcttaaggt ggcgggcttc 780 aatttgctca tgacactcag actttggtct agc 813 <210> 43 <211> 271 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 43 Met Lys Lys His Leu Thr Thr Phe Leu Val Ile Leu Trp Leu Tyr Phe 1 5 10 15 Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Gln Val Glu Gln Ser Pro Gln Ser Leu 20 25 30 Ile Ile Leu 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 46 atgggccccc agctccttgg ctatgtggtc ctttgccttc taggagcagg ccccctggaa 60 gcccaagtga cccagaaccc aagatacctc atcacagtga ctggaaagaa gttaacagtg 120 acttgttctc agaatatgaa ccatgagtat atgtcctggt atcgacaaga cccagggctg 180 ggcttaaggc agatctacta ttcaatgaat gttgaggtga ctgataaggg agatgttcct 240 gaagggtaca aagtctctcg aaaagagaag aggaatttcc ccctgatcct ggagtcgccc 300 agccccaacc agacctctct gtacttctgt gcctgcgcta gtagcttcgg caccagcggt 360 cgcggtgaac agtttttcgg gccagggaca cggctcaccg tgctagaaga tcttcgaaac 420 gtaacccctc caaaagtgag tctctttgaa ccgagtaagg ctgagatcgc gaacaaacaa 480 aaggcgaccc tcgtctgtct tgcgcgagga ttttttcccg accacgtgga gttgtcttgg 540 tgggtaaacg gtaaggaagt acacagcggt gtttgcaccg accctcaagc ctacaaggaa 600 tctaactatt catactgcct ttcatcccga cttagggttt ctgctacctt ttggcacaat 660 ccgaggaatc actttaggtg tcaagtacag ttccacggat tgtcagagga ggataaatgg 720 ccggagggct ccccgaagcc ggttacgcag aacattagtg cggaagcctg gggacgagca 780 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Claims (142)

  1. 표 1에 열거된 펩티드 서열로부터 선택된 펩티드 에피토프를 포함하는 면역원성 펩티드.
  2. 표 1에 열거된 펩티드 서열로부터 선택된 펩티드 에피토프로 구성된 면역원성 펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 면역원성 펩티드는 MAGEC2 단백질로부터 유래되고, 선택적으로 면역원성 펩티드는 길이가 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 아미노산인, 면역원성 펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 펩티드는 대상체에서 MAGEC2 및/또는 MAGEC2-발현 세포에 대한 면역 반응을 유도할 수 있고, 선택적으로 면역 반응은 i) T 세포 반응 및/또는 CD8+ T 세포 반응이고/이거나 ii) T 세포 확장, 사이토카인 방출 및/또는 세포독성 사멸로 구성된 군으로부터 선택되는, 면역원성 펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 면역원성 펩티드를 포함하는 면역원성 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 애주반트를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 면역원성 조성물은 대상체에서 MAGEC2 및/또는 MAGEC2-발현 세포에 대한 면역 반응을 유도할 수 있고, 선택적으로 면역 반응은 i) T 세포 반응 및/또는 CD8+ T 세포 반응이고/이거나 ii) T 세포 확장, 사이토카인 방출 및/또는 세포독성 사멸로 구성된 군에서 선택되는, 면역원성 조성물.
  8. 표 1에 열거된 펩티드 서열로부터 선택된 펩티드 에피토프 및 MHC 분자를 포함하는 조성물.
  9. 제8항에 있어서, MHC 분자는 MHC 다량체이고, 선택적으로 MHC 다량체는 사량체인, 조성물.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, MHC 분자는 MHC 클래스 I 분자인, 조성물.
  11. 제9항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, MHC 분자는 HLA-A*02, HLA-A*03, HLA-A*01, HLA-A*11, HLA-A*24 및/또는 HLA-B*07로 구성된 군으로부터 선택된 HLA 혈청형인 MHC 알파 사슬을 포함하며, 선택적으로 HLA 대립유전자는 HLA-A*0201, HLA-A*0202, HLA-A*0203, HLA-A*0204, HLA-A*0205, HLA-A*0206, HLA-A*0207, HLA-A*0210, HLA-A*0211, HLA-A*0212, HLA-A*0213, HLA-A*0214, HLA-A*0216, HLA-A*0217, HLA-A*0219, HLA-A*0220, HLA-A*0222, HLA-A*0224, HLA-A*0230, HLA-A*0242, HLA-A*0253, HLA-A*0260, HLA-A*0274 대립유전자, HLA-A*0301, HLA-A*0302, HLA-A*0305, HLA-A*0307, HLA-A*0101, HLA-A*0102, HLA-A*0103, HLA-A*0116 대립유전자, HLA-A*1101, HLA-A*1102, HLA-A*1103, HLA-A*1104, HLA-A*1105, HLA-A*1119 대립유전자, HLA-A*2402, HLA-A*2403, HLA-A*2405, HLA-A*2407, HLA-A*2408, HLA-A*2410, HLA-A*2414, HLA-A*2417, HLA-A*2420, HLA-A*2422, HLA-A*2425, HLA-A*2426, HLA-A*2458 대립유전자, HLA-B*0702, HLA-B*0704, HLA-B*0705, HLA-B*0709, HLA-B*0710, HLA-B*0715, 및 HLA-B*0721 대립유전자로 구성된 군으로부터 선택된, 조성물.
  12. MHC 분자의 맥락에서 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 펩티드를 포함하는, 안정한 MHC-펩티드 복합체.
  13. 제12항에 있어서, MHC 분자는 MHC 다량체이고, 선택적으로 MHC 다량체는 사량체인, 안정한 MHC-펩티드 복합체.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, MHC 분자는 MHC 클래스 I 분자인, 안정한 MHC-펩티드 복합체.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, MHC 분자는 HLA-A*02, HLA-A*03, HLA-A*01, HLA-A*11, HLA-A*24 및/또는 HLA-B*07로 구성된 군으로부터 선택된 HLA 혈청형인 MHC 알파 사슬을 포함하며, 선택적으로 HLA 대립유전자는 HLA-A*0201, HLA-A*0202, HLA-A*0203, HLA-A*0204, HLA-A*0205, HLA-A*0206, HLA-A*0207, HLA-A*0210, HLA-A*0211, HLA-A*0212, HLA-A*0213, HLA-A*0214, HLA-A*0216, HLA-A*0217, HLA-A*0219, HLA-A*0220, HLA-A*0222, HLA-A*0224, HLA-A*0230, HLA-A*0242, HLA-A*0253, HLA-A*0260, HLA-A*0274 대립유전자, HLA-A*0301, HLA-A*0302, HLA-A*0305, HLA-A*0307, HLA-A*0101, HLA-A*0102, HLA-A*0103, HLA-A*0116 대립유전자, HLA-A*1101, HLA-A*1102, HLA-A*1103, HLA-A*1104, HLA-A*1105, HLA-A*1119 대립유전자, HLA-A*2402, HLA-A*2403, HLA-A*2405, HLA-A*2407, HLA-A*2408, HLA-A*2410, HLA-A*2414, HLA-A*2417, HLA-A*2420, HLA-A*2422, HLA-A*2425, HLA-A*2426, HLA-A*2458 대립유전자, HLA-B*0702, HLA-B*0704, HLA-B*0705, HLA-B*0709, HLA-B*0710, HLA-B*0715, 및 HLA-B*0721 대립유전자로 구성된 군으로부터 선택된, 안정한 MHC-펩티드 복합체.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 에피토프와 MHC 분자는 공유적으로 연결되어 있고/있거나 MHC 분자의 알파 및 베타 사슬은 공유적으로 연결되어 있는, 안정한 MHC-펩티드 복합체.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 안정한 MHC-펩티드 복합체는 검출가능한 표지를 포함하고, 선택적으로 검출가능한 표지는 형광단인, 안정한 MHC-펩티드 복합체.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 안정한 MHC-펩티드 복합체 및 애주반트를 포함하는 면역원성 조성물.
  19. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 펩티드 또는 이의 보체를 인코딩하는 단리된 핵산.
  20. 제19항의 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
  21. a) 제19항의 단리된 핵산을 포함하고, b) 제20항의 벡터를 포함하고/하거나 c) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 면역원성 펩티드를 생산하고/하거나 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 안정한 MHC-펩티드 복합체를 세포 표면에 제시하며, 선택적으로 여기서 세포는 유전적으로 조작된, 세포.
  22. a) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 면역원성 펩티드 및/또는 b) 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 안정한 MHC-펩티드 복합체를 포함하는 장치 또는 키트로서, 상기 장치 또는 키트는 선택적으로 결합 단백질에 대한 a) 및/또는 b)의 결합을 검출하기 위한 시약을 포함하며, 선택적으로 결합 단백질은 항체, 항체의 항원-결합 단편, TCR, TCR의 항원-결합 단편, 단일 사슬 TCR(scTCR), 키메라 항원 수용체(CAR), 또는 TCR과 이펙터 도메인을 포함하는 융합 단백질인, 장치 또는 키트.
  23. 다음을 포함하는 안정한 MHC-펩티드 복합체에 결합하는 T 세포를 검출하는 방법:
    a) T 세포를 포함하는 샘플을 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 안정한 MHC-펩티드 복합체와 접촉시키는 단계; 및
    b) 안정한 MHC-펩티드 복합체에 대한 T 세포의 결합을 검출하는 단계, 선택적으로 안정한 MHC-펩티드 복합체에 결합하는 안정한 MHC-펩티드-특이적 T 세포의 백분율을 추가로 결정하는 단계로서, 선택적으로 여기서 샘플은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 포함하는, 단계.
  24. 제23항에 있어서, T 세포는 CD8+ T 세포인, 방법.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 및/또는 결정하는 단계는 형광 활성화 세포 분류(FACS), 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사면역 검정(RIA), 면역화학, 웨스턴 블롯, 또는 세포내 흐름 검정을 사용하여 수행되는, 방법.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 하나 이상의 MAGEC2 단백질 또는 이의 단편과 접촉되었거나 접촉된 것으로 의심되는 T 세포를 포함하는, 방법.
  27. 다음을 포함하는 T 세포가 MAGEC2에 노출되었는지 여부를 결정하는 방법:
    a) T 세포를 포함하는 세포 집단을 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 펩티드 또는 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 안정한 MHC-펩티드 복합체와 인큐베이션하는 단계; 및
    b) 반응성의 존재 또는 수준을 검출하는 단계로서,
    여기서 대조군 수준에 비하여 반응성의 존재 또는 더 높은 수준은 T 세포가 MAGEC2에 노출되었음을 나타내고, 선택적으로 여기서 T 세포를 포함하는 세포 집단은 대상체로부터 획득되는, 단계.
  28. 다음을 포함하는 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 앓고 있는 대상체의 임상 결과를 예측하는 방법:
    a) 대상체로부터 얻은 T 세포와 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 면역원성 펩티드 또는 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 안정한 MHC-펩티드 복합체 사이의 반응성의 존재 또는 수준을 결정하는 단계; 및
    b) 반응성의 존재 또는 수준을 대조군으로부터의 것과 비교하는 단계로서, 여기서 대조군은 양호한 임상 결과를 갖는 대상체로부터 얻어지고,
    여기서 대조군에 비하여 대상체 샘플에서 반응성의 존재 또는 더 높은 수준은 대상체가 양호한 임상 결과를 갖는다는 것을 나타내는, 단계.
  29. 다음을 포함하는 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애에 대한 요법의 효능을 평가하는 방법:
    a) 대상체에게 요법의 적어도 일부를 제공하기 이전에 대상체으로부터 얻은 제1 샘플에서, 대상체로부터 얻은 T 세포와 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 면역원성 펩티드 또는 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 안정한 MHC-펩티드 복합체 사이의 반응성의 존재 또는 수준을 결정하는 단계, 및
    b) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 면역원성 펩티드, 또는 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 안정한 MHC-펩티드 복합체와, 대상체에게 요법의 제공에 이어서 대상체로부터 얻은 제2 샘플에 존재하는 대상체로부터 얻은 T 세포 사이의 반응성의 존재 또는 수준을 결정하는 단계로서,
    여기서, 제1 샘플에 비해 제2 샘플에서 반응성의 존재 또는 더 높은 수준은 요법이 대상체에서 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 치료하는데 효과적이라는 표시인, 단계.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 반응성의 수준은 a) 결합의 존재 및/또는 b) T 세포 활성화 및/또는 이펙터 기능에 의해 표시되고, 선택적으로 여기서 T 세포 활성화 또는 이펙터 기능은 T 세포 증식, 사멸 또는 사이토카인 방출인, 방법.
  31. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 후속 시점에 단계 a) 및 b)를 반복하는 단계를 추가로 포함하며, 선택적으로 여기서 대상체는 제1 시점과 후속 시점 사이에 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 개선하기 위한 치료를 받은, 방법.
  32. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 결합, 활성화 및/또는 이펙터 기능은 형광 활성화된 세포 분류(FACS), 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사면역 검정(RIA), 면역화학, 웨스턴 블롯, 또는 세포내 흐름 검정을 사용하여 검출되는, 방법.
  33. 제27항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 대조군 수준은 참조 번호인, 방법.
  34. 제27항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 대조군 수준은 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애가 없는 대상체의 수준인, 방법.
  35. 대상체에게 치료적으로 유효한 양의 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 예방 및/또는 치료하는 방법.
  36. 다음을 포함하는 표 1에 열거된 펩티드 서열로부터 선택된 펩티드 에피토프에 결합하는 펩티드-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편을 식별하는 방법:
    a) 세포의 표면 상에 MHC 분자의 맥락에서 표 1에 열거된 펩티드 서열로부터 선택된 펩티드 에피토프를 제시하는 세포를 제공하는 단계;
    b) 세포 상의 MHC 분자의 맥락에서 펩티드 에피토프에 대한 복수의 후보 펩티드-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편의 결합을 결정하는 단계; 및
    c) MHC 분자의 맥락에서 펩티드 에피토프에 결합하는 하나 이상의 펩티드-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편을 식별하는 단계.
  37. 제36항에 있어서, 단계 a)는 세포의 표면 상의 MHC 분자를 표 1에 열거된 펩티드 서열로부터 선택된 펩티드 에피토프와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  38. 제36항에 있어서, 단계 a)는 표 1에 열거된 펩티드 서열로부터 선택된 펩티드 에피토프를 펩티드 에피토프를 인코딩하는 이종 서열을 포함하는 벡터를 사용하여 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는, 방법.
  39. 다음을 포함하는 표 1에 열거된 펩티드 서열로부터 선택된 펩티드 에피토프에 결합하는 펩티드-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편을 식별하는 방법:
    a) 단독으로 또는 MHC 분자의 맥락에서 표 1에 열거된 펩티드 서열로부터 선택된 펩티드 에피토프를 포함하는, 펩티드 에피토프를 단독으로 또는 안정한 MHC-펩티드 복합체에 제공하는 단계;
    b) 펩티드 또는 안정한 MHC-펩티드 복합체에 대한 복수의 후보 펩티드-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편의 결합을 결정하는 단계; 및
    c) 펩티드 에피토프 또는 안정한 MHC-펩티드 복합체에 결합하는 하나 이상의 펩티드-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편을 식별하는 단계로서, 선택적으로 MHC 또는 MHC-펩티드 복합체는 제8항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 것인, 단계.
  40. 제39항에 있어서, 복수의 후보 펩티드 결합 분자는 항체, 항체의 항원-결합 단편, TCR, TCR의 항원-결합 단편, 단일 사슬 TCR(scTCR), 키메라 항원 수용체(CAR), 또는 TCR 및 이펙터 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함하는, 방법.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 복수의 후보 펩티드 결합 분자는 적어도 2, 5, 10, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 또는 그 초과의 서로 다른 후보 펩티드 결합 분자를 포함하는, 방법.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 후보 펩티드 결합 분자는 대상체 또는 대상체의 집단으로부터의 샘플로부터 얻은 하나 이상의 후보 펩티드 결합 분자를 포함하고; 또는 복수의 후보 펩티드 결합 분자는 대상체로부터의 샘플로부터 얻은 모체 스캐폴드 펩티드 결합 분자에 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 후보 펩티드 결합 분자를 포함하는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 대상체 또는 대상체의 집단은 a) MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 앓고 있지 않고/않거나 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애로부터 회복되었거나, 또는 b) MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 앓고 있는, 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 대상체 또는 대상체의 집단에는 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 조성물이 투여되는, 방법.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애의 동물 모델 및/또는 포유동물이며, 선택적으로 여기서 포유동물은 인간, 영장류 또는 설치류인, 방법.
  46. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애의 동물 모델, HLA-형질전환 마우스 및/또는 인간 TCR 형질전환 마우스인, 방법.
  47. 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), T 세포 및/또는 CD8+ 기억 T 세포를 포함하는, 방법.
  48. 제39항 내지 제47항 중 어느 한 항에 따라 식별된 펩티드-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 선택적으로 여기서 펩티드-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편은 항체, 항체의 항원-결합 단편, TCR, TCR의 항원-결합 단편, 단일 사슬 TCR(scTCR), 키메라 항원 수용체(CAR), 또는 TCR 및 이펙터 도메인을 포함하는 융합 단백질인, 펩티드-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편.
  49. i) 표 1에 열거된 서열로부터 선택된 펩티드 에피토프에 결합하고, ii) 제39항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 식별되고/되거나, iii) MHC 분자의 맥락에서 표 1에 열거된 서열로부터 선택된 펩티드 에피토프를 포함하는 안정한 MHC-펩티드 복합체에 결합하는, 펩티드-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편을 발현하는 유전적으로 조작된 T 세포의 치료적으로 유효한 양을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 치료하는 방법으로서, 선택적으로 여기서 펩티드-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편은 항체, 항체의 항원-결합 단편, TCR, TCR의 항원-결합 단편, 단일 사슬 TCR(scTCR), 키메라 항원 수용체(CAR), 또는 TCR 및 이펙터 도메인을 포함하는 융합 단백질이며, 선택적으로 MHC 또는 MHC-펩티드 복합체는 제8항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 것인, 방법.
  50. 제49항에 있어서, T 세포는 a) 대상체, b) MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 앓고 있지 않은 공여자, 또는 c) MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애로부터 회복된 공여자로부터 단리되는, 방법.
  51. 항원-특이적 T 세포를 대상체에게 주입하는 것을 포함하는 대상체에서 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 치료하는 방법으로서, 항원-특이적 T 세포는 다음에 의해 생성되는, 방법:
    a) 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 조성물로 대상체로부터의 면역 세포를 자극하는 단계; 및
    b) 시험관내 또는 생체외에서 항원-특이적 T 세포를 확장하며, 선택적으로 i) 면역 세포를 자극하기 전에 대상으로부터 면역 세포를 단리하고/하거나 ii) 면역 세포는 PBMC, T 세포, CD8+ T 세포, 나이브 T 세포, 중앙 기억 T 세포, 및/또는 이펙터 기억 T 세포를 포함하는, 단계.
  52. 제51항에 있어서, 제제는 펩티드 에피토프, 면역원성 펩티드, 안정한 MHC-펩티드 복합체, T 세포 수용체 및/또는 면역 세포 사이에 적어도 하나의 면역 복합체의 형성에 적합한 조건 아래 그리고 시간 동안 접촉되게 위치되는, 방법.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 펩티드 에피토프, 면역원성 펩티드, 안정한 MHC-펩티드 복합체 및/또는 T 세포 수용체는 세포에 의해 발현되고, 세포는 하나 이상의 단계 동안 확장 및/또는 단리되는, 방법.
  54. 제23항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애는 암 또는 이의 재발이며, 선택적으로 암은 흑색종, 두경부암, 폐암, 자궁경부암, 전립선암, 다발성 골수종, 간세포 암종, 유방 침윤성 암종 및 방광 요로상피 암종으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  55. 제23항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애의 동물 모델 및/또는 포유동물이며, 선택적으로 여기서 포유동물은 인간, 영장류 또는 설치류인, 방법.
  56. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 펩티드 서열, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 펩티드, 및/또는 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 안정한 MHC-펩티드 복합체를 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 결합 단백질로서, 선택적으로 여기서 결합 단백질은 항체, 항체의 항원-결합 단편, TCR, TCR의 항원-결합 단편, 단일 사슬 TCR(scTCR), 키메라 항원 수용체(CAR), 또는 TCR 및 이펙터 도메인을 포함하는 융합 단백질인, 결합 단백질.
  57. 제56항에 있어서,
    a) 표 2에 열거된 TCR 알파 사슬 CDR 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR 알파 사슬 CDR 서열에 대해 적어도 약 80% 동일성을 갖는 T 세포 수용체(TCR) 알파 사슬 CDR 서열; 및/또는
    b) 표 2에 열거된 TCR 베타 사슬 CDR 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR 베타 사슬 CDR 서열에 대해 적어도 약 80% 동일성을 갖는 TCR 베타 사슬 CDR 서열을 포함하며, 결합 단백질은 MAGEC2 면역원성 펩티드-MHC(pMHC) 복합체에 결합할 수 있으며, 선택적으로 결합 친화성은 약 5x10-4 M 이하의 Kd를 갖는, 결합 단백질.
  58. 제56항에 있어서,
    a) 표 2에 열거된 TCR 알파 사슬 가변(Vα) 도메인 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR Vα 도메인 서열에 대해 적어도 약 80% 동일성을 갖는 TCR Vα 도메인 서열; 및/또는
    b) 표 2에 열거된 TCR 베타 사슬 가변(Vβ) 도메인 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR Vβ 도메인 서열에 대해 적어도 약 80% 동일성을 갖는 TCR Vβ 도메인 서열을 포함하며, 결합 단백질은 MAGEC2 면역원성 펩티드-MHC(pMHC) 복합체에 결합할 수 있으며, 선택적으로 결합 친화성은 약 5x10-4 M 이하의 Kd를 갖는, 결합 단백질.
  59. 제56항에 있어서,
    a) 표 2에 열거된 TCR 알파 사슬 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR 알파 사슬 서열에 대해 적어도 약 80% 동일성을 갖는 TCR 알파 사슬 서열; 및/또는
    b) 표 2에 열거된 TCR 베타 사슬 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR 베타 사슬 서열에 대해 적어도 약 80% 동일성을 갖는 TCR 베타 사슬 서열을 포함하며, 결합 단백질은 MAGEC2 면역원성 펩티드-MHC(pMHC) 복합체에 결합할 수 있으며, 선택적으로 결합 친화성은 약 5x10-4 M 이하의 Kd를 갖는, 결합 단백질.
  60. 제56항에 있어서,
    a) 표 2에 열거된 TCR 알파 사슬 CDR 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR 알파 사슬 CDR 서열; 및/또는
    b) 표 2에 열거된 TCR 베타 사슬 CDR 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR 베타 사슬 CDR 서열를 포함하며, 결합 단백질은 MAGEC2 면역원성 펩티드-MHC(pMHC) 복합체에 결합할 수 있으며, 선택적으로 결합 친화성은 약 5x10-4 M 이하의 Kd를 갖는, 결합 단백질.
  61. 제56항에 있어서,
    a) 표 2에 열거된 TCR 알파 사슬 가변(Vα) 도메인 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR Vα 도메인 서열; 및/또는
    b) 표 2에 열거된 TCR 베타 사슬 가변(Vβ) 도메인 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR Vβ 도메인 서열을 포함하며, 결합 단백질은 MAGEC2 면역원성 펩티드-MHC(pMHC) 복합체에 결합할 수 있으며, 선택적으로 결합 친화성은 약 5x10-4 M 이하의 Kd를 갖는, 결합 단백질.
  62. 제56항에 있어서,
    a) 표 2에 열거된 TCR 알파 사슬 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR 알파 사슬 서열; 및/또는
    b) 표 2에 열거된 TCR 베타 사슬 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR 베타 사슬 서열을 포함하며, 결합 단백질은 MAGEC2 면역원성 펩티드-MHC(pMHC) 복합체에 결합할 수 있으며, 선택적으로 결합 친화성은 약 5x10-4 M 이하의 Kd를 갖는, 결합 단백질.
  63. 제56항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 1) TCR 알파 사슬 CDR, TCR Vα 도메인 및/또는 TCR 알파 사슬이 표 2에 열거된 TRAV, TRAJ 및 TRAC 유전자의 군으로부터 선택되는 TRAV, TRAJ 및/또는 TRAC 유전자 또는 이의 단편에 의해 인코딩되고/거나 2) TCR 베타 사슬 CDR, TCR Vβ 도메인 및/또는 TCR 베타 사슬은 표 2에 열거된 TRBV, TRBJ 및 TRBC 유전자의 군으로부터 선택되는 TRBV, TRBJ 및/또는 TRBC 유전자 또는 이의 단편에 의해 인코딩되고/거나 3) 결합 단백질의 각각의 CDR은 표 2에 열거된 동족 참조 CDR 서열과 비교하여 최대 5개의 아미노산 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 갖는, 결합 단백질.
  64. 제56항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 단백질이 키메라, 인간화된 또는 인간 결합 단백질인, 결합 단백질.
  65. 제56항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인은 막횡단 도메인을 갖는 결합 도메인 및 세포내에 있는 이펙터 도메인을 포함하는, 결합 단백질.
  66. 제56항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, TCR 알파 사슬 및 TCR 베타 사슬이 공유적으로 연결되고, 선택적으로 TCR 알파 사슬 및 TCR 베타 사슬은 링커 펩티드를 통해 공유적으로 연결되는, 결합 단백질.
  67. 제56항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, TCR 알파 사슬 및/또는 TCR 베타 사슬이 모이어티에 공유적으로 연결되고, 선택적으로 공유적으로 연결된 모이어티가 친화성 태그 또는 표지를 포함하는, 결합 단백질.
  68. 제67항에 있어서, 친화성 태그가 CD34 농축 태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 칼모듈린 결합 단백질(CBP), 단백질 C 태그, Myc 태그, HaloTag, HA 태그, Flag 태그, His 태그, 비오틴 태그 및 V5 태그로 구성된 군으로부터 선택되고/거나 표지는 형광 단백질인, 결합 단백질.
  69. 제56항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 공유적으로 연결된 모이어티가 염증제, 사이토카인, 독소, 세포독성 분자, 방사성 동위원소, 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는, 결합 단백질.
  70. 제56항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 단백질이 세포 표면 상의 pMHC 복합체에 결합하는, 결합 단백질.
  71. 제56항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, MHC 또는 MHC-펩티드 복합체는 제8항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 것인, 결합 단백질.
  72. 제56항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, MAGEC2 펩티드-MHC(pMHC) 복합체에 대한 결합 단백질의 결합이 면역 반응을 유발하고, 선택적으로, 면역 반응이 i) T 세포 반응 및/또는 CD8+ T 세포 반응이고/이거나 ii) T 세포 확장, 사이토카인 방출 및/또는 세포독성 사멸로 구성된 군으로부터 선택되는, 결합 단백질.
  73. 제56항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 단백질이 약 1x10-4 M 이하, 약 5x10-5 M 이하, 약 1x10-5 M 이하, 약 5x10-6 M 이하, 약 1x10-6 M 이하, 약 5x10-7 M 이하, 약 1x10-7 M 이하, 약 5x10-8 M 이하, 약 1x10-8 M 이하, 약 5x10-9 M 이하, 약 1x10-9 M 이하, 약 5x10-10 M 이하, 약 1x10-10 M 이하, 약 5x10-11 M 이하, 약 1x10-11 M 이하, 약 5x10-12 M 이하, 또는 약 1x10-12 M 이하의 Kd로 MAGEC2 면역원성 펩티드-MHC(pMHC) 복합체에 특이적으로 그리고/또는 선택적으로 결합할 수 있는, 결합 단백질.
  74. 제56항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 단백질이 공지된 T-세포 수용체보다 펩티드-MHC(pMHC)에 대해 더 높은 결합 친화성을 가지며, 선택적으로 더 높은 결합 친화성은 적어도 1.05-배 더 높은, 결합 단백질.
  75. 제56항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 단백질이 MAGEC2의 이형접합성 발현을 갖는 표적 세포와 접촉되는 경우 공지된 T-세포 수용체보다 더 높은 T 세포 확장, 사이토카인 방출 및/또는 세포독성 사멸을 유도하며, 선택적으로 유도는 적어도 1.05-배 더 높은, 결합 단백질.
  76. 제75항에 있어서, 세포독성 사멸은 표적 암 세포인, 결합 단백질.
  77. 제76항에 있어서, 암은 흑색종, 두경부암, 폐암, 자궁경부암, 전립선암, 다발성 골수종, 간세포암종, 유방 침윤성 암종, 방광 요로상피 암종으로 구성된 군에서 선택되는, 결합 단백질.
  78. 제56항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 단백질이 ALKDVEERV/HLA-A*02, LLFGLALIEV/HLA-A*02, SESIKKKVL/HLA-B*44 및 ASSTLYLVF/HLA-B*57로 구성된 군에서 선택된 펩티드-MHC(pMHC) 복합체에 결합하지 않는, 결합 단백질.
  79. 표 2에 열거된 TCR 알파 사슬 및 베타 사슬 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 TCR 알파 사슬 및/또는 베타 사슬.
  80. i) 엄격한 조건 하에, 표 2에 열거된 폴리펩티드 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 상보체와 혼성화되고, ii) 표 2에 열거된 폴리펩티드 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산에 대해 적어도 약 80% 상동성을 갖는 서열, 및/또는 iii) ii) 표 2에 열거된 것을 인코딩하는 핵산과 적어도 약 80% 상동성을 갖는 서열인 분리된 핵산 분자로서, 선택적으로 분리된 핵산 분자는 1) 표 2에 열거된 TRAV, TRAJ 및/또는 TRAC 유전자의 군으로부터 선택되는 TRAV, TRAJ 및 TRAC 유전자 또는 이의 단편 및/또는 2) 표 2에 열거된 TRBV, TRBJ 및 TRBC 유전자의 군으로부터 선택되는 TRBV, TRBJ 및/또는 TRBC 유전자 또는 이의 단편을 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  81. 제80항에 있어서, 핵산이 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된, 분리된 핵산.
  82. 제80항 또는 제81항의 단리된 핵산을 포함하는 벡터로서, 선택적으로 i) 벡터는 클로닝 벡터, 발현 벡터 또는 바이러스 벡터이고/이거나 ii) 벡터는 표 3에 열거된 벡터 서열을 포함하는, 벡터.
  83. 제82항에 있어서, 벡터가 CD8α 및/또는 CD8β를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는, 벡터.
  84. 제83항에 있어서, CD8α 또는 CD8β를 인코딩하는 핵산 서열이 태그를 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결되는, 벡터.
  85. 제83항 또는 제84항에 있어서, 태그를 인코딩하는 핵산이 CD8α 또는 CD8β의 N-말단에 태그가 융합되도록 CD8α 또는 CD8β을 인코딩하는 핵산 서열의 5' 업스트림에 있는, 벡터.
  86. 제84항 또는 제85항에 있어서, 태그가 CD34 농축 태그인, 벡터.
  87. 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 제80항 또는 제81항의 분리된 핵산, 및 CD8α 및/또는 CD8β를 인코딩하는 핵산 서열이 내부 리보솜 진입 부위 또는 자가-절단 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열과 상호연결되는, 벡터.
  88. 제87항에 있어서, 자가-절단 펩티드가 P2A, E2A, F2A 또는 T2A인, 벡터.
  89. 제80항 또는 제81항의 분리된 핵산을 포함하고/거나 제82항 내지 제88항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하고/거나 제56항 내지 제78항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질을 발현하는 숙주 세포로서, 선택적으로 세포가 유전적으로 조작되는, 숙주 세포.
  90. 제89항에 있어서, 숙주 세포가 TCR 유전자, HLA 유전자 또는 둘 모두의 염색체 유전자 녹아웃을 포함하는, 숙주 세포.
  91. 제89항 또는 제90항에 있어서, 숙주 세포가 α1 마크로글로불린 유전자, α2 마크로글로불린 유전자, α3 마크로글로불린 유전자, β1 마이크로글로불린 유전자, β2 마이크로글로불린 유전자 및 이들의 조합으로부터 선택되는 HLA 유전자의 녹아웃을 포함하는, 숙주 세포.
  92. 제89항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 TCRα 가변 영역 유전자, TCR β 가변 영역 유전자, TCR 불변 영역 유전자 및 이들의 조합으로부터 선택되는 TCR 유전자의 녹아웃을 포함하는, 숙주 세포.
  93. 제89항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 CD8α 및/또는 CD8β를 발현하며 선택적으로 CD8α 및/또는 CD8β가 CD34 농축 태그에 융합되는, 숙주 세포.
  94. 제93항에 있어서, 숙주 세포가 CD34 농축 태그를 사용하여 농축되는, 숙주 세포.
  95. 제89항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 조혈 간세포, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 제대혈 세포 또는 면역 세포인, 숙주 세포.
  96. 제95항에 있어서, 면역 세포가 T 세포, 세포독성 림프구, 세포독성 림프구 전구 세포, 세포독성 림프구 간세포, 세포독성 림프구 줄기 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4/CD8 이중 음성 T 세포, 감마 델타(γδ) T 세포, 자연 살해(NK) 세포, NK-T 세포, 수지상 세포 또는 이들의 조합인, 숙주 세포.
  97. 제89항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 나이브 T 세포, 중심 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포 또는 이들의 조합인, 숙주 세포.
  98. 제89항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 일차 T 세포 또는 T 세포주의 세포인, 숙주 세포.
  99. 제89항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 내인성 TCR을 발현하지 않거나 더 낮은 표면 발현을 갖는, 숙주 세포.
  100. 제89항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 MHC 분자의 맥락에서 MAGEC2 펩티드 에피토프를 포함하는 펩티드-MHC(pMHC) 복합체를 포함하는 표적 세포와 접촉되는 경우 사이토카인 또는 세포독성 분자를 생산할 수 있는, 숙주 세포.
  101. 제100항에 있어서, 숙주 세포가 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 표적 세포와 접촉되는, 숙주 세포.
  102. 제100항 또는 제101항에 있어서, 사이토카인이 TNF-α, IL-2, 및/또는 IFN-γ인, 숙주 세포.
  103. 제89항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성 분자가 퍼포린 및/또는 그랜자임이고, 선택적으로 세포독성 분자가 그랜자임 B인, 숙주 세포.
  104. 제89항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 MAGEC2의 이형접합성 발현을 갖는 표적 세포와 접촉되는 경우 더 높은 수준의 사이토카인 또는 세포독성 분자를 생산할 수 있는, 숙주 세포.
  105. 제104항에 있어서, 숙주 세포가 적어도 1.05배 더 높은 수준의 사이토카인 또는 세포독성 분자를 생산할 수 있는, 숙주 세포.
  106. 제89항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 MHC 분자의 맥락에서 MAGEC2 펩티드 에피토프를 포함하는 펩티드-MHC(pMHC) 복합체를 포함하는 표적 세포를 사멸시킬 수 있는, 숙주 세포.
  107. 제106항에 있어서, 사멸이 사멸 검정에 의해 결정되는, 숙주 세포.
  108. 제106항 또는 제107항에 있어서, 사멸 검정에서 숙주 세포 및 표적 세포의 비가 20:1 내지 1:4인, 숙주 세포.
  109. 제106항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포는 1μg/mL 내지 50pg/mL의 MAGEC2 펩티드로 펄싱된 표적 세포이고, 선택적으로 표적 세포는 MAGEC2 펩티드에 일치하는 MHC에 대한 세포 단일대립유전자인, 숙주 세포.
  110. 제106항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 MAGEC2의 이형접합성 발현을 갖는 표적 세포와 접촉되는 경우 더 많은 수의 표적 세포를 사멸시킬 수 있으며, 선택적으로, 세포 서멸은 적어도 1.05-배 더 높은, 숙주 세포.
  111. 제89항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포가 세포주 또는 일차 세포이고, 선택적으로 표적 세포가 HEK293 유래된 세포주, 암 세포주, 일차 암 세포, 형질전환된 세포주 및 불멸화된 세포주로 구성된 군으로부터 선택되는, 숙주 세포.
  112. 제89항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, MAGEC2 면역원성 펩티드가 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 것이고/이거나 MHC 또는 MHC-펩티드 복합체가 제8항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 것인, 숙주 세포.
  113. 제89항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 ALKDVEERV/HLA-A*02, LLFGLALIEV/HLA-A*02, SESIKKKVL/HLA-B*44 및 ASSTLYLVF/HLA-B*57로 구성된 군으로부터 선택되는 펩티드-MHC(pMHC) 복합체를 포함하는 표적 세포와 접촉할 때 T 세포 확장, 사이토카인 방출 또는 세포독성 사멸을 유도하지 않는, 숙주 세포.
  114. 제89항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 MAGEC2 항원을 발현하지 않고, 제56항 내지 제78항 중 어느 한 항의 결합 단백질에 의해 인식되지 않고, 혈청형 HLA-B*07이 아니고, HLA-B*07 대립유전자를 발현하지 않고, 혈청형 HLA-A*24가 아니고/아니거나 HLA-A*24 대립유전자를 발현하지 않는, 숙주 세포.
  115. 제89항 내지 제114항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포의 집단.
  116. a) 제56항 내지 제77항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질, b) 제80항 또는 제81항에 따른 분리된 핵산, c) 제82항 내지 제88항 중 어느 한 항에 따른 벡터, d) 제89항 내지 제114항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포 및/또는 e) 제115항에 따른 숙주 세포의 집단, 및 담체를 포함하는 조성물.
  117. a) 제56항 내지 제77항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질, b) 제80항 또는 제81항에 따른 분리된 핵산, c) 제82항 내지 제88항 중 어느 한 항에 따른 벡터, d) 제89항 내지 제114항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포 및/또는 e) 제115항에 따른 숙주 세포의 집단을 포함하는 장치 또는 키트로서, 상기 장치 또는 키트는 pMHC 복합체에 대한 a), d) 및/또는 e)의 결합을 검출하기 위한 시약을 선택적으로 포함하는, 장치 또는 키트.
  118. 제56항 내지 제77항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질을 생산하기 위한 방법으로서, 방법이 (i) 제56항 내지 제77항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산에 의해 형질전환된 형질전환 숙주 세포를 상기 결합 단백질의 발현을 허용하기에 적합한 조건하에 배양하는 단계; 및 (ii) 발현된 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
  119. 제56항 내지 제77항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질을 발현하는 숙주 세포를 생산하는 방법으로서, 방법이 (i) 제56항 내지 제77항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 숙주 세포 내로 도입하는 단계; 및 (ii) 상기 결합 단백질의 발현을 허용하기에 적합한 조건 하에 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  120. MAGEC2 항원 및/또는 MAGEC2를 발현하는 세포의 존재 또는 부재를 검출하는 방법으로서, 선택적으로 세포가 과증식성 세포이며, 제56항 내지 제77항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 결합 단백질 또는 제89항 내지 제114항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 숙주 세포 또는 제115항에 따른 숙주 세포의 집단을 사용하여 샘플 중 상기 MAGEC2 항원의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하며, MAGEC2 항원의 검출이 MAGEC2 항원 및/또는 MAGEC2를 발현하는 세포의 존재를 나타내는, 방법.
  121. 제120항에 있어서, 적어도 하나의 결합 단백질 또는 적어도 하나의 숙주 세포는 MHC 분자의 맥락에서 MAGEC2 펩티드와 복합체를 형성하고, 복합체는 형광 활성화된 세포 분류(FACS), 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사면역 검정(RIA), 면역화학, 웨스턴 블롯 또는 세포내 유동 검정의 형태로 검출되는, 방법.
  122. 제120항 또는 제121항에 있어서, 대상체로부터 샘플을 수득하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  123. 대상체에서 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애의 수준을 검출하는 방법으로서,
    a) 대상체로부터 수득된 샘플을 제56항 내지 제77항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 결합 단백질, 제89항 내지 제114항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 숙주 세포 또는 제115항에 따른 숙주 세포의 집단과 접촉시키는 단계; 및
    b) 반응성의 수준을 검출하는 단계를 포함하며,
    대조군 수준과 비교하여 반응성의 존재 또는 더 높은 수준은 대상체에서 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애의 수준을 나타내는, 방법.
  124. 제123항에 있어서, 대조군 수준이 참조 넘버(reference number)인, 방법.
  125. 제123항 또는 제124항에 있어서, 대조군 수준이 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애가 없는 대상체로부터의 수준인, 방법.
  126. 대상체에서 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애의 진행을 모니터링하는 방법으로서, 방법은:
    a) 대상체 샘플에서, 대상체로부터 얻은 샘플과 제56항 내지 제77항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 결합 단백질, 제89항 내지 제114항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 숙주 세포, 또는 제115항에 따른 숙주 세포의 집단 사이의 반응성의 존재 또는 수준을 검출하는 단계;
    b) 후속 시점에서 단계 a)를 반복하는 단계; 및
    c) 대상체에서 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애의 진행을 모니터링하기 위해 단계 a) 및 b)에서 검출된 MAGEC2 또는 MAGEC2를 발현하는 관심 세포의 수준을 비교하는 단계로서, 여기서 단계 a)와 비교하여 단계 b)에서 검출된 부재하거나 감소된 MAGEC2 수준 또는 MAGEC2를 발현하는 관심 세포는 대상체에서 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애의 억제된 진행을 나타내고, 단계 a)와 비교하여 단계 b)에서 검출된 존재하거나 증가된 MAGEC2 수준 또는 MAGEC2를 발현하는 관심 세포는 대상체에서 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애의 진행을 나타내는 단계를 포함하는, 방법.
  127. 제126항에 있어서, 제1 시점과 후속 시점 사이에, 대상체가 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 치료하기 위한 치료를 받은, 방법.
  128. 다음을 포함하는 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 앓고 있는 대상체의 임상 결과를 예측하는 방법:
    a) 대상체로부터 얻은 샘플과 제56항 내지 제77항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 결합 단백질, 제89항 내지 제114항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 숙주 세포, 또는 제115항에 따른 숙주 세포의 집단 사이의 반응성의 존재 또는 수준을 결정하는 단계; 및
    b) 반응성의 존재 또는 수준을 대조군으로부터의 것과 비교하는 단계로서, 여기서 대조군은 양호한 임상 결과를 갖는 대상체로부터 얻어지며;
    여기서 대조군과 비교하여 대상체 샘플에서의 반응성의 부재 또는 감소된 수준은 대상체가 양호한 임상 결과를 갖는다는 것을 나타내는, 단계.
  129. MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애에 대한 요법의 효능을 평가하는 방법으로서,
    a) MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애에 대한 요법의 적어도 일부를 대상체에게 제공하기 전에 대상체로부터 수득된 제1 샘플에서, 대상체로부터 수득된 샘플과 제56항 내지 제77항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 결합 단백질, 제89항 내지 제114항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 숙주 세포 또는 제115항에 따른 숙주 세포 집단 사이의 반응성의 존재 또는 수준을 결정하는 단계, 및
    b) MAGEC2 발현을 특징으로 장애에 대한 요법을 제공한 후 대상체로부터 수득된 제2 샘플에서, 대상체로부터 수득된 샘플과 제56항 내지 제77항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 결합 단백질, 제89항 내지 제114항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 숙주 세포 또는 제115항에 따른 숙주 세포 집단 사이의 반응성의 존재 또는 수준을 결정하는 단계를 포함하며,
    제1 샘플에 비해 제2 샘플에서의 반응성의 부재 또는 감소된 수준은 요법이 대상체에서 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 치료하는데 효과적임을 나타내고, 여기서 제1 샘플에 비해 제2 샘플에서의 반응성의 존재 또는 증가된 수준은 요법이 대상체에서 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 치료하는데 효과적이지 않다는 것을 나타내는, 방법.
  130. 제120항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 반응성 수준이 a) 결합의 존재 및/또는 b) T 세포 활성화 및/또는 이펙터 기능에 의해 표시되며, 선택적으로 T 세포 활성화 또는 이펙터 기능이 T 세포 증식, 사멸 또는 사이토카인 방출인, 방법.
  131. 제120항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 결합, 활성화 및/또는 이펙터 기능이 형광 활성화된 세포 분류(FACS), 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사면역 검정(RIA), 면역화학, 웨스턴 블롯 또는 세포내 유동 검정을 사용하여 검출되는, 방법.
  132. MAGEC2를 발현하는 표적 세포를 제56항 내지 제77항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 결합 단백질을 발현하는 세포를 포함하는 치료적으로 유효한 양의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하고, 선택적으로 조성물이 대상체에게 투여되는, MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애를 예방 및/또는 치료하는 방법.
  133. 제49항 내지 제55항 및 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 동종이계 세포, 동계 세포 또는 자가 세포인, 방법.
  134. 제49항 내지 제55항, 제132항 및 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 제89항 내지 제114항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포 또는 제115항에 따른 숙주 세포의 집단인, 방법.
  135. 제49항 내지 제55항 및 제132항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포가 MAGEC2를 발현하는 암세포인, 방법.
  136. 제49항 내지 제55항 및 제132항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는, 방법.
  137. 제49항 내지 제55항 및 제132항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 대상체에서 MAGEC2를 발현하는 표적 세포에 대한 면역 반응을 유도하는, 방법.
  138. 제49항 내지 제55항 및 제132항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 대상체에서 MAGEC2를 발현하는 표적 세포에 대해 항원-특이적 T 세포 면역 반응을 유도하는, 방법.
  139. 제49항 내지 제55항 및 제132항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-특이적 T 세포 면역 반응이 CD4+ 헬퍼 T 림프구(Th) 반응 및 CD8+ 세포독성 T 림프구(CTL) 반응 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
  140. 제49항 내지 제55항 및 제132항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애에 대한 적어도 하나의 추가 치료를 투여하는 것을 더 포함하며, 선택적으로 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애에 대한 적어도 하나의 추가 치료는 조성물로 동시에 또는 순차적으로 투여되는, 방법.
  141. 제132항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애가 암 또는 이의 재발이고, 선택적으로 암은 흑색종, 두경부암, 폐암, 자궁경부암, 전립선암, 다발성 골수종, 간세포 암종, 유방 침윤성 암종 및 방광 요로 상피 암종으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  142. 제132항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 MAGEC2 발현을 특징으로 하는 장애의 동물 모델 및/또는 포유동물이고, 선택적으로 포유동물은 인간, 영장류 또는 설치류인, 방법.

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