CN118510797A - 识别hpv16 e7抗原的结合蛋白和其用途 - Google Patents

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CN118510797A CN202280087773.0A CN202280087773A CN118510797A CN 118510797 A CN118510797 A CN 118510797A CN 202280087773 A CN202280087773 A CN 202280087773A CN 118510797 A CN118510797 A CN 118510797A
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R·纳亚尔
S·詹加维
D·波拉克史密斯
A·J·布多
G·麦克比斯
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Abstract

本文提供了识别HPV16E7抗原的结合蛋白和其用途。

Description

识别HPV16 E7抗原的结合蛋白和其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2022年5月16日提出的美国临时申请No.63/342,479、2022年3月7日提出的美国临时申请No.63/317,326和2021年11月10日申请的美国临时申请No.63/277,901的权益；所述申请的完整内容以引用的方式整体并入本文中。
发明背景
人乳头瘤病毒(HPV)是一种在许多实体瘤中发现的致癌病毒(例如，美国每年诊断出20,000-30,000例HPV相关癌症)，引起多种恶性病，包括超过25％的头颈癌、超过70％的口咽癌、超过90％的宫颈癌和肛门癌以及超过60％的阴道癌、阴门癌和阴茎癌。出于多种原因，HPV抗原，例如HPV E6和EPV E7蛋白，是引人关注的靶标，原因包括：1)HPV蛋白驱动肿瘤发生并且对癌细胞存活来说是不可或缺的；2)HPV蛋白在每个肿瘤细胞中表达，从而引起均质的靶标表达；以及3)重要的健康组织不表达HPV蛋白，从而避免了靶向HPV时对健康组织的毒性。来自靶向HPV抗原的TCR-T细胞疗法的初始临床资料显示1期试验(试验NCT02858310)中治疗的50％患者(12名患者中的6名)中的肿瘤收缩和客观反应率。25％(12名患者中的3名)的患者显示一个或多个肿瘤完全消退。需要开发HPV特异性TCR免疫疗法，以便治疗以HPV抗原表达为特征的病症。
发明内容
本发明至少部分基于识别HPV16 E711-19抗原的结合蛋白，包括T细胞受体(TCR)的发现。
在一个方面，提供了一种结合蛋白，所述结合蛋白包含：a)与选自由表1中所列的TCRα链CDR序列组成的组的TCRα链CDR序列具有至少约80％同一性的T细胞受体(TCR)α链CDR序列；和/或b)与选自由表1中所列的TCRβ链CDR序列组成的组的TCRβ链CDR序列具有至少约80％同一性的TCRβ链CDR序列，其中所述结合蛋白能够与HPV16 E711-19免疫原性肽-MHC(pMHC)复合物结合，任选地其中结合亲和力的Kd小于或等于约5×10-4M。
在另一方面，提供了一种结合蛋白，所述结合蛋白包含：a)与选自由表1中所列的TCR Vα结构域序列组成的组的TCR Vα结构域序列具有至少约80％同一性的TCRα链可变(Vα)结构域序列；和/或b)与选自由表1中所列的TCR Vβ结构域序列组成的组的TCR Vβ结构域序列具有至少约80％同一性的TCRβ链可变(Vβ)结构域序列，其中所述结合蛋白能够与HPV16E711-19免疫原性肽-MHC(pMHC)复合物结合，任选地其中结合亲和力的Kd小于或等于约5×10-4M。
在另一方面，提供了一种结合蛋白，所述结合蛋白包含：a)与选自由表1中所列的TCRα链序列组成的组的TCRα链序列具有至少约80％同一性的TCRα链序列；和/或b)与选自由表1中所列的TCRβ链序列组成的组的TCRβ链序列具有至少约80％同一性的TCRβ链序列，其中所述结合蛋白能够与HPV16 E711-19免疫原性肽-MHC(pMHC)复合物结合，任选地其中结合亲和力的Kd小于或等于约5×10-4M。
在又一方面，提供了一种结合蛋白，所述结合蛋白包含：a)选自由表1中所列的TCRα链CDR序列组成的组的TCRα链CDR序列；和/或b)选自由表1中所列的TCRβ链CDR序列组成的组的TCRβ链CDR序列，其中所述结合蛋白能够与HPV16 E711-19免疫原性肽-MHC(pMHC)复合物结合，任选地其中结合亲和力的Kd小于或等于约5×10-4M。
在另一方面，提供了一种结合蛋白，所述结合蛋白包含：a)选自由表1中所列的TCRVα结构域序列组成的组的TCRα链可变(Vα)结构域序列；和/或b)选自由表1中所列的TCRVβ结构域序列组成的组的TCRβ链可变(Vβ)结构域序列，其中所述结合蛋白能够与HPV16E711-19免疫原性肽-MHC(pMHC)复合物结合，任选地其中结合亲和力的Kd小于或等于约5×10-4M。
在另一方面，提供了一种结合蛋白，所述结合蛋白包含：a)选自由表1中所列的TCRα链序列组成的组的TCRα链序列；和/或b)选自由表1中所列的TCRβ链序列组成的组的TCRβ链序列，其中所述结合蛋白能够与HPV16 E711-19免疫原性肽-MHC(pMHC)复合物结合，任选地其中结合亲和力的Kd小于或等于约5×10-4M。
还提供了多个实施方案，其可应用于本发明涵盖的任何方面和/或与本文所述的任何其它实施方案组合。举例来说，在一个实施方案中，1)TCRα链CDR、TCR Vα结构域和/或TCRα链由选自表1中所列的TRAV、TRAJ和TRAC基因的组的TRAV、TRAJ和/或TRAC基因或它们的片段编码，和/或2)TCRβ链CDR、TCR Vβ结构域和/或TCRβ链由选自表1中所列的TRBV、TRBJ和TRBC基因的组的TRBV、TRBJ和/或TRBC基因或它们的片段编码，和/或3)与表1中所列的同源参考CDR序列相比，所述结合蛋白的每个CDR具有至多五个氨基酸取代、插入、缺失或它们的组合。在另一实施方案中，HPV16 E711-19免疫原性肽包含氨基酸序列YMLDLQPET。在另一实施方案中，结合蛋白为嵌合、人源化或人类的。在又一实施方案中，结合蛋白为TCR、TCR的抗原结合片段、单链TCR(scTCR)、嵌合抗原受体(CAR)或包含TCR和效应结构域的融合蛋白，任选地其中结合结构域包含跨膜结构域和细胞内效应结构域。在另一实施方案中，TCRα链和TCRβ链共价连接，任选地其中TCRα链和TCRβ链透过连接肽共价连接。在另一实施方案中，TCRα链和/或TCRβ链共价连接到部分，任选地其中共价连接的部分包含亲和力标签或标记。在又一实施方案中，亲和力标签选自由以下组成的组：CD34富集标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、钙调蛋白结合蛋白(CBP)、蛋白C标签、Myc标签、HaloTag、HA标签、Flag标签、His标签、生物素标签和V5标签，和/或其中标记为荧光蛋白。在另一实施方案中，共价连接的部分选自由以下组成的组：致炎因子、细胞因子、毒素、细胞毒性分子、放射性同位素或抗体或其抗原结合片段。在另一实施方案中，结合蛋白与细胞表面上的pMHC复合物结合。在又一实施方案中，MHC为MHC多聚体，任选地其中所述MHC多聚体为四聚体。在另一实施方案中，MHC为MHC I类分子。在另一实施方案中，MHC包含MHCα链，所述链为HLA血清型HLA-A*02。在又一实施方案中，HLA等位基因选自由以下组成的组：HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0205、HLA-A*0206和HLA-A*0207等位基因。在另一实施方案中，本文所述的结合蛋白与HPV16 E711-19肽-MHC(pMHC)复合物的结合引发免疫反应，任选地其中所述免疫反应是T细胞反应。在另一实施方案中，T细胞反应选自由T细胞扩增(例如增殖)、细胞因子释放和/或细胞毒性杀伤组成的组。在又一实施方案中，结合蛋白能够以小于或等于约1×10-4M、小于或等于约5×10-5M、小于或等于约1×10-5M、小于或等于约5×10-6M、小于或等于约1×10-6M、小于或等于约5×10-7M、小于或等于约1×10-7M、小于或等于约5×10-8M、小于或等于约1×10- 8M、小于或等于约5×10-9M、小于或等于约1×10-9M、小于或等于约5×10-10M、小于或等于约1×10-10M、小于或等于约5×10-11M、小于或等于约1×10-11M、小于或等于约5×10-12M或小于或等于约1×10-12M的Kd与HPV16 E711-19免疫原性肽-MHC(pMHC)复合物特异性和/或选择性地结合。在又一实施方案中，与已知的T细胞受体相比，结合蛋白对肽-MHC(pMHC)具有更高结合亲和力。在另一实施方案中，与已知的T细胞受体相比，结合蛋白对肽-MHC(pMHC)的结合亲和力至少高出1.05倍。在另一实施方案中，与已知的T细胞受体相比，结合蛋白诱导更高的T细胞扩增、细胞因子释放和/或细胞毒性杀伤。在又一实施方案中，与已知的T细胞受体相比，结合蛋白诱导的T细胞扩增、细胞因子释放和/或细胞毒性杀伤至少增加1.05倍。如本文所用，在一些实施方案中，对倍数变化的提及可与任何所关注的参考模式进行比较，例如与不同结合蛋白进行比较；与不同背景下相同结合蛋白进行比较，如与本文所述的其它剂组合，相同结合蛋白在不同免疫细胞中以不同水平表达；等等。在另一实施方案中，靶细胞为CaSki、SCC152或SCC090细胞系。在另一实施方案中，靶细胞为癌细胞，任选地其中所述癌细胞为头颈癌细胞、口咽癌细胞、宫颈癌细胞、肛门癌细胞、阴道癌细胞、阴门癌细胞或阴茎癌细胞。在另一实施方案中，本文所述的结合蛋白不与肽-MHC(pMHC)复合物结合，其中所述肽包含氨基酸序列YMLDLQPET。在又一实施方案中，本文所述的结合蛋白不与肽-MHC(pMHC)复合物结合，任选地其中所述肽来源于SPTA1、MPL、HERC1、CPAMD8、INTS4、NUTM1或XM_00172256。这些基因是众所周知的并且本领域中公认根据以下NCBI基因ID编号进行注释，每个编号可在万维网ncbi.nlm.nih.gov/gene获得：SPTA1：基因ID 6708；MPL：基因ID4352；HERC1：基因ID 8925；CPAMD8：基因ID 27151；INTS4：基因ID 92105；以及NUTM1：基因ID 256646。XM_00172256：映射到染色体20的异染色质着丝粒区并且已经从RefSeq注释中去除，表明缺乏其表达的证据。
在又一方面，提供了TCRα链和/或β链，所述TCRα链和/或β链选自由表1中所列的TCRα链和β链序列组成的组。
在另一方面，提供了一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子在严格条件下与编码选自由表1中所列的多肽序列组成的组的多肽的核酸的补体，或与编码选自由表1中所列的多肽序列组成的组的多肽的核酸具有至少约80％同源性的序列杂交，任选地其中所述分离的核酸分子包含1)选自表1中所列的TRAV、TRAJ和TRAC基因的组的TRAV、TRAJ和/或TRAC基因或它们的片段和/或2)选自表1中所列的TRBV、TRBJ和TRBC基因的组的TRBV、TRBJ和/或TRBC基因或它们的片段。
还提供了多个实施方案，其可应用于本发明涵盖的任何方面和/或与本文所述的任何其它实施方案组合。举例来说，在一个实施方案中，核酸进行密码子优化以在宿主细胞中表达。
在另一方面，提供了一种载体，所述载体包含本文所述的分离的核酸。
还提供了多个实施方案，其可应用于本发明涵盖的任何方面和/或与本文所述的任何其它实施方案组合。举例来说，在一个实施方案中，载体为克隆载体、表达载体或病毒载体。在另一实施方案中，载体还包含编码CD8α、CD8β、显性负性TGFβ受体II(DN-TGFβRII)、选择性蛋白标志物的核酸序列，任选地其中所述选择性蛋白标志物为二氢叶酸还原酶(DHFR)。在另一实施方案中，编码CD8α、CD8β、DN-TGFβRII和/或选择性蛋白标志物的核酸序列可操作地连接到编码标签的核酸。在又一实施方案中，编码标签的核酸处于编码CD8α、CD8β、DN-TGFβRII和/或选择性蛋白标志物的核酸序列上游的5’，使得所述标签与CD8α、CD8β、DN-TGFβRII和/或选择性蛋白标志物的N端融合。在另一实施方案中，标签为CD34富集标签。在另一实施方案中，单独(例如编码TCRα和/或TCRβ)或与编码CD8α、CD8β、DN-TGFβRII和/或选择性蛋白标志物的核酸序列组合的本文所述的分离的核酸与内部核糖体进入位点或编码自裂解肽的核酸序列相互连接。在又一实施方案中，自裂解肽为P2A、E2A、F2A或T2A。
在又一方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本文所述的分离的核酸，包含本文所述的载体，和/或表达本文所述的结合蛋白，任选地其中所述细胞进行基因工程化。
还提供了多个实施方案，其可应用于本发明涵盖的任何方面和/或与本文所述的任何其它实施方案组合。举例来说，在一个实施方案中，宿主细胞包含TCR基因、HLA基因或两者的染色体基因敲除。在另一实施方案中，宿主细胞包含选自以下的HLA基因的敲除：α1巨球蛋白基因、α2巨球蛋白基因、α3巨球蛋白基因、β1微球蛋白基因、β2微球蛋白基因和它们的组合。在另一实施方案中，宿主细胞包含选自TCRα可变区基因、TCRβ可变区基因、TCR恒定区基因和它们的组合的TCR基因的敲除。在又一实施方案中，宿主细胞表达CD8α、CD8β、DN-TGFβRII和/或选择性蛋白标志物，任选地其中所述选择性蛋白标志物为DHFR。在另一实施方案中，CD8α、CD8β、DN-TGFβRII和/或选择性蛋白标志物与CD34富集标签融合。在另一实施方案中，宿主细胞使用CD34富集标签进行富集。在又一实施方案中，宿主细胞为免疫细胞。在另一实施方案中，免疫细胞为细胞毒性淋巴细胞、细胞毒性淋巴细胞前体细胞、细胞毒性淋巴细胞祖细胞、细胞毒性淋巴细胞干细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD4/CD8双阴性T细胞、γδ(gamma delta)T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK-T细胞、树突状细胞或它们的组合。在另一实施方案中，T细胞为初始T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞或它们的组合。在另一实施方案中，T细胞为原代T细胞或T细胞系的细胞。在又一实施方案中，T细胞不表达内源性TCR或具有内源性TCR的较低表面表达。在另一实施方案中，宿主细胞在与靶细胞接触时能够产生细胞因子或细胞毒性分子，所述靶细胞包括包含在MHC分子背景中的HPV16E711-19肽表位的肽-MHC(pMHC)复合物。在另一实施方案中，宿主细胞在体外、离体或体内与靶细胞接触。在又一实施方案中，细胞因子为TNF-α、IL-2和/或IFN-γ。在另一实施方案中，细胞毒性分子为穿孔素和/或颗粒酶，任选地其中细胞毒性分子为颗粒酶B。在另一实施方案中，宿主细胞在与表达HPV16 E711-19肽表位的靶细胞接触时能够产生更高水平的细胞因子或细胞毒性分子。在又一实施方案中，宿主细胞能够产生至少高出1.05倍水平的细胞因子或细胞毒性分子。在另一实施方案中，宿主细胞能够杀伤包括包含在MHC分子背景中的HPV16E711-19肽表位的肽-MHC(pMHC)复合物的靶细胞。在另一实施方案中，杀伤通过杀伤测定来测定。在又一实施方案中，杀伤测定中宿主细胞与靶细胞的比率为20:1至0.625:1。在另一实施方案中，靶细胞为用1μg/mL至50pg/mL HPV16 E711-19肽进行脉冲输送的T2细胞。在另一实施方案中，宿主细胞在与表达HPV16 E711-19肽表位的靶细胞接触时能够杀伤更高数目的靶细胞。在又一实施方案中，宿主细胞能够杀伤至少高出1.05倍的数目的靶细胞。在另一实施方案中，靶细胞为CaSki、SCC152或SCC090细胞系。在另一实施方案中，HPV16 E711-19免疫原性肽包含氨基酸序列YMLDLQPET。在又一实施方案中，MHC分子为MHC I类分子。在另一实施方案中，MHC分子包含MHCα链，所述链为HLA血清型HLA-A*02。在另一实施方案中，HLA等位基因选自由以下组成的组：HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:03、HLA-A*02:05、HLA-A*02:06和HLA-A*02:07等位基因。在又一实施方案中，靶细胞为选自由CaSki、SCC152和SCC090细胞系组成的组的细胞系，为表达HPV16 E711-19免疫原性肽的癌细胞，或不为siHa细胞系和/或不为NCI-H1792细胞系。在另一实施方案中，癌细胞选自由以下组成的组：头颈癌细胞、口咽癌细胞、宫颈癌细胞、肛门癌细胞、阴道癌细胞、阴门癌细胞和阴茎癌细胞。在另一实施方案中，a)宿主细胞在与包括包含在MHC分子背景中的SPTA1、MPL、HERC1、CPAMD8、INTS4、NUTM1和/或XM_00172256肽表位的肽-MHC(pMHC)复合物的靶细胞接触时不诱导T细胞扩增、细胞因子释放或细胞毒性杀伤，和/或b)宿主细胞不表达HPV16 E711-19抗原，未被本文所述的结合蛋白识别，不属于血清型HLA-A*02，和/或不表达HLA-A*02等位基因，例如HLA-A*02:01和/或HLA-A*02:06。
在另一方面，提供了本文所述的宿主细胞的群体。
在另一方面，提供了一种组合物，所述组合物包含a)本文所述的结合蛋白、b)本文所述的分离的核酸、c)本文所述的载体、d)本文所述的宿主细胞和/或e)本文所述的宿主细胞的群体，和载剂。
在又一方面，提供了一种装置或试剂盒，所述装置或试剂盒包含a)本文所述的结合蛋白、b)本文所述的分离的核酸、c)本文所述的载体、d)本文所述的宿主细胞，和/或e)本文所述的宿主细胞的群体，所述装置或试剂盒任选地包含检测a)、d)和/或e)与pMHC复合物的结合的试剂。
在另一方面，提供了一种产生本文所述的结合蛋白的方法，其中所述方法包括以下步骤：(i)在适合允许所述结合蛋白表达的条件下培养转化宿主细胞，所述宿主细胞已经通过包含编码本文所述的结合蛋白的序列的核酸转化；以及(ii)回收所表达的结合蛋白。
在另一方面，提供了一种产生表达本文所述的结合蛋白的宿主细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤：(i)将包含编码本文所述的结合蛋白的序列的核酸引入宿主细胞中；(ii)在适合允许所述结合蛋白表达的条件下培养转化宿主细胞。
在又一方面，提供了一种检测HPV16 E711-19抗原和/或表达HPV16 E711-19的细胞的存在或不存在的方法，任选地其中所述细胞为过度增殖细胞，所述方法包括通过使用至少一种本文所述的结合蛋白或至少一种本文所述的宿主细胞来检测样品中所述HPV16 E711-19抗原的存在或不存在，其中检测到HPV16 E711-19抗原表明存在HPV16E711-19抗原和/或表达HPV16 E711-19的细胞。
还提供了多个实施方案，其可应用于本发明涵盖的任何方面和/或与本文所述的任何其它实施方案组合。举例来说，在一个实施方案中，至少一种结合蛋白或至少一种宿主细胞与在MHC分子背景中的HPV16 E711-19肽形成复合物，并且以荧光激活细胞分选(FACS)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫化学、蛋白质印迹法或细胞内流式测定的形式检测复合物。在另一实施方案中，方法还包括从受试者获得样品。在另一实施方案中，方法还包括通过骨髓活检来确认表达HPV16 E711-19的细胞。
在另一方面，提供了一种检测受试者中以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的程度的方法，所述方法包括：a)使从受试者获得的样品与至少一种本文所述的结合蛋白、至少一种本文所述的宿主细胞或本文所述的宿主细胞的群体接触；以及b)检测反应性水平，其中与对照水平相比反应性水平更高指示所述受试者中以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的程度。
还提供了多个实施方案，其可应用于本发明涵盖的任何方面和/或与本文所述的任何其它实施方案组合。举例来说，在一个实施方案中，对照水平为参考数字。在另一实施方案中，对照水平为来自未患以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的受试者的水平。
在另一方面，一种用于监测受试者中以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的进展的方法，所述方法包括：a)如本文所述，在第一时间点检测受试者样品中HPV16 E711-19抗原水平或表达HPV16 E711-19的所关注细胞；b)在后续时间点重复步骤a)；以及c)比较在步骤a)和b)中检测到的HPV16 E711-19抗原水平或表达HPV16 E711-19的所关注细胞以监测受试者中以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的进展，其中与步骤a)相比，步骤b)中检测到的HPV16 E711-19或表达HPV16 E711-19的所关注细胞的不存在或水平降低表明所述受试者中以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的进展受到抑制。
还提供了多个实施方案，其可应用于本发明涵盖的任何方面和/或与本文所述的任何其它实施方案组合。举例来说，在一个实施方案中，在第一时间点与后续时间点之间，受试者已进行治疗以治疗以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发。
在又一方面，提供了一种评估疗法对以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的功效的方法，所述方法包括：a)在针对以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发向受试者提供疗法的至少一部分之前从受试者获得的第一样品中，测定从受试者获得的样品与至少一种本文所述的结合蛋白、至少一种本文所述的宿主细胞或本文所述的宿主细胞的群体之间的反应性的存在或水平，和b)在针对以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发提供疗法的部分后从受试者获得的第二样品中，测定从受试者获得的样品与至少一种本文所述的结合蛋白、至少一种本文所述的宿主细胞或本文所述的宿主细胞的群体之间的反应性的存在或水平，其中相对于第一样品，第二样品中不存在反应性或反应性水平降低表明所述疗法有效治疗所述受试者的以HPV16E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发。
还提供了多个实施方案，其可应用于本发明涵盖的任何方面和/或与本文所述的任何其它实施方案组合。举例来说，在一个实施方案中，反应性水平由a)结合的存在和/或b)T细胞激活和/或效应功能指示。在另一实施方案中，T细胞激活或效应功能为T细胞增殖、杀伤或细胞因子释放。在另一实施方案中，T细胞结合、激活和/或效应功能使用荧光激活细胞分选(FACS)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫化学、蛋白质印迹法或细胞内流式测定来检测。
在另一方面，一种预防和/或治疗受试者中以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含表达至少一种本文所述的结合蛋白的细胞的组合物。
还提供了多个实施方案，其可应用于本发明涵盖的任何方面和/或与本文所述的任何其它实施方案组合。举例来说，在一个实施方案中，细胞为同种异体细胞、同基因型细胞或自体细胞。在另一实施方案中，细胞进行基因修饰。在另一实施方案中，细胞包含TCR基因、HLA基因或TCR基因与HLA基因的染色体基因敲除。在又一实施方案中，细胞包含选自以下的HLA基因的敲除：α1巨球蛋白基因、α2巨球蛋白基因、α3巨球蛋白基因、β1微球蛋白基因、β2微球蛋白基因和它们的组合。在另一实施方案中，细胞包含选自以下的TCR基因的敲除：TCRα可变区基因、TCRβ可变区基因、TCR恒定区基因和它们的组合。在另一实施方案中，细胞表达CD8α、CD8β、DN-TGFβRII和/或选择性蛋白标志物，任选地其中所述选择性蛋白标志物为DHFR，并且进一步任选地其中CD8α、CD8β、DN-TGFβRII和/或选择性蛋白标志物与CD34富集标签融合。在又一实施方案中，细胞使用CD34富集标签进行富集。在另一实施方案中，为免疫细胞。在另一实施方案中，免疫细胞为细胞毒性淋巴细胞、细胞毒性淋巴细胞前体细胞、细胞毒性淋巴细胞祖细胞、细胞毒性淋巴细胞干细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD4/CD8双阴性T细胞、γδ(gamma delta)T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK-T细胞、树突状细胞或它们的组合。在另一实施方案中，T细胞为初始T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞或它们的组合。在另一实施方案中，T细胞为原代T细胞或T细胞系的细胞。在另一实施方案中，T细胞不表达内源性TCR或具有内源性TCR的较低表面表达。在又一实施方案中，细胞在与靶细胞接触时能够产生细胞因子或细胞毒性分子，所述靶细胞包括包含在MHC分子背景中的HPV16 E711-19肽表位的肽-MHC(pMHC)复合物。在另一实施方案中，细胞因子为TNF-α、IL-2和/或IFN-γ。在另一实施方案中，细胞毒性分子为穿孔素和/或颗粒酶，任选地其中所述细胞毒性分子为颗粒酶B。在另一实施方案中，细胞在与表达HPV16E711-19肽表位的靶细胞接触时能够产生更高水平的细胞因子或细胞毒性分子。在另一实施方案中，细胞能够产生至少高出1.05倍水平的细胞因子或细胞毒性分子。在另一实施方案中，宿主细胞能够杀伤包括包含在MHC分子背景中的HPV16 E711-19肽表位的肽-MHC(pMHC)复合物的靶细胞。在又一实施方案中，宿主细胞在与表达HPV16 E711-19肽表位的靶细胞接触时能够杀伤更高数目的靶细胞。在另一实施方案中，宿主细胞能够杀伤高出至少1.05倍数目的靶细胞。在另一实施方案中，HPV16 E711-19免疫原性肽包含氨基酸序列YMLDLQPET。在又一实施方案中，MHC分子为MHCI类分子。在另一实施方案中，MHC分子包含MHCα链，所述链为HLA血清型HLA-A*02。在另一实施方案中，HLA等位基因选自由以下组成的组：HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:03、HLA-A*02:05、HLA-A*02:06和HLA-A*02:07等位基因。在又一实施方案中，靶细胞为受试者中表达HPV16 E711-19抗原的非恶性细胞或过度增殖细胞。在另一实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载剂。在另一实施方案中，组合物在受试者中诱导针对表达HPV16 E711-19抗原的非恶性细胞或过度增殖细胞的免疫反应。在又一实施方案中，组合物在受试者中诱导针对表达HPV16 E711-19抗原的非恶性细胞或过度增殖细胞的抗原特异性T细胞免疫反应。在另一实施方案中，抗原特异性T细胞免疫反应包含CD4+辅助T淋巴细胞(Th)反应和CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应中的至少一者。在另一实施方案中，病症与HPV感染相关。例如HPV16感染。在另一实施方案中，癌症为头颈癌(例如头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、口咽癌、宫颈癌、肛门癌、阴道癌、阴门癌和/或阴茎癌。在又一实施方案中，受试者正接受或先前接受过造血细胞移植(HCT)，任选地其中所述HCT包含不表达HPV16E711-19抗原，未被本文所述的结合蛋白识别，不属于血清型HLA-A*02，和/或不表达HLA-A*02:01等位基因的细胞。在另一实施方案中，HCT包括包含编码HLA组分的基因的染色体敲除、编码TCR组分的基因的染色体敲除或两者的供体造血细胞。在另一实施方案中，受试者先前曾接受过清除淋巴细胞化学疗法。在另一实施方案中，清除淋巴细胞化学疗法包含环磷酰胺(cyclophosphamide)、氟达拉滨(fludarabine)、抗胸腺细胞球蛋白或它们的组合。在另一实施方案中，方法还包括向受试者施用至少一种针对非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的额外治疗。在又一实施方案中，至少一种针对非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的额外治疗与组合物同时或依次施用。在另一实施方案中，受试者为以HPV16 E711-19表达为特征的病症的动物模型和/或受试者为哺乳动物，任选地其中所述哺乳动物为人、灵长类动物或啮齿类动物。
在另一方面，提供了一种表达载体，其包含与编码CD8α、CD8β、DN-TGFβRII和/或选择性蛋白标志物的核酸序列可操作地连接的启动子，任选地其中所述选择性蛋白标志物为DHFR。
还提供了多个实施方案，其可应用于本发明涵盖的任何方面和/或与本文所述的任何其它实施方案组合。举例来说，在一个实施方案中，编码CD8α、CD8β、DN-TGFβRII和/或选择性蛋白标志物的核酸序列可操作地连接到编码标签的核酸，以使得标签与CD8α、CD8β、DN-TGFβRII和/或选择性蛋白标志物融合。在另一实施方案中，编码标签的核酸处于编码CD8α、CD8β、DN-TGFβRII和/或选择性蛋白标志物的核酸序列上游的5’，使得标签与CD8α、CD8β、DN-TGFβRII和/或选择性蛋白标志物的N端融合。在另一实施方案中，标签为CD34富集标签。在又一实施方案中，载体还包含编码TCRα和/或TCRβ的核酸序列。在另一实施方案中，TCRα、TCRβ和/或DN-TGFβRII包含突变跨膜结构域和/或突变恒定结构域。在另一实施方案中，突变跨膜结构域和/或突变恒定结构域增强TCRα、TCRβ和/或DN-TGFβRII的细胞表面表达，同时减少内源性TCRα、TCRβ和/或TGFβRII的表达。在又一实施方案中，编码CD8α、CD8β、DN-TGFβRII、选择性蛋白标志物、TCRα和/或TCRβ的核酸序列与内部核糖体进入位点或编码自裂解肽的核酸序列相互连接。在另一实施方案中，自裂解肽为P2A、E2A、F2A或T2A。在另一实施方案中，载体还包含编码选自由表1中所列的多肽序列组成的组的多肽的核酸序列，或与编码选自由表1中所列的所述多肽序列组成的组的多肽的核酸具有至少约80％同源性的序列，任选地其中所述分离的核酸分子包含1)选自表1中所列的TRAV、TRAJ和TRAC基因的组的TRAV、TRAJ和/或TRAC基因或它们的片段和/或2)选自表1中所列的TRBV、TRBJ和TRBC基因的组的TRBV、TRBJ和/或TRBC基因或它们的片段。在另一实施方案中，载体具有或包含表3中所示的核酸序列或其片段，任选地其中所述片段编码DN-TGFβRII。
附图说明
除非下文另外描述，否则TCR的MGTM修饰型式(例如E7-11-28MGTM)用于产生图中所示且工作实施例中例示的数据。
图1展示了HPV16 E711-19肽序列。
图2展示了对识别HPV16 E711-19的多种TCR的选择。使用专有ReceptorScan平台鉴定四百五十九(459)种HPV16 E711-19(YMLDLQPET)特异性TCR。简单地说，在第-4天从HLA-A*02:01健康供体的PBMC分离CD14+单核细胞并分化成成熟DC。第-1天，从自体PBMC分离初始CD8 T细胞并静置过夜。作为多路ReceptorScan筛选的一部分，在用1μg/mL HPV16 E711-19肽对DC进行3小时脉冲输送之后，将初始CD8 T细胞与DC共培养，接着为11天细胞扩增期。用HLA-A*02:01特异性HPV16 E711-19(YMLDLQPET)dextramer进行dextramer染色以鉴定克隆。DNA条码化dextramer用于分离HPV16 E711-19特异性细胞。通过10X genomics平台鉴定TCRαβ对。
将全T细胞转导以个别表达293种HPV特异性TCR。通过HPV16E711-19 dextramer染色评定TCR的表面表达。将工程化的T细胞与NucLight Red标记的靶细胞，例如装载1ng/mL HPV16E711-19肽的T2细胞和CaSki细胞共培养。通过时间依赖性成像作为T细胞细胞毒性的读出数据，定量靶细胞的存活。未转导的细胞(NTD)用作对照物。选择图2中列出的293种TCR中的五十九(59)种用于进一步评估表面表达和针对HPV16和HLA-A*02:01阳性和阴性细胞系的细胞毒性潜力。
图3A-图3D展示了基于表达和细胞毒性功能选择HPV16 E711-19TCR的结果。将来自HLA-A*02:01阳性健康供体的全T细胞转导以表达选自以上图2中所述的VAYG筛选的59种HPV16 E711-19 TCR。基于HPV16 E711-19(YMLDLQPET)dextramer的高表面结合，选择59种TCR中的二十四(24)种，并且在体外细胞毒性测定中进一步评估，在测定中，与‘比较TCR’进行比较。图3A展示如通过A*02:01特异性HPV16 E711-19(YMLDLQPET)dextramer染色评定，24种TCR的表面表达的点图。展示这些TCR对HLA-A*02:01+HPV16+靶细胞系CaSki(图3B)、SCC152(图3C)和SCC090(图3D)的细胞毒性反应。将工程化的T细胞与NucLight Red标记的靶细胞系以所指示的效应细胞与靶细胞(E:T)比率共培养，并且在上定量其存活率，作为T细胞细胞毒性的读出数据。
图4A-图4K展示了HPV16 E711-19 TCR的功能评估结果。将从三种HLA-A*02:01阳性健康供体PBMC分离的全T细胞转导以表达HPV16 E711-19特异性TCRE7-11-194、E7-11-176和E7-11-28和‘比较TCR’，并且评定对HPV16和HLA-A*02:01阳性和阴性的靶细胞的功能反应。图4A展示了显示如通过A*02:01特异性HPV16 E711-19(YMLDLQPET)dextramer染色评定，E711-19特异性TCR的表达的点图结果。展示了E711-19特异性TCR对HLA-A*02:01+HPV16+靶细胞系CaSki(图4B和图4C)、SCC152(图4D和图4E)、SCC090(图4F和图4G)、HLA-A*02:01-HPV16+阴性对照细胞系SiHa(图4H和图4I)和HLA-A*02:01+HPV16-细胞系NCI-H1792(图4J和图4K)的功能反应。将工程化的T细胞与NucLight Red标记的靶细胞系以所指示的E:T比率共培养，并且在上定量其存活率，作为T细胞细胞毒性的读出数据。分析在24小时(E:T 1:1)共培养上清液中IFN-γ、IL-2、TNF-α和颗粒酶B的产生并展示。使用仅T细胞条件来测定细胞因子产生的背景水平。点线表示仅T细胞条件中的细胞因子最高水平(即，T细胞的细胞因子产生或增殖的背景水平)。对于细胞毒性测定，使用单向ANOVA，接着邓尼特多重比较检验(Dunnett’s multiple comparisons test)比较平均值，其中TCR与‘比较TCR’进行比较。对于CaSki、SCC152和SCC090细胞系，仅展示不显著的差异。其余差异为显著的，P<0.05。SiHa和NCI-H1792细胞系中无一者的差异显著。
图5展示了TCRE7-11-28对110种HLA型中的108种未显示同种异体反应性。将表达TCR E7-11-28的全T细胞或未转导的对照T细胞与无MHC的HEK293T细胞共培养48小时，所述HEK293T细胞再表达110种在美国群体中最频繁遇到的MHC I类之一。筛选中包括阳性对照物，其由表达含有E711-19表位(YMLDLQPET)的HPV16-E7的片段与HLA-A*02:01两者的HEK293T细胞组成。在48小时共培养之后，测量相对于未转导的对照T细胞，表达TCR E7-11-28的全T细胞对靶细胞的抑制，作为TCR E7-11-28对同种异体MHC分子的反应性的读出数据。指示阳性对照物和同种异体反应性等位基因(靶细胞抑制>20％)。
图6A和图6B展示了对识别HPV16 E711-19的多种TCR的额外选择。将从HLA-A*02:01阳性健康供体PBMC分离的全T细胞转导以个别地表达161种HPV16 E711-19特异性TCR和‘比较TCR’。图6A展示了如通过HPV16 E711-19 dextramer染色评定的TCR表面表达和对用200pg/mlHPV16 E711-19肽和HLA-A*02:01+HPV16+靶细胞系SCC152进行脉冲输送的T2细胞的细胞毒性反应的代表性数据。图6B展示了选择161种TCR中的15种用于进一步评估表面表达和针对HPV16和HLA-A*02:01阳性和阴性细胞系的细胞毒性潜力。
图7展示了基于表达和细胞毒性功能选择HPV16 E711-19 TCR的结果。将从HLA-A*02:01阳性健康供体PBMC分离的全T细胞转导以表达HPV16 E711-19特异性TCR E7-11-28和E7-11-455和‘比较TCR’，并且评定对HPV16和HLA-A*02:01阳性和阴性的靶细胞的细胞毒性反应。展示了E711-19特异性TCR对HLA-A*02:01+HPV16+靶细胞系CaSki、SCC152、SCC090、HLA-A*02:01-HPV16+阴性对照细胞系SiHa和HLA-A*02:01+HPV16-细胞系NCI-H1792的功能反应。将工程化的T细胞与NucLightTMRed标记的靶细胞系以所指示的E:T比率共培养，并且在上定量其存活率，作为T细胞细胞毒性的读出数据。对于细胞毒性测定，使用单向ANOVA，接着邓尼特多重比较检验比较平均值，其中TCR与‘比较TCR’进行比较。*指示p<0.05。
图8提供了证实TCR-28展示相对于比较TCR可比的细胞毒性和优良效应功能的总结结果。
图9A-图9E展示了由HPV16 E711-19 TCR产生的T细胞增殖反应。将从三种HLA-A*02:01阳性健康供体PBMC分离的全T细胞转导以表达HPV16 E711-19特异性TCRE7-11-194、E7-11-176和E7-11-28和‘比较TCR’，并且评定对HPV16和HLA-A*02:01阳性和阴性的靶细胞的功能反应。为了测定表达HPV16 E711-19特异性TCR的T细胞的增殖，将工程化的T细胞用增殖染料标记并与靶细胞系(CaSki，图9A；SCC152，图9B；SCC090，图9C；SiHa，图9D；和NCI-H1792，图9E)共培养96小时(E:T 1:1)。这些细胞系具有以下性质：CaSki、SCC152和SCC090为HLA-A*02:01+HPV16+；SiHa为HLA-A*02:01-HPV16+；且NCI-H1792为HLA-A*02:01+HPV16-。使用染料稀释来评定CD8+和CD4+ T细胞的增殖。在通过流式细胞术分析前将计数珠粒添加到样品中并计数分裂CD8+和CD4+ T细胞的绝对数目。仅T细胞条件用于测定增殖的背景水平；点线表示仅T细胞条件中增殖的最高水平。使用单向ANOVA，接着邓尼特多重比较检验比较平均值，其中TCR与‘比较TCR’进行比较。对于CaSki(图9A)、SCC152(图9B)和SCC090(图9C)细胞系，仅展示不显著(ns)的差异。其余差异为显著的，P<0.05。
图10A和图10B展示了全基因组SafetyScan筛选鉴定TCR E7-11-28的推定脱靶的结果。图10A提供了代表性的非限制性全基因组SafetyScan筛选的概述。图10B展示了TCRE7-11-28的SafetyScan筛选数据，其在跨越每种野生型(w.t.)人类蛋白质的>600,000个蛋白质片段的筛选中鉴定七个潜在脱靶。所述筛选被设计成通过过表达90aa蛋白质片段来过度预测脱靶，所述蛋白质片段比全长蛋白质更有效地加工。通过基因名称鉴定推定脱靶。XM_0017722256映射到染色体20的异染色质着丝粒区并且已经从RefSeq注释中去除，表明缺乏其表达的证据。使用51个样品，包括正常组织样品、癌细胞系和肿瘤样品的RNA-seq分析未检测到该基因的表达。
图11A-图11J展示了TCR E7-11-28未显示与表达推定脱靶的癌细胞系的反应性。测试表达TCR E7-11-28的全T细胞或NTD细胞与天然表达全基因组安全性筛选中鉴定的脱靶的HLA-A*02:01+癌细胞系的反应性。图11A、11C、11E、11G和11I展示了用E711-19肽进行脉冲输送或未经脉冲并与TCR E7-11-28或NTD细胞共培养的靶细胞的结果。培养上清液中的IFNγ分泌用作TCR E7-11-28对靶细胞的反应性的读出数据。经肽脉冲输送的T2细胞用作阳性对照物。在指示的情况下，HLA-A*02:01+HPV16+SCC152细胞用作额外阳性对照物。对于表达多种脱靶的细胞系，仅共培养一次，但在多个图中展示。图11B、11D、11F、11H和11J分别展示了HERC1、INTS4、CPAMD8、MPL和SPTA1的表达，如靶细胞中相对于对照基因TBP所确定。
图12A-图12I展示了TCR E7-11-28未显示与健康人原代细胞的反应性。测试表达TCR E7-11-28的全T细胞或NTD细胞与来自健康HLA-A*02:01+人类供体的原代细胞或iPS来源细胞组的反应性，所述细胞包括天然表达全基因组安全性筛选中鉴定的推定脱靶的细胞。图12A至图12O展示了用E711-19肽进行脉冲输送或未经脉冲并且与TCR E7-11-28或NTD细胞共培养的靶细胞的结果。培养上清液中的IFNγ分泌用作TCR E7-11-28对靶细胞的反应性的读出数据。HLA-A*02:01+HPV16+SCC152细胞用作阳性对照物，并且HLA-A*02:01+HPV16-NCI-H1792细胞或未经脉冲的T2或OVCAR-3用作阴性对照物。图12P和图12Q分别展示了HERC1和INTS4的表达，如靶细胞中相对于对照基因TBP所确定。RT＝逆转录酶。
图13A-图13D展示了TCR E7-11-28有效控制体内肿瘤生长。NCG小鼠皮下注射每只小鼠1×106个Caski或1×106个SCC152细胞(每组n＝8只小鼠)。当在第10天肿瘤达到95±15mm3时，将小鼠随机化并在第11天用20×106个细胞的TCR E7-11-28、NTD或媒介物处理。图13A和图13C展示了用20×106个细胞的TCR E7-11-28处理的结果，其显示对体内肿瘤生长的强烈抑制作用。图13B和图13D展示了随着时间推移每组的个别小鼠肿瘤生长结果。*p<0.05，单向ANOVA，体内多重比较检验的霍尔姆-斯达克校正(Holms-correctionformultiple comparisons test)。图13A和13C中展示了数据线标记。
图14展示了显性负性TGFβ受体II(DN-TGFβRII)提供表达DN-TGFbRII的细胞对TGFβ信号传导的抑制作用的抗性(例如，DN-TGFβRII使TCR E7-11-28对TGFβ介导的抑制具有抗性)。T细胞分别与编码TCR E7-11-28和DN-TGFβRII的慢病毒共转导，并且经FACS分选为DN-TGFβRII阳性和DN-TGFβRII阴性部分。在与经肽脉冲输送的T2细胞+/-5ng/mLTGFβ共培养24小时之后，定量表达TCR的T细胞内的细胞内IFNγ。
图15A-图15C展示了TCR E7-11-28和DN-TGFβRII在代表性pNVVD154和pNVVD160载体中的表达和功能评估结果。使用pNVVD154和pNVVD160载体转染来自HLA-A*02:01阳性健康供体的PBMC以表达HPV16 TCRE7-11-28。来自相同供体的未经转染的(UTF)PBMC用作对照物。图15A展示了如通过A*02:01特异性HPV16 E711-19(YMLDLQPET)dextramer染色评定，TGFbRII、CD34和TCR E7-11-28的表面表达的点图。图15B展示了经TCRE7-11-28工程化的T细胞对HLA-A*02:01+HPV16+靶细胞系CaSki和SCC152以及HLA-A*02:01+HPV16-靶细胞系NCI-H1792的细胞毒性反应。图15A的顶图展示了工程化的T细胞与NucLightTMRed标记的靶细胞系CaSki和NCI-H1792(E:T比率10:1)和SCC-152(E:T比率5:1)共培养的结果，并且在上定量其存活率作为T细胞细胞毒性的读出数据。图15B的底图展示了CaSki、SCC-152和NCI-H1792细胞系在96小时的靶细胞存活率。图15C展示了测试T细胞亲合力的测定的结果。举例来说，将表达HPV16 TCR E7-11-28的T细胞与经E711-19肽(0-1,000pg/ml E7-肽)进行脉冲输送的表达NucLightTM的T2细胞以5:1的E:T比率共培养。图展示了在共培养0小时与96小时之间T2细胞生长的曲线下面积(AUC)。实验一式两份进行。进行曼-惠特尼t检验(Mann-Whitneyt-test)。
除非另外指示，否则对于显示条柱状图、曲线或与图例相关的其它数据的任何图，每个指示从左到右呈现的条柱、曲线或其它数据直接并且按顺序对应于图例中从上到下或从左到右的框。
具体实施方式
本发明至少部分基于识别HPV16 E711-19抗原(例如包含氨基酸序列YMLDLQPET的免疫原性肽)的结合蛋白，包括T细胞受体(TCR)的发现。
因此，本发明部分关于鉴定的结合蛋白(例如，TCR)；表达结合蛋白(例如，TCR)的宿主细胞；包含结合蛋白(例如，TCR)和表达结合蛋白(例如，TCR)的宿主细胞的组合物；诊断、预后和监测T细胞对表达HPV16 E711-19抗原的细胞的反应的方法；以及用于预防和/或治疗以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的方法，其通过施用表达结合蛋白(例如，TCR)的宿主细胞来进行。
I.定义
为了方便起见，这里收集本说明书、实施例和随附权利要求书中所用的某些术语。
冠词“一(a/an)”在本文中用于指该冠词的一个或超过一个(即，至少一个)语法对象。举例来说，“一要素”意指一种要素或超过一种要素。
术语“施用”意指向受试者提供药剂或组合物，并且包括但不限于由医学专业人员施用和自我施用。这涉及使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将包含治疗剂的组合物物理引入受试者。在一些实施方案中，本文所述的结合蛋白的施用途径包括静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、脊髓或其它肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用，短语“肠胃外施用”意指除肠内和局部施用以外的施用模式，通常通过注射，并且包括不限于静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下腔、脊髓内、硬膜外和胸骨内注射和输注，以及体内电穿孔。或者，本文所述的结合蛋白可经由非注射途径(non-parenteralroute)施用，例如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部。施用还可以例如进行一次、多次和/或在一个或多个延长时间段内进行。
如本文所用，术语“抗原”是指任何天然的或合成的免疫原性物质，例如蛋白质、肽或半抗原。抗原可以是HPV16 E711-19抗原或其片段，需要针对其进行保护性或治疗性免疫反应。
如本文所用，术语“佐剂”是指与单独施用抗原相比，当在施用抗原之前、同时或之后施用时促进、延长和/或增强对抗原的免疫反应的质量和/或强度的物质。佐剂可增加由疫苗接种诱导的免疫反应的量级和持续时间。
如本文所用的术语“抗体”包括全抗体和其任何抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或单链。在一个实施方案中，“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区构成。在某些天然存在的抗体中，重链恒定区由三个结构域，CH1、CH2和CH3构成。在某些天然存在的抗体中，每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区还可细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其中散布着更保守的区域，称为框架区(FR)。VH和VL每一者由三个CDR和四个FR构成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”包括专职抗原呈递细胞(例如，B淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞、朗格汉斯细胞(Langerhans cell))，以及其它抗原呈递细胞(例如，角质细胞、内皮细胞、星形细胞、成纤维细胞和少突细胞)。
如本文所用，例如TCR的结合蛋白的术语“抗原结合部分”是指TCR的一个或多个保留结合(例如，特异性和/或选择性)抗原(例如，HPV16 E711-19抗原和同源MHC/HLA)的能力的部分。这类部分的长度例如为约8至约1500个氨基酸，长度合适为约8至约745个氨基酸，长度合适为约8至约300个，例如约8至约200个氨基酸，或约10至约50个或100个氨基酸。已显示，TCR的抗原结合功能可由全长TCR的片段执行。涵盖在TCR的术语“抗原结合部分”内的结合部分的实例包括：(i)由TCR的Vα和Vβ结构域组成的Fv片段；(ii)分离的互补决定区(CDR)；或(iii)两个或更多个分离的CDR的组合，其可任选地通过合成接头接合。此外，虽然Vα和Vβ由分开的基因编码，但可使用重组方法通过合成接头将其接合，使其能够制成单个蛋白质链，其中Vα和Vβ区域配对形成单价分子(称为单链TCR(scTCR))。这类单链TCR也意图涵盖在术语TCR的“抗原结合部分”内。这些TCR片段可使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且以与完全结合蛋白相同的方式针对实用性来筛选所述片段。抗原结合部分可通过重组DNA技术或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学裂解产生。
术语“互补决定区”和“CDR”与“高变区”或“HVR”同义，并且在本领域中已知是指某些结合蛋白，例如TCR可变区内的非连续氨基酸序列，其赋予抗原特异性和/或结合亲和力。对于TCR，一般来说，每个α链可变区(αCDR1、αCDR2和αCDR3)中存在三个CDR，并且每个β链可变区(βCDR1、βCDR2和βCDR3)中存在三个CDR。认为CDR3是负责识别加工过的抗原的主要CDR。CDR1和CDR2主要与MHC相互作用。
术语“体液”是指从身体排泄或分泌的流体，以及通常不从身体排泄或分泌的流体(例如，羊水、房水、胆汁、血液和血浆、脑脊髓液、耵聍和耳垢、考珀液(cowper’s fluid)或预射精液、乳糜、食糜、粪便、女性射液、间隙液、细胞内液、淋巴液、月经、母乳、粘液、胸水、脓液、唾液、皮脂、精液、血清、汗液、滑液、泪液、尿液、阴道润滑液、玻璃样液、呕吐物)。在一些实施方案中，体液包含免疫细胞，任选地其中免疫细胞为细胞毒性淋巴细胞，例如细胞毒性T细胞和/或NK细胞、CD4+T细胞等。
术语“编码区”是指核苷酸序列中包含翻译成氨基酸残基的密码子的区域，而术语“非编码区”是指核苷酸序列中不翻译成氨基酸的区域(例如，5'和3'非翻译区)。
术语“互补”是指两条核酸链的区域之间或同一核酸链的两个区域之间的序列互补性的广泛概念。已知第一核酸区的腺嘌呤残基在第二核酸区的残基为胸腺嘧啶或尿嘧啶的情况下能够与同第一区反向平行的第二核酸区的残基形成特定氢键(“碱基配对”)。类似地，已知第一核酸链的胞嘧啶残基在第二核酸链的残基为鸟嘌呤的情况下能够与同第一链反向平行的第二核酸链的残基进行碱基配对。如果当核酸的第一区与相同或不同核酸的第二区以反向平行的方式排列时，第一区的至少一个核苷酸残基能够与第二区的残基进行碱基配对，则所述两个区域互补。在一些实施方案中，第一区包含第一部分并且第二区包含第二部分，其中当第一部分和第二部分以反向平行的方式排列时，第一部分的核苷酸残基的至少约50％并且在其它实施方案中至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多或介于两者之间的任何范围(包括端点)，例如至少约80％-100％能够与第二部分中的核苷酸残基进行碱基配对。在一些实施方案中，第一部分的所有核苷酸残基均能够与第二部分中的核苷酸残基进行碱基配对。
如本文所用，关于激活的免疫细胞的术语“共刺激”包括共刺激分子提供诱导增殖或效应功能的非激活受体介导的第二信号(“共刺激信号”)的能力。例如，共刺激信号可能例如在已接收到T细胞受体介导的信号的T细胞中引起细胞因子分泌。已接收到例如经由激活受体的细胞受体介导的信号的免疫细胞在本文中称为“激活的免疫细胞”。
“CD3”在本领域中已知为具有六条链的多蛋白复合物(参见Abbas和Lichtman,Cellular and Molecular Immunology(第9版)(2018)；Janeway等人(Immunobiology)(第9版)(2016))。在哺乳动物中，复合物包含一条CD3γ链、一条CD3δ链、两条CD3ε链、和CD3ζ链的一种同源二聚体。CD3γ、CD3δ和CD3ε链是含有单个免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的相关细胞表面蛋白。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的跨膜区带负电荷，认为这一特征允许这些链与T细胞受体链的带正电荷区域或残基缔合。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的细胞内尾部各含有单个保守基序，称为免疫受体酪氨酸激活基序或IT AM，而每条CD3ζ链具有三个ITAM。不希望受理论束缚，相信IT AM对于TCR复合物的信号传导能力很重要。根据本发明使用的CD3可来自各种动物物种，包括人、小鼠、大鼠或其它哺乳动物。
如本文所用，“TCR复合物的组分”是指TCR链(即，TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ)、CD3链(即，CD3γ、CD3δ、CD3ε或CD3ζ)或由两条或更多条TCR链或CD3链形成的复合物(例如TCRα和TCRβ的复合物、TCRγ和TCRδ的复合物、CD3ε和CD3δ的复合物、CD3γ和CD3ε的复合物、或TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ和两条CD3ε链的子TCR复合物)。
“嵌合抗原受体”或“CAR”是指一种融合蛋白，它被工程化成含有两个或更多个以非天然存在或非天然存在于宿主细胞中的方式连接在一起的氨基酸序列，所述融合蛋白在存在于细胞表面上时可用作受体。本发明所涵盖的CAR可包括细胞外部分，所述细胞外部分包含抗原结合结构域(即，获自或源自免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，例如对HPV16E711-19抗原具有特异性的TCR、单链TCR来源的结合蛋白、源自抗体的scFv、源自或获自来自NK细胞的杀伤免疫受体的抗原结合结构域等)，所述抗原结合结构域与跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域(例如效应结构域，任选地含有共刺激结构域)连接(参见例如Sadelain等人(2013)Cancer Discov.3:388；又见Harris和Kranz(2016)TrendsPharmacol.Sci.37:220；Stone等人(2014)CancerImmunol.Immunother.63:1163)。
如本文所用，术语“细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应”是指由细胞毒性T细胞诱导的免疫反应。CTL反应主要由CD8+ T细胞介导。
术语“基本上由……组成”不等同于“包含”，并且是指权利要求的具体材料或步骤，或不实质影响所主张的主题的基本特征的那些材料或步骤。例如，蛋白质结构域、区域或模块(例如，结合结构域、铰链区、接头模块)或蛋白质(可能具有一个或多个结构域、区域或模块)在结构域、区域、模块或蛋白质的氨基酸序列包括在组合下最多占结构域、区域、模块或蛋白质长度的20％(例如，最多15％、10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)并且不显著影响(即，不使活性降低超过50％，例如不超过40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％)结构域、区域、模块或蛋白质的活性(例如，结合蛋白的靶结合亲和力)的延伸、缺失、突变或它们的组合(例如，在氨基端或羧基端的氨基酸或结构域之间的氨基酸)时“基本上由特定氨基酸序列组成”。
术语“确定适合受试者的治疗方案”意指确定用于受试者的治疗方案(即，用于预防和/或治疗受试者的病毒感染的单一疗法或不同疗法的组合)，所述治疗方案基于或基本上基于或至少部分基于根据本发明的分析结果开始、进行修改和/或结束。一个实例是在手术之后开始辅助疗法，其目的是降低复发风险，另一实例将为修改特定化学疗法的剂量。除根据本发明的分析结果以外，所述确定也可以基于待治疗受试者的个人特征。在大多数情况下，将由主治医师或医生实际确定适合受试者的治疗方案。
术语“显性负性TGFβ受体”或“DN-TGFβR”是指抵抗TGFβ信号传导的转化生长因子(TGF)β受体变体或突变体。
存在五种II型受体(激活受体)和七种I型受体(信号传播受体)。活性TGFβ受体为异四聚体，由两个TGFβ受体I(TGFβRI)和两个TGFβ受体II(TGFβRII)组成。在一些实施方案中，DN-TGFβR为DN-TGFβRII(即TGFβ受体II变体或突变体)。在一些实施方案中，抵抗TGFβ信号传导在例如T细胞的免疫细胞上的抑制作用，所述TGFβ可由癌细胞产生，或由细胞环境内的其它免疫细胞，例如由基质细胞、巨噬细胞、骨髓细胞、上皮细胞、自然杀伤细胞等产生。TGFβ信号传导抑制剂是本领域中众所周知的，并且包括不限于螯合受体，从而抑制信号传导的突变TGFβ；与TGFβ和/或TGFβ受体结合的抗体(例如乐德木单抗(lerdelimumab)、麦力木单抗(metlimumab)、非苏木单抗(fressolimumab)等)；可溶性TGFβ结合蛋白，例如螯合TGFβ的TGFβ受体的部分(例如TGFβRII-Fc融合蛋白)；或其它结合剂，例如β-聚糖。代替本文所述的DN-TGFβR(例如DN-TGFβRII)或除其之外，可使用任何和所有已知的TGFβ信号传导抑制剂。在一些实施方案中，DN-TGFβR缺乏TGFβ介导的信号传导所需的细胞内部分，例如整个细胞内结构域、激酶信号传导结构域等。DN-TGFβR构建体是本领域中众所周知的。(代表性非限制性实施方案参见Brand等人(1993)J.Biol.Chem.268:11500-11503；Weiser等人(1993)Mol.Cell Biol.13:7239-7247；Bollard等人(2002)Blood 99::3179-3187；PCT公布WO 2009/152610；PCT公布WO 2017/156484；Kloss等人(2018)Mol.Ther.26:1855-1866；PCT公布WO.2019/089884；PCT公布WO 2020/042647；以及PCT公布WO 2020/042648。
在一些实施方案中，包含一种或多种本文所述的结合蛋白(例如TCR)的免疫细胞产物(例如工程化的T细胞)对β介导的免疫抑制具有抗性。如上文和本文中进一步所述，TGFβ是一种免疫抑制性细胞因子，由肿瘤细胞和肿瘤微环境中的细胞产生。TGFβ抑制细胞毒性和Th1辅助性T细胞的功能和扩增，导致对肿瘤特异性T细胞反应的抑制(Dahmani和Delisle(2018)Cancers 10:194)。T细胞中的TGFβ信号传导可通过显性负性TGFβII型受体(DN-TGFβRII)的表达而废除(Wieser等人(1993)Mol.Cell.Biol.13:7239-7247；Bollard等人(2002)Blood99:3179-3187)。在与TGFβ结合时，野生型TGFβRII发生磷酸化，从而激活TGFβRI并引发细胞内信号传输。在表达缺乏细胞内激酶结构域的截短TGFβRII(DN-TGFβRII)的细胞中该信号传导级联间断，从而导致细胞对TGFβ的抑制有抗性。DN-TGFβRII阻断工程化的T细胞(CAR-T与TCR-T细胞)中的TGFβ信号传导(Bollard等人(2002)Blood 99:3179-3187；Foster等人(2008)J.Immunother.31:500-505；Kloss等人(2018)Mol.Ther.26:1855-1866；Alabanza等人(2022)Front.Immunol.13:832645；Silk等人(2022)J.Immunol.208:169-180；Li等人(2020)Front.Oncol.10:1117)。在代表性研究中，对用于治疗霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)的装备有DN-TGFβRII的EBV特异性T细胞的评估显示经DN-TGFβRII工程化的T细胞的安全并有效的(Bollard等人(2018)J.Clin.Oncol.36:1128-1139)。
“Kite T细胞受体”或“比较T细胞受体”是指在美国专利No.10,174,098和美国专利申请No.62/004,335、61/846,167和61/846,161中报告的至少一种基准T细胞受体(例如，“Kite-439”)。在一些实施方案中，“Kite”或“比较”T细胞受体具有表2中所示的序列。
如本文所用，“同源”是指同一核酸链的两个区域之间或两个不同核酸链的区域之间的核苷酸序列相似性。当两个区域中的核苷酸残基位置由相同的核苷酸残基占据时，则所述区域在该位置处是同源的。如果每个区域的至少一个核苷酸残基位置由相同的残基占据，则第一区与第二区同源。两个区域之间的同源性以两个区域的核苷酸残基位置由相同的核苷酸残基占据的比例表述。举例来说，具有核苷酸序列5'-ATTGCC-3'的区域和具有核苷酸序列5'-TATGGC-3'的区域共享50％同源性。在一些实施方案中，第一区域包含第一部分并且第二区域包含第二部分，其中每个部分的核苷酸残基位置的至少约50％并且在其它实施方案中至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多或介于两者之间的任何范围(包括端点)，例如至少约80％-100％由相同的核苷酸残基占据。在一些实施方案中，每个部分的所有核苷酸残基位置均由相同的核苷酸残基占据。
术语“人乳头瘤病毒”或“HPV”是指一种病毒家族，其一些亚型感染，例如HPV16(NCBI Ref.Seq.NC_001526.4)，与包括癌症在内的许多病症有关。在一些情况下，这类病症与HPV致癌蛋白E7(例如相信其靶向调节细胞生长控制的肿瘤抑制信号传导通路)有关。
如本文所用，术语“HPV16 E711-19抗原”或“HPV16 E711-19肽抗原”或“含HPV16E711-19肽抗原”或“HPV16 E711-19表位”或“HPV16 E711-19肽表位”或“HPV16 E711-19b肽”是指HPV16 E7致癌蛋白的天然或合成产生的肽部分，其包含序列YMLDLQPET、由所述序列组成或基本上由所述序列组成。
术语“以HPV16 E711-19抗原表达为特征的过度增生性病症”可以是任何过度增生性病症，其中HPV16 E711-19抗原存在于由受试者中至少一些过度增殖细胞表达的MHC(例如HLA)复合物中。以HPV16E711-19:HLA复合物为特征的过度增生性病症的实例包括实体恶性病，例如下文详细描述的那些恶性病。
术语“免疫反应”包括T细胞介导和/或B细胞介导的免疫反应。示例性免疫反应包括T细胞反应，例如细胞因子产生和细胞毒性。此外，术语免疫反应包括受T细胞激活间接影响的免疫反应，例如抗体产生(体液反应)和细胞因子反应性细胞(例如巨噬细胞)的激活。
T细胞共刺激受体的激动活性增强和/或抑制性受体的拮抗活性增强可能引起刺激免疫反应或免疫系统的能力增强。刺激免疫反应或免疫系统的能力增强可由EC50的增加倍数或测量免疫反应的测定中的最大活性水平来反映，所述测定例如测量细胞因子或趋化因子释放、细胞溶解活性(直接在靶细胞上测定或经由检测CD107a或颗粒酶间接测定)和增殖的变化的测定。刺激免疫反应或免疫系统活性的能力可增强至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、350％、400％、500％或更多。
术语“免疫治疗剂”可包括可刺激受试者中宿主免疫系统对病毒感染产生免疫反应的任何分子、肽、抗体或其它剂。各种免疫治疗剂可用于本文所述的组合物和方法。
术语“免疫细胞”是指源自骨髓中的造血干细胞的任何免疫系统细胞，其产生两种主要谱系：骨髓祖细胞(产生骨髓细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、巨核细胞和粒细胞)；和淋巴祖细胞(产生淋巴样细胞，例如T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞)。示例性免疫系统细胞包括CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD4 CD8双阴性T细胞、gd T细胞、调控性T细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞。巨噬细胞和树突状细胞可称为“抗原呈递细胞”或“APC”，它们是特化细胞，当APC表面上与肽复合的主要组织相容性复合体(MHC)受体与T细胞表面的TCR相互作用时，可激活T细胞。
“分离的蛋白质”是指在从细胞中分离或通过重组DNA技术产生时基本上不含其它蛋白质、细胞材料、分离介质和培养基的蛋白质，或在化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质的蛋白质。“分离”或“纯化”的蛋白质或其生物活性部分基本上不含来自产生结合蛋白、抗体、多肽、肽或融合蛋白的细胞或组织来源的细胞材料或其它污染蛋白，或在化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质。用语“基本上不含细胞材料”包括生物标志物多肽或其片段的制剂，其中蛋白质从分离出或重组产生蛋白质的细胞的细胞组分中分离。在一实施方案中，用语“基本上不含细胞材料”包括生物标志物蛋白或其片段的制剂，其具有少于约30％(以干重计)的非生物标志物蛋白(本文中又称为“污染蛋白”)，或在一些实施方案中，少于约25％、20％、15％、10％、5％、1％或更少或介于两者之间的任何范围(包括端点)，例如少于约1％至5％的非生物标志物蛋白。当重组产生结合蛋白、抗体、多肽、肽或融合蛋白或其片段(例如其生物活性片段)时，其可基本上不含培养基，即，培养基占蛋白质制剂的体积不到约20％、15％、10％、5％、1％或更少或介于两者之间的任何范围(包括端点)，例如少于约1％至5％。
如本文所用，术语“同型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgM、IgG1、IgG2C等)。
如本文所用，术语“KD”意指特定结合蛋白-抗原相互作用的解离平衡常数。可通过标准结合蛋白-靶标测定，例如竞争测定、饱和测定或例如ELISA或RIA的标准免疫测定来测量或测定本发明所涵盖的结合蛋白的结合亲和力。相对较低的Kd值指示相对较高的结合亲和力(例如，小于或等于约5×10-4M(500uM)的Kd值包括1×10-4M(100uM)的Kd值并且100uMKd指示与500uM Kd相比结合亲和力相对较高)。
“试剂盒”是包含至少一种试剂，例如探针或小分子的任何制品(例如，包装或容器)，所述至少一种试剂用于特异性检测和/或影响本发明所涵盖的标志物的表达。试剂盒可作为用于执行本发明所涵盖的方法的单元来推销、分售或销售。试剂盒可包含表达可用于本发明所涵盖的方法的组合物所必需的一种或多种试剂。在某些实施方案中，试剂盒还可包含参考标准，例如编码不影响或调控控制细胞生长、分裂、迁移、存活或凋亡的信号传导通路的蛋白质的核酸。本领域的技术人员可设想许多这类对照蛋白，包括但不限于常见分子标签(例如，绿色荧光蛋白和β-半乳糖苷酶)、未通过GeneOntology参考归类于任何涵盖细胞生长、分裂、迁移、存活或凋亡的通路中的蛋白质或者普遍存在的持家蛋白。试剂盒中的试剂可在单独的容器中提供，或在单一容器中以两种或更多种试剂的混合物形式提供。此外，可包括描述试剂盒内的组合物的用途的指导性材料。
如本文所用，术语“连接”是指两个或更多个分子的缔合。连接可以是共价或非共价的。连接也可以是基因的(即，重组融合)。这类连接可使用多种公认的技术实现，例如化学缀合和重组蛋白产生。
在一些实施方案中，“接头”可指连接两个蛋白质、多肽、肽、结构域、区域或基序的氨基酸序列，并且可提供与两个子结合结构域的相互作用相容的间隔功能，从而所得多肽保留对靶分子的特异性结合亲和力(例如，scTCR)或保留信号传导活性(例如，TCR复合物)。在一些实施方案中，接头由例如约2至约35个氨基酸或约4至约20个氨基酸或约8至约15个氨基酸或约15至约25个氨基酸构成。
“主要组织相容性复合体”(MHC)是指将肽抗原递送到细胞表面的糖蛋白。MHC I类分子为异二聚体，具有跨链的膜(具有三个结构域)和非共价缔合的b2微球蛋白。MHC II类分子由两种跨膜糖蛋白a和b构成，所述两种糖蛋白均跨越膜。每条链具有两个结构域。MHCI类分子将源自胞质液的肽递送到细胞表面，在表面上肽抗原-MHC(pMHC)复合物被CD8+ T细胞识别。MHC II类分子将源自囊泡系统的肽递送到细胞表面，在表面上其被CD4+ T细胞识别。人MHC被称为人类白细胞抗原(HLA)。
术语“预防(prevent/preventing/prevention)”、“预防性治疗”等是指降低受试者发展疾病、病症或疾患的概率，所述受试者未患但有风险或容易发展疾病、病症或疾患。
术语“预后”包括对病毒感染的可能过程和结果或从疾病恢复的可能性的预测。在一些实施方案中，统计算法的使用提供对个体中病毒感染的预后。举例来说，预后可以是手术、病毒感染的临床亚型的发展、一种或多种临床因素的发展或从疾病恢复。
如本文所用，氨基酸序列之间的“同一性百分比”与“同源性百分比”同义，其可使用由Karlin和Altschul修改((1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877)的Karlin和Altschul算法((1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268)测定。将所提及的算法并入到Altschul等人((1990)J.Mol.Biol.215:403-410)的NBLAST和XBLAST程序中。用NBLAST程序执行BLAST核苷酸搜索，分数＝100，字长＝12，以获得与本文所述的多核苷酸同源的核苷酸序列。用XBLAST程序执行BLAST蛋白质搜索，分数＝50，字长＝3，以获得与参考多肽同源的氨基酸序列。为了获得空位比对以达成比较的目的，使用空位BLAST，如Altschul等人(1997)Nuc.Acids Res.25:3389-3402所述。当使用BLAST和空位BLAST程序时，使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
短语“药学上可接受的载剂”意指参与将本发明化合物从身体的一个器官或部分携带或转运到身体的另一个器官或部分的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂封装材料。
术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)是指包含非天然存在于细胞中的核酸的细胞，例如已引入了重组表达载体的细胞。应当理解，根据本发明的细胞不仅是指特定的主题细胞，而且还涵盖这类细胞的后代。因为由于突变或环境影响可能在后续代中发生某些修饰，所以这类后代实际上可能与亲代细胞不相同，但仍包括在根据本发明的术语细胞的范围内。
术语“癌症反应”、“对免疫疗法的反应”或“对T细胞介导的细胞毒性调节剂/免疫疗法组合疗法的反应”是指过度增生性疾病(例如癌症)对癌症药剂(例如T细胞介导的细胞毒性调节剂和免疫疗法)的任何反应，优选是指在新辅助或辅助疗法开始后肿瘤质量和/或体积的变化。术语“新辅助疗法”是指在主要治疗之前给予的治疗。新辅助疗法的实例可包括化学疗法、放射疗法和激素疗法。可例如针对疗效或在新辅助或辅助情况下评估过度增生性病症反应，其中通过CT、PET、乳房X线照片、超声波或触诊测量，系统性干预后的肿瘤大小可与初始大小和尺寸进行比较。反应也可以通过卡尺测量或活检或手术切除后的肿瘤病理学检查来评估。反应可以用定量方式(如肿瘤体积变化百分比)或定性方式(如“病理完全反应”(pCR)、“临床完全缓解”(cCR)、“临床部分缓解”(cPR)、“临床稳定疾病”(cSD)、“临床进展性疾病”(cPD)或其它定性标准)记录。过度增生性病症反应的评估可在新辅助或辅助疗法开始后早期进行，例如在几小时、几天、几周或优选几个月之后进行。反应评估的典型终点为新辅助化学疗法终止或手术切除残留肿瘤细胞和/或肿瘤床时。这通常在开始新辅助疗法后三个月。在一些实施方案中，本文所述的治疗性治疗的临床功效可通过测量临床受益率(CBR)来确定。临床受益率通过确定以下各者的总和来测量：在距离疗法结束至少6个月的时间点的完全缓解(CR)患者百分比、部分缓解(PR)患者数量和稳定疾病(SD)患者数量。该公式的简写为CBR＝6个月内CR+PR+SD。在一些实施方案中，特定癌症治疗方案的CBR为至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或更多。评估对癌症疗法反应的其它标准与“生存”有关，包括以下所有内容：生存到死亡，又称为总生存期(其中该死亡可能不考虑原因或与肿瘤相关)；“无复发生存期”(其中术语复发应包括局部复发和远处复发)；无转移生存期；无病生存期(其中术语疾病应包括癌症和与之相关的疾病)。所述生存的长度可通过参考定义的起点(例如诊断时间或治疗开始时间)和终点(例如死亡、复发或转移)来计算。此外，治疗功效的标准可扩大到包括对化学疗法的反应、生存概率、给定时间段内的转移概率和肿瘤复发概率。举例来说，为了确定适当阈值，可将特定癌症治疗方案施用于受试者群体并且结果可与在施用任何癌症疗法之前测定的生物标志物测量值相关。结果测量可以是对在新辅助环境中给与的疗法的病理反应。或者，可在癌症疗法后的一段时间内监测生物标志物测量值已知的受试者的结果测量，例如总生存期和无病生存期。在某些实施方案中，施用的剂量是本领域已知的癌症治疗剂的标准剂量。监测受试者的时间段可能有所不同。例如，可监测受试者至少2个月、4个月、6个月、8个月、10个月、12个月、14个月、16个月、18个月、20个月、25个月、30个月、35个月、40个月、45个月、50个月、55个月或60个月。与癌症疗法结果相关的生物标志物测量阈值可使用本领域众所周知的方法，例如实施例部分中描述的那些方法来确定。
如所指出，所述术语还可以指改善的预后，例如反映在到复发的时间增加，到复发的时间是到第一次复发的时间段，将第二原发性癌症作为无复发证据的第一次事件或死亡进行审查；或总生存期增加，即从治疗到任何原因死亡的时间段。反应或做出反应意指当暴露于刺激时达到有益终点。或者，负面或有害症状在暴露于刺激时最小化、减轻或减弱。应当理解，评估肿瘤或受试者将展现有利反应的可能性等同于评估肿瘤或受试者将不会展现有利反应(即，将展现缺乏反应或无反应)的可能性。
术语“抗性”是指癌症样品或哺乳动物对癌症疗法的获得性或天然抗性(即，对治疗性治疗无反应或对治疗性治疗的反应降低或有限)，例如对治疗性治疗的反应降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多，例如2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更多，或介于两者之间的任何范围(包括端点)。可通过与获得抗性之前的相同癌症样品或哺乳动物进行比较，或通过与已知对治疗性治疗无抗性的不同癌症样品或哺乳动物进行比较来测量反应的降低。对化学疗法的典型获得性抗性称为“多重抗药性”。多重抗药性可能由P-糖蛋白介导，或者可能由其它机制介导，或者可能在哺乳动物感染多重抗药性微生物或微生物组合时发生。对治疗性治疗的抗性的测定是本领域中常规的，并且在普通临床医师的技能范围内，例如，可通过如本文中描述为“敏化”的细胞增殖测定和细胞死亡测定来测量。在一些实施方案中，术语“逆转抗药性”意指在与未治疗肿瘤的肿瘤体积相比，单独主要癌症疗法(例如，化学治疗或放射疗法)不能产生统计学上显著的肿瘤体积减少的情况下，与未治疗肿瘤的肿瘤体积相比，第二种药剂与主要癌症疗法(例如，化学治疗或放射疗法)组合使用能够在统计显著性程度上产生显著肿瘤体积减少(例如，p<0.05)。这通常适用于在未治疗肿瘤呈对数生长时进行的肿瘤体积测量。
用于检测或测定至少一种生物标志物的不存在、存在或水平的术语“样品”通常为脑组织、脑脊髓液、全血、血浆、血清、唾液、尿液、粪样(stool)(例如粪便(feces))、泪液和任何其它体液(例如，如上文在“体液”的定义下所描述)，或组织样品(例如，活体组织切片)，例如小肠、结肠样品或手术切除组织。在一些实施方案中，本发明所涵盖的方法还包括在检测或测定样品中的至少一种标志物的不存在、存在或水平之前从个体获得样品。
术语“敏化”意指以允许用癌症疗法(例如，抗免疫检查点、化学治疗和/或放射疗法)更有效地治疗相关癌症的方式改变癌细胞或肿瘤细胞。在一些实施方案中，正常细胞不会被影响到导致正常细胞受到疗法过度损伤的程度。根据本领域已知的用于下文所述的特定治疗和方法的方法测量对治疗性治疗的敏感性的增加或敏感性的降低，包括但不限于细胞增殖测定(Tanigawa等人(1982)Cancer Res.42:2159-2164)和细胞死亡测定(Weisenthal等人(1984)Cancer Res.94:161-173；Weisenthal等人(1985)Cancer TreatRep.69:615-632；Weisenthal等人,Kaspers G J L,Pieters R,Twentyman P R,Weisenthal L M,Veerman A JP编辑,Drug Resistance in Leukemia andLymphoma.Langhorne,P A:Harwood Academic Publishers,1993:415-432；Weisenthal(1994)Contrib.Gynecol.Obstet.19:82-90)。还可以通过测量一段时间，例如人6个月和小鼠4-6周内肿瘤大小的减小来测量动物的敏感性或抗性。如果与组合物或方法不存在下的治疗敏感性或抗性相比，治疗敏感性增加或抗性降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多，例如2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更多，或介于两者之间的任何范围(包括端点)，则这类组合物或方法敏化对治疗性治疗的反应。对治疗性治疗的敏感性或抗性的测定是本领域中常规的，并且在普通临床医师的技能范围内。应当理解，本文所述的用于增强癌症疗法功效的任何方法可同样应用于使过度增生性或其它癌细胞(例如，抗性细胞)对癌症疗法敏感的方法。
术语“小分子”为本领域的术语且包括分子量小于约1000或分子量小于约500的分子。在一实施方案中，小分子不仅仅包含肽键。在另一实施方案中，小分子并非低聚物。可针对活性进行筛选的示例性小分子化合物包括但不限于肽、肽模拟物、核酸、碳水化合物、小的有机分子(例如聚酮类)(Cane等人(1998)Science 282:63-68)和天然产物提取物库。在另一实施方案中，化合物为小的有机非肽化合物。在另一实施方案中，小分子并非生物合成的。
术语“特异性结合”是指结合蛋白与预定抗原的结合。通常，当通过结合测定，例如表面等离子体共振(SPR)技术，在BIAcoreTM测定仪器中使用所关注抗原作为分析物并且结合蛋白作为配体测定时，结合蛋白以约小于或等于约5×10-4M、小于或等于约1×10-4M、小于或等于约5×10-5M、小于或等于约1×10-5M、小于或等于约5×10-6M、小于或等于约1×10- 6M、小于或等于约5×10-7M、小于或等于约1×10-7M、小于或等于约5×10-8M、小于或等于约1×10-8M、小于或等于约5×10-9M、小于或等于约1×10-9M、小于或等于约5×10-10M、小于或等于约1×10-10M、小于或等于约5×10-11M、小于或等于约1×10-11M、小于或等于约5×10-12M、小于或等于约1×10-12M或更低，或介于两者之间的任何范围(包括端点)，例如约1-50微摩尔、1-100微摩尔、0.1-500微摩尔等的亲和力(KD)结合。在一些实施方案中，结合蛋白以比其结合除预定抗原或密切相关的抗原以外的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)的亲和力大至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0或10.0倍的亲和力与预定抗原结合。短语“识别抗原的结合蛋白”和“对抗原具特异性的结合蛋白”在本文中可与术语“与抗原特异性结合的结合蛋白”互换使用。选择性结合是一个相对术语，是指结合蛋白区分一种抗原的结合与另一种抗原的结合，例如特定家族成员或抗原靶标的结合与相关家族成员或抗原靶标的结合的能力。举例来说，实施例部分中提供的分析数据表明，本文所述的结合蛋白特异性地结合HPV16 E711-19免疫原性表位和/或选择性地结合许多相关表位(例如，HPV16E711-19免疫原性表位和密切相关的序列)，从而区分这类靶标与人类基因组中可用的众多其它可能的表位。
术语“受试者”是指任何健康的动物、哺乳动物或人类，或任何罹患以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的动物、哺乳动物或人类。术语“受试者”可与“患者”互换。
术语“生存”包括以下所有内容：生存到死亡，又称为总生存期(其中该死亡可能不考虑原因或与肿瘤相关)；“无复发生存期”(其中术语复发应包括局部复发和远处复发)；无转移生存期；无病生存期(其中术语疾病应包括癌症和与之相关的疾病)。所述生存的长度可通过参考定义的起点(例如诊断时间或治疗开始时间)和终点(例如死亡、复发或转移)来计算。此外，治疗功效的标准可扩大到包括对化学疗法的反应、生存概率、给定时间段内的转移概率和肿瘤复发概率。
术语“协同作用”是指两种或更多种剂(例如，本文所述的HPV16E711-19相关剂和用于治疗以HPV16 E711-19表达为特征的病症的另一种疗法)的组合作用大于单独癌症药剂/疗法的单独作用的总和。
如本文所用，术语“T细胞介导的反应”是指由T细胞，包括效应T细胞(例如CD8+细胞)和辅助T细胞(例如CD4+细胞)介导的反应。T细胞介导的反应包括例如T细胞细胞毒性和增殖。
“转录的多核苷酸”或“核苷酸转录本”是与成熟mRNA的全部或一部分互补或同源的多核苷酸(例如，mRNA、hnRNA、cDNA或这类RNA或cDNA的类似物)，所述成熟mRNA是通过生物标志物核酸的转录和(如果存在)RNA转录本的正常转录后加工(例如剪接)以及RNA转录本的逆转录制成的。
“T细胞”是一种免疫系统细胞，它在胸腺中成熟并且产生T细胞受体(TCR)。T细胞可以是初始T细胞(未暴露于抗原；与TCM相比，CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD 127和CD45RA的表达增加，并且CD45RO的表达减少)、记忆T细胞(TM)(经历过抗原和寿命长)和效应细胞(经历过抗原、细胞毒性)。TM还可以分为中央记忆T细胞(TCM，与初始T细胞相比，CD62L、CCR7、CD28、CD127、CD45RO和CD95的表达增加，并且CD54RA的表达减少)和效应记忆T细胞(TEM，与初始T细胞或TCM相比，CD62L、CCR7、CD28、CD45RA的表达减少，并且CD127的表达增加)子集。效应T细胞(TE)是指经历过抗原的CD8+细胞毒性T淋巴细胞，与TCM相比，CD62L、CCR7、CD28的表达减少，并且对颗粒酶和穿孔素呈阳性。其它示例性T细胞包括调控性T细胞，例如CD4+CD25+(Foxp3+)调控性T细胞和Tregl7细胞，以及Trl、Th3、CD8+CD28和Qa-1限制性T细胞。
常规T细胞(又称为Tconv或Teff)具有效应功能(例如，分泌细胞因子、细胞毒性活性、抗自我识别等)以借助于其对一种或多种T细胞受体的表达来增加免疫反应。Tcon或Teff一般定义为任何非Treg的T细胞群体并且包括例如初始T细胞、激活T细胞、记忆T细胞、静息Tcon或已分化为例如Th1或Th2谱系的Tcon。在一些实施方案中，Teff为非Treg T细胞的子集。在一些实施方案中，Teff为CD4+Teff或CD8+ Teff，例如CD4+辅助T淋巴细胞(例如，Th0、Th1、Tfh或Th17)和CD8+细胞毒性T淋巴细胞。如本文进一步所述，细胞毒性T细胞为CD8+ T淋巴细胞。“初始Tcon”是已经在骨髓中分化并且在胸腺中成功进行正向和负向的中央选择过程，但尚未通过暴露于抗原而激活的CD4+ T细胞。初始Tcon的特征通常在于L-选择素(CD62L)的表面表达、激活标志物(例如CD25、CD44或CD69)的缺乏以及记忆标志物(例如CD45RO)的缺乏。因此，相信初始Tcon为静止且非分裂的，需要白细胞介素7(IL-7)和白细胞介素15(IL-15)来进行体内恒定存活(至少参见WO 2010/101870)。在抑制免疫反应的背景下，这类细胞的存在和活性是不需要的。与Treg不同的是，Tcon并非无反应性的并且可回应于基于抗原的T细胞受体激活而增生(Lechler等人(2001)Philos.Trans.R.Soc.Lond.Biol.Sci.356:625-637)。
“T效应”(“Teff”或“TE”)细胞是指具有细胞溶解活性的T细胞(例如CD4+和CD8+ T细胞)，以及分泌细胞因子并且激活和指导其它免疫细胞的T辅助(Th)细胞，但不包括调控性T细胞(Treg细胞)。
“T细胞受体”或“TCR”是指能够结合(例如，特异性和/或选择性)与MHC受体结合的抗原肽的免疫球蛋白超家族成员(具有可变结合结构域、恒定结构域、跨膜区和短细胞质尾；参见例如Janeway等人(1997)Curr.Biol.Publ.4:33)。TCR可在细胞表面发现或以可溶形式存在，并且通常由具有α和β链(又分别称为TCRα和TCRβ)或γ和δ链(又分别称为TCRγ和TCRδ)的异二聚体构成。与免疫球蛋白(例如抗体)一样，TCR链的胞外部分(例如α链和β链)含有两个免疫球蛋白结构域：N端的可变结构域(例如α链可变结构域或Vα和β链可变结构域或Vβ；通常为基于Kabat编号的氨基酸1至116(Kabat等人(1991)“Sequences of Proteinsof lmmunological Interest,USDept.Health and Human Services,Public HealthService National Institutes of Health,第5版)，和在C端并且与细胞膜相邻的一个恒定结构域(例如，α链恒定结构域或Cα，通常为基于Kabat的氨基酸117至259；β链恒定结构域或Cβ，通常为基于Kabat的氨基酸117至295)。也与免疫球蛋白一样，可变结构域含有由框架区(“FR”)分隔的互补决定区(“CDR”，又称为高变区或“HVR”)(参见例如Fores等人(1990)Proc.Natl.Acad Sci.US.A.87:9138；Chothia等人(1988)EMBO J.7:3745；Lefranc等人(2003)Dev.Comp.Immunol.27:55)。在一些实施方案中，在T细胞(或T淋巴细胞)的表面上发现TCR，并且与CD3复合物缔合。本发明涵盖的TCR的来源可来自各种动物物种，例如人、小鼠、大鼠、兔或其它哺乳动物。
术语“T细胞受体”或“TCR”应理解为涵盖完整TCR以及其抗原结合部分或抗原结合片段。在一些实施方案中，TCR是完整或全长TCR，包括呈αβ形式或γδ形式的TCR。在一些实施方案中，TCR是小于全长TCR但与MHC分子中结合的特定肽结合，例如与MHC-肽复合物结合的抗原结合部分。在一些情况下，TCR的抗原结合部分或片段可仅含有全长或完整TCR的部分结构域，但仍能够结合完整TCR所结合的肽表位，例如MHC-肽复合物。在一些情况下，抗原结合部分含有TCR的可变结构域，例如TCR的可变α链和可变β链，所述可变结构域足以形成与特定MHC-肽复合物结合的结合位点。一般来说，TCR的可变链含有参与肽、MHC和/或MHC-肽复合物的识别的互补决定区(CDR)。
国际免疫遗传学信息系统(IMGT)建立命名法(又见Scaviner和Lefranc(2000)Exp.Clin.Immunogenet.17:83-96和97-106；Folch和Lefranc(2000)Exp.Clin.Immunogenet,17:107-114；T Cell Receptor Factsbook”,(2001)LeFranc和LeFranc,Academic Press,ISBN 0-12-441352-8)。IMGT提供了用于描述TCR的独特序列，并且本文所述的序列可通过参考本文提供的这类独特序列来鉴定。TCR序列可在imgt.org的IMGT数据库中公开获得。
如上所述，天然α/β异二聚体TCR具有α链和β链。广义上，每条链包含可变区、接合区和恒定区，并且β链通常在可变区与接合区之间还含有短的多样性区，但该多样性区通常被认为是接合区的一部分。每个可变区包含嵌入框架序列中的三个高变CDR(互补决定区)。众所周知CDR3是抗原识别的主要介体。存在数种类型的α链可变(Vα)区和数种类型的β链可变(Vβ)区，它们通过其框架、CDR1和CDR2序列以及部分定义的CDR3序列来区分。Vα类型在IMGT命名法中由独特TRAV编号表示。例如，“TRAV4”定义一种TCRVα区，其具有独特的框架和CDR1和CDR2序列，以及由在TCR之间保守的氨基酸序列部分定义但也包括在TCR之间发生变化的氨基酸序列的CDR3序列。类似地，“TRBV2”定义一种TCRVβ区，其具有独特的框架和CDR1和CDR2序列，但仅具有部分定义的CDR3序列。已知在α和β基因座内分别存在54个α可变基因，其中44个是功能性的，和67个β可变基因，其中42个为功能性的。
类似地，TCR的接合区由独特的IMGT TRAJ和TRBJ命名法定义，并且恒定区由IMGTTRAC和TRBC命名法定义。β链多样性区在IMGT命名法中简称为TRBD，并且如前所述，串联的TRBD/TRBJ区通常被一起视为接合区。
编码TCRα和β链的基因池位于不同的染色体上，并且含有独立的V、(D)、J和C基因区段，这些基因区段在T细胞发育过程中通过重排而聚集在一起。由于54个TCRα可变基因与61个αJ基因之间或67个β可变基因、两个βD基因和13个βJ基因之间发生大量可能的重组事件，所以这引起T细胞α和β链极高的多样性。重组过程并不精确，并且在CDR3区内引入进一步的多样性。每个α和β可变基因也可以包含等位基因变体，在IMGT命名法中分别指定为TRAVxx*01和*02，或TRBVx-x*01和*02，从而进一步增加了变异量。同样，一些TRBJ序列具有两种已知的变异。(请注意，缺乏“*”限定符意指相关序列只有一个等位基因是已知的)。由重组和胸腺选择产生的人TCR的天然谱系估计包含大约106个独特β链序列，由CDR3多样性确定(Arstila等人(1999)Science 286:958-961)，并且甚至可能更高(Robins等人(2009)Blood 114:4099-4107)。估计每条β链与至少25条不同α链配对，从而产生进一步的多样性(Arstila等人(1999)Science 286:958-961)。
因此，术语“TCRα可变结构域”是指TRAV区和TRAJ区的串联；仅TRAV区；或TRAV和部分TRAJ区，并且术语TCRα恒定结构域是指胞外TRAC区，或C端截短或全长TRAC序列。同样，术语“TCRβ可变结构域”是指TRBV区和TRBD/TRBJ区的串联；仅TRBV区和TRBD区；仅TRBV区和TRBJ区；或TRBV区和部分TRBD区和/或TRBJ区，并且术语TCRβ恒定结构域是指胞外TRBC区，或C端截短或全长TRBC序列。这些TCRα可变结构域和TCRβ可变结构域命名法分别类似地适用于γ/δTCR的TCRγ和TCRδ链的可变结构域。普通技术人员可例如通过可公开获得的IMGT数据库获得TRAV、TRAJ、TRAC、TRBV、TRBJ和TRBC基因序列。
术语“TCR复合物”是指CD3与TCR缔合形成的复合物。例如，TCR复合物可由CD3γ链、CD3δ链、两条CD3ε链、CD3ζ链的同源二聚体、TCRα链和TCRβ链组成。或者，TCR复合物可由CD3γ链、CD3δ链、两条CD3ε链、CD3ζ链的同源二聚体、TCRγ链和TCRδ链组成。
术语“治疗作用”是指药理学活性物质在动物，尤其是哺乳动物，并且更尤其在人中引起的局部或全身作用。因此，该术语意指意图用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防动物或人的疾病或用于增强其所需身体或精神发育和状况的任何物质。
术语“治疗有效量”和“有效量”意指一种物质以适于任何治疗的合理效益/风险比在动物中的至少一个细胞亚群中产生一些所需作用，例如所需局部或全身治疗作用的量。在一些实施方案中，物质的治疗有效量将取决于所述物质的治疗指数、溶解度、药物动力学、半衰期等。可在细胞培养物或实验动物中通过例如用于测定LD50和ED50的标准医药学程序来测定主题化合物的毒性和治疗功效。在一些实施方案中，使用表现出大治疗指数的组合物。在一些实施方案中，可测量LD50(致死剂量)，并且相对于不施用药剂，其在施用药剂时可例如降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多。类似地，可测量ED50(即，实现症状的半最大抑制的浓度)，并且相对于不施用药剂，其在施用药剂时可例如增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多。类似地，也可以测量IC50，并且相对于不施用药剂，其在施用药剂时可例如增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多。在一些实施方案中，在一种分析中，T细胞免疫反应可增加至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至100％。在另一实施方案中，可实现病毒载量降低至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至100％。
术语“治疗”是指所关注的疾患(例如，疾病或病症)的治疗性管理或改善。治疗可包括但不限于向受试者施用剂或组合物(例如药物组合物)。通常进行治疗以努力以对受试者有益的方式改变疾病的进程(该术语用于指示任何疾病、病症、综合征或需要或可能需要疗法的不良状况)。治疗效果可包括逆转、减轻疾病或疾病的一种或多种症状或表现、降低其严重性、延迟其发作、治愈其、抑制其进展和/或降低其发生或复发的可能性。理想的治疗效果包括但不限于预防疾病发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速率、改善或缓解疾病状态和缓解或改善预后。治疗剂可施用于患有疾病或相对于一般人群成员具有增加的疾病发展风险的受试者。在一些实施方案中，可将治疗剂施用于患有疾病但不再显示疾病证据的受试者。可施用剂，例如以降低明显疾病复发的可能性。可预防性地施用治疗剂，即，在疾病的任何症状或表现出现之前施用。“预防性治疗”是指为尚未患疾病或未显示疾病证据的受试者提供医疗和/或手术治疗，以例如降低疾病发生的可能性或降低疾病发生时的严重程度。受试者可能已被鉴定为处于显现疾病的风险中(例如，相对于普通人群具有增加的风险或具有增加显现疾病可能性的风险因素。
术语“无反应性”包括癌细胞对疗法的折射性，或治疗性细胞，例如免疫细胞对刺激，例如经由激活受体或细胞因子的刺激的折射性。可能会出现无反应性，例如由于暴露于免疫抑制剂或暴露于高剂量的抗原。如本文所用，术语“无能”或“耐受性”包括对激活受体介导的刺激的折射性。该折射性通常是抗原特异性的，并且在停止暴露于耐受性抗原后仍然存在。举例来说，T细胞无能(与无反应性相对)的特征在于缺乏例如IL-2的细胞因子的产生。当T细胞暴露于抗原并且在无第二信号(共刺激信号)的情况下接收第一信号(T细胞受体或CD-3介导的信号)时，会出现T细胞无能。在这些条件下，细胞再暴露于相同抗原(即使再暴露在共刺激多肽的存在下发生)导致不能产生细胞因子，因此不能增殖。然而，如果与细胞因子(例如，IL-2)一起培养，无能T细胞可能会增殖。例如，通过用ELISA或使用指示细胞系的增殖测定法测量到T淋巴细胞不产生IL-2，也可以观察到T细胞无能。或者，可使用报告基因构建体。例如，无能T细胞无法启动由5'IL-2基因增强子控制下的异源启动子或由增强子内可能发现的AP1序列多聚体诱导的IL-2基因转录(Kang等人(1992)Science257:1134)。
术语“可变区”或“可变结构域”是指与免疫球蛋白超家族结合蛋白(例如，TCR)与抗原的结合有关的免疫球蛋白超家族结合蛋白的结构域(例如，TCRα链或β链(或对于γδTCR为γ链和δ链))。天然TCR的α链和β链(分别为Vα和Vβ)的可变结构域通常具有相似的结构，每个结构域均包含四个保守框架区(FR)和三个CDR。Vα结构域由两个独立的DNA区段，即可变基因区段和接合基因区段(V-J)编码；Vβ结构域由三个独立的DNA区段，即可变基因区段、多样性基因区段和接合基因区段(V-D-J)编码。单个Vα或Vβ结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可使用Vα或Vβ结构域从结合抗原的TCR中分离出结合特定抗原的TCR，以分别筛选互补Vα或Vβ结构域的文库。
术语“载体”是指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。在一些实施方案中，载体为游离基因，即能够进行染色体外复制的核酸。在一些实施方案中，载体为能够自主复制和/或表达与其连接的核酸的那些载体。能够引导可操作性连接的基因的表达的载体在本文中称为“表达载体”。一般来说，在重组DNA技术中使用的表达载体通常呈“质粒”形式，质粒一般是指环状双链DNA环，其载体形式不与染色体结合。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，如本领域的技术人员将了解，本发明意图包括提供等效功能并随后在本领域中为人所知的这类其它形式的表达载体。
特定蛋白质的氨基酸序列与可编码所述蛋白质的核苷酸序列之间存在已知并且确定的对应关系，如遗传密码所定义(如下所示)。同样，特定核酸的核苷酸序列与由彼核酸编码的氨基酸序列之间存在已知并且确定的对应关系，如遗传密码所定义。
遗传密码
丙氨酸(Ala、A) GCA、GCC、GCG、GCT
精氨酸(Arg、R) AGA、ACG、CGA、CGC、CGG、CGT
天冬酰胺(Asn、N) AAC、AAT
天冬氨酸(Asp、D) GAC、GAT
半胱氨酸(Cys、C) TGC、TGT
谷氨酸(Glu、E) GAA、GAG
谷氨酰胺(Gln、Q) CAA、CAG
甘氨酸(Gly、G) GGA、GGC、GGG、GGT
组氨酸(His、H) CAC、CAT
异亮氨酸(Ile、I) ATA、ATC、ATT
亮氨酸(Leu、L) CTA、CTC、CTG、CTT、TTA、TTG
赖氨酸(Lys、K) AAA、AAG
甲硫氨酸(Met、M) ATG
苯丙氨酸(Phe、F) TTC、TTT
脯氨酸(Pro、P) CCA、CCC、CCG、CCT
丝氨酸(Ser、S) AGC、AGT、TCA、TCC、TCG、TCT
苏氨酸(Thr、T) ACA、ACC、ACG、ACT
色氨酸(Trp、W) TGG
酪氨酸(Tyr、Y) TAC、TAT
缬氨酸(Val、V) GTA、GTC、GTG、GTT
终止信号(末端) TAA、TAG、TGA
遗传密码的一个重要并且众所周知的特征是其冗余性，由此，对于用于制备蛋白质的大多数氨基酸来说，可采用多于一个编码核苷酸三联体(如上文所说明)。因此，许多不同的核苷酸序列可编码既定氨基酸序列。这类核苷酸序列被视为在功能上等效，因为其在所有生物体中产生相同的氨基酸序列(尽管某些生物体可能比其它生物体更有效地翻译一些序列)。此外，有时可在既定核苷酸序列中发现嘌呤或嘧啶的甲基化变体。这类甲基化不影响三核苷酸密码子与对应氨基酸之间的编码关系。
鉴于前述，可使用编码生物标志物核酸(或其任何部分)的DNA或RNA的核苷酸序列，使用遗传密码将DNA或RNA翻译成氨基酸序列来衍生多肽氨基酸序列。同样，对于多肽氨基酸序列，可以从遗传密码推断出可编码所述多肽的对应核苷酸序列(由于其冗余性，其将产生用于任何既定氨基酸序列的多个核酸序列)。因此，本文中对编码多肽的核苷酸序列的描述和/或公开应被视为也包括对由所述核苷酸序列编码的氨基酸序列的描述和/或公开。类似地，本文中对多肽氨基酸序列的描述和/或公开应被视为也包括对可编码所述氨基酸序列的所有可能核苷酸序列的描述和/或公开。
II.结合蛋白
在本发明涵盖的一个方面，本文提供了结合蛋白，其结合(例如特异性和/或选择性)包含在MHC分子(例如MHC I类分子)背景中的HPV16 E711-19免疫原性肽的肽-MHC(pMHC)复合物。在一些实施方案中，结合蛋白能够与HPV16 E711-19肽-MHC(pMHC)复合物结合(例如，特异性和/或选择性地)，Kd小于或等于约5×10-4M、小于或等于约1×10-4M、小于或等于约5×10-5M、小于或等于约1×10-5M、小于或等于约5×10-6M、小于或等于约1×10-6M、小于或等于约5×10-7M、小于或等于约1×10-7M、小于或等于约5×10-8M、小于或等于约1×10-8M、小于或等于约5×10-9M、小于或等于约1×10-9M、小于或等于约5×10-10M、小于或等于约1×10- 10M、小于或等于约5×10-11M、小于或等于约1×10-11M、小于或等于约5×10-12M、小于或等于约1×10-12M，或介于两者之间的任何范围(包括端点)，例如约1-50微摩尔、1-100微摩尔、0.1-500微摩尔之间等。在一些实施方案中，MHC分子包含MHCα链，所述链为HLA血清型HLA-A*02。在一些实施方案中，HLA等位基因选自由以下组成的组：HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0205、HLA-A*0206和HLA-A*0207等位基因。在一特定实施方案中，HLA等位基因为HLA-A*0201。在一些实施方案中，本文提供的结合蛋白进行基因工程化、分离和/或纯化。
在一些实施方案中，结合蛋白对HPV16 E711-19肽-MHC(pMHC)的结合亲和力比已知的T细胞受体(例如，本文所述的Kite TCR)高。举例来说，结合蛋白对HPV16 E711-19肽-MHC(pMHC)的结合亲和力比已知的T细胞受体(例如，本文所述的Kite TCR)可高至少1.2倍、1.5倍、1.8倍、2.0倍、2.2倍、2.5倍、2.8倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、1000倍、5000倍、10000倍、50000倍、100000倍、500000倍、1000000倍或更多，或介于两者之间的任何范围(包括端点)，例如1.2倍至2倍。
在一些实施方案中，当与以某一水平或更低水平表达HPV16E711-19的靶细胞接触时，与已知的T细胞受体(例如，本文所述的Kite TCR)相比，结合蛋白诱导更高的T细胞扩增、细胞因子释放和/或细胞毒性杀伤。举例来说，在本文所述的任何方面的一些实施方案中，HPV16 E711-19水平可根据每百万的转录本表示，并且可例如小于或等于约1,000个转录本/百万转录本(TPM)、950TPM、900TPM、850TPM、800TPM、750TPM、700TPM、650TPM、600TPM、550TPM、500TPM、450TPM、400TPM、350TPM、300TPM、250TPM、200TPM、150TPM、100TPM、95TPM、90TPM、85TPM、80TPM、75TPM、70TPM、65TPM、60TPM、55TPM、50TPM、45TPM、40TPM、35TPM、34TPM、33TPM、32TPM、31TPM、30TPM、29TPM、28TPM、27TPM、26TPM、25TPM、24TPM、23TPM、22TPM、21TPM、20TPM、19TPM、18TPM、17TPM、16TPM、15TPM、14TPM、13TPM、12TPM、11TPM、10TPM、9TPM、8TPM、7TPM、6TPM、5TPM、4TPM、3TPM、2TPM和1TPM，或介于两者之间的任何范围(包括端点)，例如小于或等于约1,000TPM至小于或等于约35TPM)。在一些实施方案中，低HPV16 E711-19表达水平称为“杂合表达”，意指介于约1TPM与约35TPM之间，或之间的任何范围，包括端点，例如32TPM或1-32TPM。较高表达为36TPM剂更高。如本文进一步描述，TPM根据众所周知的技术测量，例如RNA-Seq，并且多种细胞系、组织类型等的基因表达TPM数据是本领域中众所周知的(参见例如万维网上portals.broadinstitute.org的布罗德研究院癌细胞系百科全书(Broad Institute Cancer Cell Line Encyclopedia，CCLE))。在一些实施方案中，当与表达HPV16 E711-19肽表位的靶细胞接触时，与已知的T细胞受体(例如本文所述的Kite TCR)相比，结合蛋白诱导T细胞扩增、细胞因子释放和/或细胞毒性杀伤增加至少1.2倍、1.5倍、1.8倍、2.0倍、2.2倍、2.5倍、2.8倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、1000倍或更多倍，或介于两者之间的任何范围(包括端点)，例如1.2倍至2倍。
在一些实施方案中，HPV16 E711-19的表达使用RNA测序(RNA-seq)来检测。RNA-seq一般包括以下步骤：获得含有遗传物质的样品，从获得的样品分离总RNA，从总RNA制备扩增的cDNA文库，对扩增的cDNA文库进行测序，并且对扩增的cDNA进行分析和剖析以评估不同转录本的表达水平。样品可以是细胞群体、组织样品、活检样品、细胞培养物或单细胞。可使用本领域已知的任何方法从生物样品分离总RNA。在某些实施方案中，总RNA是从血浆中提取的。血浆RNA提取描述于Enders等人,“The Concentration of CirculatingCorticotropin-Releasing Homer mRNA in Material Plasma Is Inclined inPreclampsia”,Clinr中。如其中所述，在离心步骤之后收集的血浆与Trizol LS试剂(Invitrogen)和氯仿混合。将混合物离心并将水层转移到新管中。向该水层中添加乙醇。接着将混合物置于RNeasy微型柱(Qiagen)中并根据制造商的建议进行加工。
在一些实施方案中，本文所述的RNA-seq包括从总RNA制备扩增的cDNA的步骤。例如，制备cDNA并且在不稀释的情况下随机扩增分离的RNA样品，或者将分离的RNA中的遗传物质混合物分散到各个反应样品中。在某些实施方案中，扩增在3'末端随机开始并且贯穿样品中的整个转录组以扩增mRNA和未多腺苷酸化的转录本。通过这种方式，对双链cDNA扩增产物进行优化，以产生用于下一代测序平台的测序文库。适用于通过本发明所涵盖的方法扩增cDNA的试剂盒包括例如RNA-Seq系统。
在一些实施方案中，本文所述的RNA-seq包括对扩增的cDNA进行测序的步骤。任何已知的测序方法均可用于对扩增的cDNA混合物进行测序，包括单分子测序方法。在某些实施方案中，通过全转录组鸟枪法测序对扩增的cDNA进行测序。全转录组鸟枪法测序可使用各种下一代测序平台进行，例如基因组分析平台、ABI SOLiDTM测序平台或LifeScience的454测序平台。
在一些实施方案中，本文所述的RNA-seq还包括对cDNA进行数位计数和分析。扩增样品中每个转录本的扩增序列数量可通过序列读取(每一扩增链读取一次)来定量。在一些实施方案中，每百万的转录本(TPM)用于定量特定转录本的表达水平。TPM可按照Wagner等人(2012)Theory in Biosciences 131:281-285中所示来计算，其内容通过引用的方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，结合蛋白不与肽-MHC(pMHC)复合物结合，任选地其中所述肽来源于SPTA1、MPL、HERC1、CPAMD8、INTS4、NUTM1或XM_00172256。
在一些实施方案中，结合蛋白不与SPTA1-、MPL-、HERC1-、CPAMD8-、INTS4-、NUTM1-和/或XM_00172256-肽-MHC(pMHC)复合物结合。
在一些实施方案中，本文提供的结合蛋白包括以下(例如，包含以下、基本上由以下组成或由以下组成)：a)与选自由表1中所列的TCRα序列组成的组的TCRα链序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的TCRα链序列；和/或b)与选自由表1中所列的TCRβ链序列组成的组的TCRβ链序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的TCRβ链序列。
在一些实施方案中，本文提供的结合蛋白包括以下(例如，包含以下、基本上由以下组成或由以下组成)：a)选自由表1中所列的TCRα链序列组成的组的TCRα链序列；和/或b)选自由表1中所列的TCRβ链序列组成的组的TCRβ链序列。
在一些实施方案中，本文提供的结合蛋白包括以下(例如，包含以下、基本上由以下组成或由以下组成)：a)与选自由表1中所列的TCR Vα结构域序列组成的组的TCRα链可变(Vα)结构域序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的TCRα链可变(Vα)结构域序列；和/或b)与选自由表1中所列的TCR Vβ结构域序列组成的组的TCRβ链可变(Vβ)结构域序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的TCRβ链可变(Vβ)结构域序列。
在一些实施方案中，本文提供的结合蛋白包括以下(例如，包含以下、基本上由以下组成或由以下组成)：a)选自由表1中所列的TCR Vα结构域序列组成的组的TCRα链可变(Vα)结构域序列；和/或b)选自由表1中所列的TCR Vβ结构域序列组成的组的TCRβ链可变(Vβ)结构域序列。
在一些实施方案中，本文提供的结合蛋白包括(例如，包含至少一种(例如，一种、两种或三种，例如单独CDR3或与CDR1和CDR2组合)、基本上由其组成或由其组成)与选自由表1中所列的TCRα链CDR序列组成的组的TCRα链CDR序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的TCRα链互补决定区(CDR)序列。认为CDR3是负责识别加工过的抗原的主要CDR，并且CDR1和CDR2主要与MHC相互作用，因此，在一些实施方案中，提供了包含单独的来自表1中所列的TCRα链的CDR3和/或单独的来自表1中所列的TCRβ链的CDR3的结合蛋白，每个CDR3具有如本段所述的序列同源性。
在一些实施方案中，本文提供的结合蛋白也可以包括(例如，包含至少一种(例如，一种、两种或三种，例如单独CDR3或与CDR1和CDR2组合)、基本上由其组成或由其组成)与选自由表1中所列的TCRβ链CDR序列组成的组的TCRβ链CDR序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的TCRβ链互补决定区(CDR)序列。如上文所述，认为CDR3是负责识别加工过的抗原的主要CDR，并且CDR1和CDR2主要与MHC相互作用，因此，在一些实施方案中，提供了包含单独的来自表1中所列的TCRβ链的CDR3和/或单独的来自表1中所列的TCRα链的CDR3的结合蛋白，每个CDR3具有如本段所述的序列同源性。
在一些实施方案中，本文提供的结合蛋白包括(例如，包含至少一种(例如，一种、两种或三种)、基本上由其组成或由其组成)表1中所列的TCRα链互补决定区(CDR)。
在一些实施方案中，本文提供的结合蛋白也可以包括(例如，包含至少一种(例如，一种、两种或三种)、基本上由其组成或由其组成)表1中所列的TCRβ链互补决定区(CDR)。
在一些实施方案中，本文提供的结合蛋白包括以下(例如，包含以下、基本上由以下组成或由以下组成)：与表1中所列的TCR Cα序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的TCRα链恒定区(Cα)序列。
在一些实施方案中，本文提供的结合蛋白也可以包括以下(例如，包含以下、基本上由以下组成或由以下组成)：与表1中所列的TCR Cβ序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的TCRβ链恒定区(Cβ)序列。
在一些实施方案中，本文提供的结合蛋白包括以下(例如，包含以下、基本上由以下组成或由以下组成)：选自由表1中所列的TCR Cα序列组成的组的TCRα链恒定区(Cα)序列。
在一些实施方案中，本文提供的结合蛋白也可以包括以下(例如，包含以下、基本上由以下组成或由以下组成)：选自由表1中所列的TCR Cβ序列组成的组的TCRβ链恒定区(Cβ)序列。
在一些实施方案中，本文所提供的结合蛋白包含嵌合、人源化、人类、灵长类动物或啮齿类动物(例如，大鼠或小鼠)恒定区。举例来说，人类可变区可与鼠科动物恒定区嵌合，或鼠科动物可变区可用人类恒定区和/或人类框架区人源化。在一些实施方案中，可使恒定区突变以修饰功能性(例如，在TCRα和β链中的相对残基位置中引入非天然存在的半胱氨酸取代以提供可用于增加TCRα与β链之间的亲和力的二硫键)。类似地，可在恒定区的跨膜结构域中进行突变以修饰功能性(例如，通过用疏水性氨基酸引入非天然存在的残基取代来增加疏水性)。在一些实施方案中，可对恒定区进行突变以增加细胞表面表达。
表1
E7-11-28WT序列(与“E7-11-28MGTM”相同的CDR)
α链：
TRAV25/TRAJ37/TRAC
α链DNA序列
α链蛋白质序列
β链：
TRBV2/TRBJ2-7/TRBC1
β链DNA序列
β链蛋白质序列
E7-11-176野生型序列
α链：
TRAV29DV5/TRAJ41/TRAC
α链DNA序列
α链蛋白质序列
β链：
TRBV24-1/TRBJ2-6/TRBC1
β链DNA序列
β链蛋白质序列
E7-11-194野生型序列
α链：
TRAV25/TRAJ37/TRAC
α链DNA序列
α链蛋白质序列
β链：
TRBV2/TRBJ2-7/TRBC1
β链DNA序列
β链蛋白质序列
E7-11-455野生型序列
α链：
TRAV12-3/TRAJ37/TRAC
α链DNA序列
α链蛋白质序列
β链：
TRBV7-9/TRBJ2-4/TRBC1
β链DNA序列
β链蛋白质序列
E7-11-28MGTM密码子优化序列(又称为“TCR28”或“28”或“TCR-200-A02”。在一些实施方案中，编码TCR的密码子优化α链和β链DNA序列可如表3中提供的载体，例如载体pNVVD160中所示使用。)
α链：
TRAV25/TRAJ37/MGTM修饰的TRAC
α链DNA序列
α链蛋白质序列
β链：
TRBV2/TRBJ2-7/MGTM修饰的TRBC
β链DNA序列
β链蛋白质序列
完整β和αORF DNA序列(“弗林蛋白酶(Furin)-P2A”位点中带下划线的斜体区域编码允许在单个盒中表达两条多肽链的序列”)
完整β和αORF蛋白质序列(“弗林蛋白酶-P2A”位点中带下划线的斜体区域允许在单个盒中表达两条多肽链”)”)
E7-11-176 MGTM密码子优化序列(又称为“TCR176”或“176”)
α链：
TRAV29DV5/TRAJ41/MGTM修饰的TRAC
α链DNA序列
α链蛋白质序列
β链：
TRBV24-1/TRBJ2-6/MGTM修饰的TRBC
β链DNA序列
β链蛋白质序列
完整β和αORF DNA序列(“弗林蛋白酶-P2A”位点中带下划线的斜体区域编码允许在单个盒中表达两条多肽链的序列”)
完整β和αORF蛋白质序列(“弗林蛋白酶-P2A”位点中带下划线的斜体区域允许在单个盒中表达两条多肽链”)”)
E7-11-194MGTM密码子优化序列(又称为“TCR194”或“194”)
α链：
TRAV25/TRAJ37/MGTM修饰的TRAC
α链DNA序列
α链蛋白质序列
β链：
TRBV2/TRBJ2-7/MGTM修饰的TRBC
β链DNA序列
β链蛋白质序列
完整β和αORF DNA序列(“弗林蛋白酶-P2A”位点中带下划线的斜体区域编码允许在单个盒中表达两条多肽链的序列”)
完整β和αORF蛋白质序列(“弗林蛋白酶-P2A”位点中带下划线的斜体区域允许在单个盒中表达两条多肽链”)”)
E7-11-455MGTM密码子优化序列(又称为“TCR455”或“455”)
α链：
TRAV12-3/TRAJ37/MGTM修饰的TRAC
α链DNA序列
α链蛋白质序列
β链：
TRBV7-9/TRBJ2-4/MGTM修饰的TRBC
β链DNA序列
β链蛋白质序列
完整β和αORF DNA序列(“弗林蛋白酶-P2A”位点中带下划线的斜体区域编码允许在单个盒中表达两条多肽链的序列”)
完整β和αORF蛋白质序列(“弗林蛋白酶-P2A”位点中带下划线的斜体区域允许在单个盒中表达两条多肽链”)”)
表2
Kite TCR序列(又称为“比较”)：
α链：
TRAV1-2/TRAJ7/密码子优化小鼠恒定α
α链DNA序列
α链蛋白质序列
β链：
TRBV5-6/TRBJ2-1/密码子优化小鼠恒定ββ链DNA序列
β链蛋白质序列
完整β和αORF DNA序列
完整β和αORF蛋白质序列
*表1提供了代表性TCR序列，所述TCR序列根据MHC血清型呈递分组并且根据MHC血清型呈递并由分小组的TCR结合的不同肽分小组。描述和要求个别TCR，例如表中代表性示例的那些TCR，以及结合单独或与MHC复合的本文所述的肽表位序列的结合蛋白种类，例如本文提供的表中分组的那些结合蛋白。此外，提供了本文所述的每条TCRα链的TRAV、TRAJ和TRAC基因，以及本文所述的每条TCRβ链的TRBV、TRBJ和TRBC基因。本文所述的每个TCR的序列作为每个命名TCR的同源α链和β链对提供。对本文描述的TCR序列进行注释。可变结构域序列大写。恒定结构域序列小写。CDR1、CDR2和CDR3序列使用粗体和带下划线的文字进行注释。CDR1、CDR2和CDR3按从左(N端)到右(C端)的标准出现顺序显示。本文所述的每条TCRα链的TRAV、TRAJ和TRAC基因，以及本文所述的每条TCRβ链的TRBV、TRBJ和TRBC基因根据本文所述的众所周知的IMGT命名法进行注释。类似地，TRAV和TRBV的CDR1和CDR2是本领域中众所周知的，因为它们基于众所周知并且注释的TRAV和TRBV序列(例如，如例如可在imt.org获得的IMGT和可在iedb.org获得的IEDB的数据库中所注释)。
表3
载体：pTSLV102-MSCV-E7-11-28-MGTM-Q-CD8-opt
tggaagggctaattcactcccaaagaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctacttccctgattagcagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaaggagagaacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatgggatggatgacccggagagagaagtgttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccggagtacttcaagaactgctgatatcgagcttgctacaagggactttccgctggggactttccagggaggcgtggcctgggcgggactggggagtggcgagccctcagatcctgcatataagcagctgctttttgcctgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcgccgaattaattcacaaatggcagtattcatccacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaatta caaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacaggCGcGCcagagatccagtttggacCTgcAGGTGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGtTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAATACATAACTGAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGTTAGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGCGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTtGCTTCTtGCTTCTGTTtGtGtGCTTCTGCTCCCtGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTtGGtGgGCCAGTCCTCtGATAGACTGtGTCcCCtGGaTACCCGTAcggtaccgctagcgccaccATGGATACCTGGCTCGTGTGTTGGGCCATCTTTAGCCTGCTGAAGGCCGGACTGACCGAGCCTGAAGTGACCCAGACTCCAAGCCATCAAGTGACTCAGATGGGGCAAGAAGTCATTCTGCGTTGCGTGCCCATCAGCAACCACCTGTACTTTTATTGGTATCGCCAGATCCTGGGCCAGAAAGTGGAATTCCTGGTGTCCTTCTACAACAATGAGATCTCCGAGAAGTCCGAGATCTTCGACGACCAGTTCTCCGTGGAAAGACCCGACGGCAGCAACTTCACACTGAAGATCCGGTCTACCAAACTTGAGGACTCCGCTATGTATTTTTGTGCAATCACAGGTCGCGTTTCATATGAGCAATATTTCGGGCCGGGCACCAGGCTCACGGTCACAGAAGATCTGAACAAGGTGTTCCCTCCAGAGGTGGCCGTGTTCGAGCCTTCTAAGGCCGAGATCGCCCACACACAAAAAGCCACCCTCGTGTGCCTGGCCACCGGCTTTTTCCCCGACCACGTGGAACTGTCTTGGTGGGTCAACGGCAAAGAGGTGCACTCCGGCGTGTCAACGGATCCCCAGCCTCTGAAAGAACAGCCTGCCCTGAACGACAGCCGGTACTGCCTGAGCTCCAGACTGAGAGTGTCCGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGGAACCACTTCAGATGCCAGGTGCAGTTTTACGGCCTGAGCGAGAACGACGAGTGGACCCAGGACAGAGCCAAGCCCGTGACACAAATCGTGTCTGCCGAAGCCTGGGGAAGAGCCGATTGCGGCATCACCAGCGCCTCCTATCACCAGGGCGTGCTGAG CGCCACAATCCTGTACGAAATCCTGCTGGGCAAGGCCACCCTGTACGCCGTGCTGGTGTCTGCTCTGGTGCTGATGGCCATGGTCAAGCGGAAGGACTTTGGCAGCGGCAGAGCCAAAAGGTCCGGGAGCGGTGCGACAAACTTTAGCCTGTTGAAACAAGCCGGCGACGTTGAAGAGAACCCCGGACCTATGCTGCTGATCACCTCCATGCTGGTGCTGTGGATGCAGCTGAGCCAAGTGAACGGCCAGCAAGTGATGCAGATCCCTCAGTACCAGCACGTGCAAGAAGGCGAGGACTTCACCACCTACTGCAACAGCAGCACCACACTGAGCAACATCCAGTGGTACAAGCAGCGGCCTGGCGGACACCCTGTGTTTCTGATCCAGCTGGTCAAGTCCGGCGAAGTGAAGAAGCAGAAGCGGCTGACCTTCCAGTTCGGCGAGGCCAAGAAGAACAGCAGCCTGCACATCACCGCCACACAGACCACAGATGTGGGCACCTACTTCTGCGCTGGCATCGGTAGCAGCAACACCGGTAAGCTCATCTTTGGGCAAGGGACAACTTTACAAGTAAAACCAGACATCCAGAACCCCGACCCCGCCGTGTACCAGCTGAGGGACTCCAAGTCCAGCGACAAGAGCGTGTGTCTGTTTACGGACTTCGACAGCCAGACCAACGTGAGTCAAAGCAAGGACAGCGACGTCTACATAACGGATAAGACCGTGCTGGACATGCGGAGCATGGACTTCAAGAGCAACAGCGCCGTGGCCTGGTCCAACAAGAGCGACTTCGCCTGCGCCAACGCCTTCAACAACAGCATCATCCCCGAGGACACCTTCTTCCCCAGCAGCGACGTGCCCTGCGACGTGAAACTGGTGGAGAAGTCCTTCGAGACAGACACCAATCTGAACTTTCAGAACCTGCTGGTGATCGTGCTGCGGATTCTGCTGCTGAAAGTGGCCGGCTTCAATCTGCTGATGACCCTGCGGCTGTGGAGCAGCAGGGCTAAGAGGTCCGGCAGCGGAGCCACCAATTTTTCCCTGCTGAAACAGGCTGGTGACGTGGAAGAAAACCCTGGCCCCATGGCGCTGCCCGTCACCGCGCTGCTGCTGCCCCTGGCGCTGCTGTTACACGCCGCTCGGCCAGAGCTTCCCACCCAGGGCACATTCTCCAACGTGTCCACCAATGTGTCGGGAGGCGGCGGATCGTCCCAGTTCAGAGTGTCCCCTCTGGACCGCACCTGGAACCTGGGCGAGACCGTGGAGCTGAAATGTCAGG TCCTGCTGAGCAACCCGACCTCCGGGTGCAGTTGGCTGTTCCAGCCGCGTGGTGCTGCCGCAAGCCCTACGTTCCTGCTTTACCTGAGCCAGAACAAGCCCAAGGCGGCCGAGGGCCTGGACACCCAGAGATTCTCCGGCAAGCGCCTGGGGGACACATTCGTGCTTACTTTGAGCGATTTCCGCAGAGAGAACGAGGGCTACTATTTCTGTTCGGCGCTGAGCAATTCCATCATGTATTTCAGCCACTTTGTGCCAGTGTTCCTGCCTGCCAAGCCTACCACAACACCAGCTCCCCGTCCCCCGACTCCGGCGCCTACCATCGCGAGTCAACCGTTGAGCCTGAGGCCTGAGGCTTGTCGGCCCGCTGCGGGGGGTGCCGTCCACACCAGGGGCCTCGACTTTGCGTGCGACATCTATATTTGGGCGCCTCTGGCGGGTACCTGCGGGGTGCTGCTGCTGTCATTGGTGATTACCCTGTACTGCAATCACCGCAACCGCCGGCGGGTCTGTAAGTGCCCACGGCCTGTGGTCAAGTCCGGTGACAAACCGTCGCTCTCGGCTCGCTACGTGCGCGCTAAGCGCAGCGGTTCCGGGGCCACCAACTTTTCATTGCTGAAGCAGGCCGGTGATGTGGAGGAGAATCCAGGGCCCATGCGCCCCAGGCTTTGGCTCCTTCTTGCTGCTCAGCTCACTGTCTTGCATGGCAACTCCGTTCTGCAGCAGACTCCCGCCTACATCAAGGTGCAGACGAACAAGATGGTGATGCTGTCATGCGAGGCCAAGATCTCTCTTTCAAATATGAGAATTTATTGGCTACGACAGCGCCAGGCCCCCTCCAGCGACAGCCACCACGAGTTCCTGGCGCTTTGGGATTCTGCTAAAGGCACCATCCATGGAGAGGAGGTGGAACAGGAGAAGATAGCTGTCTTCCGCGACGCATCCCGCTTCATCCTGAACCTGACCAGCGTGAAGCCGGAGGACAGCGGCATCTACTTCTGTATGATCGTTGGCTCCCCCGAGCTGACCTTCGGCAAAGGCACCCAGCTGTCCGTGGTGGACTTCCTGCCCACCACAGCCCAGCCAACCAAGAAATCCACCCTCAAGAAGCGCGTGTGCCGACTGCCCCGCCCTGAAACCCAGAAGGGCCCTCTGTGCTCCCCCATCACCCTTGGACTGCTGGTGGCGGGAGTCCTGGTGCTGCTCGTATCTCTGGGTGTCGCCATCCACCTGTGCTGCCGCCGCCGCCGCGCCCGCCTGAGGTTTATGAAACAGTTTTACAAGTGATAAatcgata gatcctaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctgagatcctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtagtagttcatgtcatcttattattcagtatttataacttgcaaagaaatgaatatcagagagtgagaggcccgggttaattaaggaaagggctagatcattcttgaagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtgttgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctt tttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatccCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCAAGCTCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCCGTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACATGATTACGAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCAACTGGATAACTCAAGCTAACCAAAATCATCCCAAACTTCCCACCCCATACCCTATTACCACTGCCAATTACCTGTGGTTTCATTTACTCTAAACCTGTGATTCCTCTGAATTATTTTCATTTTAAAGAAATTGTATTTGTTAAATATGTACTACAAACTtagtagt
载体：pHAGE-MSCV-E7-11-28-P2A-dnTGFbRII
载体：pNVVD154_TSC-200-A02_TCR-28_MSCV-TCR28-CD8-EF 1 a-TGFR-DHFR
pNVVD154_TSC-200-A02_TCR-28_MSCV-TCR28-CD8-EF1a-TGFR-DHFR载体图
图例：CD：分化簇。RNA-OUT：针对由sacB编码的细菌果聚糖蔗糖酶的反义RNA。SV：猿猴病毒。TCR：T细胞受体，TIR：末端反向重复序列，QBend：小鼠抗人CD34抗体，dnTGFbRII：显性负性TGFβ受体II，DHFR：二氢叶酸还原酶选择标志物
载体：pNVVD160_TSC-200-A02_TCR-28_MSCV-TCR28-CD8-EF1a-TGFR-DHFR
pNVVD160_TSC-200-A02_TCR-28_MSCV-TCR28-CD8-EF1a-TGFR-DHFR载体图
图例：CD：分化簇。RNA-OUT：针对由sacB编码的细菌果聚糖蔗糖酶的反义RNA。SV：猿猴病毒。TCR：T细胞受体，TIR：末端反向重复序列，QBend：小鼠抗人CD34抗体，dnTGFbRII：显性负性TGFβ受体II，DHFR：二氢叶酸还原酶选择标志物
*对于表3中的载体，注释如下：MSCV启动子为粗体。β链使用粗体和斜体文字注释。α链使用粗体和加下划线文字注释。Q标签使用斜体和加下划线文字注释。CD8-α为斜体。CD8-β加下划线。
*本文中的表1-3中包括肽表位，以及包含在全长上与表1-4中所列的任何SEQ IDNO的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更大同一性的氨基酸序列的多肽分子，或其一部分。这类多肽可具有本文进一步描述的全长肽或多肽的功能。
*表1-3中包括RNA核酸分子(例如，胸腺嘧啶用尿嘧啶置换)、编码所编码蛋白质的直系同源物的核酸分子，以及包含在全长上与表1-4中所列的任何序列的核酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更大同一性的核酸序列的DNA或RNA核酸序列，或其一部分。这类核酸分子可具有本文进一步描述的全长核酸的功能。
在一些实施方案中，本文所公开的结合蛋白可包含T细胞受体(TCR)、TCR的抗原结合片段或嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，本文所公开的结合蛋白可包含两条多肽链，其中每一条均包含可变区，所述可变区包含TCRα链的CDR3和TCRβ链的CDR3，或TCRα链和TCRβ链两者的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，结合蛋白包含单链TCR(scTCR)，其包含TCRVα和TCRVβ结构域两者，但仅包含单个TCR恒定结构域(Cα或Cβ)。术语“嵌合抗原受体”(CAR)是指一种融合蛋白，它被工程化成含有两个或更多个天然存在的氨基酸序列，所述序列以非天然存在或非天然存在于宿主细胞中的方式连接在一起，当存在于细胞表面上时，所述融合蛋白可用作受体。本发明所涵盖的CAR可包括细胞外部分，其包含抗原结合结构域(即，获自或源自免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，例如抗体或TCR，或者源自或获自来自NK细胞的杀伤免疫受体的抗原结合结构域)，所述抗原结合结构域与跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域(任选地含有共刺激结构域)连接(参见例如Sadelain等人(2013)CancerDiscov.3:388；Harris和Kranz(2016)TrendsPharmacol.Sci.37:220；和Stone等人(2014)Cancer Immunol.Immunother.63:1163)。
在一些实施方案中，1)TCRα链CDR、TCRVα结构域和/或TCRα链由选自表1中所列的TRAV、TRAJ和TRAC基因的组的TRAV、TRAJ和/或TRAC基因或它们的片段编码，和/或2)TCRβ链CDR、TCR Vβ结构域和/或TCRβ链由选自表1中所列的TRBV、TRBJ和TRBC基因的组的TRBV、TRBJ和/或TRBC基因或它们的片段编码，和/或3)与表1中所列的同源参考CDR序列相比，所述结合蛋白的每个CDR具有至多五个氨基酸取代、插入、缺失或它们的组合。
在一些实施方案中，本文所公开的结合蛋白(例如，TCR、TCR的抗原结合片段或嵌合抗原受体(CAR))为嵌合的(例如，包含来自多于一个供体或物种的氨基酸残基或基序)、人源化(例如，包含来自非人类生物体的残基，所述残基发生改变或被取代以降低人类的免疫原性风险)或人类的。
用于产生工程化的结合蛋白(例如TCR、CAR和其抗原结合片段)的方法是本领域中众所周知的(例如Bowerman等人(2009)Mol.Immunol.5:3000；美国专利No.6,410,319；美国专利No.7,446,191；美国专利公布No.2010/065818；美国专利No.8,822,647；PCT公布No.WO2014/031687；美国专利No.7,514,537；和Brentjens等人(2007)Clin.CancerRes.73:5426)。
在一些实施方案中，本文所述的结合蛋白是在细胞表面上表达的TCR或其抗原结合片段，其中与内源性TCR相比，细胞表面表达的TCR能够更有效地与CD3蛋白缔合。当在如T细胞的细胞的表面上表达时，与内源性结合蛋白(例如内源性TCR)相比，本发明所涵盖的结合蛋白(例如TCR)也可以具有更高的在细胞上的表面表达。在一些实施方案中，本文提供了一种CAR，其中CAR的结合结构域包含抗原特异性TCR结合结构域(参见例如Walseng等人(2017)Scientific Reports 7:10713)。
还提供了修饰的结合蛋白(例如，TCR、TCR的抗原结合片段或CAR)，其可根据众所周知的方法使用本文所公开的具有一个或多个Vα和/或Vβ序列的结合蛋白作为起始物质对修饰的结合蛋白进行工程化来制备，所述修饰的结合蛋白可具有与起始结合蛋白相比发生改变的特性。可通过修饰一个或两个可变区(即，Vα和/或Vβ)内，例如一个或多个CDR区内和/或一个或多个框架区内的一个或多个残基来对结合蛋白进行工程化。或者或另外，可通过修饰恒定区内的残基来对结合蛋白进行工程化。
另一类型的可变区修饰是使Vα和/或VβCDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基发生突变，由此改良所关注的结合蛋白的一种或多种结合特性(例如，亲和力)。可执行定点突变诱发或PCR介导的突变诱发以引入突变，并且可在如本文所述和实施例中所提供的体外、离体或体内测定中评估对蛋白结合或其它所关注的功能特性的影响。在一些实施方案中，可引入保守修饰(如上文所论述)。突变可以是氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施方案中，突变是取代。此外，通常CDR区内不超过一个、两个、三个、四个或五个残基被修饰。
在一些实施方案中，本文所述的结合蛋白(例如，TCR、TCR的抗原结合片段或CAR)相对于天然存在的TCR可具有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。在一些实施方案中，与表1中所列的同源参考CDR序列相比，结合蛋白的每个CDR具有至多五个氨基酸取代、插入、缺失或它们的组合。氨基酸的保守取代是众所周知的并且可天然存在或可在重组产生结合蛋白时引入。可使用本领域中已知的突变诱发方法将氨基酸取代、缺失和添加引入到蛋白质中(参见例如Sambrook等人(2001)Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY)。可采用寡核苷酸定点特异性(或区段特异性)突变诱发程序来提供改变的多核苷酸，所述改变的多核苷酸具有根据所需取代、缺失或插入发生改变的特定密码子。或者，可使用随机或饱和突变诱发技术，例如丙氨酸扫描突变诱发、易错聚合酶链反应突变诱发和寡核苷酸定向突变诱发来制备免疫原多肽变体(参见例如Sambrook等人,同上)。
一般技术人员已知的多种准则指示在肽或多肽中的特定位置处取代的氨基酸是否为保守的(或相似的)。举例来说，相似氨基酸或保守氨基酸取代是其中氨基酸残基经具有相似侧链的氨基酸残基置换的取代。相似氨基酸可包括于以下类别中：具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)；具有不带电极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、组氨酸)；具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；具有β-分支链侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。脯氨酸被视为较难以归类，它与具有脂肪族侧链的氨基酸(例如，亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和丙氨酸)共享特性。在一些实施方案中，用谷氨酰胺取代谷氨酸或用天冬酰胺取代天冬氨酸可被视为相似取代，因为谷氨酰胺和天冬酰胺分别是谷氨酸和天冬氨酸的酰胺衍生物。如本领域中应理解，通过对多肽的氨基酸序列和其保守氨基酸取代与第二多肽的序列进行比较来测定两种多肽之间的“相似性”(例如，使用GENEWORKSTM、Align、BLAST算法或本文中描述并且在本领域中实践的其它算法)。
在一些实施方案中，编码的结合蛋白(例如，TCR、TCR的抗原结合片段或CAR)可包含“信号肽”(又称为前导序列、前导肽或转运肽)。信号肽使新合成的多肽靶向其在细胞内部或外部的适当位置。在定位或分泌期间或者一旦定位或分泌已完成，可从多肽中去除信号肽。具有信号肽的多肽在本文中称作“前蛋白”并且已去除信号肽的多肽在本文中称作“成熟”蛋白或多肽。在一些实施方案中，本文所述的结合蛋白(例如，TCR、TCR的抗原结合片段或CAR)包含成熟Vα结构域、成熟Vβ结构域或两者。在一些实施方案中，本文所述的结合蛋白(例如，TCR、TCR的抗原结合片段或CAR)包含成熟TCRβ-链、成熟TCRα-链或两者。
在一些实施方案中，结合蛋白为融合蛋白，所述融合蛋白包含：(a)包含TCR或其抗原结合片段的细胞外组分；(b)包含效应结构域或其功能部分的细胞内组分；和(c)连接细胞外组分和细胞内组分的跨膜结构域。在一些实施方案中，融合蛋白能够与肽-MHC(pMHC)复合物结合(例如，特异性和/或选择性地)，所述肽-MHC复合物包含在MHC分子(例如，MHC I类分子)背景中的HPV16 E711-19免疫原性肽。在一些实施方案中，MHC分子包含MHCα链，所述链为HLA血清型HLA-A*02。在一些实施方案中，HLA等位基因选自由以下组成的组：HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0205、HLA-A*0206和HLA-A*0207等位基因。在特定实施方案中，HLA等位基因为HLA-A*0201。
如本文所用，“效应结构域”或“免疫效应结构域”是融合蛋白或受体的细胞内部分或结构域，当接收到适当的信号时，其可直接或间接促进细胞中的免疫反应。在一些实施方案中，效应结构域来自免疫细胞蛋白或其部分或免疫细胞蛋白复合物，当进行结合(例如，CD3ζ)时，或当所述免疫细胞蛋白或其部分或免疫细胞蛋白复合物直接与靶分子结合并触发免疫细胞中的效应结构域的信号转导时，所述效应结构域接收信号。
当效应结构域含有一个或多个信号传导结构域或基序，例如细胞内酪氨酸激活基序(ITAM)，例如在共刺激分子中发现的那些时，它可直接促进细胞反应。不希望受理论束缚，相信在T细胞受体或包含T细胞效应结构域的融合蛋白与配体衔接之后，ITAM可用于T细胞激活。在一些实施方案中，细胞内组分或其功能部分包含ITAM。示例性免疫效应结构域包括但不限于来自以下的那些结构域：CD3ε、CD3δ、CD3ζ、CD25、CD79A、CD79B、CARD11、DAP10、FcRα、FcRβ、FcRγ、Fyn、HVEM、ICOS、Lck、LAG3、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、Wnt、ROR2、Ryk、SLAMF1、Slp76、pTα、TCRα、TCRβ、TRIM、Zap70、PTCH2或它们的任何组合。在一些实施方案中，效应结构域包含淋巴细胞受体信号传导结构域(例如，CD3ζ或其功能部分或变体)。
在其它实施方案中，融合蛋白的细胞内组分包含选自以下的共刺激结构域或其功能部分：CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、CD2、CD5、ICAM-l(CD54)、LFA-l(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、GITR、CD30、CD40、BAFF-R、HVEM、LIGHT、MKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、与CD83结合(例如，特异性和/或选择性地)的配体或其功能变体，或它们的任何组合。在一些实施方案中，细胞内组分包含CD28共刺激结构域或其功能部分或变体(其可任选地包括在原生CD28蛋白的位置186-187处的LL-GG突变(例如，Nguyen等人(2003)Blood702:4320)、4-1BB共刺激结构域或其功能部分或变体，或两者。
在一些实施方案中，效应结构域包含CD3ε胞内结构域或其功能(例如，信号传导)部分，或其功能变体。在其它实施方案中，效应结构域包含CD27胞内结构域或其功能(例如，信号传导)部分，或其功能变体。在其它实施方案中，效应结构域包含CD28胞内结构域或其功能(例如，信号传导)部分，或其功能变体。在其它实施方案中，效应结构域包含4-1BB胞内结构域或其功能(例如，信号传导)部分，或其功能变体。在其它实施方案中，效应结构域包含OX40胞内结构域或其功能(例如，信号传导)部分，或其功能变体。在其它实施方案中，效应结构域包含CD2胞内结构域或其功能(例如，信号传导)部分，或其功能变体。在其它实施方案中，效应结构域包含CD5胞内结构域或其功能(例如，信号传导)部分，或其功能变体。在其它实施方案中，效应结构域包含ICAM-l胞内结构域或其功能(例如，信号传导)部分，或其功能变体。在其它实施方案中，效应结构域包含LFA-l胞内结构域或其功能(例如，信号传导)部分，或其功能变体。在其它实施方案中，效应结构域包含ICOS胞内结构域或其功能(例如，信号传导)部分，或其功能变体。
本发明所涵盖的细胞外组分和细胞内组分通过跨膜结构域连接。如本文所用，“跨膜结构域”是跨膜蛋白中可插入到细胞膜中或横跨细胞膜的部分。跨膜结构域具有三维结构，所述结构在细胞膜中热力学稳定并且长度一般介于约15个氨基酸至约30个氨基酸的范围内。跨膜结构域的结构可包含α螺旋、β桶、β折叠、β螺旋或它们的任何组合。在一些实施方案中，跨膜结构域包含或源自已知的跨膜蛋白(例如，CD4跨膜结构域、CD8跨膜结构域、CD27跨膜结构域、CD28跨膜结构域或它们的任何组合)。
在一些实施方案中，融合蛋白的细胞外组分还包含安置于结合结构域与跨膜结构域之间的接头。如本文中当提及融合蛋白中连接结合结构域与跨膜结构域的组分时所用，“接头”可以是具有约两个氨基酸至约500个氨基酸的氨基酸序列，其可以为通过接头连接的两个区域、结构域、基序、片段或模块之间的构形移动提供柔性和空间。举例来说，本发明所涵盖的接头可使结合结构域远离表达融合蛋白的宿主细胞的表面定位以使得能够实现宿主细胞与靶细胞之间的适当接触、抗原结合和激活(Patel等人(1999)Gene Therapy 6:412-419)。接头长度可基于所选靶分子、所选结合表位或抗原结合结构域捕获和亲和力而变化以使抗原识别增至最大(参见例如Guest等人(2005)Immu nother.28:203-11，和PCT公布No.WO 2014/031687)。示例性接头包括具有甘氨酸-丝氨酸氨基酸链的那些接头，所述甘氨酸-丝氨酸氨基酸链具有一个至约十个GlyxSery重复序列，其中x和y各自独立地为0至10的整数，其限制条件在于x和y不同时为0(例如，(Gly4S er)2、(Gly3Ser)2、Gly2Ser或它们的组合，例如((Gly3Ser)2Gly2Ser))。
在一些实施方案中，本发明涵盖的结合蛋白可与部分共价连接。在一些实施方案中，共价连接的部分包含亲和力标签或标记。亲和力标签可选自由以下组成的组：谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、钙调蛋白结合蛋白(CBP)、蛋白C标签、Myc标签、HaloTag、HA标签、Flag标签、His标签、生物素标签和V5标签。标记可以是荧光蛋白。在一些实施方案中，共价连接的部分选自由以下组成的组：致炎因子、抗炎剂、细胞因子、毒素、细胞毒性分子、放射性同位素或抗体，例如单链Fv。
结合蛋白可与用于成像、研究、治疗学、治疗诊断学、药学、化学疗法、螯合疗法、靶向药物递送和放射疗法的剂缀合。在一些实施方案中，结合蛋白可与可检测剂缀合或融合，所述可检测剂例如荧光团、近红外染料、对比剂、纳米粒子、含金属纳米粒子、金属螯合物、X射线对比剂、PET剂、金属、放射性同位素、染料、放射性核素螯合剂或可用于成像的另一合适材料。在一些实施方案中，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个可检测部分可连接到结合蛋白。放射性同位素的非限制性实例包括α发射体、β发射体、正电子发射体和γ发射体。在一些实施方案中，金属或放射性同位素选自由以下组成的组：锕、镅、铋、镉、铯、钴、铕、钆、铱、铅、镥、锰、钯、钋、镭、钌、钐、锶、锝、铊和钇。在一些实施方案中，金属为锕、铋、铅、镭、锶、钐或钇。在一些实施方案中，放射性同位素为锕-225或铅-212。在一些实施方案中，近红外染料不容易被生物组织和体液淬灭。在一些实施方案中，荧光团是发射波长在650nm与4000nm之间的电磁辐射的荧光剂，这类发射用于检测这类剂。可用作缀合分子的荧光染料的非限制性实例包括DyLight-680、DyLight-750、VivoTag-750、DyLight-800、IRDye-800、VivoTag-680、Cy5.5、ZQ800或吲哚青绿(ICG)。在一些实施方案中，近红外染料通常包括花青染料(例如，Cy7、Cy5.5和Cy5)。用作根据本发明的缀合分子的荧光染料的额外非限制性实例包括吖啶橙或吖啶黄、Alexa(例如，Alexa790、750、700、680、660和647)和其任何衍生物、7-放线菌素D、8-苯胺基萘-1-磺酸、染料和其任何衍生物、金胺-若丹明染色剂和其任何衍生物、苯蒽酮(bensantrhone)、比曼恩(bimane)、9-10-双(苯基乙炔基)蒽、5,12-双(苯基乙炔基)萘、双苯甲酰亚胺、脑彩虹、钙黄绿素、羧基荧光素和其任何衍生物、1-氯-9,10-双(苯基乙炔基)蒽和其任何衍生物、DAPI、DiOC6、和其任何衍生物、艾吡可酮(epicocconone)、溴化乙锭、Fluo dye和其任何衍生物、和其任何衍生物、荧光素和其任何衍生物、和其任何衍生物、和其任何衍生物、和其任何衍生物、荧光蛋白和其任何衍生物、m同种型蛋白和其任何衍生物(例如mCherry)、赫他明(hetamethine)染料和其任何衍生物、郝思特(hoeschst)染色剂、亚氨基香豆素、印度黄、indo-1和其任何衍生物、来若丹(laurdan)、荧光黄和其任何衍生物、荧光素和其任何衍生物、荧光素酶和其任何衍生物、部花青和其任何衍生物、尼罗染料(niledye)和其任何衍生物、苝、焰红染料(phloxine)、藻染料和其任何衍生物、碘化丙啶、比染因(pyranine)、若丹明和其任何衍生物、核糖绿、RoGFP、红萤烯、二苯乙烯和其任何衍生物、磺酰若丹明和其任何衍生物、SYBR和其任何衍生物、突触-pH敏感性绿色荧光蛋白(synapto-pHluorin)、四苯基丁二烯、tris四钠、德州红(Texas Red)、达旦黄(Titan Yellow)、TSQ、伞形酮、紫蒽酮、黄色荧光蛋白和YOYO-1。其它合适的荧光染料包括但不限于荧光素和荧光素染料(例如，异硫氰酸荧光素或FITC、萘基荧光素、4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素、6-羧基荧光素或FAM等)、羧花青、部花青、苯乙烯染料、氧杂菁染料(oxonol dye)、藻红蛋白、赤藓红、曙红、若丹明染料(例如，羧基四甲基-若丹明或TAMRA、羧基若丹明6G、羧基-X-若丹明(ROX)、丽丝胺若丹明B(lissamine rhodamine B)、若丹明6G、若丹明绿、若丹明红、四甲基若丹明(TMR)等)、香豆素和香豆素染料(例如，甲氧基香豆素、二烷基氨基香豆素、羟基香豆素、氨基甲基香豆素(AMCA)等)、Oregon GreenTM染料(例如，Oregon GreenTM488、Oregon GreenTM500、OregonGreenTM514等)、TexasTexasSPECTRUMSPECTRUM花青染料(例如，CY-3、Cy-5、CY-3.5、CY-5.5等)、Alexa染料(例如，Alexa350、Alexa488、Alexa532、Alexa546、Alexa568、Alexa594、Alexa633、Alexa660、Alexa680等)、染料(例如，FL、R6G、TMR、TR、530/550、558/568、564/570、576/589、581/591、630/650、650/665等)、IRDye(例如，IRD40TM、IRD 700TM、IRD 800TM等)等。本领域中众所周知额外合适的可检测剂(例如PCT公布No.PCT/US14/56177)。放射性同位素的非限制性实例包括α发射体、β发射体、正电子发射体和γ发射体。在一些实施方案中，金属或放射性同位素选自由以下组成的组：锕、镅、铋、镉、铯、钴、铕、钆、铱、铅、镥、锰、钯、钋、镭、钌、钐、锶、锝、铊和钇。在一些实施方案中，金属为锕、铋、铅、镭、锶、钐或钇。在一些实施方案中，放射性同位素为锕-225或铅-212。
结合蛋白可与放射增敏剂或光敏剂结合。放射增敏剂的实例包括但不限于：ABT-263、ABT-199、WEHI-539、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、吉西他滨(gemcitabine)、依他硝唑(etanidazole)、米索硝唑(misonidazole)、替拉扎明(tirapazamine)和核酸碱基衍生物(例如，卤化嘌呤或嘧啶，例如5-氟脱氧尿苷)。光敏剂的实例包括但不限于：发光时产生热的荧光分子或珠粒、纳米粒子、卟啉和卟啉衍生物(例如，二氢卟酚、细菌绿素(bacteriochlorin)、异细菌绿素、酞青和萘酞青)、金属卟啉、金属酞青、白芷素、硫属元素吡喃鎓染料(chalcogenapyrrillium dye)、叶绿素、香豆素、黄素和相关化合物(例如咯嗪和核黄素)、富勒烯(fullerene)、脱镁叶绿素酸(pheophorbide)、焦脱镁叶绿素酸、花青(例如，部花青540)、脱镁叶绿素、噻呋啉(sapphyrin)、特沙呋啉(texaphyrin)、紫红素(purpurin)、卟啉烯、吩噻嗪鎓(phenothiazinium)、亚甲蓝衍生物、萘二甲酰亚胺、尼罗蓝衍生物、醌类、苝醌(例如金丝桃素(hypericin)、竹红菌素(hypocrellin)和尾孢菌素(cercosporin))、补骨脂素(psoralen)、醌类、类视色素(retinoid)、若丹明、噻吩、威尔丁(verdin)、呫吨染料(xanthene dye)(例如曙红、赤藓红、孟加拉玫红(rosebengal))、卟啉的二聚物和低聚物形式，以及例如5-氨基乙酰丙酸的前药。有利地，该方法允许同时使用治疗剂(例如，药物)和电磁能(例如，辐射或光)两者高特异性靶向所关注细胞(例如，免疫细胞)。在一些实施方案中，结合蛋白与所述剂融合，或与所述剂共价或非共价连接，例如直接连接或经由接头连接。
在一些实施方案中，结合蛋白可被化学修饰。举例来说，可使结合蛋白发生突变以修饰肽特性，例如可检测性、稳定性、生物分布、药物动力学、半衰期、表面电荷、疏水性、缀合位点、pH、功能等。N-甲基化是可在本发明所涵盖的结合蛋白中发生的甲基化的一个实例。在一些实施方案中，可通过对游离胺进行甲基化，例如通过用甲醛和氰基硼氢化钠进行还原甲基化来修饰结合蛋白。
化学修饰可包含聚合物、聚醚、聚乙二醇、生物聚合物、两性离子聚合物、聚氨基酸、脂肪酸、树枝状聚合物、Fc区、简单饱和碳链(例如棕榈酸酯或肉豆蔻酸酯)或白蛋白。具有Fc区的结合蛋白的化学修饰可以是融合Fc-蛋白。聚氨基酸可包括例如具有重复的单个氨基酸的聚氨基酸序列(例如聚甘氨酸)，和具有可遵循或可不遵循一种模式的混合聚氨基酸序列的聚氨基酸序列，或前述的任何组合。
在一些实施方案中，本发明所涵盖的结合蛋白可被修饰。在一些实施方案中，所述修饰与亲本结合蛋白具有实质或显著序列同一性以产生维持亲本结合蛋白的一种或多种生物物理和/或生物学活性(例如，维持pMHC结合特异性)的功能变体。在一些实施方案中，突变为保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，本发明所涵盖的结合蛋白可包含合成氨基酸来替代一个或多个天然存在的氨基酸。这类合成氨基酸是本领域中众所周知的，并且包括例如氨基环己烷甲酸、正亮氨酸、a-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰氨基甲基-半胱氨酸、反式-3-羟基脯氨酸和反式-4-羟基脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、a-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、吲哚啉-2-甲酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N'-苯甲基-N'-甲基-赖氨酸、Ν',Ν'-二苯甲基-赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、a-氨基环戊烷甲酸、oc-氨基环己烷甲酸、a-氨基环庚烷甲酸、a-(2-氨基-2-降莰烷)-甲酸、α,γ-二氨基丁酸、β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和oc-叔丁基甘氨酸。
本发明所涵盖的结合蛋白可进行糖基化、酰胺化、羧化、磷酸化、酯化、N-酰化、环化(例如，经由二硫桥)，或转化为酸加成盐，和/或任选地二聚化或聚合或缀合。
在一些实施方案中，可使用疏水性部分的附接(例如附接到N端、C端或内部氨基酸)来延长本发明所涵盖的肽的半衰期。在其它实施方案中，结合蛋白可包括可影响例如血清半衰期的翻译后修饰(例如，甲基化和/或酰胺化)。在一些实施方案中，简单碳链(例如，通过肉豆蔻酰化和/或棕榈酰化)可与结合蛋白缀合。在一些实施方案中，简单碳链可使结合蛋白容易与未缀合材料分离。举例来说，可用于使结合蛋白与未缀合材料分离的方法包括但不限于溶剂萃取和反相色谱。亲脂部分可通过与血清白蛋白可逆结合来延长半衰期。缀合的部分可以是通过与血清白蛋白可逆结合来延长肽的半衰期的亲脂部分。在一些实施方案中，亲脂部分可以是胆固醇或胆固醇衍生物，包括胆甾烯、胆甾烷、胆甾二烯和氧化甾醇。在一些实施方案中，结合蛋白可与肉豆蔻酸(十四烷酸)或其衍生物缀合。在其它实施方案中，结合蛋白可与半衰期修饰剂偶合(例如，缀合)。半衰期修饰剂的实例包括但不限于：聚合物、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉、聚乙烯醇、水溶性聚合物、两性离子水溶性聚合物、水溶性聚(氨基酸)、脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸的水溶性聚合物、含有甘氨酸、谷氨酸和丝氨酸的水溶性聚合物、Fc区、脂肪酸、棕榈酸、或与白蛋白结合的分子。在一些实施方案中，间隔子或接头可与结合蛋白偶合，例如用作间隔子或接头的1个、2个、3个、4个或更多个氨基酸残基，以便促进与另一分子的缀合或融合，以及促进肽从这类缀合或融合的分子裂解。在一些实施方案中，结合蛋白可与例如可修饰或实现结合蛋白的特性的变化的其它部分缀合。
结合蛋白可例如通过固相肽合成或溶液相肽合成以重组或合成的方式产生。可通过已知的合成方法，例如使用芴基甲氧羰基(Fmoc)化学或通过丁氧羰基(Boc)化学来进行多肽合成。多肽片段可以酶促或以合成的方式接合在一起。
在本发明所涵盖的一方面，本文提供了产生本文所述的结合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在适合允许结合蛋白表达的条件下培养转化宿主细胞，所述宿主细胞已经通过包含编码所述结合蛋白的序列的核酸转化；以及(ii)回收所表达的结合蛋白。
举例来说，可用于分离和纯化重组产生的结合蛋白的方法可包括从将结合蛋白分泌到培养基中的合适宿主细胞/载体系统获得上清液，接着使用市售过滤器浓缩培养基。浓缩后，可将浓缩物应用于单一合适的纯化基质或一系列合适的基质，例如亲和力基质或离子交换树脂。可采用一个或多个逆相HPLC步骤来进一步纯化重组多肽。当从天然环境中分离免疫原时，也可以使用这些纯化方法。用于大规模制造本文所述的一种或多种结合蛋白的方法包括批量细胞培养，对其进行监测和控制以维持适当的培养条件。可根据本文中所描述并且在本领域中已知的方法来纯化结合蛋白。
在本文公开的任何实施方案中，编码的结合蛋白能够与包含在MHC分子(例如，MHCI类分子)背景中的HPV16 E711-19免疫原性肽的肽-MHC(pMHC)复合物结合。在一些实施方案中，MHC分子包含MHCα链，所述链为HLA血清型HLA-A*02。在一些实施方案中，HLA等位基因选自由以下组成的组：HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0205、HLA-A*0206和HLA-A*0207等位基因。
众所周知多种用于评估结合亲和力和/或确定结合分子是否与特定配体(例如，肽抗原-MHC复合物)结合(例如，特异性和/或选择性地)的测定。例如通过使用本领域中众所周知的多种结合测定中的任一者来测定结合蛋白对靶标(例如靶多肽的T细胞肽表位)的结合亲和力在熟练技术人员的水平内。举例来说，在一些实施方案中，可使用BiacoreTM机器来测定两种蛋白质之间的复合物的结合常数。可通过监测当缓冲液通过芯片时折射率相对于时间的变化来测定复合物的解离常数(KD)。用于测量一种蛋白质与另一蛋白质的结合的其它合适测定包括例如免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)，或通过通过荧光、UV吸收、圆二色性或核磁共振(NMR)监测蛋白质的光谱或光学特性的变化来测定结合。其它示例性测定包括但不限于蛋白质印迹法、ELISA、分析性超速离心、光谱分析和表面等离子体共振(BiacoreTM)分析(参见例如Scatchard等人(1949)Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660；Wilson(2002)Science 295:2103；Wolff等人(1993)CancerRes.53:2560；和美国专利No.5,283,173和5,468,614)、流式细胞术、测序和用于检测所表达的核酸的其它方法。在一实例中，通过使用标记的多聚体，例如MHC-抗原四聚体，例如通过流式细胞术评估与各种浓度的四聚体的结合来测量对靶标的表观亲和力。在一代表性实例中，使用一系列浓度的标记的四聚体的2倍稀释来测量结合蛋白的表观KD，接着通过非线性回归来确定结合曲线，确定表观KD为产生半最大结合的配体浓度。
III.核酸和载体
在本发明所涵盖的一方面，本文提供了核酸分子，所述核酸分子编码本文所述的结合蛋白(例如，TCR、TCR的抗原结合片段、CAR等)、肽和它们的片段。
在一些实施方案中，核酸分子在严格条件下与例如在全长上与编码选自由表1中所列的多肽序列组成的组的多肽的核酸具有至少约至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列的补体杂交。
在一些实施方案中，核酸分子在严格条件下与编码选自由表1中所列的多肽序列组成的组的多肽的核酸的补体杂交。
在一些实施方案中，核酸分子包含编码选自由表1中所列的多肽序列组成的组的多肽的核苷酸序列(例如，包含其、基本上由其组成或由其组成)。
在一些实施方案中，核酸包含编码至少一种(例如，一种、两种或三种)表1中所述的TCRα链CDR的核苷酸序列(例如，包含其、基本上由其组成或由其组成)。在一些实施方案中，核酸包含编码具有与表1中所述的TCRVα结构域序列至少约至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的TCR Vα结构域的核苷酸序列(例如，包含其、基本上由其组成或由其组成)。在一些实施方案中，核酸包含编码具有与表1中所述的TCRα链序列至少约至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的TCRα链的核苷酸序列(例如，包含其、基本上由其组成或由其组成)。
在一些实施方案中，核酸包含编码至少一种(例如，一种、两种或三种)表1中所述的TCRβ链CDR的核苷酸序列(例如，包含其、基本上由其组成或由其组成)。在一些实施方案中，核酸包含编码具有与表1中所述的TCRVβ结构域序列至少约至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的TCR Vβ结构域的核苷酸序列(例如，包含其、基本上由其组成或由其组成)。在一些实施方案中，核酸包含编码具有与表1中所述的TCRβ链序列至少约至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列的TCRβ链的核苷酸序列(例如，包含其、基本上由其组成或由其组成)。
术语“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，并且通常意指DNA或RNA的聚合物，其可为单链或双链，从天然来源合成或获得(例如，分离和/或纯化)，其可含有天然、非天然或改变的核苷酸，并且可含有天然、非天然或改变的核苷酸间键，例如氨基磷酸酯键或硫代磷酸酯键，而不是在未修饰的寡核苷酸的核苷酸之间发现的磷酸二酯。在一个实施方案中，核酸包含互补DNA(cDNA)。
在一些实施方案中，本发明所涵盖的核酸为重组的。如本文所用，术语“重组”是指(i)通过将天然或合成核酸区段与可在活细胞中复制的核酸分子接合而在活细胞外构建的分子，或(ii)由上面(i)中描述的那些分子的复制产生的分子。出于本文的目的，复制可以是体外、离体复制或体内复制。
可使用本领域已知的程序基于化学合成和/或酶促连接反应构建核酸。例如参见Green和Sambrook等人,上述。举例来说，可使用天然存在的核苷酸或各种修饰的核苷酸化学合成核酸，这些核苷酸被设计用于提高分子的生物学稳定性或提高杂交后形成的双链体的物理稳定性(例如硫代磷酸酯衍生物和被吖啶取代的核苷酸)。可用于产生核酸的修饰的核苷酸的实例包括但不限于5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-取代的腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。或者，本发明所涵盖的一种或多种核酸可购自公司，例如Integrated DNA Technologies(Coralville,IA)。
在一个实施方案中，核酸包含密码子优化的核苷酸序列。不受特定理论或机制的束缚，认为核苷酸序列的密码子优化提高mRNA转录本的翻译效率。核苷酸序列的密码子优化可能涉及将天然密码子取代为另一个编码相同氨基酸，但可由细胞内更容易获得的tRNA翻译的密码子，从而提高翻译效率。核苷酸序列的优化也可以减少会干扰翻译的二级mRNA结构，从而提高翻译效率。在一些实施方案中，本文所述的核苷酸序列针对在宿主细胞(例如，免疫细胞，例如T细胞)中的表达进行密码子优化。
本发明还提供了一种核酸，所述核酸包含与本文所述的任何核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列或在严格条件下与本文所述的任何核酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
在严格条件下杂交的核苷酸序列可在高严格条件下杂交。“高严格条件”意指核苷酸序列以比非特异性杂交可检测地强的量与靶序列(本文所述的任何核酸的核苷酸序列)特异性地杂交。高严格条件包括将具有精确互补序列的多核苷酸或仅含有少数分散错配的多核苷酸与恰好具有与核苷酸匹配的几个小区域(例如，3-10个碱基)的随机序列区分开来的条件。与14-17个或更多个碱基的全长补体相比，这类互补的小区域更容易融化，并且高严格杂交使其易于区分。相对高的严格条件将包括例如低盐和/或高温条件，例如由约0.02-0.1M NaCl或等效物在约50-70℃的温度下提供。这类高严格条件几乎不容许核苷酸序列与模板或靶链之间的错配，并且特别适合检测任何本发明的TCR的表达。普遍理解，通过添加递增量的甲酰胺可使条件变得更加严格。
本发明还提供了一种核酸，所述核酸包含与本文所述的任何核酸至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的核苷酸序列。
通常，所述核酸为DNA或RNA分子，其可包括于合适的载体，例如质粒、粘质粒、游离基因、人工染色体、噬菌体或病毒载体中。
术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”意指可将DNA或RNA序列(例如，外来基因)引入到宿主细胞中，以便将宿主转化并且促进所引入序列的表达(例如，转录和翻译)的媒介物。因此，本发明所涵盖的另一目标涉及一种包含本发明所涵盖的核酸的载体。
这类载体可包含调控元件，例如启动子、增强子、终止子等，以在向受试者施用后引起或引导所述多肽的表达。用于动物细胞表达载体中的启动子和增强子的实例包括SV40的早期启动子和增强子(Mizukami T等人1987)、莫洛尼小鼠白血病病毒的LTR启动子和增强子(Kuwana Y等人1987)、免疫球蛋白H链的启动子(Mason J O等人1985)和增强子(Gillies SD等人1983)等。
可使用任何动物细胞表达载体。合适载体的实例包括pAGE107(Miyaji H等人1990)、pAGE103(Mizukami T等人1987)、pHSG274(Brady G等人1984)、pKCR(O'Hare K等人1981)、pSG1βd2-4-(Miyaji H等人1990)等。质粒的其它代表性实例包括包含复制起点的复制质粒，或整合质粒，例如pUC、pcDNA、pBR等。病毒载体的代表性实例包括腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒和AAV载体。这类重组病毒可通过本领域中已知的技术产生，例如通过转染包装细胞或通过用辅助质粒或病毒瞬时转染产生。病毒包装细胞的典型实例包括PA317细胞、PsiCRIP细胞、GPenv阳性细胞、293细胞等。用于产生这类复制缺陷型重组病毒的详细方案是本领域中众所周知的并且可见于例如PCT公布WO 95/14785、PCT公布WO 96/22378、美国专利No.5,882,877、美国专利No.6,013,516、美国专利No.4,861,719、美国专利No.5,278,056和PCT公布WO 94/19478。
在一些实施方案中，表达载体为纳米质粒。本文中使用的术语“纳米质粒”是指具有减少的细菌序列的环状DNA序列，它为所需载物插入物提供较小的质粒。载体的尺寸减小引起转染时DNA诱发的毒性有限且可能在细胞中持续更长时间，可能在细胞中持续更长时间，可能在转染之后活力更佳，并且可能易位效率更高。在一些实施方案中，纳米质粒为无抗生素抗性标志物的纳米质粒。在一些实施方案中，纳米质粒包含选择标志物和/或无义抑制基因标志物。由于骨架尺寸小，例如<500bp骨架，所以这类纳米质粒最大化所需载物插入物的尺寸。所需载物插入物(例如真核转基因)可以是可递送到靶细胞的任何尺寸，例如至多50kb、45kb、40kb、35kb、30kb、25kb、20kb、18kb、15kb、12kb、10kb、5.0kb、4.5kb、4.0kb、3.5kb、3.0kb、2.8kb、2.5kb、2.2kb、2kb、1.8kb、1.5kb、1.2kb、1kb或之间的任何范围，包括端点，例如8-12kb。其还提供高转基因表达并且减少转基因沉默，使与载物在工程化细胞的基因组中的随机整合相关的载物的整合效率可调。
在一些实施方案中，纳米质粒可包含表3中提供的载体中所示的元件(例如R6K和RNA-OUT)。举例来说，在一些实施方案中，纳米质粒包含最小化的细菌ColE1或R6K复制起点(其使这类纳米质粒在细菌宿主菌株中可复制)、选择性标志物(例如细菌RNA选择性标志物)和真核基因区。RNA选择性标志物为载体负载的表达的非翻译RNA，其调节染色体表达的靶基因，以选择所述载体。这可以是质粒负载的无义抑制tRNA，其调节无义可抑制的可选择染色体靶标，例如美国专利No.6,977,174中描述并且以引用的方式并入本文中。这也可以是质粒负载的反义抑制RNA、抑制RNA-IN调节的靶标的RNA-OUT基因、抑制RNAII调节的靶标的pMB1质粒起点编码的RNAI、抑制RNA II调节的靶标的IncB质粒pMU720起点编码的RNAI、抑制Hok调节的靶标的质粒RI的ParB基因座Sok、抑制flmA调节的靶标的F质粒的Flm基因座FlmB、如例如Wagner等人(2002)Adv.Genet.46:361和Franch和Gerdes(2000)CurrentOpin.Microbiol.3:159中描述的天然反义抑制RNA或工程化的抑制RNA，例如小的合成小RNA，如SgrS、MicC或MicF骨架，如Park等人(2013)Nature Biotechnology 31:170-174中所述。
由无抗生素的RNA-OUT选择系统和制造这类纳米质粒的方法产生的示例性纳米质粒描述于例如PCT公布No.WO 2008153733、美国专利No.9,737,620、美国专利公布No.2010/0303859和美国专利No.9,109,012，以引用的方式整体并入本文中。另外的示例性纳米质粒描述于例如PCT申请No.PCT/US2013/000259、PCT/US2013/00067和PCT/US2013/00068以及美国专利公布No.2015/0275221，每一者以引用的方式整体并入本文中。
纳米质粒可购得。举例来说，Nature Technology公司(Aldevron子公司)提供纳米质粒载体，其将RNA选择性标志物与R6K、ColE2或ColE2相关的复制起点组合。这些纳米质粒载体包括例如NTC9385C、NTC9685C、NTC9385R、NTC9685R载体以及它们的修饰，例如PCT申请No.PCT/US13/00068中公开的那些载体；NTC9385R-BE、NTC9385Ra-O1和NTC9385Ra-O2载体，例如美国专利No.10,144,935中所述；以及NTC9385C2、NTC9385C2a、NTC9385R2、NTC9385R2a、NTC9385R2b、NTC9385Ra、NTC9385RaF和NTC9385RbF复制型小环载体，例如美国专利公布No.2021/0189407中所述，每一者以引用的方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，组合物包含表达载体，所述表达载体包含编码本文所述的结合蛋白或多肽或其片段的开发阅读框。在一些实施方案中，核酸包括表达开发阅读框所必需的调控元件。这类元件可包括例如启动子、起始密码子、终止密码子和多腺苷酸化信号。另外，可包括增强子。这些元件可操作地连接到编码结合蛋白、多肽或其片段的序列。
在一些实施方案中，载体还包含编码CD8α、CD8β、显性负性TGFβ受体(例如DN-TGFβRII)、选择性蛋白标志物的核酸序列，任选地其中所述选择性蛋白标志物为二氢叶酸还原酶(DHFR)。在某些实施方案中，编码CD8α、CD8β、DN-TGFβR和/或选择性蛋白标志物的核酸序列可操作地连接到编码标签(例如，CD34富集标签)的核酸。在特定实施方案中，本文所述的核酸序列，例如编码TCRα、TCRβ、CD8α、CD8β、DN-TGFβR和/或选择性蛋白标志物的核酸序列与内部核糖体进入位点或编码自裂解肽(例如P2A、E2A、F2A或T2A)的核酸序列等相互连接。
在一些实施方案中，本文提供的表达载体包含与SEQ ID NO.27中所示的任何核酸至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的核苷酸序列。
启动子的实例包括但不限于来自猿病毒40(SV40)的启动子；小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子；来自人类免疫缺陷病毒(HIV)的启动子，例如HIV长末端重复序列(LTR)启动子；来自莫洛尼病毒的启动子；来自巨细胞病毒(CMV)的启动子，例如CMV立即早期启动子；来自爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein Barr Virus，EBV)的启动子；来自劳斯肉瘤病毒(RousSarcomaVirus，RSV)的启动子；以及来自例如人类肌动蛋白、人类肌凝蛋白、人类血红蛋白、人类肌肉肌酸和人类金属硫蛋白的人类基因的启动子。合适的多腺苷酸化信号的实例包括但不限于SV40多腺苷酸化信号和LTR多腺苷酸化信号。
除表达所需的调控元件以外，核酸分子中也可以包括其它元件。这类另外的元件包括增强子。增强子包括上文所述的启动子。在一些实施方案中，增强子/启动子包括例如人类肌动蛋白、人类肌凝蛋白、人类血红蛋白、人类肌肉肌酸和病毒增强子，例如来自CMV、RSV和EBV的那些增强子/启动子。
在一些实施方案中，核酸可操作地并入如下文进一步描述的载剂或递送载体中。可用递送载体包括但不限于生物可降解微胶囊、免疫刺激复合物(ISCOM)或脂质体以及进行基因工程化的减毒活载剂，例如病毒或细菌。
在一些实施方案中，载体为病毒载体，例如慢病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘苗病毒、杆状病毒、鸡痘(Fowl pox)病毒、禽痘(AV-pox)病毒、修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒和其它重组病毒。举例来说，慢病毒载体可用于感染T细胞。
在一些实施方案中，重组表达载体能够将多核苷酸递送到合适的宿主细胞，例如T细胞或抗原呈递细胞，即在其细胞表面上展示肽/MHC复合物并且缺乏CD8的细胞(例如，树突状细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞为免疫细胞，例如人类免疫系统细胞。例如，免疫系统细胞可以是CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD4/CD8双阴性T细胞、gd T细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞或它们的任何组合。在一些实施方案中，其中T细胞为宿主，T细胞可为初始T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞或它们的任何组合。因此，重组表达载体也可以包括例如淋巴组织特异性转录调控元件(TRE)，例如B淋巴细胞、T淋巴细胞或树突状细胞特异性TRE。淋巴组织特异性TRE是本领域中已知的(参见例如Thompson等人(1992)Mol.Cell.Biol.72:1043；Todd等人(1993)J.Exp.Med.777:1663；和Penix等人(1993)J.Exp.Med.775:1483)。
在一些实施方案中，重组表达载体包含编码TCRα链、TCRβ链和/或连接肽的核苷酸序列。例如，在一些实施方案中，重组表达载体包含编码结合蛋白的全长TCRα和TCRβ链(其中接头位于之间)的核苷酸序列，其中编码β链的核苷酸序列位于编码α链的核苷酸序列的5'。在一些实施方案中，核苷酸序列编码全长TCRα和TCRβ链(其中接头位于之间)，其中编码TCRβ链的核苷酸序列位于编码TCRα链的核苷酸序列的3'。在一些实施方案中，全长TCRα和/或TCRβ链经其片段替换。
如下进一步所述，本发明所涵盖的另一方面涉及一种已经被根据本发明的核酸和/或载体转染、感染或转化的细胞。宿主细胞可包括任何可接受载体或并入核酸和/或蛋白质的个别细胞或细胞培养物，以及任何子代细胞。该术语还涵盖宿主细胞的后代，无论在遗传学上或表型上相同还是不同。合适的宿主细胞可取决于载体，并且可包括哺乳动物细胞、动物细胞、人类细胞、猿细胞、昆虫细胞、酵母细胞和细菌细胞。这些细胞可通过使用病毒载体、经由磷酸钙沉淀转化、DEAE-葡聚醣、电穿孔、显微注射或其它方法来诱导并入载体或其它材料(参见例如Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual第2版(Cold Spring Harbor Laboratory))。术语“转化”意指将“外来”(即，外部或细胞外)基因、DNA或RNA序列引入宿主细胞，使得宿主细胞将表达所引入的基因或序列，从而产生所需物质，通常为由所引入的基因或序列编码的蛋白质或酶。接受并且表达所引入的DNA或RNA的宿主细胞已经被“转化”。
举例来说，在一些实施方案中，工程化免疫细胞(例如T细胞)可包含如下全T细胞(CD4+与CD8+ T细胞)，其通过转座子/转座酶介导的基因递送进行工程化以表达编码例如重组T细胞受体(TCR)的α和β链的元件的遗传载物，所述重组T细胞受体对特定MHC上呈递的既定靶抗原(例如I类HLA)具有特异性。载体可表达另外的元件，例如选自由以下组成的组的一个或多个元件：a)能够接合CD4+ T细胞的CD8α和CD8β共受体；b)与CD8α的氨基端融合的CD34来源的QBEND/10表位标签以能够在体外和体内追踪工程化细胞；c)显性负性II型TGFβ受体(DN-TGFβRII)以克服肿瘤介导的免疫抑制；和d)选择标志物，例如二氢叶酸还原酶(DHFRdm)的突变形式，以在制造过程期间便于富集工程化细胞。外源TCR的α和β链和CD8的α和β链可在单一启动子(例如鼠科干细胞病毒(MSCV)启动子)控制下由单一mRNA分子编码。在自裂解肽元件(例如P2A位点)处的翻译后加工可产生独立的多肽，例如产生与载体中的每个元件对应的四种个别多肽。类似地，DN-TGFβRII和DHFRdm可由单一启动子(例如人类延伸因子1α(EF1α)启动子)驱动的单一mRNA分子编码。在自裂解肽元件(例如P2A位点)处的翻译后加工可产生与载体中的每一个别元件对应的独立多肽。
本发明所涵盖的核酸可用于在合适的表达系统中产生本发明所涵盖的重组多肽。术语“表达系统”意指在合适条件下例如表达由载体所携带并且引入到宿主细胞的外来DNA编码的蛋白质的宿主细胞和相容性载体。
常见的表达系统包括大肠杆菌宿主细胞和质粒载体、昆虫宿主细胞和杆状病毒载体以及哺乳动物宿主细胞和载体。宿主细胞的其它实例包括但不限于原核细胞(例如细菌)和真核细胞(例如酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等)。特定实例包括大肠杆菌；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)或酵母属(Saccharomyces)酵母；哺乳动物细胞系(例如，Vero细胞、CHO细胞、3T3细胞、COS细胞等)；以及原代或所建立的哺乳动物细胞培养物(例如，由淋巴母细胞、成纤维细胞、胚胎细胞、上皮细胞、神经细胞、脂肪细胞等产生)。实例还包括小鼠SP2/0-Ag14细胞(ATCC CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653细胞(ATCC CRL1580)、二氢叶酸还原酶基因(下文称为“DHFR基因”)缺陷型CHO细胞(Urlaub G等人(1980))、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16A g.20细胞(ATCC CRL 1662，下文称为“YB2/0细胞”)等。在一些实施方案中，使用YB2/0细胞，因为当在该细胞中表达时，嵌合或人源化结合蛋白的ADCC活性有所增强。
本发明还涵盖产生表达本发明所涵盖的结合蛋白、肽和其片段的重组宿主细胞的方法，所述方法包括由以下组成的步骤：(i)将如上文所述的重组核酸或载体体外或离体引入到胜任宿主细胞中，(ii)体外或离体培养所获得的重组宿主细胞，和(iii)任选地，选择表达所述结合蛋白、肽和其片段的细胞。这类重组宿主细胞可用于本发明所涵盖的诊断、预后和/或治疗方法。
在另一方面，本发明提供了分离的核酸，其在选择性杂交条件下与本文所公开的多核苷酸杂交。因此，该实施方案的多核苷酸可用于分离、检测和/或定量包含这类多核苷酸的核酸。举例来说，本发明所涵盖的多核苷酸可用于鉴定、分离或扩增寄存文库中的部分或全长克隆。在一些实施方案中，多核苷酸为从人类或哺乳动物核酸文库分离或以其它方式与来自所述文库的cDNA互补的基因组序列或cDNA序列。在一些实施方案中，cDNA文库包含至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多，或介于两者之间的任何范围(包括端点)，例如至少约80％-100％的全长序列。可将cDNA文库归一化以增加稀有序列的表示。低严格或中等严格杂交条件通常但不限于用于相对于互补序列具有降低的序列同一性的序列。中等严格和高严格条件可任选地用于具更高同一性的序列。低严格条件允许具有约70％序列同一性的序列的选择性杂交，并且可用于鉴定直系同源或旁系同源序列。任选地，本发明所涵盖的多核苷酸将编码由本文所述的多核苷酸编码的结合蛋白的至少一部分。本发明所涵盖的多核苷酸包括可用于与编码本发明所涵盖的结合蛋白的多核苷酸选择性杂交的核酸序列(参见例如Ausubel,上述和Colligan,上述)。
IV.宿主细胞
在本发明所涵盖的一方面，本文提供了宿主细胞，所述宿主细胞表达本文所述的结合蛋白(例如，TCR、TCR的抗原结合片段、CAR或包含TCR和效应结构域的融合蛋白)。在一些实施方案中，宿主细胞包含本文所述的核酸或载体。
在一些实施方案中，编码结合蛋白的多核苷酸用于转化、转染或转导宿主细胞(例如，T细胞)以用于过继性转移疗法。已描述了核酸测序和特定TCR测序的进展(例如，Robins等人(2009)Blood114:4099；Robins等人(2010)Sci.Translat.Med.2:47ra64；Robins等人(2011)J.Imm.Meth.；和Warren等人(2011)Genome Res.21:790)并且可在实践本发明所涵盖的实施方案的过程中采用。类似地，用所需核酸转染或转导T细胞的方法是本领域中众所周知的(例如，美国专利公布No.US2004/0087025)以及使用具有所需抗原特异性的T细胞的过继性转移程序(例如，Schmitt等人(2009)Hum.Gen.20:1240；Dossett等人(2009)Mol.Ther.77:742；Till等人(2008)Blood772:2261；Wang等人(2007)Hum.Gene Ther.18:112；Kuball等人(2007)Blood 709:2331；美国专利公布2011/0243972；美国专利公布2011/0189141；和Leen等人(2007)Ann.Rev.Immunol.25:243)。
可修饰任何合适的免疫细胞以包括本发明所涵盖的异源多核苷酸，包括例如T细胞、NK细胞或NK-T细胞。在一些实施方案中，细胞可以是原代细胞或细胞系的细胞。在一些实施方案中，修饰的免疫细胞包含CD4+ T细胞、CD8+ T细胞或两者。出于本文的目的，T细胞可以是任何T细胞，例如培养的T细胞，例如原代T细胞，或来自培养的T细胞系的T细胞，例如Jurkat、SupTl等，或从哺乳动物获得的T细胞。如果从哺乳动物获得，则T细胞可从多种来源获得，包括但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其它组织或体液。T细胞也可以富集或纯化。在一些实施方案中，T细胞为人T细胞。在一些实施方案中，T细胞为从人分离的T细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞，并且可处于任何发育阶段，包括但不限于细胞毒性淋巴细胞、细胞毒性淋巴细胞前体细胞、细胞毒性淋巴细胞祖细胞、细胞毒性淋巴细胞干细胞、CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助T细胞(例如Th1和Th2细胞)、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、记忆T细胞(例如中央记忆T细胞和效应记忆T细胞)、初始T细胞等。
任何合适的方法都可用于转染或转导细胞，例如T细胞，或施用本文所述的方法所涵盖的核苷酸序列或组合物。将多核苷酸递送到宿主细胞的方法包括例如使用阳离子聚合物、类脂分子和某些商业产品，例如in其它方法包括离体转导、注射、电穿孔、DEAE-葡聚醣、声波加载、脂质体介导的转染、受体介导的转导、微粒轰击、转座子介导的转移等。转染或转导宿主细胞的更进一步的方法采用载体，在本文中进一步详细描述。
如本文所述的修饰的免疫细胞可使用用于测定T细胞活性的方法进行功能表征，包括测定T细胞结合、激活或诱导，并且还包括测定抗原特异性T细胞反应。实例包括测定T细胞增殖、T细胞的细胞因子释放、抗原特异性T细胞刺激、MHC限制性T细胞刺激、CTL活性(例如，通过检测预加载靶细胞的51Cr释放)、T细胞表型标志物表达的变化以及T细胞功能的其它量度。
进行这些和类似测定的程序可见于例如Lefkovits(Immunology MethodsManual:Hie Comprehensive Sourcebook of Techniques,1998)，以及CurrentProtocolsin Immunology,Weir,(1986)Handbookof Experimental Immunology,BlackwellScientific,Boston,MA；Mishell和Shigii(编辑)(1979)Selected Methods in CellularImmunology,Freeman Publishing,San Francisco,CA；Green和Reed(1998)Science281:1309，以及其中引用的参考文献。
在一些实施方案中，可通过评估与不同浓度的MHC多聚体的结合来测量对结合蛋白(例如TCR或其抗原结合部分)的表观亲和力。“MHC-肽多聚体染色”是指用于检测抗原特异性T细胞的测定法，在一些实施方案中，其特征在于MHC分子的四聚体，每种MHC分子包含具有与至少一种抗原同源(例如，相同或相关)的氨基酸序列的相同肽(例如，HPV16 E711-19免疫原性肽)，其中复合物能够与识别同源抗原的结合蛋白，例如TCR或其抗原结合部分结合。每种MHC分子均可用生物素分子标记。生物素化MHC/肽可通过添加链霉亲和素进行多聚化(例如四聚化)，链霉亲和素可进行荧光标记。
多聚体可通过流式细胞术经由荧光标记进行检测。在一些实施方案中，pMHC多聚体测定用于检测或选择本发明所涵盖的亲和力增强的结合蛋白，例如TCR或其抗原结合部分。在一些实例中，使用一系列浓度的标记多聚体的2倍稀释来测量结合蛋白，例如TCR或其抗原结合部分的表观KD，接着通过非线性回归来确定结合曲线，确定表观KD为产生半最大结合的配体浓度。
细胞因子的水平可使用本文所述的方法来确定，例如ELISA、ELISPOT、细胞内细胞因子染色和流式细胞术以及它们的组合(例如细胞内细胞因子染色和流式细胞术)。
由抗原特异性引发或刺激免疫反应引起的免疫细胞增殖和克隆扩增可通过以下来测定：分离淋巴细胞，例如外周血细胞或来自淋巴结的细胞的样品中的循环淋巴细胞，用抗原刺激所述细胞并且例如通过并入氚化胸苷或非放射性测定，例如MTT测定等，测量细胞因子产生、细胞增殖和/或细胞活力。本文所述的免疫原对Thl免疫反应与Th2免疫反应之间的平衡的影响可例如通过测定Thl细胞因子(例如IFN-g、IL-12、IL-2和TNF-b)以及2型细胞因子(例如IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和IL-l3)的水平来检查。
本发明所涵盖的宿主细胞可包含编码如本文所述的结合蛋白的单一多核苷酸，或结合蛋白可由多于一种多核苷酸编码。换句话说，结合蛋白的组分或部分可由两种或更多种多核苷酸编码，所述多核苷酸可含于单一核酸分子上或可含于两种或更多种核酸分子上。
此外，如下文和工作实施例中进一步描述，本发明涵盖的宿主细胞可在与结合蛋白或其组分相同的多核苷酸或不同的多核苷酸上编码和/或表达除如本文所述的结合蛋白之外的有用的辅助蛋白。举例来说，宿主细胞可编码和/或表达CD8α、CD8β、DN-TGFβR(例如DN-TGFβRII)和/或选择性蛋白标志物，任选地其中选择性蛋白标志物为DHFR。
在一些实施方案中，编码本发明所涵盖的结合蛋白的两个或更多个组分或部分的多核苷酸包含在单个开发阅读框中可操作性连接的两个或更多个编码序列。这类安排可有利地允许所需基因产物的协调表达，例如同时表达TCR的α链和β链，使得其以约1:1的比率产生。在一些实施方案中，本发明所涵盖的结合蛋白的两种或更多种取代基因产物，例如TCR(例如，α链和β链)或CAR，表达为单独分子并且在翻译后缔合。在进一步的实施方案中，本发明所涵盖的结合蛋白的两种或更多种取代基因产物表达为单个肽，其部分被可裂解或可去除的区段隔开。例如，可用于表达由单个多核苷酸或载体编码的可分离多肽的自裂解肽是本领域中已知的，并且包括例如猪捷申病毒-12A(P2A)肽、明脉扁刺蛾病毒(thoseaasigna virus)2A(T2A)肽、马鼻炎A病毒(ERAV)2A(E2A)肽和口蹄疫病毒2A(F2A)肽。
在一些实施方案中，本发明所涵盖的结合蛋白包含一种或多种连接氨基酸。“连接氨基酸”或“连接氨基酸残基”是指多肽的两个相邻基序、区域或结构域之间，例如结合结构域与相邻恒定结构域之间或TCR链与相邻自裂解肽之间的一个或多个(例如2至约10个)氨基酸残基。连接氨基酸可由编码融合蛋白的构建体的设计产生(例如，在构建编码融合蛋白的核酸分子期间使用限制性酶位点产生的氨基酸残基)，或由例如与本发明所涵盖的编码结合蛋白的一个或多个结构域相邻的自裂解肽裂解产生(例如，位于TCR a链与TCRβ链之间的P2A肽，其自裂解可在a链、TCRβ链或两者中留下一个或多个连接氨基酸)。
本发明所涵盖的工程化免疫细胞可作为例如以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的疗法施用。在一些情况下，可能需要减少或停止与细胞免疫疗法相关的活性。因此，在一些实施方案中，本发明所涵盖的工程化免疫细胞包含编码结合蛋白和辅助蛋白(例如安全开关蛋白)的异源多核苷酸，其可使用同源药物或其它化合物靶向以在需要时选择性地调节这类细胞的活性(例如，减少或消融)。在这方面使用的安全开关蛋白包括例如截短EGF受体多肽(huEGFRt)，其缺乏细胞外N端配体结合结构域和细胞内受体酪氨酸激酶活性，但保留天然氨基酸序列、I型跨膜细胞表面定位以及医药级抗EGFR单克隆抗体、西妥昔单抗(cetuximab，Erbitux)tEGF受体(tEGFr；Wang等人(2011)Blood118:1255-1263)、半胱天冬酶多肽(例如，iCasp9；Straathof等人(2005)Blood 105:4247-4254；Di Stasi等人(2011)N.Engl.J.Med.365:1673-1683；Zhou和Brenner(2016)Hematol.pii:S0301-472X:30513-30516)、RQR8(Philip等人(2014)Blood124:1277-1287)和人c-myc蛋白标签(Kieback等人(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:623-628)的构象完整结合表位。
对治疗细胞有用的其它辅助组分包含标签或选择标志物(例如CD34富集标签)，它允许鉴定、分选、分离、富集或追踪细胞。例如，具有所需特征的标记免疫细胞(例如，抗原特异性TCR和安全开关蛋白)可以从样品中的未标记细胞中分选出来，并且更有效地激活和扩增以包括在所需纯度的治疗产品中。
如本文所用，术语“选择标志物”包含赋予细胞可鉴定的变化的核酸构建体，它允许检测和阳性选择用包含选择标志物的多核苷酸转导的免疫细胞。例如，RQR是一种选择标志物，其包含CD20的主要胞外环和两个最小CD34结合位点。在一些实施方案中，编码RQR的多核苷酸包含编码16氨基酸的CD34最小表位的多核苷酸。在一些实施方案中，例如本文实施例中提供的某些实施方案，CD34最小表位并入CD8茎结构域(Q8)的氨基末端位置。在进一步的实施方案中，CD34最小结合位点序列可与CD20的靶表位组合以形成T细胞的紧凑标志物/自杀基因(RQR8)(Philip等人2014)。该构建体允许用例如与磁珠结合的CD34特异性抗体(Miltenyi)选择表达所述构建体的免疫细胞，并且利用临床上接受的药物抗体利妥昔单抗，该抗体允许选择性删除表达转基因的工程化T细胞(例如，Philip等人(2014)Blood124:1277-1287；美国专利公布2015-0093401；和美国专利公布2018-0051089)。
其它示例性选择标志物包括数种通常不在T细胞上表达的截短的I型跨膜蛋白：截短的低亲和力神经生长因子、截短的CD19和截短的CD34(例如，Di Stasi等人(2011)N.Engl.J.Med.365:1673-1683；Mavilio等人(1994)Blood83:1988-1997；和Fehse等人(2000)Mol.Ther.7:448-456)。CD19和CD34的一个特别吸引人的特征在于现成MiltenyiCliniMACsTM选择系统的可用性，该系统可靶向这些标志物进行临床级分选。然而，CD19和CD34是相对较大的表面蛋白，可能会影响整合载体的载体包装能力和转录效率。也可以采用含有细胞外非信号传导结构域或各种蛋白质(例如CD19、CD34、LNGFR等)的表面标志物。可采用任何选择标志物，并且应为良好制造规范可接受的。在一些实施方案中，选择标志物与编码所关注的基因产物(例如，本发明所涵盖的结合蛋白，例如TCR或CAR，或其抗原结合片段)的多核苷酸一起表达。选择标志物的其它实例包括例如报告基因，例如GFP、EGFP、β-gal或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。在一些实施方案中，选择标志物，例如CD34由细胞表达，并且CD34可用于选择、富集或分离(例如，通过免疫磁性选择)转导的所关注的细胞以用于本文所述的方法。如本文所用，CD34标志物区别于抗CD34抗体，或例如scFv、TCR或与CD34结合的其它抗原识别部分。
在一些实施方案中，选择标志物包含RQR多肽、截短的低亲和力神经生长因子(tNGFR)、截短的CD19(tCD19)、截短的CD34(tCD34)或它们的任何组合。
作为背景，在免疫治疗细胞产品中包括CD4+ T细胞可提供抗原诱导的IL-2分泌并且增强转移的细胞毒性CD8+ T细胞的持久性和功能(例如，Kennedy等人(2008)Immunol.Rev.222:129和Nakanishi等人Nature(2009)52:510)。在一些实施方案中，CD4+ T细胞中的I类限制性TCR可能需要转移CD8共受体以增强TCR对I类HLA肽复合物的敏感性。CD4共受体在结构上与CD8不同，并且不能有效替代CD8共受体(例如，Stone和Kranz(2013)Front.Immunol.4:244和Cole等人(2012)Immunology 737:139)。因此，用于本发明所涵盖的组合物和方法的另一种辅助蛋白包含CD8共受体或其组分。在一些实施方案中，包含编码本发明所涵盖的结合蛋白的异源多核苷酸的工程化免疫细胞还可包含编码CD8共受体蛋白或其β链或α链组分的异源多核苷酸。
宿主细胞可有效地转导以含有并且可有效地表达编码结合蛋白、安全开关蛋白、选择标志物和CD8共受体蛋白的单一多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明所涵盖的宿主细胞还包括编码共刺激分子的核酸，使得修饰的T细胞表达共刺激分子。在一些实施方案中，共刺激结构域选自CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1和PD1L。
在任何前述实施方案中，表达本文所述的结合蛋白的宿主细胞可以是通用免疫细胞。“通用免疫细胞”包含如下免疫细胞，其经过修饰，减少或消除一种或多种编码选自PD-l、LAG-3、CTLA4、TIM3、TIGIT、HLA分子、TCR分子或它们的任何组合的多肽产物的内源基因的表达。不希望受理论束缚，某些内源性表达的免疫细胞蛋白可能下调修饰的免疫细胞的免疫活性(例如，PD-1、LAG-3、CTLA4、TIGIT)，或可能干扰本发明所涵盖的异源表达的结合蛋白(例如，结合非HPV16 E711-19抗原并且干扰修饰的免疫细胞与表达HPV16 E711-19抗原(例如在MHC分子背景中的包含氨基酸序列YMLDLQPET的HPV16 E711-19免疫原性肽)的靶细胞的结合的内源性TCR)的结合活性。此外，在供体免疫细胞上表达的内源蛋白(例如免疫细胞蛋白质，例如HLA等位基因)可能被同种异体宿主识别为外源蛋白，这可能导致修饰的供体免疫细胞被同种异体宿主消除或抑制。
因此，降低或消除这类内源基因或蛋白质的表达或活性可提高修饰的免疫细胞在自体同源或同种异体宿主环境中的活性、耐受性或持久性，并且允许细胞的通用施用(例如，施用于任何接受者，无论HLA类型如何)。在一些实施方案中，根据本发明的细胞是同基因型的，这意味着它们在遗传学上相同或足够相同并且免疫学上相容从而允许移植。在一些实施方案中，通用免疫细胞为供体细胞(例如，同种异体)或自体细胞。在一些实施方案中，本发明所涵盖的修饰的免疫细胞(例如通用免疫细胞)包含编码以下的基因中的一者或多者的染色体基因敲除：PD-l、LAG-3、CTLA4、TIM3、TIGIT、HLA组分(例如，编码αl巨球蛋白、α2巨球蛋白、α3巨球蛋白、β1微球蛋白或β2微球蛋白的基因)或TCR组分(例如，编码TCR可变区或TCR恒定区的基因)(参见例如Torikai等人(2016)NatureSci.Rep.6:21757；Torikai等人(2012)Blood 179:5697；和Torikai等人(2013)Blood722:1341，还提供了根据本发明有用的代表性的示例性基因编辑技术、组合物和过继性细胞疗法)。
如本文所用，术语“染色体基因敲除”是指在宿主细胞中防止(例如，减少、延迟、抑制或消除)宿主细胞产生功能活性的内源多肽产物的遗传改变或引入的抑制剂。引起染色体基因敲除的改变可能包括例如引入的无义突变(包括提前终止密码子的形成)、错义突变、基因缺失和链断裂，以及抑制宿主细胞中的内源基因表达的抑制性核酸分子的异源表达。
在一些实施方案中，染色体基因敲除或基因敲入可通过宿主细胞的染色体编辑来进行。可使用例如核酸内切酶进行染色体编辑。如本文所用，“核酸内切酶”是指能够催化多核苷酸链内磷酸二酯键裂解的酶。在一些实施方案中，核酸内切酶能够使靶基因裂解，从而使靶基因失活或“敲除”靶基因。核酸内切酶可以是天然存在、重组、遗传修饰或融合的核酸内切酶。由核酸内切酶引起的核酸链断裂通常通过同源重组或非同源末端连接(NHEJ)的不同机制进行修复。在同源重组过程中，供体核酸分子可用于供体基因“敲入”，用于靶基因“敲除”，并且任选地通过供体基因敲入或靶基因敲除事件使靶基因失活。NHEJ为一个容易出错的修复过程，通常会导致裂解位点的DNA序列发生变化，例如至少一个核苷酸的取代、缺失或添加。NHEJ可用于“敲除”靶基因。核酸内切酶的实例包括锌指核酸酶、TALE-核酸酶、CRISPR-Cas核酸酶、大范围核酸酶和megaTAL。
如本文所用，“锌指核酸酶”(ZFN)是指一种融合蛋白，其包含与非特异性DNA裂解结构域，例如Fokl核酸内切酶融合的锌指DNA结合结构域。约30个氨基酸的每个锌指基序与约3个DNA碱基对结合，并且某些残基上的氨基酸可发生变化以改变三联体序列特异性(例如，Desjarlais等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90:2256-2260和Wolfe等人(1999)J.Mol.Biol.255:1917-1934)。多个锌指基序可串联连接以产生与所需DNA序列，例如长度在约9个至约18个碱基对范围内的区域的结合特异性。作为背景，ZFN通过催化基因组中位点特异性DNA双链断裂(DSB)的形成来介导基因组编辑，并且同源定向修复促进在DSB位点靶向整合包含与基因组同源的侧翼序列的转基因。或者，由ZFN产生的DSB可经由非同源末端连接(NHEJ)修复引起靶基因敲除，这是一种容易出错的细胞修复途径，导致裂解位点处核苷酸的插入或缺失。在一些实施方案中，基因敲除包含使用ZFN分子进行的插入、缺失、突变或它们的组合。
如本文所用，“转录激活因子样效应核酸酶”(TALEN)是指一种融合蛋白，其包含TALE DNA结合结构域和DNA裂解结构域，例如Fokl核酸内切酶。“TALE DNA结合结构域”或“TALE”由一个或多个TALE重复结构域/单元构成，每个结构域/单元通常具有高度保守的33-35氨基酸序列，具有不同的第12和第13氨基酸。TALE重复结构域参与TALE与靶DNA序列的结合。不同氨基酸残基，称为重复可变双残基(RVD)，与特定核苷酸识别相关。已确定这些TALE识别DNA的自然(规范)密码，使得TALE的第12和13位的HD(组氨酸-天冬氨酸)序列引起TALE与胞嘧啶(C)结合，NG(天冬酰胺-甘氨酸)与T核苷酸结合，NI(天冬酰胺-异亮氨酸)与A核苷酸结合，NN(天冬酰胺-天冬酰胺)与G或A核苷酸结合，并且NG(天冬酰胺-甘氨酸)与T核苷酸结合。非规范(非典型)RVD也是本领域中众所周知的(例如，美国专利公布No.US2011/0301073，其中非典型RVD的全部内容以引用的方式并入本文)。TALEN可用于指导T细胞基因组中的位点特异性双链断裂(DSB)。非同源末端连接(NHEJ)连接双链断裂两侧的DNA，其中退火时序列重叠很少或没有，因此引入敲除基因表达的错误。或者，同源定向修复可在DSB位点引入转基因，条件为转基因中存在同源侧翼序列。在一些实施方案中，基因敲除包含使用TALEN分子进行的插入、缺失、突变或它们的组合。
如本文所用，“成簇的规则间隔的短回文重复序列/Cas”(CRISPR/Cas)核酸酶系统是指一种系统，其采用CRISPR RNA(crRNA)引导的Cas核酸酶，经由碱基配对互补性来识别基因组内的靶位点(称为前间隔序列)，接着如果短的保守的前间隔序列相关基序(PAM)紧跟在互补靶序列的3'之后，则使DNA裂解。CRISPR/Cas系统根据Cas核酸酶的序列和结构分为三种类型(即，I型、II型和III型)。I型和III型crRNA引导的监测复合物需要多个Cas亚基。研究最多的II型系统至少包含三个组分：RNA引导的Cas9核酸酶、crRNA和反式作用crRNA(tracrRNA)。tracrRNA包含双链体形成区。crRNA与tracrRNA形成双链体，其能够与Cas9核酸酶相互作用，并且经由crRNA上的间隔子和PAM上游的靶DNA上的前间隔序列之间的沃森-克里克碱基配对(Watson-Crick base-pairing)，将Cas9/crRNA:tracrRNA复合物引导到靶DNA上的特定位点。Cas9核酸酶使由crRNA间隔子界定的区域内的双链断裂裂解。NHEJ修复导致插入和/或缺失，这破坏了所靶向的基因座的表达。或者，可经由同源定向修复将具有同源侧翼序列的转基因引入DSB位点。crRNA和tracrRNA可被工程化成单一引导RNA(sgRNA或gRNA)(例如，Jinek等人(2012)Science 337:816-821)。此外，与靶位点互补的引导RNA的区域可进行改变或编程以靶向所需序列(Xie等人(2014)PLOS One9:el00448；美国专利公布No.US2014/0068797；美国专利公布No.US2014/0186843；美国专利No.8,697,359；和PCT公布No.WO 2015/071474)。在一些实施方案中，基因敲除包含使用CRISPR/Cas核酸酶系统进行的插入、缺失、突变或它们的组合。
示例性gRNA序列和使用其敲除编码免疫细胞蛋白的内源基因的方法包括Ren等人(2017)Clin.Cancer Res.23:2255-2266中所示的那些gRNA序列和方法，所述文献提供了代表性的示例性gRNA、CAS9 DNA、载体和基因敲除技术。
如本文所用，“大范围核酸酶”，又称为“归巢核酸内切酶”，是指以大识别位点(约12至约40个碱基对的双链DNA序列)为特征的内切脱氧核糖核酸酶。基于序列和结构基序，大范围核酸酶可分为五个家族：LAGLIDADG、GIY-YIG、HNH、His-Cys盒和PD-(D/E)XK。示例性大范围核酸酶包括I-Scel、I-Ceul、PI-PspI、RI-Sce、I-ScelV、I-Csml、I-Panl、I-Scell、I-Ppol、I-SceIII、I-Crel、I-Tevl、I-TevII和I-TevIII，其识别序列是众所周知的(例如，美国专利No.5,420,032和6,833,252；Belfort等人(1997)Nucl.Acids Res.25:3379-3388；Dujon等人(1989)Gene 52:115-118；Perler等人(1994)Nucl.Acids Res.22:1125-1127；Jasin(1996)Trends Genet.72:224-228；Gimble等人(1996)J.Mol.Biol.263:163-180；和Argast等人(1998)J.Mol.Biol.280:345-353)。
在一些实施方案中，天然存在的大范围核酸酶可用于促进所关注的靶标的位点特异性基因组修饰，例如免疫检查点、HLA编码基因或TCR组分编码基因。
在其它实施方案中，对靶基因具有新结合特异性的工程化的大范围核酸酶用于位点特异性基因组修饰(参见例如Porteus等人(2005)Nat.Biotechnol.23:967-73；Sussman等人(2004)J.Mol.Biol.342:31-41；Epinat等人(2003)Nucl.AcidsRes.37:2952-2962；Chevalier等人(2002)Mol.Cell 70:895-905；Ashworth等人(2006)Nature441:656-659；Paques等人(2007)Curr.Gene Ther.7:49-66；和美国专利公布No.US2007/0117128、US2006/0206949、US2006/0153826、US2006/0078552和US2004/0002092)。在进一步的实施方案中，染色体基因敲除使用归巢核酸内切酶产生，所述核酸内切酶经TALEN的模块化DNA结合结构域修饰，制成称为megaTAL的融合蛋白。MegaTAL不仅可用于敲除一种或多种靶基因，也可以在与编码所关注的多肽的外源供体模板结合使用时引入(敲入)异源或外源多核苷酸。
在一些实施方案中，染色体基因敲除包含被引入宿主细胞(例如免疫细胞)的抑制性核酸分子，所述抑制性核酸分子包含编码与HPV16 E711-19抗原结合(例如特异性和/或选择性地)的抗原特异性受体的异源多核苷酸，其中抑制性核酸分子编码靶特异性抑制剂，并且其中编码的靶特异性抑制剂抑制宿主免疫细胞中的内源基因表达(即，免疫检查点、HLA组分或TCR组分或它们的任何组合)。
在使用敲除程序或剂后，可通过宿主免疫细胞的DNA测序直接确认染色体基因敲除。
染色体基因敲除也可以从敲除后基因表达的缺乏(例如，由所述基因编码的mRNA或多肽产物的缺乏)中推断出来。
在一些实施方案中，本发明所涵盖的宿主细胞能够特异性和/或选择性地杀伤50％或更多的靶细胞，所述靶细胞包括包含在MHC分子背景中的HPV16 E711-19免疫原性肽的肽-MHC(pMHC)复合物。
在一些实施方案中，修饰的免疫细胞在与靶细胞接触时能够产生细胞因子，所述靶细胞包括包含在MHC分子背景中的HPV16 E711-19免疫原性肽的肽-MHC(pMHC)复合物。
在一些实施方案中，细胞因子包含IFN-γ或IL2。在一些实施方案中，细胞因子包含TNF-α。
在一些实施方案中，当与HPV16 E711-19表达水平小于或等于约1,000个转录本/百万转录本(TPM)、950TPM、900TPM、850TPM、800TPM、750TPM、700TPM、650TPM、600TPM、550TPM、500TPM、450TPM、400TPM、350TPM、300TPM、250TPM、200TPM、150TPM、100TPM、95TPM、90TPM、85TPM、80TPM、75TPM、70TPM、65TPM、60TPM、55TPM、50TPM、45TPM、40TPM、35TPM、34TPM、33TPM、32TPM、31TPM、30TPM、29TPM、28TPM、27TPM、26TPM、25TPM、24TPM、23TPM、22TPM、21TPM、20TPM、19TPM、18TPM、17TPM、16TPM、15TPM、14TPM、13TPM、12TPM、11TPM、10TPM、9TPM、8TPM、7TPM、6TPM、5TPM、4TPM、3TPM、2TPM和1TPM，或介于两者之间的任何范围(包括端点)，例如小于或等于约1,000TPM至小于或等于约35TPM)的靶细胞接触时，宿主细胞能够产生更高水平的细胞因子或细胞毒性分子。在一些实施方案中，低HPV16 E711-19表达水平称为“杂合表达”，意指约1TPM与约35TPM之间，或介于两者之间的任何范围(包括端点)，例如1-32TPM。举例来说，宿主细胞能够产生高出至少1.2倍、1.5倍、1.8倍、2.0倍、2.2倍、2.5倍、2.8倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、1000倍或更多，或介于两者之间的任何范围(包括端点)，例如1.2倍至2倍的水平的细胞因子或细胞毒性分子。
在一些实施方案中，宿主细胞能够特异性和/或选择性地杀伤表达HPV16 E711-19的靶细胞(例如，表达HPV16 E711-19的过度增殖细胞)。在某些实施方案中，靶细胞表达：(i)包含氨基酸序列YMLDLQPET或由氨基酸序列YMLDLQPET组成的多肽；以及(ii)匹配的MHC分子。
在一些实施方案中，宿主细胞不表达HPV16 E711-19抗原，未被如权利要求1-30中任一项的结合蛋白识别，不属于血清型HLA-A*02，和/或不表达HLA-A*02等位基因，例如HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:03、HLA-A*02:05、HLA-A*02:06或HLA-A*02:07等位基因。例如，患者可接受来自HPV16 E711-19阴性或HLA-A*02:01阴性的健康供体的宿主细胞。从所述供体(或工程化的自体细胞)分离的干细胞，例如造血干细胞可用作移植材料的来源。平行地，从同一供体分离的T细胞可进行基因工程化以识别HPV16E711-19，例如通过表达本文所述的HPV16 E711-19结合蛋白。供体干细胞可用于将细胞群体，例如重建免疫系统移植到患者体内，并且可将宿主细胞注入患者体内，以激发高度特异性的抗肿瘤作用。工程化的供体T细胞可被设计成识别和消除表达HPV16 E711-19的细胞，例如患者的所有HPV16 E711-19阳性天然血细胞，包括例如癌细胞，如残留白血病细胞，从而防止复发并促进完全治愈。因为患者新的健康血细胞源自供体，因此为HPV16 E711-19阴性，HLA-A*02血清型阴性和/或或HLA-A*02:01阴性，所以本文所述的工程化细胞可能具有最小的毒副作用。这类患者匹配的宿主细胞和治疗方法可根据下文进一步描述的治疗方法使用。
在一些实施方案中，杀伤通过杀伤测定来测定。在一些实施方案中，杀伤测定通过将宿主细胞和靶细胞以20:1至0.625:1，例如15:1至1.25:1、10:1至1.5:1、8:1至3:1、6:1至5:1、20:1至5:1、10:1至2.5:1等的比率共培养来进行。在一些实施方案中，用1μg/mL至50pg/mL，例如1ug/mL至10ng/mL、500ng/mL至0.5ng/mL、10ng/mL至10pg/mL、250ng/mL至1ng/mL、50ng/mL至5ng/mL、20ng/mL至10ng/mL等HPV16 E711-19肽对靶细胞进行脉冲输送。
在一些实施方案中，当与HPV16 E711-19水平小于或等于约1,000个转录本/百万转录本(TPM)、950TPM、900TPM、850TPM、800TPM、750TPM、700TPM、650TPM、600TPM、550TPM、500TPM、450TPM、400TPM、350TPM、300TPM、250TPM、200TPM、150TPM、100TPM、95TPM、90TPM、85TPM、80TPM、75TPM、70TPM、65TPM、60TPM、55TPM、50TPM、45TPM、40TPM、35TPM、34TPM、33TPM、32TPM、31TPM、30TPM、29TPM、28TPM、27TPM、26TPM、25TPM、24TPM、23TPM、22TPM、21TPM、20TPM、19TPM、18TPM、17TPM、16TPM、15TPM、14TPM、13TPM、12TPM、11TPM、10TPM、9TPM、8TPM、7TPM、6TPM、5TPM、4TPM、3TPM、2TPM和1TPM，或介于两者之间的任何范围(包括端点)，例如小于或等于约1,000TPM至小于或等于约35TPM)的靶细胞接触时，宿主细胞能够杀伤更高数目的靶细胞。在一些实施方案中，低HPV16 E711-19表达水平称为“杂合表达”，意指约1TPM与约35TPM之间，或介于两者之间的任何范围(包括端点)，例如1-32TPM。举例来说，宿主细胞能够杀伤高出至少1.2倍、1.5倍、1.8倍、2.0倍、2.2倍、2.5倍、2.8倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、1000倍或更多，或介于两者之间的任何范围(包括端点)，例如1.2倍至2倍的数目的靶细胞。
本发明还提供了包含至少一种本文所述宿主细胞的细胞群体。细胞群体可以是异质群体，它包含：包含任何所述的重组表达载体的宿主细胞；以及至少一种其它细胞，例如不包含任何重组表达载体的宿主细胞(例如，T细胞)，或T细胞以外的细胞，例如B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、红细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌肉细胞、脑细胞等。或者，细胞群体可为实质上同质群体，其中该群体主要由包含重组表达载体的宿主细胞构成(例如，基本上由其组成)。群体也可以是细胞的克隆群体，其中群体的所有细胞均为包含重组表达载体的单一宿主细胞的克隆，使得群体的所有细胞均包含重组表达载体。在本发明所涵盖的一个实施方案中，细胞群体为包括包含如本文所述的重组表达载体的宿主细胞的克隆群体。
在本发明所涵盖的一个实施方案中，群体中的细胞数目可迅速扩增。T细胞数目的扩增可通过本领域众所周知的多种方法中的任一种来实现(例如，美国专利No.8,034,334和8,383,099、美国专利公布No.2012/0244133；Dudley等人(2003)J.Immunother.26:332-242；和Riddell等人(1990)J.Immunol.Methods 128:189-201)。例如，T细胞数目的扩增可通过将T细胞与OKT3抗体、IL-2和饲养PBMC(例如，经过辐照的同种异体PBMC)一起培养来进行。
V.药物组合物
在本发明所涵盖的另一方面，本文提供了药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的组合物(例如，结合蛋白、核酸、细胞等)和药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。
术语“药学上可接受”是指在合理医学判断范围内，适合与人和动物组织接触而无过度毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症，与合理收益/风险比相称的那些剂、材料、组合物和/或剂型。
本发明所涵盖的剂和其它组合物可特别配制用于以固体或液体形式施用，包括适用于各种施用途径的那些形式，例如(1)口服施用，例如灌服剂(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂、大丸剂、散剂、颗粒、糊剂；(2)肠胃外施用，例如呈例如无菌溶液或悬浮液形式通过皮下、肌肉内或静脉内注射；(3)局部涂覆，例如呈涂在皮肤上的乳膏、软膏或喷雾剂；(4)阴道内或直肠内，例如呈子宫托、乳膏或泡沫形式；或(5)气溶胶，例如呈含有所述化合物的水性气溶胶、脂质体制剂或固体颗粒形式。考虑本文所述的剂或组合物的任何合适形式因子，例如但不限于片剂、胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。
本发明所涵盖的药物组合物可呈现为离散剂型，例如胶囊、小袋或片剂，或液体或气溶胶喷雾剂，每一者含有预定量的活性成分，呈粉末或颗粒、在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液、水包油乳液、油包水液体乳液、用于复原的散剂、口服散剂、瓶(包括瓶中的散剂或液体)、口服溶解薄膜、口含锭、糊剂、管、口香糖和包装。这类剂型可通过任何药学方法制备。
合适赋形剂包括水、盐水、葡萄糖、甘油等和它们的组合。在一些实施方案中，包含如本文公开的宿主细胞、结合蛋白或融合蛋白的组合物还包含合适的输注介质。合适的输注介质可以是任何等渗介质制剂，通常可利用生理盐水、NormosolTM-R(Abbott)或Plasma-LyteTMA(Baxter)、5％葡萄糖水溶液、乳酸林格氏液(Ringer's lactate)。输注介质可补充人血清白蛋白或其它人血清组分。还考虑包含有效量的宿主细胞或组合物的单位剂量。
本文还提供了包含有效量的宿主细胞或包含宿主细胞的组合物的单位剂量。如本文所述，宿主细胞包括免疫细胞、T细胞(CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)、细胞毒性淋巴细胞(例如，细胞毒性T细胞和/或自然杀伤(NK)细胞)等。举例来说，在一些实施方案中，单位剂量包含的组合物包含至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％)、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的单独或与其它细胞组合的工程化细胞，例如包含至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％)、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％其它细胞。在一些实施方案中，不需要的细胞以减少的量存在或基本上不存在，例如小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％、小于约5％或小于约1％组合物中的细胞群体。
组合物或单位剂量中的细胞量为至少一个细胞(例如，至少一个工程化CD8+ T细胞、工程化CD4+ T细胞和/或NK细胞)或更通常大于102个细胞，例如，多达106、多达107、多达108个细胞、多达109个细胞或超过1010个细胞。在一些实施方案中，细胞以约106至约1010个细胞/m2的范围，例如以约105至约109个细胞/m2的范围施用。细胞数目将取决于组合物的预期最终用途以及其中包括的细胞类型。例如，被修饰成含有对特定抗原具有特异性的结合蛋白的细胞将包含含有至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多这类细胞的细胞群体。对于本文提供的用途，细胞的体积通常为一公升或更小、500ml或更小、250ml或更小、或100ml或更小。在实施方案中，所需细胞的密度通常大于104个细胞/ml并且通常大于107个细胞/ml，通常为108个细胞/ml或更大。细胞可作为单次输注或在一段时间内以多次输注的形式施用。临床相关数目的免疫细胞可分配到多次输注中，累积等于或超过106、107、108、109、1010或1011个细胞。在一些实施方案中，单位剂量的工程化免疫细胞可与来自同种异体供体的造血干细胞共施用(例如同时或同时期)。
如医学领域的技术人员所确定，药物组合物可以用适合于待治疗(或预防)的疾病或疾患的方式施用。组合物的适当剂量和合适的施用持续时间和频率将由例如患者的健康状况、患者体型(即体重、质量或身体面积)、患者疾患的类型和严重程度、活性成分的具体形式和施用方法的因素决定。一般来说，适当的剂量和治疗方案以足以提供治疗和/或预防益处(例如本文所述，包括改善的临床结果，例如更频繁的完全或部分缓解，或更长的无病期和/或总生存期，或症状严重程度的减轻)的量提供组合物。
药物组合物的有效量是指足以达到所需临床结果或有益治疗所需的剂量和时间段的量，如本文所述。可在一次或多次施用中递送有效量。如果对已知或确认患有疾病或疾病病况的受试者进行施用，则术语“治疗有效量”可用于指代治疗，而“预防有效量”可用于描述作为预防过程，向易感或有发展疾病或疾病病况(例如复发)风险的受试者施用有效量。
本文所述的药物组合物可呈现于单位剂量或多剂量容器中，例如密封安瓿或小瓶。这类容器可冷冻以保持制剂的稳定性，直到输注到患者体内。在一些实施方案中，单位剂量包含剂量为约107个细胞/m2至约1011个细胞/m2的如本文所述的宿主细胞。开发适用于在各种治疗方案中使用本文所述的特定组合物的施用和治疗方案，包括例如肠胃外或静脉内施用或配制。
如果主题组合物肠胃外施用，则所述组合物也可以包括无菌水性或油性溶液或悬浮液。合适的无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂包括水、林格氏溶液、等渗盐溶液、1,3-丁二醇、乙醇、丙二醇或聚乙二醇与水的混合物。水溶液或悬浮液还可包含一种或多种缓冲剂，例如乙酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠或酒石酸钠。当然，用于制备任何剂量单位制剂的任何材料均应为药学纯的并且在所采用的量下基本上无毒。此外，活性化合物可并入持续释放的制剂(preparation)和制剂(formulation)中。如本文所用，单位剂型是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理离散单元；每个单元可含有经过计算可产生所需的效果的预定量的工程化免疫细胞或活性化合物，以及适当药物载剂。
在一些实施方案中，所述的药物组合物在施用于受试者时可引发针对表达HPV16E711-19的所关注细胞的免疫反应。这类药物组合物可用作用于预防性和/或治疗性治疗以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的疫苗。
在一些实施方案中，药物组合物还包含生理学上可接受的佐剂。在一些实施方案中，所用佐剂增加药物组合物的免疫原性。这类刺激进一步免疫反应的化合物或佐剂可(i)在肽复原并且任选地用如上文所定义的油基佐剂乳化之后混合到根据本发明的药物组合物，(ii)可以是上文所定义的本发明所涵盖的复原组合物的一部分，(iii)可实体连接到待复原的肽，或(iv)可分开施用于待治疗的受试者、哺乳动物或人。佐剂可以是提供抗原的缓慢释放的佐剂(例如，佐剂可以是脂质体)，或其可以是自身具免疫原性，从而与抗原协同地起作用的佐剂。举例来说，佐剂可以是已知的佐剂，或促进抗原摄取、将免疫系统细胞募集到施用部位或促进起反应的淋巴样细胞的免疫激活的其它物质。佐剂包括但不限于免疫调节分子(例如，细胞因子)、油和水乳液、氢氧化铝、葡聚糖、硫酸葡聚糖、氧化铁、褐藻酸钠、bacto-adjuvant、合成聚合物(例如聚氨基酸和氨基酸共聚物)、皂苷、石蜡油和胞壁酰二肽。在一些实施方案中，佐剂为佐剂65、α-GalCer、磷酸铝、氢氧化铝、磷酸钙、β-葡聚糖肽、CpG DNA、GM-CSF、GPI-0100、IFA、IFN-γ、IL-17、脂质A、脂多糖、Lipovant、MontanideTM、N-乙酰基-胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺、pam3CSK4、quil A、海藻糖二霉菌酸酯或酵母聚糖。
在一些实施方案中，佐剂为免疫调节分子。举例来说，免疫调节分子可以是被设计用于增强免疫反应的重组蛋白细胞因子、趋化因子或免疫刺激剂或编码细胞因子、趋化因子或免疫刺激剂的核酸。
免疫调节细胞因子的实例包括干扰素(例如，IFNα、IFNβ和IFNγ)、白细胞介素(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-17和IL-20)、肿瘤坏死因子(例如，TNFα和TNFβ)、红细胞生成素(EPO)、FLT-3配体、gIp10、TCA-3、MCP-1、MIF、MIP-1α、MIP-1β、Rantes、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，以及前述任一者的功能片段。
在一些实施方案中，与趋化因子受体(即，CXC、CC、C或CX3C趋化因子受体)结合的免疫调节趋化因子也可以包括于这里提供的组合物中。趋化因子的实例包括但不限于Mip1α、Mip-1β、Mip-3α(Larc)、Mip-3β、Rantes、Hcc-1、Mpif-1、Mpif-2、Mcp-1、Mcp-2、Mcp-3、Mcp-4、Mcp-5、Eotaxin、Tarc、Elc、I309、IL-8、Gcp-2 Gro-α、Gro-β、Gro-γ、Nap-2、Ena-78、Gcp-2、Ip-10、Mig、I-Tac、Sdf-1和Bca-1(Blc)，以及前述任一者的功能片段。
在一些实施方案中，组合物包含本文所述的结合蛋白(例如，TCR、TCR的抗原结合片段、CAR或包含TCR和效应结构域的融合蛋白)、TCRα和/或TCRβ多肽。在一些实施方案中，组合物包含编码本文所述的结合蛋白、TCRα和/或TCRβ多肽的核酸，例如编码结合蛋白、TCRα和/或TCRβ多肽的DNA分子。在一些实施方案中，组合物包含表达载体，所述表达载体包含编码结合蛋白、TCRα和/或TCRβ多肽的开发阅读框。
当被细胞(例如，T细胞、NK细胞等)吸收时，DNA分子可作为染色体外分子存在于细胞中和/或可整合到染色体中。DNA可呈质粒形式引入到细胞中，其可保持为独立的遗传物质。替代地，可将可整合到染色体中的线性DNA引入到细胞中。任选地，当将DNA引入到细胞中时，可添加促进DNA整合到染色体中的试剂。
VI.用途和方法
本文所述的组合物可用于多种诊断、预后和治疗应用。在本文所述的任何方法，例如诊断方法、预后方法、治疗方法或它们的组合中，方法的所有步骤均可由单个参与者或替代地由多于一个参与者进行。举例来说，诊断可由提供治疗性治疗的参与者直接进行。或者，提供治疗剂者可要求进行诊断测定。诊断师和/或治疗干预师可解释诊断测定结果以确定治疗策略。类似地，这类替代过程可应用于其它测定，例如预后测定。
在本发明所涵盖的一些用途和方法中，利用受试者或受试者样品。在一些实施方案中，受试者为动物。动物可为任何性别，并且可处于任何发育阶段。在一些实施方案中，动物为脊椎动物，例如哺乳动物。在一些实施方案中，受试者为非人类哺乳动物。在一些实施方案中，受试者为驯养动物，例如狗、猫、牛、猪、马、绵羊或山羊。在一些实施方案中，受试者为伴侣动物，例如狗或猫。在一些实施方案中，受试者为家畜，例如牛、猪、马、绵羊或山羊。在一些实施方案中，受试者为动物园动物。在一些实施方案中，受试者为研究动物，例如啮齿类动物(例如小鼠或大鼠)、狗、猪或非人类灵长类动物。在一些实施方案中，动物为进行基因工程化的动物。在一些实施方案中，动物为转基因动物(例如，转基因小鼠和转基因猪)。在一些实施方案中，受试者为鱼或爬行动物。
在一些实施方案中，受试者为啮齿类动物，例如小鼠。在一些这类实施方案中，小鼠为转基因小鼠，例如表达人MHC(即，HLA)分子的小鼠(例如，Nicholson等人(2012)Adv.Hematol.2012:404081)。在一些实施方案中，受试者为表达人TCR的转基因小鼠或为抗原阴性小鼠(例如，Li等人(2010)Nat.Med.16:1029-1034和Obenaus等人(2015)Nat.Biotechnol.33:402-407)。在一些实施方案中，受试者为表达人HLA分子和人TCR的转基因小鼠。在一些实施方案中，例如在受试者为转基因HLA小鼠的情况下，将鉴定的TCR修饰为例如嵌合或人源化的。在一些实施方案中，例如类似于已知的结合蛋白人源化方法，修饰TCR支架。
在一些实施方案中，受试者为人。在一些实施方案中，受试者为以HPV16 E711-19表达为特征的病症(例如以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发)的动物模型。。例如，动物模型可为人类来源癌症的原位异种移植动物模型。
在一些实施方案中，受试者为人，例如患有以HPV16 E711-19表达为特征的病症的人。
可使用本文所述的方法来治疗任何有需要的受试者。如本文所用，“有需要的受试者”包括患有以HPV16 E711-19表达为特征的病症、以HPV16 E711-19表达为特征的病症复发和/或易患以HPV16 E711-19表达为特征的病症的任何受试者。如本文所述，以HPV16 E711-19表达为特征的病症可为以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发。
在本发明所涵盖的方法的一些实施方案中，受试者未针对以HPV16 E711-19表达为特征的病症进行治疗，例如化学疗法、放射疗法、靶向疗法和/或免疫疗法。在一些实施方案中，受试者针对以HPV16E711-19表达为特征的病症进行治疗，例如化学疗法、放射疗法、靶向疗法和/或免疫疗法。
在一些实施方案中，受试者已进行手术以去除癌性或癌前组织。在一些实施方案中，癌组织尚未被去除，例如，癌组织可能位于身体的不可手术区域，例如在对生命至关重要的组织中，或在外科手术将对患者造成相当大的伤害风险的区域中。
在一些实施方案中，受试者或其细胞对相关疗法具有抗性，例如对标准护理疗法、免疫检查点抑制剂疗法等具有抗性。举例来说，调节本发明所涵盖的一种或多种生物标志物可克服对免疫检查点抑制剂疗法的抗性。
在一些实施方案中，受试者需要根据本文所述的组合物和方法进行调节，例如已被鉴定为具有不想要的HPV16 E711-19表达的缺乏、存在或异常。
a.诊断方法
在本发明所涵盖的一方面，本文提供了用于检测HPV16 E711-19抗原和/或表达HPV16 E711-19的所关注的细胞的存在或不存在的诊断方法，所述方法包括通过使用本文所述的至少一种结合蛋白或至少一种宿主细胞来检测样品中所述HPV16 E711-19抗原的存在或不存在。在一些实施方案中，所述方法还包括获得样品(例如，从受试者)。在一些实施方案中，至少一种结合蛋白或至少一种宿主细胞与在MHC分子背景中的HPV16 E711-19肽表位形成复合物，并且以荧光激活细胞分选(FACS)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫化学、蛋白质印迹法或细胞内流式测定的形式检测复合物。
在本发明所涵盖的一方面，本文提供了用于检测受试者中的以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的程度的诊断方法，所述方法包括：a)使从受试者获得的样品与本文所述的至少一种结合蛋白、至少一种宿主细胞或宿主细胞的群体接触；以及b)检测反应性水平，其中与对照水平相比更高水平的反应性指示受试者中以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的程度。
在一些实施方案中，反应性水平由T细胞激活或效应功能，例如但不限于T细胞增殖、杀伤或细胞因子释放指示。对照水平可为参考数字或未暴露于以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的健康受试者的水平。
可从受试者获得生物样品，用于确定对如本文所述的肽抗原(例如HPV16 E711-19抗原)的免疫反应的存在和水平。如本文所用，“生物样品”可以是血液样品(可从中制备血清或血浆)、活检标本、体液(例如血液、分离的PBMC、分离的T细胞、肺灌洗液、腹水、粘膜冲洗液、滑液等)、骨髓、淋巴结、组织外植体、器官培养物或来自受试者或生物来源的任何其它组织或细胞制剂。也可以在接受任何药物组合物之前从受试者获得生物样品，所述生物样品可用作建立基线数据的对照。
抗原特异性T细胞反应通常根据本文所述的任何T细胞功能参数(例如增殖、细胞因子释放、CTL活性、改变的细胞表面标志物表型等)通过比较观察到的T细胞反应来确定，比较可在暴露于适当背景中的同源抗原(例如，当由免疫相容的抗原呈递细胞呈递时，用于启动或激活T细胞的抗原)的T细胞与来自相同来源群体的代之以暴露于结构上不同或不相关的对照抗原的T细胞之间进行。对同源抗原的反应比对对照抗原的反应大，具有统计学意义，表明抗原特异性。
免疫反应，例如细胞毒性T淋巴细胞(CTL)免疫反应的水平可通过本文所述和本领域常规实践的众多免疫学方法中的任一种来确定。例如，CTL免疫反应的水平可在施用本文所述的任一种由例如T细胞表达的结合蛋白之前和之后测定。用于测定CTL活性的细胞毒性测定可使用本领域常规实践的数种技术和方法中的任一种来进行(例如，Henkart等人,“Cytotoxic T-Lymphocytes”,Fundamental Immunology,Paul(编辑)(2003LippincottWilliams&Wilkins,Philadelphia,PA),第1127-50页，以及其中引用的参考文献)。
本发明部分提供用于准确分类生物样品是否与所关注的输出，例如所关注的靶标，例如HPV16 E711-19的表达相关的方法、系统和代码。在一些实施方案中，本发明可用于使用统计算法和/或经验数据将样品(例如来自受试者)分类为与以HPV16 E711-19表达为特征的病症相关或处于对以HPV16 E711-19表达为特征的病症的疗法有反应或无反应的风险下。
用于检测HPV16 E711-19的量或活性并因此可用于分类样品是否可能或不可能对以HPV16 E711-19表达为特征的病症的疗法有反应的示例性方法涉及使生物样品与能够检测生物样品中HPV16 E711-19的量或活性的剂，例如本文所述的HPV16 E711-19免疫原性肽或结合剂接触。在一些实施方案中，所述方法还包括例如从测试受试者获得生物样品。在一些实施方案中，使用至少一种剂，其中两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种这类剂可组合使用(例如，在夹心ELISA中)或串联使用。在某些情况下，统计算法是单一学习统计分类器系统。例如，单一学习统计分类器系统可用于基于预测或概率值以及生物标志物的存在或水平对样品进行分类。使用单一学习统计分类器系统通常以至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值和/或总体准确度对样品进行分类。
其它合适的统计算法是本领域技术人员众所周知的。例如，学习统计分类器系统包括一种机器学习算法技术，它能够适应复杂的数据集(例如，所关注的标志物组)并根据这类数据集做出决策。在一些实施方案中，使用单一学习统计分类器系统，例如分类树(例如，随机森林)。在其它实施方案中，使用2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个学习统计分类器系统的组合，优选串联使用。学习统计分类器系统的实例包括但不限于使用以下的那些系统：归纳学习(例如，决策/分类树，例如随机森林、分类和回归树(C&RT)、提升树等)、概率近似正确(ProbablyApproximately Correct，PAC)学习、连接学习(例如，神经网络(NN)、人工神经网络(ANN)、神经模糊网络(NFN)、网络结构、感知机(例如多层感知机)、多层前馈网络、神经网络的应用、信念网络中的贝叶斯学习(Bayesian learning)等)、强化学习(例如，已知环境中的被动学习(例如朴素学习、自适应动态学习和时序差分学习)、未知环境中的被动学习、未知环境中的主动学习、学习动作-价值函数、强化学习的应用等)和遗传算法和进化规划。其它学习统计分类器系统包括支持向量机(例如，核方法)、多元自适应回归样条(MARS)、莱文贝格-马夸特算法(Levenberg-Marquardt algorithm)、高斯-牛顿算法(Gauss-Newton algorithm)、混合高斯、梯度下降算法和学习向量量化(LVQ)。在某些实施方案中，本发明所涵盖的方法还包括将样品分类结果发送给临床医师，例如肿瘤科医生。
在一些实施方案中，在受试者的诊断(例如，包括HLA分型和/或杂合性丢失(LOH)以确定与所关注TCR与TCR-HLA复合物结合的相容性)之后向个体施用治疗有效量的基于诊断的确定的治疗。
在一些实施方案中，所述方法进一步涉及获得对照生物样品(例如，来自未患以HPV16 E711-19表达为特征的病症的受试者、处于缓解中的受试者、病症对疗法敏感的受试者、病症正在进展的受试者或其它所关注的受试者的生物样品)。
在本文所述的分析方法的一些实施方案中，将HPV16 E711-19表达(例如，在来自受试者的样品中)与预定对照(标准)样品进行比较。来自受试者的样品通常来自患病组织，例如癌细胞或组织。对照样品可来自同一受试者或来自不同受试者。对照样品通常为正常的未患病样品。然而，在一些实施方案中，例如为了疾病分期或为了评估治疗效果，对照样品可来自患病组织。对照样品可以是来自数个不同受试者的样品的组合。在一些实施方案中，将来自受试者的HPV16 E711-19表达测量值与预定水平进行比较。该预定水平通常从正常样品中获得。如本文所述，“预定”表述可用于(仅作为示例)评估可选择进行治疗的受试者，评估对癌症的反应，和/或评估对组合癌症疗法的反应。可在患有或未患以HPV16 E711-19表达为特征的病症的患者群体中确定预定的生物标志物量和/或活性测量值。预定的生物标志物量和/或活性测量值可以是单个数字，同样适用于每个患者，或者预定的生物标志物量和/或活性测量值可根据特定患者亚群而变化。受试者的年龄、体重、身高和其它因素可能影响个体的预定的生物标志物量和/或活性测量值。此外，可为每个受试者单独确定预定的生物标志物量和/或活性。在一个实施方案中，在本文所述的方法中确定和/或比较的量基于绝对测量值。
在另一实施方案中，在本文描述的方法中确定和/或比较的量基于相对测量值，例如比率(例如，治疗前与治疗后的生物标志物拷贝数、水平和/或活性，这类生物标志物测量值相对于加标或人造对照，这类生物标志物测量值相对于管家基因的表达等)。举例来说，相对分析可基于治疗前生物标志物测量值与治疗后生物标志物测量值相比的比率。治疗前生物标志物测量值可在治疗开始之前的任何时间进行。治疗后生物标志物测量值可在治疗开始之后的任何时间进行。在一些实施方案中，治疗后生物标志物测量值在治疗开始之后1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周或更长时间测定，并且甚至更长时间至无限期，以持续监测。治疗可包括单独或与其它剂，例如抗癌剂，如化学疗法或免疫检查点抑制剂组合的治疗以HPV16 E711-19表达为特征的病症的疗法。
预定的HPV16 E711-19表达可以是任何合适的标准。例如，预定的HPV16 E711-19表达可从正在评估受试者选择的相同或不同受试者获得。在一个实施方案中，预定的生物标志物量和/或活性测量值可从同一患者的先前评估获得。通过这种方式，可随时间监测患者选择的进展。此外，如果受试者为人，则对照可从对另一个人或多人的评估获得，例如选定人类组。通过这种方式，正在评估选择的人的选择程度可与合适的其他人进行比较，例如与所关注的人处于类似情况的其他人，例如罹患相似或相同疾患和/或相同种族的人。
在本发明所涵盖的一些实施方案中，HPV16 E711-19表达相对于预定水平的变化为约0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、1.0倍、1.5倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍或5.0倍或更大，或介于两者之间的任何范围，包括端点。当测量基于相对变化，例如基于治疗前生物标志物测量值与治疗后生物标志物测量值的比率时，这类截止值同样适用。
在一些实施方案中，可通过例如使用本文所述的组合物检测或定量HPV16 E711-19多肽或其抗原来检测和/或定量HPV16 E711-19表达。可通过本领域技术人员众所周知的多种方法中的任一种，例如通过免疫扩散、免疫电泳、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定、蛋白质印迹法、结合物-配体测定、免疫组织化学技术、凝集、补体测定、高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)、超扩散色谱法等来检测和定量多肽(例如，Basic and Clinical Immunology,Sites和Terr编辑,Appleton and Lange,Norwalk,Conn.第217-262页,1991)。
b.治疗方法
在本发明所涵盖的一方面，本文提供了用于预防和/或治疗以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发和/或用于诱导针对例如通过感染HPV病毒株，如HPV16而表达HPV16 E711-19抗原的所关注的细胞(例如过度增殖细胞)的免疫反应的方法。在一些实施方案中，方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的组合物，所述组合物包含表达至少一种结合蛋白的细胞。本发明所涵盖的方法也可以用于确定受试者中许多以HPV16E711-19表达为特征的不同病症，例如本文所述的那些病症对疗法的反应性。
在一些实施方案中，以MAGEA1表达为特征的病症为癌症。术语“癌症”或“肿瘤”或“过度增殖”是指存在具有致癌细胞典型特征，例如不受控制的增殖、永生、侵袭或转移潜能、快速生长和某些特征性形态特征的细胞。在一些实施方案中，由于免疫检查点蛋白，例如PD-1、PD-L1、PD-L2和/或CTLA-4的表达和活性，这类细胞部分或全部表现出这类特征。
癌细胞通常呈肿瘤形式，但这类细胞可能单独存在于动物体内，或者可能为非致瘤性癌细胞，例如血液癌症，如白血病中。如本文所用，术语“癌症”包括癌前癌和恶性癌。癌症包括但不限于多种癌症：癌瘤，包括膀胱癌(包括加速和转移性膀胱癌)、乳腺癌、结肠癌(包括结直肠癌)、肾癌、肝癌、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌和肺腺癌)、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、泌尿生殖道癌、淋巴系统癌、直肠癌、喉癌、胰腺癌(包括外分泌性胰腺癌)、食道癌、胃癌、胆囊癌、宫颈癌、甲状腺癌和皮肤癌(包括鳞状细胞癌)；淋巴谱系的造血肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkins lymphoma)、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤、组织细胞性淋巴瘤和伯克特淋巴瘤(Burketts lymphoma)；骨髓谱系造血肿瘤，包括急性和慢性骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征、髓系白血病和早幼粒细胞白血病；中枢和周围神经系统肿瘤，包括星形细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；间叶来源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；其它肿瘤，包括黑色素瘤、色素性异皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎癌；黑色素瘤、不可切除的III期或IV期恶性黑色素瘤、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、胃肠道癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性胶质母细胞瘤、宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝肿瘤、乳腺癌、结肠癌、头颈癌、胃癌、生殖细胞肿瘤、骨癌、骨肿瘤、成人骨恶性纤维组织细胞瘤；儿童骨恶性纤维组织细胞瘤、肉瘤、小儿肉瘤、鼻窦自然杀伤细胞、赘瘤、浆细胞赘瘤；骨髓增生异常综合征；神经母细胞瘤；睾丸生殖细胞肿瘤、眼内黑色素瘤、骨髓增生异常综合征；骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、滑膜肉瘤、慢性髓系白血病、急性淋巴母细胞性白血病、费城染色体阳性急性淋巴母细胞性白血病(Philadelphia chromosomepositive acute lymphoblastic leukemia，Ph+ALL)、多发性骨髓瘤、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、肥大细胞增多症和任何与肥大细胞增多症相关的症状和其任何转移。此外，病症包括色素性荨麻疹、肥大细胞增多症(例如弥漫性皮肤肥大细胞增多症)、人类孤立性肥大细胞瘤以及狗肥大细胞瘤和一些罕见亚型，如大疱性、红皮性和远血管扩张性肥大细胞增多症、伴有血液病的肥大细胞增多症(例如骨髓增生性或骨髓增生异常综合征)，或急性白血病、与肥大细胞增多症相关的骨髓增生性病症、肥大细胞白血病以及其它癌症。其它癌症也包括在病症范围内，包括但不限于以下：癌瘤，包括膀胱癌、尿路上皮癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、甲状腺癌、睾丸癌(尤其是睾丸精原细胞瘤)和皮肤癌；包括鳞状细胞癌；胃肠道间质瘤(“GIST”)；淋巴谱系造血肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤和伯克特淋巴瘤；骨髓谱系造血肿瘤，包括急性和慢性骨髓性白血病和早幼粒细胞白血病；间叶来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其它肿瘤，包括黑色素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、神经母细胞瘤和神经胶质瘤；中枢和周围神经系统肿瘤，包括星形细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；间叶来源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；以及其它肿瘤，包括黑色素瘤、色素性异皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌、畸胎癌、化学疗法难治性非精原细胞瘤型生殖细胞瘤和卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)，以及其任何转移瘤。适用于本发明所涵盖的方法的癌症类型的其它非限制性实例包括人类肉瘤和癌瘤，例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓质癌、支气管癌、肾细胞癌、肝肿瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、威尔姆斯瘤(Wilms'tumor)、骨癌、脑瘤、肺癌(包括肺腺癌)、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤，听神经瘤、寡树突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤；白血病，例如急性淋巴细胞性白血病和急性骨髓细胞性白血病(骨髓母细胞性、早幼粒细胞、骨髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病)；慢性白血病(慢性骨髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)；和真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金病和非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)和重链病。在一些实施方案中，癌症本质上为上皮的并且包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、妇科癌症、肾癌、喉癌、肺癌、口腔癌、头颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或皮肤癌。在一些实施方案中，上皮癌为非小细胞肺癌、非乳头状肾细胞癌、宫颈癌、卵巢癌(例如浆液性卵巢癌)或乳腺癌。可以各种其它方式表征上皮癌，包括但不限于浆液性、子宫内膜样、粘液性、透明细胞、布伦纳(Brenner)或未分化。在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：(晚期)非小细胞肺癌、黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌、(晚期)膀胱尿路上皮癌、(晚期)肾癌(RCC)、高微卫星不稳定性癌、经典霍奇金淋巴瘤、(晚期)胃癌、(晚期)宫颈癌、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、(晚期)肝细胞癌、侵袭性乳腺癌、膀胱尿路上皮癌和(晚期)默克尔细胞癌(merkel cell carcinoma)。
此外，本文所述的组合物也可以以组合疗法施用以进一步调节所需活性。另外的剂包括但不限于化学治疗剂、激素、抗血管生成剂、放射性标记的化合物或手术、冷冻疗法和/或放射疗法。前述治疗方法可与其它形式的常规疗法(例如，本领域技术人员众所周知的癌症标准护理疗法)联合施用，在常规疗法之前或之后连续施用。例如，这些调节剂可与治疗有效剂量的化学治疗剂一起施用。在另一实施方案中，这些调节剂与化学疗法联合施用以增强化学治疗剂的活性和功效。Physicians'DeskReference(PDR)公开了已用于治疗各种癌症的化学治疗剂的剂量。治疗有效的这些上述化学治疗药物的给药方案和剂量将取决于所治疗的特定黑色素瘤、疾病程度和本领域的医师熟悉的其它因素，并且可由医师决定。
单独或与其它疗法(例如癌症疗法)组合的使用本文所述的一种或多种组合物的疗法可用于接触表达HPV16 E711-19的细胞和/或施用于所需受试者，例如指示为可能对疗法有反应的受试者。在另一实施方案中，一旦受试者指示为不可能对疗法有反应(例如，根据本文所述的诊断或预后方法评估)，则可避免这类疗法，并且可推荐和/或施用替代治疗方案(例如靶向和/或非靶向癌症疗法)。
术语“靶向疗法”是指施用选择性地与所选生物分子相互作用从而治疗癌症的剂。例如，关于抑制免疫检查点抑制剂的靶向疗法可与本发明所涵盖的方法组合使用。
术语“免疫疗法(immunotherapy)”或“免疫疗法(immunotherapies)”通常是指以有益的方式调节免疫反应的任何策略，并且涵盖通过包括诱导、增强、抑制或以其它方式改变免疫反应的方法治疗罹患疾病或有感染疾病或疾病复发风险的受试者，以及使用受试者免疫系统的某些部分来对抗疾病(例如癌症)的任何治疗。在施用或未施用一种或多种用于达成该目的的剂下，受试者自身的免疫系统受到刺激(或抑制)。被设计用于引发或放大免疫反应的免疫疗法被称为“激活免疫疗法”。被设计用于减少或抑制免疫反应的免疫疗法被称为“抑制免疫疗法”。在一些实施方案中，免疫疗法对所关注的细胞，例如癌细胞具有特异性。在一些实施方案中，免疫疗法可为“非靶向”的，是指施用不选择性地与免疫系统细胞相互作用但调节免疫系统功能的剂。非靶向疗法的代表性实例包括但不限于化学疗法、基因疗法和放射疗法。
一些形式的免疫疗法为靶向疗法，其可包括例如使用癌症疫苗和/或致敏的抗原呈递细胞。举例来说，溶瘤病毒是一种能够感染和溶解癌细胞，同时不伤害正常细胞的病毒，这使得其在癌症疗法中可能有用。溶瘤病毒的复制既促进肿瘤细胞的破坏，又在肿瘤部位放大剂量。它们还可以用作抗癌基因的载体，使所述基因能够被特异性地递送到肿瘤部位。免疫疗法可涉及用于短期保护宿主的被动免疫，这通过施用针对癌症抗原或疾病抗原的预先形成的抗体(例如，施用任选地与化学治疗剂或毒素连接的针对肿瘤抗原的单克隆抗体)来实现。免疫疗法也可能侧重于使用癌细胞系的细胞毒性淋巴细胞识别表位。或者，反义多核苷酸、核酶、RNA干扰分子、三螺旋多核苷酸等可用于选择性地调节与肿瘤或癌症的起始、进展和/或病理学相关的生物分子。类似地，免疫疗法可采取基于细胞的疗法的形式。例如，过继性细胞免疫疗法是一类使用免疫细胞(例如T细胞)的免疫疗法，所述免疫细胞对患者的癌症具有天然反应性或基因工程化的反应性，然后再转移回癌症患者体内。注射大量激活的肿瘤特异性T细胞可诱导癌症完全和持久的消退。
免疫疗法可涉及用于短期保护宿主的被动免疫，这通过施用针对癌症抗原或疾病抗原的预先形成的抗体(例如，施用任选地与化学治疗剂或毒素连接的针对肿瘤抗原的单克隆抗体)来实现。免疫疗法也可能侧重于使用癌细胞系的细胞毒性淋巴细胞识别表位。或者，反义多核苷酸、核酶、RNA干扰分子、三螺旋多核苷酸等可用于选择性地调节与肿瘤或癌症的起始、进展和/或病理学相关的生物分子。
在一些实施方案中，免疫治疗剂为免疫刺激分子的激动剂；免疫抑制分子的拮抗剂；趋化因子的拮抗剂；刺激T细胞激活的细胞因子的激动剂；对抑制T细胞激活的细胞因子有拮抗或抑制作用的剂；和/或与B7家族的膜结合蛋白结合的剂。在一些实施方案中，免疫治疗剂为免疫抑制分子的拮抗剂。在一些实施方案中，免疫治疗剂可为针对细胞因子、趋化因子和生长因子的剂，例如中和肿瘤相关的细胞因子、趋化因子、生长因子和其它可溶性因子，包括IL-10、TGF-β和VEGF的抑制作用的中和抗体。
在一些实施方案中，免疫疗法包含一种或多种免疫检查点的抑制剂。术语“免疫检查点”是指CD4+和/或CD8+ T细胞的细胞表面上的一组分子，其通过调节抗癌免疫反应，例如下调或抑制抗肿瘤免疫反应来微调免疫反应。免疫检查点蛋白是本领域中众所周知的，并且包括但不限于CTLA-4、PD-1、VISTA、B7-H2、B7-H3、PD-L1、B7-H4、B7-H6、ICOS、HVEM、PD-L2、CD200R、CD160、gp49B、PIR-B、KRLG-1、KIR家族受体、TIM-1、TIM-3、TIM-4、LAG-3(CD223)、IDO、GITR、4-IBB、OX-40、BTLA、SIRPα(CD47)、CD48、2B4(CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT、HHLA2、嗜乳脂蛋白和A2aR(参见例如WO 2012/177624)。所述术语还涵盖生物活性蛋白片段，以及编码全长免疫检查点蛋白的核酸。
一些免疫检查点为“免疫抑制性免疫检查点”，其涵盖抑制、下调或遏制免疫系统功能(例如免疫反应)的分子(例如蛋白质)。例如，PD-L1(程序性死亡配体1)，又称为CD274或B7-H1，是一种传递抑制信号，减少T细胞增殖以遏制免疫系统的蛋白质。CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)，又称为CD152，是一种在抗原呈递细胞的表面上的蛋白质受体，其用作免疫检查点(“关闭”开关)来下调免疫反应。TIM-3(T细胞免疫球蛋白和粘蛋白域-3)，又称为HAVCR2，是一种细胞表面蛋白，其用作免疫检查点来调节巨噬细胞激活。VISTA(T细胞激活的V域Ig遏制因子)是一种I型跨膜蛋白，其可用作免疫检查点来抑制T细胞效应功能并且维持周围耐受性。LAG-3(淋巴细胞激活基因3)是一种免疫检查点受体，其负向调控T细胞的增殖、激活和稳态。BTLA(B和T淋巴细胞衰减因子)是一种经由与肿瘤坏死家族受体(TNF-R)的相互作用来抑制T细胞的蛋白质。KIR(杀伤细胞免疫球蛋白样受体)是在NK细胞和少数T细胞上表达的蛋白质家族，其可遏制NK细胞的细胞毒活性。在一些实施方案中，免疫治疗剂可以是对免疫抑制酶具有特异性的剂，例如可阻断精氨酸酶(ARG)和吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)(一种遏制T细胞和NK细胞的免疫检查点蛋白)活性的抑制剂，其改变免疫抑制肿瘤微环境中氨基酸精氨酸和色氨酸的分解代谢。抑制剂可包括但不限于靶向表达ARG的M2巨噬细胞的N-羟基-L-Arg(NOHA)、硝基阿司匹林(nitroaspirin)或西地那非(sildenafil)可同时阻断ARG和一氧化氮合酶(NOS)；和IDO抑制剂，例如1-甲基-色氨酸。所述术语还涵盖生物活性蛋白片段，以及编码全长免疫检查点蛋白和其生物活性蛋白片段的核酸。在一些实施方案中，所述术语还涵盖根据本文提供的同源描述的任何片段。
相比之下，其它免疫检查点为“免疫刺激性”的，涵盖激活、刺激或促进免疫系统功能(例如免疫反应)的分子(例如蛋白质)。在一些实施方案中，免疫刺激分子为CD28、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、CD27、CD70、CD40、CD40L、CD122、CD226、CD30、CD30L、OX40、OX40L、HVEM、BTLA、GITR和其配体GITRL、LIGHT、LTβR、LTαβ、ICOS(CD278)、ICOSL(B7-H2)和NKG2D。CD40(分化簇40)是一种在抗原呈递细胞上发现的为细胞激活所必需的共刺激蛋白。OX40，又称为肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4)或CD134，通过防止T细胞死亡，随后增加细胞因子的产生来参与激活后免疫反应的维持。CD137是肿瘤坏死因子受体(TNF-R)家族的成员，可共刺激激活T细胞以增强增殖和T细胞存活。CD122是白细胞介素-2受体(IL-2)蛋白的亚基，其促进未成熟的T细胞分化为调控、效应或记忆T细胞。CD27是肿瘤坏死因子受体超家族的成员，并且用作共刺激免疫检查点分子。CD28(分化簇28)是一种在T细胞上表达的蛋白质，其提供T细胞激活和存活所需的共刺激信号。GITR(糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白)，又称为TNFRSF18和AITR，是一种在调控性T细胞维持的显性免疫自身耐受性中起关键作用的蛋白质。ICOS(可诱导T细胞共刺激分子)，又称为CD278，是一种CD28超家族共刺激分子，其在激活T细胞上表达并且在T细胞信号传导和免疫反应中发挥作用。
免疫检查点和其序列是本领域中众所周知的，并且代表性实施方案在下面进一步描述。免疫检查点通常与成对的抑制性受体和天然结合搭配物(例如，配体)有关。例如，PD-1多肽是能够将抑制信号传递到免疫细胞从而抑制免疫细胞效应功能的抑制性受体，或者例如当以可溶的单体形式存在时，能够促进免疫细胞的共刺激(例如，通过竞争性抑制)。优选的PD-1家族成员与PD-1共享序列同一性并且结合一个或多个B7家族成员，例如B7-1、B7-2、PD-1配体和/或抗原呈递细胞上的其它多肽。术语“PD-1活性”包括PD-1多肽例如通过与抗原呈递细胞上的天然PD-1配体啮合而在激活免疫细胞中调节抑制信号的能力。免疫细胞中抑制信号的调节引起免疫细胞增殖和/或细胞因子分泌的调节。因此，术语“PD-1活性”包括PD-1多肽结合其天然配体的能力、调节免疫细胞抑制信号的能力和调节免疫反应的能力。术语“PD-1配体”是指PD-1受体的结合搭配物，并且包括PD-L1(Freeman等人(2000)J.Exp.Med.192:1027-1034)和PD-L2(Latchman等人(2001)Nat.Immunol.2:261)。术语“PD-1配体活性”包括PD-1配体多肽结合其天然受体(例如PD-1或B7-1)的能力、调节免疫细胞抑制信号的能力和调节免疫反应的能力。
如本文所用，术语“免疫检查点疗法”是指使用抑制免疫抑制性免疫检查点，例如抑制其核酸和/或蛋白质的剂。一种或多种这类免疫检查点的抑制可阻断或以其它方式中和抑制性信号传导，因此上调免疫反应，从而更有效地治疗癌症。可用于抑制免疫检查点的示例性剂包括可结合和/或灭活或抑制免疫检查点蛋白或其片段的抗体、小分子、肽、肽模拟物、天然配体和天然配体的衍生物；以及可下调免疫检查点核酸或其片段的表达和/或活性的RNA干扰、反义、核酸适体等。用于上调免疫反应的示例性剂包括针对一种或多种免疫检查点蛋白的抗体，其阻断蛋白质与其天然受体之间的相互作用；一种或多种免疫检查点蛋白的非激活形式(例如，显性阴性多肽)；阻断一种或多种免疫检查点蛋白与其天然受体之间的相互作用的小分子或肽；结合其天然受体的融合蛋白(例如，与抗体或免疫球蛋白的Fc部分融合的免疫检查点抑制蛋白的细胞外部分)；阻断免疫检查点核酸转录或翻译的核酸分子；等等。这类剂可直接阻断一种或多种免疫检查点与其天然受体(例如抗体)之间的相互作用，以防止抑制性信号传导并且上调免疫反应。或者，剂可间接阻断一种或多种免疫检查点蛋白与其天然受体之间的相互作用，以防止抑制性信号传导并且上调免疫反应。例如，免疫检查点蛋白配体的可溶形式，例如稳定的细胞外结构域，可与其受体结合，以间接降低受体与合适配体结合的有效浓度。在一个实施方案中，单独或组合使用抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和/或抗PD-L2抗体来抑制免疫检查点。用于阻断PD-1通路的治疗剂包括拮抗性抗体和可溶性PD-L1配体。针对PD-1和PD-L1/2抑制通路的拮抗剂可包括但不限于针对PD-1或PD-L1/2的拮抗性抗体(例如，17D8、2D3、4H1、5C4(又称为纳武单抗(nivolumab)或BMS-936558)、4A11、7D3和5F4，美国专利No.8,008,449中公开；AMP-224、匹地利珠单抗(pidilizumab)(CT-011)、派姆单抗(pembrolizumab)和美国专利No.8,779,105、8,552,154、8,217,149、8,168,757、8,008,449、7,488,802、7,943,743、7,635,757和6,808,710中公开的抗体。类似地，另外的代表性检查点抑制剂可以是但不限于针对抑制性调节因子CTLA-4(抗细胞毒性T淋巴细胞抗原4抗细胞毒性T淋巴细胞抗原4)的抗体，例如伊匹单抗(ipilimumab)、曲美木单抗(tremelimumab)(完全人源化)、抗CD28抗体、抗CTLA-4粘附素、抗CTLA-4结构域抗体、单链抗CTLA-4抗体片段、重链抗CTLA-4片段、轻链抗CTLA-4片段和其它抗体，例如以下中公开的那些抗体：美国专利No.8,748,815；8,529,902；8,318,916；8,017,114；7,744,875；7,605,238；7,465,446；7,109,003；7,132,281；6,984,720；6,682,736；6,207,156；和5,977,318，以及欧洲专利No.1212422、美国专利公布号2002/0039581和2002/086014，和Hurwitz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:10067-10071。
以PD-1、PD-L1、PD-L2和CTLA-4为例的免疫检查点活性、配体、阻断等的代表性定义通常适用于其它免疫检查点。
术语“非靶向疗法”是指施用不选择性地与所选生物分子相互作用但治疗癌症的剂。非靶向疗法的代表性实例包括但不限于化学疗法、基因疗法和放射疗法。
在一个实施方案中，使用化学疗法。化学疗法包括施用化学治疗剂。这类化学治疗剂可以是但不限于选自以下化合物组的那些化学治疗剂：铂化合物、细胞毒性抗生素、抗代谢物、抗有丝分裂剂、烷化剂、砷化合物、DNA拓扑异构酶抑制剂、紫杉烷类、核苷类似物、植物生物碱和毒素；和它们的合成衍生物。示例性剂包括但不限于烷化剂：氮芥(例如环磷酰胺、异环磷酰胺(ifosfamide)、曲磷酰胺(trofosfamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、雌莫司汀(estramustine)和美法仑(melphalan))、亚硝基脲(例如卡莫司汀(carmustine，BCNU)和洛莫司汀(lomustine，CCNU))、烷基磺酸盐(例如白消安(busulfan)和曲奥舒凡(treosulfan))、三氮烯(例如达卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺(temozolomide))、顺铂(cisplatin)、曲奥舒凡和曲磷酰胺；植物生物碱：长春花碱(vinblastine)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxol)；DNA拓扑异构酶抑制剂：替尼泊苷(teniposide)、克立那托(crisnatol)和丝裂霉素(mitomycin)；抗叶酸剂：甲氨蝶呤(methotrexate)、霉酚酸(mycophenolic acid)和羟基脲；嘧啶类似物：5-氟尿嘧啶、脱氧氟尿苷(doxifluridine)和胞嘧啶阿拉伯糖苷；嘌呤类似物：巯基嘌呤和硫鸟嘌呤；DNA抗代谢物：2'-脱氧-5-氟尿苷、甘氨酸阿非迪霉素(aphidicolin glycinate)和吡唑并咪唑；和抗有丝分裂剂：软海绵素、秋水仙碱和根瘤菌素。类似地，其它示例性剂包括含铂化合物(例如，顺铂、卡铂、奥沙利铂)、长春花生物碱(例如，长春新碱(vincristine)、长春花碱、长春地辛(vindesine)和长春瑞滨(vinorelbine))、紫杉醇(例如，太平洋紫杉醇或太平洋紫杉醇等效物，例如纳米粒子白蛋白结合型太平洋紫杉醇(ABRAXANE)、二十二碳六烯酸结合型太平洋紫杉醇(DHA-太平洋紫杉醇、Taxoprexin)、聚谷氨酸结合型太平洋紫杉醇(PG-太平洋紫杉醇、聚谷氨酸太平洋紫杉醇(paclitaxel poliglumex)、CT-2103、XYOTAX)、肿瘤激活前药(TAP)ANG1005(Angiopep-2与三个太平洋紫杉醇分子结合)、太平洋紫杉醇-EC-1(太平洋紫杉醇与识别erbB2的肽EC-1结合)和葡萄糖缀合的太平洋紫杉醇，例如2'-太平洋紫杉醇甲基2-吡喃葡萄糖基琥珀酸酯；多西紫杉醇、紫杉醇)、表鬼臼苦素(例如，依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、拓扑替康(topotecan)、9-氨基喜树碱、喜树碱、伊立替康(irinotecan)、克立那托、丝裂霉素C(mytomycin C))、抗代谢物、DHFR抑制剂(例如，甲氨蝶呤、二氯甲氨蝶呤、三甲氨蝶呤、依达曲沙(edatrexate))、IMP脱氢酶抑制剂(例如霉酚酸、噻唑呋林(tiazofurin)、利巴韦林(ribavirin)和EICAR)、核糖核苷酸还原酶抑制剂(例如羟基脲和去铁胺)、尿嘧啶类似物(例如5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷、脱氧氟尿苷、瑞曲塞(ratitrexed)、替加氟-尿嘧啶(tegafur-uracil)、卡培他滨(capecitabine))、胞嘧啶类似物(例如，阿糖胞苷(ara C)、胞嘧啶阿拉伯糖苷和氟达拉滨)、嘌呤类似物(例如，巯基嘌呤和硫鸟嘌呤)、维生素D3类似物(例如，EB 1089、CB 1093和KH 1060)、异戊二烯化抑制剂(例如，洛伐他汀(lovastatin))、多巴胺能神经毒素(例如，1-甲基-4-苯基吡啶鎓离子)、细胞周期抑制剂(例如，星形孢菌素)、放线菌素(actinomycin)(例如，放线菌素D(actinomycinD)、放线菌素D(dactinomycin))、博来霉素(bleomycin)(例如，博来霉素A2、博来霉素B2、培洛霉素(peplomycin))、蒽环霉素(anthracycline)(例如，道诺霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、聚乙二醇化脂质体多柔比星、伊达比星(idarubicin)、表柔比星(epirubicin)、吡柔比星(pirarubicin)、佐柔比星(zorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone))、MDR抑制剂(例如，维拉帕米(verapamil))、Ca2+ATP酶抑制剂(例如，毒胡萝卜素(thapsigargin))、伊马替尼(imatinib)、沙利度胺(thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，阿西替尼(axitinib)(AG013736)、波舒替尼(bosutinib)(SKI-606)、西地尼布(cediranib)(RECENTINTM、AZD2171)、达沙替尼(dasatinib)(BMS-354825)、厄洛替尼(erlotinib)吉非替尼(gefitinib)伊马替尼(imatinib)(CGP57148B、STI-571)、拉帕替尼(lapatinib)来他替尼(lestaurtinib)(CEP-701)、来那替尼(neratinib)(HKI-272)、尼罗替尼(nilotinib)司马尼布(semaxanib)(司马尼布(semaxinib)、SU5416)、舒尼替尼(sunitinib)(SU11248)、托西尼布(toceranib)凡德他尼(vandetanib)(ZD6474)、瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787、PTK/ZK)、曲妥珠单抗(trastuzumab)贝伐单抗(bevacizumab)利妥昔单抗(rituximab)西妥昔单抗(cetuximab)帕尼单抗(panitumumab)兰尼单抗(ranibizumab)尼罗替尼(nilotinib)索拉非尼(sorafenib)依维莫司(everolimus)阿仑单抗(alemtuzumab)吉妥单抗(gemtuzumab ozogamicin)替西罗莫司(temsirolimus)ENMD-2076、PCI-32765、AC220、乳酸多韦替尼(dovitinib lactate)(TKI258、CHIR-258)、BIBW 2992(TOVOKTM)、SGX523、PF-04217903、PF-02341066、PF-299804、BMS-777607、ABT-869、MP470、BIBF 1120AP24534、JNJ-26483327、MGCD265、DCC-2036、BMS-690154、CEP-11981、替沃扎尼(tivozanib)(AV-951)、OSI-930、MM-121、XL-184、XL-647和/或XL228)、蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米(bortezomib))、mTOR抑制剂(例如，雷帕霉素(rapamycin)、替西罗莫司(CCI-779)、依维莫司(RAD-001)、地磷莫司(ridaforolimus)、AP23573(Ariad)、AZD8055(AstraZeneca)、BEZ235(Novartis)、BGT226(Norvartis)、XL765(Sanofi Aventis)、PF-4691502(Pfizer)、GDC0980(Genentech)、SF1126(Semafoe)和OSI-027(OSI))、奥利默森(oblimersen)、吉西他滨、洋红霉素(carminomycin)、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、培美曲塞(pemetrexed)、环磷酰胺、达卡巴嗪、丙卡比嗪(procarbizine)、泼尼松龙(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、喜树碱、普卡霉素(plicamycin)、天冬酰胺酶、氨基喋呤、甲氨蝶呤、卟啉霉素(porfiromycin)、美法仑、异长春碱(leurosidine)、长春罗新(leurosine)、苯丁酸氮芥、曲贝替定(trabectedin)、丙卡巴肼(procarbazine)、园皮海绵内酯(discodermolide)、洋红霉素、氨基喋呤和六甲蜜胺(hexamethyl melamine)。还可以使用包含一种或多种化学治疗剂的组合物(例如，FLAG、CHOP)。FLAG包含氟达拉滨、胞嘧啶阿拉伯糖苷(Ara-C)和G-CSF。CHOP包含环磷酰胺、长春新碱、多柔比星和泼尼松(prednisone)。在另一实施方案中，使用PARP(例如，PARP-1和/或PARP-2)抑制剂，并且这类抑制剂是本领域众所周知的(例如，奥拉帕利(Olaparib)、ABT-888、BSI-201、BGP-15(N-Gene Research Laboratories公司)；INO-1001(Inotek Pharmaceuticals公司)；PJ34(Soriano等人,2001；Pacher等人,2002b)；3-氨基苯甲酰胺(Trevigen)；4-氨基-1,8-萘酰亚胺(Trevigen)；6(5H)-菲啶酮(Trevigen)；苯甲酰胺(美国专利Re.36,397)；和NU1025(Bowman等人)。作用机制通常与PARP抑制剂结合PARP并且降低其活性的能力有关。PARP催化β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)转化为烟酰胺和聚-ADP-核糖(PAR)。聚(ADP-核糖)和PARP均与转录、细胞增殖、基因组稳定性和致癌作用的调控有关(Bouchard等人(2003)Exp.Hematol.31:446-454)；Herceg(2001)Mut.Res.477:97-110)。聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP1)是修复DNA单链断裂(SSB)的关键分子(de Murcia J.等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:7303-7307；Schreiber等人(2006)Nat.Rev.Mol.CellBiol.7:517-528；Wang等人(1997)GenesDev.11:2347-2358)。通过抑制PARP1功能来敲除SSB修复可诱导DNA双链断裂(DSB)，这可能会在具有缺陷同源定向DSB修复的癌细胞中引发合成致死(Bryant等人(2005)Nature 434:913-917；Farmer等人(2005)Nature434:917-921)。前述化学治疗剂的实例为说明性的而非限制性的。
在另一实施方案中，使用放射疗法。放射疗法中使用的放射线可以是电离辐射。放射疗法也可以是γ射线、X射线或质子束。放射疗法的实例包括但不限于外射束放射疗法、放射性同位素(I-125、钯、铱)的间质植入、放射性同位素(例如锶-89)、胸部放射疗法、腹膜内P-32放射疗法和/或全腹部和盆腔放射疗法。有关放射疗法的一般概述，参见Hellman,第16章:Principles ofCancerManagement:Radiation Therapy,第6版,2001；DeVita等人编辑,J.B.Lippencott Company,Philadelphia。放射疗法可作为外射束放射或远距离疗法来施用，其中放射线从远程源引导。放射治疗也可以作为内部疗法或近距离疗法来施用，其中将放射源放置在身体内部靠近癌细胞或肿瘤块的位置。还涵盖光动力疗法的用途，其包括施用光敏剂，例如血卟啉和其衍生物、维托泊芬(BPD-MA)、酞菁、光敏剂Pc4、脱甲氧基-竹红菌素A(demethoxy-hypocrellinA)；和2BA-2-DMHA。
在另一实施方案中，使用激素疗法。激素治疗性治疗可包含例如激素激动剂、激素拮抗剂(例如氟他胺(flutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate，LUPRON)、LH-RH拮抗剂)、激素生物合成和加工抑制剂和类固醇(例如地塞米松、类视色素(retinoids)、三角肌(deltoid)、倍他米松(betamethasone)、皮质醇、可的松(cortisone)、泼尼松、去氢睾酮、糖皮质激素、盐皮质激素、雌激素、睾酮、助孕素)、维生素A衍生物(例如，全反式维甲酸(ATRA))；维生素D3类似物；抗助孕素(例如米非司酮(mifepristone)、奥那司酮(onapristone))或抗雄激素(例如醋酸环丙孕酮(cyproterone acetate))。
在一方面，本文提供了一种在受试者中引发对表达HPV16 E711-19抗原的细胞的免疫反应的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：向受试者施用本文所述的药物组合物，其中当施用于受试者时，所述药物组合物引发对表达HPV16 E711-19抗原的细胞的免疫反应。
在一些实施方案中，免疫反应可包括细胞介导的免疫反应。细胞免疫反应是涉及T细胞并且可在体外或体内测定的反应。举例来说，全身细胞免疫反应可测定为在施用药物组合物之后的合适时间从受试者取样的细胞(例如，外周血白血球(PBL))中的T细胞增殖活性。在将例如PBMC与刺激物一起孵育适当时间段之后，可测定[3H]胸苷并入。可使用流式细胞术来测定正在增殖的T细胞子集。
在本发明所涵盖的另一方面，本文提供的方法包括如上所述向人和非人类哺乳动物施用。还考虑兽医应用。在一些实施方案中，受试者可以是可在其中引发免疫反应的任何活生物体。
在一些实施方案中，可在任何适当时间施用所述药物组合物。举例来说，可在治疗患有以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的受试者之前或期间进行施用，并且在以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发变得临床上不可检测之后继续施用。也可以在显示复发征象的受试者中继续施用。
在一些实施方案中，可以治疗或预防有效量施用药物组合物。可使用已知的程序并且以足以实现所需作用的剂量和时间段向受试者施用药物组合物。
在一些实施方案中，可在任何合适部位向受试者施用药物组合物。可使用本领域公知的方法实现施用。可通过直接注射或通过本领域中使用的任何其它方式，包括但不限于血管内、脑内、肠胃外、腹膜内、静脉内、硬膜外、脊椎内、胸骨内、关节内、滑膜内、鞘内、动脉内、心内或肌肉内施用，将包括细胞的剂引入所需部位。例如，所关注的受试者可通过各种途径植入移植的细胞。这类途径包括但不限于静脉内施用、皮下施用、向特定组织施用(例如，局灶性移植)、股骨骨髓腔内注射、脾脏内注射、胎肝肾囊下施用等。在某些实施方案中，本发明所涵盖的癌症疫苗通过瘤内或皮下注射到受试者。细胞可在一次输注中施用，或通过在足以产生所需作用的限定时间段内连续输注来施用。关于移植的细胞的移植、植入评估和标志物表型分析的示例性方法是本领域中众所周知的(参见例如Pearson等人(2008)C urr.Protoc.Immunol.81:15.21.1-15.21.21；Ito等人(2002)Blood 100:3175-3182；Traggiai等人(2004)Science 304:104-107；Ishikawa等人Blood(2005)106:1565-1573；Shultz等人(2005)J.Immunol.174:6477-6489；和Holyoake等人(1999)Exp.Hematol.27:1418-1427)。在一些实施方案中，将以有效产生所需反应(引发免疫反应或预防性或治疗性治疗以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发和/或相关症状)的量和时间段施用剂量。
药物组合物可在其它疗法之后、之前或同时给与，所述其它疗法包括也引发受试者的免疫反应的疗法。举例来说，受试者可预先或同时由其它形式的免疫调节剂治疗，这类其它疗法可以不干扰本文所述的组合物的免疫原性的方式提供。
施用可由护理人员(例如，医师、兽医)适当地计时，并且可取决于受试者的临床疾患、施用目标和/或还考虑或施用的其它疗法。在一些实施方案中，可施用初始剂量，并且监测受试者的免疫学和/或临床反应。免疫监测的合适手段包括使用患者的外周血淋巴细胞(PBL)作为反应物并且使用本文所述的免疫原性肽或肽-MHC复合物作为刺激物。也可以通过施用部位处的延迟发炎反应来确定免疫反应。适当时可在初始剂量之后给与一个或多个剂量，通常每月、每半月或每周一次，直到实现所需作用。此后，可根据需要给与另外的加强剂量或维持剂量，尤其当免疫学或临床益处显示减弱时。
通常，适当剂量和治疗方案以足以提供益处的量提供活性分子或细胞。可通过在治疗的受试者中建立与未治疗的受试者相比改善的临床结果(例如，更频繁的完全或部分缓解，或更长的无病生存期)来监测这类反应。预先存在的对病毒蛋白的免疫反应的增加通常与临床结果的改善相关。通常可使用常规的标准增殖、细胞毒性或细胞因子测定来评估这类免疫反应。
对于预防性使用，剂量应足以预防与疾病或病症相关的疾病、延缓其发作或减轻其严重程度。根据本文所述的方法施用的免疫原性组合物的预防益处可通过进行临床前(包括体外、离体和体内动物研究)和临床研究，并且通过适当统计学、生物学和临床方法和技术对由此获得的数据进行分析来确定，所有这些均可由普通技术人员轻松实践。
如本文所用，组合物的施用是指将其递送到受试者，与递送途径或方式无关。施用可连续或间歇进行，并且可肠胃外施用。施用可用于治疗已确认患有公认疾患、疾病或疾病病况的受试者，或用于治疗易患或有风险发展这类疾患、疾病或疾病病况的受试者。与辅助疗法的共同施用可包括以任何顺序和任何给药方案同时和/或依序递送多种剂(例如，具有一种或多种细胞因子的工程化免疫细胞；免疫抑制疗法，例如钙调神经磷酸酶抑制剂、皮质类固醇、微管抑制剂、低剂量的霉酚酸前药或它们的任何组合)。
在一些实施方案中，将多剂本文所述的宿主细胞(例如，工程化免疫细胞)施用于受试者，其可以施用之间约2至约4周的间隔施用。
本发明所涵盖的治疗或预防方法可作为治疗过程或方案的一部分施用于受试者，所述治疗过程或方案可包含在施用本发明公开的单位剂量、细胞或组合物之前或之后进行另外的治疗。例如，在一些实施方案中，接受单位剂量宿主细胞(例如，工程化免疫细胞)的受试者正在接受或以前接受过造血细胞移植(HCT；包括清髓性和非清髓性HCT)。在任何前述实施方案中，用于HCT的造血细胞可以是“通用供体”细胞，其被修饰成减少或消除编码选自MHC、抗原和结合蛋白的多肽产物的一种或多种内源基因的表达(例如，根据本文所述的方法通过染色体基因敲除)。
用于进行细胞移植的技术和方案是本领域中已知的并且可包含移植任何合适的供体细胞，例如源自脐带血、骨髓或外周血的细胞、造血干细胞、动员干细胞或来自羊水的细胞。因此，在一些实施方案中，本发明所涵盖的宿主细胞(例如，工程化免疫细胞)可与干细胞疗法一起或在干细胞疗法之后不久施用。
在一些实施方案中，本发明所涵盖的方法还可包括施用一种或多种另外的剂以通过组合疗法治疗疾病或病症(例如，以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发)。例如，在一些实施方案中，组合疗法包括将本发明所涵盖的宿主细胞或结合蛋白与抗病毒剂(并行、同时或依次)施用。在一些实施方案中，组合疗法包括将本发明所涵盖的宿主细胞或结合蛋白与洛匹那韦(lopinavir)/利托那韦(ritonavir)、氯喹(chloroquine)、利巴韦林、类固醇药物、羟氯喹和/或干扰素α一起施用。在一些实施方案中，组合疗法包括将本发明所涵盖的宿主细胞、组合物或单位剂量的宿主细胞与二次疗法，例如手术、抗体、疫苗或它们的任何组合一起施用。
在一些实施方案中，受试者为人，例如患有以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的人。在一些实施方案中，受试者为啮齿类动物，例如小鼠。在一些这类实施方案中，小鼠为转基因小鼠，例如表达人MHC(即，HLA)分子，例如HLA-A2的小鼠(例如，Nicholson等人(2012)Adv.Hematol.2012:404081)。
在一些实施方案中，受试者为表达人TCR的转基因小鼠或为抗原阴性小鼠(例如，Li等人(2010)Nat Med.16:1029-1034和Obenaus等人(2015)Nat.Biotechnol.33:402-407)。在一些实施方案中，受试者为表达人HLA分子和人TCR的转基因小鼠。
在一些实施方案中，例如在受试者为转基因HLA小鼠的情况下，将鉴定的TCR修饰为例如嵌合或人源化的。在一些实施方案中，例如类似于已知的结合蛋白人源化方法，修饰TCR支架。
c.筛选方法
本发明所涵盖的另一方面涵盖筛选分析。
本发明涵盖对与HPV16 E711-19或其抗原结合或调节HPV16E711-19或其抗原活性的剂，例如测试蛋白进行筛选的测定。这类剂包括但不限于抗体、蛋白质、融合蛋白、小分子和核酸。在一些实施方案中，用于鉴定调节免疫反应的剂的方法需要测定候选剂调节HPV16E711-19活性和进一步调节所关注的免疫反应的能力，例如调节细胞毒性T细胞激活和/或活性、癌细胞对免疫检查点疗法的敏感性等。
在一些实施方案中，测定为无细胞或基于细胞的测定，其包括将靶标与测试剂接触，并且例如通过测量如下所述的直接或间接参数，测定测试剂调节(例如，上调或下调)靶标的量和/或活性的能力。
在一些实施方案中，测定为基于细胞的测定，例如包括以下的测定：使(a)所关注的细胞与测试剂接触并且测定测试剂调节靶标的量和/或活性的能力，例如结合特性。测定多肽相互结合或相互作用的能力可通过例如测量直接结合或通过测量免疫细胞激活或功能的参数来实现。
在另一实施方案中，测定为基于细胞的测定，其包括使细胞(例如癌细胞)与免疫细胞(例如，细胞毒性T细胞)和测试剂接触，并且例如通过测量如下所述的直接或间接参数，测定测试剂调节靶标的量和/或活性，和/或调节免疫反应的能力。
上文和本文描述的方法也可以适用于测试一种或多种已知调节本文描述的一种或多种生物标志物的量和/或活性的剂，以确认所述一种或多种生物标志物的调节和/或确认剂对所需表型读数的影响，例如调节的免疫反应、对免疫检查点阻断的敏感性等。
在一些实施方案中，测定测试剂(例如抗体、融合蛋白、肽或小分子)调节一组给定多肽之间的相互作用的能力可通过测定该组多肽的一个或多个成员的活性来实现。例如，蛋白质和/或一种或多种结合搭配物的活性可通过检测细胞第二信使(例如细胞内信号传导)的诱导、检测适当底物的催化/酶活性、检测报告基因(包含与编码可检测标志物的核酸可操作性连接的靶标响应性调控元件，例如氯霉素乙酰转移酶)的诱导或检测由蛋白质和/或一种或多种结合搭配物调节的细胞反应来测定。例如，可通过在增殖测定中测量化合物调节免疫细胞共刺激或抑制的能力，或通过干扰所述多肽与识别其一部分的抗体结合的能力来测定测试剂与所述多肽结合或相互作用的能力。
当添加到体外测定时，调节靶标量和/或活性，例如与一种或多种结合搭配物的相互作用的剂可通过其抑制免疫细胞增殖和/或效应功能，或诱导无能、克隆缺失和/或耗竭的能力来鉴定。例如，可在经由激活受体刺激信号转导的剂存在下培养细胞。许多公认的细胞激活读数可用于测量在剂存在的情况下的细胞增殖或效应功能(例如，抗体产生、细胞因子产生、吞噬作用)。使用本领域已知的技术，通过测量剂实现所测量的增殖或效应功能降低的能力，可容易地确定测试剂阻断该激活的能力。
例如，如Freeman等人(2000)J.Exp.Med.192:1027和Latchman等人(2001)Nat.Immunol.2:261所述，可在T细胞测定中测试本发明所涵盖的剂抑制或增强共刺激的能力。可从人PBMC中分离CD4+ T细胞并且用激活抗CD3抗体进行刺激。T细胞的增殖可通过3H胸苷并入来测量。可在测定中有或无CD28共刺激下进行测定。可用Jurkat T细胞和来自PBMC的PHA-胚细胞进行类似测定。
或者，可测试本发明所涵盖的剂调节细胞的细胞因子产生的能力，所述细胞因子由免疫细胞产生或其产生在免疫细胞中响应于一种或多种生物标志物的调节而增强或抑制。所关注的免疫细胞释放的指示性细胞因子可通过ELISA或通过阻断细胞因子的抗体抑制免疫细胞增殖或由细胞因子诱导的其它细胞类型增殖的能力来鉴定，例如在实施例部分中描述的那些。体外免疫细胞共刺激测定也可以用于鉴定可通过调节一种或多种生物标志物来调节的细胞因子的方法中。例如，如果在共刺激时诱导的特定活性，例如免疫细胞增殖，无法通过添加已知细胞因子的阻断抗体来抑制，则所述活性可能由未知细胞因子的作用引起。在共刺激的后，可通过常规方法从培养基中纯化该细胞因子，并且通过其诱导免疫细胞增殖的能力测量其活性。为了鉴定可能在诱导耐受性中起作用的细胞因子，可使用如上所述的体外T细胞共刺激测定。在此情况下，将给与T细胞初级激活信号并与选定的细胞因子接触，但不会给与共刺激信号。在洗涤免疫细胞和静息后，细胞将再次受到初级激活信号和共刺激信号的攻击。如果免疫细胞无反应(例如，增殖或产生细胞因子)，则其已变得耐受并且细胞因子未阻止耐受性的诱导。然而，如果免疫细胞有反应，则细胞因子阻止耐受性的诱导。那些能够阻止耐受性的诱导的细胞因子可与阻断B淋巴细胞抗原的试剂一起在体内靶向阻断，作为在移植接受者或患有自身免疫性疾病的受试者中诱导耐受性的更有效手段。
在一些实施方案中，本发明所涵盖的测定为一种无细胞测定，它用于筛选调节生物标志物和/或一种或多种结合搭配物之间的相互作用的剂，其包括使多肽和一种或多种天然结合搭配物或其生物活性部分与测试剂接触并且测定测试化合物调节多肽与一种或多种天然结合搭配物或其生物活性部分之间的相互作用的能力。可如上所述直接或间接测定测试化合物的结合。在一个实施方案中，测定包括将多肽或其生物活性部分与其结合搭配物接触以形成测定混合物，使所述测定混合物与测试化合物接触，并且测定测试剂与测定混合物中的多肽相互作用的能力，其中测定测试剂与多肽相互作用的能力包括测定测试剂与结合搭配物相比优先结合多肽或其生物活性部分的能力。
在一些实施方案中，无论基于细胞的测定还是无细胞测定，都可以进一步测定测试剂以确定其是否影响多肽与一种或多种结合搭配物以及其它结合搭配物之间的相互作用的结合和/或活性。其它有用的结合分析方法包括使用实时生物分子相互作用分析(BIA)(Sjolander和Urbaniczky(1991)Anal.Chem.63:2338-2345和Szabo等人(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5:699-705)。如本文所用，“BIA”是一种用于研究实时生物特异性相互作用的技术，无需标记任何相互作用物(例如，)。表面等离子体共振(SPR)的光学现象的变化可用作生物多肽之间实时反应的指示。所关注的多肽可固定在芯片上，并且可测试多种试剂(阻断抗体、融合蛋白、肽或小分子)与所关注的多肽的结合。Fitz等人(1997)Oncogene 15:613描述了使用BIA技术的一个实例。
本发明所涵盖的无细胞测定适用于使用可溶性和/或膜结合形式的蛋白质。在使用膜结合形式蛋白质的无细胞测定的情况下，可能需要利用增溶剂以使蛋白质的膜结合形式保持在溶解状态。这类增溶剂的实例包括非离子型洗涤剂，例如正辛基葡糖苷、正十二烷基葡糖苷、正十二烷基麦芽糖苷、辛酰基-N-甲基葡糖酰胺、癸酰基-N-甲基葡糖酰胺、X-100、X-114、异十三聚(乙二醇醚)n、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸酯(CHAPS)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸盐(CHAPSO)或N-十二烷基＝N,N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸酯。
在上述分析测定的一个或多个实施方案中，可能需要固定任一多肽以促进一种或两种蛋白质的复合形式与未复合形式的分离，以及适应测定的自动化。可在任何适合容纳反应物的容器中实现测试剂与多肽的结合。这类容器的实例包括微量滴定板、试管和微量离心管。在一个实施方案中，可提供一种融合蛋白，其添加一个结构域，所述结构域允许一种或两种蛋白质与基质结合。例如，基于谷胱甘肽-S-转移酶的多肽融合蛋白，或谷胱甘肽-S-转移酶/靶融合蛋白，可吸附到谷胱甘肽琼脂糖珠(Sigma Chemical,St.Louis,MO)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，接着与测试化合物组合，并且将混合物在有助于形成复合物的条件下(例如，在盐和pH的生理条件下)孵育。孵育后，洗涤珠粒或微量滴定板孔以去除任何未结合的组分，在珠粒的情况下固定基质，例如如上所述，直接或间接测定复合物。或者，复合物可从基质中解离，并且使用标准技术测定多肽结合或活性的水平。
本发明还涉及通过上述筛选测定鉴定的新颖试剂。因此，在适当模型系统中进一步使用如本文所述鉴定的试剂在本发明的范围内。例如，如本文所述鉴定的剂可用于模型系统中以确定用这类剂治疗的功效、毒性或副作用。或者，如本文所述鉴定的剂可用于模型系统中以确定这类剂的作用机制。此外，本发明涉及通过上述筛选测定鉴定的新颖剂用于本文所述的治疗的用途。
d.临床试验期间的作用监测
监测以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的疗法(例如化合物、药物、疫苗、细胞疗法等)对免疫反应，例如T细胞反应性(例如，结合的存在和/或T细胞激活和/或效应功能)的影响，不仅可应用于基础候选HPV16E711-19抗原结合分子筛选，也可以应用于临床试验中。例如，可在罹患以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的受试者的临床试验中监测本文所述的结合分子和相关组合物，例如核酸、宿主细胞、药物组合物等增加针对所关注的细胞，例如表达HPV16 E711-19抗原的过度增殖细胞的免疫反应(例如，T细胞免疫反应)的有效性。在这类临床试验中，结合的存在和/或T细胞激活和/或效应功能(例如，T细胞增殖、杀伤和/或细胞因子释放)可用作特定细胞、组织或系统的表型的“读出”或标志物。类似地，可在患有以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的受试者的临床试验中监测如本文所述的利用被工程化成表达结合蛋白(例如，TCR、TCR的抗原结合片段、CAR或包含TCR和效应结构域的融合蛋白)的T细胞的适应性T细胞疗法增加对表达HPV16 E711-19抗原的所关注的细胞(例如过度增殖细胞)的免疫反应的有效性。在这类临床试验中，结合的存在和/或T细胞激活和/或效应功能(例如，T细胞增殖、杀伤和/或细胞因子释放)可用作特定细胞、组织或系统的表型的“读出”或标志物。
举例来说，可能希望增加以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的疗法的施用以增加从受试者获得的样品与一种或多种结合蛋白或相关组合物之间的反应性的存在或水平，例如增加以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的疗法的有效性。根据这类实施方案，从受试者获得的样品与一种或多种结合蛋白或相关组合物之间的反应性的存在或水平可用作以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的疗法的有效性的指标，即使缺乏可观察到的表型反应。类似地，也可以使用对从受试者获得的样品与一种或多种结合蛋白或相关组合物之间的反应性的存在或水平的分析，例如通过直接结合测定、荧光激活细胞分选(FACS)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫化学、蛋白质印迹法或细胞内流式测定来选择将接受以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的疗法的患者。
例如，在直接结合测定中，免疫原性肽或抗原肽-MHC(pMHC)复合物可与放射性同位素或酶标记偶合，以便可通过检测标记的免疫原性肽或pMHC复合物来确定结合。举例来说，免疫原性肽或pMHC复合物可直接或间接地用125I、35S、14C或3H标记，并且通过对放射性发射直接计数或通过闪烁计数来检测放射性同位素。或者，可用例如辣根过氧化酶、碱性磷酸酶或荧光素酶以酶法标记免疫原性肽或pMHC复合物，并且通过测定适当底物至产物的转化来检测酶标记。也可以使用标准结合或酶分析测定法来测定免疫原性肽或pMHC复合物与免疫细胞，例如T细胞和/或NK细胞之间的相互作用。在上述测定方法的一个或多个实施方案中，可能需要固定免疫原性肽或pMHC复合物以适应测定的自动化。
在不标记任何相互作用物的情况下测定剂调节所关注的参数的能力也在本发明的范围内。例如，可使用微生理计来检测多肽之间的相互作用，而无需标记将监测的多肽(McConnell等人(1992)Science257:1906-1912)。如本文所用，“微生理计”(例如，)是一种分析仪器，它使用光寻址电位传感器(LAPS)测量细胞酸化其环境的速率。该酸化速率的变化可用作化合物与受体之间的相互作用的指标。
可在任何适合容纳反应物的容器中实现免疫原性肽或pMHC复合物与免疫细胞，例如T细胞和/或NK细胞的结合。这类容器的非限制性实例包括微量滴定板、试管和微量离心管。免疫原性肽或pMHC复合物的固定形式也可以包括与固相结合的免疫原性肽或pMHC复合物，所述固相如多孔、微孔(具有小于约一微米的平均孔径)或大孔(具有超过约10微米的平均孔径)材料，例如膜、纤维素、硝基纤维素或玻璃纤维；珠粒，例如由琼脂糖或聚丙烯酰胺或乳胶制成的珠粒；或器皿、板或孔的表面，例如由聚苯乙烯制成的器皿、板或孔的表面。
在一些实施方案中，从受试者获得的样品对本文所述的一种或多种结合蛋白或对本文所述的一种或多种宿主细胞的反应性可通过检测结合的存在和/或T细胞激活和/或效应功能来测量。术语“T细胞激活”是指选自增殖、分化、细胞因子分泌、释放细胞毒性效应分子、细胞毒活性和表达激活标志物的T淋巴细胞，尤其是指细胞毒性T淋巴细胞的一种或多种细胞反应。
细胞因子的产生和/或释放可通过本领域中众所周知的方法，例如ELISA、酶联免疫吸附点样(ELISPOT)、测定、细胞内细胞因子染色和流式细胞术以及它们的组合(例如细胞内细胞因子染色和流式细胞术)测量。其可根据所执行的方法测定。
如本文所用，术语“细胞因子”是指介导和/或调节生物或细胞功能或过程(例如免疫性、炎症和造血)的分子。如本文所用，术语“细胞因子”包括“淋巴因子”、“趋化因子”、“单核因子”和“白细胞介素”。有用细胞因子的实例为GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α和TNF-β。
由抗原特异性诱导或刺激免疫反应产生的T细胞增殖和克隆扩增可例如透过并入非放射性测定，例如氚化胸腺嘧啶测定或MTT测定来测定。
可使用本领域中通常实行的数种技术和方法中的任一者进行测定CTL活性的细胞毒性测定(例如Henkart等人(2003)Fund.Immunol.1127-1150)。用于测量抗原特异性T细胞反应性的方法的额外描述可见于例如美国专利No.10,208,086和美国专利公布No.2017/0209573中。
e.预测医学
本发明还涉及预测医学领域，其中诊断测定、预后测定和监测临床试验用于达成预后(预测)目的，从而预防性地治疗个体。因此，本发明所涵盖的一个方面涵盖诊断测定，用于确定(例如，检测)生物样品(例如，血液、血清、细胞或组织)中HPV16 E711-19的存在、不存在、量和/或活性水平或对HPV16 E711-19的反应性，从而确定患有以HPV16 E711-19表达为特征的病症的个体是否可能对疗法有反应，无论在原始状态下还是在复发时。这类测定可用于达成预后或预测的目的，从而在以HPV16 E711-19表达为特征的病症发作之前或复发之后预防性治疗个体。
此外，本文所述的诊断方法可用于鉴定患有与HPV16 E711-19表达或缺乏相关的病症或有患上所述病症的风险的受试者。如本文所用，术语“异常”包括HPV16 E711-19相对于正常水平上调或下调。异常表达或活性包括表达或活性增加或减少，以及不遵循表达的正常发展模式或表达的亚细胞模式的表达或活性。例如，异常水平意图包括生物标志物基因或调控序列中的突变，或染色体基因的扩增，导致所关注的生物标志物上调或下调的情况。如本文所用，术语“不想要”包括涉及生物反应，例如免疫细胞活性的不想要的现象。
本文所述的测定，例如前述诊断测定或以下测定，可用于鉴定患有与HPV16 E711-19失调相关的病症或有发展所述病症的风险的受试者。因此，本发明提供了一种用于鉴定与异常或不想要的HPV16E711-19调控相关的病症的方法，其中从受试者获得测试样品并检测HPV16 E711-19表达，其中HPV16 E711-19表达的存在将患者诊断为患有与异常或不想要的HPV16 E711-19表达相关的病症或有发展所述病症的风险。如本文所用，“测试样品”是指从所关注的受试者获得的生物样品。例如，测试样品可以是生物流体(例如，脑脊髓液或血清)、细胞样品或组织，例如肿瘤微环境、瘤周区域和/或瘤内区域的组织病理学切片。
此外，本文所述的预后测定可用于确定受试者是否可施用本文所述的剂以治疗与异常或不想要的HPV16 E711-19表达相关的这类病症。例如，这类方法可用于确定受试者是否可用一种剂或剂的组合有效治疗。因此，本发明提供了用于确定受试者是否可用本文所述的一种或多种剂有效治疗以治疗与异常或不想要的HPV16 E711-19表达相关的病症的方法。
本文所述的方法可例如通过利用包含至少一种本文所述的抗体试剂的预包装的诊断试剂盒来进行，所述试剂盒可方便地用于例如临床环境中以诊断表现出涉及所关注的生物标志物的疾病或病症的症状或家族史的患者。
此外，表达所关注的生物标志物的任何细胞类型或组织均可用于本文所述的预后测定中。
此外，本文所述的预后方法可用于确定是否可向受试者施用治疗剂以治疗以HPV16 E711-19表达为特征的病症。
f.临床功效
临床功效可通过本领域已知的任何方法测量。例如，对疗法的反应涉及以HPV16E711-19表达为特征的病症(例如肿瘤)对疗法的任何反应，优选地涉及例如在开始新辅助或辅助化学疗法后癌细胞数目、肿瘤块和/或肿瘤体积的变化。可在新辅助或辅助情况下评估肿瘤反应，其中通过CT、PET、乳房X线照片、超声波或触诊测量，系统性干预后的肿瘤大小可与初始大小和尺寸进行比较并且可在组织学上估计肿瘤的细胞结构，并且与开始治疗前进行的肿瘤活检的细胞结构进行比较。反应也可以通过卡尺测量或活检或手术切除后的肿瘤病理学检查来评估。反应可以定量方式记录，例如肿瘤体积或细胞结构的变化百分比，或通过使用半定量评分系统，例如残余癌负荷(Symmans等人(2007)J.Clin.Oncol.25:4414-4422)或米勒-佩恩评分(Miller-Payne score)(Ogston等人(2003)Breast(Edinburgh,Scotland)12:320-327)，以定性方式记录，如“病理完全反应”(pCR)、“临床完全缓解”(cCR)、“临床部分缓解”(cPR)、“临床稳定疾病”(cSD)、“临床进展性疾病”(cPD)或其它定性标准。肿瘤反应的评估可在新辅助或辅助疗法开始后早期进行(例如，几小时、几天、几周或优选几个月之后)。反应评估的典型终点为新辅助化学疗法终止或手术切除残留肿瘤细胞和/或肿瘤床时。提供在以上章节I中列出的术语定义方面的额外指导。
VII.细胞疗法
在本发明所涵盖的另一方面，所述方法包括过继性细胞疗法，其中向受试者施用表达所提供的靶向MHC限制性表位的分子的基因工程化细胞(例如，表达结合蛋白(例如，TCR或CAR)或其抗原结合片段的细胞)。这类施用可以抗原靶向方式促进免疫细胞激活(例如，T细胞激活)，以便靶向表达HPV16 E711-19抗原的所关注的细胞(例如过度增殖细胞)进行破坏。
因此，所提供的方法和用途包括用于过继性细胞疗法的方法和用途。在一些实施方案中，所述方法包括将细胞或含有细胞的组合物施用于受试者、组织或细胞，例如患有疾病、疾患或病症、有患上疾病、疾患或病症的风险或疑似患有疾病、疾患或病症的受试者、组织或细胞。在一些实施方案中，将细胞、群体和组合物施用于患有待治疗的特定疾病或疾患的受试者(例如，经由过继性细胞疗法，例如过继性T细胞疗法)。在一些实施方案中，将细胞或组合物施用于受试者，例如患有疾病或疾患或有患上疾病或疾患的风险的受试者。在一些实施方案中，所述方法由此治疗(例如，改善)疾病或疾患的一种或多种症状。
用于过继性细胞疗法的细胞施用方法是已知的并且可与所提供的方法和组合物联合使用(例如，美国专利公布No.2003/0170238；美国专利No.4,690,915；Rosenberg(2011)Nat.Rev.Clin.Oncol.8:577-585；Themeli等人(2013)Nat.Biotechnol.31:928-933；Tsukahara等人(2013)Biochem.Biophys.Res.Commun.438:84-89；和Davila等人(2013)PLoS ONE 8:e61338)。
在一些实施方案中，通过自体移植进行细胞疗法(例如过继性细胞疗法，例如过继性T细胞疗法)，其中从将要接受细胞疗法的受试者或从源自这类受试者的样品分离和/或以其它方式制备细胞。因此，在一些实施方案中，细胞源自需要治疗的受试者，例如患者，并且在分离和加工之后将细胞施用于同一受试者。
在一些实施方案中，通过同种异体移植进行细胞疗法(例如，过继性细胞疗法，例如过继性T细胞疗法)，其中从除将要接受或最终接受细胞疗法的受试者以外的受试者，例如第一受试者分离和/或以其它方式制备细胞。在这类实施方案中，接着将细胞施用于相同物种的不同受试者，例如第二受试者。在一些实施方案中，第一受试者和第二受试者在遗传学上相同(同基因型)。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传学上相似。在一些实施方案中，第二受试者表达与第一受试者相同的HLA类别或超类型。
在一些实施方案中，施用细胞、细胞群体或组合物的受试者为灵长类动物，例如人。在一些实施方案中，灵长类动物为猴或猿。受试者可以是雄性或雌性并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿、少年、青少年、成人和老年受试者。在一些实施方案中，受试者为非灵长类哺乳动物，例如啮齿类动物。在一些实例中，患者或受试者是经验证用于疾病、过继性细胞疗法和/或用于评估例如细胞因子释放综合征(CRS)的毒性结果的动物模型。
可通过任何合适方式，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房内注射、结膜下注射(subconjectval injection)、结膜下注射(subconjuntival injection)、眼球筋膜下注射(sub-Tenon's injection)、眼球后注射、球周注射或后巩膜旁递送来施用结合分子，例如TCR、TCR的抗原结合片段(例如，scTCR)和含有TCR的嵌合受体(例如，CAR)和表达它们的细胞。在一些实施方案中，通过肠胃外、肺内和鼻内施用结合分子，并且如果需要局部治疗，则通过病变内施用进行施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药和施用可部分地取决于施用为短暂的还是长期的。各种给药方案包括但不限于在多个时间点单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。
对于疾病的预防或治疗，结合分子或细胞的适当剂量可取决于有待治疗的疾病的类型、结合分子的类型、疾病的严重程度和病程、施用结合分子出于预防目的还是治疗目的、先前疗法、患者的临床病史和对结合分子的反应，并且由主治医师决定。在一些实施方案中，组合物和分子以及细胞适合一次性或经一系列治疗施用于患者。
在一些实施方案中，细胞的施用量可为每公斤受试者体重0.1×106个、0.2×106个、0.3×106个、0.4×106个、0.5×106个、0.6×106个、0.7×106个、0.8×106个、0.9×106个、1.0×106个、5.0×106个、1.0×107个、5.0×107个、1.0×108个、5.0×108个或更多个细胞，或介于两者之间的任何范围或介于两者之间的任何值。移植的细胞数目可根据在给定时间量内所需的移植水平进行调整。通常，根据需要，可移植1×105至约1×109个细胞/公斤体重、约1×106至约1×108个细胞/公斤体重或约1×107个细胞/公斤体重或更多个细胞。在一些实施方案中，相对于平均大小的小鼠，移植至少约0.1×106个、0.5×106个、1.0×106个、2.0×106个、3.0×106个、4.0×106个或5.0×106个总细胞是有效的。举例来说，在一些实施方案中，可将细胞或细胞亚型的个别群体以约一百万至约一千亿个细胞的范围和/或以下细胞量/公斤体重施用于受试者：例如100万至约500亿个细胞(例如，约500万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞，或由前述值中的任两者限定的范围)，例如约1000万至约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞或由前述值中的任两者限定的范围)，和在一些情况下，约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞)或这些范围之间和/或每公斤体重的任何值。剂量可视疾病或病症和/或患者和/或其它治疗所特有的属性而变化。
移植的细胞的植入可通过多种方法中的任一种来评估，例如但不限于肿瘤体积、细胞因子水平、施用时间、在移植后的一个或多个时间点从受试者获得的所关注细胞的流式细胞术分析等。例如，基于时间的分析，等待1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天或可能标志收获肿瘤的时间。任何这类量度都是可根据众所周知的参数进行调整的变量，以确定变量对针对抗癌免疫疗法的反应的影响。此外，移植的细胞可与其它剂共同移植，例如细胞因子、细胞外基质、细胞培养支持物等。
细胞也可以在其它抗癌剂之前、同时或之后施用。
可组合和施用两种或更多种细胞类型，例如基于细胞的疗法和干细胞的过继性细胞转移、癌症疫苗和基于细胞的疗法等。例如，过继性的基于细胞的免疫疗法可与本发明所涵盖的基于细胞的疗法组合。在一些实施方案中，基于细胞的剂可单独使用或与另外的基于细胞的剂，例如免疫疗法，如过继性T细胞疗法(ACT)组合使用。例如，进行基因工程化以识别CD19的T细胞用于治疗滤泡性B细胞淋巴瘤。用于ACT的免疫细胞可以是树突状细胞、T细胞(例如CD8+ T细胞和CD4+ T细胞)、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、淋巴因子激活杀伤(LAK)细胞、记忆T细胞、调控T细胞(Treg)、辅助T细胞、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞和它们的任何组合。众所周知的过继性的基于细胞的免疫治疗方式包括但不限于辐照的自体同源或同种异体肿瘤细胞、肿瘤溶解物或凋亡肿瘤细胞、基于抗原呈递细胞的免疫疗法、基于树突状细胞的免疫疗法、过继性T细胞转移、过继性CAR T细胞疗法、自体同源免疫增强疗法(AIET)、癌症疫苗和/或抗原呈递细胞。这类基于细胞的免疫疗法可进行进一步修饰以表达一种或多种基因产物，从而进一步调节免疫反应，例如表达细胞因子，如GM-CSF，和/或表达肿瘤相关抗原(TAA)抗原，例如Mage-1、gp-100等。本发明所涵盖的剂(例如癌细胞)与本发明所涵盖的另一剂或其它组合物的比率可为相对于彼此1:1(例如，等量的2种剂、3种剂、4种剂等)，但可以按任何所需的量进行调节(例如，1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、8:1、8.5:1、9:1、9.5:1、10:1或更高)。
在一些实施方案中，例如在受试者为人的情况下，剂量包括少于约1×108总结合蛋白(例如，表达TCR或CAR)的细胞、T细胞或外周血单个核细胞(PBMC)，例如在约1×106至1×108这类细胞范围内，例如2×106、5×106、1×107、5×107或1×108或全部这类细胞，或在前述值中的任两者之间的范围。
在一些实施方案中，本文所述的细胞或相关组合物，例如核酸、宿主细胞、药物制剂等可作为组合治疗的一部分施用，例如与另一治疗介入(例如另一抗体或工程化细胞或受体或剂，例如细胞毒性或治疗剂)同时或以任何次序依序施用。
在一些实施方案中，细胞或相关组合物可与一种或多种另外的治疗剂共施用，或与另一治疗介入联合，同时或以任何次序依序施用。在一些情况下，细胞或相关组合物与另一疗法共施用，其时间上足够接近，使得细胞群体增强一种或多种另外的治疗剂的作用，反之亦然。在一些实施方案中，细胞或相关组合物在一种或多种另外的治疗剂之前施用。在一些实施方案中，细胞或相关组合物在一种或多种另外的治疗剂之后施用。
在一些实施方案中，一旦将细胞或相关组合物施用于受试者(例如，人)，即可通过多种已知方法中的任一种测量细胞或相关组合物的生物活性。将评估的参数包括体内例如通过成像或者体外/离体例如通过ELISA或流式细胞术测量的工程化或天然T细胞或其它免疫细胞与抗原的特异性结合。在一些实施方案中，可使用本领域中已知的任何合适测定或方法(例如，Kochenderfer等人(2009)J.Immunother.32:689-702和Herman等人(2004)J.Immunol.Meth.285:25-40)来测量细胞破坏靶细胞的能力。在一些实施方案中，也可以通过测定例如CD107a、IFNγ、IL-2和TNFα的某些细胞因子的表达和/或分泌来测量细胞的生物活性。在一些实施方案中，通过评估例如病毒负荷或负载减少的临床结果来测量生物活性。
在一些实施方案中，细胞以多种方式进行修饰，使得其治疗或预防功效增加。举例来说，由群体表达的结合蛋白(例如，工程化TCR、CAR或其抗原结合片段)可直接或通过接头间接与靶向部分缀合。使化合物与靶向部分缀合的实践是本领域中已知的(例如，Wadwa等人(1995)J.Drug Targeting3:111和美国专利No.5,087,616)。
例如细胞毒性淋巴细胞的免疫细胞可获自任何合适的来源，例如外周血、脾脏和淋巴结。免疫细胞可呈粗制剂或呈部分纯化或基本上纯化的制剂形式使用，所述制剂可通过标准技术获得，技术包括但不限于涉及使用抗体的免疫磁性或流式细胞术技术的方法。
在本发明所涵盖的另一方面，本文提供了一种用于引发对表达HPV16 E711-19抗原的细胞的免疫反应的方法，所述方法包括以足以引发免疫反应的有效量向受试者施用本文所述的表达结合蛋白(例如，工程化的TCR、CAR或其抗原结合片段)的细胞。在一些实施方案中，本文提供了一种治疗或预防以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文所述的表达结合蛋白(例如，工程化的TCR、CAR或其抗原结合片段)的细胞。在一个实施方案中，细胞全身施用，例如通过注射施用。或者，可例如经由直接注射到组织中来进行局部而非全身施用，例如在储槽或持续释放制剂中。
在一些实施方案中，本文所述的表达结合蛋白(例如，工程化的TCR、CAR或其抗原结合片段)的细胞可用作免疫调节组合物中的活性化合物，用于预防性或治疗性治疗以HPV16 E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发。在一些实施方案中，HPV16 E711-19引发的抗原呈递细胞可用于产生淋巴细胞(例如，CD8+ T淋巴细胞、CD4+ T淋巴细胞和/或B淋巴细胞)，以进一步用于过继性转移到具有本文所述的表达结合蛋白(例如，工程化TCR、CAR或其抗原结合片段)的细胞的受试者。
在一些实施方案中，可将本文所述的表达结合蛋白(例如，工程化TCR、CAR或其抗原结合片段)的细胞单独或与淋巴细胞组合施用于受试者以引发免疫反应，尤其引发对表达HPV16 E711-19抗原的细胞的免疫反应。
如上所述，可单次或多次施用单独或与淋巴细胞组合的本文所述的表达结合蛋白(例如，工程化TCR、CAR或其抗原结合片段)的细胞，其中细胞数目和治疗由照护提供者(例如，医师)来选择。类似地，单独或与淋巴细胞组合的细胞可在药学上可接受的载剂中施用。合适的载剂可为细胞在其中生长的生长培养基，或任何合适的缓冲培养基，例如磷酸盐缓冲盐水。细胞可单独或作为与其它治疗剂联合的辅助疗法施用。
VIII.试剂盒和装置
本发明还涵盖试剂盒和装置。举例来说，试剂盒或装置可包含包装于合适容器中的结合蛋白、包含编码结合蛋白的序列的核酸或载体、包含核酸或载体和/或表达如本文所述的结合蛋白的宿主细胞、稳定MHC-肽复合物、佐剂、检测试剂和它们的组合，并且还可包含这类试剂的使用说明书。试剂盒或装置也可以含有其它组件，例如包装于单独容器中的施用工具。试剂盒或装置可作为用于执行本发明所涵盖的方法的单元来推销、分售或销售。
通过以下实施例进一步说明本公开，所述实施例不应解释为限制性的。
实施例
实施例1：实施例2的材料和方法
a.慢病毒包装和慢病毒滴度的定量
使用Lenti-XTMGoStixTMPlus(Takara Bio USA,Mountain View,CA)来包装和定量HPV16-E711-19病毒构建体。简单地说，将HPV16-E711-19病毒构建体用PBS1:100稀释。将二十(20)ul的HPV16-E711-19病毒上清液施加到Lenti-XTMGoStixTMPlus盒样品孔，然后施加80ul追加缓冲液。进行横向流动测试10分钟，并且测试带(T)将在5分钟内出现，并且如果样品含有充足的慢病毒，则在10分钟时达到最大强度。当测试正常运作时对照带(C)将一直出现。在10分钟之后，通过在扫描窗中使用盒的轮廓，实现适当对准和成像焦距。样品名称出现在盒的轮廓的下方。一旦实现适当对准，轮廓即变绿，并且盒将自动扫描。为了计算未知储液的实际IFU/ml，使用具有通过CD8表达测量的已知滴度的参考病毒(已知IFU/ml的病毒储液)并进行测试，获得感染单位值以及GoStixTM值GV。计算参考病毒的IFU/GV比率。使用Lenti-XTMGoStixTMPlus分析未知样品以获得GV(ng/ml p24)并进行以下计算[式：GV(未知)×(IFU/ml)/GV(参考)＝IFU/ml(未知)]以确定IFU/ml。
b.评估HPV16-E711-19 TCR功能
(i)对T细胞进行工程化以表达HPV16-E711-19特异性TCR
使用EasySep人T细胞分离试剂盒(StemCell Technologies)，根据制造商说明书从HLA-A*02:01阳性健康供体PBMC分离全T细胞。将分离的T细胞用ImmunoCult CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂混合物(StemCell Technologies)激活并在完全T细胞培养基(X-VIVO 15[Lonza,Morristown,NJ]，补充有5％人血清[Sigma Aldrich]、1％青霉素(penicillin)-链霉素(streptomycin)[Thermo Fisher Scientific]、1X GlutaMaxTM补充剂[Thermo FisherScientific]、5ng/mL IL-7[R&D Systems]和50IU/mL IL-2[Sigma Aldrich])中培养过夜。激活24小时后，用HPV16-E711-19 TCR病毒上清液转导T细胞。转导24小时后，将T细胞洗涤并转移到G-Rex板(Wilson Wolf,New Brighton,MN)或VECELL 96孔板(Cosmo Bio,Carlsbad,CA)，并且在激活后扩增总共7-11天。每2-3天T细胞培养物补充新鲜IL-2(50IU/mL)和IL-7(5ng/mL)和/或分开，以维持最适宜的细胞密度。
(ii)工程化的HPV16-E711-19 TCR转导的全T细胞的流式细胞术
根据制造商说明书，将工程化的全T细胞用HLA-A*02:01HPV16-E711-19(YMLDLQPET)(Immudex)dextramer、TCRα/βPE-Cy7(IP26，BioLegend)、CD8 PerCP-Cy5.5(HIT8a，BioLegend)、CD4APC-Cy7(OKT4，Biolegend)和CD34 Alex Fluor 488(QBEND/10，R&DSystems)和DAPI染色。然后在CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter)上操作细胞并使用FlowJo软件(10版，TreeStar)分析。
(iii)细胞系
T淋巴母细胞细胞系T2(ATCC CRL-1992)、腺癌细胞系NCI-H1792(ATCC CRL-5895)、表皮样癌细胞系Ca Ski(ATCC CRL-1550)和鳞状细胞癌细胞系SCC152(ATCC CRL-3240)、SCC090(ATCC CRL-3239)和SiHa(ATCC HTB-35)购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。T2细胞在含有20％热失活FBS、1％青霉素-链霉素[Thermo Fisher Scientific]的IMDM中培养。Ca Ski和NCI-H1792细胞在含有10％热失活FBS和1％青霉素-链霉素[ThermoFisher Scientific]的RPMI 1640中培养。SCC152、SCC090和SiHa维持在含有10％热失活FBS、1％青霉素-链霉素[Thermo Fisher Scientific]和1X GlutaMax补充剂[ThermoFisher Scientific]的EMEM中。
(iv)表达NuclightRed的稳定细胞系的产生
将T2、NCI-H1792、Ca Ski、SiHa、SCC090和SCC152细胞在无血清的培养基中用NucLightRed慢病毒试剂(EF-1α启动子、嘌呤霉素(puromycin)选择)(Sartorius)以MOI 5转导。转导24小时后，将细胞洗涤并使其再悬浮于其相应细胞系培养基中，并且在37℃、5％CO2下培养。转导3天后，将嘌呤霉素(Gibco,Waltham,MA)以预定浓度(在0.5ug/mL至1ug/mL范围内)添加到培养物以选择转导的细胞。培养物在嘌呤霉素选择下进行扩增，直到如通过流式细胞术分析，其至少98％NucLight Red阳性。
(v)体外细胞毒性测定
在室温(RT)下在用聚-L-鸟氨酸(Sigma Aldrich)包被的96孔平底组织培养板中进行针对T2细胞的体外细胞毒性测定30分钟，然后去除包被溶液，并且使培养板在室温下再干燥30分钟。在未用聚-L-鸟氨酸包被的96孔平底组织培养板中进行针对贴壁细胞系的体外细胞毒性测定，其中涂铺贴壁细胞并使之贴壁，一天后添加T细胞。在指示的情况下，将T细胞与表达NucLightTMRed的NCI-H1792、Ca Ski、SiHa、SCC090、SCC152或经肽脉冲输送的T2细胞(1ng/ml HPV16-E711-19肽[YMLDLQPET，Genscript])以20:1至1.25:1范围内的E:T比率共培养。在S3仪器(Sartorius)上获得数据，并且在Incucyte S3上定量靶细胞生长，作为T细胞细胞毒性的读出数据。
(vi)细胞因子产生测定
将T细胞与表达NucLightTMRed的NCI-H1792、Ca Ski、SiHa、SCC090和SCC152细胞或经肽脉冲输送的T2细胞(1ng/ml HPV16-E711-19肽[YMLDLQPET，Genscript])以1:1的E:T共培养。24小时后收获上清液并冷冻在-80℃下。将上清液解冻并装载在multiAnalyte滤筒(ProteinSimple,San Jose,CA)上以使用Ella仪器(ProteinSimple)评估IFN-γ、TNF-α、IL-2和颗粒酶B的水平。
(vii)增殖测定
根据制造商说明书，将T细胞用2.5μM CellTraceTMViolet(Thermo FisherScientific)标记。将T细胞与表达NucLightTMRed的CaSki、SCC152、SCC090、SiHa和NCI-H1792共培养。在96小时之后，收获细胞并用Fixable活力染料660(Thermo Fisher Scientific)、TCRα/βPE-Cy7(IP26，BioLegend)、CD4 APC-Cy7(OKT4，BioLegend)和CD8 PerCP-Cy5.5(HIT8a，BioLegend)抗体染色。将细胞用EasySepTM缓冲液洗涤并用BD CytofixTM固定缓冲液(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ)固定。将CountBrightTM绝对计数珠粒(Thermo Fisher Scientific)在EasySepTM缓冲液中稀释并添加到样品中，然后在CytoFLEX流式细胞仪上获得，以评定CellTraceTMViolet的稀释度，作为T细胞增殖的指标。使用FlowJo软件(10版，TreeStar)分析数据，并且使用下式确定分裂CD8和CD4 T细胞的绝对计数：
样品中的CD8或CD4 T细胞数目＝(门中的CD8或CD4 T细胞事件数目/门中的珠粒事件数目)×批次特异的分配的珠粒计数。
c.同种异体反应性和安全性筛选
(i)用于同种异体反应性筛选的基于96孔的表达MHC的阵列的产生
使用CRISPR-Cas工程化在HEK293T细胞中敲除内源HLA-A/B/C。使用multicrispr.net工具针对跨越HLA-A、HLA-B和HLA-C基因座保守的序列设计向导RNA(gRNA)(Prykhozhij等人,Plos One,2015)。选择以下向导：CRISPR-ALL-1：CGGCTACTACAACCAGAGCG；CRISPR-ALL-2：AGATCACACTGA CCTGGCAG；CRISPR-ALL-3：AGGTCAGTGTGATCTCCGCA。使用BsmBI位点将gRNA克隆到LentiCRISPRV2载体中。使用MirusTransIT(Mirus Bio,Madison,WI)用质粒向导构建体转染HEK293T细胞。7天后，使用泛MHC抗体(BioLegend)将MHC敲除(MHC-KO)细胞分选。扩增单细胞克隆，并且通过流式细胞术验证MHC的缺乏。B2M敲除(B2M-KO)细胞用作完全缺乏表面MHC表达的阳性对照物。在HEK293T细胞中通过使用以下向导RNA将靶向B2M的CRISPR RNP电穿孔来敲除B2M：GGCCACGGAGCGAGACATCT。
将无MHC的HEK293T细胞用NucLightTMRed病毒(Essen BioScience)转导。使用Sony SH800分选器针对NucLightTMRed表达对转导的细胞进行分选。为了产生表达MHC的阵列，在96孔板中的个别孔中将无MHC的表达NucLightTMRed的HEK293T细胞用最常见的110种MHC(pHAGE-EF1a-MHC-UBC-NAT)转导。用诺尔丝菌素(nourseothricin)(400μg/ml)选择转导的细胞，历时一周。表达最常见的110种MHC的细胞进行传代并呈阵列储存在96孔板中。通过使用泛MHC抗体(BioLegend)染色来证实个别MHC等位基因的表达。
为了产生用于测定的阳性对照物，将无MHC的HEK293T细胞用NucLightTMRed病毒(Essen BioScience)转导并且使用Sony SH800分选器针对NucLightTMRed表达进行分选。接着使用慢病毒转导将HLA-A*02:01(pHAGE-EF1a-MHC-UBC-NAT)引入细胞中。用诺尔丝菌素(400μg/ml)选择转导的细胞，历时一周。接着将这些细胞用表达HPV16-E7的片段的90聚体构建体(pHAGE-CMV-FHA-HPV16-E7.1-EFS-AmCyan)转导，所述片段含有HPV16-E711-19表位(YMLDLQPET)。接着使用Bigfoot Spectral细胞分选器(Thermo Fisher Scientific)针对AmCyan表达对转导的细胞进行分选。
(ii)慢病毒包装和转导
为了包装110种MHC表达构建体(pHAGE-EF1a-MHC-UBC-NAT)的慢病毒，将无MHC的HEK293T细胞在75％汇合下涂铺在96孔中并使用转染试剂(Polyplus,Illkirch,France)转染。将个别MHC表达构建体与包装质粒(pREV/pTAT/pVSVG/pGAGPOL)混合并根据制造商方案与试剂一起孵育，并且在转染后24小时添加DMEM培养基。在转染之后48小时收获病毒上清液并用于以基于96孔的阵列格式转导110种MHC。为了包装其它构建体的慢病毒，将细胞(Takara Bio USA,Mountain View,CA)在75％汇合下涂铺并使用转染试剂(Polyplus,Illkirch,France)转染。将表达构建体与包装质粒(pREV/pTAT/pVSVG/pGAGPOL)混合并根据制造商方案与试剂一起孵育，并且在转染后24小时添加OptiPROTMSFM培养基。在转染之后48小时收获病毒上清液并使用20离心浓缩器或50盒(Sartorius,Bohemia,NY)浓缩。
所有涉及来源于HEK293T细胞的细胞系的病毒转导均用聚凝胺(4μg/ml)进行。
(iii)共培养以进行同种异体反应性剖析
全T细胞如上所述进行工程化并冷冻。第0天，T细胞在直立T25烧瓶中用1.0E+6T细胞、20.0E+6辐照的PBMC、重组人IL-2和CD3单克隆抗体(OKT3)[0.1ug/mL，eBioscience]再刺激。第2天、第4天、第5天和第6天，将一半体积的培养基更换为RPMI 1640，其补充有10％热失活胎牛血清[FBS]、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素和重组人IL-2[50U/mL；PeproTech,Cranbury,NJ]。第7天，收获细胞用于测定。
测定一式三份进行。第5天，呈96孔阵列的靶细胞进行传代并接种在384孔板中。第6天，将工程化的表达重组E7-11-28TCR(又称为“TCR 28”或“28”或“TCR-200-A02”)的CD8+T细胞或未转导的对照T细胞以5:1的效应物:靶标物(E:T)比率添加并与靶细胞一起孵育48小时。随着时间推移，使用通过测量NucLightTMRed阳性细胞的数目来测量靶细胞数目。测定中在48小时每个MHC上所关注的重组TCR对细胞的抑制计算为1-(细胞倍增[与表达E7-11-28的T细胞孵育]/细胞倍增[与未转导的对照T细胞孵育])。
(iv)用于安全性筛选的表达TCRE7-11-28的CD8 T细胞的产生
使用CD8微珠试剂盒(Miltenyi Biotec)根据制造商方案从A*02:01阴性供体分离原代CD8+ T细胞。将分离的细胞冷冻在CS10(Stem Cell Technologies)中并储存在液氮中直到使用。第-1天，将CD8+ T细胞解冻，用完全T细胞培养基(RPMI 1640，补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素、重组人IL-2[50U/mL；PeproTech,Cranbury,NJ]、重组人IL-15[5ng/mL，R&DSystems]和重组人IL-7[5ng/mL，R&D Systems])洗涤。第0天，将CD8+ T细胞洗涤并再悬浮于新鲜的T细胞培养基并且使用ImmunoCultTM人CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂(5μL/1×106CD8+ T细胞，Stem Cell Technologies)激活。第1天，将细胞洗涤并再悬浮于新鲜的完全T细胞培养基中，并且以MOI 10用慢病毒粒子转导以表达TCR E7-11-28。第2天，将细胞洗涤并再悬浮于新鲜的完全T细胞培养基中并且在24孔板(Wilson Wolf)中扩增直到第5天。第5天，收获细胞并再悬浮于EasySepTM缓冲液(Stem Cell)并且在室温下以1:25稀释度添加HLA-A*02:01HPV1611-19dextramer-APC(Immudex)。抗CD34-Alexa488(克隆：QBEnd10，R&D Systems)以1:50稀释度添加并在室温下孵育10分钟。将细胞用EasySepTM缓冲液洗涤并以1:200稀释度再悬浮于含有7-AAD的EasySepTM缓冲液。通过细胞分选(Beckman Coulter MoFlo Astrios EQ)来分离活的结合dextramer的细胞(DAPI-Dextramer+CD34+)。将分选的细胞洗涤并再悬浮于新鲜的完全T细胞培养基中并且在10烧瓶(Wilson Wolf)中扩增，直到第12天，此刻将细胞冷冻在CS10中并储存在液氮中，直到使用。
将表达E7-11-28的CD8+ T细胞解冻，并且通过在100烧瓶(Wilson Wolf)中将T细胞与辐照(60戈瑞)的同种异体HLA-A*02:01PBMC在新鲜的T细胞培养基(RPMI1640，补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素、重组人IL-2[50U/mL，PeproTech])中在0.1ug/mL抗CD3(OKT3，eBioscience)和50U/mL重组IL-2(Peprotech)存在下共培养而再刺激(进一步扩增)。每隔一天将50U/mL重组IL-2添加到扩增细胞直到第6天。第6天，将一半培养基替换为含有50U/mL重组IL-2的新鲜的T细胞培养基。第7天使用细胞进行筛选。
(v)T细胞中靶杀死的质量控制(QC)
在再刺激第5天，在室温下将报告细胞(表达多肽组文库)用CellTraceTMViolet(Thermo Fisher)标记10分钟。将标记的反应用5X过量的完全DMEM培养基(1XDMEM，补充有10％FBS、100IU/mL青霉素、100ug/mL链霉素)淬灭。离心之后，接种细胞以供后续测定。对于脱靶筛选，将400×106个标记的报告细胞接种在烧瓶中。对于T细胞中靶杀死的QC，96孔平底板每孔接种25,000个报告细胞。
在TCR E7-11-28再刺激第6天，测试T细胞针对HPV1611-19肽的活性。作为阳性对照物，将一小部分报告细胞用100ng/mL HPV1611-19肽(Genscript)进行脉冲输送一小时。将T细胞以四种效应物:靶标物(E:T)比率(2:1、1:1、1:2、1:4)一式三份添加到报告细胞。在37℃下孵育四小时之后，通过上下吸移使细胞再悬浮，接着在CytoFLEX流式细胞仪(BeckmanCoulter)上采集数据。
(vi)筛选共培养物、靶细胞富集和分选
在TCR E7-11-28扩增第7天，将T细胞添加到文库转导的报告细胞并在37℃下孵育四小时。在孵育之后，通过胰蛋白酶消化和离心收获所有细胞，使细胞再悬浮于1X膜联蛋白V结合缓冲液(Miltenyi Biotec)并离心。使细胞在膜联蛋白V磁性微珠(Miltenyi Biotec)下再悬浮于1X膜联蛋白V结合缓冲液(每1×109个总细胞，9mL膜联蛋白V结合缓冲液中1mL微珠)中并在室温下孵育15分钟。将细胞用5X体积的膜联蛋白V结合缓冲液洗涤并离心。使细胞再悬浮于膜联蛋白V结合缓冲液中，然后分成2次“megarep”并使用70uM细胞过滤器(Corning)过滤。使用Pro(Miltenyi Biotec)对膜联蛋白V标记的细胞进行阳性选择。每次“megarep”的溶析进一步分成四次“重复实验”，每次筛选总共8次技术重复实验。使用Astrios EQ细胞分选器(Beckman Coulter)对IFP+细胞进行分选。
(vii)下一代测序
使用GeneJETTM基因组DNA纯化试剂盒(Thermo Fisher Scientific)从分选的细胞提取基因组DNA(gDNA)。通过PCR，从提取的gDNA扩增抗原盒，然后在第二PCR反应中附加测序衔接子和样品特异性索引序列。在Illumina NextSeqTM机上使用标准Illumina测序引物对扩增子进行测序。
(viii)数据分析
核苷酸序列映射到个别核苷酸瓦块。针对每个筛选重复实验(n＝8)并针对转导的报告细胞的每个池的输入，计算每个瓦块的读段计数的比例，并且通过筛选重复实验中的瓦块的比例除以输入文库中的瓦块的比例来计算每个瓦块的富集。跨越8个筛选重复实验，相同瓦块的富集的修正几何平均值用于鉴定可再现的筛选命中。使用NetMHC4.0预测每个瓦块超过1.5倍富集的阈值的特异性MHC结合表位。通过跨越筛选中富集的重叠相邻瓦块和冗余瓦块，鉴定预测的强烈结合的表位来选择每个瓦块的候选表位。
d.TCRE7-11-28的安全性评估
(i)表达TCRE7-11-28的推定脱靶的癌细胞系
在下表4中描述的培养基中培养癌细胞系：
表4：癌细胞系和其培养基
(ii)表达TCRE7-11-28的推定脱靶的健康人原代/iPS来源细胞
使来自健康供体的原代细胞或iPS来源细胞解冻，并且根据制造商说明书，在下表5中描述的培养基中培养。皮下人白色前脂肪细胞(HWP)在前脂肪细胞生长培养基(备用)中培养，直到80-90％汇合，并且通过培养基变成前脂肪细胞分化培养基(备用)，分化成脂肪细胞，历时72小时。将其在脂肪细胞营养培养基中进一步培养14天以完成分化过程。
表5：健康人原代/iPS来源细胞和其培养基
(iii)定量RT-PCR
使用Qiagen微型试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)根据制造商说明书从癌细胞系或健康人原代细胞提取总RNA。使用NanoDropTMOneC机(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)测定样品中RNA的质量和浓度。使用来自不同样品的等量RNA(2μg)进行cDNA合成，所述cDNA合成使用SuperScriptTMIV VILOTM合成试剂盒(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)，根据制造商说明书，使用T100TM热循环仪(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)进行，循环条件如下：在25℃下粘接引物10分钟，在50℃下将RNA逆转录10分钟，和在85℃下使酶失活5分钟。
所有qPCR测定使用QuantStudioTM7Pro PCR系统(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)在20μL反应体积中一式三份进行，所述反应体积含有10μLFastAdvanced Master Mix(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)、5μL稀cDNA(50ng)、4μL无RNA酶/DNA酶的水和1μL以下基因特异性测定探针中的每一种(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)：TATA盒结合蛋白(Hs00427620_m1)、INTS4(Hs00369250_m1)、CPAMD8(Hs00610855_m1)、HERC1(Hs01032486_m1)、MPL(Hs00180489_m1)、SPTA1(Hs00162179_m1)和NUTM1(Hs01395191_m1)。以下标准PCR反应条件用于所有转录本：50℃2分钟、95℃2分钟；40个95℃1秒、60℃20秒循环。使用QuantStudioTM设计和分析管理软件(2.6版)分析数据，用于测量定量循环(Cq)。应用2-ΔC T方法，使用持家基因TATA盒结合蛋白的几何平均数，进行内部归一化。
(iv)用于TCRE7-11-28的安全性评价的细胞因子测定
在共培养测定前的二十四(24)小时，使用Gibco TrypLETM试剂将癌细胞系从其培养瓶分开，用培养基洗涤并以50,000个细胞/孔的密度接种于96孔平底培养板中并允许贴壁过夜。将细胞用1ng/mL或100ng/mL E711-19肽进行脉冲输送2小时或在其相应培养基中未进行脉冲。在脉冲输送后，将孔用培养基轻轻洗涤三次。接着将E7-11-28或NTD细胞以50,000个细胞/孔的密度添加在完全T细胞培养基中。共培养后24小时，收集上清液并冷冻在-80℃下。使上清液解冻并通过负载在单重人IFN-γ(第3代)滤筒(ProteinSimple,San Jose,CA)使用EllaTM仪器分析IFN-γ水平。在共培养测定前24小时，使用DetachKitTM(PromoCell,Germany)将HUVEC、HPF、HSAEpC、HAoSMC、NHA和HHSteC从其培养瓶或培养板分开，洗涤并在其相应培养基中以25,000个细胞/孔的密度涂铺。第二天，将其用肽进行脉冲输送或不进行脉冲输送，洗涤并与50,000个细胞/孔的E7-11-28或NTD细胞共培养。在解冻之后，皮下HWP以供应商推荐的密度直接涂铺在96孔平底培养板中并分化成成熟脂肪细胞，不进行分开。在解冻之后，HCM也以供应商推荐的密度直接涂铺在96孔平底培养板中并培养40天以使其成熟。接着，将脂肪细胞和HCM用肽进行脉冲输送或不进行脉冲输送，并且与50,000个细胞/孔的E7-11-28或NTD共培养。将iCell星形细胞解冻并根据制造商说明书涂铺在24孔培养板中7天。第二天，将其用肽进行脉冲输送或不进行脉冲输送，洗涤并与250,000个细胞/孔的E7-11-28或NTD细胞共培养。在所有原代/iPS来源细胞与T细胞共培养后24小时收集上清液，并且在EllaTM仪器上分析IFN-γ水平。
e.小鼠异种移植研究
通过将CaSki和SCC152细胞皮下注射细胞到7-9周龄雌性NCG小鼠(NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/NjuCrl，Charles River)中，在两种异种移植模型中评估TCR E7-11-28的体内抗肿瘤功效。Explora BioLabs的动物护理和使用程序经国际实验动物评估与认可委员会(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory AnimalCare International，AAALAC)认可，这确保了遵守实验动物护理与使用的通用标准。CaSki和SCC152细胞分别在含有10％胎牛血清的RPMI-1640和EMEM培养基中生长成贴壁培养物。将由50％PBS和50％组成的100μL体积中1×106个CaSki或SCC152肿瘤细胞皮下注射到右侧腹中。在注射后十天或十四天，基于根据下式的肿瘤体积(用卡尺测量)将动物随机化到实验组：体积＝1/2(肿瘤长度×垂直肿瘤宽度2)。
在给药当日，将T细胞在完全T细胞培养基中解冻，洗涤并以2×107个活细胞/0.2mL的密度再悬浮于无菌PBS中。将媒介物(PBS)、2×107活NTD或TCRE7-11-28T细胞在0.2mL固定体积中静脉内注射到每只测试动物的尾静脉中
通过每两周测量生长评估对肿瘤生长的作用。
f.对HPV16 E7-11-28和DN-TGFβRII双阳性T细胞的工程化和DN-TGFβRII功能的评估
除T细胞经编码(1)TCR E7-11-28和Q标记的CD8α和(2)DN-TGFβRII的两种慢病毒共同转导以外，如章节‘对T细胞进行工程化以表达HPV16 E711-19特异性TCR’中所述用慢病毒对T细胞进行工程化(参见上文章节b(i)。通过流式细胞术证实TCR E7-11-28、Q标记的CD8和DN-TGFβRII的表达。随后，将细胞用TGFβRII的抗体(W17055，BioLegend)染色并经FACS分选成DN-TGFβRII阳性(TGFβRII亮)和DN-TGFβRII阴性(TGFβRII暗)部分。T细胞在补充有50IU/mL IL-2(Sigma Aldrich)和5ng/mL IL-7(R&D Systems)的T细胞培养基中静置过夜，然后在含有0或5ng/mL TGFβ1(R&D Systems)的T细胞培养基中涂铺在12孔板中。在TGFβ1存在对比不存在下孵育24小时之后，建立与经肽脉冲输送的T2细胞的共培养测定。为此，将T2细胞用E711-19肽(YMLDLQPET，Genscript)以多种浓度(0.7pg/mL、7.4pg/mL、22pg/mL、67pg/mL、200pg/mL和2,000pg/mL)脉冲输送，并且在50％T细胞培养基和50％靶细胞培养基(RPMI 1640，含有10％热失活FBS和1％青霉素/链霉素(Thermo Fisher Scientific))中在E:T 1:1下与T细胞一起涂铺；将TGFβ1添加到0或5ng/mL的最终浓度。在20小时之后，将GolgiPlugTM(BD Biosciences)添加到共培养物中。将细胞再孵育4小时，然后针对细胞内IFNγ进行染色。通过将细胞与Fc阻断剂(Thermo Fisher Scientific)一起孵育15分钟来抑制与Fc受体的非特异性结合。随后，将细胞用生物素标记的抗人CD34(QBEND10，ThermoFisher Scientific)染色，接着用Brilliant VioletTM421缀合的链霉亲和素(streptavidin)(BD Biosciences)、抗人CD3 FITC(HIT3a，BioLegend)和可固定的近红外LIVE/DEADTM染料(Thermo Fisher Scientific)染色。将细胞用CytofixTM(BDBiosciences)固定，用Perm/WashTM缓冲液(BD Biosciences)透化，并且用抗人IFNγ-PE(B27，BioLegend)染色。在CytoFLEX流式样品仪(Beckman Coulter)上获得样品并使用FlowJo软件(10版，TreeStar)分析。确定Q标记的活T细胞群体(LIVE/DEADTM-CD3+CD34+)内IFNγ+细胞百分比。
如下进一步描述，术语“TSC-200-A02”是指除包括CD8α、CD8β、CD34富集标签(例如Q标签)和DN-TGFβRII的其它组分以外表达E7-11-28(即，上文在表1中描述的TCR-200-A02序列)的工程化的全T细胞群体，包括CD8+ T细胞和CD4+ T细胞。
g.ReceptorScan筛选
(i)DC培养
第-4天，使用从HLA-A*02:01阳性健康供体分离的PBMC，利用EasySepTM人CD14阳性选择试剂盒II(StemCell Technologies)根据制造商说明书进行单核细胞分离。使用对CD14(M5E2；BioLegend,Dedham,MA)、HLA-A2(BB7.2，BioLegend)、CD80(2D10，BioLegend)、CD83(HB15e，BioLegend)和CD86(IT2.2，BioLegend)具有特异性的荧光标记的抗体评定纯度和共刺激分子表达。CD14表达>90％。CD14+单核细胞再悬浮于补充有重组人GM-CSF和IL-4(R&D Systems,Minneapolis,MN)，最终浓度分别为800IU/mL和1000IU/mL的AIM-VTM培养基(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)。第-2天，将重组人TNF-α(10ng/mL)、IL-6(1000IU/mL)和IL-1β(2ng/mL)(R&D Systems)以及PGE2(1μg/mL，StemCell Technologies)添加到培养的单核细胞中。
(ii)CD8初始T细胞分离
第-1天，使用EasySepTM人初始CD8+ T细胞分离试剂盒II(StemCellTechnologies)根据制造商说明书，从来自表达HLA-A*02:01的健康供体的PBMC分离自体同源CD8初始T细胞。使用对CD8α(HIT8a，BioLegend)、CD45RO(UCHL1，BioLegend)、CD45RA(HI100，BioLegend)、CD56(5.1H11，BioLegend)、CD57(HCD57，BioLegend)和CCR7(G043H7，BioLegend)具有特异性的荧光标记的抗体评定纯度。初始CD8α+ T细胞的纯度>90％。将细胞在37℃、5％CO2下在T细胞培养基(X-VIVOTM15无血清培养基[Lonza,Rockland,MD]或LymphoONETM[LymphoONE T细胞扩增Xeno-Free培养基,Takara,WK552]，含有10％人血清[SigmaAldrich,St.Louis,MO]、1％青霉素-链霉素[Thermo Fisher Scientific]、1％GlutaMAX[Thermo Fisher])中静置过夜，并且补充有10ng/ml重组人IL-7(R&D Systems)。
(iii)共培养
第0天，使用与第-1天相同的抗体组再评估CD8 T细胞纯度，并且通过HLA-A2、CD80、CD83和CD86的上调和CD14的下调确认DC成熟。在37℃、5％CO2下将DC用1μM HPV16E711-19肽(YMLDLQPET，GenScript[Piscataway,NJ])以及具有多种抗原特异性的另外的肽进行脉冲输送(即，多路筛选)，历时3小时。将经脉冲输送的DC与静置的CD8初始T细胞在补充有重组人IL-12(10ng/mL)和IL-21(60ng/mL)(R&D Systems)的T细胞培养基中共培养。在第3天与第10天之间，共培养物补充重组人IL-7和IL-15(R&D Systems)。在第10天或第11天，使用A*02:01HPV16 E711-19(YMLDLQPET)dCODE(Immudex,Copenhagen,Denmark,WB3823-PfBC0621)、CD8α和TCRα/β(IP26,BioLegend)和DAPI(Thermo FisherScientific)根据制造商说明书对HPV16 E711-19特异性细胞进行Dextramer染色。
(iv)抗原特异性细胞分选
第12天，收集细胞并根据制造商说明书用A*02:01HPV16 E711-19(YMLDLQPET)dCODE(Immudex)连同对多种其它抗原具有特异性的dCODE(Immudex)染色。洗涤细胞，然后用对CD8α和TCRα/β具有特异性的抗体染色，并且在第10-11天用DAPI染色，并且使用Sony SH800S细胞分选仪(Sony Biotechnology,San Jose,CA)、BigFoot细胞分选仪(ThermoFisher Scientific)或Astrios细胞分选仪(Beckman Coulter,Brea,CA)对dextramer阳性细胞(CD8α+、DAPI-、TCRα/β+、dextramer+)进行分选。使用10xGenomics平台(Pleasanton,CA)使分选的细胞进行单细胞TCRα/β测序。
(v)使用10x Genomics平台的多路NGS和分析
根据10x Chromium Next GEM单细胞5'试剂试剂盒v2(Dual Index)，利用特征条形码技术进行细胞表面蛋白与免疫受体定位(10x Genomics，方案CG000330Rev A)制备单细胞文库。高达15,000个细胞被捕捉在液滴(GEM)中并根据制造商说明书进行加工，以获得得到VDJ和细胞表面蛋白信息的文库。在Illumina NextSeqTM2000仪器(Illumina)上对完全组装的文库进行测序。
分别使用Cell Ranger 6.0.0VDJ和COUNT管线(10x Genomics)加工测序的VDJ和细胞表面蛋白文库。利用测量dCODE(Immudex)的细胞表面蛋白数据集将VDJ数据多路分解，以确定哪个表位由每个TCR识别。如果对于既定的细胞条形码，总dextramer计数超过10并且一种dextramer占总计数>90％，则将靶表位分配到细胞条形码。利用VDJ与细胞表面蛋白文库之间的共享细胞条形码允许鉴定每个测序TCR的靶标。
h.对T细胞进行工程化以表达HPV16-E711-19特异性TCR(图15)
使用自动化细胞加工系统从HLA-A*02:01阳性健康供体leukopak分离PBMC。将分离、洗涤和浓缩的PBMC电穿孔，以递送编码转座酶的mRNA和转座子纳米质粒载体。在电穿孔之后，允许细胞在基础培养基中静置过夜。电穿孔后24小时，将细胞用CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂和刺激生长的细胞因子激活。在培养扩增期期间，经由在小分子存在下的选择性生长优势，对工程化的细胞进行富集。在第15天收获扩增的细胞并再配制成冷冻保存培养基。使用自动化控制速率冷冻程序冷冻保存细胞。数据展示于图15中。
i.材料
细胞系
·Lenti-X：TakaraBio USA，632180
·HEK293T细胞：ATCC，CRL-3216
·T2：ATCC，CRL-1992
·CaSki：ATCC，CRL-1550
·NCI-H1792：ATCC，5895
·SCC090：ATCC，CRL-3239
·SCC152：ATCC，CRL-3240
·SiHa：ATCC，HTB-35
·CAL-12T：DSMZ，ACC 443
·THP-1：ATCC，TIB202
·TF-1：ATCC，CRL-2003
·OVCAR-3：ATCC，HTB-161
·SNU-475：ATCC，CRL-2236
·ChaGo-K-1：ATCC，HTB-168
·JVM2：ATCC，CRL-3002
·L363：DSMZ，ACC 49
·SET-2：DSMZ，ACC 608
·CMK：DSMZ，ACC 392
·OCI-M1：DSMZ，ACC529
·OCI-M2：DSMZ，ACC619
健康人原代/iPS来源细胞
·人脐静脉内皮细胞(HUVEC)：PromoCell，C-12200(批号466Z026)
·HUVEC-人脐静脉内皮细胞，单个供体，EGMTM：Lonza，CC-2517(批号0000246083)
·人肺成纤维细胞(HPF)：PromoCell，C-12360(批号474Z024.2、446Z03、1474Z031.2、1081503.2)
·人小气道上皮细胞(HSAEpC)：PromoCell，C-12642(批号467Z033、467Z025.2)
·皮下人白色前脂肪细胞(HWP)：PromoCell，C-12735(批号454Z006、467Z014)
·人主动脉平滑肌细胞(HAoSMC)：PromoCell，C-12533(批号453Z011.6、470Z011.2)
·人心肌细胞(HCM)：PromoCell，C-12810(批号463Z016.2、470Z011.9、472Z002.3)
·iCell星形细胞试剂盒，01434：Fujifilm CellularDynamics
·正常人星形细胞(NHA)：Lonza，CC-2656(批号0000672445)
·人肝脏星状细胞(HHSteC)：Creative Bioarray，CSC-C1496(批号C212011，C212641)
·人肝脏星状细胞(HHSteC)：ScienCell Research Laboratories，5300(批号25914)
·正常人表皮细胞(NHDF)：PromoCell，C-12300(批号471Z018.2)、C-12302(批号472Z001.3、477Z023.2)
·人心脏成纤维细胞(HCF)：PromoCell，C-12360(批号472Z002.2、475Z017.1)
·正常人表皮角化细胞(NHEK)：PromoCell，C-12003(批号451Z014.1)
·肝细胞：InVitro ADMET Laboratories，82006(批号HH1052、HH1165、HH1186)
·人子宫颈上皮细胞(HCerEpC)：iXCells Biotechnologies，10HU-237(批号202099)
·人小肠上皮细胞(HSIEpC)：iXCells Biotechnologies，10HU-237(批号201457)
·人子宫颈上皮细胞(HCerEpC)：ATCC，PCS-480-011(批号70029809)
·人乳腺上皮细胞(HMEpC)：ATCC，PCS-600-010(批号70043304)
·骨胳肌细胞(SkMC)：ATCC，PCS-950-010(批号81202212)
·人骨髓单核细胞(HBMMNC)：StemCell Technologies，70001.2(批号2208422001、2208412006、2208412008)
动物
·NCG小鼠(NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/NjuCrl)：Charles RiverLaboratories
培养基和补充剂
·X-VIVO 15无血清造血细胞培养基，具有L-谷氨酰胺、庆大霉素(gentamycin)和酚红：Lonza，04-418Q
·人类男性AB血清(热失活)：SigmaAldrich，H3667-100ML
·青霉素链霉素：Gibco，15149-122
·GlutaMAXTM补充剂：Fisher Scientific，35050061
·RPMI-1640培养基：ATCC，30-2001
·胎牛血清(FBS)，热失活：Gibco，A3840102
·IMDM：ATCC，30-2005
·RPMI培养基1640(1x)[+]4.5g/L D-葡萄糖、[+]2.383g/L HEPES缓冲液、[+]L-谷氨酰胺、[+]1.5g/L碳酸氢钠、[+]110mg/L丙酮酸钠：Gibco，A10491-01
·DMEM培养基(1X)[+]4.5g/L D-葡萄糖、[+]L-谷氨酰胺、[+]3.7g/L碳酸氢钠：Thermo Fisher Scientific，11965084
·DMEM(1x)[+]4.5g/L D-葡萄糖、[+]L-谷氨酰胺、[-]丙酮酸钠：Gibco，11965
·OptiPROTMSFM培养基：Thermo Fisher Scientific，12309019
·EMEM培养基：ATCC，30-2003
·内皮细胞生长培养基(备用)：PromoCell，C-22010
·成纤维细胞生长培养基(备用)：PromoCell，C-23010
·气道上皮细胞生长培养基(备用)：PromoCell，C-21060
·前脂肪细胞生长培养基(备用)：PromoCell，C-27410
·前脂肪细胞分化培养基(备用)：PromoCell，C-27436
·脂肪细胞营养培养基(备用)：PromoCell，C-27438
·平滑肌细胞生长培养基2(备用)：PromoCell，C-22062
·肌细胞生长培养基(备用)：PromoCell，CC-22070
·DMEM培养基/F-12、HEPES：Thermo Fisher Scientific，11330
·N-2补充剂：Thermo Fisher Scientific，17502048
·AGMTM星形细胞生长培养基BulletKitTM：Lonza，CC-3186
·星状细胞培养基：Creative Bioarray，CM-1193W
·星状细胞培养基：ScienCell Research Laboratories，5301
·DetachKitTM：PromoCell，C-41220
·TrypLETMExpress：Thermo Fisher Scientific，12605-010
·成纤维细胞生长培养基3(备用)：PromoCell，C-23025
·UCRMTM-通用冷冻保存回收培养基，50mL：In Vitro ADMET Laboratories，81015
·UPCMTM-通用原代细胞涂铺培养基，50mL：In Vitro ADMET Laboratories，81016
·角化细胞生长培养基2(备用)：PromoCell，C-20011
·上皮细胞生长培养基：iXCells Biotechnologies，MD-0041
·乳腺上皮细胞基础培养基：ATCC，PCS-600-030
·乳腺上皮细胞生长试剂盒：ATCC，PCS-600-040
·脂肪、脐带和骨髓来源MSC的间充质干细胞基础培养基：ATCC，PCS-500-030
·初级骨胳肌生长试剂盒：ATCC，PCS-950-040
缓冲液
·EasySep缓冲液：StemCell Technologies，20144
·DPBS(无Ca2+/Mg2+)：Gibco，14190-122
细胞因子
·重组人IL-2：Sigma Aldrich，11147528001
·重组人IL-2：PeproTech，200-02
·重组人IL-7：R&D Systems，219-IL-025
·重组人IL-15：R&D Systems，247-ILB-005
·重组人TGFβ1：R&D Systems，7754-BH-025/CF
试剂盒
·EasySepTM人T细胞分离试剂盒：StemCell Technologies：17951
·用于32个样品的EllaTM单重试剂盒：ProteinSimple：SPCKB-PS-003027
·CD8微珠试剂盒：Miltenyi Biotech，130-117-019
·膜联蛋白VMicroBead试剂盒：Miltenyi Biotech，130-090-201
·单重人IFN-γ(第三代)滤筒：ProteinSimple，SPCKB-PS-002574抗体和染色试剂
·CD3单克隆抗体(OKT)，功能等级：eBioscience 16-0037-81
·抗人CD8αPerCp-Cy5.5(克隆：HIT8a)：BioLegend：300924
·抗人CD4 APC-Cy7(克隆：OKT4)：BioLegend：317418
·抗人CD56 PE(克隆：5.1H11)：BioLegend：362508
·抗人CD57 PE(克隆：HCD57)：BioLegend：322312
·抗人CD34 AlexaFluor488：(克隆：QBEND/10)：R&D Systems，FAB7227G
·抗人HLA-A2 PE(克隆：BB7.2)：BioLegend，343306
·抗人TCRα/βPE-Cy7(克隆：IP26)：BioLegend：306720
·抗人HLA-A,B,C APC抗体：BioLegend，311410
·可固定活力染料eFluor 660(APC Channel)Thermo Fisher Scientific：65-0864-14
·DAPI：Thermo Scientific：Thermo Scientific，62248
·Cytofix：BD Biosciences，554655
·抗人CD3 FITC：(克隆HIT3a)：Biolegend：300306
·抗人CD34生物素标记：(克隆QBEND/10)：Thermo Fisher Scientific：MA5-16924
·抗人TGFβRIIPE：(克隆W17055)Biolegend：399704
·抗IFNγPE：(克隆B27)：Biolegend：506507
·抗人Fc受体结合抑制剂：Thermo Fisher Scientific：16-9161-73
·LIVE/DEADTM可固定近红外染料：Thermo Fisher Scientific：L10119
·链霉亲和素Brilliant VioletTM41：BD Biosciences：563259
·GolgiPlugTM：BD Biosciences：555029
·Perm/WashTM缓冲液：BD Biosciences：554723
·CellTraceTMViolet(CTV)：Thermofisher，C34557
·可固定活力染料660：Thermo Fisher Scientific：65-0864-14
·CountBrightTM绝对计数珠粒：Fisher Scientific：C36950
·7-AAD活力染色溶液：BioLegend，420404
肽
·HPV16-E711-19(YMLDLQPET)：Genscript
Dextramer
·HLA-A*02:01YMLDLQPET HPV16-E711-19 dextramer：Immundex
CRISPR-Cas9和电穿孔试剂
·S.p.Cas9核酸酶V3(批号0000417827)：IDT，1081059
·CRISPR-Cas9tracrRNA(批号0000415438)：IDT，1072534
·4D-NucleofectorTM核心单元：Lonza，AAF-1002B
·4D-NucleofectorTM X单元：Lonza，AAF-1002X
·SE细胞系4D-NucleofectorTM X试剂盒L：Lonza V4XC-1012
组织培养板
·24孔板：Wilson Wolf，80192M
·6孔板：Wilson Wolf，80240M
·100：WilsonWolf，800400
·VECELL 96孔板：Cosmo Bio Co.，VCL-V96WGPB-10-EX
·TC处理的6孔板：Corning Costar，3506
·TC处理的24孔板：Corning Costar，3524
·96孔平底板：Corning Costar，3595
·384孔平底板：Corning Costar，3764
·M：Corning，10020
·5室，具有排气帽，Corning，3313
·70uM Nylon细胞过滤器，Corning，431751
·CellAdhereTM胶原蛋白I包被的96孔平底板：StemCell Technologies，100-0366
·PureColTM包被的6孔板：MilliporeSigma，CC302
包装和慢病毒产生试剂
·Lenti-XTMGoStixTMPlus：Takara，631281
·转染试剂：Polyplus-transfection，114-75
·20：Sartorius，VS2041
·50盒：Sartorius，VF05P4
定量RT-PCR试剂
·微型试剂盒：Qiagen，74104
·Fast Advanced Master Mix：Thermo Fisher Scientific，4444557
·SuperScriptTMIV VILOTM：Thermo Fisher Scientific，11756050
·RT-PCR级水：Thermo Fisher Scientific，AM9935
Leukopak加工试剂：
·Multi-24 Column Block：Miltenyi，130-095-692
·淋巴细胞分离介质：Corning，25-072-CV
其它试剂
·ImmunoCultTM人CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂：StemCell Technologies，10970
·聚L-鸟氨酸溶液0.01％：Millipore-Sigma，P4957-50ML
·CryoStor CS10：StemCell Technologies，07930
·PBS中的ViaStain AO/PI染色溶液：Nexcelom Bioscience，CS2-0106-5mL
·诺尔丝菌素：GoldBio，N-500-1
·嘌呤霉素：Gibco，A11138-03
·Mirus TransIT，Mirus Bio MIR 2704
·聚凝胺：EMD Millipore，TR-1003-G
·NucLight Red慢病毒试剂(EF-1α启动子、嘌呤霉素选择)，Sartorius，4476
·层粘连蛋白：Millipore-Sigma，L2020
·聚-L-赖氨酸10mg/mL：ScienCell Research Laboratories，0413
·基底膜基质高浓度(HC)，无LDEV，10mL，产品编号354248
实施例2：对HPV16-E711-19(YMLDLQPET)具有特异性的TCR的发现
开发了一种高通量TCR发现平台，它能够从原代人初始CD8 T细胞快速克隆抗原特异性TCR，并且用于鉴定对HPV16-E711-19(YMLDLQPET)具有特异性的TCR(图1)。发现了总共459种TCR。分别从两种单独的专有VAYG筛选鉴定59/293种和15/161种HPV16-E711-19特异性TCR(图2和图6)。使用多种细胞系(参见表6)，鉴定TCR子集为具有所需细胞表面表达和效应功能，例如细胞毒性或细胞因子产生(图3、图4和图7)。图8提供了证实TCR-28展示相对于比较TCR可比的细胞毒性和优良效应功能的总结结果。
表6：细胞系表达的参考
另外，在同种异体反应性测定中筛选HPV16-E711-19特异性TCR E7-11-28。TCR28表现出最小的同种异体反应性，一般定义为靶细胞抑制超过20％(例如对测试的110种不同HLA类型中的108种，无可检测的同种异体反应性)(图5)，诱发抗原特异性T细胞增殖(图9)，未与表达推定脱靶的癌细胞系(图11)或健康人原代细胞(图12)反应，并且有效控制体内肿瘤生长(图13)。此外，证实例如通过使用DN-TGFβRII遏制TGFβ信号传导使TSC-200-A02 T细胞对TGFβ介导的遏制具有抗性(图14)。实际上，在代表性pNVVD154和pNVVD160载体中TCRE7-11-28的表达和评估进一步证实功能TCR活性(图15A-15C)。
因此，本文已鉴定并描述了具有所希望特征(例如识别靶标、细胞表面表达、细胞毒性功能、低同种异体反应性等)的多种HPV16-E711-19特异性TCR。
以引用的方式并入
本文所提及的所有出版物、专利和专利申请均以引用的方式整体并入本文中，如同特定并且个别地指示每一个别出版物、专利或专利申请以引用的方式并入一般。在发生冲突的情况下，将以本申请(包括本文中的任何定义)为准。
提及与登录公共数据库相关的登录号的任何多核苷酸和多肽序列也以引用的方式整体并入，数据库例如由美国基因组研究院(The Institute for Genomic Research，TIGR)在万维网tigr.org和/或美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information；NCBI)在万维网ncbi.nlm.nih.gov维护的那些数据库。
等效物和范围
在以上描述中阐述了本发明所涵盖的一个或多个实施方案的细节。尽管上面已经描述了代表性的示例性材料和方法，但与本文描述的材料和方法相似或等效的任何材料和方法均可用于本发明所涵盖的实施方案的实践或测试。与本发明相关的其它特征、目标和优点从描述中可显而易见。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明本领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在发生冲突的情况下，以上面提供的本发明的描述为准。
本领域的技术人员将认识到或能够仅使用常规实验即可确定本文所述的本发明所涵盖的特定实施方案的多种等效物。本发明所涵盖的范围不意图限于本文提供的描述，并且意图随附权利要求书涵盖这类等效物。
还应注意，术语“包含”意图为开放性的并且允许但不要求包括另外的要素或步骤。当本文使用术语“包含”时，因此还涵盖和公开术语“由……组成”。
在给出范围的地方，包括端点。此外，应当理解，除非另有指示或从上下文和本领域普通技术人员的理解中明显看出，否则在本发明所涵盖的不同实施方案中表示为范围的值可采用所陈述范围内的任何特定值或子范围，除非上下文另有明确规定，否则为范围下限单位的十分之一。
此外，应当理解，可明确地从任何一项或多项权利要求书中排除本发明所涵盖的属于现有技术的任何特定实施方案。因为这类实施方案被视为本领域普通技术人员已知的，所以即使本文中未明确阐述排除的情况下，其也可以被排除。本发明所涵盖的组合物的任何特定实施方案(例如，任何抗生素、治疗剂或活性成分；任何生产方法；任何使用方法等)可出于任何原因从任何一项或多项权利要求书中排除，无论是否与现有技术的存在相关。
应当理解，已使用的词语为描述性词语而非限制性词语，并且在不背离本发明在其更广泛的态样中所涵盖的真实范围和精神下，可在所附权利要求书的范围内进行改变。
尽管本发明已针对数个描述的实施方案进行一定长度和一些特殊性的描述，但不意图将本发明限制于任何这类细节或实施方案或任何特定实施方案，而应参考所附权利要求书来解释，以便根据现有技术提供对这些权利要求书的最广泛可能的解释，并因此有效地涵盖本发明所涵盖的预期范围。

Claims (149)

1.一种结合蛋白，所述结合蛋白包含：
a)与选自由表1中所列的TCRα链CDR序列组成的组的TCRα链CDR序列具有至少约80％同一性的T细胞受体(TCR)α链CDR序列；和/或
b)与选自由表1中所列的TCRβ链CDR序列组成的组的TCRβ链CDR序列具有至少约80％同一性的TCRβ链CDR序列，其中所述结合蛋白能够与HPV16E711-19免疫原性肽-MHC(pMHC)复合物结合，任选地其中结合亲和力的Kd小于或等于约5×10-4M。
2.一种结合蛋白，所述结合蛋白包含：
a)与选自由表1中所列的TCR Vα结构域序列组成的组的TCRVα结构域序列具有至少约80％同一性的TCRα链可变(Vα)结构域序列；和/或
b)与选自由表1中所列的TCR Vβ结构域序列组成的组的TCRVβ结构域序列具有至少约80％同一性的TCRβ链可变(Vβ)结构域序列，其中所述结合蛋白能够与HPV16E711-19免疫原性肽-MHC(pMHC)复合物结合，任选地其中结合亲和力的Kd小于或等于约5×10-4M。
3.一种结合蛋白，所述结合蛋白包含：
a)与选自由表1中所列的TCRα链序列组成的组的TCRα链序列具有至少约80％同一性的TCRα链序列；和/或
b)与选自由表1中所列的TCRβ链序列组成的组的TCRβ链序列具有至少约80％同一性的TCRβ链序列，其中所述结合蛋白能够与HPV16E711-19免疫原性肽-MHC(pMHC)复合物结合，任选地其中结合亲和力的Kd小于或等于约5×10-4M。
4.一种结合蛋白，所述结合蛋白包含：
a)选自由表1中所列的TCRα链CDR序列组成的组的TCRα链CDR序列；和/或
b)选自由表1中所列的TCRβ链CDR序列组成的组的TCRβ链CDR序列，其中所述结合蛋白能够与HPV16E711-19免疫原性肽-MHC(pMHC)复合物结合，任选地其中结合亲和力的Kd小于或等于约5×10-4M。
5.一种结合蛋白，所述结合蛋白包含：
a)选自由表1中所列的TCR Vα结构域序列组成的组的TCRα链可变(Vα)结构域序列；和/或
b)选自由表1中所列的TCR Vβ结构域序列组成的组的TCRβ链可变(Vβ)结构域序列，其中所述结合蛋白能够与HPV16E711-19免疫原性肽-MHC(pMHC)复合物结合，任选地其中结合亲和力的Kd小于或等于约5×10-4M。
6.一种结合蛋白，所述结合蛋白包含：
a)选自由表1中所列的TCRα链序列组成的组的TCRα链序列；和/或
b)选自由表1中所列的TCRβ链序列组成的组的TCRβ链序列，其中所述结合蛋白能够与HPV16E711-19免疫原性肽-MHC(pMHC)复合物结合，任选地其中结合亲和力的Kd小于或等于约5×10-4M。
7.如权利要求1-6中任一项所述的结合蛋白，其中1)所述TCRα链CDR、所述TCR Vα结构域和/或所述TCRα链由选自表1中所列的TRAV、TRAJ和TRAC基因的组的TRAV、TRAJ和/或TRAC基因或它们的片段编码，和/或2)所述TCRβ链CDR、所述TCR Vβ结构域和/或所述TCRβ链由选自表1中所列的TRBV、TRBJ和TRBC基因的组的TRBV、TRBJ和/或TRBC基因或它们的片段编码，和/或3)与表1中所列的同源参考CDR序列相比，所述结合蛋白的每个CDR具有至多五个氨基酸取代、插入、缺失或它们的组合。
8.如权利要求1-7中任一项所述的结合蛋白，其中所述HPV16E711-19免疫原性肽包含氨基酸序列YMLDLQPET。
9.如权利要求1-8中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白为嵌合、人源化或人类的。
10.如权利要求1-9中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白为TCR、TCR的抗原结合片段、单链TCR(scTCR)、嵌合抗原受体(CAR)或包含TCR和效应结构域的融合蛋白，任选地其中结合结构域包含跨膜结构域和细胞内效应结构域。
11.如权利要求1-10中任一项所述的结合蛋白，其中所述TCRα链和所述TCRβ链共价连接，任选地其中所述TCRα链和所述TCRβ链透过连接肽共价连接。
12.如权利要求1-11中任一项所述的结合蛋白，其中所述TCRα链和/或所述TCRβ链共价连接到部分，任选地其中所述共价连接的部分包含亲和力标签或标记。
13.如权利要求12所述的结合蛋白，其中所述亲和力标签选自由以下组成的组：CD34富集标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、钙调蛋白结合蛋白(CBP)、蛋白C标签、Myc标签、HaloTag、HA标签、Flag标签、His标签、生物素标签和V5标签，和/或其中所述标记为荧光蛋白。
14.如权利要求1-13中任一项所述的结合蛋白，其中所述共价连接的部分选自由以下组成的组：致炎因子、细胞因子、毒素、细胞毒性分子、放射性同位素或抗体或其抗原结合片段。
15.如权利要求1-14中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白与细胞表面上的所述pMHC复合物结合。
16.如权利要求1-15中任一项所述的结合蛋白，其中所述MHC为MHC多聚体，任选地其中所述MHC多聚体为四聚体。
17.如权利要求1-16中任一项所述的结合蛋白，其中所述MHC为MHC I类分子。
18.如权利要求1-17中任一项所述的结合蛋白，其中所述MHC包含MHCα链，所述链为HLA血清型HLA-A*02。
19.如权利要求1-18中任一项所述的结合蛋白，其中所述HLA等位基因选自由以下组成的组：HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0205、HLA-A*0206和HLA-A*0207等位基因。
20.如权利要求1-19中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白与所述HPV16E711-19肽-MHC(pMHC)复合物的结合引发免疫反应，任选地其中所述免疫反应是T细胞反应。
21.如权利要求1-20中任一项所述的结合蛋白，其中所述T细胞反应选自由T细胞扩增、细胞因子释放和/或细胞毒性杀伤组成的组。
22.如权利要求1-21中任一项所述的结合蛋白，所述结合蛋白能够以小于或等于约1×10-4M、小于或等于约5×10-5M、小于或等于约1×10-5M、小于或等于约5×10-6M、小于或等于约1×10-6M、小于或等于约5×10-7M、小于或等于约1×10-7M、小于或等于约5×10-8M、小于或等于约1×10-8M、小于或等于约5×10-9M、小于或等于约1×10-9M、小于或等于约5×10-10M、小于或等于约1×10-10M、小于或等于约5×10-11M、小于或等于约1×10-11M、小于或等于约5×10-12M或小于或等于约1×10-12M的Kd与所述HPV16E711-19免疫原性肽-MHC(pMHC)复合物特异性和/或选择性地结合。
23.如权利要求1-22中任一项所述的结合蛋白，其中与已知的T细胞受体相比，所述结合蛋白对所述肽-MHC(pMHC)具有更高结合亲和力。
24.如权利要求1-23中任一项所述的结合蛋白，其中与已知的T细胞受体相比，所述结合蛋白对所述肽-MHC(pMHC)的结合亲和力至少高出1.05倍。
25.如权利要求1-24中任一项所述的结合蛋白，其中当与表达HPV16E711-19肽表位的靶细胞接触时，与已知的T细胞受体相比，所述结合蛋白诱导更高的T细胞扩增、细胞因子释放和/或细胞毒性杀伤。
26.如权利要求1-25中任一项所述的结合蛋白，其中当与表达HPV16E711-19肽表位的靶细胞接触时，与已知的T细胞受体相比，所述结合蛋白诱导的T细胞扩增、细胞因子释放和/或细胞毒性杀伤至少增加1.05倍。
27.如权利要求25或26所述的结合蛋白，其中所述靶细胞为CaSki、SCC152或SCC090细胞系。
28.如权利要求25或26所述的结合蛋白，其中所述靶细胞为癌细胞，任选地其中所述癌细胞为头颈癌细胞、口咽癌细胞、宫颈癌细胞、肛门癌细胞、阴道癌细胞、阴门癌细胞或阴茎癌细胞。
29.如权利要求22-28中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白不与肽-MHC(pMHC)复合物结合，任选地其中所述肽来源于SPTA1、MPL、HERC1、CPAMD8、INTS4、NUTM1或XM00172256。
30.如权利要求22-29中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白不与SPTA1-、MPL-、HERC1-、CPAMD8-、INTS4-、NUTM1-和/或XM_00172256-肽-MHC(pMHC)复合物结合。
31.一种TCRα链和/或β链，所述TCRα链和/或β链选自由表1中所列的TCRα链和β链序列组成的组。
32.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子在严格条件下与编码选自由表1中所列的多肽序列组成的组的多肽的核酸的补体，或与编码选自由表1中所列的多肽序列组成的组的多肽的核酸具有至少约80％同源性的序列杂交，任选地其中所述分离的核酸分子包含1)选自表1中所列的TRAV、TRAJ和TRAC基因的组的TRAV、TRAJ和/或TRAC基因或它们的片段和/或2)选自表1中所列的TRBV、TRBJ和TRBC基因的组的TRBV、TRBJ和/或TRBC基因或它们的片段。
33.如权利要求32所述的分离的核酸，其中所述核酸进行密码子优化以在宿主细胞中表达。
34.一种载体，所述载体包含如权利要求32或33所述的分离的核酸。
35.如权利要求34所述的载体，其中所述载体为克隆载体、表达载体或病毒载体。
36.如权利要求34或35所述的载体，其中所述载体还包含编码CD8α、CD8β、显性负性TGFβ受体II(DN-TGFβRII)、选择性蛋白标志物的核酸序列，任选地其中所述选择性蛋白标志物为二氢叶酸还原酶(DHFR)。
37.如权利要求34-36中任一项所述的载体，其中编码CD8α、CD8β、所述DN-TGFβRII和/或所述选择性蛋白标志物的所述核酸序列可操作地连接到编码标签的核酸。
38.如权利要求34-37中任一项所述的载体，其中所述编码标签的核酸处于编码CD8α、CD8β、所述DN-TGFβRII和/或所述选择性蛋白标志物的所述核酸序列上游的5’，使得所述标签与CD8α、CD8β、所述DN-TGFβRII和/或所述选择性蛋白标志物的N端融合。
39.如权利要求34-38中任一项所述的载体，其中所述标签为CD34富集标签。
40.如权利要求32-39中任一项所述的核酸或载体，其中如权利要求23或24所述的分离的核酸和/或编码TCR8α、TCR8β、CD8α、CD8β、所述DN-TGFβRII和/或所述选择性蛋白标志物的所述核酸序列与内部核糖体进入位点或编码自裂解肽的核酸序列相互连接。
41.如权利要求32-40中任一项所述的核酸或载体，其中所述自裂解肽为P2A、E2A、F2A或T2A。
42.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求32或33所述的分离的核酸，包含如权利要求34-41中任一项所述的载体，和/或表达如权利要求1-30中任一项所述的结合蛋白，任选地其中所述细胞进行基因工程化。
43.如权利要求42所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含TCR基因、HLA基因或两者的染色体基因敲除。
44.如权利要求42或43所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含选自以下的HLA基因的敲除：α1巨球蛋白基因、α2巨球蛋白基因、α3巨球蛋白基因、β1微球蛋白基因、β2微球蛋白基因和它们的组合。
45.如权利要求42-44中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含选自以下的TCR基因的敲除：TCRα可变区基因、TCRβ可变区基因、TCR恒定区基因和它们的组合。
46.如权利要求42-45中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞表达CD8α、CD8β、DN-TGFβRII和/或选择性蛋白标志物，任选地其中所述选择性蛋白标志物为DHFR。
47.如权利要求46所述的宿主细胞，其中所述CD8α、CD8β、所述DN-TGFβRII和/或所述选择性蛋白标志物与CD34富集标签融合。
48.如权利要求47所述的宿主细胞，其中宿主细胞使用所述CD34富集标签进行富集。
49.如权利要求42-48中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为免疫细胞。
50.如权利要求42-49中任一项所述的宿主细胞，其中所述免疫细胞为细胞毒性淋巴细胞、细胞毒性淋巴细胞前体细胞、细胞毒性淋巴细胞祖细胞、细胞毒性淋巴细胞干细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4/CD8双阴性T细胞、γδ(gamma delta)T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK-T细胞、树突状细胞或它们的组合。
51.如权利要求42-50中任一项所述的宿主细胞，其中所述T细胞为初始T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞或它们的组合。
52.如权利要求42-51中任一项所述的宿主细胞，其中所述T细胞为原代T细胞或T细胞系的细胞。
53.如权利要求42-52中任一项所述的宿主细胞，其中所述T细胞不表达内源性TCR或具有内源性TCR的较低表面表达。
54.如权利要求42-53中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞在与靶细胞接触时能够产生细胞因子或细胞毒性分子，所述靶细胞包括包含在MHC分子背景中的HPV16E711-19肽表位的肽-MHC(pMHC)复合物。
55.如权利要求54所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞在体外、离体或体内与所述靶细胞接触。
56.如权利要求54或55所述的宿主细胞，其中所述细胞因子为TNF-α、IL-2和/或IFN-γ。
57.如权利要求54-56中任一项所述的宿主细胞，其中所述细胞毒性分子为穿孔素和/或颗粒酶，任选地其中所述细胞毒性分子为颗粒酶B。
58.如权利要求54-57中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞在与表达HPV16E711-19肽表位的靶细胞接触时能够产生更高水平的细胞因子或细胞毒性分子。
59.如权利要求58所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞能够产生至少高出1.05倍水平的细胞因子或细胞毒性分子。
60.如权利要求54-59中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞能够杀伤包括包含在MHC分子背景中的所述HPV16E711-19肽表位的肽-MHC(pMHC)复合物的靶细胞。
61.如权利要求61所述的宿主细胞，其中所述杀伤通过杀伤测定来测定。
62.如权利要求60或61所述的宿主细胞，其中所述杀伤测定中所述宿主细胞与所述靶细胞的比率为20:1至0.625:1。
63.如权利要求60-62中任一项所述的宿主细胞，其中靶细胞为用1μg/mL至50pg/mLHPV16E711-19肽进行脉冲输送的T2细胞。
64.如权利要求60-62中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞在与表达HPV16E711-19肽表位的靶细胞接触时能够杀伤更高数目的靶细胞。
65.如权利要求64所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞能够杀伤至少高出1.05倍的数目的靶细胞。
66.如权利要求60、61、64和65中任一项所述的宿主细胞，其中所述靶细胞为CaSki、SCC152或SCC090细胞系。
67.如权利要求54-66中任一项所述的宿主细胞，其中所述HPV16E711-19免疫原性肽包含氨基酸序列YMLDLQPET。
68.如权利要求54-67中任一项所述的宿主细胞，其中所述MHC分子为MHC I类分子。
69.如权利要求54-68中任一项所述的宿主细胞，其中所述MHC分子包含MHCα链，所述链为HLA血清型HLA-A*02。
70.如权利要求54-69中任一项所述的宿主细胞，其中所述HLA等位基因选自由以下组成的组：HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:03、HLA-A*02:05、HLA-A*02:06和HLA-A*02:07等位基因。
71.如权利要求54-70中任一项所述的宿主细胞，其中所述靶细胞为选自由CaSki、SCC152和SCC090细胞系组成的组的细胞系，为表达HPV16E711-19免疫原性肽的癌细胞，或不为SiHa细胞系和/或不为NCI-H1792细胞系。
72.如权利要求71所述的宿主细胞，其中所述癌细胞选自由以下组成的组：头颈癌细胞、口咽癌细胞、宫颈癌细胞、肛门癌细胞、阴道癌细胞、阴门癌细胞和阴茎癌细胞。
73.如权利要求54-72中任一项所述的宿主细胞，其中a)所述宿主细胞在与包括包含在MHC分子背景中的SPTA1、MPL、HERC1、CPAMD8、INTS4、NUTM1或XM_00172256肽表位的肽-MHC(pMHC)复合物的靶细胞接触时不诱导T细胞扩增、细胞因子释放或细胞毒性杀伤，和/或b)所述宿主细胞不表达HPV16E711-19抗原，未被如权利要求1-30中任一项所述的结合蛋白识别，不属于血清型HLA-A*02，和/或不表达HLA-A*02等位基因，任选地其中所述HLA-A*02等位基因为HLA-A*02:01和/或HLA-A*02:06。
74.一种如权利要求42-73中任一项所述的宿主细胞的群体。
75.一种组合物，所述组合物包含：a)根据权利要求1-30中任一项所述的结合蛋白，b)根据权利要求32或33所述的分离的核酸，c)根据权利要求34-41中任一项所述的载体，d)根据权利要求42-73中任一项所述的宿主细胞，和/或e)根据权利要求74所述的宿主细胞的群体，和载剂。
76.一种装置或试剂盒，所述装置或试剂盒包含：a)根据权利要求1-30中任一项所述的结合蛋白，b)根据权利要求32或33所述的分离的核酸，c)根据权利要求34-41中任一项所述的载体，d)根据权利要求42-73中任一项所述的宿主细胞，和/或e)根据权利要求74所述的宿主细胞的群体，所述装置或试剂盒任选地包含检测a)、d)和/或e)与pMHC复合物的结合的试剂。
77.一种产生根据权利要求1-30中任一项所述的结合蛋白的方法，其中所述方法包括以下步骤：(i)在适合允许所述结合蛋白表达的条件下培养转化宿主细胞，所述宿主细胞已经通过包含编码根据权利要求1-30中任一项所述的结合蛋白的序列的核酸转化；以及(ii)回收所述表达的结合蛋白。
78.一种产生表达根据权利要求1-30中任一项所述的结合蛋白的宿主细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤：(i)将包含编码根据权利要求1-30中任一项所述的结合蛋白的序列的核酸引入所述宿主细胞中；(ii)在适合允许所述结合蛋白表达的条件下培养所述转化宿主细胞。
79.一种检测HPV16E711-19抗原和/或表达HPV16E711-19的细胞的存在或不存在的方法，任选地其中所述细胞为过度增殖细胞，所述方法包括通过使用至少一种根据权利要求1-30中任一项所述的结合蛋白或至少一种根据权利要求42-73中任一项所述的宿主细胞来检测样品中所述HPV16E711-19抗原的存在或不存在，其中检测到所述HPV16E711-19抗原表明存在HPV16E711-19抗原和/或表达HPV16E711-19的细胞。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述至少一种结合蛋白或所述至少一种宿主细胞与在MHC分子背景中的所述HPV16E711-19肽形成复合物，并且以荧光激活细胞分选(FACS)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫化学、蛋白质印迹法或细胞内流式测定的形式检测所述复合物。
81.如权利要求79或80所述的方法，所述方法还包括从受试者获得所述样品。
82.如权利要求79-81中任一项所述的方法，所述方法还包括通过骨髓活检来确认表达HPV16E711-19的细胞。
83.一种检测受试者中以HPV16E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的程度的方法，所述方法包括：
a)使从所述受试者获得的样品与至少一种根据权利要求1-30中任一项所述的结合蛋白、至少一种根据权利要求42-73中任一项所述的宿主细胞或根据权利要求74所述的宿主细胞的群体接触；以及
b)检测反应性水平，
其中与对照水平相比反应性水平更高表明所述受试者中以HPV16E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的程度。
84.如权利要求83所述的方法，其中所述对照水平为参考数字。
85.如权利要求83所述的方法，其中所述对照水平为未患所述以HPV16E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的受试者的水平。
86.一种用于监测受试者中以HPV16E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的进展的方法，所述方法包括：
a)根据权利要求79-85中的任一项，在第一时间点检测受试者样品中所述HPV16E711-19抗原的水平或表达HPV16E711-19的所关注细胞；
b)在后续时间点重复步骤a)；以及
c)比较在步骤a)和b)中检测到的所述HPV16E711-19抗原水平或所述表达HPV16E711-19的所关注细胞以监测所述受试者中以HPV16E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的进展，其中与步骤a)相比，步骤b)中检测到的所述HPV16E711-19抗原或所述表达HPV16E711-19的所关注细胞的不存在或水平降低表明所述受试者中以HPV16E711-19抗原表达为特征的所述非恶性病症、所述过度增生性病症或所述过度增生性病症复发的进展受到抑制。
87.如权利要求86所述的方法，其中在第一时间点与所述后续时间点之间，所述受试者已进行治疗以治疗以HPV16E711-19抗原表达为特征的所述非恶性病症、所述过度增生性病症或所述过度增生性病症复发。
88.一种评估疗法对以HPV16E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的功效的方法，所述方法包括：
a)在针对以HPV16E711-19抗原表达为特征的所述非恶性病症、所述过度增生性病症或所述过度增生性病症复发向受试者提供所述疗法的至少一部分之前从所述受试者获得的第一样品中，测定从所述受试者获得的样品与至少一种根据权利要求1-30中任一项所述的结合蛋白、至少一种根据权利要求42-73中任一项所述的宿主细胞或根据权利要求74所述的宿主细胞的群体之间的反应性的存在或水平，和
b)在针对以HPV16E711-19抗原表达为特征的所述非恶性病症、所述过度增生性病症或所述过度增生性病症复发提供所述疗法的所述部分后从所述受试者获得的第二样品中，测定从所述受试者获得的样品与至少一种根据权利要求1-30中任一项所述的结合蛋白、至少一种根据权利要求42-73中任一项所述的宿主细胞或根据权利要求74所述的宿主细胞的群体之间的反应性的存在或水平，
其中相对于所述第一样品，所述第二样品中不存在反应性或反应性水平降低表明所述疗法有效治疗所述受试者的以HPV16E711-19抗原表达为特征的所述非恶性病症、所述过度增生性病症或所述过度增生性病症复发。
89.如权利要求83-89中任一项所述的方法，其中所述反应性水平由a)结合的存在和/或b)T细胞激活和/或效应功能指示。
90.如权利要求89所述的方法，其中所述T细胞激活或效应功能为T细胞增殖、杀伤或细胞因子释放。
91.如权利要求83-90中任一项所述的方法，其中所述T细胞结合、激活和/或效应功能使用荧光激活细胞分选(FACS)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫化学、蛋白质印迹法或细胞内流式测定来检测。
92.一种预防和/或治疗受试者中以HPV16E711-19抗原表达为特征的非恶性病症、过度增生性病症或过度增生性病症复发的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含表达至少一种如权利要求1-30中任一项所述的结合蛋白的细胞的组合物。
93.如权利要求92所述的方法，其中所述细胞为同种异体细胞、同基因型细胞或自体细胞。
94.如权利要求92或93所述的方法，其中所述细胞进行基因修饰。
95.如权利要求92-94中任一项所述的方法，其中所述细胞包含TCR基因、HLA基因或TCR基因与HLA基因的染色体基因敲除。
96.如权利要求92-95中任一项所述的方法，其中所述细胞包含选自以下的HLA基因的敲除：α1巨球蛋白基因、α2巨球蛋白基因、α3巨球蛋白基因、β1微球蛋白基因、β2微球蛋白基因和它们的组合。
97.如权利要求92-96中任一项所述的方法，其中所述细胞包含选自以下的TCR基因的敲除：TCRα可变区基因、TCRβ可变区基因、TCR恒定区基因和它们的组合。
98.如权利要求92-97中任一项所述的方法，其中所述细胞表达CD8α、CD8β、DN-TGFβRII和/或选择性蛋白标志物，任选地其中所述选择性蛋白标志物为DHFR，并且进一步任选地其中所述CD8α、CD8β、所述DN-TGFβRII和/或所述选择性蛋白标志物与CD34富集标签融合。
99.如权利要求98所述的方法，其中细胞使用所述CD34富集标签进行富集。
100.如权利要求923-99中任一项所述的方法，其中所述细胞为免疫细胞。
101.如权利要求92-100中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞为细胞毒性淋巴细胞、细胞毒性淋巴细胞前体细胞、细胞毒性淋巴细胞祖细胞、细胞毒性淋巴细胞干细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4/CD8双阴性T细胞、γδ(gamma delta)T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK-T细胞、树突状细胞或它们的组合。
102.如权利要求92-101中任一项所述的方法，其中所述T细胞为初始T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞或它们的组合。
103.如权利要求92-102中任一项所述的方法，其中所述T细胞为原代T细胞或T细胞系的细胞。
104.如权利要求92-103中任一项所述的方法，其中所述T细胞不表达内源性TCR或具有内源性TCR的较低表面表达。
105.如权利要求92-104中任一项所述的方法，其中所述细胞在与靶细胞接触时能够产生细胞因子或细胞毒性分子，所述靶细胞包括包含在MHC分子背景中的HPV16E711-19肽表位的肽-MHC(pMHC)复合物。
106.如权利要求92-105中任一项所述的方法，其中所述细胞因子为TNF-α、IL-2和/或IFN-γ。
107.如权利要求92-106中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性分子为穿孔素和/或颗粒酶，任选地其中所述细胞毒性分子为颗粒酶B。
108.如权利要求92-107中任一项所述的方法，其中所述细胞在与表达HPV16E711-19肽表位的靶细胞接触时能够产生更高水平的细胞因子或细胞毒性分子。
109.如权利要求108所述的方法，其中所述细胞能够产生至少高出1.05倍水平的细胞因子或细胞毒性分子。
110.如权利要求92-109中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞能够杀伤包括包含在MHC分子背景中的HPV16E711-19肽表位的肽-MHC(pMHC)复合物的靶细胞。
111.如权利要求92-110中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞在与表达HPV16E711-19肽表位的靶细胞接触时能够杀伤更高数目的靶细胞。
112.如权利要求111所述的方法，其中所述宿主细胞能够杀伤高出至少1.05倍数目的靶细胞。
113.如权利要求92-112中任一项所述的方法，其中所述HPV16E711-19免疫原性肽包含氨基酸序列YMLDLQPET。
114.如权利要求92-113中任一项所述的方法，其中所述MHC分子为MHC I类分子。
115.如权利要求92-114中任一项所述的方法，其中所述MHC分子包含MHCα链，所述链为HLA血清型HLA-A*02。
116.如权利要求92-115中任一项所述的宿主细胞，其中所述HLA等位基因选自由以下组成的组：HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:03、HLA-A*02:05、HLA-A*02:06和HLA-A*02:07等位基因。
117.如权利要求92-116中任一项所述的方法，其中所述靶细胞为所述受试者中表达所述HPV16E711-19抗原的非恶性细胞或过度增殖细胞。
118.如权利要求92-117中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含药学上可接受的载剂。
119.如权利要求92-118中任一项所述的方法，其中所述组合物在所述受试者中诱导针对表达所述HPV16E711-19抗原的所述非恶性细胞或所述过度增殖细胞的免疫反应。
120.如权利要求92-119中任一项所述的方法，其中所述组合物在所述受试者中诱导针对表达所述HPV16E711-19抗原的所述非恶性细胞或所述过度增殖细胞的抗原特异性T细胞免疫反应。
121.如权利要求92-120中任一项所述的方法，其中所述抗原特异性T细胞免疫反应包含CD4+辅助T淋巴细胞(Th)反应和CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应中的至少一者。
122.如权利要求83-121中任一项所述的方法，其中所述病症与HPV感染相关。
123.如权利要求83-122中任一项所述的方法，其中所述HPV感染为HPV16感染。
124.如权利要求83-123中任一项所述的方法，其中所述癌症为头颈癌。
125.如权利要求83-124中任一项所述的方法，其中所述癌症为头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)。
126.如权利要求83-124中任一项所述的方法，其中所述癌症为口咽癌。
127.如权利要求83-124中任一项所述的方法，其中所述癌症为宫颈癌。
128.如权利要求83-124中任一项所述的方法，其中所述癌症为肛门癌。
129.如权利要求83-124中任一项所述的方法，其中所述癌症为阴道癌。
130.如权利要求83-124中任一项所述的方法，其中所述癌症为阴门癌。
131.如权利要求83-124中任一项所述的方法，其中所述癌症为阴茎癌。
132.如权利要求92-131中任一项所述的方法，其中所述受试者正接受或先前接受过造血细胞移植(HCT)，任选地其中所述HCT包含不表达HPV16E711-19抗原，未被如权利要求1-30中任一项所述的结合蛋白识别，不属于血清型HLA-A*02，和/或不表达HLA-A*02:01等位基因的细胞。
133.如权利要求132所述的方法，其中所述HCT包括包含编码HLA组分的基因的染色体敲除、编码TCR组分的基因的染色体敲除或两者的供体造血细胞。
134.如权利要求92-133中任一项所述的方法，其中所述受试者先前曾接受过清除淋巴细胞化学疗法。
135.如权利要求134所述的方法，其中所述清除淋巴细胞化学疗法包含环磷酰胺、氟达拉滨、抗胸腺细胞球蛋白或它们的组合。
136.如权利要求92-135中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用至少一种针对所述非恶性病症、所述过度增生性病症或所述过度增生性病症复发的额外治疗。
137.如权利要求92-136中任一项所述的方法，其中所述至少一种针对所述非恶性病症、所述过度增生性病症或所述过度增生性病症复发的额外治疗与所述组合物同时或依次施用。
138.如权利要求81-137中任一项所述的方法，其中所述受试者为以HPV16E711-19表达为特征的病症的动物模型和/或哺乳动物，任选地其中所述哺乳动物为人、灵长类动物或啮齿类动物。
139.一种表达载体，所述表达载体包含与编码CD8α、CD8β、DN-TGFβRII和/或选择性蛋白标志物的核酸序列可操作地连接的启动子，任选地其中所述选择性蛋白标志物为DHFR。
140.如权利要求139所述的载体，其中编码CD8α、CD8β、所述DN-TGFβRII和/或所述选择性蛋白标志物的所述核酸序列可操作地连接到编码标签的核酸，以使得所述标签与所述CD8α、CD8β、所述DN-TGFβRII和/或所述选择性蛋白标志物融合。
141.如权利要求139或140所述的载体，其中所述编码标签的核酸处于编码CD8α、CD8β、所述DN-TGFβRII和/或所述选择性蛋白标志物的所述核酸序列上游的5’，使得所述标签与CD8α、CD8β、所述DN-TGFβRII和/或所述选择性蛋白标志物的N端融合。
142.如权利要求139-141中任一项所述的载体，其中所述标签为CD34富集标签。
143.如权利要求139-142中任一项所述的载体，其中所述载体还包含编码TCRα和/或TCRβ的核酸序列。
144.如权利要求139-143中任一项所述的载体，其中所述TCRα、TCRβ和/或所述DN-TGFβRII包含突变跨膜结构域和/或突变恒定结构域。
145.如权利要求139-144中任一项所述的载体，其中所述突变跨膜结构域和/或突变恒定结构域增强TCRα、TCRβ和/或所述DN-TGFβRII的细胞表面表达，同时减少内源性TCRα、TCRβ和/或TGFβRII的表达。
146.如权利要求139-145中任一项所述的载体，其中编码CD8α、CD8β、所述DN-TGFβRII、所述选择性蛋白标志物、所述TCRα和/或所述TCRβ的所述核酸序列与内部核糖体进入位点或编码自裂解肽的核酸序列相互连接。
147.如权利要求139-146中任一项所述的载体，其中所述自裂解肽为P2A、E2A、F2A或T2A。
148.如权利要求139-147中任一项所述的载体，其中所述载体还包含编码选自由表1中所列的多肽序列组成的组的多肽的核酸序列，或与编码选自由表1中所列的所述多肽序列组成的组的多肽的核酸具有至少约80％同源性的序列，任选地其中分离的核酸分子包含1)选自表1中所列的TRAV、TRAJ和TRAC基因的组的TRAV、TRAJ和/或TRAC基因或它们的片段和/或2)选自表1中所列的TRBV、TRBJ和TRBC基因的组的TRBV、TRBJ和/或TRBC基因或它们的片段。
149.如权利要求139-148中任一项所述的载体，其中所述载体具有或包含表3中所示的核酸序列或其片段，任选地其中所述片段编码DN-TGFβRII。
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