CN108780089B

CN108780089B - 评估细胞间的蛋白质相互作用的方法

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Publication number: CN108780089B
Application number: CN201780017351.5A
Authority: CN
Inventors: G·J·沃韦伯
Original assignee: American Holding Laboratories
Current assignee: American Holding Laboratories
Priority date: 2016-03-15
Filing date: 2017-03-15
Publication date: 2020-09-08
Anticipated expiration: 2037-03-15
Also published as: US20200041498A1; EP3403095B1; CN108780089A; JP2020073911A; EP3403095A1; CA3016914C; CA3016914A1; US10451614B2; WO2017161030A1; JP2019515252A; JP7097396B2; US20190064156A1

Abstract

提供了使用基于灵敏抗体的测定法来检测和定量测量存在于不同细胞表面上的蛋白质之间的蛋白质间相互作用的方法。直接标记对每种靶蛋白特异的抗体，或通过标记的二抗来检测所述抗体。抗体用可检测的标签标记，当靶蛋白质彼此接近时，这些标签是可释放的。还提供了使用该测定检测目标靶蛋白之间的蛋白质间相互作用来促进癌症的诊断、预后和治疗的方法。还提供了筛选影响蛋白质间相互作用的测试试剂的方法。

Description

评估细胞间的蛋白质相互作用的方法

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2016年3月15日提交的美国临时申请第62/308,587号的权益和优先权，所述临时申请通过引用整体并入本文。

背景

蛋白质控制细胞中的所有生物系统。虽然许多蛋白质独立地发挥其功能，但绝大多数蛋白质与其他蛋白质相互作用以发挥适当的生物学活性。蛋白质的功能和活性通常由与其相互作用的其他蛋白质调节。细胞对无数刺激发生反应，因此蛋白质表达可以是一个短暂的或动态的过程。另外，不同类型的细胞可表达不同类型的蛋白质(细胞类型依赖性或特异性表达)。表征蛋白质间相互作用对于理解蛋白质功能和细胞的生物学非常重要。虽然有各种方法可用于评估蛋白质间相互作用，但当相互作用的蛋白质在不同细胞上表达时，这一任务可能变得更加困难。本文描述的方法提供了用于促进细胞之间的此类蛋白质间相互作用的检测和定量的手段。

简述

在一个方面，提供了定量样品中蛋白质间相互作用的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含在其细胞表面上表达第一蛋白质的第一细胞和在其细胞表面上表达第二蛋白质的第二细胞的样品；(b)提供对第一蛋白质特异的第一抗体结合组合物，其中第一抗体结合组合物具有通过可裂解键联与其连接的分子标签；(c)提供对第二蛋白质特异的第二抗体结合组合物，其中第二结合组合物具有与其连接的裂解诱导部分；(d)使样品与第一抗体结合组合物和第二抗体结合组合物接触；(e)当第一抗体结合组合物在与第二抗体结合组合物连接的裂解诱导部分的有效靠近范围内时，诱导分子标签从第一抗体结合组合物上裂解，从而释放分子标签；和(f)定量释放的分子标签的量，作为第一蛋白质与第二蛋白质之间蛋白质间相互作用的量的量度。

在另一个方面，提供了定量样品中蛋白质间相互作用的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供包含在其细胞表面上表达第一蛋白质的第一细胞和在其细胞表面表达第二蛋白质的第二细胞的样品；(b)提供对第一蛋白质特异的第一抗体结合组合物，其中第一种抗体结合组合物具有通过可裂解键联与其连接的分子标签；(c)提供对第二蛋白质特异的第二抗体结合组合物；(d)提供与第二抗体组合物结合的第三抗体组合物，所述第三抗体组合物具有与其连接的裂解诱导部分；(e)使样品与第一抗体结合组合物、第二抗体结合组合物和第三抗体结合组合物接触；(f)当第一抗体结合组合物在与第三抗体结合组合物连接的裂解诱导部分的有效靠近范围内时，诱导分子标签从第一抗体结合组合物上裂解，从而释放分子标签；和(g)定量释放的分子标签的量，作为第一蛋白质与第二蛋白质之间蛋白质间相互作用的量的量度。

另一方面，提供了定量样品中蛋白质间相互作用的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供包含在其细胞表面上表达第一蛋白质的第一细胞和在其细胞表面上表达第二蛋白质的第二细胞的样品；(b)提供对第一蛋白质特异的第一抗体结合组合物，该第一抗体组合物具有与其连接的裂解诱导部分； (c)提供对第二蛋白质特异的第二抗体结合组合物；(d)提供与第二抗体组合物结合的第三抗体组合物，所述第三抗体结合组合物具有通过可裂解键联与其连接的分子标签；(e)使样品与第一抗体结合组合物、第二抗体结合组合物和第三抗体结合组合物接触；(f)当第三抗体结合组合物在与第一抗体结合组合物连接的裂解诱导部分的有效靠近范围内时，诱导分子标签从第三抗体结合组合物上裂解，从而释放分子标签；和(g)定量释放的分子标签的量，作为第一蛋白质与第二蛋白质之间蛋白质间相互作用的量的量度。

在另一个方面，提供了定量样品中蛋白质间相互作用的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供包含在其细胞表面上表达第一蛋白质的第一细胞和在其细胞表面上表达第二蛋白质的第二细胞的样品；(b)提供对第一蛋白质特异的第一抗体结合组合物；(c)提供对第二蛋白质特异的第二抗体结合组合物；(d)提供与第一抗体组合物结合的第三抗体组合物，所述第三抗体组合物具有通过可裂解键联与其连接的分子标签；(e)提供与第二抗体组合物结合的第四抗体组合物，所述第四抗体组合物具有与其连接的裂解诱导部分；(e)使样品与第一抗体结合组合物、第二抗体结合组合物、第三抗体结合组合物和第四抗体结合组合物接触；(f)当第三抗体结合组合物在与第四抗体结合组合物连接的裂解诱导部分的有效靠近范围内时，诱导分子标签从第三抗体结合组合物上裂解，从而释放分子标签；(g)定量释放的分子标签的量，作为第一蛋白质与第二蛋白质之间蛋白质间相互作用的量的量度。

在一些情况下，第一抗体结合组合物可结合第一蛋白质的细胞外结构域表位或细胞内结构域表位。在其他情况下，第二抗体结合组合物可结合第二蛋白质的细胞外结构域表位或细胞内结构域表位。在一些情况下，裂解诱导部分对分子标签的裂解是由光诱导的。

在一些情况下，样品可以是组织样品、培养细胞或外周血单核细胞 (PMBC)。样品可以是癌症活检物。样品可以是福尔马林固定的石蜡包埋的 (FFPE)样品。样品可以是血液样品。

在一些情况下，第一细胞可以是T细胞，第二细胞可以是肿瘤细胞。在一些情况下，第一蛋白质是PD-1，第二蛋白质是PD-L1。

在另一方面，提供了用于预测患有癌症的受试者对PD-1或PD-L1作用剂的反应性的方法，该方法包括以下步骤：(a)使用上述方法中的任何方法测量来自受试者的癌症的生物样品中PD-1-PD-L1复合物的量；(b)确定受试者样品中PD-1-PD-L1复合物的量是高于还是低于阈值水平；和(c)如果受试者样品中PD-1-PD-L1复合物的量等于或高于阈值水平，则表明受试者比在PD-1-PD-L1复合物的量低于阈值水平的情况下更有可能对PD-1 或PD-L1作用剂作出反应。

在另一个方面，提供了对测试试剂筛选破坏或促进样品中两个细胞之间的蛋白质间相互作用的形成的能力的方法，所述方法具有以下步骤：(a) 使测试细胞培养物与测试试剂接触，所述测试细胞培养物包含在其细胞表面上表达第一蛋白质的第一细胞和在其细胞表面上表达第二蛋白质的第二细胞；(b)使用上述方法中的任何方法测量第一蛋白质与第二蛋白质之间的蛋白质间相互作用的量；和(c)将步骤(b)中测量的蛋白质间相互作用的量与未和测试试剂接触的对照细胞培养物中第一蛋白质与第二蛋白质之间测量的蛋白质间相互作用的量进行比较，所述对照细胞培养物包含在其细胞表面上表达第一蛋白质的第一细胞和在其细胞表面上表达第二蛋白质的第二细胞。

在一些情况下，如果与对照细胞培养物相比，测试细胞培养物中蛋白质间相互作用的量减少，则测试试剂可能是第一蛋白质与第二蛋白质之间的蛋白质间相互作用的抑制剂。在其他情况下，如果与对照细胞培养物相比，测试细胞培养物中蛋白质间相互作用的量增加，则测试试剂可以是第一蛋白质与第二蛋白质之间蛋白质间相互作用的促进剂。

在一些情况下，第一细胞与第二细胞可以是不同的细胞类型。在一些情况下，第一细胞与第二细胞可以是不同的癌细胞系。在一些情况下，第一细胞和第二细胞之一是贴壁细胞系并且另一个是非贴壁细胞系。在一些情况下，第一细胞是Jurkat细胞，第二细胞是贴壁癌细胞。

附图简述

图1A-1E是显示根据本公开的一些方面的各种

测定形式的示意图的图。图1A和图1B描绘了福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织样品的分析，其中图1A显示光释放测定形式，图1B显示还原(例如，DTT) 测定形式。在光释放形式中，扩散的反应性单线态氧可用于响应裂解诱导剂对光(“hv”)的光诱导而裂解

报告分子(“标签”)与靶特异性抗体(“1°Ab”)之间的共价接头。在还原形式中，还原剂用于诱导

报告分子(“标签”)与第二抗体(“2°Ab”)之间的共价接头的裂解。裂解后，可进行

报告分子的毛细管电泳(CE)分离并通过电泳图进行评估。 x轴显示裂解的

报告分子从毛细管洗脱的时间，荧光强度显示在 y轴上。荧光峰MF和ML表示两种不同的内部

报告分子的洗脱。

图1C显示用于检测单个蛋白质的光释放测定形式的示意图，其中将报告分子(诸如Pro11)与裂解诱导部分连接以分隔结合不同表位的靶特异性抗体。裂解诱导部分(也称为“分子剪刀”)连接于第二一抗。示例性部分是缀合有链霉抗生物素蛋白(方形形状)的亚甲基蓝(MB)。图1D显示了另一种光释放测定形式的示意图，所述光释放测定形式用于使用与报告分子连接的第一靶特异性抗体、结合与第一靶特异性抗体所结合的表位不同的表位的第二靶异性抗体和二抗(其与第二靶特异性抗体结合并且与裂解诱导部分连接)检测单个蛋白质。图1E显示还原测定形式的示意图，所述还原测定形式用于使用靶特异性抗体和二抗检测单个蛋白质，所述二抗结合靶特异性抗体并且通过接头与报告分子连接，所述接头含有可被还原剂 (例如，DTT)裂解的二硫键。

图1F和图1G显示用于检测在第一细胞表面上表达的第一蛋白质与在第二细胞表面上表达的第二蛋白质之间的蛋白质间相互作用的光释放测定形式的示意图，其中图1F显示分别与第一和第二蛋白质的细胞外结构域结合的两种靶特异性抗体的应用，图1G显示结合第一蛋白的细胞外结构域的第一靶特异性抗体和结合第二蛋白的细胞内结构域的第二靶特异性抗体的应用。报告分子和裂解诱导部分分别与靶特异性抗体之一连接。图1H显示用于检测在第一细胞表面上表达的第一蛋白质与在第二细胞表面上表达的第二蛋白质之间的蛋白质间相互作用的另一种光释放测定形式的示意图，该测定形式使用第一靶特异性抗体(其与第一蛋白质结合并具有与其连接的报告分子)、第二靶特异性抗体(其与第二蛋白质结合)和二抗(其与第二靶特异性抗体结合并具有与其连接的裂解诱导部分)。图1I显示用于检测在第一细胞表面上表达的第一蛋白质与在第二细胞表面上表达的第二蛋白质之间的蛋白质间相互作用的另一种光释放测定形式的示意图，该测定形式使用第一靶特异性抗体(其结合第一蛋白质)、第一二抗(其与第一靶特异性抗体结合并与报告分子连接)、第二靶特异性抗体和第二二抗(其与第二靶特异性抗体结合并与裂解诱导部分连接)。

图1J显示根据本公开的一些方面在与抗体缀合前的

报告分子Pro11-NHS和Pro125-NHS的化学结构(在缀合时NHS部分丢失)。

图2A显示根据本公开的一些方面的散点图分布，其说明癌细胞系大全(CCLE，数据可在http://www.broadinstitute.org/ccle/home上获得)中的 1036个细胞系的PD-1与PD-L1的mRNA表达水平之间的关系。PD-L1 mRNA水平显示～250倍的动态范围，而PD-1mRNA水平的变化小得多，具有约5倍的动态范围。在上图中，将PD-1和PD-L1mRNA表达水平分别绘制在x轴上，而下图显示相对于彼此重新绘制的该数据。本公开中描述的实施例中使用的五种细胞系用星号表示。选择它们来代表PD-L1 mRNA表达的宽动态范围，反映整个CCLE细胞系群体。

图2B显示根据本公开的一些方面的散点图，所述散点图基于使用

测定获得的蛋白质测量结果和从癌症基因组图谱(TCGA)和 CCLE获得的mRNA测量结果比较乳腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)之间的PD-L1表达水平。使用

测定法分析的样品获自Asterand Bioscience(n＝38；NSCLC，n＝14；SCCHN，n＝ 27)。TCGA包括来自以下肿瘤样品的数据：n＝1,100；NSCLC，n＝1,018； SCCHN，n＝522。CCLE包括来自以下细胞系的数据：n＝59；NSCLC， n＝133；SCCHN，n＝32。在乳腺癌中，相较于在肺-NSC或SCCHN中，存在统计学上不同的较低水平的PD-L1蛋白(如通过

测定法测量的)(乳腺癌对比NSCLC或SCCHN，p<0.0001)。这些差异与来自肿瘤 (TCGA)(乳腺癌对比NSCLC或SCCHN，p<0.0001)和细胞系(CCLE)(乳腺癌对比SCCHN，p<0.0001，乳腺癌对比NSCLC，p<0.0002)的PD-L1 mRNA水平一致。

图3显示根据本公开内容的一些方面的抗PD-1抗体评估实验的结果，所述实验评估九种不同抗PD-1抗体在用于

测定时检测PD-1的能力。测定形式使用抗PD-1一抗和用DTT可释放标签标记的二抗，如图 1E中所示。用pH 6.2或pH 9热诱导表位修复(HIER)缓冲液进行表位修复。在用植物凝集素-L(PHA-L)刺激的500,000或25,000个Jurkat细胞上测试抗体。使用抗体检测的PD-1的量被确定为相对峰面积(RPA)(“PD1VeraTag RPA”)。

图4显示根据本公开的一些方面的通过

测定(RPA)在图3中描述的500,000或25,000个Jurkat细胞实验之间检测到的PD-1的倍数变化。

图5A-5C显示根据本公开的一些方面的抗体滴定实验的结果，所述抗体滴定实验在

测定中评估3种不同抗PD-1抗体，以检测用植物凝集素-L(PHA-L)刺激的500,000或25,000个Jurkat细胞中的PD-1。测定形式使用抗PD-1一抗和用DTT可释放标签标记的二抗，如图1E所示。随着测定中使用的抗体量增加，检测到增加量的

测定信号。X轴是抗体浓度，y轴是

测定信号(RPA；“PD-1VeraTag RPA”)。

图6A显示根据本公开的一些方面的通过

测定(RPA)在图 5A-5C中描述的500,000或25,000个Jurkat细胞实验之间检测到的PD-1 的倍数变化。X轴显示抗体浓度，y轴显示通过

测定(RPA)检测的PD-1量的倍数变化。

图6B显示根据本公开的一些方面的图，所述图说明PHA刺激的 Jurkat细胞的数量与可通过

测定检测的PD-1的量之间的关系。该测定形式在基于靠近度的光释放测定(如图1D中示意性显示的)中使用小鼠抗人PD-1单克隆抗体NAT105、山羊抗小鼠IgG1(与生物素缀合)和山羊抗人PD-1单克隆抗体AF1086(标签标记的)。随着刺激的Jurkat细胞 (x轴)的增加，观察到如通过

测定(y轴)检测到的PD-1的量增加。相反，用小鼠IgG1同种型对照替换小鼠抗人PD-1单克隆抗体NAT105导致随着刺激的Jurkat细胞数量增加而信号变化非常小，这表明检测到的信号是PD-1特异性的(而不是由于单独的抗体背景结合)。

图7是根据本公开的一些方面的示意图，所述示意图显示用于制备用于PD-1-PD-L1

测定的细胞系对照的Jurkat和贴壁细胞系的共培养程序。将贴壁细胞系培养过夜，洗涤并将PHA刺激的Jurkat细胞以相对于贴壁细胞系1或5倍过量加入到培养物中。使共培养物生长两天，然后用冷PBS洗涤3次。最后的洗涤步骤从共培养皿中除去未附着的Jurkat 细胞。然后将细胞用NBF固定过夜，然后转移至80％乙醇中并在4℃下储存。

图8A-8C显示根据本公开的一些方面的柱状图，所述柱状图将如图7 中所述与1倍或5倍量的Jurkat细胞共培养的两种不同的细胞系 (MD-MBA-231和RKO)中通过

测定测量的PD-1、PD-L1和 PD-1-PD-L1复合物的量绘制成图。将检测到的蛋白质或蛋白质复合物的量 (y轴)绘制为每个细胞系在Jurkat细胞的每个比率(x轴)下的相对峰面积 (RPA)。用于这些实验的测定形式示意性地显示在图1E(PD-1和PD-L1) 和图1I(PD-1-PD-L1复合物)中。

图8D显示根据本公开的一些方面的曲线图，所述曲线图证明了在用 Jurkat细胞共培养四种癌细胞系后，PD-L1mRNA与通过

测定测量的PD-1-PD-L1复合物的量之间的相关性。评估的癌细胞系是 MDA-MB-435、BT20、MB-231和RKO，其具有递增的PD-L1mRNA表达水平和相对相似的PD-1mRNA表达水平，如图2A(底部)所示。从CCLE 数据库获得mRNA表达水平。使用如图1H所示的

测定，应用兔抗人PD-L1抗体E1L3N、与标签缀合的山羊抗人PD-1抗体和缀合有生物素的山羊抗兔IgG测量PD-1-PD-L1复合物的量。随着PD-L1表达量的增加，使用

测定法检测的PD-1-PD-L1复合物的量也增加(具有偏差棒的黑色圆圈)。通过用兔IgG(同种型对照)替换兔抗人PDL1抗体 E1L3N进行的平行实验导致随着PD-L1表达量的增加而信号变化非常小，这反映了测定中的背景信号(灰色方块)。

图9A显示根据本公开的一些方面在12个人乳腺癌肿瘤(Asterand Bioscience)(就肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的存在而预先选择的)中通过

测定进行的PD-1蛋白水平的分析。使用的

测定形式是如图1D所示的基于靠近度的光释放测定，并使用小鼠抗人PD-1单克隆抗体NAT105、山羊抗小鼠IgG1(缀合了生物素)和缀合有标签的山羊抗人 PD-1单克隆抗体AF1086。X轴：肿瘤样品；y轴：

测定信号 (RPA)。还使用

测定法分析一些样品的PD-L1蛋白表达(如图2B 所示)。

图9B显示根据本公开的一些方面在与图9A中评估的相同的12个人乳腺癌肿瘤中通过

测定进行的PD-1-PD-L1复合物水平的分析。使用的

测定形式是如图1H所示的基于靠近度的光释放测定，并使用兔抗人PD-L1抗体E1L3N、缀合有生物素的山羊抗兔IgG和缀合有标签的山羊抗人PD-1抗体AF1086。X轴：肿瘤样品；y轴：

测定信号(RPA)。黑色条块是检测到的复合物的量，而灰色条块表示使用对照同种型抗体在平行

测定中检测到的背景量。

图10A-10C显示根据本公开的一些方面的图，所述图分别说明通过

测定测量的PD1:PD-L1复合物水平与PD-1表达、PD1:PD-L1 复合物水平与PD-L1表达以及PD-L1表达与PD-1表达的成对比较。PD-1 数据和PD-1-PD-L1复合物数据分别来自图9A和图9B所示的分析。显示了每个比较的皮尔逊相关系数和p值。

发明详述

结合附图，参考以下详细描述，所提供技术的实施方案的特征和伴随的有利方面将变得显而易见并被进一步理解。

提供了检测和定量在不同细胞上表达的蛋白质之间的蛋白质间相互作用的量的方法。具体地，所述方法可用于检测和定量细胞外受体-配体相互作用。还提供了在临床上使用此类测量进行对患者疾病状态(诸如癌症状态) 进行分类、指示患者预后或指示患者对治疗的反应性中的任一种的方法。

在一个方面，提供了定量样品中蛋白质间相互作用的方法，该方法包括：(a)提供包含在其细胞表面上表达第一蛋白质的第一细胞和在其细胞表面表达第二蛋白质的第二细胞的样品；(b)提供对第一蛋白质特异的第一抗体结合组合物，其中第一抗体结合组合物包含通过可裂解键联与其连接的分子标签；(c)提供对第二蛋白质特异的第二抗体结合组合物，其中第二结合组合物包含与其连接的裂解诱导部分；(d)使样品与第一抗体结合组合物和第二抗体结合组合物接触；(e)当第一抗体结合组合物在与第二抗体结合组合物连接的裂解诱导部分的有效靠近范围内时，诱导分子标签从第一抗体结合组合物上裂解，从而释放分子标签；和(f)定量释放的分子标签的量，作为第一蛋白质与第二蛋白质之间的蛋白质间相互作用的量的量度。这种类型的测定的实例示意性地显示于图1A、图1F和图1G中。样品可以是组织样品、培养细胞或外周血单核细胞(PMBC)。第一抗体结合组合物可与第一蛋白的细胞外结构域表位或细胞内结构域表位结合。第二抗体结合组合物可与第二蛋白的细胞外结构域表位或细胞内结构域表位结合。

在另一方面，提供了定量样品中蛋白质间相互作用的方法，该方法包括：(a)提供包含在其细胞表面上表达第一蛋白质的第一细胞和在其细胞表面表达第二蛋白质的第二细胞的样品；(b)提供对第一蛋白质特异的第一抗体结合组合物，其中第一抗体结合组合物包含通过可裂解键联与其连接的分子标签；(c)提供对第二蛋白质特异的第二抗体结合组合物；(d)提供与第二抗体组合物结合的第三抗体组合物，所述第三抗体组合物包含与其连接的裂解诱导部分；(e)使样品与第一抗体结合组合物、第二抗体结合组合物和第三抗体结合组合物接触；(f)当第一抗体结合组合物在与第三抗体结合组合物连接的裂解诱导部分的有效靠近范围内时，诱导分子标签从第一抗体结合组合物上裂解，从而释放分子标签；和(g)定量释放的分子标签的量，作为第一蛋白质与第二蛋白质之间蛋白质间相互作用的量的量度。图1H 中示意性地显示了这种类型的测定的实例。样品可以是组织样品、培养细胞或外周血单核细胞(PMBC)。第一抗体结合组合物可与第一蛋白的细胞外结构域表位或细胞内结构域表位结合。第二抗体结合组合物可与第二蛋白的细胞外结构域表位或细胞内结构域表位结合。

在另一个方面，提供了定量样品中蛋白质间相互作用的方法，该方法包括：(a)提供包含在其细胞表面上表达第一蛋白质的第一细胞和在其细胞表面上表达第二蛋白质的第二细胞的样品；(b)提供对第一蛋白质特异的第一抗体结合组合物，第一抗体组合物包含与其连接的裂解诱导部分；(c)提供对第二蛋白质特异的第二抗体结合组合物；(d)提供与第二抗体组合物结合的第三抗体组合物，所述第三抗体结合组合物包含通过可裂解键联与其连接的分子标签；(e)使样品与第一抗体结合组合物、第二抗体结合组合物和第三抗体结合组合物接触；(f)当第三抗体结合组合物在与第一抗体结合组合物连接的裂解诱导部分的有效靠近范围内时，诱导分子标签从第三抗体结合组合物上裂解，从而释放分子标签；和(g)定量释放的分子标签的量，作为第一蛋白质与第二蛋白质之间蛋白质间相互作用的量的量度。未示出这种类型的测定的示意图，但可从图1H中所示的示意图容易地设想示意图。样品可以是组织样品、培养细胞或外周血单核细胞(PMBC)。第一抗体结合组合物可与第一蛋白的细胞外结构域表位或细胞内结构域表位结合。第二抗体结合组合物可与第二蛋白的细胞外结构域表位或细胞内结构域表位结合。

在另一个方面，提供了定量样品中蛋白质间相互作用的方法，该方法包括：(a)提供包含在其细胞表面上表达第一蛋白质的第一细胞和在其细胞表面上表达第二蛋白质的第二细胞的样品；(b)提供对第一蛋白质特异的第一抗体结合组合物；(c)提供对第二蛋白质特异的第二抗体结合组合物；(d) 提供与第一抗体组合物结合的第三抗体组合物，所述第三抗体组合物包含通过可裂解键联与其连接的分子标签；(e)提供与第二抗体组合物结合的第四抗体组合物，所述第四抗体组合物包含与其连接的裂解诱导部分；(e)使样品与第一抗体结合组合物、第二抗体结合组合物、第三抗体结合组合物和第四抗体结合组合物接触；(f)当第三抗体结合组合物在与第四抗体结合组合物连接的裂解诱导部分的有效靠近范围内时，诱导分子标签从第三抗体结合组合物上裂解，从而释放分子标签；和(g)定量释放的分子标签的量，作为第一蛋白质与第二蛋白质之间蛋白质间相互作用的量的量度。图1I中示意性地显示了这种类型的测定的实例。样品可以是组织样品、培养细胞或外周血单核细胞(PMBC)。第一抗体结合组合物可与第一蛋白的细胞外结构域表位或细胞内结构域表位结合。第二抗体结合组合物可与第二蛋白的细胞外结构域表位或细胞内结构域表位结合。

在一个方面，所提供的方法可用于检测在免疫细胞(诸如T细胞)表面上表达的蛋白质与在癌细胞表面上表达的蛋白质之间的相互作用。T细胞与抗原呈递细胞(APC)之间存在各种配体-受体相互作用，其调节T细胞对抗原的反应。免疫检查点分子可以是刺激性的(调高信号)或抑制性的(调低信号)。免疫细胞上的抑制性检查点分子在与其配体结合时，将传递抑制信号，维持自身耐受性，并调节外周组织中免疫反应的持续时间和幅度，以使组织病理学最小化。癌细胞可通过抑制T细胞信号而使用这些途径来保护它们自己免受免疫系统的侵害。示例性的免疫检查点分子列于表1中。通常，检查点分子在T细胞上表达，而配体在抗原呈递细胞诸如癌细胞上表达。对此的一个例外是CD40在癌细胞上表达，而CD40L在T细胞上表达(在下表1中用*标记的例外)。也可存在其他例外情况。检测样品特别是肿瘤样品中的此类蛋白质间相互作用可以反映样品中免疫细胞的存在程度。当样品是肿瘤样品时，蛋白质间相互作用的量代表样品中活化的免疫检查点复合物的量。

表1.免疫检查点分子

抑制性分子	配体
		PD-1	PD-L1或PD-L2
CTLA4	CD80或CD86
		BTLA4	HVEM
TIM3	GAL9
		刺激性分子	配体
CD27	CD70
		CD28	CD80或CD86
CD40*	CD40L
		CD137	CD137L
OX40	OX40L
		ICOS	B7RP1
GITR	GITRL

在一些情况下，第一蛋白质可以是受体，第二蛋白质可以是受体的配体。在一些情况下，第一细胞可以是T细胞，第二细胞可以是抗原呈递细胞。在一个实例中，抗原呈递细胞可以是肿瘤细胞。在另一个实例中，第一蛋白质可以是PD-1(本文中也称为PD1)，第二蛋白质可以是PD-L1(本文也称为PDL1)。在另一个实例中，第一蛋白质可以是CD28或CTLA4，第二蛋白质可以是CD80或CD86。在另一个实例中，第一蛋白质可以是 BTLA4，第二蛋白质可以是HVEM。在另一个实例中，第一蛋白质可以是 TIM3，第二蛋白质可以是GAL9。在另一个实例中，第一蛋白质可以是 CD27，第二蛋白质可以是CD70。在另一个实例中，第一蛋白质可以是CD40L，第二蛋白质可以是CD40。在另一个实例中，第一蛋白质可以是 CD137，第二蛋白质可以是CD137L。在另一个实例中，第一蛋白质可以是OX40，第二蛋白质可以是OX40L。在另一个实例中，第一蛋白质可以是ICOS，第二蛋白质可以是B7RP1。在另一个实例中，第一蛋白质可以是GITR，第二蛋白质可以是CITRL。在一些情况下，第一细胞可以是T 细胞，第一蛋白质可以是PD-1、CTLA4、BTLA4、TIM3、CD27、CD28、 CD40L、CD137、OX40、ICOS或GITR。在一些情况下，第二细胞可以是肿瘤细胞，第二蛋白质可以是PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、HVEM、 GAL9、CD70、CD40、CD137L、OX40L、B7RP1或GITRL。

在一些情况下，除了定量两种蛋白质之间的复合物的量之外，还可以测定第一蛋白质、第二蛋白质或两者的量。例如，这可以是用于确定样品中是否存在第一蛋白质和/或第二蛋白质的阈值测量值。在一些情况下，可以执行该步骤以确定所述蛋白质中的一种蛋白质是否比另一种蛋白质更受限制，并且在一些情况下，确定受限制的程度。在一些情况下，当样品是肿瘤样品并且第一细胞是T细胞时，该方法包括定量第一蛋白质的量以确定肿瘤中T细胞浸润的量。如果存在大量第一蛋白质，则可表明存在大量浸润肿瘤的活化T细胞。如果存在少量第一蛋白质，则可表明肿瘤中存在很少的活化T细胞。在一些情况下，在肿瘤中存在大量活化T细胞的情况下，患者对针对第一蛋白质或第二蛋白质的疗法的反应性(例如，就患者对此类疗法的反应速度而言)可能增加。

测定的特点

在某些实施方案中，样品中蛋白质复合物的量通过以下方式来确定：使样品与具有通过可裂解键联连接的分子标签的抗体结合组合物和具有与其连接的裂解诱导部分的抗体结合组合物接触，并且检测被释放的分子标签的量。图1A、1C、1F、1G、1H和1I提供了示例性

测定形式的示意图。在一个实例中，如图1A所示，固定样品(组织切片、培养细胞)，然后使其与具有裂解诱导剂的第一抗体结合组合物和与可检测部分诸如分子标签(例如，

报告分子)连接的第二抗体结合组合物结合。可将第一抗体与生物素缀合，然后生物素与裂解诱导部分例如链霉抗生物素蛋白功能化的敏化剂染料(亚甲基蓝)结合。将第二抗体结合组合物与

报告分子或其他合适的可检测部分缀合。可进行裂解诱导剂的光诱导以引起单线态氧的释放，其诱导可裂解键联的裂解和

报告分子向测定溶液中的释放。然后收集溶液并通过毛细管电泳分析。该测定形式的示例性示意图显示在图1C、1F、1G、1H和1I中。图1D、1G和1I 具有不同的抗体结合组合物配对，但以图1A所述的相同示例性

测定化学法显示。

在一些情况下，第一抗体结合组合物可以特异性结合第一蛋白质，第二抗体结合组合物可以特异性结合第二蛋白质，例如，如图1F和图1G中所示。该测定形式允许检测在第一蛋白质与第二蛋白质之间形成的复合物，因为当与第一抗体结合组合物连接的分子标签在与第二抗体连接的裂解诱导部分的有效靠近范围内时，分子标签可被裂解。在一些情况下，可将分子标签连接于与第一抗体组合物结合的第三抗体组合物，而不是连接于第一抗体，如例如图1H中所示。在其他情况下，可将裂解诱导部分连接于与第二抗体组合物结合的第三抗体组合物，而不是连接于第二抗体。在其他情况下，可将分子标签连接于与第一抗体组合物结合的第三抗体组合物，而不是连接于第一抗体上，并且可将分子标签连接于与第二抗体组合物结合的第四抗体组合物，而不是连接于第二抗体，如例如图1I中所示。

在某些情况下，可使用

测定来检测样品中蛋白质的总量。在此类测定中，第一抗体结合组合物和第二抗体结合组合物均可特异性结合同一蛋白质靶标但结合不同的表位。在某些实施方案中，其上连接有分子标签的第一抗体结合组合物和其上连接有裂解诱导部分的第二抗体结合组合物结合同一靶蛋白但不结合靶蛋白的相同表位。此类测定形式示于例如图1C中。在另一种形式中，其上连接有分子标签的第一抗体结合组合物结合第一表位，第二抗体结合组合物结合与第一表位不同的第二表位，其上连接有裂解诱导部分的第三抗体组合物结合第二抗体结合组合物。此类测定形式示于例如图1D中。在另一种形式中，第一抗体结合组合物结合第一表位，其上连接有分子标签的第二抗体结合组合物结合第一抗体结合组合物，其上连接有裂解诱导部分的第三抗体组合物结合与第一表位不同的第二表位。在这些形式中的每一种中，当分子标签在裂解诱导部分的有效靠近范围内时，该裂解诱导部分可以裂解可裂解的接头，使得分子标签被释放。在某些情况下，这种类型的测定形式测量样品中靶蛋白的总量。使用类似测定形式检测总HER2的实例描述于共同拥有的美国专利申请公开第2009/0191559号(其通过引用整体并入本文)中。还可使用如关于测量生物标志物诸如HER1、HER3、cMET等的总量所述的类似测定形式，如美国专利第7,648,828号和第8,349,574号中所述。

在一个替代实施方案中，可使用图1E中所示的还原形式测定来检测蛋白质的总量，其中第一抗体结合组合物与靶蛋白特异性结合，第二抗体组合物与第一抗体结合组合物结合，第二抗体结合组合物包含通过可裂解键联诸如二硫键(-SS-)与其缀合的可检测部分，所述键联可通过还原剂诸如 DTT裂解。

“抗体结合组合物”在本文中用于指分子或分子复合物，其包含一种或多种抗体或结合分子的其抗原结合片段，并从此类抗体或抗体结合片段获得其结合特异性。抗体结合组合物包括但不限于(i)抗体对，其中第一抗体特异性结合靶分子，并且第二抗体特异性结合第一抗体的恒定区；特异性结合靶分子的生物素化的抗体和链霉抗生物素蛋白，所述蛋白通过生物素部分用分子标签或光敏剂等部分衍生而来；(ii)对靶分子特异并与聚合物诸如葡聚糖缀合的抗体，所述抗体又用诸如分子标签或光敏剂等的部分衍生 (直接通过共价键或间接通过链霉抗生物素蛋白-生物素键联)；(iii)对靶分子特异并与珠粒或微珠或其他固相载体缀合的抗体，所述抗体又用诸如分子标签或光敏剂的部分或含有后者的聚合物进行直接或间接衍生。

“裂解诱导部分”和“裂解剂”在本文中可互换使用，是指产生能够裂解 (例如通过氧化)可裂解键联的活性物质的基团。优选地，活性物质是表现出短寿命活性(使得其裂解诱导效应仅在其产生的位置附近)的化学物质。

如本文中所用，“分子标签”或“标签”或“报告分子”或“可检测部分”是指可基于待分离的分子之间的一种或多种物理、化学或光学差异(包括但不限于电泳迁移率、分子量、形状、溶解度、pKa、疏水性、电荷、荷/质比、极性等)与其他分子相区分的分子。在一个方面，多个或一组分子标签差异在于电泳迁移率和光学检测特性，并且可通过电泳分离。在另一个方面，多个或一组分子标签可相异在于分子量、形状、溶解度、pKa、疏水性、电荷、极性，并且可通过正相或反相HPLC、离子交换HPLC、毛细管电色谱、质谱、气相色谱或类似技术来分离。如本文中所述，

报告分子是一种分子标签。

“光敏剂”是指光吸收分子，当被光激活时，其将分子氧转化为单线态氧。如本文中所用，“二硫苏糖醇”或“DTT”可用作光敏剂的替代物，以通过还原裂解

报告分子。

术语“样品”、“组织样品”、“患者样品”、“患者细胞或组织样品”或“样本”各自是指从受试者或患者的组织获得的相似细胞的集合。组织样品的来源可以是来自新鲜、冷冻和/或保存的器官或组织样品或活检物或抽吸物的固体组织；血液或任何血液成分；体液诸如脑脊髓液、羊水、腹膜液或组织间液；或来自妊娠或受试者发育的任何时间的细胞。组织样品可含有在自然界中不与组织天然混合的化合物，诸如防腐剂、抗凝血剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素等。可以以常规方式固定(例如，福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE))细胞。

和

测定”在本文中可互换使用，是指单个免疫测定和多重免疫测定(单标记和多标记形式)，以及用于进行和利用此类测定的材料、方法和技术，包括但不限于与这些测定相关的试剂、分析程序和软件。

测定中的标记是可检测的部分，称为

报告分子。在本申请以及美国专利第7,648,828号、第8,470,542号和第 8,349,574号以及美国专利申请第2012-0295259号和第2016-0041171号中公开了此类测定法，所有这些专利或专利申请均通过引用整体并入本文。

如本文中所用，

报告分子”或“vTag”是指连接于

测定中使用的抗体的一类分子标签(如上所定义的)。示例性

报告分子是Pro11和Pro125，其是如图1J中所示的。其他

分子描述于美国专利第6,627,400号、第7,105,308号、第7,255,999号、第9,110,975 号、第7,402,397号和第8,357,277号(所述每个专利为了所有目的整体并入本文)中。

通过使用可释放的分子标签测量蛋白质间相互作用提供了许多有利方面，包括(1)从测定混合物中分离释放的分子标签提供了大大减少的背景和灵敏度的显著增加；和(2)使用专门设计用于使分离和检测容易进行的分子标签提供了方便的多路复用能力，使得可在同一测定中容易地同时测量多种受体复合物组分。使用此类标签的测定可具有多种形式，并公开于下列参考文献中：美国专利第7,105,308号和第6,627,400号；公开的美国专利申请第002/0013126号、第2003/0170915号、第2002/0146726号、第 2009/0191559号、第2010/0143927号、第2010/0233732号和第2010/0210034 号，其各自通过引用整体并入本文。例如，可以采用多种分离技术，所述分离技术可以基于被分离的分子之间的一种或多种物理、化学或光学差异 (包括电泳迁移率、分子量、形状、溶解度、pKa、疏水性、电荷、荷/质比或极性)来区分分子。在一个方面，多个或一组分子标签相异在于电泳迁移率和光学检测特性，并且可通过电泳分离。在另一个方面，多个或一组分子标签可相异在于分子量、形状、溶解度、pKa、疏水性、电荷、极性，并且可通过正相或反相HPLC、离子交换HPLC、毛细管电色谱、质谱或气相色谱分离。

提供了成组的分子标签，它们可在从结合化合物释放后通过分离技术分离至不同的条带或峰中。此类峰的鉴定和定量提供了蛋白质、蛋白质复合物和翻译后修饰的蛋白质的存在和/或量的量度或模式。一组内的分子标签可具有化学多样性；然而，为方便起见，成组的分子标签通常是化学相关的。例如，它们可以全部是肽，或者它们可由相同的基本结构单元或单体的不同组合组成，或者它们以使用具有不同取代基团以赋予不同分离特征的相同基本支架合成。多个分子标签的数量可以根据若干因素而变化，包括所采用的分离模式、用于检测的分子标签上使用的标记物、结合部分的灵敏度和裂解可裂解键联的效率。

直接对组织样品进行的测量可以通过在细胞或组织靶标上包括测量来标准化，所述细胞或组织靶标代表样品中的总细胞数和/或样品中特定细胞亚型的数量。由于患者样品，特别是肿瘤样品(其可包含很大比例的正常细胞)中的细胞和组织异质性，因此额外的测量可能是优选的，或甚至是必需的。

在一些情况下，组织样品包括但不限于乳腺、前列腺、卵巢、结肠、肺、子宫内膜、胃、唾液腺、喉、咽、舌或胰腺组织样品。组织样品可通过多种方法获得，包括手术切除、抽吸或活组织检查。组织可以是新鲜的或冷冻的。在一个实施方案中，对已经固定并包埋在石蜡中的组织样品进行本发明的测定，并进行脱蜡步骤。可通过常规方法固定(即保存)组织样品。参见，例如，Lee G.Luna,HT(ASCP)编辑，1960,Manual of HistologicalStaining Method of the Armed Forces Institute of Pathology第3版，The BlakstonDivision McGraw-Hill Book Company,New York；Ulreka V. Mikel,Ed.,1994,The ArmedForces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology andPathology,Armed Forces Institute of Pathology,American Registry of Pathology,Washington,D.C.。本领域技术人员将理解，固定剂的选择由对组织进行组织学染色或以其他方式分析组织的目的决定。本领域技术人员还将理解，固定的时间长度取决于组织样品的大小和所用固定剂。

通常，首先固定组织样品，然后通过一系列浓度递升的醇脱水，用石蜡或其他切片介质进行浸透和包埋，以使得可对组织样品进行切片。或者，可以将组织进行切片并固定所获得的切片。例如，可根据上文提供的参考文献中描述的常规技术，通过常规方法将组织样品包埋并在石蜡中进行加工。可使用的石蜡的实例包括但不限于Paraplast、Broloid和Tissuemay。一旦组织样品被包埋，可根据常规技术通过切片机对样品进行切片。切片的厚度可以为约3微米至约12微米，优选厚度为约5微米至约10微米。在一个方面，切片可具有约10mm²至约1cm²的面积。切片后，可通过几种标准方法将切片附着于载玻片上。载玻片粘合剂的实例包括但不限于甲硅烷、明胶和多聚-L-赖氨酸。可将石蜡包埋的切片附着于带正电荷的载玻片和/或涂有聚-L-赖氨酸的载玻片上。

如果石蜡已被用作包埋材料，则在检测生物标志物之前，通常将组织切片脱石蜡并再水化至水。组织切片可通过几种常规标准方法脱石蜡。例如，可根据上面提供的参考文献中描述的常规技术，使用二甲苯和一系列梯度下降的醇。或者，可使用市售的脱蜡非有机试剂诸如

(CMS, Houston,Tex.)。

如上所述，可提供含有多种不同结合化合物的混合物，其中每种不同的结合化合物具有通过可裂解键联连接的一个或多个分子标签。结合化合物、可裂解键联和分子标签的性质可以广泛变化。在一个方面，抗体结合组合物可由下式表示：

B-(L-E)_K

其中B是结合部分(抗体)；L是可裂解键联，E是分子标签。在均相测定中，可裂解键联L可以是氧化-不稳定键，更优选地，其是可被单线态氧裂解的键联，例如如图1A所示的。或者，其可以是对通过还原(例如通过DTT)裂解敏感的键联，如例如图1B所示的。部分“-(L-E)k”表示单个结合化合物可具有通过可裂解键联连接的多个分子标签。在一个方面， k是大于或等于1的整数，但在其他实施方案中，k可以大于数百，例如 100至500，或k大于数百至多达数千，例如500至5000。通常，多种不同类型的结合化合物中的每一种都具有不同的分子标签E。通过常规化学方法将可裂解键联诸如氧化-不稳定性键联和分子标签E与B连接。

优选地，B是特异性结合靶标的抗体结合组合物。抗体组合物易于由多种市售抗体(单克隆或多克隆)形成。在某些实施方案中，B具有可裂解键联L，其被裂解探针产生的裂解剂裂解，所述裂解探针在短距离内起作用，使得只有紧邻裂解探针的可裂解键联才可被裂解。

可裂解键联L实际上可以是可在不降解结构或影响释放的分子标签E 的检测特性的条件下裂解的任何化学连接基团。通常，必须通过对反应混合物产生物理或化学变化来激活此类试剂，使得所述试剂产生扩散到可裂解键联以实现裂解的短寿命活性物质。在均相形式中，优选将裂解剂连接至结合部分诸如抗体，所述抗体在活化之前将裂解剂靶向具有可释放的分子标签的结合化合物附近的特定位点。在此类实施方案中，裂解剂在本文中称为“裂解诱导部分”。

可裂解键联可以不仅包括对与局部作用的反应性物质(诸如过氧化氢、单线态氧等)反应不稳定的键联，而且还包括对在整个反应混合物中起作用的试剂不稳定的键联，诸如对碱不稳定的键联、光可裂解键联、可通过还原裂解的键联、可通过氧化裂解的键联、对酸不稳定的键联和可被特定蛋白酶裂解的肽键。描述许多此类键联的参考文献包括Greene和Wuts,1991, Protective Groups in Organic Synthesis,Second Edition,JohnWiley&Sons, New York；Hermanson,1996,Bioconjugate Techniques,Academic Press,New York；以及美国专利第5,565,324号。

在一个方面，市售的可裂解试剂系统可用于本发明。例如，可使用可从提供商诸如Pierce Chemical Company(Rockford,IL)获得的异功能型试剂诸如N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基氧基羰基-

-甲基-

-(2-吡啶二硫基)甲苯(SMPT)等在抗体结合组合物与分子标签之间引入二硫键。通过用还原剂诸如二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、2-巯基乙醇或硼氢化钠处理，可以破坏由此类键键引入的二硫键。实现二硫键裂解的还原剂的典型浓度范围为约1mM至100mM。可使用同双功能NHS酯交联剂、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)(可从Pierce获得) 在抗体结合组合物与分子标签之间引入氧化不稳定性键联，所述酒石酸二琥珀酰亚胺酯含有易于用高碘酸钠(例如，15mM高碘酸盐在生理pH下持续4小时)裂解的中心顺式二醇。含有酯化间隔子组分的键联可用强亲核试剂诸如羟胺例如0.1N羟胺，pH 8.5在37℃下裂解3-6小时来裂解。此类间隔子可通过同双功能型交联剂诸如可从Pierce(Rockford,IL)获得的乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)引入。可对碱不稳定的键联与砜基团一起引入。可用于在可裂解键联中引入砜基团的同双功能型交联剂包括双 [2-(琥珀酰亚胺基氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)和4,4-二氟-3,3-二硝基苯基-砜(DFDNPS)。用于裂解的示例性碱性条件包括0.1M磷酸钠，通过添加含有6M尿素、0.1％SDS和2mM DTT的Tris碱调节至pH 11.6，以及在37℃下孵育2小时。可光学裂解的键联还包括美国专利第5,986,076 号中公开的那些。

当L对氧化不稳定时，L可以是硫醚或其硒类似物；或含有碳-碳双键的烯烃，其中双键裂解成氧代基团，释放分子标签E。示例性的对氧化不稳定的键联公开于美国专利第6,627,400号和第5,622,929号中以及公开的美国专利申请中公开第2002/0013126号和第2003/0170915号中，其每一篇在此通过引用整体并入本文。

当通过气相色谱或质谱法进行多个分子标签的分离时，本发明中的分子标签E可以包含如以下参考文献中所述的电泳标签：参见，例如，Zhang 等，2002,BioconjugateChem.13:1002-1012；Giese,1983,Anal.Chem. 2:165-168；和美国专利第4,650,750号、第5,360,819号、第5,516,931号和第5,602,273号，其每一篇通过引用整体并入本文。

分子标签E优选是水溶性有机化合物，其相对于活性物质，特别是单线态氧是稳定的，并且包括检测或报告基团。另外，E的大小和结构可以差异很大。在一个方面，E的分子量为约50至约2500道尔顿，更优选约 50至约1500道尔顿。E可包含用于产生电化学、荧光或生色信号的检测基团。在采用质量检测的实施方案中，E可以不具有用于检测目的的分开部分。优选地，检测基团产生荧光信号。示例性分子标签Pro11和Pro125 示于图1C和图1J中。

在一个方面，分子标签E是(M，D)，其中M是迁移率修饰部分 (mobility-modifyingmoiety)，D是检测部分。符号“(M，D)”用于表示M 和D部分的排序可以使得任一部分可以与可裂解键联L相邻。即，“B-L-(M, D)”表示具有两种形式：“B-L-M-D”或“B-L-D-M”中任一种的结合化合物。

检测部分D可以是荧光标记或染料、生色标记或染料或电化学标记。优选地，D是荧光染料。用于本发明的示例性荧光染料包括水溶性罗丹明染料、荧光素、4,7-二氯荧光素、苯并呫染料和能量转移染料，如以下参考文献中所公开的：Handbook of MolecularProbes and Research Reagents，第8版(2002),Molecular Probes,Eugene,OR；美国专利第6,191,278号、第6,372,907号、第6,096,723号、第5,945,526号、第4,997,928号和第 4,318,846号；和Lee等，1997,Nucleic Acids Research 25:2816-2822。优选地，D是荧光素或荧光素衍生物。

裂解诱导部分或裂解剂是产生能够裂解(优选通过氧化)可裂解键联的活性物质的基团。优选地，活性物质是表现出短寿命活性(使得其裂解诱导效应仅存在于其产生位点附近)的化学物质。活性物质本身就是短寿命的，使得其不会在超出其产生的附近产生明显的背景，或者采用高效清除活性物质的清除剂，使得其不能与可裂解键联在超过离其产生位点短距离处反应。说明性的活性物质包括单线态氧、过氧化氢、NADH和羟基基基团、苯氧基基团、超氧化物等。引起氧化的活性物质的示例性猝灭剂包括多烯、类胡萝卜素、维生素E、维生素C、酪氨酸、组氨酸和谷胱甘肽的氨基酸-吡咯N-缀合物。参见，例如，Beutner等，2000,Meth.Enzymol. 319:226-241。

设计使用裂解诱导部分和可裂解键联的测定的一个考虑因素是，当与蛋白质-蛋白质复合物结合时，它们不会彼此远离而使得由裂解诱导部分产生的活性物质不能高效地裂解可裂解键联。在一个方面，可裂解键联优选在结合的裂解诱导部分的约1000nm内，优选在约20-200nm内。更优选地，对于产生单线态氧的光敏剂裂解诱导部分，可裂解键联在受体复合物中的光敏剂的约20-100nm内。裂解诱导部分可在其中有效裂解可裂解键联(即，裂解足够的分子标签以产生可检测信号)的范围在本文中称为其“有效靠近度”。本领域普通技术人员将认识到特定敏化剂的有效靠近可取决于特定测定设计的细节，并可通过常规实验来确定或修改。

敏化剂是可被诱导来产生反应性中间体或物质(通常是单线态氧)的化合物。优选地，根据本发明使用的敏化剂是光敏剂。包括在本发明范围内的其他敏化剂是在通过热、光、电离辐射或化学活化激发时将释放单线态氧分子的化合物。此类化合物中最著名的成员包括内过氧化物，诸如1,4- 双羧乙基-1,4-萘内过氧化物、9,10-二苯基蒽-9,10-内过氧化物和5,6,11,12- 四苯基萘5,12-内过氧化物。加热这些化合物或所述化合物对光的直接吸收会释放出单线态氧。Di Mascio等，1994,FEBS Lett.355:287；和Kanofsky,1983,J.Biol.Chem.258:5991-5993；Pierlot等，2000,Meth.Enzymol. 319:3-20公开了另外的敏化剂。

光敏剂可以通过共价或非共价键直接或间接连接到类别特异性试剂的结合剂上。构建此类组合物的指导，特别是作为结合剂的抗体，可在例如光动力疗法、免疫诊断学等领域中的文献中获得。示例性指导可见于 Ullman等，1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91,5426-5430；Strong等，1994, Ann.New York Acad.Sci.745:297-320；Yarmush等，1993,Crit.Rev. Therapeutic Drug Carrier Syst.10:197-252和美国专利第5,340,716号、第5,516,636号、第5,709,994号和第6,251,581号中。

在一些情况下，通过光诱导来诱导裂解诱导部分对分子标签的裂解。有多种光源可用来光活化光敏剂以产生单线态氧。可使用多色和单色光源，只要光源足够强以在实际持续时间内产生足够的单线态氧即可。照射的长度取决于光敏剂的性质、可裂解键联的性质、辐射源的功率及其与样品的距离。通常，照射时间可以大于约1微秒至约10分钟，通常在约1毫秒至约60秒的范围内。照射的强度和长度应足以激发至少约0.1％的光敏剂分子，通常至少约30％的光敏剂分子，优选基本上所有的光敏剂分子。示例性光源包括激光器，诸如例如氦-氖激光器、氩激光器、YAG激光器、He/Cd 激光器和红宝石激光器；光电二极管；汞、钠和氙气灯；白炽灯诸如钨和钨/卤素灯以及闪光灯。适用于本发明方法的示例性光活化装置公开在国际专利公开号WO 03/051669中。在此类实施方案中，光活化装置是安装在壳体中的发光二极管(LED)阵列，其允许同时照射96孔板中的所有孔。

可用于本发明的光敏剂的实例是具有上述性质的那些和以下专利或文献中公开的那些：美国专利第5,536,834号、第5,763,602号、第5,565,552 号、第5,709,994号、第5,340,716号、第5,516,636号、第6,251,581号和第6,001,673号、公开的欧洲专利申请第0484027号；Martin等，1990, Methods Enzymol.186:635-645；和Yarmush等，1993,Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Syst.10:197-252。与敏化剂一样，在某些实施方案中，光敏剂可通过共价或非共价连接到载体的表面或掺入载体的主体内而与固相载体结合。通常，光敏剂以获得必需量的单线态氧所必需的量与载体结合。通常，光敏剂的量根据常规方法凭经验确定。

在进行所述方法时，制备测定组分的组合，包括待测样品和抗体结合化合物。通常，测定组分可以以任何顺序组合。然而，在某些应用中，添加顺序可能是相关的。例如，人们可能希望定量监测竞争性结合。或者可能希望监测组装的复合物的稳定性。在此类应用中，反应可以分阶段组装。

通常可凭经验确定每种试剂的量。测定中使用的样品量将通过存在的目标复合物的预测数量以及用于监测测定的信号的分离和检测手段来确定。通常，可以相对于样品中靶分子的预期量以摩尔过量(通常以至少约1.5 倍的摩尔过量，更理想地约约10倍过量或者更多过量)提供结合化合物和裂解探针的量。在具体应用中，使用的浓度可以更高或更低，这取决于结合剂的亲和力和单个细胞上存在的预期靶分子数。当确定化合物对细胞表面上蛋白质复合物形成的效果时，可以在添加探针之前、同时或之后将化合物加入细胞中，这取决于要监测的效果。

可以将测定混合物组合并在提供探针与细胞表面分子结合的条件下 (通常在含水介质中，通常在通过浓度在约10至200mM的范围内的缓冲液维持的生理pH下(与细胞培养的pH相当))孵育。可使用常规缓冲剂，以及必要时其它常规添加剂诸如盐、生长培养基、稳定剂等。通常使用生理和恒定温度。孵育温度通常为约4℃至70℃，通常为约15℃至45℃，更通常为约25℃至37℃。

在组装测定混合物并孵育以使探针与细胞表面分子结合后，可处理混合物以活化裂解剂来从在裂解剂的有效靠近内的结合化合物裂解标签，将相应的标签从细胞表面释放到溶液中。该处理的性质取决于裂解剂的作用机理。例如，当光敏剂被用作裂解剂时，裂解的激活可包括在适合于所用的特定敏化剂的光波长下照射混合物。

在裂解之后，然后可分析样品以确定已经释放的标签的身份。在采用使用多种结合化合物的测定的情况下，释放的标签的分离通常先于它们的检测。在设计用于测定的标签的过程中确定用于分离和检测的方法。优选的分离模式采用电泳，其中基于其电泳迁移率的已知差异来分离各种标签。

如上所述，在一些实施方案中，如果测定反应条件可能干扰所用的分离技术，则可能需要在裂解和分离分子标签之前除去或交换测定反应缓冲液。例如，测定条件可包括在基于电泳迁移率分离分子标签时降低分离性能的盐浓度(诸如，特异性结合所需的)。因此，可以通过过滤、抽吸、稀释或其它方式例如在裂解分子标签之前除去这种高盐缓冲液，并用适于电泳分离的另一种缓冲液进行替换。

测量PD-1-PD-L1相互作用

可使用本文提供的方法检测的示例性蛋白质间相互作用是表达程序化死亡1(“PD-1”)的T细胞和表达PD配体1(“PD-L1”)的癌细胞之间的相互作用。如上所述，在T细胞与抗原呈递细胞如癌细胞之间存在几种其他类似的蛋白质-蛋白质复合物。本节的讨论重点关注作为实例的PD-1-PD-L1 相互作用。应当理解，可以类似地检测和测量其他这样的复合物并将其用于类似目的。

在表达PD-1的T细胞与表达PD-L1的肿瘤细胞之间发生PD-1-PD-L1 相互作用。表达PD-L1的肿瘤与表达PD-1的T细胞之间的相互作用降低了对肿瘤的免疫反应。(总体参见Chen,D.S.和Mellman,I.,Oncology meets immunology:the cancer-immunitycycle.Immunity 39:1-10(2013)；Keir, M.E.等，PD-1and its ligands in toleranceand immunity.Ann.Rev. Immunol.26:677-704(2008)；Teng,MWL等，Classifying cancersbased on T-cell infiltration and PD-L1.Cancer Res.75:2139-2145(2015).)。抑制PD-1 与PD-L1之间的相互作用可恢复T细胞抗肿瘤活性。检查点抑制剂，诸如结合PD-1或PD-L1并抑制其相互作用的治疗性抗体正在临床开发中。免疫组织化学(IHC)已被用作PD-1或PD-L1的生物标志物测定。然而，到目前为止，IHC状态并不一定表明反应性。例如，并非所有IHC阳性患者都对抗PD-1或抗PD-L1疗法有反应，而一些IHC阴性患者对所述疗法有反应。

使用IHC作为PD-1和PD-L1的生物标志物测定存在若干缺点。有多种IHC方法和试剂未标准化，并且没有被鉴定为对于这些蛋白质的表达为 “阳性”的标准表达水平。另外，由于视觉评分系统的原因，IHC定量是主观的。缺乏标准IHC测定可能至少部分地导致IHC阴性患者中观察到的临床反应。

在本公开的一个方面，PD-1与PD-L1之间的蛋白质-蛋白质复合物相互作用的准确定量可以是比单独的或一起的PD-1或PD-L1更好的预测患者可能对抗PD-1或抗PD-L1疗法有反应的预测者。因此，提供了用于检测PD-1与PD-L1之间的相互作用并确定患者是否可对抗PD-1或抗PD-L1 疗法有反应的方法。

如本文所述，可使用具有本公开中描述的形式的

测定法检测在不同细胞上表达的PD-1与PD-L1的相互作用。具体地，基于细胞间(在不同细胞上的蛋白质之间)发生的

报告分子的靠近依赖性释放来检测复合物。使用这种类型的测定法检测信号取决于两个细胞即T细胞与肿瘤细胞的紧密靠近度。本公开中描述的PD-1-PD-L1

测定方法产生在宽动态范围内的PD-1-PD-L1复合物量的直接定量和连续测量。

例如，PD-1-PD-L1复合物形成可使用靠近依赖性光释放

测定形式来检测，其中

报告分子连接于抗PD-1抗体并与生物素化抗PD-L1抗体配对。在另一个实例中，PD-1-PD-L1复合物形成可使用靠近依赖性光释放

测定形式来检测，其中

报告分子连接于抗PD-L1抗体并与生物素化的抗PD-1抗体配对。图1F和图1G中所示的示意图代表这两种测定形式。在另一个实例中，PD-1-PD-L1复合物形成可使用靠近依赖性光释放

测定形式来检测，其中

报告分子连接于结合抗PD-L1的二抗并与生物素化的抗PD-1抗体配对。在另一个实例中，PD-1-PD-L1复合物形成可使用靠近依赖性光释放

测定形式来检测，其中

报告分子连接于结合抗PD-1抗体的二抗，并且与生物素化的抗PD-L1抗体配对。图1H中所示的示意图代表这两种测定形式。在另一个实例中，PD-1-PD-L1复合物形成可使用靠近依赖性光释放

测定形式来检测，其中

报告分子连接于结合抗 PD-L1抗体的第一二抗，并与结合抗PD-1抗体的生物素化二抗配对。在另一个实例中，PD-1-PD-L1复合物形成可使用靠近依赖性光释放

测定形式来检测，其中

报告分子连接于结合抗PD-抗体的第一二抗并与结合抗PD-L1抗体的生物素化的二抗配对。图1I中所示的示意图代表这两种测定形式。

在一些情况下，本文所述方法中使用的PD-L1抗体可以是兔抗人 PD-L1单克隆抗体E1L3N(Cell Signaling)或兔抗人PD-L1单克隆抗体28-8 (Abcam，目录号ab205921)。在一些情况下，本文所述方法中使用的PD-1 抗体可以是表2中列出的任何抗体。本文所述测定中使用的分子标签可以是美国专利第6,627,400号、第7,105,308号、第7,255,999号、第9,110,975 号、第7,402,397号和第8,357,277号中描述的任何标签。

在一些情况下，可在细胞培养系统中检测PD-1与PD-L1之间的蛋白质间相互作用，其中将贴壁癌细胞与T淋巴细胞(诸如Jurkat细胞)的永生化细胞系共培养，如关于图7所描述的。可将贴壁细胞系培养过夜，洗涤，然后可将PHA刺激的Jurkat细胞相对于贴壁细胞系以1:1或过量地(诸如2倍、5倍、10倍)添加到培养物中。可使共培养物生长1、2、3、4或5天，然后洗涤以除去未结合的细胞(预期主要是淋巴细胞)。然后可在分析之前固定共培养的细胞。可以容易地采用类似的测定形式来评估在癌细胞上表达的其他检查点抑制剂蛋白的蛋白质相互作用。在一些情况下，该测定形式可用于评估测试化合物(诸如化学化合物、肽或抗体或抗体片段)改变两种靶蛋白之间相互作用的能力，从而有助于鉴定治疗性分子。此类测定可用作筛选测定以测试不同的测试分子。在一些情况下，测试分子可以是蛋白质间相互作用的抑制剂，减少靶蛋白质之间的相互作用。例如，靶分子可在另一靶蛋白发生相互作用的同一区域中与靶蛋白之一的一部分结合。在一些情况下，测试分子可以是促进靶蛋白的蛋白质间相互作用的刺激分子。

在另一方面，提供了筛选测试试剂破坏或促进样品中两个细胞之间的蛋白质间相互作用形成的能力的方法，该方法具有以下步骤：(a)使测试细胞培养物与测试试剂接触，所述测试细胞培养物包含在其细胞表面上表达第一蛋白质的第一细胞和在其细胞表面上表达第二蛋白质的第二细胞；(b) 使用上述方法中的任何方法测量第一蛋白质与第二蛋白质之间的蛋白质间相互作用的量；和(c)比较步骤(b)中测量的蛋白质间相互作用的量与未和测试试剂接触的对照细胞培养物中第一蛋白质与第二蛋白质之间测量的蛋白质间相互作用的量，该对照细胞培养物包含在其细胞表面上表达第一蛋白质的第一细胞和在其细胞表面上表达第二蛋白质的第二细胞。

在一些情况下，如果与对照细胞培养物相比，测试细胞培养物中蛋白质间相互作用的量减少，则测试试剂可能是第一蛋白质与第二蛋白质之间的蛋白质间相互作用的抑制剂。在其他情况下，如果与对照细胞培养物相比，测试细胞培养物中蛋白质间相互作用的量增加，则测试试剂可能是第一蛋白质与第二蛋白质之间的蛋白质间相互作用的促进剂。

在一些情况下，第一细胞和第二细胞可以是不同的细胞类型。在一些情况下，第一细胞和第二细胞可以是不同的癌细胞系。在一些情况下，第一细胞和第二细胞之一是贴壁细胞系，并且另一个是非贴壁细胞系。在一些情况下，第一细胞是Jurkat细胞，第二细胞是贴壁癌细胞。

在一些情况下，可使用本文所述方法检测的PD-L1蛋白和PD-1蛋白的量与这些蛋白的mRNA表达量成比例，如例如图2B所示的。在一些情况下，可使用本文所述的方法检测的PD-1-PD-L1复合物的量随着样品中 PD-L1 mRNA的量增加而增加，如例如图8D所示的。在其他情况下，检测到的复合物的量可随着样品中PD-1mRNA的量增加而增加。在图8A-8C 中对这些实施方案进行了举例说明，其中通过所提供的方法检测的样品中 PD-1蛋白的量随着与贴壁癌细胞系共培养的Jurkat细胞的量增加而增加。此外，如图10A-10C中所示，通过所提供的方法检测的复合物的量以统计学上显著的方式与样品中PD-1蛋白的量相关。

在肿瘤样品中，使用所述方法检测PD-1-PD-L1复合物可揭示T细胞对肿瘤的浸润。在一些情况下，在来自患者的肿瘤样品中用所述测定法检测的PD-1-PD-L1复合物的量可以预测患者对抗PD-1或抗PD-L1疗法有反应的可能性。在一些情况下，在来自患者的肿瘤样品中用所述测定法检测的PD-1-PD-L1复合物的量可与患者对抗PD-1或抗PD-L1疗法有反应的可能性相关。

在一个方面，提供了用于预测患有癌症的受试者对免疫检查点靶向治疗的反应性的方法，其包括：(a)使用本公开中描述的定量蛋白质间相互作用的方法测量来自受试者的癌症的生物样品中检查点分子-配体复合物的量；(b)确定受试者样品中复合物的量是高于还是低于阈值水平；和(c)受试者样品中复合物的量等于或高于阈值水平，则表明受试者比在复合物的量低于所述阈值水平的情况下更有可能对检查点靶向治疗作出反应。

在一个方面，提供了用于预测患有癌症的受试者对PD-1或PD-L1作用剂的反应性的方法，其包括：(a)使用如本公开中所述的定量蛋白质间相互作用的方法测量来自受试者癌症的生物样品中的PD-1-PD-L1复合物的量；(b)确定受试者样品中PD-1-PD-L1复合物的量是高于还是低于阈值水平；和(c)如果受试者样品中PD-1-PD-L1复合物的量等于或高于阈值水平，则表明受试者比在PD-1-PD-L1复合物的量低于阈值水平的情况下更有可能对PD-1或PD-L1作用剂作出反应。

在一些情况下，除了定量两种蛋白质之间的复合物的量以外，还可测定第一蛋白质、第二蛋白质或两者的量。在一些情况下，该方法涉及定量第一蛋白质的量以确定肿瘤中T细胞浸润的量。例如，如果存在大量第一蛋白质，则可表明存在大量浸润肿瘤的活化T细胞。在另一个实例中，如果存在少量第一蛋白质，则可表明肿瘤中存在很少的活化T细胞。在一些情况下，在肿瘤中存在大量活化T细胞的情况下，患者对涉及第一蛋白质或第二蛋白质的疗法的反应性(例如，就患者对此类疗法的反应速度而言) 可增加。

如本文中所用，术语“受试者”和“患者”可互换使用。如本文中所用，术语“受试者”和“多个受试者”是指动物，优选哺乳动物，包括非灵长类动物(例如，牛、猪、马、驴、山羊、骆驼、猫、狗、豚鼠、大鼠、小鼠、绵羊)和灵长类动物(诸如猴诸如食蟹猴、大猩猩、黑猩猩和人)。

在一些情况下，阈值水平是在与受试者具有相同类型的癌症的患者的参考群体中测定的PD-1-PD-L1复合物的中位量。在另一种情况下，阈值水平是在与受试者具有相同类型的癌症的患者的参考群体中测定的 PD-1-PD-L1复合物的最佳量。如本文所使用的最佳截止值是指对表现出某些属性的受试者的预定度量的值，其允许属性的两个类别之间的最佳区分。例如，找到允许最佳地区分患者的两个类别(亚组)以确定总体存活率的最佳截止值的值。最佳截止值用于将具有低于或高于最佳截止值的值的受试者分开以优化预测模型，诸如但不限于最大化模型的特异度，最大化模型的灵敏度，最大化结果的差异，或最小化来自危害比或反应的差异的p值。

如本文中所用，对治疗的“反应性”、对治疗的“反应”以及该动词的其他形式是指受试者对用Her-2作用剂治疗的反应。例如，如果受试者中肿瘤的生长延迟约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、 90％或更长时间，则受试者对用PD-1作用剂或PD-L1作用剂的治疗有反应。在另一个实例中，如果受试者中的肿瘤，如通过任何适当的测量(例如，按质量或体积)所测定的，缩小约5％、10％、20％、30％、40％、 50％或更多，则受试者对用Her-2作用剂的治疗有反应。在另一个实例中，如果受试者的预期寿命比在不施用治疗的情况下所预测的寿命延长约5％、 10％、20％、30％、40％、50％或更多，则受试者对用PD-1作用剂或PD-L1 作用剂的治疗有反应。在另一个实例中，如果受试者具有增加的无病存活期、总体存活期或增加的至进展时间，则受试者对用PD-1作用剂或PD-L1 作用剂的治疗有反应。可使用几种方法来确定患者是否对治疗有反应，包括总体存活率、至进展的时间，无进展存活期和/或使用RECIST标准或其他医学上接受的反应标准。RECIST标准代表“实体瘤反应评估标准”的标准，是一组公布的规则，用于定义癌症患者在治疗期间何时改善(“反应”)，保持不变(“稳定”)或恶化(“进展”)。例如，在Journal of the NationalCancer Institute,第92卷，第3期，2000年2月2日中已公布了由RECIST 标准定义的反应。这些指南定期更新，并且任何此类更新都在本公开的范围内。还预期除RECIST标准外的标准、规则或指南可以在将来开发用于表征临床肿瘤反应，并且任何这样的标准、规则或指南都在本公开的范围内。本领域技术人员将理解符合RECIST标准的定义，包括部分反应(“PR”)、完全反应(“CR”)、稳定的疾病(“SR”)和进行性疾病(“PD”)。

实施例

通过参考以下非限制性实施例可更好地理解本发明。

实施例1.抗体、

-抗体、生物素和分子剪刀

识别人PD-L1的细胞内结构域的单克隆抗体购自Cell Signaling Technologies(兔抗人PD-L1单克隆抗体E1L3N)。如果可与FFPE样品兼容使用，则其他抗人PD-L1抗体可适用于本文所述的测定，诸如市售的兔抗人PD-L1单克隆抗体28-8(Abcam，目录号#ab205921)。下表2显示研究的10种抗人PD-1抗体以及它们的同种型和免疫原(rhPD-1指重组人 PD-1)。

表2.测试的抗人PD-1小鼠单克隆抗体

根据先前在美国专利第7,105,308号中描述的方案合成和纯化

报告分子Pro11和Pro125(图1J)以及缀合有链霉抗生物素蛋白的亚甲蓝(“分子剪刀”)，该专利(包括任何附图)通过引用并入本文。根据制造商的方案使用磺基-NHS-LC-LC-生物素(Pierce)作为接头制备抗体-生物素缀合物，并且通过HPLC(Agilent)或AKTA FPLC(GEHealthcare Life Sciences)上的1cm x 10cm Sephadex G-50尺寸排阻柱纯化抗体-生物素和抗体-标签缀合产物。在某些实验中，将

报告分子或生物素与一抗缀合，诸如图1C、1F、1G和1H所示。在其他实验中，将

标签或生物素与结合一抗的二抗缀合，诸如图1D、1E、1H和1I中所示。

实施例2.细胞培养

将所有细胞系在37℃，5％CO₂下维持在具有L-谷氨酰胺生长培养基的GibcoRPMI 1640中，其中补充有10％胎牛血清(FBS)以及青霉素(100 U/mL)和链霉素(100ug/mL)。所有细胞系均购自美国典型培养物保藏中心 (ATCC)。

实施例3.Jurkat细胞系的培养和刺激

将Jurkat细胞以1至2x10⁶个细胞/mL在T-175细胞培养瓶(Corning) 中的100mL培养基中培养。为了刺激，加入终浓度为3μg/mL的植物凝集素-L(PHA-L,Roche)，并在37℃，5％CO₂下孵育2天。通过在4℃下以300x g离心10分钟收获细胞，然后用冷PBS洗涤2次。为了固定细胞，将细胞沉淀重悬于20mL 10％的中性缓冲福尔马林(10％NBF， Richard-Allen Scientific)中，并在4℃下置于旋转架上过夜(>16小时)。将细胞以300x g离心10分钟，除去固定溶液，将细胞沉淀重新溶于最少量的80％乙醇(3至4mL)中并于4℃下储存。

实施例4.共培养贴壁细胞和Jurkat细胞系

将贴壁细胞系MDA-MB453、BT-20、MDA-MB231和RKO中的每一种与悬浮Jurkat T细胞共培养。该共培养实验的概要如图7所示。将贴壁细胞系以10x10⁶个细胞接种于150mm培养皿中的20mL培养基中(约50％汇合)并使其贴壁过夜。第二天，除去培养基，用冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS， Gibco)洗涤细胞一次。将Jurkat细胞以5x10⁵个细胞/mL或2.5x10⁶个细胞/mL在20mL培养基中(总共10x10⁶或50x10⁶个Jurkat细胞(相当于贴壁细胞量的1或5倍，分别为培养条件1和2))和3μg/mL植物凝集素-L (PHA-L,Roche)一起缓慢加入到贴壁细胞系中，使共培养物生长48小时。除去培养基后，用冷PBS洗涤培养皿3次以除去所有非贴壁细胞，并在4℃ 下将20mL的10％中性缓冲福尔马林(10％NBF,Richard-Allen Scientific)加入培养皿中，进行1小时，以固定细胞并固定与贴壁细胞系相互作用的任何Jurkat细胞。然后将细胞刮入50mL离心管(Corning)中，添加10％ NBF至35mL，并置于4℃的旋转架上过夜(>16小时)。将细胞以300x g 离心10分钟，除去固定溶液，将细胞沉淀重新溶解在最少量的80％乙醇(1 至2mL)中并于4℃下储存。

实施例5.用于

测定的载玻片的制备。

固定组织：福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的乳腺、NSCLC和 SCCHN组织样品块购自Asterand Biosciences。将5微米组织切片置于带正电荷的玻璃载玻片((Fisherbrand^TMSuperfrost^TM plus显微镜载玻片，目录号12-550-15)上，然后在设定为70℃的加热烘箱中烘烤20分钟。将所有样品载玻片储存在4℃下以用于将来的测定。

培养细胞：将固定的细胞在40％乙醇中稀释至12,500或625个细胞 /mL，并将40μL(总共500,000或25,000个细胞)置于带正电荷的玻璃载玻片(FisherbrandTMSuperfrostTM plus显微镜载玻片，目录号 12-550-15))上，然后在设置在70℃的加热烘箱中烘烤20分钟。将所有样品载玻片储存在4℃下以用于将来的测定。

实施例6.

测定方案

1.DTT释放试验

在Decloaking Chamber^TM Pro(Biocare Medical)中用250mL Diva Decloaker,pH6.2(Biocare Medical#DV2004MM)对载玻片(FFPE组织样品或培养细胞)进行热诱导表位修复(HIER)，在95℃时下进行40分钟，以及在90℃下进行10秒钟。从Decloaking室中取出载玻片，并使其在室温下冷却1小时。将载玻片用去离子水漂洗六次，并在经改进以缓慢旋转的离心机(Tomy PMC-082)中进行部分干燥。使用mini PAP笔(Invitrogen目录号00-8877)在样品周围绘制疏水圆，以将试剂保留在样品上。然后用在 PBS中含有10％山羊血清(Sigma#G9023)和1.5％牛血清白蛋白的封闭缓冲液覆盖样品1小时。在抽吸除去封闭缓冲液后，将在封闭缓冲液中含有一抗的溶液加入到载玻片中，并在加湿室中于4℃放置过夜，同时轻轻摇动。吸出抗体溶液，用含有0.25％Triton X-100的PBS洗涤样品5分钟，然后用PBS洗涤5分钟。抽吸后，加入封闭缓冲液中的二抗。使二抗在室温下于加湿室中孵育1小时。然后将载玻片转移到去离子水中的载玻片架上，然后用含有0.25％Triton X-100的PBS漂洗5分钟，然后用去离子水洗涤6次，每次1分钟。将载玻片在离心机(Tomy PMC-082)中部分干燥，然后在样品切片上添加在0.01X PBS中含有1.0mM二硫苏糖醇(DTT)、3 pM荧光素和两种CE内标记(MF和ML)的释放缓冲液。将载玻片在加湿室中孵育3小时以允许VeraTag释放。将来自每个载玻片的释放缓冲液转移到96孔板中，然后在不含DTT的释放缓冲液中适当稀释(通常10倍)。在ABI3130CE仪(22-cm毛细管阵列，Applied Biosystems)上于6kV和50 秒的CE注射条件下分离和检测释放缓冲液中释放的

报告分子，并在30℃下运行650秒。使用

Informer软件(参见，诸如，美国公开号0203408-A1，其通过引用并入本文，包括任何附图)进行

的鉴定和定量。为了分析原始CE电泳图中的

报告分子信号，使用两个CE内部标记MF(第一标记)和ML(最后标记)，根据其按照下式：

/[t(ML)-t(MF)])获得的相对于两个标记的电泳迁移率或迁移时间(t)鉴定

峰。然后通过每个VeraTag的峰面积计算定量鉴定的

峰。为了修正

从组织切片恢复的变化性，以及CE注射效率和/或毛细管阵列检测灵敏度的运行变化性，在

捕获缓冲液(CB)中包含荧光素(3pM)，并在每个样品运行中共电泳作为内部参考对照。然后通过将

峰(

峰面积)针对内部荧光素峰 (荧光素峰面积)进行面积标准化，将每个

报告分子峰的面积报告为相对峰面积(RPA)。

通过标准技术用苏木精和曙红(H&E)对载玻片进行染色。简言之，将载玻片置于染色架中并首先在自来水中进行漂洗。将载玻片连续浸入苏木精、澄清剂和上蓝剂中各45秒，然后在每一步后用自来水漂洗。然后用乙醇中的5％水溶液(2份新鲜溶液)处理载玻片，然后用100％乙醇(3份新鲜溶液)处理，然后用二甲苯(3份新鲜溶液，每份5分钟)处理。最后，应用盖玻片来保护该切片。

将通过

测定法检测的靶蛋白的最终定量项计算为：对于使用相同捕获缓冲液体积的相似样品(细胞培养物样品)，指RPA，或为 RPA*CB体积/肿瘤面积(以mm²表示)以解释载玻片上肿瘤的不同量。

对于图3和图4中描述的实验，与Diva Decloaker,pH 6.2(Biocare Medical,#DV2004MM)平行，使用靶修复溶液(Target Retrieval Solution)， pH 9.0(Dako Corp.,#S2368)作为热诱导表位修复(HIER)缓冲液进行相同的方案，以便在测试各种PD1抗体时比较两种缓冲液。

1.光释放测定

除了将Diva Decloaker,pH 6.2(Biocare Medical,#DV2004MM)用作热诱导表位修复(HIER)缓冲液外，光释放

测定形式遵循上述用于DTT释放测定形式的程序，直至并包括二抗的添加和孵育。在与二抗一起孵育后，然后用含有0.25％Triton X-100的PBS洗涤样品5分钟，然后用PBS洗涤5分钟并吸出。抽吸后，加入在1X PBS中浓度为2.5μg/mL 的缀合有链霉抗生物素蛋白的亚甲蓝，并在室温下于加湿室中孵育1小时。然后将载玻片转移到去离子水中的载玻片架上，然后用含有0.25％Triton X-100的PBS漂洗5分钟，然后用去离子水洗涤6次，每次1分钟。将载玻片在离心机(Tomy PMC-082)中部分干燥，然后在样品切片上加入在 0.002X PBS中含有3pM荧光素和两种CE内标记(MF和ML)的照明缓冲液。使用配有电子冰块(Torrey Pine Scientific)的内部高功率LED阵列照明器，通过光激活裂解在～4℃下释放结合的

照射后，通过添加硼氢化钠将

中间体还原成可定量的形式。在ABI3130CE仪(22-cm 毛细管阵列，AppliedBiosystems)上在6kV和65秒的CE注射条件下分离和检测CE样品中释放的

报告分子，并在30℃下运行650秒。如上文关于DTT释放测定所描述的，进行释放的

标签的鉴定和定量。

实施例7.

测定形式-抗体组合

1.DTT释放试验

对于图2A-2B和图8A中所示的实验，使用(1)0.6μg/mL的兔抗人 PD-L1单克隆抗体E1L3N和(2)0.4μg/mL的缀合有

报告分子 Pro125的山羊抗兔二抗进行PD-L1

测定。使用DTT通过还原释放分子标签。该测定形式的示例性示意图示于图1E中。

对于图5A、5B、5C、6A和8B中所示的实验，使用(1)图中所示浓度的小鼠抗人单克隆抗体NAT105(Cell Marque)或EH33(Cell Signaling Technologies)或J121(eBioscience)和(2)1μg/mL的缀合有Pro125

报告分子的山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.，目录号115-005-146)进行PD1

测定。使用DTT 通过还原释放分子标签。该测定形式的示例性示意图示于图1E中。

2.光释放测定

对于图6B和图9A中所示的实验，使用(1)1μg/mL的小鼠抗人PD-1 单克隆抗体NAT105(Cell Marque)、(2)1μg/mL的缀合有生物素的山羊抗小鼠IgG1二抗(RocklandImmunochemicals Inc)和(3)1μg/mL的缀合有

报告分子Pro11的山羊抗人PD-1AF1086(R&D Systems) 进行PD-1抗体

测定。通过光释放分子标签。该测定形式的示例性示意图示于图1D中。

对于图8C中所示的实验，使用(1)1μg/mL的小鼠抗人PD-1单克隆抗体NAT105(Cell Marque)、(2)0.5μg/mL的兔抗人PD-L1单克隆抗体 E1L3N(Cell SignalingTechnologies)、(3)1μg/mL的缀合有

报告分子Pro11的山羊抗小鼠二抗(Jackson ImmunoResearch Labs)和(4) 0.6μg/mL的缀合有生物素的山羊抗兔二抗(Southern Biotech)进行 PD-1-PD-L1复合物

测定。通过光释放分子标签。该测定形式的示例性示意图示于图1I中。

对于图8D和图9B中所示的实验，使用(1)1μg/mL的缀合有

报告分子Pro11的山羊抗人PD-1多克隆抗体AF1086(R&D Systems)、(2) 0.6μg/mL的兔抗人PD-L1单克隆抗体E1L3N(Cell Signaling Technologies)、(3)1μg/mL的缀合有生物素的山羊抗兔IgG二抗 (Rockland Immunochemicals Inc.)进行PD-1-PD-L1复合物

测定。通过光释放分子标签。该测定形式的示例性示意图示于图1H中。通过用等量的兔IgG替换兔单克隆抗体E1L3N进行同种型对照测定。

实施例8.来自CCLE数据库的PD1和PDL1mRNA的表达

图2A顶部显示标绘的来自可从CCLE获得的1,036个癌细胞系的PD1 和PDL1的mRNA表达水平。数据可从癌细胞系大全(CCLE，数据可在 http://www.broadinstitute.org/ ccle/home上获得)获得。PD-L1mRNA水平显示～250倍的动态范围，而PD-1mRNA水平变化小得多，具有～5倍的动态范围。

图2A底部显示来自与图2A顶部中相同的CCLE数据集的PD1与 PDL1的mRNA表达水平之间的关系，所述关系是相对彼此以及利用四个贴壁细胞系(MB453、BT20、MB231和RKO)绘制的，并且对Jurkat悬浮细胞系也进行了绘制(标记并标识为星形)。选择这些贴壁细胞系来代表 PD-L1mRNA表达的宽动态范围，反映整个CCLE细胞系群体。

还将通过

测定法测定的PDL1蛋白的表达与从公共数据库 TCGA和CCLE获得的乳腺癌、NSCLC和SCCHN中的PDL1mRNA表达水平进行比较。如上所述，对从AsterandBiosciences获得的FFPE乳腺、 NSCLC和SCCHN块进行PD-L1

测定，并针对来自每种癌症类型的每个样品绘制经肿瘤面积标准化的PD-L1

信号(RF/mm²)。显著的Mann-Whitney p值(p<0.001，GraphPad Prism 6)表明与NSCLC 或SCCHN相比来自乳腺的PD-L1蛋白水平的差异(图2B，左图)。将来自

的PD-L1蛋白水平与可从相同癌症类型的TCGA(图2B，中图) 或CCLE(图2B，右图)获得的mRNA水平进行比较。与在癌症类型之间对PDL1蛋白水平观察到的差异一致，mRNA水平也表现出相似的差异。

实施例9.使用

测定法评估细胞系中的PD-1蛋白水平。

识别所测试的人PD-1的单克隆抗体如上表2中所示。山羊抗小鼠二抗购自Jackson ImmunoResearch Labs。

其中选择抗人PD-1抗体在500,000或25,000个刺激的Jurkat细胞上进行的pH6.2与pH 9.0HIER缓冲液的比较显示于图3中，并将其与对照 (仅二抗)进行比较。抗-PD-1抗体12A7D7在所有测试条件下产生非常强的信号，表明显著量的与固定样品的非特异性结合，其余的抗PD-1抗体显示两个细胞量和HIER缓冲液之间的不同量的信号差异。图4将图3的结果转换成RPA的倍数变化(为每种HIER缓冲液的500,000个细胞/25,000 个细胞的比率)。HIER pH 6.2缓冲液中的抗PD-1抗体NAT105、J121和 EH33显示出最大的倍数变化，表明当与HIER pH 6.2缓冲液一起使用时，这些抗体在测定中对PD-1具有最大的灵敏度。

进行另一个实验，其中在

测定中滴定抗PD-1抗体NAT105 (图5A)、EH33(图5B)和J121(图5C)，从而对图3中显示的结果进行了扩展。图5A-5C所示的实验结果对图3中显示的结果进行了扩展，因为实验包括NAT105(图5A)、EH33(图5B)和J121(图5C)抗PD-1抗体的滴定。倍数变化的比较示于图6A中。如上所述，在500,000个和25,000个固定的经刺激的Jurkat细胞/载玻片上使用HIER pH 6.2缓冲液，并使用山羊抗小鼠-Pro125抗体进行

测定。抗-PD-1抗体NAT105和EH33 在整个来自500,000个细胞样品的抗体滴定中显示相似的RPA，而抗体 NAT105和J121对于25,000个细胞样品具相似的RPA。这也反映在倍数变化中(图6A)，其中NAT105在整个抗体滴定中具有最大的倍数变化，表明该抗体对PD-1具有最佳灵敏度。

使用上述方法，利用不同的

测定形式进行另外的实验以测量递增数量的经刺激的Jurkat细胞中的PD-1蛋白水平。在该实验中，测定形式涉及缀合于山羊抗人PD-1抗体AF1086(R&D Systems)的

报告分子Pro11的靠近依赖性光释放，所述山羊抗人PD-1抗体AF1086 与小鼠抗人PD-1抗体NAT105(Cell Marque)和缀合于生物素的山羊抗小鼠二抗(Rockland Immunochemicals Inc.)配对。该测定形式的示例性示意图示于图1D中。

图6B显示使用PD1

测定法测定递增量的经PHA刺激和固定的Jurkat细胞。随着Jurkat细胞数量增加，观察到PD1

信号的线性增加。相反，随着经刺激的Jurkat细胞的量增加，用小鼠IgG1同种型对照替换小鼠抗人PD1单克隆抗体NAT105几乎没有引起信号变化，表明检测到的信号是PD1特异性的，并且不完全是由抗体背景结合造成的。

实施例10.使用

测定法测定PD1、PDL1和PD1-PDL1复合物的共培养物

用

测定法分析从MD-MB231或RKO贴壁细胞系与Jurkat 悬浮细胞系共培养产生的固定样品，以检测PD-L1(图8A)、PD-1(图8B) 和PD-1-PD-L1复合物(图8C)。如上所述(DTT-释放PDL-1

测定，参见图1E中的示意图)，用兔抗人PD-L1单克隆抗体E1L3N(Cell Signaling Technologies)和山羊抗兔二抗-Pro125

缀合物进行PD-L1

测定。在MDA-MB231-Jurkat和RKO-Jurkat的固定共培养物中，

PD-L1信号可能潜在地源自培养物中的任一细胞系。在 MDA-MB231-Jurkat与RKO-Jurkat共培养物之间，PD-L1

信号存在大约16倍的差异，与如下表3中显示的来自单个MDA-MB231和RKO 细胞系的不同mRNA表达水平一致。此外，随着Jurkat细胞的数量增加(共培养条件为1X对5X)，观察到类似的PD-L1

信号，表明添加的Jurkats是整体PD-L1

信号的最小贡献者，并且与它们的低 mRNA表达水平(参见表3)一致。综上所述，来自这些共培养物的PD-L1

信号中的大部分可能源自MDA-MB231或RKO贴壁细胞系。

表3.测试的细胞系

图8B显示共培养实验的PD-1

测定的结果。在两种 RKO-Jurkat共培养条件下观察到比MDA-MB231-Jurkat共培养物更大的 PD-1

信号。贴壁细胞系和Jurkat细胞系均表达非常低量的PD-1 mRNA(参见表3)，并且先前的工作已经显示通过PHA刺激可以在Jurkat 细胞上诱导PD-1蛋白表达(Vibhakar.R.等，Activation-inducedexpression of human programmed death-1gene in T-lymphocytes,Exp.Cell Res. 232(1):25-28(1997))。RKO-Jukat共培养物中较大的PD-1

信号与以下观点一致：共培养后固定的表达PD-1的Jurkat细胞的量与贴壁细胞系的PD-L1表达水平成比例。图8B还显示在MDA-MB231-和RKO-Jurkat 共培养物中随着Jurkat T细胞数量的增加(共培养条件为1X和5X Jurkats)，PD-1

信号增强，表明共培养后固定的表达PD-1的Jurkat细胞的量也反映了PD-1的量。

图8C显示来自共培养实验的PD-1-PD-L1复合物

测定的结果。PD-1-PD-L1复合物

测定采用如图1I中示意性显示的

报告分子Pro11的靠近依赖性光释放。图8C中来自与Jurkat细胞共培养的MDA-MB-231和RKO细胞系的PD-1-PD-L1复合物

测定结果遵循图8B中的PD-1

测定结果。通过

测定法测量的PD-1-PD-L1蛋白复合物的量随着PD-L1表达的增加而增加(RKO-Jurkat共培养)，并且PD-1-PD-L1复合物的量随着PD-1表达增加(条件1X对5X)而增加。这种固定的共培养模型系统的可能限制是要求Jurkat 细胞与贴壁细胞相互作用，以使它们存在于最终的固定制剂中。预计对 FFPE乳腺癌NSCLC和SCCHN肿瘤样品的调查将更全面地了解这三种

检测(PD-L1、PD-1和PD-1-PD-L1复合物)之间的关系。

用不同的

测定形式(示意性地示于图1H中)进行另外的实验以测量PD1-PD-L1复合物。如图8D所示，与Jurkat细胞共培养的 MDA-MB-453、BT20、MDA-MB-231和RKO细胞系中的PD1-PD-L1复合物的量遵循来自CCLE的PD-L1mRNA的量。通过

测定法测量的PD-1-PD-L1蛋白复合物的量随着PD-L1mRNA表达增加而增加。相反，用兔IgG同种型对照抗体替换兔抗人PD-L1单克隆抗体E1L3N导致随着PD-L1mRNA的量增加，PD1-PD-L1复合物

信号的变化最小(灰色方块，同种型对照)。如上所述，这种固定的共培养模型系统的可能限制是要求Jurkat细胞与贴壁细胞相互作用，以使它们存在于最终的固定制剂中，并且由于本研究中使用的贴壁细胞系具有递增的PD-L1表达量，所以我们预计PD1-PD-L1复合物的量会增加。

实施例11.人乳腺癌肿瘤中PD-1、PD-L1和PD-1/PD-L1复合物的检测和定量

通过

测定法在12个人乳腺癌肿瘤(Asterand Bioscience)中测量PD1和PD1-PDL1复合物的量。通过对相邻H&E染色的载玻片进行病理学检查，在

测定之前就肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的存在预先选择样品。另外，使用小鼠抗人PD1单克隆抗体NAT105和兔抗人PDL1单克隆抗体E1L3N对选定的一组样品进行PD1的免疫组织化学染色，所述抗体染色分别证实了PD1和PDL1在TIL上的肿瘤细胞膜表达(数据没有显示)。使用的PD1

测定形式是如图1D所示的和上文中关于图 6B所描述的基于靠近的光释放测定。使用的PD1-PDL1复合物

测定形式是如图1H中示意性显示的和上文中关于图8D所描述的基于靠近的光释放测定。对于PD1-PDL1复合物

测定，使用如上文关于图 8D所述的同种型对照测定形式平行评估背景信号。

PD-1蛋白表达的量示于图9A中。检测到的PD1-PDL1复合物的量示于图9B中(黑色条块)。对于同种型对照测定结果(灰色条块)，最小测定信号对背景比为2被认为是可接受的，并且所有样品都通过。存在测定信号对背景比随着测定信号增强而增加的总体趋势。

图10A-10C显示使用

测定法从乳腺癌样品检测的PD1、 PDL1和PD1-PDL1复合物的量之间的所有成对比较。每个比较的皮尔逊相关系数(R²)和p值显示在图的右侧。绘制的数据来自图9A(PD-1)、图9B (PD1-PDL1复合物)和图2B(左图)(PD-L1；12个乳腺癌样品中的8个)的数据。在PD1与PD1:PD-L1复合物之间观察到最强的相关性(皮尔逊R2＝ 0.7638)，表明PD1而非PD-L1可能是复合物形成的主要驱动者。

出于所有目的，本公开中论述的所有专利、专利出版物、专利申请、期刊文章、书籍、技术参考文献等通过引用整体并入本文。

应当理解，本发明的附图和描述已被简化来举例说明与清楚理解本发明相关的要素。应该理解的是，附图是出于说明目的而不是作为结构图而给出的。省略的细节和修改或替代实施方案在本领域普通技术人员的知识范围内。

可以理解，在本发明的某些方面，单个组件可以由多个组件替换，并且多个组件可由单个组件替换，以提供要素或结构或执行给定的一个或多个功能。除非这种取代不能用于实施本发明的某些实施方案，否则这种取代被认为是在本发明的范围内。

本文呈现的实施例旨在说明本发明的潜在和具体实行。可以理解，这些实施例主要是为了对本领域技术人员说明本发明。在不脱离本发明的精神的情况下，可对这些图或本文描述的操作进行变化。例如，在某些情况下，可以以不同的顺序进行或执行方法步骤或操作，或者可以添加、删除或修改操作。

附图中描绘的或上面描述的组件的不同排布，以及未显示或描述的组件和步骤是可能的。类似地，一些特征和子组合是有用的，并且可以在不参考其他特征和子组合的情况下使用。已经出于说明性而非限制性目的描述了本发明的实施方案，并且替代实施方案对于本专利的读者将变得显而易见。因此，本发明不限于上述实施方案或附图中描绘的实施方案，并且在不脱离以下权利要求的范围的情况下可进行各种实施方案和修改。

Claims

1.一种定量样品中两个细胞之间的蛋白质间相互作用的方法，该方法包括：

(a)提供包含在其细胞表面上表达第一蛋白质的第一细胞和在其细胞表面表达第二蛋白质的第二细胞的样品；

(b)提供对所述第一蛋白质特异的第一抗体结合组合物，其中所述第一抗体结合组合物具有通过可裂解键联与其连接的分子标签，其中所述分子标签是包含检测部分的水溶性有机化合物；

(c)提供对所述第二蛋白质特异的第二抗体结合组合物，其中所述第二抗体结合组合物具有与其连接的敏化剂，其中所述敏化剂是可被诱导来产生单线态氧的化合物；

(d)使所述样品与所述第一抗体结合组合物和所述第二抗体结合组合物接触；

(e)当所述第一抗体结合组合物在与所述第二抗体结合组合物连接的敏化剂的20-200nm内时，诱导所述分子标签从所述第一抗体结合组合物上裂解，从而释放所述分子标签；

(f)对释放的分子标签的量进行定量，作为所述第一蛋白质与所述第二蛋白质之间蛋白质间相互作用的量的量度。

2.一种定量样品中两个细胞之间的蛋白质间相互作用的方法，该方法包括：

(b)提供对所述第一蛋白质特异的第一抗体结合组合物，其中所述第一抗体结合组合物包含通过可裂解键联与其连接的分子标签，其中所述分子标签是包含检测部分的水溶性有机化合物；

(c)提供对所述第二蛋白质特异的第二抗体结合组合物；

(d)提供能够与所述第二抗体结合组合物结合的第三抗体结合组合物，所述第三抗体结合组合物包含与其连接的敏化剂，其中所述敏化剂是可被诱导来产生单线态氧的化合物；

(e)使所述样品与所述第一抗体结合组合物、所述第二抗体结合组合物和所述第三抗体结合组合物接触；

(f)当所述第一抗体结合组合物在与所述第三抗体结合组合物连接的敏化剂的20-200nm内时，诱导所述分子标签从所述第一抗体结合组合物上裂解，从而释放所述分子标签；以及

(g)对释放的分子标签的量进行定量，作为所述第一蛋白质与所述第二蛋白质之间蛋白质间相互作用量的量度。

3.一种定量样品中两个细胞之间的蛋白质间相互作用的方法，该方法包括：

(a)提供包含在其细胞表面上表达第一蛋白质的第一细胞和在其细胞表面上表达第二蛋白质的第二细胞的样品；

(b)提供对所述第一蛋白质特异的第一抗体结合组合物，所述第一抗体结合组合物包含与其连接的敏化剂，其中所述敏化剂是可被诱导来产生单线态氧的化合物；

(c)提供对所述第二蛋白质特异的第二抗体结合组合物；

(d)提供能够与所述第二抗体结合组合物结合的第三抗体结合组合物，所述第三抗体结合组合物具有通过可裂解键联与其连接的分子标签，其中所述分子标签是包含检测部分的水溶性有机化合物；

(f)当所述第三抗体结合组合物在与所述第一抗体结合组合物连接的敏化剂的20-200nm内时，诱导所述分子标签从所述第三抗体结合组合物上裂解，从而释放所述分子标签；以及

(g)对释放的分子标签的量进行定量，作为所述第一蛋白质与所述第二蛋白质之间蛋白质间相互作用的量的量度。

4.一种定量样品中两个细胞之间的蛋白质间相互作用的方法，该方法包括：

(b)提供对所述第一蛋白质特异的第一抗体结合组合物；

(c)提供对所述第二蛋白质特异的第二抗体结合组合物；

(d)提供能够与所述第一抗体结合组合物结合的第三抗体结合组合物，所述第三抗体结合组合物包含通过可裂解键联与其连接的分子标签，其中所述分子标签是包含检测部分的水溶性有机化合物；

(e)提供能够与所述第二抗体结合组合物结合的第四抗体结合组合物，所述第四抗体结合组合物包含与其连接的敏化剂，其中所述敏化剂是可被诱导来产生单线态氧的化合物；

(f)使所述样品与所述第一抗体结合组合物、所述第二抗体结合组合物、所述第三抗体结合组合物和所述第四抗体结合组合物接触；

(g)当所述第三抗体结合组合物在与所述第四抗体结合组合物连接的敏化剂的20-200nm内时，诱导所述分子标签从所述第三抗体结合组合物上裂解，从而释放所述分子标签；

(h)对释放的分子标签的量进行定量，作为所述第一蛋白质与所述第二蛋白质之间的蛋白质间相互作用的量的量度。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述样品是组织样品、培养细胞或外周血单个核细胞(PBMC)。

6.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述样品是癌症活组织检查样品。

7.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述样品是福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)样品。

8.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述样品是血液样品。

9.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述第一细胞是T细胞，并且所述第二细胞是肿瘤细胞。

10.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述第一蛋白质是PD-1，并且所述第二蛋白质是PD-L1。

11.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述敏化剂是光敏剂并且所述敏化剂对所述分子标签的裂解是由光诱导的。

12.权利要求11的方法，其中所述光敏剂是亚甲基蓝。

13.权利要求11的方法，其中所述光敏剂是内过氧化物。

14.权利要求13的方法，其中所述内过氧化物是1,4-双羧乙基-1,4-萘内过氧化物、9,10-二苯基蒽-9,10-内过氧化物和5,6,11,12-四苯基萘5,12-内过氧化物。

15.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述检测部分包含荧光标记、生色标记或电化学标记。

16.PD-1或PD-L1作用剂在制备诊断剂中的用途，所述诊断剂用于预测患有癌症的受试者对PD-1或PD-L1作用剂的反应性，所述预测包括：

(a)使用权利要求1-15中任一项的方法测量来自所述受试者的癌症生物样品中PD-1-PD-L1复合物的量；

(b)确定所述受试者的样品中PD-1-PD-L1复合物的量高于还是低于阈值水平；以及

(c)如果所述受试者的样品中PD-1-PD-L1复合物的量等于或高于阈值水平，则表明所述受试者比在PD-1-PD-L1复合物的量低于所述阈值水平的情况下更可能对PD-1或PD-L1作用剂作出反应。

17.一种对测试试剂筛选其破坏或促进样品中两个细胞之间的蛋白质间相互作用的形成的能力的方法，该方法包括：

(a)使测试细胞培养物与测试试剂接触，所述测试细胞培养物包含在其细胞表面上表达第一蛋白质的第一细胞和在其细胞表面上表达第二蛋白质的第二细胞；

(b)使用权利要求1-4或9-15中任一项的方法测量所述第一蛋白质与所述第二蛋白质之间的蛋白质间相互作用的量；以及

(c)将步骤(b)中测量的蛋白质间相互作用的量与未和所述测试试剂接触的对照细胞培养物中所述第一蛋白质与所述第二蛋白质之间测量的蛋白质间相互作用的量进行比较，所述对照细胞培养物包含在其细胞表面上表达所述第一蛋白质的所述第一细胞和在其细胞表面上表达所述第二蛋白质的所述第二细胞。

18.权利要求17的方法，其中如果与所述对照细胞培养物相比，所述测试细胞培养物中蛋白质间相互作用的量减少，则所述测试试剂是所述第一蛋白质与所述第二蛋白质之间的蛋白质间相互作用的抑制剂。

19.权利要求17的方法，其中如果与所述对照细胞培养物相比，所述测试细胞培养物中蛋白质间相互作用的量增加，则所述测试试剂是所述第一蛋白质与所述第二蛋白质之间蛋白质间相互作用的促进剂。

20.权利要求17-19中任一项的方法，其中所述第一细胞和所述第二细胞是不同的细胞类型。

21.权利要求17-19中任一项的方法，其中所述第一细胞和所述第二细胞是不同的癌细胞系。

22.权利要求17-19中任一项的方法，其中所述第一细胞和所述第二细胞之一是贴壁细胞，而另一个是非贴壁细胞。

23.权利要求17-19中任一项的方法，其中所述第一细胞是Jurkat细胞，并且所述第二细胞是贴壁癌细胞。