CN102590528A - 一种蛋白相互作用的检测方法 - Google Patents

Abstract

一种蛋白相互作用的检测方法，涉及一种蛋白的检测方法。将两个待测相互作用蛋白分别克隆到细菌双杂交载体上，再共转化至报告细菌。因为这两个目标蛋白的相互作用而启动报告基因的转录表达，产生特定的酶。采用荧光底物对共转化了两个目标蛋白的报告细菌进行染色，报告产物酶将荧光底物水解，释放出荧光素，通过流式细胞仪对单个细菌荧光强度的定量分析即可在单细菌水平检测两个目标蛋白的相互作用。单细菌水平蛋白-蛋白相互作用的定量检测及相关分析对于蛋白质功能的准确解析、信号转导通路的确定及新的药物靶点的发现具有重要意义。

Description

一种蛋白相互作用的检测方法

技术领域

本发明涉及一种蛋白的检测方法，尤其是涉及一种结合流式细胞检测技术与细菌双杂交系统对单个细菌水平蛋白-蛋白相互作用进行快速检测的方法。

背景技术

蛋白质是生物体中各种生理功能的主要执行者，蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个重要组成部分，不仅可以从分子水平揭示蛋白质的功能，而且为我们更好地理解生命过程、疾病机制和新药开发等提供了一个很好的基础。蛋白质相互作用研究方法分为体外和体内检测两大类，其中体外检测主要包括免疫共沉淀、表面等离子共振分析、噬菌体展示、蛋白质芯片等([1]H.Guan，E.Kiss-Toth，Advanced technologies for studies onprotein interactomes，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.2008，110，1；[2]A.Droit，G.G.Poirier，J.M.Hunter，Experimental and bioinformatic approaches for interrogating protein-protein interactions todetermine protein function，J.Mol.Endocrinol.2005，34，263)，这些方法均需要对细胞进行破碎以提取蛋白，对所研究蛋白的浓度和纯度有较高的要求，不仅操作繁琐且无法在天然状态下达成蛋白-蛋白相互作用。体内检测手段主要包括酵母双杂交、荧光共振能量转移、蛋白质片段互补技术等([1]H.Guan，E.Kiss-Toth，Advanced technologies for studies on proteininteractomes，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.2008，110，1)，这些技术在活细胞水平研究蛋白-蛋白相互作用，通过报告基因的表达产物可敏感地检测到蛋白质之间微弱的、瞬间的相互作用；更具特色的是所有操作均在核酸水平上进行，无需纯化蛋白。其中，最具代表性的酵母双杂交系统(Y2H)已被广泛地应用于发现新的蛋白质和蛋白质的新功能、研究抗原和抗体的相互作用、筛选药物作用位点以及考察药物对蛋白质之间相互作用的影响、绘制蛋白相互作用图谱和发现可以用来诊断和治疗的蛋白质标志物等领域([3]A.Bruckner，C.Polge，N.Lentze，D.Auerbach，U.Schlattner，Yeast two-hybrid，a powerful tool for systems biology，Int.J.Mol.Sci.2009，10，2763；[4]H.Yu，P.Braun，M.A.Yildirim，I.Lemmens，K.Venkatesan，et al.High-quality binary protein interaction map of the yeast interactome network，Science.2008，322，104；[5]I.Lemmens，S.Lievens，J.Tavernier，Strategies towards high-quality binary proteininteractome maps，J.Proteomics.2010，73，1415；[6]B.Suter，S.Kittanakom，I.Stagljar，Two-hybrid technologies in proteomics research，Curr.Opin.Biotechnol.2008，19，316)。

尽管如此，酵母双杂交系统在蛋白质相互作用研究中仍然存在较大的局限性，传统的Y2H方法操作过程烦杂，耗时费力，需要使用琼脂平板和滤膜来进行营养缺陷标记选择(如：ADE2，HIS3/3AT)以及LacZ基因的比色定量分析(通过β-半乳糖苷酶对X-Gal的水解作用)([7]J.K.Joung，E.I.Ramm，C.O.Pabo，A bacterial two-hybrid selection system for studying protein-DNAand protein-protein interactions，Proc.Natl.Acad.Sci.U SA2000，97，7382)。1998年，Karimova等在酵母双杂交的基础上提出了细菌双杂交模型([8]G.Karimova，J.Pidoux，A.Ullmann，D.Ladant，A bacterial two-hybrid system based on a reconstituted signal transduction pathway，Proc.Natl.Acad.Sci.US A 1998，95，5752)，较之于酵母双杂交系统，细菌双杂交有如下优点：1)研究周期短，操作简单。大肠杆菌双杂交分析不仅可将实验时间从酵母双杂交的6天缩短至1天，而且质粒的分离和扩增也更加简便；2)转化效率高，可高通量地筛选文库。酵母细胞的转化效率为10⁶cfu/μgDNA，而大肠杆菌细胞可达到10⁹cfu/μgDNA；3)更低的假阳性率。真核来源的“诱饵”及“靶”蛋白与细菌的类似物同源性更低，不仅显著降低了它们在报告菌株(reporter strain)中的毒性作用，而且减少了自激活假阳性率；4)普遍适用性强。采用大肠杆菌作为筛选宿主，可规避传统酵母双杂交系统对于蛋白质核定位的要求，无法转运到细胞核内的蛋白质，如胞浆蛋白和细胞膜蛋白都可以通过细菌双杂交系统来进行研究。

细菌双杂交应用于蛋白质相互作用研究目前主要是采用传统的生物化学手段进行检测，需要对细菌进行分离、培养及一系列生化反应，操作繁琐、检测时间长，而且平板显色或比色定量获得的信号是成千上万个细胞内众多蛋白表现的集权平均。单个细菌水平的蛋白-蛋白相互作用研究有助于更准确地考察蛋白在细菌介导的活细胞中相互作用的状况，揭示因集权平均而被掩盖的个体差异，获得单个细菌蛋白-蛋白相互作用的性状分布图，确定个体对整体的贡献，区分正常与异常，对于揭示蛋白相互作用相关信号转导的分子机制具有明显优势([9]Y.Taniguchi，P.J.Choi，G.W.Li，H.Chen，M.Babu，J.Hearn，A.Emili，X.S.Xie，Quantifying E.coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells，Science.2010，329，533；[10]W.Hellmich，C.Pelargus，K.Leffhalm，A.Ros，D.Anselmetti，Single cell manipulation，analytics，and label-free protein detection in microfluidic devices forsystems nanobiology，Electrophoresis.2005，26，3689)。流式细胞术是一种功能强大的单细胞分析手段，具有检测速度快、精度高和多参数分析等特点，已在蛋白质组学和系统生物学中发挥着重要的作用([11]J.P.Nolan，L.Yang，The flow of cytometry into systems biology，Brief.Funct.Genomic.Proteomic.2007，6，81)。它能高效地对微孔板里的细胞进行分析和分选(每秒上万个)，特别适合大规模的细胞分析([12]Y.Zhou，S.Kajiyama，K.Itoh，T.Tanino，N.Fukuda，T.Tanaka，A.Kondo，K.Fukui，Development of an enzyme activity screening system forbeta-glucosidase-displaying yeasts using calcium alginate micro-beads and flow sorting，Appl.Microbiol.Biotechnol.2009，84，375)，已广泛应用于酵母和细菌抗体展示库的筛选([13]Y.Mazor，T.Van Blarcom，B.L.Iverson，G.Georgiou，E-clonal antibodies：selection of full-lengthIgG antibodies using bacterial periplasmic display，Nat.Protoc.2008，3，1766；[14]U.Binder，G.Matschiner，I.Theobald，A.Skerra，High-throughput sorting of an Anticalin library viaEspP-mediated functional display on the Escherichia coli cell surface，J.Mol.Biol.2010，400，783；[15]H.Wernerus，S.Stahl，Biotechnological applications for surface-engineered bacteria，Biotechnol.Appl.Biochem.2004，40，209)。2008年有文献报道采用流式细胞仪对以增强型绿色荧光蛋白(yEGFP)为报告基因的酵母双杂交系统进行检测并将其应用于cDNA文库的筛选([16]J.Chen，J.Zhou，W.Bae，C.K.Sanders，J.P.Nolan，H.Cai，A yEGFP-based reportersystem for high-throughput yeast two-hybrid assay by flow cytometry，Cytometry.A.2008，73，312)，实现了蛋白-蛋白相互作用的高通量鉴定和表征，极大地精简了Y2H的筛选过程。

发明内容

本发明的目的在于针对现有的蛋白相互作用检测分析方法操作繁琐、灵敏度低、实验周期长等缺陷，提供一种灵敏、快速、高分辨、在单个细菌水平检测的蛋白相互作用的检测方法。

本发明包括以下步骤：

1)构建细菌双杂交载体：选择一对待确定相互作用的蛋白，将编码两个待测相互作用蛋白的核苷酸序列分别连接于相应的载体上，形成两个分别表达相互作用蛋白的细菌双杂交载体；

2)将步骤1)中的表达两个相互作用蛋白的细菌双杂交载体共转化到报告细菌，形成包含两个相互作用蛋白的重组细胞；

3)在适合表达两个相互作用蛋白的条件下，培养步骤2)中的重组细胞，表达目标产物，两个蛋白相互作用后促进报告基因的转录和表达；

4)对于非跨膜荧光底物，加入荧光底物染色前需对重组细胞进行破膜处理，改变细胞的渗透性；对于可跨膜荧光底物，直接进行步骤5)的荧光染色步骤；

5)在破膜后的重组细胞中加入荧光底物，其被报告基因的产物水解后，释放出荧光物质，通过流式细胞仪对单个细菌荧光强度进行定量分析，从而实现单细菌水平两个目标蛋白相互作用的检测。

在步骤2)中，所述报告细菌，是可以用于细菌双杂交的各种原核细菌，所述报告细菌可选自E.coliBTH101或E.coli DHM1等。

在步骤3)中，所述报告基因可选自编码内酰氨酶的bla或半乳糖苷酶的lacZ基因，参与组氨酸生物合成途径的HIS3基因和链霉素抗性基因aadA等中的一种。

在步骤5)中，所述荧光底物为对应于各报告基因产物的相应荧光底物；所述蛋白相互作用是通过检测荧光底物被报告基因产物水解后，释放出的荧光素，来达到检测蛋白相互作用的目的；所述荧光底物的终浓度可为10nM～1mM，反应时间可为1～240min，反应温度可为4～80℃。

本发明以lacZ作为细菌双杂交体系的报告基因范例，选择可以被lacZ基因表达产物β-gal水解后释放出荧光产物的底物C12FDG作为报告细菌的染色剂；以保持细菌外膜稳定性紧密相关的一对相互作用蛋白Pal-TolB作为细菌双杂交模型，获得最佳实验方案，并建立了相应的技术体系，能满足在单个细菌水平对体内蛋白质相互作用进行灵敏、快速、高分辨的检测及研究的需求。

本发明通过流式细胞检测技术与细菌双杂交系统的有机结合，采用荧光底物对共转化了两个待确定相互作用目标蛋白的报告细菌进行染色，两个蛋白相互作用后的报告基因产物将荧光底物水解，释放出荧光素，通过灵敏的流式细胞仪对单个细菌荧光强度的定量分析即可在单细菌水平检测两个目标蛋白的相互作用。

本发明发展的单个细菌水平蛋白-蛋白相互作用的定量分析方法，通过对成千上万个细菌的快速、逐一分析，获得统计分布图，弥补现有的分析测试手段仅提供集权平均信息的不足。

附图说明

图1为用流式细胞仪检测Pal-TolB蛋白相互作用的阴性对照1(BTH101 pKT25+pUT18)荧光信号图。在图1中，纵坐标为荧光强度FLintensity(mV)。

图2为用流式细胞仪检测Pal-TolB蛋白相互作用的阴性对照2(BTH101pKT25-TolB+pUT18)荧光信号图。在图2中，纵坐标为荧光强度FL intensity(mV)。

图3为用流式细胞仪检测Pal-TolB蛋白相互作用的阴性对照3(BTH101pKT25-+pUT18-Pal)荧光信号图。在图3中，纵坐标为荧光强度FL intensity(mV)。

图4为用流式细胞仪检测Pal-TolB蛋白相互作用的实验(BTH101 KT25-TolB+pUT18-Pal)荧光信号图。在图4中，纵坐标为荧光强度FL intensity(mV)。

图5为用流式细胞仪检测Pal-TolB蛋白相互作用的阴性对照1(BTH101 pKT25+pUT18)的侧向散射光信号图。在图5中，横坐标为Bin number(bin＝100μs)/500ms，纵坐标为散射光强度SS intensity(mV)。

图6为用流式细胞仪检测Pal-TolB蛋白相互作用的阴性对照2(BTH101pKT25-TolB+pUT18)的侧向散射光信号图。在图6中，横坐标为Bin number(bin＝100μs)/500ms，纵坐标为散射光强度SS intensity(mV)。

图7为用流式细胞仪检测Pal-TolB蛋白相互作用的阴性对照3(BTH101pKT25-+pUT18-Pal)的侧向散射光信号图。在图7中，横坐标为Bin number(bin＝100μs)/500ms，纵坐标为散射光强度SS intensity(mV)。

图8为用流式细胞仪检测Pal-TolB蛋白相互作用的实验(BTH101KT25-TolB+pUT18-Pal)的侧向散射光信号图。在图8中，横坐标为Bin number(bin＝100μs)/500ms，纵坐标为散射光强度SS intensity(mV)。

图9为图1～4中阴性对照和实验组的荧光统计直方图。在图9中，横坐标为荧光强度FLintensity(mV)，纵坐标为所检测到的各荧光强度所对应的细菌个数Events；曲线1与图1相对应，曲线2与图2相对应，曲线3与图3相对应，曲线4与图4相对应。

图10为图5～8中阴性对照和实验组的侧向散射光统计直方图。在图10中，横坐标为散射光强度SS intensity(mV)，纵坐标为所检测到的各散射光强度所对应的细菌个数Events；曲线1与图5相对应，曲线2与图6相对应，曲线3与图7相对应，曲线4与图8相对应。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步阐述本发明。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(2001 by Cold SpringHarbor Laboratory Press)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1细菌双杂交体系的构建

以大肠杆菌K12基因组为模板，设计pal和tolB基因的引物并于生工合成，通过PCR分别获取pal和tolB基因。将它们分别插入细菌双杂交载体pUT18、pKT25的EcorI和XhoI酶切位点，获得pUT18-pal和pKT25-tolB。将分别带有pal和tolB的两种载体共转化于报告细菌E.coli BTH101，完成细菌双杂交系统的构建。采用常规的蓝白斑筛选及比色定量法确定Pal-TolB细菌双杂交体系的成功建立，同时采用Western Blot、免疫共沉淀、荧光显微镜等传统生物学实验手段进行验证。

实施例2双杂交细菌的培养及相互作用蛋白的表达

挑取待检菌E.coli BTH101+pUT18-pal+pKT25-tolB单菌落于2mL LB培养基中，加入诱导剂IPTG至终浓度0.5mM，30℃，250rpm培养18h，诱导Pal和TolB的表达，两个蛋白相互作用后促进报告基因产物β-gal的转录和表达。同时设置BTH101pKT25+pUT18；BTH101pKT25-TolB+pUT18；BTH101pKT25-+pUT18-Pal作为阴性对照。

实施例3紫外可见分光光度法测定β-gal酶活性以确定蛋白相互作用

用分光光度计测定实施例2中的4种菌液的OD600值，通过调节M63培养基的加入量，使4种菌液的OD600基本一致。采用Miller方法，以ONPG为底物，在紫外可见分光光度计上测定4种菌的β-gal酶活性(设定DU800，kinetic/time，analytical 420nm，Scan time 20min，interval 2min)，从而确定蛋白的相互作用情况。

实施例4单细菌水平细菌双杂交体系流式检测模式的建立

1)改变细菌细胞渗透性

移取0.5mL细菌，10000rpm，4℃下离心去上清，用0.5mL M63培养基重悬，加入到玻璃试管中。加入7.5μL甲苯和0.1％SDS，用纱布封口，37℃，250rpm摇床10min。10000rpm，4℃下离心去上清，用0.2mL PBS重悬。

2)荧光底物C12FDG染色

分别移取20μL改变细胞渗透性的菌液于1.5mL离心管中，然后加入20μL 20μMC12FDG。37℃水浴25min后立即加入360μL预冷PBS；在冰上孵育30min后，10000rpm4℃下离心5min，除去上清后加入预冷的100μL 200μM PETG重悬菌体。

3)流式细胞仪测定β-gal酶活性确定蛋白相互作用

将上述处理好的菌体在流式细胞仪上检测，条件是：散射光PMT 300mV，荧光PMT 500mV。

结果如图所示，图1为用流式细胞仪检测Pal-TolB蛋白相互作用的阴性对照1(BTH101pKT25+pUT18)荧光信号图；图2为用流式细胞仪检测Pal-TolB蛋白相互作用的阴性对照2(BTH101pKT25-TolB+pUT18)荧光信号图；图3为用流式细胞仪检测Pal-TolB蛋白相互作用的阴性对照3(BTH101pKT25-+pUT18-Pal)荧光信号图；图4为用流式细胞仪检测Pal-TolB蛋白相互作用的实验(BTH101KT25-TolB+pUT18-Pal)荧光信号图。图5为用流式细胞仪检测Pal-TolB蛋白相互作用的阴性对照1(BTH101pKT25+pUT18)的侧向散射光信号图；图6为用流式细胞仪检测Pal-TolB蛋白相互作用的阴性对照2(BTH101pKT25-TolB+pUT18)的侧向散射光信号图；图7为用流式细胞仪检测Pal-TolB蛋白相互作用的阴性对照3(BTH101pKT25-+pUT18-Pal)的侧向散射光信号图；图8为用流式细胞仪检测Pal-TolB蛋白相互作用的实验(BTH101KT25-TolB+pUT18-Pal)的侧向散射光信号图。

图9为图1～4中阴性对照和实验组的荧光统计直方图。由图9可见，曲线1与图1相对应，曲线2与图2相对应，曲线3与图3相对应，曲线4与图4相对应。

图10为图5～8中阴性对照和实验组的侧向散射光统计直方图。由图10可见，曲线1与图5相对应，曲线2与图6相对应，曲线3与图7相对应，曲线4与图8相对应。

实验组的荧光峰明显比3个阴性组向右偏移，即信号可以与背景分离。表明该体系可适用于在单个细菌水平对蛋白相互作用进行快速检测。

Claims (8)

1.一种蛋白相互作用的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1)构建细菌双杂交载体：选择一对待确定相互作用的蛋白，将编码两个待测相互作用蛋白的核苷酸序列分别连接于相应的载体上，形成两个分别表达相互作用蛋白的细菌双杂交载体；

2)将步骤1)中的表达两个相互作用蛋白的细菌双杂交载体共转化到报告细菌，形成包含两个相互作用蛋白的重组细胞；

3)在适合表达两个相互作用蛋白的条件下，培养步骤2)中的重组细胞，表达目标产物，两个蛋白相互作用后促进报告基因的转录和表达；

4)对于非跨膜荧光底物，加入荧光底物染色前需对重组细胞进行破膜处理，改变细胞的渗透性；对于可跨膜荧光底物，直接进行步骤5)的荧光染色步骤；

5)在破膜后的重组细胞中加入荧光底物，其被报告基因的产物水解后，释放出荧光物质，通过流式细胞仪对单个细菌荧光强度进行定量分析，从而实现单细菌水平两个目标蛋白相互作用的检测。

2.如权利要求1所述的一种蛋白相互作用的检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述报告细菌，是用于细菌双杂交的各种原核细菌。

3.如权利要求1或2所述的一种蛋白相互作用的检测方法，其特征在于所述报告细菌选自E.coli BTH101或E.coli DHM1。

4.如权利要求1所述的一种蛋白相互作用的检测方法，其特征在于在步骤3)中，所述报告基因选自编码内酰氨酶的bla或半乳糖苷酶的lacZ基因，参与组氨酸生物合成途径的HIS3基因和链霉素抗性基因aadA中的一种。

5.如权利要求1所述的一种蛋白相互作用的检测方法，其特征在于在步骤5)中，所述荧光底物为对应于各报告基因产物的相应荧光底物。

6.如权利要求1所述的一种蛋白相互作用的检测方法，其特征在于在步骤5)中，所述蛋白相互作用是通过检测荧光底物被报告基因产物水解后，释放出的荧光素，来达到检测蛋白相互作用的目的。

7.如权利要求1所述的一种蛋白相互作用的检测方法，其特征在于在步骤5)中，所述荧光底物的终浓度为10nM～1mM。

8.如权利要求1所述的一种蛋白相互作用的检测方法，其特征在于在步骤5)中，所述反应时间为1～240min，反应温度为4～80℃。

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