JP2681061B2 - 検出可能なシグナルのセンシタイザー誘導発生を利用したアッセイ - Google Patents
検出可能なシグナルのセンシタイザー誘導発生を利用したアッセイInfo
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- Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
- Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
Description
を用いる特異的結合アツセイに関する。
レクトロルミネセンス)またはエネルギー転移による
“励起(excitation)”時に励起した三重項状態にな
る。これらの化合物すなわち“センシタイザー”は種々
な他の化合物と相互して、エネルギーまたは熱をこれら
の他の化合物に移動させ、これによつてセンシタイザー
はその非励起状態すなわち基底状態に戻る。励起シンセ
タイザーとこれらの他の化合物との間の相互作用はある
条件下では監視および/または定量することのできる検
出可能な“シグナル”を発生させる。
を用いることが望ましい。
セイを開示する。サンプル中の分析物の存在のアツセイ
において特異性結合反応に用いられる特異性結合物質に
センシタイザーを取りつける場合に、シンセタイザーと
他の化合物との間の相互作用の結果として生ずるシグナ
ルはサンプル中の分析物の存在または量と相関しうる。
起に利用されるので、ラベルとしてのシンセタイザーの
利用はシンセタイザーからのシグナルを増幅するという
付加的な利点をもたらし、アツセイの感度を大きく高め
る。
類以上の波長の光線(radiation)または化学的もしく
は物理的刺激(例えば電子転移、電気分解、エレクトロ
ルミネセンスまたはエネルギー転移)によつて励起され
た時に励起状態に達し、(a)分子状酸素との次の反応
特に一重項分子状酸素を生ずるか、または(b)ロイコ
ダイ(leucodye)との次の反応時に還元形になり、次に
分子状酸素との反応によつて最初の状態に戻り、過酸化
水素を発生させる成分(moiety)を意味する。
他の反応物質の添加によつて、他の場合には生じないと
しても、検出可能なシグナルを生ずる。最初に、一重項
分子状酸素はオレフインと反応して(a)ジオキセタン
を形成し、ジオキセタンは加熱特に分解して検出可能な
フオトンを放出するか、または(b)ペルオキシドを形
成し、ペルオキシドは(i)加熱特に分解して検出可能
なフオトンを放出するかあるいは(ii)クロモゲンを酸
化して検出可能な変色もしくはフルオレセンスを生ず
る。第二に、酸化されたロイコダイは検出可能な変色ま
たはフルオレツセンスを生ずる。分子状酸素によつて還
元されたシンセタイザーのリサイクリングによつて生ず
る過酸化水素は検出可能な変色もしくはフルオレセンス
を生ずるクロモゲンの酸化の結果として、または検出可
能なフオトンを生ずる化学発光性成分の酸化の結果とし
て検出されうる。
およびロイコダイを含むアツセイキツトを開示する。
フインに対するシンセタイザーの使用を示す。
イの結果を示す。
によつてラベルする。このようなシンセタイザーは無制
限に、例えばメチレンブルー、ローダミン、ペリレン、
芳香族炭化水素(例えばピレン)、複素環式化合物、エ
オシン、遊離ポルフイリン、メタロポルフイリン、テト
ラフエニルポルフイン、フタロシアニンおよび種々なフ
ラビン誘導体のような大ていの染料を含む。特定のシン
セタイザーの例は“合成染料の化学(The Chemistry of
Synthetic Dye)"I〜IX巻、ケイ.ヴエンカタラマン
(K.Venkataraman)編集〔アカデミツク プレス(Acad
emic Press)、ニユーヨーク、1988〕および“一重項分
子状酸素(Singlet Molecular Oxygen)”、エイ.ポー
ル.シヤープ(A.Paul Schaap)編集〔ボーデン,ハツ
チソソン アンドロス(Bowden,Hutchinson and Ross)
1976〕(これはその全体において、ここに参考文献とし
て関係する)に述べられている。
合物質に結合させることができ、この方法には非限定的
にN−ヒドロキシスクシニミジルエステルリンカーの使
用、ジアミンの使用およびセンシタイザーの特異的結合
物質の構成ブロツク(例えばヌクレオチドまたはアミノ
酸)中への包含がある。シンセタイザーの特異的結合物
質への結合方法は用いる特異的結合物質の種類とシンセ
タイザーの種類とに依存する。
“シンセタイザー結合体”)はサンプル中の分析物の存
在に対する広範囲の特異的結合アツセイに有用である。
“存在”とはここでは分析物の特定的および/または定
量的検出を意味する。このようなアツセイは特異的結合
反応に関連してセンシタイザー結合体の使用によつて検
出可能な分析物を対象とする。これらのアツセイには非
限定的にイムノアツセイ、蛋白質結合アツセイ、核酸ハ
イブリツド化アツセイがある。
あり、サンプル中のその存在はアツセイ試薬によるその
免疫反応によつて検出される。典型的な蛋白質結合アツ
セイでは、サンプル中の分析物の存在は分析物のアツセ
イ試薬との特異的結合反応性(この反応性は免疫反応性
以外のものである)によつて測定される。この例は酸素
−基質認識およびアビジンのビオチンに対する結合親和
性である。典型的な核酸ハイブリツド化アツセイでは、
サンプル中の分析物の存在は分析物とアツセイ試薬との
ハイブリツド化反応によつて測定される。分析物核酸
(通常は二重鎖DNAまたはRNAとして存在)は通常、最初
に一重鎖形に転化され、キヤリヤー(例えばニトロセル
ロースペーパー)に固定される。この代りに、分析物核
酸をゲルマトリツクス中で電気泳動させることもでき
る。次に、固定された分析物を核酸の相補的配列によつ
てハイブリツド化する(すなわち、特異的に結合させ
る)。
ツトで実施することができる。これらのアツセイフオー
マツトは特異的結合物質に取付けられたセンシタイザー
を含むセンシタイザー結合体を用いる。“特異的結合物
質”とは、ここでは免疫反応、蛋白質結合反応、核酸ハ
イブリツド化反応および該物質が制限された種類の生物
学的、生化学的または化学的物質種と特異的に反応する
他の反応によつて特異的に反応する物質を意味する。こ
のカテゴリーのアツセイでは、センシタイザー結合体は
特異的結合反応に参加し、サンプル中の分析物の存在は
センシタイザー結合体を含む1種類以上の特異的結合反
応生成物の形成に比例する。適当な反応条件で必要な特
異的結合反応を生じさせることによつて、アツセイを実
施する。センシタイザー結合体を含む特異的結合反応生
成物の形成はシンセタイザー結合体を含むこのような生
成物の励起の結果として発生するシグナルを測定するこ
とによつて、またはこのような生成物中に含まれない、
反応しなかつたまたは不完全に反応したセンシタイザー
の励起の結果として発生するシグナルを測定することに
よつて評価される。
イ、コンペテイテイブアツセイ、表面抗原アツセイ、連
続飽和アツセイ、コンペテイテイブ置換アツセイおよび
クエンチングアツセイ(quenching assay)である。
イザーが結合する特異的結合物質は分析物と特異的に結
合することができる。このアツセイはさらに分析物と特
異的に結合して、反応物質−分析物−センシタイザー結
合体複合体を形成しうる反応物質を用いる。反応物質は
非限定的にデイツプ ステイツク(dipstick)、ビー
ズ、チユーブ、ペーパーまたはポリマーシートを含めた
固相に結合しうる。このような場合に、サンプル中の分
析物の存在は、特異的結合反応が終了した後に固相に結
合したシンセタイザーの励起の結果として発生したシグ
ナルに比例する。このようなアツセイ フオーマツト
は、ここに参考文献として関係する米国特許第4,652,53
3号、第4,383,031号、第4,380,580号、および第4,226,9
93号にさらに考察されている。
セイは分析物と特異的に結合して分析物−反応物質複合
体を形成し、センシタイザーが結合する特異的結合物質
と特異的に結合してセンシタイザー結合体−反応物質複
合体を形成しうる反応物質を用いる。この反応物質は固
相に結合する、またはこの代りに反応物質を含む反応生
成物が第2抗体の使用によつてもしくは他の公知の手段
によつて沈降される。このコンペテイテイブ フオーマ
ツトでは、分析物の存在は固相に結合したまたは沈殿に
含まれるセンシタイザーの励起の結果として生ずるシグ
ナルに“比例する”すなわち逆比例する。このアツセイ
フオーマツトの他の考察は上記米国特許中に認められ
る。
物学的、生化学的または化学的物質種上に生ずるかまた
はこれらに結合する。この種のフオーマツトは表面抗原
アツセイによつて説明される。このフオーマツトでは、
特異的結合物質は分析物と特異的に結合することがで
き、分析物の存在は反応生成物として形成される分析物
−センシタイザー結合体複合体に比例する。このことは
細胞上の表面抗原に特異的である抗体にセンシタイザー
を結合させることによつて説明される。細胞表面抗原の
存在は反応の終了後に細胞に結合したセンシタイザーの
励起の結果として発生するシグナルによつて示される。
細胞自体は細胞の表面に形成される分析物−センシタイ
ザー結合体複合体を未反応センシタイザー結合体から分
離するための過系と共に用いられる。これはさらに米
国特許第4,652,533号中で考察されている。
ペテイテイブ置換アツセイを含めた、技術上公知の他の
アツセイ フオーマツトに用いられ、これらの両アツセ
イはセンシタイザーが付着する特異的結合物質(1)と
分析物(2)の両方が反応物質と特異的に結合する場合
に、センシタイザーを用いる。連続飽和アツセイの場合
には、分析物が最初に反応物質と反応し、次にセンシタ
イザー結合体が残留する未反応の反応物質と反応する。
コンペテイテイブ置換アツセイの場合には、センシタイ
ザー結合体が既に反応物質と結合した分析物を競合的に
置換する。
は分析物と特異的に結合して、分析物−反応物質複合体
を形成し、またセンシタイザーが付着した特異的結合物
質と特異的に結合して、センシタイザー結合体−反応物
質複合体を形成しうる反応物質を用いる。クエンチング
成分は反応物質に付着させる。このクエンチング成分は
センシタイザーに密接に近接する場合に、結合したセン
シタイザーの励起の結果として発生するシグナルを減ず
るかまたは消滅させる、あるいは励起センシタイザーか
ら中間体種(すなわち分子状酸素またはロイコダイ)へ
の電子もしくはエネルギーの転移を減ずるかまたは消滅
させる。このクエンチングフオーマツトでは、分析物の
存在は分解するジオキセタンのルミネセンスに比例す
る。このフオーマツトに関するこの他の考察は、ここに
参考文献として関係する、米国特許第4,220,450号と第
4,277,437号に認められる。
するフオーマツトでは、アツセイ試薬を転化し反応させ
る順序は技術上周知であるように広範囲に変化しうる。
例えば、サンドイツチ アツセイでは、固相に結合した
反応物質はサンプル中に含まれる分析物と反応して、こ
の反応後に分析物複合体を含む固相を残りのサンプルか
ら分離する。この分離工程後に、センシタイザー結合体
は固相上の複合体と反応しうる。または、固相、サンプ
ルおよびセンシタイザー結合体を一緒に同時に加えて、
反応させた後に分離することができる。さらに他の、あ
まり好ましくない代替アツセイとして、サンプル中の分
析物とセンシタイザー結合体とを固相上の反応物質の添
加前に反応させることができる。コンペテイテイブ ア
ツセイ フオーマツトならびに技術上公知の他のフオー
マツトについても混合および反応工程の同様な変化が可
能である。特異的結合反応生成物の“適当な条件下で実
質的な形成を可能にする”とは、この場合に、アツセイ
試薬の添加および反応の順序の多くの種々な変化を含
む。
不均質アツセイでは、その形成がサンプル中の分析物の
存在に比例する反応生成物を他の反応生成物から分離す
る。分離は非限定的に過、ミクロ過、二重抗体沈
殿、遠心分離、サイズ排除クロマトグラフイー、サンプ
ル溶液からの固相の除去(例えば、デイツプステイツ
ク)または電気泳動による固相から液相の分離を含む何
らかの手段によつて実施することができる。例えば、サ
ンドイツチ アツセイでは反応物質−分析物−センシタ
イザー結合体複合体を未反応のセンシタイザー結合体か
ら分離することができる。表面抗原アツセイでは、分析
物−センシタイザー結合体複合体を未反応のセンシタイ
ザー結合体から分離する。コンペテイテイブ アツセイ
では、反応物質−センシタイザー結合体複合体を未反応
センシタイザー結合体から分離する。連続飽和アツセイ
とコンペテイテイブ置換アツセイでは、反応物質−セン
シタイザー結合体複合体を未反応センシタイザー結合体
から分離する。または、均質アツセイでは、反応生成物
を分離しない。アツセイ試薬を反応させた後に、アツセ
イ混合物が溶液中、固相上に存在するかまたはデイツプ
ステイツクもしくは他の固相サポートの種々な膜層の
間に分布しているとしても、このような混合物全体から
のシグナルを測定する。クエンチング アツセイは分離
が不必要である複合体均質アツセイ(complex homogene
ous assay)を説明する。いずれのカテゴリーのアツセ
イ フオーマツトも不均質または均質フオーマツトのい
ずれかを生じうることが考えられる。
3699.1号、1985年10月16日発行(公開第070,685号)に
よつて説明され、この特許出願は参考文献としてここに
関係する。この特許出願では、2種類のプローブを用
い、1種類のプローブは化学発光成分でラベルし、他方
のプローブは吸収剤/エミツタ(emitter)成分でラベ
ルする均質ハイブリツド化アツセイが開示されている。
このアツセイは固定方法を必要とせず、溶液中で実施さ
れる。本発明では、対立端部から読み取られる二重鎖DN
Aが好ましく選択される。一方の鎖はその励起状態が高
い化学発光量子収量を生ずる。他方の鎖は他方のラベル
によつて励起されるセンシタイザーによつて好ましくラ
ベルされる。この代りに、化学発光成分の代りに、重い
原子(IまたはBr)を含む化合物を用いることができ
る。このような重い原子を含む化学物がセンシタイザー
ラベルに密接に接近した場合に、インターシステム ク
ロツシング(intersystem crossing)によつて第2鎖上
のセンシタイザーレベルは弱いセンシタイザーから強い
センシングタイザーへ変えられる。
定にも利用される。DNAの既存の塩基配列決定には、4
種類の螢光染料が反応A、T、CおよびGの各々に対し
て1種類ずつ用いられる。本発明では、異なる励起波長
を有する4種類のセンシタイザーの各々は4フイルター
と共に用いられて、適当なセンシタイザーを連続的に励
起させることができる。
の存在が適当な光線(radiation)または他の刺激(例
えば電子転移、電気分解、エレクトロルミネセンスまた
はエネルギー転移)によるセンシタイザー励起によつて
検出される。次に、励起したセンシタイザーは次に“中
間物種(intermediary species)”(すなわち、分子状
酸素またはロイコダイ)と反応する。生成物と他の反応
は用いる中間物種に依存する。
酸素が生成し、センシタイザーはその本来の非励起状態
に戻る。次に一重項分子状酸素はオレフインと反応し
て、ジオキセタンまたはペルオキシドのいずれかを形成
する。オレフインは一般式: 〔式中、R1、R2、R3およびR4は何らかの基である〕 によつて特徴づけられる。R1、R2、R3および/またはR4
は場合によつては互いに結合して、例えば下記の構造式
(1)および(4)のような環または環様構造を形成す
ることもできる: 一定のオレフイン中の二重結合に最も近い、R1、R2、
R3およびR4の各々内の炭素原子(隣接炭素)の性質が、
オレフインと一重項分子状酸素との反応時にジオキセタ
ンまたはペルオキシドのいずれかが形成されるかを決定
する。隣接炭素のすべてが(a)ブリツジヘツド(brid
gehead)であるかまたは(b)水素原子を有さないなら
ば、ジオキセタンが形成される。例えば、 加熱時に、ジオキセタンは分解して検出可能なフオト
ンを生ずる。例えば: 置換基の中に電子ドナー基を有する置換オレフインは
分解時に量子収量(quantum yield)の大きいジオキセ
タンを生ずるので、本発明の実施に好ましい。R1、とR2
および/またはR3とR4は結合して、螢光性である環状成
分を形成することが好ましい。例えば、構造式(1)で
は、R1とR2はN−メチルアクリダンを形成する。オレフ
インの“一端”が螢光性成分を有すると、生成するジオ
キセタンからの量子収量はさらに増加する。
く、(b)少なくとも一つの水素原子を有するならば、
ペルオキシドが形成される。加熱時に、ジオキセタンは
分解して、検出可能な(弱いが)フオトンを放出する。
この代りに、ペルオキシドを用いてクロモゲンを酸化し
て、検出可能な変色または螢光を生ずることもできる。
イザーはロイコダイによつて還元される。酸化されたロ
イコダイは目視可能になり、生ずる変色または螢光によ
つて検出可能になる。還元されたセンシタイザーは分子
状酸素とも反応して、過酸化水素を生成して、センシタ
イザーはその本来の非励起状態に戻る。過酸化水素を用
いてクロモゲンを酸化して、検出可能な変色または螢光
を生ずるかまたは化学発生成分を酸化して検出可能なフ
オトンを形成することもできる。ロイコダイはその還元
形では無色であるが、酸化時に着色される染料(例えば
ヒドロキシアントラキノンおよびメチレンブルー)であ
る。ロイコダイの例は“合成染料の化学(The Chemistr
y of Synthetic Dycs)"I〜IX巻、ケイ.ベンカタラマ
ン編集(アカデミツク プレス,ニユーヨーク 1978)
および“一重項分子状酸素(Singlet Molecular Oxyge
n)”エイ.ポール シヤープ(ボーデン,ハツチンソ
ンおよびロス,1976)に述べられている、これらは参考
文献としてここに関係する。
するので、上記反応によつて発生するシグナル(すなわ
ち、フオトンまたは変色または螢光)もサンプル中の分
析物の存在または量に相関しうる。
“クロモゲン”は技術上周知である。変色を生ずる、適
当な“クロモゲン”には、非限定的にベンジジンとベン
ジジン誘導体がある。螢光を生ずる適当な“クロモゲ
ン”には、非限定的にフルオレシン(すなわち、ジヒド
ロフルオレセイン)とその誘導体がある。
な場合に、特異的結合反応生成物(その形成がサンプル
中の分析物の存在に比例する)を他の反応生成物から分
離する作用、特異的結合反応生成物中に含まれるセンシ
タイザー結合体の励起、他の試薬(すなわちオレフイ
ン、ロイコダイ、クロモゲンまたは化学発光性成分)の
添加および/または分解を誘発するためのジオキセタン
またはペルオキシドの加熱、何らかの手段(すなわち、
目視、吸光度、反射率、螢光測定)による変色または螢
光の測定を含む。また、本発明により、次の要素: 特異的結合物質に結合したセンシタイザーから成るセ
ンシタイザー結合体を含む第1バイアル;および オレフィンまたはロイコダイを含む第2バイアル から成る特異的結合アッセイキットである製品が提供さ
れる。
挙げられる: センシタイザーを染料、ポリフイリン、メタロポルフ
イリン、芳香族炭化水素、およびフラビン誘導体から成
る群から選択する上記の製品; 第2バイアルがオレフインを含む上記の製品; オレフインが置換オレフインである上記の製品; 置換オレフインが電子ドナー基である少なくとも1個
の置換基を含む上記の製品; 置換オレフインの少なくとも2個の置換基が結合し
て、螢光性である環状成分を形成する上記の製品; 置換オレフインが式: で示される上記の製品; 第2バイアルがロイコダイを含む上記の製品: また、本発明は、特異的結合物質に結合したセンシタ
イザーから成るセンシタイザー結合体を開示する。上記
のセンシタイザー結合体の実施態様としては以下のもの
が挙げられる: センシタイザーを染料、ポリフイリン、メタロポルフ
イリン、芳香族炭化水素、複合環式化合物およびフラビ
ン誘導体から成る群から選択する上記センシタイザー結
合体; センシタイザーがピレンまたはメチレンブルーである
上記センシタイザー結合体; センシタイザーがプロトポルフイリンジメチルエステ
ル、プロトポルフイリン二ナトリウム塩、メチルピロポ
ルフインエチルエステル、メチルピロポルフイン、テト
ラフエニルポルフイン、コーポルフイリンまたはヘマト
ポルフイリンである上記センシタイザー結合体; センシタイザーがフタロシアニン、ヘミンまたはロー
ダミンである上記センシタイザー結合体; 特異的結合物質がA、T、CまたはGのいずれかと特
異的に結合する上記センシタイザー結合体; 特異的結合物質がポリヌクレオチドセグメントに特異
的に結合する上記センシタイザー結合体; 特異的結合物質が蛋白質または蛋白質複合体と特異的
に結合する上記センシタイザー結合体; 特異的結合物質が抗体であるか、または抗体フラグメ
ントを含む上記センシタイザー結合体: 例I センシタイザー結合体を形成するために、下記に示す
ように、ピレン酪酸をキナーゼ合成オリゴヌクレオチド
(20塩基;配列:5′−TTCAATCATGCGAAACGATC−3′)の
5′末端ホスフエートにヘキサンジアミンリンカーを介
して付着させた: オリゴヌクレオチドは自動合成装置〔アプライド バ
イオシステムス(Applied Biosystems)、フオスターシ
テイ、CA94404、から商業的に入手可能、モデル 380
B〕で合成した。
−イミダゾール緩衝液(pH7.8)中の0.1M 1−エチル
−3,3−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド(CDI)
による室温における激しく振とうしながらの1時間の処
理によつて、5′−ホスホルイミダゾリドに転化した。
生成物を0.25M ヘキサンジアミン(pH7.8)による50℃
における1時間の処理によつて、5′−ヘキサンジアミ
ンアダクツに転化した。
ダゾール緩衝液(pH7.8)中のそのN−ビドロキシスク
シニミジルエステルとしての0.25M ピレン酪酸と室温
において反応させることによつて、ピレン(センシタイ
ザー)ラベルドオリゴヌクレオチド(pyrene(sensitiz
er)−labelled oligonucleotide)を形成した。
リダン〔上記構造式(1)〕は次のように合成した。N
−メチルアクリダン(15.2g、0.074モル)と五硫化リン
(10.3g、0.046モル)とを乾燥ピリジン(470ml)中で
混合し、1時間還流させた。溶液を冷却した後、赤色結
晶を回収した。キシレンからの再結晶によつて、N−メ
チルアクリドン−エチオン12.5gを得た。
−トリルヒドラゾンとトリフエニルホスフインとを乾燥
水素化ナトリウムに加え、混合物を120℃に20分間加熱
した。N−メチルアクリドンエチオンを反応混合物に加
え、新しい混合物を2時間還流させた。溶液を冷却し、
回収した固体をキシレンから再結晶した。得られた生成
物をシリカゲル上でクロマトグラフイーし、トルエンで
溶出した。最初のフラクシヨン(Rf0.8)を回収した。
トルエンを蒸発させ、得られた9−(アダマンチリデ
ン)−N−メチルアクリダンをアセトンから再結晶し
た。
技術上周知の方法でナイロンフイルター〔アマーシヤム
(Amersham)英国からハイボンド(Hybond)として商業
的に入手可能〕上に固定した。プローブとしてセンシタ
イザーラベルドオリゴヌクレオシドを用いる標準サザン
ブロツト法において、相補的オリゴヌクレオチド〔ソ
ルネオ(Sorneo)〕と非相補的(すなわち対照)オリゴ
ヌクレオチド(pAT 153)を標的として用いた。標的オ
リゴヌクレオチドを0.2μg、0.02μgおよび0.002μg
濃度において分析した。サンプルを2×2cmスポツトに
集中させた。ハイブリツド化はハイブリツド化緩衝液
〔6×SSC、0.5% SDS、110×デンハルツ(Denhardt
s)〕中でセンシタイザーラベルドオリゴヌクレオチド2
00μg/mlによつて37℃において2時間実施し、洗浄は通
常のやり方で実施した。
エン中1×10-6M 9−(アダマンチリデン)−N−メ
チルアクリダン50μを各ハイブリツド化スポツトに加
えた。各スポツトに周囲分子状酸素の存在下で紫外線源
(150Wキセノンアークランプ)を10分間照射した。スポ
ツトの半数は照射直後に100℃に加熱して、照射時に形
成されたジオキセタンの分解を誘発した。
EMI(Thorn EMI)から商業的に入手可能、タイプ9813
QB〕を用いて測定し、光電子増倍管は標準的な熱電冷却
ハウジング内で0℃に保持した。測定すべきサンプルを
加熱ブロツク上の光を通さない室に入れた。加熱台(he
ating platen)内に設けた熱電対が加熱台の直下の加熱
要素の温度制御(30〜300℃の範囲内で±0.1℃)を可能
にした。また、サンプルセルを密封シールして、好まし
い雰囲気下での測定を可能にした。
プロトコールによつて得られたが、加熱は強いシグナル
を生じ、相補的標的は対照標的よりも大きいカウントを
生じた。このアツセイ方法を改良する手段(例えば、各
種試薬のより良好な洗浄、オレフインの自然酸化を減ず
るための抑制剤の添加、より効果的なセンシタイザーの
使用、センシタイザーによつて吸光される主な波長に適
したフイルターの使用、照射中のスポツトの冷却、加熱
速度の調節および/または最適化、反応性の大きいオレ
フインの使用、発光性の大きいジオキセタンを生ずるオ
レフインの使用および一重項酸素の移動を促進する溶媒
の使用)は当業者によつて容易に認識されるであろう。
ドオリゴヌクレオチドに対して用いた。ポルフイリン
(センシタイザー)ラベルドオリゴヌクレオチドは下記
に示すN6−(6−アミノヘキシル)dATP(以降ではAHdA
TP)を用いて形成される: DNAにAHdATPの存在下で公知のやり方でのニツク翻訳
を実施して露出NH2官能基を有するDNA鎖を形成した。こ
の生成物をNHSエステル−ポルフイリン結合体とDMA−H2
Oの存在下で公知のやり方で反応させて、 ポルフイリンラベルが付加したDNA鎖を形成した。
ポルフイリン二ナトリウム塩を用いてくり返した。dCT
P、dGTPおよびdTTP(20μM)の5μを試験DNP(pU
G)1μ、0.4mM AHdATP 3μおよびH2O10μに
加えた。短時間混合した後に、DNAポリメラーゼI 5
μを加えた。次に混合物を15℃において60分間インキ
ユベートした。包含(incorporation)を公知のやり方
で監視した。アミノヘキサル基によつてラベルしたDNA
を包含されないヌクレオチドからセフアデツクス(Seph
adex)G−50カラム上での排除クロマトグラフイー(1
×5SC 0.1% SDS含有によつて溶出)によつて分離し
た。フラクシヨンを回収し、次にEtOH沈降を実施した。
NHSエステル−プロトポルフイリンを用いた例IIによる
反応後に、例Iに従つてプローブアツセイを実施した。
DNAをナイロンフイルターに固定した。例Iによるプロ
ーブとしてセンシタイザーラベルドオリゴヌクレオチド
を用いた標準サザン ブロツト法に標的として相補的オ
リゴヌクレオチドを用いた。生成したスポツトを照射直
後に100℃に加熱し、照射によつて形成されたジオキセ
タンの分解を誘発した。
と32Pとを用いて、例IIIをくり返して、これらの2ラベ
ルを用いたアツセイの感度を比較した。DNAポリメラー
ゼI 5μを加える前の例IIIの混合物に32P−dCTP
1μを加えた。次の濃度の標的DNAに対してアツセイ
を実施した: 100μg 10μg 1μg 0.1μg 0.01μg 0.005μg ブランク 100℃における1分間のスポツト加熱に関する第2図
に示した結果は上記アツセイにおける標的DNAの検出限
界が0.005μgであることを示す。この代りに32Pラベル
の場合には、標準フイルム検出系での24時間暴露時間が
匹敵する検出限界を示した。
グラウンドを減ずることは試みなかつた。一般的なペル
オキシドの形成を含めたバツクグラウンド物質に対する
励起波長とは異なる特定波長に対する感度によつて、セ
ンシタイザーを選択した。例えば、メチレンブルーまた
はピレンをセンシタイザーとして用いて、これらのセン
シタイザーを励起させる波長のみが一重項酸素を発生さ
せるように、励起フイルターを組入れることができる。
膜を加熱すると、一般的ペルオキシドの加熱からのバツ
クグラウンド光線が発生しうる。低温によるジオキセタ
ン分解の誘発は、特にこのような温度がバツクグラウン
ド光線を発生させる温度よりも非常に低い場合に、バツ
クグラウンド読取り値の低下に役立つ。結局、バツクグ
ラウンドとは異なる波長で発光するジオキセタンを形成
するようにオレフインを選択すべきである。発光フイル
ター(emission filter)をバツクグラウンドを減ずる
ように選択することもできる。上記その他の改良がセン
シタイザーラベルドアツセイの感度を有意に高めること
が考えられる。上記説明の他に、センシタイザーラベル
はDNA塩基配列決定にも利用可能である。現在のDNA塩基
配列決定では、A、T、CおよびGに対する各反応に対
して、1種類ずつ、4種類の染料が用いられる。本発明
では各々異なる励起波長を有する4種類のセンシタイザ
ーを4フィルターと共に用いて、適当なセンシタイザー
を励起させることができる。
変更が、本発明の精神および範囲から逸脱することな
く、なされうることは当業者に明らかであると考えられ
る。従つて、本発明はその精神または本質的な特徴から
逸脱せずに、他の特定の形式においても具体化すること
が可能である。それ故、本発明の実施態様および例はす
べてに関して説明と見なすべきであり、限定と見なすべ
きではない、本発明の範囲は上記説明によるよりもむし
ろ請求の範囲によつて示されるものであり、従つて請求
項に等しい意味と範囲に含まれる、すべての変化は本発
明に包含されることになる。
Claims (28)
- 【請求項1】(i)特異的結合物質に結合したセンシタ
イザーから成るセンシタイザー結合体を利用する;およ
び (ii)サンプル中の分析物の存在が前記センシタイザー
結合体を含む、1種類以上の特異的結合反応生成物の形
成に比例することから成る、サンプル中の分析物の存在
に対する特異的結合アッセイであって、次の段階: 適当な条件下で、前記センシタイザー結合体を含む1種
類以上の特異的結合反応生成物の実質的な形成を可能に
する段階; 適当な条件下において、(A)(i)前記センシタイザ
ー結合体を含む前記1種類以上の特異的結合反応生成物
中に含まれるセンシタイザーまたは(ii)前記1種類以
上の特異的結合反応生成物中に含まれないセンシタイザ
ー結合体中に含まれるセンシタイザーを励起させ、
(B)(i)前記センシタイザー結合体を含む前記1種
類以上の特異的結合反応生成物中に含まれる励起センシ
タイザーまたは(ii)前記1種類以上の特異的結合反応
生成物中に含まれないセンシタイザー結合体中に含まれ
た励起センシタイザーを分子状酸素と反応させて、検出
可能なシグナルを発生させるための反応に適した一重項
分子状酸素を形成する段階;および 前記検出可能なシグナルを測定する段階 から成る特異的結合アッセイ。 - 【請求項2】前記特異的結合物質が分析物と特異的に結
合可能であり、前記1種類以上の特異的結合反応生成物
が分析物−センシタイザー結合体複合体である請求項1
記載の特異的結合アッセイ。 - 【請求項3】(i)前記分析物と特異的に結合して、分
析物−反応物質複合体を形成することができ、また(i
i)前記特異的結合物質と特異的に結合して、センシタ
イザー結合体−反応物質複合体を形成することができる
反応物質をさらに用いることを含み、前記第1種類以上
の特異的結合反応生成物が前記センシタイザー結合体−
反応物質複合体である請求項1記載の特異的結合アッセ
イ。 - 【請求項4】前記特異的結合物質が前記分析物と特異的
に結合することができ、前記アッセイがさらに前記分析
物と特異的に結合して反応物質−分析物−センシタイザ
ー結合体複合体を形成しうる反応物質を用いることを含
み、前記1種類以上の特異的結合反応生成物が前記反応
物質−分析物−センシタイザー結合体複合体である請求
項1記載の特異的結合アッセイ。 - 【請求項5】前記センシタイザーを染料、ポルフイリ
ン、メタロポルフイリン、芳香族炭化水素、複素環式化
合物およびフラビン誘導体から成る群から選択する請求
項1記載の特異的結合アッセイ。 - 【請求項6】前記センシタイザーがピレンまたはメチレ
ンブルーである請求項5記載の特異的結合アッセイ。 - 【請求項7】前記ポルフイリンがプロトポルフイリンジ
メチルエステル、プロトポルフイリン二ナトリウム塩、
メチルピロポルフインエチルエステル、メチルピロポル
フイン、テトラフエニルポルフイン、コーポルフイリン
またはヘマトポルフイリンである請求項5記載の特異的
結合アッセイ。 - 【請求項8】前記センシタイザーがフタロシアニン、ヘ
ミンまたはローダミンである請求項5記載の特異的結合
アッセイ。 - 【請求項9】前記一重項分子状酸素がオレフインと反応
して、ジオキセタンおよびペルオキシドから成る群から
選択された成分を形成する請求項1記載の特異的結合ア
ッセイ。 - 【請求項10】前記成分が加熱時に分解して、前記検出
可能なシグナルをフオトンとして発生させる請求項9記
載の特異的結合アッセイ。 - 【請求項11】前記ペルオキシドがクロモゲンを酸化し
て、前記クロモゲンによる変色または螢光として前記検
出可能なシグナルを発生させる請求項9記載の特異的結
合アッセイ。 - 【請求項12】前記オレフインが置換オレフインである
請求項9記載の特異的結合アッセイ。 - 【請求項13】前記置換オレフインが電子ドナー基であ
る少なくとも少なくとも1個の置換基を有する請求項12
記載の特異的結合アッセイ。 - 【請求項14】前記置換オレフインの置換基の少なくと
も2個が結合して、螢光性である環状成分を形成する請
求項12記載の特異的結合アッセイ。 - 【請求項15】(i)特異的結合物質に結合したセンシ
タイザーから成るセンシタイザー結合体を利用する;お
よび(ii)サンプル中の分析物の存在が前記センシタイ
ザー結合体を含む、1種類以上の特異的結合反応生成物
の形成に比例することから成る、サンプル中の分析物の
存在に対する特異的結合アッセイであって、次の段階: 適当な条件下で、前記センシタイザー結合体を含む1種
類以上の特異的結合反応生成物の実質的な形成を可能に
する段階; 適当な条件下において、(A)(i)前記センシタイザ
ー結合体を含む前記1種類以上の特異的結合反応生成物
中に含まれるセンシタイザーまたは(ii)前記1種類以
上の特異的結合反応生成物中に含まれないセンシタイザ
ー結合体中に含まれるセンシタイザーを励起させ、
(B)(i)前記センシタイザー結合体を含む前記1種
類以上の特異的結合反応生成物中に含まれる励起センシ
タイザーまたは(ii)前記1種類以上の特異的結合反応
生成物中に含まれないセンシタイザー結合体中に含まれ
た励起センシタイザーをロイコダイと反応させて、検出
可能なシグナルを発生させる段階;および 前記検出可能なシグナルを測定する段階 から成る特異的結合アッセイ。 - 【請求項16】前記特異的結合物質が分析物と特異的に
結合可能であり、前記1種類以上の特異的結合反応生成
物が分析物−センシタイザー結合体複合体である請求項
15記載の特異的結合アッセイ。 - 【請求項17】(i)前記分析物と特異的に結合して、
分析物−反応物質複合体を形成することができ、また
(ii)前記特異的結合物質と特異的に結合して、センシ
タイザー結合体−反応物質複合体を形成することができ
る反応物質をさらに用いることを含み、前記1種類以上
の特異的結合反応生成物が前記センシタイザー結合体−
反応物質複合体である請求項15記載の特異的結合アッセ
イ。 - 【請求項18】前記特異的結合物質が前記分析物と特異
的に結合することができ、前記アッセイがさらに前記分
析物と特異的に結合して反応物質が−分析物−センシタ
イザー結合体複合体を形成しうる反応物質を用いること
を含み、前記1種類以上の特異的結合反応生成物が前記
反応物質−分析物−センシタイザー結合体複合体である
請求項15記載の特異的結合アッセイ。 - 【請求項19】前記センシタイザーを染料、ポルフイリ
ン、メタロポルフイルン、芳香族炭化水素、複素環式化
合物およびフラビン誘導体から成る群から選択する請求
項15記載の特異的結合アッセイ。 - 【請求項20】前記センシタイザーがピレンまたはメチ
レンブルーである請求項19記載の特異的結合アッセイ。 - 【請求項21】前記ポルフイリンがプロトポルフイリン
ジメチルエステル、プロトポルフイリン二ナトリウム
塩、メチルピロポルフインエチルエステル、メチルピロ
ポルフイン、テトラフエニルポルフイン、コーポルフイ
リンまたはヘマトポルフイリンである請求項19記載の特
異的結合アッセイ。 - 【請求項22】前記センシタイザーがフタロシアニン、
ヘミンまたはローダミンである請求項19記載の特異的結
合アッセイ。 - 【請求項23】ロイコダイを酸化して、前記ロイコダイ
による変色または螢光として、前記検出可能なシグナル
を発生させる請求項15記載の特異的結合アッセイ。 - 【請求項24】励起センシタイザーが前記ロイコダイに
よって還元され、次に分子状酸素との反応によって酸化
されて過酸化水素を形成する請求項15記載の特異的結合
アッセイ。 - 【請求項25】前記過酸化水素がクロモゲンを酸化し
て、前記クロモゲンによる変色または螢光として前記検
出可能なシグナルを発生させる請求項24記載の特異的結
合アッセイ。 - 【請求項26】前記過酸化水素が化学発光性成分を酸化
して、フォトンとして前記検出可能なシグナルを発生さ
せる請求項24記載の特異的結合アッセイ。 - 【請求項27】次の要素: 特異的結合物質に結合したセンシタイザーから成るセン
シタイザー結合体を含む第1バイアル;および オレフインまたはロイコダイを含む第2バイアル から成る特異的結合アッセイキットである製品。 - 【請求項28】前記センシタイザー結合体が第1一重鎖
ポリヌクレオチドセグメントに結合したセンシタイザー
から成り、前記アッセイが第2一重鎖ポリヌクレオチド
セグメントに結合した化学発光性成分から成る化学発光
性成分結合体をさらに用いることを含み、前記第1およ
び第2ポリヌクレオチドセグメントが標的一重鎖ポリヌ
クレオチドの相互に排他的部分に対して相補的であり、
標的一重鎖ポリヌクレオチドによるハイブリッド化時
に、化学発光性成分とセンシタイザーとが互いに充分に
接近して、化学発光性成分からセンシタイザーを励起さ
せるためのエネルギー転移を可能にすることから成る請
求項1〜15のいずれかに記載の特異的結合アッセイ。
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