JPH04244085A - 蛍光性化合物、錯体、試薬および該試薬を用いる特異的結合アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、蛍光測定に用いられる
新規な蛍光性化合物、該蛍光性化合物を配位子とする錯
体、該蛍光性化合物部分を有する試薬、および、該試薬
を用い、蛍光分析法、特に時間分解蛍光分析法にて蛍光
強度の測定を行なう特異的結合アッセイに関する。

【０００２】

【従来の技術】生体試料中の標的物質を定性的または定
量的に測定するに際し、該標的物質に競合または特異的
に結合する物質であって特定の信号を発する標識剤が結
合せられた物質を用いる技術は、従来からよく知られて
いる。特に、抗原抗体反応や核酸のハイブリダイゼーシ
ョンに基礎をおく測定方法は、微量物質を感度良く測定
することが可能であるため、極めて有用である。

【０００３】これらの方法では、標識剤が結合せられた
物質を、直接または間接的に標的物質と結合させ、ある
いは、標的物質またはその類縁物質に標識剤を結合せし
めた物質を標的物質と競合させ、その後、標識からの信
号強度を測定することにより、存在する標的物質の有無
あるいは量、濃度を測定するものである。

【０００４】このような用途に用いられる標識剤のひと
つとして、放射性同位体が知られており、放射性同位体
の使用により、標的物質を高い測定感度で検出すること
が可能となった。しかし、放射性同位体は、その貯蔵、
使用、処理に際して危険を伴なうという大きな欠点があ
るため、標識剤としての放射性同位体の使用は年々減少
する傾向にある。そして、近年になり、放射性同位体に
替って非放射性の標識剤の使用が急激に増加している。

【０００５】非放射性標識剤の代表的なもののひとつと
して、酵素標識剤があり、特に、免疫測定法においては
、酵素標識剤を使用する方法が多く用いられるようにな
ってきた。しかしながら、酵素標識剤の使用には、いく
つかの大きな問題がある。

【０００６】すなわち、酵素は温度等の外的環境に影響
されやすくて不安定であるため、酵素標識剤を用いた測
定結果の再現性が低いこと、市販されている酵素が概し
て高価であること等が挙げられる。また、免疫測定法に
おいては、酵素標識剤は標的物質と競合あるいは特異的
に結合する特異的結合体に結合されて用いられるが、致
命的な欠点として、酵素標識剤を特異的結合体に結合さ
せることにより、酵素および特異的結合体の活性が低下
してしまうことが挙げられる。

【０００７】酵素以外の非放射性標識剤としては、蛍光
物質が挙げられる。そして、従来から標識剤として使用
されてきた蛍光物質としては、フルオレセイン、ローダ
ミン、ダンシルクロライド、ウンベリフェロン等が挙げ
られる。

【０００８】蛍光物質を標識剤として使用する測定法は
、蛍光現象、すなわち、ある励起光の照射により、ある
化合物がその化合物の電子準位に基づく固有の放射光を
発する現象を利用した測定方法であり、原理的には高感
度が期待できる方法である。しかし、この蛍光物質の標
識剤としての使用にも問題がある。

【０００９】そのひとつは、励起光が引き起こすレイリ
ー散乱によってバックグラウンドノイズが発生してしま
うことである。さらに、血清、尿等の生体試料中に存在
する標的物質を測定する際には、標識剤以外の物質に由
来する多くの蛍光が、標識剤に由来する蛍光の検出を大
きく妨害してしまうという問題もある。

【００１０】これらの問題点の原因としては、一般に、
従来から使用されている蛍光物質は、ストークスシフト
が小さいこと、バックグラウンド蛍光から標識剤由来の
蛍光を区別するための特別な性質が存在しないこと等が
挙げられる。このような問題が解決されるならば、蛍光
物質を標識剤として用いることは、分析分野において極
めて有力な手段となり得る。

【００１１】ところで、近年になり、ある種の配位子と
希土類金属イオンにより形成される錯体が強い蛍光を発
することが見いだされた。この場合、励起光は配位子に
より吸収され、そのエネルギーが配位子の励起三重項状
態から希土類金属イオンに移動することにより、該希土
類金属イオンのｆ軌道電子の遷移に基づく蛍光が観測さ
れるのである。なお、希土類金属としてはユウロピウム
、テルビウム、サマリウム等が例示され、これら希土類
金属自体も、固有の蛍光を有している。

【００１２】このような錯体において、励起波長は配位
子の種類に依存し、発光波長は希土類金属の種類に依存
する。そして、このような錯体由来の蛍光は、そのスト
ークスシフトが少なくとも１００ｎｍ　以上あり、しか
も、バックグラウンド蛍光の原因となる蛋白質等に由来
する蛍光の寿命が約１０ｎｓであることに比較して、そ
の蛍光寿命は　１μｓ　以上のオーダーと非常に長い。 従って、この性質を利用すれば、前記錯体由来の蛍光を
他のバックグラウンド蛍光から完全に分離することが可
能であるため、希土類金属を中心金属イオンとする蛍光
性錯体は、標識剤として好ましいものである。

【００１３】希土類金属イオンと共に錯体を形成する化
合物は、既にそのいくつかが公知である。

【００１４】そのひとつとして、ユウロピウムイオン、
サマリウムイオンと共に錯体を形成するβ−ジケトンが
挙げられる。

【００１５】この錯体については、β−ジケトンは、２
価の配位子であり、ユウロピウムイオンには通常３分子
以上で配位することをはじめとして、諸性質が報告され
ている（Ｋｒｉｓｈｎａ　Ｃ．　Ｊｏｓｈｉ　ｅｔ　ａ
ｌ．，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｆｌｕｏｒｉｎｅ　Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ，　１３，　ｐ．２６１−２６５，　
　１９７９；　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ　Ｓ．　Ｅ．　
ｅｔ　ａｌ．，　Ａｕｓｔ．　Ｊ．　Ｃｈｅｍ．，　２
９，　ｐ．１８４５−１８５０，　１９７６；黄　　漢
国ら、日本化学会誌、１、６６−７３、１９８１等）　
。

【００１６】また、このような錯体を標識剤として利用
する試みとして、特公昭６２−１８８６８号公報には、
β−ジケトンとユウロピウムイオンまたはテルビウムイ
オンによって形成された錯体を結合させた抗体について
の記載がある。

【００１７】しかし、β−ジケトン−希土類金属イオン
錯体の安定性は低く、実際の測定条件下においては、測
定終了時まで錯体状態を維持できないので、これを、免
疫測定法等における標識剤として使用することはきわめ
て困難である。

【００１８】また、希土類金属イオンとＥＤＴＡにより
形成される錯体についても、Ｎａｋａｔａｎｉ　Ｈ．　
らの報告（Ｔｈｅ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｐｈｙｓｉｃ
ａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ，　４２
，ｐ．１０３−１０７，　１９７２）等、数多くの報告
がある。

【００１９】そして、このような錯体を標識剤として利
用する試みのひとつとして、特開昭６０−５００７６７
号公報に、ランタニドイオンと強力に配位結合するとと
もに、該錯体を抗原や抗体に結合させることのできる官
能基を有するＥＤＴＡ誘導体についての記載がある。

【００２０】しかし、ＥＤＴＡ−希土類金属イオン錯体
は、錯体自体の安定度は優れているが、錯体となっても
蛍光増幅性がないという致命的な欠点がある。すなわち
、ＥＤＴＡ−希土類金属錯体においては、ＥＤＴＡにエ
ネルギーの吸収伝達能力がなく、かつ、この希土類金属
由来の蛍光は強度がきわめて小さいので、前記した従来
から使用されてきた蛍光物質を使用した場合と同様の欠
点がある。

【００２１】また、Ｅ．　Ｓｏｉｎｉ、Ｉ．　Ｈｅｍｍ
ｉｌｅらは、特開昭５７−１８６１７０号で、非蛍光性
の錯形成性化合物と蛍光性の錯形成性化合物の２種類を
用い、それらの間で金属イオンを移動させることにより
、最終的に得られる蛍光強度を高める方法を開示してい
る。具体的には、金属の錯形成能は強いが、ほとんど蛍
光を発することのないＥＤＴＡ類縁体を標識剤とする標
識特異的結合体を用い、特異的結合反応を行なわせた後
、ミセル形成化剤及び前記金属と共に蛍光性錯体となる
錯形成性化合物を添加し、ＥＤＴＡ類縁体から分離され
た金属イオンと蛍光性の錯形成性化合物とで、液相中に
て、新たな蛍光性錯体を形成させるものである。

【００２２】このような　Ｓｏｉｎｉ、Ｈｅｍｍｉｌｅ
　らの方法における重大な欠点は、２種類の錯形成性化
合物間で金属イオンを移動させるため、この反応系に関
与していないはずの金属イオンが反応系に加わる、すな
わちコンタミネーションを起こす可能性が極めて高い点
にある。したがって、測定に際しては、外界からの金属
イオンのコンタミネーションを防ぐため、試薬、装置の
みならず、使用する全ての器具や実験環境に細心の注意
を払う必要がある。

【００２３】また、より改良された蛍光性化合物として
、　Ｄｉａｍａｎｄｉｓ　Ｅ．　Ｐ．らの報告（Ｃｌｉ
ｎ．　Ｃｈｅｍ．，　３３，　ｐ．２０００，　１９８
７；　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ
ａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　１１２，　ｐ．４３，　１９
８８）中にみられる４，７−ビス（クロロスルフォフェ
ニル）−１，１０−　フェナンスロリン−２，９−　ジ
カルボン酸があり、特開昭６４−４７９５２号には、こ
の蛍光性化合物で標識された牛血清アルブミン（ＢＳＡ
）を抗体に結合する方法、および、この蛍光性化合物で
標識されたアビジンとビオチン標識された抗体をアビジ
ン・ビオチン結合で結合させる方法、すなわち中間体を
介在させた方法が記載されている。

【００２４】Ｄｉａｍａｎｄｉｓ　らのこの蛍光性化合
物の特徴は、フェナンスロリン環の窒素原子側で希土類
金属イオンに配位し、スルフォニルクロライド基により
蛋白質のアミノ基と結合することにあるが、該化合物と
希土類金属イオンとで形成される錯体の安定度は期待さ
れるよりも小さい。さらに、該化合物は、その立体構造
から考えても理解されることであるが、水性溶媒中にお
いて蛍光を測定する場合に常に懸念される水分子による
蛍光消光作用を完全に取り除くようには設計されていな
い。

【００２５】従って、この蛍光性化合物を用いる場合は
、免疫反応中常に、または免疫反応終了後に、大過剰の
金属イオンを添加しなければならず、かつ、蛍光測定に
際して抗体等が固定化してある固相を乾燥させなければ
ならないという問題がある。さらに、この蛍光性化合物
と希土類金属イオンにより形成された錯体の示す蛍光強
度は、期待されるほど強いものではないため、前記特開
昭６４−４７９５２号に開示されているように、特異的
結合体である抗体とこの蛍光性化合物との間にＢＳＡや
アビジン等の蛋白質を介在させ、抗体１分子当りの標識
数をかなり増大させなければ、実用的な測定感度は達成
できないという問題もある。

【００２６】さらに、Ａｌｐｈａ　Ｂ．らやＢｌａｓｓ
ｅ　Ｇ．　は、クリプタンドと希土類金属イオンによっ
て形成される錯体の蛍光について述べている（Ａｎｇｅ
ｗ．　Ｃｈｅｍ．　Ｉｎｔ．　Ｅｄ．　Ｅｎｇｌ．，　
２６，　ｐ．２６６−２６７，　１９８７；　Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，　１，　ｐ．
２９４−３０１，　１９８９）。

【００２７】クリプタンドは、錯体としての安定度や蛍
光性において比較的好ましい性質を有している化合物で
あるが、その基本構造中に、蛋白質と結合するための官
能基を導入することが困難であるという問題がある。ま
た、クリプタンドの基本構造の中心に金属イオンが取り
込まれてしまえば、形成された錯体は安定であるが、該
錯体を形成させる工程、すなわちキレート化させる工程
として、高温で長時間反応させる等の操作を組み込まな
ければならない等の問題もある。

【００２８】前述の公知の化合物の他にも、キレート剤
となり得る大環状化合物として、例えば、クラウンエー
テルや大環状ポリアミン等の化合物が知られている。

【００２９】これら環状構造を有する化合物は、金属イ
オンと共に比較的安定な錯体を形成し得るが、環の空孔
サイズと配位すべき中心金属のイオン半径とが一致して
いなければならないため、中心金属と環状構造を有する
化合物との組合せは著しく限定されてしまう。さらに、
ビスジピリジルや大環状ポリアミン等は、比較的平面的
な構造をとるため、二次元的に中心金属に配位すること
しかできず、三次元的に配位できるＥＤＴＡ等を配位子
とする錯体よりも、錯体としての安定性が低いことが予
想される。

【００３０】

【発明が解決しようする課題】前記の如く、生体試料中
の標的物質を測定する際の標識剤としての蛍光物質の利
用は、解決すべき課題はあるものの、非常に有用性が高
いと考えられる。

【００３１】そして、前記課題の解決は、安定で、スト
ークスシフトが大きく、蛍光寿命が長く、かつ、水性溶
媒中でも消光作用を受けにくい蛍光物質の開発により達
成される。

【００３２】本発明は、このような実情に鑑みてなされ
たものあり、水系でも十分な強度の蛍光を発し、蛍光寿
命の長い安定な錯体を希土類金属イオンと共に容易にか
つ安定に形成できる蛍光性化合物と、該蛍光性化合物と
希土類金属イオンによって形成される錯体、該蛍光性化
合物または該錯体と特異的結合体とが直接または間接に
結合してなる試薬、および該試薬を用いる特異的結合ア
ッセイの提供を目的とする。

【００３３】なお、本明細書において、「特異的結合体
」とは、ある物質と特異的に結合する物質をいう。

【００３４】

【課題を解決するための手段】前記のような従来技術に
おける種々の問題点を解決するべく、鋭意研究の結果、
本発明者らは、蛍光測定法、特に時間分解蛍光測定法に
使用するに際して極めて有用であり、特異的結合体に結
合させても用いることのできる新規の蛍光性化合物を開
発することに成功すると共に、その具体的用途である特
異的結合アッセイを開発することに成功し、本発明を完
成した。

【００３５】すなわち、本発明第一の態様は、下記式Ａ
で示される蛍光性化合物である。

【００３６】

【化６】

【００３７】（式Ａ中、ｍは１または２であり、ｎは０
〜４の整数である。Ｒ１　は、それぞれ独立に、水素原
子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アラル
キル基、アリール基から選択される。Ｒ２　は、それぞ
れ独立に、水素原子、アリール基、アルキル基から選択
される。Ｒ３　は、それぞれ独立に、−Ｒ３−１　−Ｒ
３−２　で示される官能基（ただし、Ｒ３−１　は必須
ではないが、存在する場合は、アルキレン基、アリーレ
ン基、アラルキレン基から選択され、Ｒ３−２　は必須
であり、水素原子、アルキル基、アリール基、カルボキ
シル基、ヒドロキシル基、アルコキシル基、アミノ基、
アミド基、スルフォンアミド基、スルフィド基、スルフ
ォキシド基、スルフォン基、ハライド原子、カルボニル
基、ニトロ基から選択される。）から選択される。Ｒ４
　は、それぞれ独立に、水素原子、アルキル基、アルケ
ニル基、アルキニル基、アリール基、カルボキシル基、
ヒドロキシル基、アルコキシル基、アミノ基、アミド基
、スルフォンアミド基、スルフィド基、スルフォキシド
基、スルフォン基、ニトロ基、ハライド原子、メルカプ
ト基、カルボニル基、−Ｒ４−１　−Ｒ４−２　で示さ
れる官能基（ただし、Ｒ４−１　は必須ではないが、存
在する場合は、アルキレン基、アルケニレン基、アリー
レン基、アラルキレン基から選択され、Ｒ４−２　は必
須であり、下記（化７に示す）官能基から選択される。 ）から選択される。

【００３８】

【化７】

【００３９】なお、Ｒ４　は、隣接するＲ４　同士が結
合して縮環し、フェナンスロリン環を形成している二つ
または三つの炭素原子を含む芳香環または複素環となっ
ていてもよい。）

【００４０】また、本発明第二の態様は、本発明第一の
態様の蛍光性化合物と希土類金属イオンにより構成され
る錯体である。

【００４１】さらに、本発明第三の態様は、特異的結合
体と、該特異的結合体に直接または間接に結合した本発
明第一の態様の蛍光性化合物または本発明第二の態様の
錯体とで構成される試薬である。

【００４２】加えて、本発明第四の態様は、液性試料中
の標的物質を測定する特異的結合アッセイであって、特
異的結合体と、該特異的結合体に直接または間接に結合
した本発明第一の態様の蛍光性化合物とで構成される本
発明第三の態様の試薬を用い、該試薬中の蛍光性化合物
と希土類金属イオンにより錯体を構成させ、該錯体を励
起し、前記標的物質の量または濃度に相関する、該錯体
の示す崩壊寿命の長い蛍光の強度を測定することを特徴
とする特異的結合アッセイであり、本発明第五の態様は
、液性試料中の標的物質を測定する特異的結合アッセイ
であって、特異的結合体と、該特異的結合体に直接また
は間接に結合した本発明第二の態様の錯体とで構成され
る本発明第三の態様の試薬を用い、該試薬中の蛍光性化
合物と希土類金属イオンによって構成される錯体を励起
し、前記標的物質の量または濃度に相関する、該錯体の
示す崩壊寿命の長い蛍光の強度を測定することを特徴と
する特異的結合アッセイである。

【００４３】以下に、本発明の構成を詳細に説明する。 本発明第一の態様の蛍光性化合物は、前記式Ａで示され
る。

【００４４】ここで、「蛍光性化合物」とは、後述する
希土類金属イオンに配位して錯体となったときに、希土
類金属イオンの蛍光を増強せしめ得る化合物をいう。

【００４５】前記式Ａで示される本発明第一の態様の蛍
光性化合物は、該化合物の環構造の中心側に位置する窒
素原子の孤立電子対が後述する希土類金属イオンに配位
する、そして、環構造の空孔サイズが、該希土類金属イ
オン半径とほぼ一致することを特徴とする。従って、該
希土類金属イオンを安定に保持できる。

【００４６】また、前記式Ａ中にＲ１　〜Ｒ４　で示さ
れる位置の原子や官能基の選択により、あるいはｍ、ｎ
の選択により、本発明第一の態様の蛍光性化合物に、下
記する様々な特徴をも有させることができる。

【００４７】すなわち、Ｒ１　は、環構造の空孔サイズ
や希土類金属イオンの取り込まれ易さ、錯体の安定性等
に影響を与え、それぞれ独立に、水素原子、アルキル基
、アルケニル基、アルキニル基、アラルキル基、アリー
ル基から選択されるが、水素原子を選択すると、環構造
が柔軟となり、また、空孔サイズが希土類金属イオンの
イオン半径と一致するので好ましい。

【００４８】Ｒ２　は、カルボキシル基の配位能力、方
向性、柔軟性に影響を与え、それぞれ独立に、水素原子
、アリール基、アルキル基から選択されるが、水素原子
が最も好ましい。

【００４９】Ｒ３　は、それぞれ独立に、−Ｒ３−１　
Ｒ３−２　で示される官能基（Ｒ３−１　およびＲ３−
２　についての説明は前記したので省略する）から選択
される。

【００５０】Ｒ３　として水素原子を選択（Ｒ３−１　
：なし、Ｒ３−２　：水素原子）すると、本発明第一の
態様の蛍光性化合物が希土類金属イオンと錯体を形成す
るに際し、希土類金属イオンが、平面的な窒素原子によ
る配位のみならず、軸方向からのカルボキシル基による
配位も受けるため、得られる錯体の安定度が上昇する。

【００５１】また、Ｒ３　として、立体的にかさばる官
能基を選択してもよい。この場合には、例えば、次のよ
うな測定方法に本発明第一の態様の蛍光性化合物を応用
することができる。

【００５２】すなわち、立体的にかさばるＲ３　が存在
するために、本発明の蛍光性化合物は、軸方向の立体障
害が大きくなり、希土類金属イオンと錯体を形成できな
いが、測定すべき標的物質の量に応じて特異的にＲ３を
切断、除去せしめてカルボキシル基を復活させることに
より、本発明の蛍光性化合物を希土類金属イオンに配位
可能な構造に変換せしめ、錯体を形成せしめ、錯体由来
の蛍光を測定する方法等である。

【００５３】本発明第一の態様の蛍光性化合物をこのよ
うな方法に使用する場合には、Ｒ３　としては、アリー
ル基を選択することが好ましく、特に、下記式Ｅまたは
Ｆで示される官能基を選択することが好ましい。

【００５４】

【化８】

【００５５】

【化９】

【００５６】なお、式Ｅ中におけるＲ７　は、それぞれ
独立に、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキ
ニル基、アリール基、カルボキシル基、ヒドロキシル基
、アルコキシル基、アミノ基、アミド基、スルフォンア
ミド基、スルフィド基、スルフォキシド基、スルフォン
基、ニトロ基、ハライド原子、メルカプト基、カルボニ
ル基、−Ｒ７−１　−Ｒ７−２　で示される官能基（た
だし、−Ｒ７−１　−Ｒ７−２　は、式Ａ中における−
Ｒ４−１　−Ｒ４−２　と同様に定義される。）から選
択され、式Ｆ中におけるＲ８　は、Ｒ７　と同様である
。

【００５７】Ｒ４　は、それぞれ独立に、水素原子、ア
ルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、
カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルコキシル基、ア
ミノ基、アミド基、スルフォンアミド基、スルフィド基
、スルフォキシド基、スルフォン基、ニトロ基、ハライ
ド原子、メルカプト基、カルボニル基、−Ｒ４−１　−
Ｒ４−２　で示される官能基（Ｒ４−１　およびＲ４−
２　についての説明は前記したので省略する）から選択
されるか、あるいは、隣接するＲ４　同士が結合して縮
環し、フェナンスロリン環を形成している二つまたは三
つの炭素原子を含む芳香環または複素環となる。

【００５８】なお、該芳香環または複素環は、本発明第
一の態様の蛍光性化合物の基本骨格に含まれる二つのフ
ェナンスロリン環に対し、直接に共役して縮環したもの
であるが、このような縮環したＲ４　を有する本発明第
一の態様の蛍光性化合物のフェナンスロリン環部分の一
例として、下記式Ｇ、Ｈで示される基が挙げられる。

【００５９】

【化１０】

【００６０】

【化１１】

【００６１】ここで、式Ｇ中におけるＲ９　は、それぞ
れ独立に、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アル
キニル基、アリール基、カルボキシル基、ヒドロキシル
基、アルコキシル基、アミノ基、アミド基、スルフォン
アミド基、スルフィド基、スルフォキシド基、スルフォ
ン基、ニトロ基、ハライド原子、メルカプト基、カルボ
ニル基、−Ｒ９−１　−Ｒ９−２　で示される官能基（
ただし、−Ｒ９−１　−Ｒ９−２　は、式Ａ中における
Ｒ４−１　−Ｒ４−２　と同様に定義される。）から選
択され、式Ｈ中におけるＲ１０は、Ｒ９　と同様である
。

【００６２】ところで、Ｒ４　の位置は、本発明第一の
態様の蛍光性化合物の構造中における、希土類金属イオ
ンとの錯体形成には殆ど関与しない部分であり、前記し
たような種々の官能基が導入され得るのであるが、Ｒ４
　として適切な官能基を選択することにより、該蛍光性
化合物と希土類金属イオンとによって形成される錯体の
最適励起波長を、好ましい波長にシフトさせることがで
きる。

【００６３】そして、一般的に、構造式中に共役系をよ
り多く含む方が、エネルギー効率がよく、結果として、
錯体の蛍光強度が高まるので、最適な励起波長を選択し
て、励起光の吸収効率を上昇させ、錯体からの蛍光強度
を増大させるために、Ｒ４　として、特にアリール基を
選択することが好ましい。

【００６４】また、Ｒ４　として、本発明第一の態様の
蛍光性化合物を後述する特異的結合体と結合可能とする
官能基を選択することも好ましい。

【００６５】このような官能基としては、例えば、−Ｒ
４−１　−Ｒ４−２　で示される官能基（Ｒ４−１　お
よびＲ４−２　についての説明は前記したので省略する
）が挙げられるが、具体的な官能基の選択は、本発明の
蛍光性化合物を結合させる相手の物質の、結合に関与す
る部分の構造に影響される。

【００６６】例えば、本発明の蛍光性化合物を結合させ
る相手が特異的結合体の一種である蛋白質であり、結合
部位がアミノ基である場合には、Ｒ４　として、−Ｒ４
−１　−Ｒ４−２　で示され、かつ、−Ｒ４−２　が−
ＳＯ２　Ｃｌ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−ＣＯＯＨおよびその誘
導体、マレイミド基等である官能基を選択するのがよい
。

【００６７】前記式Ａ中のｍは、それぞれ独立に、０ま
たは１であり、４箇所のｍは、互いに同じであっても異
なっていてもよいが、錯体形成に関与する窒素原子と配
位される希土類金属イオンとの間の距離は等しい方がよ
いので、４箇所のｍが同じであることが好ましい。また
、ｍが２以上となると、空孔サイズが希土類金属イオン
半径と一致しなくなるので、ｍは０または１とする。

【００６８】前記式Ａ中のｎは、それぞれ独立に、０〜
４の整数から選択される。ｎが５以上の整数となると、
立体的障害が起こり得るし、また、ｎが５以上の整数で
かつＲ３　が水素原子の場合、カルボキシル基の希土類
金属イオンへの配位性が低下するので、ｎは０〜４の整
数とする。

【００６９】なお、本発明第一の態様の蛍光性化合物は
、　前記式Ａで示されるが、中でも、下記式ＢまたはＣ
で示される化合物が好ましく、特に、下記式Ｉで示され
る基本骨格を有する化合物が好ましい。

【００７０】

【化１２】

【００７１】（式Ｂ中、　Ｒ５　は、それぞれ独立に、
水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、
アリール基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルコ
キシル基、アミノ基、アミド基、スルフォンアミド基、
スルフィド基、スルフォキシド基、スルフォン基、ニト
ロ基、ハライド原子、メルカプト基、カルボニル基、−
Ｒ５−１　−Ｒ５−２　で示される官能基（ただし、−
Ｒ５−１　−Ｒ５−２　は、式Ａ中における−Ｒ４−１
　−Ｒ４−２　と同様に定義される。）から選択される
。）

【００７２】

【化１３】

【００７３】（式Ｃ中、Ｒ６　は、それぞれ独立に、式
Ｄ（化１４に示す）で示される官能基から選択される。 式Ｄ中の−Ｒ６−１　−Ｒ６−２　は、式Ａ中における
−Ｒ４−１　−Ｒ４−２　と同様に定義され、式Ｄ中の
ｋは、０〜５の整数である。）

【００７４】

【化１４】

【００７５】

【化１５】

【００７６】次に、本発明第一の態様の蛍光性化合物の
好適合成方法の一例として、前記式Ｉで示される化合物
の合成方法を、図１に即して説明する。

【００７７】第一の工程として、化合物ａのトシル化を
行ない、次に、化合物ａのトシル化体である化合物ｂを
、化合物ｃと反応させる。

【００７８】ここで、化合物ａと化合物ｃとを反応させ
ずに、化合物ｂと化合物ｃとを反応させるのは、前者を
行なうと、目的とする化合物ではなく、下記式Ｊで示さ
れる化合物が合成されてしまうためである。

【００７９】

【化１６】

【００８０】なお、化合物ｂと化合物ｃとの反応に際し
、共存させる溶媒としては、ジメチルホルムアミド、ク
ロロホルム、テトラヒドロフラン等が挙げられるが、化
合物ｂおよび化合物ｃの溶解性と収率の面で、ジメチル
ホルムアミドが好ましい。また、この反応に用いる塩基
としては、炭酸カリウム、水素化ナトリウム、ビス（ジ
メチルアミノ）ナフタレン等が例示されるが、炭酸カリ
ウムが好ましい。そして、この反応の反応温度は、収率
を考慮すると、１００〜２００℃が好ましい。また、反
応が高温で行なわれるため、酸素による原料（化合物ｂ
、化合物ｃ）および生成物（化合物ｄ）の劣化防止のた
めに、反応容器全体を窒素もしくはアルゴン等の不活性
ガスで置換してもよい。

【００８１】次に、得られた化合物ｄの脱トシル化を行
なう。この脱トシル化反応は、Ｂｏｔｔｉｎｏ　Ｆ．等
の方法（Ｊ．　Ｏｒｇ．　Ｃｈｅｍ．，　５３，　ｐ．
３５２１，　１９８８　）等に記載の公知方法に従えば
よい。また、脱トシル化反応の際の溶媒としては、硫酸
と酢酸との混合溶媒が好ましい。反応条件としては、６
０〜１００℃で１２時間以上反応させるのが好ましく、
約８０℃で約１２時間反応させるのが特に好ましい。反
応温度が５０℃以下では、脱トシル化されないものが残
り、また、反応時間が短くても、同様に原料が残る。

【００８２】続いて、化合物ｅの２位および１５位の窒
素原子に、エトキシカルボニルメチル基を導入する。こ
の際の、エトキシカルボニルメチル基を提供する原料と
しては、クロロ酢酸エチル、ブロモ酢酸エチル等が挙げ
られ、また、触媒として用いる塩基としては、炭酸カリ
ウム、ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン、ジイソプロ
ピルエチルアミン、トリエチルアミン等が挙げられる。 なお、該原料としてブロモ酢酸エチルを選択し、該塩基
として、炭酸カリウムを選択するのが好ましい。さらに
、反応系に共存させる溶媒としては、ジメチルホルムア
ミド、クロロホルム、テトラヒドロフラン、アセトニト
リル等が挙げられ、特に、ジメチルホルムアミドが好ま
しい。

【００８３】このようにして合成された化合物ｆは、本
発明第一の態様の蛍光性化合物であるが、さらに、脱エ
チル化を行ない、化合物ｇとしてもよい。

【００８４】脱エチル化反応は、常法である、アルコー
ル溶媒中でのアルカリ金属またはアルカリ土類金属の水
酸化物を用いる加水分解によって行なえばよい。溶媒は
、アルコール溶媒なら何れのものを選択してもよいが、
化合物ｅの溶解性を考慮すると、低級飽和アルコール、
特にメタノールまたはエタノールを選択することが好ま
しい。また、該水酸化物としては、本反応を妨げないも
のであれば如何なるものでもよいが、メタノールやエタ
ノールに溶解し易い水酸化カリウムが好ましい。反応条
件は、加水分解を確実に行なうためには、還流下で１時
間以上反応させることが好ましい。

【００８５】本発明第二の態様は、本発明第一の態様の
蛍光性化合物と希土類金属イオンにより構成される錯体
である。

【００８６】該希土類金属としては、ユウロピウム、テ
ルビウム、サマリウム、ガドリニウム、イッテルビウム
等が挙げられるが、蛍光強度の観点から、特にユウロピ
ウム、テルビウムが好ましく、蛍光寿命の観点を含める
と、特にユウロピウムが好ましい。

【００８７】本発明第二の態様の錯体は、本発明第一の
態様の蛍光性化合物の環構造の中心側に位置する窒素原
子の孤立電子対が、希土類金属イオンに配位することを
特徴とする。

【００８８】また、本発明第一の態様の蛍光性化合物が
、その２位および１５位の窒素原子から伸びる官能基の
末端にカルボキシル基を有するか、あるいは、ある条件
の下で該カルボキシル基が復活する構造である場合には
、前記希土類金属イオンは、このカルボキシル基によっ
ても配位される。そして、この配位は、前記窒素原子の
孤立電子対による配位とは約９０度ずれる方向からの配
位となるので、希土類金属イオンは、三次元的に配位さ
れることになり、該錯体の安定性が増大する。

【００８９】本発明第二の態様の錯体は、上記の配位特
性と、本発明第一の態様の蛍光性化合物の環構造の空孔
サイズが、希土類金属イオン半径とほぼ一致することか
ら、非常に安定となる。

【００９０】本発明第二の態様の錯体は、本発明第一の
態様の蛍光性化合物と希土類金属塩とを混合すること等
の方法によって得ることができる。

【００９１】本発明第二の態様の錯体は、特徴ある蛍光
特性を示す。すなわち、本発明の錯体の蛍光寿命は、バ
ックグラウンドとなる他の物質由来の蛍光寿命に比較し
て十分長いという特徴である。このため、本発明の錯体
を用いると、バックグラウンド蛍光が消失した後に、本
発明の錯体からの蛍光を測定することができる。従って
、本発明第二の態様の錯体からの蛍光は、時間分解蛍光
光度計、すなわち、パルス方式で励起し、ゲート機能に
より励起と蛍光検出の間に、バックグラウンド蛍光を除
去するための時間的遅延を設けた蛍光光度計にて測定す
ることが好ましい。また、本発明の錯体は、ストークス
シフトが大きいという特徴も有する。

【００９２】本発明第三の態様は、特異的結合体と、該
特異的結合体に直接または間接に結合した本発明第一の
態様の蛍光性化合物または本発明第二の態様の錯体とで
構成される試薬である。

【００９３】本発明第三の態様の試薬を構成する特異的
結合体とは、前記したように、ある物質と特異的に結合
する物質をいうが、より具体的には、例えば、抗体、抗
原、ハプテン、ホルモン、蛋白質、ポリペプチド、核酸
、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、オリゴサッ
カライド、ポリサッカライド等が挙げられる。

【００９４】ところで、該特異的結合体と本発明第一の
態様の蛍光性化合物、または、本発明第二の態様の錯体
との結合は、直接的であっても、間接的であってもよい
のであるが、直接的に結合させる場合には、本発明第一
の態様の蛍光性化合物として、前記したように、特異的
結合体の結合に関与する部分の構造に即して選択された
官能基を有する化合物を選択する。また、本発明第二の
態様の錯体についても、該錯体を構成する蛍光性化合物
として、同様の化合物を選択する。

【００９５】具体的には、特異的結合体の結合に関与す
る部分の構造としては、アミノ基、カルボキシル基、メ
ルカプト基、アルデヒド基などの反応性の官能基を挙げ
ることができ、これらの官能基と反応する蛍光性化合物
の側の官能基としては、スクシイミドエステル基、イソ
チオシアナート基、スルフォニルクロライド基、アルキ
ルハライド基、マレイミド基、ヒドラジド基等が挙げら
れる。

【００９６】なお、前記したような官能基を有する蛍光
性化合物と特異的結合体との結合方法には、「石川栄治
他編、酵素免疫測定法（第３版）、医学書院、７５−１
５１（１９８７）」等に記載された公知の方法を用いれ
ばよい。

【００９７】また、特異的結合体と蛍光性化合物または
錯体との結合反応液から、それらが結合してなる化合物
を得るには、ゲルろ過法などの方法にて、精製を行なえ
ばよく、これも、同書等に記載されている公知技術に従
えばよい。

【００９８】一方、間接的に結合させる場合には、本発
明第一態様の蛍光性化合物、または、本発明第二の態様
の錯体と、特異的結合体との間に、ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）、サイログロブリン、アビジン、ストレプト
アビジンのような蛋白質、ポリＬ−リジン等のポリペプ
チド、ビオチン、および／または、架橋試薬として知ら
れる公知の物質を介在させればよい。

【００９９】本発明第一の態様の蛍光性化合物、または
、本発明第二の態様の錯体と、特異的結合体との間に、
上記のような物質を介在させると、上記のような物質に
は、多数の標識剤（蛍光性化合物あるいは錯体）が結合
可能であるので、標識剤が多数結合した試薬が得られる
。

【０１００】なお、本発明第一の態様の蛍光性化合物、
または、本発明第二の態様の錯体と、特異的結合体との
間に介在される物質は、１種類に限定されるわけではな
い。

【０１０１】例えば、アビジンと蛍光性化合物とを結合
させ、一方、特異的結合体とビオチンとを結合させ、そ
の後、蛍光性化合物標識アビジンとビオチン標識特異的
結合体とを結合させることにより、蛍光性化合物と特異
的結合体との間にアビジンおよびビオチンが介在する試
薬を得ることができる。なお、この試薬は、後記する特
異的結合アッセイの際に、反応系中で蛍光性化合物標識
アビジンとビオチン標識特異的結合体とを結合させると
いう用い方もできる。

【０１０２】あるいは、蛍光性化合物とＢＳＡとを架橋
試薬を用いて結合させ、同じく、特異的結合体とＢＳＡ
とを架橋試薬を用いて結合させ、蛍光性化合物と特異的
結合体との間に、架橋試薬およびＢＳＡが介在する試薬
を得ることができる。

【０１０３】標識剤である蛍光性化合物または錯体の一
般的な結合方法としては、直接的結合、間接的結合の何
れの場合でも、従来より、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）用
の標識試薬を作製するために、標識剤である酵素を抗体
等に結合させる際に用いられている、グルタルアルデヒ
ド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、ピリジルジスルフ
ィド法あるいは混合酸無水物法等の方法、あるいは、必
要に応じ、これらの方法を適宜改変した方法が例示され
る。

【０１０４】また、標識される物質が核酸である場合に
は、結合方法は、高橋豊三による「ＤＮＡプローブＩＩ
」（シーエムシー社刊）に記載の方法が好ましい。

【０１０５】本発明第三の態様の試薬は、血液、尿等の
体液や、工業用水等中に存在する標的物質の測定におい
て、標識特異的結合体として使用することができる。特
に、液性試料中に存在する標的物質を測定する際に有用
である。

【０１０６】ここで、標的物質とは、被測定物質のこと
であり、具体的には、血液、尿等の体液や、工業用水等
中に存在する様々な物質、さらに具体的には、薬物、代
謝物質、生理活性物質、化学物質、天然物質、抗生物質
、遺伝物質等を指す。

【０１０７】本発明第三の態様の試薬は、いずれの標的
物質にも対応して作製され得るが、これらの試薬を用い
て測定することが好適な標的物質としては、抗体、抗原
、核酸、ポリヌクレオチド、細胞、ホルモン、ウイルス
、細菌、原虫、ハプテン、ポリペプチド、アレルゲン、
オリゴサッカライド、ポリサッカライド等が挙げられる
。

【０１０８】なお、本発明第三の態様の試薬の作製にあ
たり、対応する標的物質の種類を考慮することはもちろ
んであるが、さらに、測定方法も考慮しなければならな
い。

【０１０９】例えば、標的物質が抗原である場合、本発
明の試薬を構成する特異的結合体としては、抗体や、該
抗原またはそのアナログが選択される。

【０１１０】同様に、標的物質が生体内レセプターであ
る場合には、特異的結合体としては、アクセプターや、
該レセプターまたはそのアナログが選択される。

【０１１１】さらに、標的物質が核酸である場合は、特
異的結合体としては、相補的な核酸や、標的物質と同一
またはそれが若干改変された核酸が選択される。

【０１１２】本発明第四の態様および第五の態様は、本
発明第三の態様の試薬を標識物質として用いる、液性試
料中の標的物質を測定する特異的結合アッセイである。

【０１１３】ここで、液性試料とは、血液、血清、血し
ょう、尿、髄液、精液などの各種体液や糞便や組織から
の抽出液、あるいは工業用水等を指す。

【０１１４】特異的結合アッセイとは、抗原抗体反応を
利用した免疫測定、レセプター、アクセプターの結合反
応を利用したアッセイ、核酸のハイブリダイゼーション
を利用したアッセイなどを指す。

【０１１５】標的物質とは、被測定物質のことであり、
具体的には、下記の物質が例示される。

【０１１６】すなわち、特異的結合アッセイが抗原抗体
反応を利用した免疫測定の場合は、標的物質としては、
アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、カルシノエンブ
リオニックアンティゲン（ＣＥＡ）、ＣＡ１９−９、Ｃ
Ａ１２５、ＣＡ５４／６１、ＣＡ６０２などといった腫
瘍マーカーとして用いられる物質、フェリチン、ベータ
２ミクログロブリン（β２ｍ）などといった生体機能の
指標となり得る物質、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣ
Ｇ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、卵胞刺激ホルモ
ン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）などといった
糖蛋白ホルモンやペプチドホルモン、エストロゲン、プ
ロゲステロン、テストステロン、コルチゾールなどとい
ったステロイドホルモン、ＨＢｓ抗原などといったウイ
ルス性抗原およびそれに対する抗体などといったハプテ
ンまたは完全抗原となり得る物質およびこれらに対する
抗体等が例示される。

【０１１７】特異的結合アッセイがレセプター、アクセ
プターの結合反応を利用したアッセイの場合は、標的物
質としては、アンドロゲン、アンドロゲンレセプター、
エストロゲン、エストロゲンレセプター、インシュリン
、インシュリンレセプター、甲状腺ホルモン、甲状腺ホ
ルモンレセプター、グルココルチコイド、グルココルチ
コイドレセプターなどのレセプター／アクセプターの関
係にある物質が挙げられる。

【０１１８】特異的結合アッセイが核酸のハイブリダイ
ゼーションを利用したアッセイの場合は、標的物質とし
ては、ヘパタイティスＢウイルス（ＨＢＶ）やヘパタイ
ティスＣウイルス（ＨＣＶ）等のウイルスのＤＮＡやＲ
ＮＡ、また、感染症の原因となるクラミジア、カンピロ
バクター、結核菌、多剤耐性ブドウ球菌、毒素産生大腸
菌等のＤＮＡやＲＮＡ等の核酸が例示される。

【０１１９】本発明第四の態様、第五の態様の特異的結
合アッセイは、サンドイッチ法や競合法、およびその他
の原理に基づく方法で実施可能である。

【０１２０】液性試料中の抗原（標的物質）を、サンド
イッチ法を用いて免疫測定する場合は、下記のように行
なう。

【０１２１】このようなサンドイッチ法では、２種の抗
体を必要とし、第１の抗体は固相化抗体、第２の抗体は
標識抗体（本発明第三の態様の試薬である）として用い
られる。そして、２種の抗体と抗原で形成される免疫複
合体中の蛍光活性を測定することにより、抗原量が定量
できるのである。

【０１２２】より具体的に述べると、本発明第四の態様
では、例えば、液性試料中の抗原と、蛍光性化合物が直
接または間接に結合した標識抗体および固相化抗体とを
反応させることによって免疫複合体を得る。なお、反応
は、ワンステップ法、ツーステップ法等のいずれでもよ
い。そこに希土類金属イオンを添加し、前記標識抗体中
の蛍光性化合物と希土類金属イオンとで錯体を形成せし
める。その後、該錯体に適切な波長の励起光を照射して
励起せしめ、好ましくは共存物質によるバックグラウン
ド蛍光が消光した後、該錯体からの蛍光の強度を測定す
る（時間分解蛍光測定法）。

【０１２３】上記方法において、希土類金属イオンの添
加は、免疫複合体の形成後に限定されるわけではない。 標識抗体を反応に供する前に、標識抗体中の蛍光性化合
物と希土類金属イオンとで錯体を形成させてもよいし、
あるいは、標識抗体の反応中に希土類金属イオンを添加
し、錯体を形成させてもよい。

【０１２４】本発明第五の態様の場合は、標識抗体とし
て、蛍光性化合物と希土類金属イオンとで構成される錯
体が直接または間接に抗体に結合したものを用いるので
、該標識抗体および固相化抗体と液性試料中の抗原とを
反応させて免疫複合体を得た後、前記錯体に適切な波長
の励起光を照射して励起せしめ、好ましくは共存物質に
よるバックグラウンド蛍光が消光した後、該錯体からの
蛍光の強度を測定する。

【０１２５】このようなサンドイッチ法では、蛍光の強
度は抗原量にほぼ比例する。なお、蛍光強度を高めるた
めに、測定時に界面活性剤等を共存させてもよい。

【０１２６】また、液性試料中の抗原（標的物質）を競
合法で測定する場合は、下記のように行なう。

【０１２７】競合法には、抗原またはそのアナログを標
識試薬として用いる方法と、抗体を標識試薬として用い
る方法がある。前者の場合は、抗原に対する抗体を固相
化しておき、この固相化抗体を、液性試料中の抗原と、
本発明第三の態様の試薬である標識された抗原（または
そのアナログ）とで競合せしめ、その後、固相化抗体に
結合した標識抗原（またはそのアナログ）の蛍光活性を
測定することにより、抗原量を定量するのである。

【０１２８】また、後者の場合は、まず、本発明第三の
態様の試薬である標識抗体と液性試料中の抗原とを結合
させ、次いで、抗原と結合しなかった標識抗体を、予め
固相化しておいた抗原（またはそのアナログ）と反応さ
せ、固相化抗原（またはそのアナログ）に結合した標識
抗体の蛍光活性を測定することにより、抗原量を定量す
るのである。

【０１２９】これらの競合法においても、前記サンドイ
ッチ法の場合と同様に、本発明第四の態様の特異的結合
アッセイの場合は、蛍光活性の測定よりも前のいずれか
の工程で、希土類金属イオンを添加し、標識抗原あるい
は標識抗体中の蛍光性化合物と希土類金属イオンとで錯
体を形成せしめる。一方、本発明第五の態様の特異的結
合アッセイの場合は、標識抗原あるいは標識抗体は錯体
で標識されているので、希土類金属イオンの添加工程は
不要である。

【０１３０】なお、競合法の場合は、蛍光の強度は抗原
量にほぼ反比例する。

【０１３１】本発明第四の態様、第五の態様の特異的結
合アッセイのひとつである免疫測定では、液性試料中に
存在する抗体の測定も可能である。この場合、抗体の認
識する標識抗原（本発明第三の態様の試薬）を用いる方
法、該抗体を認識する抗体、すなわち、第２抗体として
標識抗体（本発明第三の態様の試薬）を用いる方法があ
る。

【０１３２】前者においては、標的物質である生体内で
産生される抗体は２価以上でなければならない。そして
、抗原を固相化および標識物質として用い、前記抗体を
該２個の抗原と結合させて複合体を形成させ、該複合体
中の錯体に由来する蛍光活性を測定する。

【０１３３】また、後者においては、抗原を固相化し、
これに反応した標的物質である抗体にさらに蛍光標識さ
れた第２抗体を反応させ、複合体を形成させ、該複合体
中の錯体に由来する蛍光活性を測定する。この際、抗原
は、該抗原に対する抗体に結合せられて固相化されても
よい。

【０１３４】これらの方法においても、本発明第四の態
様の特異的結合アッセイの場合は、希土類金属イオンの
添加工程が必要である。

【０１３５】また、本発明第四の態様、第五の態様の特
異的結合アッセイでは、レセプター、アクセプターを用
いた高感度なアッセイが可能である。この場合、標識物
質として本発明第三の態様の試薬を用いること、および
、本発明第四の態様の特異的結合アッセイでは、希土類
金属イオンの添加工程があること以外は、「新しいバイ
オ診断薬の開発と評価　　テクニカルレサーチレポート
Ｎｏ．１」（シーエムシー社刊）、４８〜５７頁に記載
の公知方法を用いることができる。

【０１３６】さらに、本発明第四の態様、第五の態様の
特異的結合アッセイでは、核酸のハイブリダイゼーショ
ンに基づくアッセイを行なうことができる。

【０１３７】液性試料中の標的物質である核酸を測定す
るには、まず、標的物質の特異的配列に相補的な核酸を
作製し、この相補的な配列の核酸を用いて本発明第三の
態様の試薬を作製する。そして、アッセイは、例えば下
記のように行なう。

【０１３８】すなわち、一方法においては、まず、生体
試料から核酸を抽出する。抽出した核酸を固相に固定化
した後、それに、標識されたプローブ（本発明第三の態
様の試薬）を反応させ、Ｂ／Ｆ分離操作後固相に残る標
識されたプローブ由来の蛍光活性を測定することにより
、標的物質の核酸が存在するか否かを調べることができ
る。試料中の目的とする核酸量が微量の場合は、公知技
術であるＰＣＲ法等の増幅法を用いてから行なっても良
い。

【０１３９】また、第二の方法として、標的物質の核酸
の配列の一部と相補的な２種の核酸を作製し、うち第１
の核酸を固相化したのち、そこに生体試料中の標的物質
を反応させ、次に、標識された第２のプローブ（本発明
第三の態様の試薬）を反応させ、サンドイッチタイプの
複合体を作製し、洗浄後、該複合体中の第２のプローブ
由来の蛍光活性を測定し、標的物質の定量を行なう方法
が挙げられる。

【０１４０】これらの方法においても、本発明第四の態
様の特異的結合アッセイでは、蛍光活性の測定よりも前
の工程に、希土類金属イオンの添加工程がある。

【０１４１】このように、本発明第四の態様には、標識
物質として、本発明第一の態様の蛍光性化合物が特異的
結合体に直接または間接に結合してなる本発明第三の態
様の試薬を用い、該蛍光性化合物と希土類金属イオンに
より錯体を形成させる工程と、該錯体を励起して蛍光強
度を測定する工程とを有する、免疫測定法、レセプター
、アクセプターの結合反応を利用したアッセイ、核酸ハ
イブリダイゼーションを利用したアッセイ等の各種の特
異的結合アッセイが包含される。

【０１４２】また、本発明第五の態様には、標識物質と
して、本発明第二の態様の錯体が特異的結合体に直接ま
たは間接に結合してなる本発明第三の態様の試薬を用い
、該錯体を励起して蛍光強度を測定する工程を有する、
免疫測定法、レセプター、アクセプターの結合反応を利
用したアッセイ、核酸ハイブリダイゼーションを利用し
たアッセイ等の各種の特異的結合アッセイが包含される
。

【０１４３】

【実施例】以下に、実施例として、本発明の実施態様の
一例を示すが、これらは本発明を例示するためのもので
あって、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。

【０１４４】（実施例１）　　２，１５−ジアザ［３．
３］（２，９）−１，１０−フェナンスロリノファン−
Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸の合成 図１に示す合成経路図に従い、下記の方法で合成を行な
った。

【０１４５】（１）２，９−ジ（アミノメチル）−１，
１０−フェナンスロリン過塩素酸塩（ａ）　の合成２，
９−ジメチル−１，１０−フェナンスロリンを原料とし
て用い、「Ｊ．　Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ　Ｃｈｅｍ
．，　１８，　Ｐ．５９９，　１９８１」に記載の方法
によって合成した。

【０１４６】（２）２，９−ジ（トシルアミノメチル）
−１，１０−フェナンスロリン（ｂ）　の合成（１）で
得た２，９−ジ（アミノメチル）−１，１０−フェナン
スロリン過塩素酸塩（ａ）　１．７６ｇ（４ｍｍｏｌ）
をピリジン２０ｍｌに溶解し、氷浴下で冷却しながら、
塩化ｐ−トルエンスルホニル１．６ｇ（８ｍｍｏｌ）を
加えた。室温で３時間攪拌し、反応液を水２００ｍｌに
注いだ後、クロロホルム２００ｍｌで抽出した。 クロロホルム抽出液を、クロロホルム−メタノールを展
開溶媒として用いてシリカゲルカラムにて精製し、目的
とする２，９−ジ（トシルアミノメチル）−１，１０−
フェナンスロリン（ｂ）　１．８７ｇを得た。

【０１４７】（３）２，９−ジ（ブロモメチル）−１，
１０−フェナンスロリン（ｃ）　の合成２，９−ジメチ
ル−１，１０−フェナンスロリンを原料として用い、「
Ｊ．　Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ　Ｃｈｅｍ．，　１８
，　Ｐ．５９９，　１９８１」に記載の方法によって合
成した。

【０１４８】（４）Ｎ２　，Ｎ１５−ジトシル−２，１
５−ジアザ［３．３］（２，９）−１，１０−フェナン
スロリノファン（ｄ）　の合成 （２）で得た２，９−ジ（トシルアミノメチル）−１，
１０−フェナンスロリン（ｂ）　６２８ｍｇ（１．１５
ｍｍｏｌ）と（３）で得た２，９−ジ（ブロモメチル）
−１，１０−フェナンスロリン（ｃ）　４２０ｍｇ（１
．１５ｍｍｏｌ）とをジメチルホルムアミド５００ｍｌ
に溶解し、炭酸カリウム５ｇを加え、１２０℃で４時間
加熱攪拌した。冷却後、反応液を濾過し、濾液を濃縮し
た。濃縮された残分に水を加え、析出した結晶を濾別し
、目的とするＮ２，Ｎ１５−ジトシル−２，１５−ジア
ザ［３．３］（２，９）−１，１０−フェナンスロリノ
ファン（ｄ）　３１０ｍｇを得た。

【０１４９】（５）２，１５−ジアザ［３．３］（２，
９）−１，１０−フェナンスロリノファン（ｅ）　の合
成（４）で得たＮ２　，Ｎ１５−ジトシル−２，１５−
ジアザ［３．３］（２，９）−１，１０−フェナンスロ
リノファン（ｄ）　３１０ｍｇを硫酸４ｍｌと酢酸６ｍ
ｌとの混合溶液に溶解し、８０℃にて２０時間加熱撹拌
した。反応液を氷水１００ｍｌ中に注ぎ、水酸化ナトリ
ウムにて中和した。析出した結晶を濾別し、水洗し、減
圧乾燥し、目的とする２，１５−ジアザ［３．３］（２
，９）−１，１０−フェナンスロリノファン（ｅ）　１
８０ｍｇを得た。

【０１５０】（６）２，１５−ジアザ［３．３］（２，
９）−１，１０−フェナンスロリノファン−Ｎ２　，Ｎ
１５−ジ酢酸ジエチル（ｆ）　の合成 （５）で得た２，１５−ジアザ［３．３］（２，９）−
１，１０−フェナンスロリノファン（ｅ）　１８０ｍｇ
をジメチルホルムアミド１００ｍｌに溶解し、炭酸カリ
ウム２ｇおよびブロモ酢酸エチル２ｍｌを加え、１００
℃にて１２時間加熱撹拌した。冷却後、反応液を濾過し
、濾液を濃縮した。濃縮された残分を、クロロホルム−
メタノールを展開溶媒として用いてシリカゲルカラムに
て精製し、目的とする２，１５−ジアザ［３．３］（２
，９）−１，１０−フェナンスロリノファン−Ｎ２　，
Ｎ１５−ジ酢酸ジエチル（ｆ）４０ｍｇを得た。

【０１５１】（７）２，１５−ジアザ［３．３］（２，
９）−１，１０−フェナンスロリノファン−Ｎ２　，Ｎ
１５−ジ酢酸（ｇ）　の合成 （６）で得た２，１５−ジアザ［３．３］（２，９）−
１，１０−フェナンスロリノファン−Ｎ２　，Ｎ１５−
ジ酢酸ジエチル（ｆ）　４０ｍｇをメタノール１０ｍｌ
に溶解し、水酸化カリウム５０ｍｇを加え、５０〜１０
０℃で２時間還流させた。反応液を濃縮した後、水１０
ｍｌを加えて希釈し、希塩酸にて中和した。析出した物
質を濾別し、目的とする２，１５−ジアザ［３．３］（
２，９）−１，１０−フェナンスロリノファン−Ｎ２　
，Ｎ１５−ジ酢酸（ｇ）　３０ｍｇを得た。

【０１５２】（実施例２）　　８−（３´−スクシイミ
ジルオキシカルボニルプロピオンアミド）−２，１５−
ジアザ［３．３］（２，９）−１，１０−フェナンスロ
リノファン−Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸の合成図２に示す
合成経路図に従い、下記の方法で合成を行なった。

【０１５３】（１）５−ニトロ−２，９−ジメチル−１
，１０−フェナンスロリン（ｉ）　の合成２，９−ジメ
チル−１，１０−フェナンスロリン（ｈ）　２０ｇを硫
酸１２０ｍｌと硝酸４０ｍｌとの混合溶液に溶解し、１
００℃にて１２時間加熱撹拌した。反応液を氷水３００
ｍｌ中に注ぎ、析出した結晶を濾別した。その結晶を水
５００ｍｌに溶解し、水酸化ナトリウムで中和した。析
出した結晶を濾別し、メタノール３００ｍｌより再結晶
し、目的とする５−ニトロ−２，９−ジメチル−１，１
０−フェナンスロリン（ｉ）　８．８ｇを得た。

【０１５４】（２）５−ニトロ−２，９−ジ（ブロモメ
チル）−１，１０−フェナンスロリン（ｊ）　の合成（
１）で得た５−ニトロ−２，９−ジメチル−１，１０−
フェナンスロリン（ｉ）　８．４ｇ（０．０３ｍｏｌ）
を四塩化炭素５００ｍｌに溶解し、Ｎ−ブロモスクシン
イミド１０．７ｇ（０．０６ｍｏｌ）、過酸化ベンゾイ
ル３００ｍｇを加え、８０℃で１２時間還流した。反応
液を濃縮後、ベンゼン２００ｍｌを加えて希釈し、不溶
物を濾別した後、濾液を濃縮した。濃縮された残分を、
ベンゼン−酢酸エチルを展開溶媒として用いてシリカゲ
ルカラムにて精製し、目的とする５−ニトロ−２，９−
ジ（ブロモメチル）−１，１０−フェナンスロリン（ｊ
）　５００ｍｇを得た。

【０１５５】（３）８−ニトロ−Ｎ２　，Ｎ１５−ジト
シル−２，１５−ジアザ［３．３］（２，９）−１，１
０−フェナンスロリノファン（ｋ）　の合成（２）で得
た５−ニトロ−２，９−ジ（ブロモメチル）−１，１０
−フェナンスロリン（ｊ）　４１０ｍｇ（１ｍｍｏｌ）
と２，９−ジ（トシルアミノメチル）−１，１０−フェ
ナンスロリン（ｂ）　（実施例１（２）参照）５４７ｍ
ｇ（１ｍｍｏｌ）とをジメチルホルムアミド５００ｍｌ
に溶解し、炭酸カリウム５ｇを加え、１２０℃で４時間
加熱攪拌した。冷却後、反応液を濾過し、濾液を濃縮し
た。濃縮された残分に水を加え、析出した結晶を濾別後
水洗し、減圧乾燥して、目的とする８−ニトロ−Ｎ２　
，Ｎ１５−ジトシル−２，１５−ジアザ［３．３］（２
，９）−１，１０−フェナンスロリノファン（ｋ）　３
８０ｍｇを得た。

【０１５６】（４）８−ニトロ−２，１５−ジアザ［３
．３］（２，９）−１，１０−フェナンスロリノファン
（ｌ）　の合成 （３）で得た８−ニトロ−Ｎ２　，Ｎ１５−ジトシル−
２，１５−ジアザ［３．３］（２，９）−１，１０−フ
ェナンスロリノファン（ｋ）　３８０ｍｇを硫酸４ｍｌ
と酢酸６ｍｌとの混合溶液に溶解し、８０℃にて２０時
間加熱撹拌した。反応液を氷水１００ｍｌ中に注ぎ、水
酸化ナトリウムにて中和した。析出した結晶を濾別し、
目的とする８−ニトロ−２，１５−ジアザ［３．３］（
２，９）−１，１０−フェナンスロリノファン（ｌ）　
２３０ｍｇを得た。

【０１５７】（５）８−ニトロ−２，１５−ジアザ［３
．３］（２，９）−１，１０−フェナンスロリノファン
−Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸ジエチル（ｍ）　の合成（４
）で得た８−ニトロ−２，１５−ジアザ［３．３］（２
，９）−１，１０−フェナンスロリノファン（１）　２
３０ｍｇをジメチルホルムアミド１００ｍｌに溶解し、
炭酸カリウム２ｇ、ブロモ酢酸エチル２ｍｌを加え、１
００℃にて１２時間加熱した。反応液を濾過し、濾液を
濃縮後、クロロホルム−メタノールを展開溶媒として用
いてシリカゲルカラムにて精製し、目的とする８−ニト
ロ−２，１５−ジアザ［３．３］（２，９）−１，１０
−フェナンスロリノファン−Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸ジ
エチル（ｍ）　６５ｍｇを得た。

【０１５８】（６）８−ニトロ−２，１５−ジアザ［３
．３］（２，９）−１，１０−フェナンスロリノファン
−Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸（ｎ）　の合成（５）で得た
８−ニトロ−２，１５−ジアザ［３．３］（２，９）−
１，１０−フェナンスロリノファン−Ｎ２　，Ｎ１５−
ジ酢酸ジエチル（ｍ）　６５ｍｇをメタノール１０ｍｇ
に溶解し、水酸化カリウム５０ｍｇを加え、８０℃で２
時間還流した。反応液を濃縮後、水１０ｍｌを加えて希
釈し、希塩酸にて中和した。析出した結晶を濾別し、目
的とする８−ニトロ−２，１５−ジアザ［３．３］（２
，９）−１，１０−フェナンスロリノファン−Ｎ２　，
Ｎ１５−ジ酢酸（ｎ）　４０ｍｇを得た。

【０１５９】（７）８−アミノ−２，１５−ジアザ［３
．３］（２，９）−１，１０−フェナンスロリノファン
−Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸（ｏ）　の合成（６）で得た
８−ニトロ−２，１５−ジアザ［３．３］（２，９）−
１，１０−フェナンスロリノファン−Ｎ２　，Ｎ１５−
ジ酢酸（ｎ）　４０ｍｇをエタノール１５ｍｌに溶解し
、５％パラジウム−カーボン２０ｍｇを加え、水素雰囲
気下で２０時間攪拌した。反応液を濾過後、濾液を濃縮
し、アモルファス状の目的とする８−アミノ−２，１５
−ジアザ［３．３］（２，９）−１，１０−フェナンス
ロリノファン−Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸（ｏ）　２５ｍ
ｇを得た。

【０１６０】（８）８−（３´−スクシイミジルオキシ
カルボニルプロピオンアミド）−２，１５−ジアザ［３
．３］（２，９）−１，１０−フェナンスロリノファン
−Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸（ｐ）　の合成（７）で得た
８−アミノ−２，１５−ジアザ［３．３］（２，９）−
１，１０−フェナンスロリノファン−Ｎ２　，Ｎ１５−
ジ酢酸（ｏ）　２５ｍｇをジメチルホルムアミド１０ｍ
ｌに溶解し、ジスクシイミジルスクシネート３１０ｍｇ
、炭酸カリウム５００ｍｇを加え、８０℃で１５時間加
熱撹拌した。反応液を濾過後、濾液を濃縮し、濃縮され
た残分を、クロロホルム−メタノールを溶媒として用い
てシリカゲルカラムにて精製し、目的とする８−（３´
−スクシイミジルオキシカルボニルプロピオンアミド）
−２，１５−ジアザ［３．３］（２，９）−１，１０−
フェナンスロリノファン−Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸（ｐ
）　１５ｍｇを得た。

【０１６１】（実施例３）　　７，１０−ジフェニル−
２，１５−ジアザ［３．３］（２，９）−１，１０−フ
ェナンスロリノファン−Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸の合成
図３に示す合成経路図に従い、下記の方法で合成を行な
った。

【０１６２】（１）２，９−ジ（ブロモメチル）−４，
７−ジフェニル−１，１０−フェナンスロリン（ｑ）　
の合成 ２，９−ジメチル−４，７−ジフェニル−１，１０−フ
ェナンスロリンを原料として用い、「Ｊ．　Ｈｅｔｅｒ
ｏｃｙｃｌｉｃ　Ｃｈｅｍ．，　１８，　Ｐ．５９９，
　１９８１」に記載の方法によって合成した。

【０１６３】（２）Ｎ２　，Ｎ１５−ジトシル−７，１
０−ジフェニル−２，１５−ジアザ［３．３］（２，９
）−１，１０−フェナンスロリノファン（ｒ）　の合成
（１）で得た２，９−ジ（ブロモメチル）−４，７−ジ
フェニル−１，１０−フェナンスロリン（ｑ）　４６５
ｍｇ（０．９ｍｍｏｌ）と２，９−ジ（トシルアミノメ
チル）−１，１０−フェナンスロリン（ｂ）　（実施例
１（２）参照）４９０ｍｇ（０．９ｍｍｏｌ）をジメチ
ルホルムアミド２０ｍｌに溶解し、炭酸カリウム２ｇを
加え、１２０℃で４時間加熱攪拌した。冷却後、反応液
を濾過し、濾液を濃縮した。濃縮された残分に水を加え
、析出した結晶を濾別し、クロロホルムより再結晶し、
目的とするＮ２　，Ｎ１５−ジトシル−７，１０−ジフ
ェニル−２，１５−ジアザ［３．３］（２，９）−１，
１０−フェナンスロリノファン（ｒ）　７４０ｍｇを得
た。

【０１６４】（３）７，１０−ジフェニル−２，１５−
ジアザ［３．３］（２，９）−１，１０−フェナンスロ
リノファン硫酸塩（ｓ）　の合成 （２）で得たＮ２　，Ｎ１５−ジトシル−７，１０−ジ
フェニル−２，１５−ジアザ［３．３］（２，９）−１
，１０−フェナンスロリノファン（ｒ）　７２０ｍｇを
硫酸６ｍｌと酢酸９ｍｌとの混合溶液に溶解し、８０℃
にて２０時間加熱撹拌した。反応液を氷水１００ｍｌ中
に注ぎ、析出した結晶を濾別し、水洗し、減圧乾燥し、
目的とする７，１０−ジフェニル−２，１５−ジアザ［
３．３］（２，９）−１，１０−フェナンスロリノファ
ン硫酸塩（ｓ）　４３０ｍｇを得た。

【０１６５】（４）７，１０−ジフェニル−２，１５−
ジアザ［３．３］（２，９）−１，１０−フェナンスロ
リノファン−Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸ジエチル（ｔ）　
の合成（３）で得た７，１０−ジフェニル−２，１５−
ジアザ［３．３］（２，９）−１，１０−フェナンスロ
リノファン硫酸塩（ｓ）　３８０ｍｇをジメチルホルム
アミド１０ｍｌに溶解し、炭酸カリウム２ｇ、ブロモ酢
酸エチル２ｍｌを加え、１００℃にて１２時間加熱撹拌
した。反応液を濾過し、濾液を濃縮した。濃縮された残
分をクロロホルム−メタノールを展開溶媒として用いて
シリカゲルカラムにて精製し、目的とする７，１０−ジ
フェニル−２，１５−ジアザ［３．３］（２，９）−１
，１０−フェナンスロリノファン−Ｎ２　，Ｎ１５−ジ
酢酸ジエチル（ｔ）　１８０ｍｇを得た。

【０１６６】（５）７，１０−ジフェニル−２，１５−
ジアザ［３．３］（２，９）−１，１０−フェナンスロ
リノファン−Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸（ｕ）　の合成（
４）で得た７，１０−ジフェニル−２，１５−ジアザ［
３．３］（２，９）−１，１０−フェナンスロリノファ
ン−Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸ジエチル（ｔ）　４０ｍｇ
をメタノール１０ｍｌに溶解し、水酸化カリウム５０ｍ
ｇを加え、８０℃で２時間還流した。反応液を濃縮後、
水１０ｍｌを加えて希釈し、希塩酸で中和した。析出し
た物質を濾別し、目的とする７，１０−ジフェニル−２
，１５−ジアザ［３．３］（２，９）−１，１０−フェ
ナンスロリノファン−Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸（ｕ）　
６５ｍｇを得た。

【０１６７】（実施例４）　　７，１０−ビス（クロロ
スルフォフェニル）−２，１５−ジアザ［３．３］（２
，９）−１，１０−フェナンスロリノファン−Ｎ２　，
Ｎ１５−ジ酢酸の合成 図３に示す合成経路図に従い、下記の方法で合成を行な
った。すなわち、実施例３で得た７，１０−ジフェニル
−２，１５−ジアザ［３．３］（２，９）−１，１０−
フェナンスロリノファン−Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸（ｕ
）　６０ｍｇをクロロスルフォン酸１ｍｌに溶解し、８
０℃で４時間加熱撹拌した。反応液を氷水２０ｍｌ中に
注ぎ、析出した物質を濾別後水洗し、減圧乾燥し、目的
とする７，１０−ビス（クロロスルフォフェニル）−２
，１５−ジアザ［３．３］（２，９）−１，１０−フェ
ナンスロリノファン−Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸（ｖ）　
４５ｍｇを得た。

【０１６８】（実施例５）　　７，１０，２０，２３−
テトラキス（クロロスルフォフェニル）−２，１５−ジ
アザ［３．３］（２，９）−１，１０−フェナンスロリ
ノファン−Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸の合成図４に示す合
成経路図に従い、下記の方法で合成を行なった。

【０１６９】（１）２，９−ジ（トシルアミノメチル）
−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナンスロリン（
ｘ）の合成 ２，９−メチル−４，７−ジフェニル−１，１０−フェ
ナンスロリンを原料として用い、「Ｊ．　Ｈｅｔｅｒｏ
ｃｙｃｌｉｃ　Ｃｈｅｍ．，　１８，　Ｐ．５９９，　
１９８１」に記載の方法により合成した２，９−ジ（ア
ミノメチル）−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナ
ンスロリン過塩素酸塩（ｗ）２．３６ｇ（４ｍｍｏｌ）
をピリジン２０ｍｌに溶解し、氷浴下で冷却しながら、
塩化ｐ−トルエンスルホニル１．６ｇ（８ｍｍｏｌ）を
加えた。室温で３時間撹拌し、反応液を水２００ｍｌに
注いだ後、クロロホルム２００ｍｌで抽出した。クロロ
ホルム抽出液を、クロロホルム−メタノールを展開溶媒
として用いてシリカゲルカラムにて精製し、目的とする
２，９−ジ（トシルアミノメチル）−４，７−ジフェニ
ル−１，１０−フェナンスロリン（ｘ）１．５４ｇを得
た。

【０１７０】（２）Ｎ２　，Ｎ１５−ジトシル−７，１
０，２０，２３−テトラフェニル−２，１５−ジアザ［
３．３］（２，９）−１，１０−フェナンスロリノファ
ン（ｙ）の合成 ２，９−ジ（ブロモメチル）−４，７−ジフェニル−１
，１０−フェナンスロリン（ｑ）（実施例３（１）参照
）５２０ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）と、（１）で得た２，
９−ジ（トシルアミノメチル）−４，７−ジフェニル−
１，１０−フェナンスロリン（ｘ）７００ｍｇ（１．０
ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド２０ｍｌに溶解し、
炭酸カリウム２ｇを加え、１２０℃にて４時間加熱撹拌
した。冷却後、反応液を濾過し、濾液を濃縮した。濃縮
された残分に水を加え、析出した結晶を濾別し、クロロ
ホルムより再結晶し、目的とするＮ２　，Ｎ１５−ジト
シル−７，１０，２０，２３−テトラフェニル−２，１
５−ジアザ［３．３］（２，９）−１，１０−フェナン
スロリノファン（ｙ）７９０ｍｇを得た。

【０１７１】（３）７，１０，２０，２３−テトラフェ
ニル−２，１５−ジアザ［３．３］（２，９）−１，１
０−フェナンスロリノファン硫酸塩（ｚ）の合成（２）
で得たＮ２　，Ｎ１５−ジトシル−７，１０，２０，２
３−テトラフェニル−２，１５−ジアザ［３．３］（２
，９）−１，１０−フェナンスロリノファン（ｙ）７４
０ｍｇを硫酸６ｍｌと酢酸９ｍｌの混合溶液に溶解し、
８０℃にて２０時間加熱撹拌した。反応液を氷水１００
ｍｌ中に注ぎ、析出した結晶を濾別し、水洗減圧乾燥し
、目的とする７，１０，２０，２３−テトラフェニル−
２，１５−ジアザ［３．３］（２，９）−１，１０−フ
ェナンスロリノファン硫酸塩（ｚ）４４５ｍｇを得た。

【０１７２】（４）７，１０，２０，２３−テトラフェ
ニル−２，１５−ジアザ［３．３］（２，９）−１，１
０−フェナンスロリノファン−Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸
ジエチル（α）の合成 （３）で得た７，１０，２０，２３−テトラフェニル−
２，１５−ジアザ［３．３］（２，９）−１，１０−フ
ェナンスロリノファン硫酸塩（ｚ）４１０ｍｇをジメチ
ルホルムアミド１０ｍｌに溶解し、炭酸カリウム２ｇ、
ブロモ酢酸エチル２ｍｌを加え、１００℃にて１２時間
加熱した。反応液を濾過し、濾液を濃縮後、クロロホル
ム−メタノールを展開溶媒として用いてシリカゲルカラ
ムにて精製し、目的とする７，１０，２０，２３−テト
ラフェニル−２，１５−ジアザ［３．３］（２，９）−
１，１０−フェナンスロリノファン−Ｎ２　，Ｎ１５−
ジ酢酸ジエチル（α）１９０ｍｇを得た。

【０１７３】（５）７，１０，２０，２３−テトラフェ
ニル−２，１５−ジアザ［３．３］（２，９）−１，１
０−フェナンスロリノファン−Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸
（β）の合成 （４）で得た７，１０，２０，２３−テトラフェニル−
２，１５−ジアザ［３．３］（２，９）−１，１０−フ
ェナンスロリノファン−Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸ジエチ
ル（α）１８５ｍｇをメタノール１０ｍｌに溶解し、水
酸化カリウム５０ｍｇを加え、２時間還流した。反応液
を濃縮後、水１０ｍｌを加えて希釈し、希塩酸で中和し
た。析出した物質を濾別し、目的とする７，１０，２０
，２３−テトラフェニル−２，１５−ジアザ［３．３］
（２，９）−１，１０−フェナンスロリノファン−Ｎ２
　，Ｎ１５−ジ酢酸（β）１０５ｍｇを得た。

【０１７４】（６）７，１０，２０，２３−テトラキス
（クロルスルフォフェニル）−２，１５−ジアザ［３．
３］（２，９）−１，１０−フェナンスロリノファン−
Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸（γ）の合成 （５）で得た７，１０，２０，２３−テトラフェニル−
２，１５−ジアザ［３．３］（２，９）−１，１０−フ
ェナンスロリノファン−Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸（β）
８６ｍｇをクロルスルフォン酸１ｍｌに溶解し、８０℃
で４時間加熱した。反応液を氷水２０ｍｌ中に注ぎ、析
出した物質を濾別後水洗し、減圧乾燥し、目的とする７
，１０，２０，２３−テトラキス（クロルスルフォフェ
ニル）−２，１５−ジアザ［３．３］（２，９）−１，
１０−フェナンスロリノファン−Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢
酸（γ）６０ｍｇを得た。

【０１７５】（実施例６）７，１０−ジフェニル−２，
１５−ジアザ［３．３］（２，９）−１，１０−フェナ
ンスロリノファン−Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸ユウロピウ
ム塩（ＰＡＰＰＡ−Ｅｕ）の合成 実施例３に従って合成した７，１０−ジフェニル−２，
１５−ジアザ［３．３］（２，９）−１，１０−フェナ
ンスロリノファン−Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸（ｕ）９０
ｍｇを５０％メタノール−水５０ｍｌに溶解した。ここ
に、塩化ユウロピウム１００ｍｇを加え、１時間還流し
た。 反応液を濃縮後、クロロホルム５０ｍｌに溶解し、それ
を５％塩化カリウム水溶液２０ｍｌで洗浄し、未反応の
塩化ユウロピウムを除いた。クロロホルム相を脱水濃縮
後、クロロホルム−メタノールを溶媒として用いてシリ
カゲルカラムにて精製し、目的とする７，１０−ジフェ
ニル−２，１５−ジアザ［３．３］（２，９）−１，１
０−フェナンスロリノファン−Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸
ユウロピウム塩（ＰＡＰＰＡ−Ｅｕ）４０ｍｇを得た。 目的物であることは、マススペクトル、元素分析で確認
した。

【０１７６】（実施例７）　　２，１５−ジアザ［３．
３］（２，９）−１，１０−フェナンスロリノファン−
Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸（ｇ）のユウロピウム錯体の蛍
光特性の検討 （１）吸収スペクトルの測定 実施例１にて合成した２，１５−ジアザ［３．３］（２
，９）−１，１０−フェナンスロリノファン−Ｎ２　，
Ｎ１５−ジ酢酸（ｇ）（以下、蛍光性化合物ｇと略称す
る）０．８ｍｇを、ジメチルスルホキシド４５８μｌ、
続いて蒸留水５．３ｍｌに溶解し、蛍光性化合物ｇ溶液
とした。また、塩化ユウロピウム７８８ｍｇを蒸留水２
１．５ｍｌに溶解し、塩化ユウロピウム溶液とした。両
溶液の各８０μｌを０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ１０．５）２ｍｌに添加、混合してサンプルとし、３
０分後に分光光度計（島津製作所社製ＵＶ−２１００）
にて吸収スペクトルを測定した。結果は図５に示した。 なお、コントロールとしてのジメチルスルホキシドおよ
び蒸留水の添加された０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ１０．５）と、塩化ユウロピウムを含まないこと以
外は同様に調製されたサンプルについても吸収スペクト
ルを測定し、同じく図５に示した。

【０１７７】（２）励起および蛍光スペクトルの測定（
１）にて調製した蛍光性化合物ｇ溶液と塩化ユウロピウ
ム溶液各３０μｌを、同じく（１）にて調製した炭酸ナ
トリウム緩衝液３ｍｌに添加、混合してサンプルとし、
３０分後にＪＡＳＣＯ　　ＦＰ−７７７スペクトロフル
オロメーター（日本分光工業社製）にて励起・蛍光スペ
クトルを測定した。結果は、図６（励起スペクトル）お
よび図７（蛍光スペクトル）に示した。図６より、蛍光
波長６１４ｎｍにおける励起スペクトル測定の結果、最
適励起波長は２４３ｎｍ付近であることが、また、図７
より、励起波長２４３ｎｍにおける蛍光スペクトル測定
の結果、蛍光波長は６１９ｎｍ付近であることが明らか
となった。

【０１７８】（３）ユウロピウム錯体の蛍光寿命の測定
（１）にて調製した蛍光性化合物ｇ溶液と塩化ユウロピ
ウム溶液各８０μｌを、同じく（１）にて調製した炭酸
ナトリウム緩衝液２ｍｌ中に添加、混合してサンプルと
し、３０分後に蛍光寿命を測定した。すなわち、窒素レ
ーザー（堀場製作所社製ＮＤＬ−１００）を励起源とし
て用い、蛍光寿命は、堀場製作所社製ＮＡＥＳ−１１０
０、浜松ホトニクス社製ユニバーサルフォトンカウンテ
ィングシステムにて測定した。なお、測定の際、励起波
長は３３７．１ｎｍ、検出波長は６１９ｎｍに設定した
。測定の結果は図８に示した通りであり、ユウロピウム
錯体の蛍光寿命は５０５μｓであった。

【０１７９】（４）錯体形成時間に及ぼす温度の影響の
検討 （１）にて調製した蛍光性化合物ｇ溶液と塩化ユウロピ
ウム溶液各４０μｌを、同じく（１）にて調製した炭酸
ナトリウム緩衝液にて各々５０倍に希釈した。希釈後の
各溶液を１．５ｍｌずつとり、ＪＡＳＣＯ　　ＦＰ−７
７７スペクトロフルオロメーター（既出）にセットした
石英セルに同時に注入し、蛍光強度の測定を開始した。 なお、溶液温度は２５、３０、３５℃の各々に設定し、
測定開始後３０分間測定した。また、測定に際し、励起
波長は２４２．０ｎｍ、蛍光波長は６１９．０ｎｍに固
定した。結果は図９に示す通りであり、錯体形成時の周
囲の温度が高いほど、蛍光強度が早く一定になる、すな
わち錯体が形成されるのに要する時間が短くなることが
観察された。図９より、最適錯体形成温度は約３５℃付
近であることが明らかとなったが、常温（２５℃）でも
２０分間程度で蛍光強度が一定になったので、常温で錯
体を形成させても問題はない。

【０１８０】（５）ユウロピウム錯体の水性媒質への溶
解性の検討 （１）にて調製した蛍光性化合物ｇ溶液を希釈し、０．
００１×１０−８Ｍ〜２５０×１０−８Ｍの各濃度の溶
液を調製した。また、（１）にて調製した塩化ユウロピ
ウム溶液３０μｌと各濃度の蛍光性化合物ｇ溶液各３０
μｌとを、同じく（１）にて調製した炭酸ナトリウム緩
衝液２．９４ｍｌに添加し、混合してサンプルとした。 それらを３時間静置した後、各々について、ワラックＬ
ＫＢ製１２３０アーカス蛍光光度計にて蛍光強度を測定
した。結果は図１０に示したが、蛍光性化合物ｇ濃度が
０．１×１０−８Ｍ〜２５０×１０−８Ｍの範囲におい
て、蛍光強度と化合物濃度との間にほぼ直線的な相関が
みられた。

【０１８１】（実施例８）　　７，１０−ジフェニル−
２，１５−ジアザ［３．３］（２，９）−１，１０−フ
ェナンスロリノファン−Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸（ｕ）
のユウロピウム錯体および７，１０−ジフェニル−２，
１５−ジアザ［３．３］（２，９）−１，１０−フェナ
ンスロリノファン−Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸ユウロピウ
ム塩（ＰＡＰＰＡ−Ｅｕ）の蛍光特性の検討 （１）励起および蛍光スペクトルの測定実施例４にて合
成した７，１０−ジフェニル−２，１５−ジアザ［３．
３］（２，９）−１，１０−フェナンスロリノファン−
Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸（ｕ）（以下、蛍光性化合物ｕ
と略称する）を、５０％メタノール−水に溶解し、２．
５×１０−４Ｍ溶液とした。この蛍光性化合物ｕ溶液３
０μｌと２．５×１０−４Ｍの塩化ユウロピウム溶液３
０μｌを３ｍｌの０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
５．５）に加え、撹拌し、蛍光性化合物ｕのユウロピウ
ム錯体溶液とした。これを５０℃にて１時間インキュベ
イトした後、励起スペクトルおよび蛍光スペクトルをＦ
Ｐ−７７７スペクトロフルオロメーター（既出）にて測
定した。また、実施例６にて合成したＰＡＰＰＡ−Ｅｕ
を、０．２Ｍトリス酢酸緩衝液（ｐＨ９．０）にて２．
５×１０−６Ｍ溶液に調製し、上述のようにして励起ス
ペクトルおよび蛍光スペクトルを測定した。図１１には
両者の励起スペクトル、図１２には両者の蛍光スペクト
ルを示した。両図から明らかなように、蛍光性化合物ｕ
のユウロピウム錯体と、合成段階で錯体を形成させたＰ
ＡＰＰＡ−Ｅｕのスペクトルパターンはほとんど同じで
あり、先の蛍光性化合物ｇのユウロピウム錯体と同じく
、６１９ｎｍにユウロピウム由来の蛍光が観察された。

【０１８２】（２）蛍光寿命の測定 （１）において調製した、蛍光性化合物ｕのユウロピウ
ム錯体溶液、および、ＰＡＰＰＡ−Ｅｕ溶液を用い、蛍
光寿命測定機（既出）にてそれらの蛍光寿命を測定した
ところ、蛍光性化合物ｕのユウロピウム錯体は１１４０
μｓ、ＰＡＰＰＡ−Ｅｕは１１８０μｓといずれも長く
、これらは時間分解蛍光法に充分応用可能であることが
明らかとなった。

【０１８３】（実施例９）　　７，１０−ビス（クロロ
スルフォフェニル）−２，１５−ジアザ［３．３］（２
，９）−１，１０−フェナンスロリノファン−Ｎ２　，
Ｎ１５−ジ酢酸ｖ標識抗ｈＣＧモノクローナル抗体の調
製（１）蛍光性化合物ｖ標識抗体−１の調製実施例４で
合成した７，１０−ビス（クロロスルフォフェニル）−
２，１５−ジアザ［３．３］（２，９）−１，１０−フ
ェナンスロリノファン−Ｎ２，Ｎ１５−ジ酢酸ｖ（以下
、蛍光性化合物ｖと略称する）０．５ｍｇ（５．５×１
０−７ｍｏｌ）に、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ９．１）にて６×１０−５Ｍに調製した抗ｈＣＧモノ
クローナル抗体（ＨＭ２１；持田製薬製）溶液０．２ｍ
ｌを加え、撹拌溶解させ、そのまま撹拌下、室温にて３
０分間反応させた。続いて、その反応液を、０．１Ｍ炭
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．１）にて平衡化させたセ
ファデックスＧ−５０カラム（ファルマシア社製）にア
プライし、未反応の蛍光性化合物ｖを除去した。

【０１８４】図１３にセファデックスＧ−５０カラムに
よる精製パターンを示す。ボイド分画に蛍光活性が見い
だされ、蛍光性化合物ｖ標識抗体−１の存在が示された
。ボイド分画をプールしたのち、セントリコン（アミコ
ン社製）にて濃縮し、０．０５％ＮａＮ３　、０．９％
ＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．２
）にて透析した。得られた蛍光性化合物ｖ標識抗体−１
濃度を、３１０ｎｍと２８０ｎｍの２波長における吸光
度を測定することにより、蛍光性化合物ｖ濃度および抗
体濃度のそれぞれについて求めたところ、蛍光性化合物
ｖ濃度は１．７×１０−５Ｍ、抗体濃度は１．２×１０
−６Ｍであった。すなわち、抗体一分子あたり、１４分
子の蛍光性化合物ｖが標識されていた。

【０１８５】（２）蛍光性化合物ｖ標識抗体−２の調製
ジメチルホルムアミドに蛍光性化合物ｖを溶解し、６０
ｍＭ溶液を調製した。０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ９．１）にて６×１０−５Ｍに調製した抗ｈＣＧモ
ノクローナル抗体（ＨＭ２１）溶液０．２ｍｌに対し、
上記蛍光性化合物ｖ溶液１０μｌを加え、撹拌下、室温
にて３０分間反応させた。以下、蛍光性化合物ｖ標識抗
体−２の精製法は、実施例９（１）に準じた。得られた
蛍光性化合物ｖ標識抗体−２濃度を、３１０ｎｍと２８
０ｎｍの２波長における吸光度を測定することにより、
蛍光性化合物ｖ濃度および抗体濃度のそれぞれについて
求めたところ、蛍光性化合物ｖ濃度は１．０×１０−５
Ｍ、抗体濃度は１．０×１０−６Ｍであった。すなわち
、抗体一分子あたり、１０分子の蛍光性化合物ｖが標識
されていた。

【０１８６】（３）蛍光性化合物ｖ−希土類金属錯体標
識抗体の調製 ジメチルホルムアミドに、蛍光性化合物ｖが６０ｍＭ、
塩化ユウロピウムが１２０ｍＭとなるよう溶解させ、室
温にて１時間静置し、錯体を形成させた。この蛍光性化
合物ｖ−ユウロピウム錯体溶液１０μｌを、０．１Ｍ炭
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．１）にて６×１０−５Ｍ
に調製した抗ｈＣＧモノクローナル抗体（ＨＭ２１）溶
液０．２ｍｌに加え、撹拌溶解させ、そのまま撹拌下、
室温にて３０分間反応させた。以下、蛍光性化合物ｖ−
希土類金属錯体の精製法は、実施例９（１）に準じた。 得られた蛍光性化合物ｖ−希土類金属錯体標識抗体濃度
を、３１０ｎｍと２８０ｎｍの２波長における吸光度を
測定することにより、蛍光性化合物ｖ−希土類金属錯体
濃度および抗体濃度のそれぞれについて求めたところ、
蛍光性化合物ｖ−希土類金属錯体濃度は２．１×１０−
５Ｍ、抗体濃度は１．５×１０−６Ｍであった。すなわ
ち、抗体一分子あたり、１４分子の蛍光性化合物ｖ−希
土類金属錯体が標識されていた。

【０１８７】（実施例１０）　　８−（３´−スクシイ
ミジルオキシカルボニルプロピオンアミド）−２，１５
−ジアザ［３．３］（２，９）−１，１０−フェナンス
ロリノファン−Ｎ２，Ｎ１５−ジ酢酸ｐ標識抗ｈＣＧモ
ノクローナル抗体および７，１０，２０，２３−テトラ
キス（クロロスルフォフェニル）−２，１５−ジアザ［
３．３］（２，９）−１，１０−フェナンスロリノファ
ン−Ｎ２，Ｎ１５−ジ酢酸γ標識抗ｈＣＧモノクローナ
ル抗体の調製 （１）蛍光性化合物ｐ標識抗体の調製 実施例２で合成した８−（３´−スクシイミジルオキシ
カルボニルプロピオンアミド）　−２，１５−ジアザ［
３．３］（２，９）−１，１０−フェナンスロリノファ
ン−Ｎ２，Ｎ１５−ジ酢酸ｐ（以下、蛍光性化合物ｐと
略称する）をエタノールに溶解し、６０ｍＭの蛍光性化
合物ｐ溶液とした。０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ９．１）にて６×１０−５Ｍに調製した抗ｈＣＧモノ
クローナル抗体（ＨＭ２１）溶液０．２ｍｌに対し、上
記蛍光性化合物ｐ溶液１０μｌを加え、撹拌下、室温に
て３０分間反応させた。以下、蛍光性化合物ｐ標識抗体
の精製法は、実施例９（１）に準じた。得られた蛍光性
化合物ｐ標識抗体濃度を、３１０ｎｍと２８０ｎｍの２
波長における吸光度を測定することにより、蛍光性化合
物ｐ濃度および抗体濃度のそれぞれについて求めたとこ
ろ、蛍光性化合物ｐ濃度は１．０×１０−５Ｍ、抗体濃
度は０．９×１０−６Ｍであった。すなわち、抗体一分
子あたり、１１分子の蛍光性化合物ｐが標識されていた
。

【０１８８】（２）蛍光性化合物γ標識抗体の調製実施
例５で合成した７，１０，２０，２３−テトラキス（ク
ロロスルフォフェニル）−２，１５−ジアザ［３．３］
（２，９）−１，１０−フェナンスロリノファン−Ｎ２
　，Ｎ１５−ジ酢酸γ（以下、蛍光性化合物γと略称す
る）をジメチルホルムアミドに溶解し、６０ｍＭの蛍光
性化合物γ溶液とした。０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ９．１）にて６×１０−５Ｍに調製した抗ｈＣＧ
モノクローナル抗体（ＨＭ２１）溶液０．２ｍｌに対し
、上記蛍光性化合物γ溶液１０μｌを加え、撹拌下、室
温にて３０分間反応させた。以下、蛍光性化合物γ標識
抗体の精製法は、実施例９（１）に準じた。得られた蛍
光性化合物γ標識抗体濃度を、３１０ｎｍと２８０ｎｍ
の２波長における吸光度を測定することにより、蛍光性
化合物γ濃度および抗体濃度のそれぞれについて求めた
ところ、蛍光性化合物γ濃度は６．４×１０−６Ｍ、抗
体濃度は０．８×１０−６Ｍであった。すなわち、抗体
一分子あたり、８分子の蛍光性化合物γが標識されてい
た。

【０１８９】（実施例１１）　　蛍光性化合物ｖ標識チ
ロキシンの調製 実施例４で合成した蛍光性化合物ｖをジメチルホルムア
ミドに溶解し、５×１０−５Ｍの蛍光性化合物ｖ溶液と
した。チロキシンナトリウム塩をエタノールに溶解し、
５×１０−５Ｍの溶液とした。蛍光性化合物ｖ溶液１０
０μｌとチロキシンナトリウム塩のエタノール溶液１０
０μｌとを混合し、撹拌下、室温で３０分間反応させた
。反応液をＨＰＬＣ（カラム：ＡＰ−３１３、株式会社
ＹＭＣ製；溶媒：０．０２％酢酸を含むメタノール：水
＝３：７（Ｖ：Ｖ））にアプライし、蛍光性化合物ｖ標
識チロキシン画分を分取した。蛍光性化合物ｖ標識チロ
キシン画分の同定は、各分画について、チロキシン酵素
免疫測定キット（ベーリンガーマンハイム社製）にてチ
ロキシン活性を測定すると共に、１０−５Ｍ濃度の塩化
ユウロピウム溶液と等量混合した後に蛍光強度を測定す
ることにより行なった。両活性が存在する画分を蛍光性
化合物ｖ標識チロキシン画分とした。

【０１９０】（実施例１２）　　蛍光性化合物ｖ標識Ｈ
Ｂｓ抗原の調製 実施例４で合成した蛍光性化合物ｖ０．５ｍｇに、０．
１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．１）にて６×１０
−５Ｍに調製したヒトプラズマより精製したＨＢｓ抗原
（キールシュガー社製）溶液０．２ｍｌを加え、撹拌溶
解させ、そのまま撹拌下、室温にて３０分間反応させた
。以下、蛍光性化合物ｖ標識ＨＢｓ抗原の精製法は、実
施例９（１）に準じた。得られた蛍光性化合物ｖ標識Ｈ
Ｂｓ抗原濃度を、３１０ｎｍと２８０ｎｍの２波長にお
ける吸光度を測定することにより、蛍光性化合物ｖ濃度
およびＨＢｓ抗原濃度のそれぞれについて求めたところ
、蛍光性化合物ｖ濃度は４．８×１０−６Ｍ、ＨＢｓ抗
原濃度は１．２×１０−６Ｍであった。すなわち、ＨＢ
ｓ抗原一分子あたり、４分子の蛍光性化合物ｖが標識さ
れていた。

【０１９１】（実施例１３）　　蛍光化合物ｖ標識ＨＢ
Ｖオリゴマープローブの調製 実施例４で合成した蛍光性化合物ｖをジメチルホルムア
ミドに溶解し、１００ｍＭの蛍光性化合物ｖ溶液を調製
した。核酸合成機（アプライドバイオシステム社製、モ
デル３８１Ａ）を用いてＨＢウイルスの核酸配列に相補
的なオリゴマープローブ（Ｃ領域１９４１ー１９７０、
３０ｍｅｒ）を合成し、アミノリンカー２（アプライド
バイオシステム社製）を用いて５´末端にアミノ基を導
入した。常法に従い、オリゴマーを切り出し、エタノー
ル沈澱により脱塩を行なった。次に、このオリゴマー４
０μｇを８０μｌの０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ９．０）に溶解し、そこに、１００ｍＭの蛍光性化合
物ｖ溶液２４μｌを添加し、室温にて３０分間反応させ
た。反応終了後、反応液を、５０ｍＭトリエチルアミン
アセテート（以下、ＴＥＡＡと略称する）（ｐＨ７．０
）にて平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（ファ
ルマシア社製）にアプライし、未反応の蛍光性化合物ｖ
を除去した。ボイド分画を分取し、それをセントリコン
３（アミコン社製）にて濃縮した後、ＨＰＬＣにて精製
した。精製には、Ｃ８逆相カラム（ＡｑｕａｐｏｒｅＲ
Ｐ３００　　Ｃ８、アプライドバイオシステム社製）を
用い、５０ｍＭＴＥＡＡ中のアセトニトリル濃度を１５
％から３０％へ上昇させることによりグラジエント溶出
した。各画分の２６０ｎｍにおける吸光度と蛍光強度と
を測定し、両者の一致した分画をプールした。プールし
た液を真空乾燥し、１ｍＭＥＤＴＡを含む０．１Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、濃度が５μｇ／ｍｌと
なるように溶解した。

【０１９２】（実施例１４）　　蛍光性化合物ｖ標識ス
トレプトアビジンの調製 実施例４で合成した蛍光性化合物ｖ０．５ｍｇに、０．
１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．１）にて６×１０
−５Ｍに調製したストレプトアビジン（シグマ社製）溶
液０．２ｍｌを加え、撹拌溶解させ、そのまま撹拌下、
室温にて３０分間反応させた。以下、蛍光性化合物ｖ標
識ストレプトアビジンの精製法は、実施例９（１）に準
じた。得られた蛍光性化合物ｖ標識ストレプトアビジン
濃度を、３１０ｎｍと２８０ｎｍの２波長における吸光
度を測定することにより、蛍光性化合物ｖ濃度およびス
トレプトアビジン濃度のそれぞれについて求めたところ
、蛍光性化合物ｖ濃度は１．３×１−５Ｍ、ストレプト
アビジン濃度は１．４×１０−６Ｍであった。すなわち
、ストレプトアビジン一分子あたり、９分子の蛍光性化
合物ｖが標識されていた。 （実施例１５）　　蛍光性化合物ｖ標識ＢＳＡ結合抗体
の調製 （１）蛍光性化合物ｖ標識ＢＳＡの調製実施例４で合成
した蛍光性化合物ｖ２．５ｍｇに、０．１Ｍ炭酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ９．１）にて６×１０−５Ｍに調製し
たＢＳＡ溶液１ｍｌを加え、撹拌溶解させ、そのまま撹
拌下、室温にて３０分間反応させた。以下、蛍光性化合
物ｖ標識ＢＳＡの精製法は、実施例９（１）に準じた。 得られた蛍光性化合物ｖ標識ＢＳＡについて、プロテイ
ンアッセイキット（バイオラッド社製）により、ＢＳＡ
濃度を求め、３１０ｎｍにおける吸光度を測定すること
により、蛍光性化合物ｖ濃度を求めた。その結果、蛍光
性化合物ｖ濃度は８．４×１０−５Ｍ、ＢＳＡ濃度は７
．０×１０−６Ｍであった。すなわち、ＢＳＡ一分子あ
たり、１２分子の蛍光性化合物ｖが標識されていた。

【０１９３】（２）蛍光性化合物ｖ標識ＢＳＡへのマレ
イミド基の導入 ５０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．０）に緩衝液置換を行
ない、濃縮した３×１０−５Ｍ濃度の蛍光性化合物ｖ標
識ＢＳＡ溶液１ｍｌに対して、同緩衝液にて１８ｍＭ濃
度に調製したスルホスクシイミジル−４−（Ｎ−マレイ
ミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート
（ｓｕｌｆｏＳＭＣＣ、ピアス社製）を１００μｌ加え
、撹拌下、室温で１時間反応させた。マレイミド基の導
入された蛍光性化合物ｖ標識ＢＳＡは、０．１Ｍりん酸
緩衝液（ｐＨ６．２）にて平衡化させたセファデックス
Ｇ−２５カラムにて精製、分取し、セントリコンで濃縮
した。導入されたマレイミド基の数を、石川らの方法（
Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，　４（３），２０９−
３２７（１９８３））により求めたところ、ＢＳＡ一分
子あたり５分子のマレイミド基が導入されていた。

【０１９４】（３）メルカプト基含有抗体の調製０．１
Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．１）にて３×１０−
５Ｍに調製した抗ｈＣＧモノクローナル抗体（ＨＭ２１
）１ｍｌに対し、ジメチルホルムアミドにて１５ｍＭに
調製したＮ−スクシイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテ
ート（ＳＡＴＡ、カルビオケム・ベーリング社製）溶液
１０μｌを、撹拌下、２．５μｌずつ１分間隔で４回に
分けて添加した。室温で１時間反応させた後、０．１Ｍ
りん酸緩衝液（ｐＨ６．２）にて透析を行ない、セント
リコンで濃縮した。導入されたＳＡＴＡ分子数を、上記
石川らの方法を用いて測定したところ、抗体一分子あた
り約３分子であった。

【０１９５】（４）蛍光性化合物ｖ標識ＢＳＡ結合抗体
の調製 （２）で得たマレイミド基含有蛍光性化合物ｖ標識ＢＳ
Ａと、（３）で得たメルカプト基含有抗体とを結合させ
、標識剤が抗体に間接的に結合した標識抗体を調製した
。すなわち、マレイミド基含有蛍光性化合物ｖ標識ＢＳ
Ａ溶液４００μｌとメルカプト基含有抗体溶液３００μ
ｌとを混合し、それを窒素雰囲気下で３００μｌまでに
濃縮した。その濃縮溶液を充分窒素置換した後、５０μ
ｌの０．５ＭＮＨ２　ＯＨ（ｐＨ７．０）を加え、３７
℃にて２時間反応させた。反応後、０．１２Ｍの２−メ
ルカプトエタノール２０μｌを加え、室温で１５分間反
応させ、さらに０．２４ＭのＮーエチルマレイミド２０
μｌを加え、室温で１５分間反応させた。反応液をウル
トロゲルＡｃＡ３４カラム（ＩＢＦ社製）にアプライし
、蛍光性化合物ｐ標識ＢＳＡと抗体とが、マレイミド基
とメルカプト基で結合した画分を分取した。なお、画分
の同定は、ｈＣＧ酵素免疫測定キット（持田製薬製）に
おける競合活性で抗体活性を調べると共に、１０−５Ｍ
の塩化ユウロピウム溶液を加えて蛍光活性を調べること
によって行なった。

【０１９６】（実施例１６）　　蛍光性化合物ｖ標識抗
体あるいは蛍光性化合物ｖ−希土類金属錯体標識抗体を
用いたｈＣＧ免疫測定 ９６ウェルプレート（ＥＦＬＡＢ社製）に、抗体濃度が
１０μｇ／ｍｌとなるように０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ９．６）にて調製した抗ｈＣＧモノクローナ
ル抗体（ＨＭ７０；持田製薬製）溶液を２００μｌ／ウ
ェル分注し、３７℃にて１時間インキュベイトした。精
製水で洗浄後、０．０５％のＮａＮ３　を含む、０．１
Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）にて濃度０．５
％に調製したＢＳＡ溶液を３００μｌ／ウェル加え、室
温にて２時間以上イキンュベイトし、ブロッキング処理
を行なった。この抗体固相化プレートは、使用時まで冷
蔵保存した。

【０１９７】この抗体固相化プレートを精製水で洗浄後
、正常家兎血清（以下、ＮＲＳと略称する）にて所定濃
度に希釈したｈＣＧ標準品（１ｓｔＩＲＰ、７５／５３
７に合わせた）および０．９％塩化ナトリウム、０．５
％ＢＳＡ、０．０５％牛ガンマグロブリンならびに０．
０１％ツイーン４０を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（
ｐＨ７．８）（以下、アッセイバッファーと略称する）
を１００μｌ／ウェル加え、撹拌後、室温で１時間イン
キュベイトした。０．００５％ツイーン２０を含む生理
食塩水（洗浄液）にて各ウェルを洗浄後、１０−５Ｍの
塩化ユウロピウムを含むアッセイバッファーにて０．５
μｇ／ｍｌに希釈した蛍光性化合物ｖ標識抗体−１（実
施例９参照）、あるいは、同じく１０−５Ｍの塩化ユウ
ロピウムを含むアッセイバッファーにて０．７μｇ／ｍ
ｌに希釈した蛍光性化合物ｖ標識抗体−２（実施例９参
照）を、２００μｌ／ウェル加えた。また、蛍光性化合
物ｖ−希土類金属錯体標識抗体（実施例９参照）は、ア
ッセイバッファーにて０．３ｇ／ｍｌに希釈して用いた
。室温で１時間インキュベイトした後、洗浄液で洗浄し
、未反応の標識抗体を除去した後、時間分解蛍光光度計
（アーカス１２３０、ＬＫＢ−ワラック社製）にて時間
分解蛍光強度を測定した。図１４に示すごとく、標識方
法の違い、また、錯体形成を標識時に行なうか、免疫反
応中に行なうかの違いによる差はほとんどなく、しかも
、高感度にｈＣＧを測定することが可能であった。

【０１９８】（実施例１７）　　蛍光性化合物ｐ標識抗
体および蛍光性化合物γ標識抗体を用いたｈＣＧ免疫測
定蛍光性化合物ｐ標識抗体（実施例１０参照）は０．８
μｇ／ｍｌに、蛍光性化合物γ標識抗体（実施例１０参
照）は１．２μｇ／ｍｌになるように、各々１０−５Ｍ
の塩化ユウロピウムを含むアッセイバッファーにて希釈
して用いた以外は、実施例１６に準じた。図１５に示す
ごとく、蛍光性標識剤として蛍光性化合物ｐまたは蛍光
性化合物γを用いた場合、その免疫測定における反応性
は実施例１６に示した蛍光性化合物ｖを用いた場合に比
較して殆ど差がなく、これら蛍光性化合物ｐまたは蛍光
性化合物γを標識剤として用いても、蛍光性化合物ｖを
標識剤として用いた場合と同様、高感度な免疫測定が可
能であった。

【０１９９】（実施例１８）　　蛍光性化合物ｖ標識チ
ロキシンを用いた免疫測定 ９６ウェルプレート（ＥＦＬＡＢ社製）に、抗体濃度が
１０μｇ／ｍｌとなるように０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ９．６）にて調製した抗ｈＣＧチロキシンモ
ノクローナル抗体（０６７−Ａ２２０３；バイオスパシ
フィック社製）溶液を２００μｌ／ウェル分注し、３７
℃にて１時間インキュベイトした。精製水で洗浄後、０
．０５％のアジ化ナトリウムを含む、０．１Ｍ炭酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ８．３）にて濃度０．５％に調製し
たＢＳＡ溶液を３００μｌ／ウェル加え、室温にて２時
間以上イキンュベイトし、ブロッキング処理を行なった
。この抗体固相化プレートは、使用時まで冷蔵保存した
。

【０２００】この抗体固相化プレートを精製水で洗浄後
、チャコール処理したＮＲＳにて所定濃度に希釈したチ
ロキシン標準品５０μｌと、アッセイバッファーにて２
０ｎｇ／ｍｌに希釈した蛍光性化合物ｖ標識チロキシン
（実施例１１参照）１５０μｌとを各ウェルに加え、撹
拌した後、室温で１時間インキュベイトした。洗浄液に
て洗浄し、未反応の標識チロキシンを除去した。ここに
、２×１０−６Ｍの塩化ユウロピウムを含む０．２Ｍト
リス−酢酸緩衝液（ｐＨ９．０）を２００μｌ／ウェル
加え、室温にて１時間静置した後、時間分解蛍光光度計
（既出）にて時間分解蛍光強度を測定した。図１６に示
すごとく、５ｎｇ／ｍｌの感度まで測定が可能であった
。

【０２０１】（実施例１９）　　蛍光性化合物ｖ標識Ｈ
Ｂｓ抗原を用いた抗ＨＢｓ抗体の測定 ９６ウェルプレートに、抗原濃度が１０μｇ／ｍｌとな
るように０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）
にて調製したヒトプラズマから精製したＨＢｓ抗原（キ
ールシュガー社製）溶液を２００μｌ／ウェル分注し、
３７℃にて１時間インキュベイトした。精製水で洗浄後
、０．０５％のアジ化ナトリウムを含む、０．１Ｍ炭酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）にて濃度０．５％に調
製したＢＳＡ溶液を３００μｌ／ウェル加え、室温にて
２時間以上イキンュベイトし、ブロッキング処理を行な
った。このＨＢｓ抗原固相化プレートは、使用時まで冷
蔵保存した。

【０２０２】このＨＢｓ抗原固相化プレートを精製水で
洗浄後、抗ＨＢｓ抗体が陰性または陽性のコントロール
ヒト血清またはサンプル血清を５０μｌ／ウェルと、ア
ッセイバッファー１５０μｌ／ウェルを加え、撹拌後、
室温で１時間インキュベイトした。洗浄液にて洗浄後、
１０−５Ｍの塩化ユウロピウムを含むアッセイバッファ
ーにて１μｇ／ｍｌに希釈した蛍光性化合物ｖ標識ＨＢ
ｓ抗原（実施例１２参照）を２００μ／ウェルを加え、
室温で１時間インキュベイトした。その後、洗浄液で洗
浄し、未反応の標識ＨＢｓ抗原を除去し、時間分解蛍光
光度計（既出）にて時間分解蛍光強度を測定した。表１
に示すごとく、１００検体の測定において、この蛍光性
化合物ｖを標識剤として用いた本発明の方法では、２８
例が陽性であった。

【０２０３】同じ検体について、市販の酵素免疫測定キ
ット（エルジアａｎｔｉ−ＨＢｓ、国際試薬社製）を用
いて抗ＨＢｓ抗体の測定を行なったところ、２６例が陽
性であった。このように、本発明法は、従来法に比べて
検出感度が高い。

【０２０４】

【０２０５】（実施例２０）　　蛍光性化合物ｖ標識Ｈ
ＢＶオリゴマープローブを用いたＨＢＶ−ＤＮＡの測定
ＨＢＶ−ＤＮＡが１３２５ｐｇ／ｍｌであるＢ型慢性肝
炎患者血清を正常人（ＨＢＶ−ＤＮＡ陰性）の血清で段
階希釈したものを血清検体として使用した。血清検体１
００μｌに、５ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ、１％ドデ
シル硫酸ナトリム（ＳＤＳ）、５ｍＭ　　ＥＤＴＡを含
む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．５）１０μｌを添加し
、６８℃にて１時間処理した。続いて、常法に従い、フ
ェノール／クロロホルム処理を２回行ない、検体処理液
２００μｌを得た。検体処理液を熱変性後（９５℃、１
０分間処理、のち急冷）それらを９６ウェルプレートの
各ウェルに吸着固定化させた。洗浄後、ハイブリダイゼ
ーション溶液（６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄ’ｓ、
０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性さけ精子ＤＮＡ
、１０−５Ｍ塩化ユウロピウム）に蛍光性化合物ｖ標識
ＨＢＶオリゴマープローブ（実施例１３参照）を添加し
、ＨＢＶオリゴマープローブ濃度が５０ｎｇ／ｍｌの溶
液を調製した。それを各ウェルに２００μｌずつ添加し
、５５℃にて３時間反応（ハイブリダイゼーション）さ
せた。ハイブリダイゼーション後、プレートを２×ＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳにて、室温で、５分間／回で、５回
洗浄し、未反応の標識プローブを除去した。時間分解蛍
光光度計にて時間分解蛍光強度を測定したところ、図１
７にしめすごとく、１ｐｇ／ｍｌまで測定可能であった
。また、Ｂ型慢性肝炎患者血清および正常人血清各５例
について、同様の方法で測定したところ、両者間の差は
明瞭であった（図１８参照）。

【０２０６】（実施例２１）　　蛍光性化合物ｖ標識ス
トレプトアビジンを標識物質として用いたｈＣＧ免疫測
定実施例１６に準じ、抗ｈＣＧモノクローナル抗体（Ｈ
Ｍ７０；持田製薬製）を固相化させた９６ウェルプレー
ト（既出）を調製した。ブロッキング処理の終わった抗
体固相化プレートを精製水で洗浄後、ＮＲＳにて所定濃
度に希釈したｈＣＧ標準品（１ｓｔＩＲＰ、７５／５３
７に合わせた）を５０μｌ／ウェルおよびアッセイバッ
ファーを１５０μｌ／ウェル加え、撹拌後、室温で１時
間インキュベイトした。洗浄液にて洗浄後、アッセイバ
ッファーにて２μｇ／ｍｌ濃度に希釈したビオチン標識
ＨＭ２１抗体溶液を１００μｌ／ウェル加え、さらに室
温で１時間反応させた。なお、ビオチン標識ＨＭ２１抗
体の作製は、Ｄｉａｍａｎｄｉｓ，　Ｅ．　Ｐ．らの方
法（Ａｎａｌ．　Ｃｈｅｍ．，　６１，ｐ．ｐ．４８−
５３，　１９８９）に従った。反応後、洗浄液にて洗浄
し、１０−５Ｍの塩化ユウロピウムを含むアッセイバッ
ファーにて０．５μｇ／ｍｌ濃度に希釈した蛍光性化合
物ｖ標識ストレプトアビジン（実施例１４参照）の溶液
を１００μｌ／ウェル加え、室温で１時間インキュベイ
トし、洗浄液で洗浄し、未反応の標識ストレプトアビジ
ンを除去した後、時間分解蛍光光度計（既出）にて時間
分解蛍光強度を測定した。図１９に示すごとく、この増
幅法を用いることにより、標識剤（ここでは蛍光性化合
物ｖ）が特異的結合体（ここでは抗体）に直接結合した
標識抗体を用いる場合（実施例１６）に比べ、約３倍反
応性が上昇した。

【０２０７】（実施例２２）　　蛍光性化合物ｖ標識Ｂ
ＳＡ結合抗体を用いたｈＣＧ免疫測定 アッセイは、蛍光性化合物ｖ標識抗体（ＨＭ２１）のか
わりに、実施例１５で調製した蛍光性化合物ｖ標識ＢＳ
Ａ結合抗体の溶液（１．５μｇ／ｍｌ）を用いた以外は
、実施例１６に準じて行なった。図１９に示すごとく、
実施例１６に比べ、この標識剤増幅法では反応性が約５
倍上昇した。

【０２０８】

【発明の効果】本発明により、以下に示す特徴を有する
蛍光性化合物、錯体、試薬および特異的結合アッセイが
提供される。

【０２０９】すなわち ・本発明の蛍光性化合物は、環構造を有しており、その
空孔サイズは希土類金属イオン半径とほぼ一致するため
、希土類金属イオンと共に安定な錯体を形成する。 ・本発明の蛍光性化合物には、カルボキシル基が存在す
るものがあり、その場合、環により形成される平面構造
の配位に加え、希土類金属イオンに親和性の高いカルボ
キシル基による垂直上下方向からの配位もあるため、き
わめて安定な錯体を形成する。 ・本発明の蛍光性化合物は、カルボキシル基が存在する
場合、水溶性を有している。 ・本発明の蛍光性化合物は、カルボキシル基が存在する
場合、いかなるｐＨ環境においても酸化されることなく
、安定な状態を維持できる。 ・本発明の蛍光性化合物は、水溶液中においても安定で
、かつ、該蛍光性化合物と希土類金属イオンで形成され
る錯体は、中心金属イオンに対し、疎水環境を形成しや
すくなるため、水による蛍光消光を受けにくい。 ・本発明の蛍光性化合物は、特異的結合体に結合し得る
官能基を有しており、かつ、この官能基の存在は蛍光特
性に影響がない。 ・本発明の蛍光性化合物は、二つのフェナンスロリン環
を有し、希土類金属イオンと共に錯体を形成するに際し
、希土類金属イオン一個あたりに二つのフェナンスロリ
ン環が配位する。従って、単位金属イオンあたりに吸収
される励起エネルギー量が多くなり、蛍光強度の強い錯
体が形成される。 ・本発明の錯体の蛍光寿命は、バックグラウンド蛍光に
比べて十分に長い。従って、バックグラウンド蛍光が消
失した後に蛍光強度を測定すること（時間分解蛍光分析
）により、バックグラウンドの影響を受けないで蛍光強
度を測定できる。 ・本発明の試薬は、上記本発明の蛍光性化合物または錯
体が有する特徴と、該蛍光性化合物または錯体が結合せ
られる特異的結合体の有する活性、結合性等の諸性質と
を保持しているので、本発明の試薬を用いることにより
、危険がなく、かつ、高感度の免疫測定が可能となる。 ・本発明の特異的結合アッセイは、従来の酵素免疫測定
法における標識物質を、本発明の試薬に置き換えるだけ
で行なうことができ、かつ、本発明によれば、従来にな
い高感度が達成される。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１に示す２，１５−ジアザ［３．３］（
２，９）−１，１０−フェナンスロリノファン−Ｎ２　
，Ｎ１５−ジ酢酸の合成経路図である。

【図２】実施例２に示す８−（３´−スクシイミジルオ
キシカルボニルプロピオンアミド−２，１５−ジアザ［
３．３］（２，９）−１，１０−フェナンスロリノファ
ン−Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸の合成経路図である。

【図３】７，１０−ジフェニル−２，１５−ジアザ［３
．３］（２，９）−１，１０−フェナンスロリノファン
−Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸および７，１０−ビス（クロ
ロスルフォフェニル）−２，１５−ジアザ［３．３］（
２，９）−１，１０−フェナンスロリノファン−Ｎ２　
，Ｎ１５−ジ酢酸の合成経路図である。

【図４】実施例５に示す７，１０，２０，２３−テトラ
キス（クロロスルフォフェニル）−２，１５−ジアザ［
３．３］（２，９）−１，１０−フェナンスロリノファ
ン−Ｎ２　，Ｎ１５−ジ酢酸の合成経路図である。

【図５】実施例７における、蛍光性化合物ｇとユウロピ
ウムイオンによって形成された錯体の吸収スペクトルで
ある。

【図６】実施例７における、蛍光性化合物ｇとユウロピ
ウムイオンによって形成された錯体の励起スペクトルで
ある。

【図７】実施例７における、蛍光性化合物ｇとユウロピ
ウムイオンによって形成された錯体の蛍光スペクトルで
ある。

【図８】実施例７における、蛍光性化合物ｇとユウロピ
ウムイオンによって形成された錯体の蛍光寿命を示す図
である。

【図９】実施例７における、蛍光性化合物ｇとユウロピ
ウムイオンによる錯体形成時間に対する周囲の温度の影
響を示す図である。

【図１０】実施例７において、蛍光性化合物ｇの水性溶
媒への溶解性を、ユウロピウムイオンとの錯体形成によ
り発生する蛍光によって検討した結果を示す図である。

【図１１】実施例８における、蛍光性化合物ｕとユウロ
ピウムイオンによって形成された錯体およびＰＡＰＰＡ
−Ｅｕの励起スペクトルである。

【図１２】実施例８における、蛍光性化合物ｕとユウロ
ピウムイオンによって形成された錯体およびＰＡＰＰＡ
−Ｅｕの蛍光スペクトルである。

【図１３】実施例９において行なった蛍光性化合物ｖ標
識抗体の精製パターンを示す図である。

【図１４】実施例１６において行なったｈＣＧ時間分解
蛍光免疫測定の結果を示す図である。

【図１５】実施例１７において行なったｈＣＧ時間分解
蛍光免疫測定の結果を示す図である。

【図１６】実施例１８において行なったチロキシン時間
分解蛍光免疫測定の結果を示す図である。

【図１７】実施例２０において行なったＨＢＶ−ＤＮＡ
時間分解蛍光プローブアッセイの結果を示す図である。

【図１８】実施例２０において行なったＨＢＶ−ＤＮＡ
時間分解蛍光プローブアッセイの結果を、Ｂ型肝炎患者
と健常人にわけてプロットした図である。

【図１９】実施例２１と実施例２２における蛍光性化合
物標識中間体を用いたｈＣＧ時間分解蛍光免疫測定の結
果を示す図である。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　下記式Ａで示される蛍光性化合物。 【化１】 （式Ａ中、ｍは１または２であり、ｎは０〜４の整数で
   ある。Ｒ１　は、それぞれ独立に、水素原子、アルキル
   基、アルケニル基、アルキニル基、アラルキル基、アリ
   ール基から選択される。Ｒ２　は、それぞれ独立に、水
   素原子、アリール基、アルキル基から選択される。Ｒ３
   　は、それぞれ独立に、−Ｒ３−１　−Ｒ３−２　で示
   される官能基（ただし、Ｒ３−１　は必須ではないが、
   存在する場合は、アルキレン基、アリーレン基、アラル
   キレン基から選択され、Ｒ３−２　は必須であり、水素
   原子、アルキル基、アリール基、カルボキシル基、ヒド
   ロキシル基、アルコキシル基、アミノ基、アミド基、ス
   ルフォンアミド基、スルフィド基、スルフォキシド基、
   スルフォン基、ハライド原子、カルボニル基、ニトロ基
   から選択される。）から選択される。Ｒ４　は、それぞ
   れ独立に、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アル
   キニル基、アリール基、カルボキシル基、ヒドロキシル
   基、アルコキシル基、アミノ基、アミド基、スルフォン
   アミド基、スルフィド基、スルフォキシド基、スルフォ
   ン基、ニトロ基、ハライド原子、メルカプト基、カルボ
   ニル基、−Ｒ４−１　−Ｒ４−２　で示される官能基（
   ただし、Ｒ４−１　は必須ではないが、存在する場合は
   、アルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基、アラ
   ルキレン基から選択され、Ｒ４−２　は必須であり、下
   記（化２に示す）官能基から選択される。）から選択さ
   れる。 【化２】 なお、Ｒ４　は、隣接するＲ４　同士が結合して縮環し
   、フェナンスロリン環を形成している二つまたは三つの
   炭素原子を含む芳香環または複素環となっていてもよい
   。）
2. 【請求項２】　　下記式Ｂで示される請求項１に記
   載の蛍光性化合物。 【化３】 （式Ｂ中、Ｒ５　は、それぞれ独立に、水素原子、アル
   キル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、カ
   ルボキシル基、ヒドロキシル基、アルコキシル基、アミ
   ノ基、アミド基、スルフォンアミド基、スルフィド基、
   スルフォキシド基、スルフォン基、ニトロ基、ハライド
   原子、メルカプト基、カルボニル基、−Ｒ５−１　−Ｒ
   ５−２　で示される官能基（ただし、−Ｒ５−１　−Ｒ
   ５−２　は、請求項１における−Ｒ４−１　−Ｒ４−２
   　と同様に定義される。）から選択される。）
3. 【請求項３】　　下記式Ｃで示される請求項１に記載の
   蛍光性化合物。 【化４】 （式Ｃ中、Ｒ６　は、それぞれ独立に、式Ｄ（化５に示
   す）で示される官能基から選択される。式Ｄ中の−Ｒ６
   −１　−Ｒ６−２は、請求項１における−Ｒ４−１　−
   Ｒ４−２　と同様に定義され、式Ｄ中のｋは、０〜５の
   整数である。） 【化５】
4. 【請求項４】　　請求項１〜３のいずれかに記載の蛍光
   性化合物と希土類金属イオンにより構成される錯体。
5. 【請求項５】　　前記希土類金属イオンが、ユウロピウ
   ムイオン、テルビウムイオン、サマリウムイオンから選
   択される１種である請求項４に記載の錯体。
6. 【請求項６】　　特異的結合体と、該特異的結合体に直
   接または間接に結合した請求項１〜３のいずれかに記載
   の蛍光性化合物とで構成される試薬。
7. 【請求項７】　　特異的結合体と、該特異的結合体に直
   接または間接に結合した請求項４または５に記載の錯体
   とで構成される試薬。
8. 【請求項８】　　前記特異的結合体が抗原または抗体ま
   たは核酸である請求項６または７に記載の試薬。
9. 【請求項９】　　液性試料中の標的物質を測定する特異
   的結合アッセイであって、請求項６に記載の試薬を用い
   、該試薬中の蛍光性化合物と希土類金属イオンにより錯
   体を構成させ、該錯体を励起し、前記標的物質の量また
   は濃度に相関する、該錯体の示す崩壊寿命の長い蛍光の
   強度を測定することを特徴とする特異的結合アッセイ。
10. 【請求項１０】　　液性試料中の標的物質を測定する特
    異的結合アッセイであって、請求項７に記載の試薬を用
    い、該試薬中の蛍光性化合物と希土類金属イオンによっ
    て構成される錯体を励起し、前記標的物質の量または濃
    度に相関する、該錯体の示す崩壊寿命の長い蛍光の強度
    を測定することを特徴とする特異的結合アッセイ。