KR20040082273A - 단백질 분석을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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KR20040082273A
KR20040082273A KR10-2003-7015209A KR20037015209A KR20040082273A KR 20040082273 A KR20040082273 A KR 20040082273A KR 20037015209 A KR20037015209 A KR 20037015209A KR 20040082273 A KR20040082273 A KR 20040082273A
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타히르시에드하산
월웨버제랄드제이.
키라코시안흐레어
매트레이트레이시제이.
헤르난데츠빈센트에스.
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Abstract

표적 폴리펩티드가 번역후 변형을 거친 샘플에서 하나 이상의 표적 폴리펩티드를 측정하기 위한 방법, 조성물 및 키트가 개시된다. 샘플 및, 절단유발 부분 및 표적 폴리펩티드 상의 결합 부위에 대한 제 1 결합제를 포함한 제 1 시약을 포함하는 혼합물은 각 결합 부분의 결합이 일아나는 조건 하에 놓인다. 결합 부위는 표적 폴리펩티드를 포함하는 번역후 변형 활성의 결과이다. 방법은 표적 폴리펩티드 자체를 측정하는데 사용될 수 있다. 또다른 구체예에서, 표적 폴리펩티드의 존재 및/또는 양은 표적 폴리펩티드의 번역후 변형에 관련된 효소와 같은 작용인자의 존재 및/또는 양 및/또는 활성에 관련된다. 제 1 결합제 및 결합 부위와의 상호작용은 절단유발 부분이 절단가능 부분에 근접하도록 하는데, 이것은 폴리펩티드와 연관되며 절단유발 부분에 근접할 시에만 절단되는 것으로 생각된다. 이 방법에서 각각의 폴리펩티드를 위한 전기영동 태그가 방출될 수 있다. 방출된 전기영동 태그는 분리되어 표적 폴리펩티드의 존재 및/또는 양은 해당 전기영동 태기에 기초하여 측정된다.

Description

단백질 분석을 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR ANALYZING PROTEINS}
혈액 또는 다른 생물학적 체액 내의 폴리펩티드 및 핵산 서열을 포함하는 다수의 분석대상물을 측정하는 필요성은 의학의 많은 분지에서 더욱더 분명해져 왔다. 다수의 핵산 서열을 검출하는 유전체학 분야에서의 검정과 같은, 대부분의 다중-분석대상물 검정은 다수의 단계를 포함하고, (전형적으로 2 내지 100배의 차이에 속하는) 제한된 동적 범위인, 빈약한 민감성을 가지며, 몇몇은 정교한 기계 사용을 필요로 한다. 다중 분석대상물 검정을 위한 몇몇 공지된 전통적 방법은 하기의 사용을 포함한다.
a. 두 개의 상이한 분석대상물을 구별하기 위한 두 개의 상이한 방사선 동위원소 표지의 사용.
b. 둘 이상의 분석대상물을 구별하기 위한 둘 이상의 상이한 형광 표지의 사용.
c. 둘 이상의 분석대상물을 구별하기 위해 수명 및 파장을 이용한 란탄 계열 원소 킬레이트 화합물의 사용.
d. 둘 이상의 분석대상물을 구별하기 위한 형광 및 화학발광 표지의 사용.
e. 둘 이상의 분석대상물을 구별하기 위한 두 개의 상이한 효소의 사용.
f. 둘 이상의 분석대상물을 구별하기 위한 효소 및 아크리디늄 에스테르의 사용.
g. 다수의 분석대상물을 확인하고 정량하기 위한, 예를 들어 배열 상의, 상이한 분석대상물의 공간 해상력.
h. 두 개의 상이한 바이러스 표적을 정량하기 위해 수명 또는 디옥세타논 형성을 이용한 아크리디늄 에스테르 표지의 사용.
프로테오믹스는 최근 몇년에 걸쳐 관심의 대상이 되었다. 프로테오믹스가 유전체학보다 더 복잡함에도 불구하고, 단백질의 연구는 mRNA를 연구하는 것보다 더욱 정확한 세포 생물학 묘사를 제공한다. 프로테오믹스의 분야는 매우 광범위하고, 예를 들어 세포에서 발현되는 단백질을 연구하기 위해 2-차원 겔 전기영동 및 질량 분석법을 사용한 단백질 프로파일링; 효모 2-혼성체법을 이용한 단백질-단백질 상호작용; 신호 트랜스덕션 및 다른 복잡한 세포 프로세싱을 이해하기 위한 경로 분석; 대규모의 단백질 폴딩 및 3-D 구조 연구 및 단백질의 고-효율 발현 및 정제; 예를 들어, 약물, 바이러스, 과다하거나 부족한 영양분 및 보조인자를 포함하는 물리 또는 화학적 조건에서의 변화, 스트레스, 노화, 생물의 특정 주의 존재와 같은 외부 자극에 반응한, 물질대사, 유사분열, 감수분열 도중의 세포 발현; 생물및 균주의 동정; 다중 약물 내성; 단백질-DNA 상호작용; 단백질-펩티드 상호작용 등과 같은 분야를 포함한다. 단일 샘플에서 다수의 단백질 동정은 물론이고, 검출되는 상이한 단백질의 정량을 제공하는 수단이 필요하다.
인간 게놈이 평가된 것과 같이, 유전자의 코딩 서열에 관련된 진단 방법을 수행하기 위한 수많은 기회가 존재할 것이다. 유전자의 하나의 주된 기능은 단백질을 생산하는 것으로서, 이것은 세포에서 수행되는 작업에서 주된 역할을 담당한다. 세포에서의 단백질 기능이 동적이기 때문에, 특정 지점에서 특정 단백질의 구조, 농도, 위치 등은 끊임없이 변화한다. 단백질 발현 패턴의 분석은 진행중인 유전체학 프로젝트의 주제이다. 단백질의 생리학적 활성 형태 및 세포에서 그것의 공간적 및 일시적 상호작용은 전반적인 연구의 중요한 양태이다.
단백질의 하나의 번역후 변형은 인산기의 추가 또는 제거이다. 단백질 인산화 및 탈-인산화 반응은 대사 조절 및 신호 전달 경로의 주요 구성요소로서 확립되었다. 단백질 인산화에서의 변화는 현재 생물학적 시스템에서, 특히 세포 표면 수용체로부터의 신호 전달 조절에서 공지된 효소적 조절의 유력한 수단을 제공한다. 가역적 인산화는 모든 살아있는 세포에서, 증식 신호를 포함하는 조절 신호를 전달하는데 있어서 중요하다. 이들 조절 기작의 분자적 기초를 이해하기 위하여, 인산화되는 특이적 아미노산 잔기를 확인할 필요가 있다. 인산화의 기질 및 부위를 확인함으로써, 몇몇 종양에 대한 진단 도구가 개발될 수 있고 프로세싱의 변형 자체는 치료적 중재를 위한 표적이 될 수 있다.
성장 인자, 분화 인자 및 호르몬과 같은 폴리펩티드는 다세포 생물의 분화를조정하는 조절 시스템의 중요한 구성성분이다. 이들 인자 중 다수는 고유의 단백질 티로신 키나아제 활성을 갖는 세포 표면 수용체에 결합하여 활성화시킴으로써 이들 인자의 작용을 중재한다. 성장 인자 및 사이토카인과 같은 세포외 신호전달 분자에 의해 유도된 세포 행동에서의 변화는 전사 사건의 복잡한 프로그램의 실행을 필요로 한다. 전사를 활성화하거나 억제하기 위해, 전사 인자는 핵 내에 위치하고, DNA와 결합하고, 기저 전사 기구와 상호작용해야 한다. 따라서, 전사 인자 활성을 조절하는 세포외 신호는 이 프로세싱 중 하나 이상에 영향을 미칠 수 있다. 가장 통상적으로, 조절은 가역적 인산화에 의해 성취된다. 몇몇 상이한 키나아제 (또는 하나 이상의 경로에 연결된 키나아제)에 의한 전사 인자의 인산화는 상이한 신호가 동일한 인자에 수렴하도록 허용하는 단순한 기작이다.
인산화의 분석을 지시한 문헌에는 다수의 접근법이 있다. 이러한 방법 중 하나는32P-표지 단백질의 2-차원적 포스포펩티드 맵핑이다. 또다른 접근법은 비-방사선표지 인산단백질의 분석을 위한 질량 분석법을 의지한다. 또다른 접근법에서 (Cao, et al, Rapid Commun. Mass Spectrom. (2000) 14:1600-1606) 단백질의 인산화 부위는 온라인의 고정 금속 친화도 크로마토그래피 (IMAC)/모세관 전기영동법 (CE)/전자분무 이온화 다중 단계 직결 질량 분석법 (MS)을 이용하여 맵핑하였다. IMAC 레진은 인산화된 단백질 및 펩티드를 보유 및 사전농축하고, CE는 IMAC 레진으로부터 용리된 혼합물의 포스포펩티드를 분리하며, MS는 각 성분의 인산화 부위를 포함하는 정보를 제공한다.
질량 분석에 대한 선작업으로서, 인산화된 펩티드의 미세정제를 위한 방법은 Posewitz, et al., Anal. Chem. (1999) 71:2883-2892에서 개시된다. 마이크로팁 포맷 및 더 구체적으로는 갈륨 Ⅲ 이온과 조합된 고정 금속 친화도 크로마토그래피가 이용된다. 포스포펩티드는 거의 양적이고 고도로 선택적인 수단으로 회수되어, 매트릭스-원조 레이저 탈착/비행의 이온화 비행시간형 및 나노전자분무 이온화 질량 분석법에 의한 직접 분석을 위한 농축된 샘플을 생산한다.
그러나, 번역후 변형 프로세싱에 연관된 폴리펩티드의, 활성을 확인 및/또는 측정하고/또는 존재 및/또는 양을 측정하기 위한 방법은 여전히 필요하다. 방법은 발생한 변형, 부위 또는 변형의 부위군 및 변형 부위의 위치를 확인할 수 있어야 한다. 방법은 단일 검정에서 다수의 폴리펩티드를 검출할 가능성이 있고 그렇게 할 수 있는, 즉 고등급의 복합 능력을 갖는 부류-특이적 시약을 사용해야 한다. 방법은 실시간으로 측정되는 정보를 허용해야 하고 생물학적 경로에서 어떤 폴리펩티드의 중요성을 결정하도록 허용해야 한다. 더욱이, 방법은 특정 경로가 활성화되었는지를 결정하기 위해 복합화되어야 한다는 것은 중요하다.
발명의 개요
한 양태에서 본 발명은 표적 폴리펩티드를 함유한 것으로 생각되는 샘플에서 하나 이상의 표적 폴리펩티드의 존재 및/또는 양을 측정하기 위한 방법에 관련된다. 혼합물은 (i) 샘플; (ii) 절단유발 부분 및 하나 이상의 표적 폴리펩티드 상에서의 번역후 변형에 특이적인 제 1 결합제를 포함하는 제 1 시약 (여기에서는 "부류-특이적 시약"으로도 지칭됨); 및 (iii) 표적 폴리펩티드에 특이적인 결합 부분을 각각 갖는 하나 이상의 전기영동 프로브와 절단 가능한 연결에 의해 여기에 각각 부착된 하나 이상의 전기영동 태그를 포함하도록 형성된다. 각각의 결합제 및 부분의 결합이 일어나는 조건 하에서 혼합이 일어난다. 제 1 결합제 및 번역후 변형 사이의 상호작용은 절단유발 부분이 절단가능 결합에 아주 근접하게 만드는데 (여기에서는 "효과적 근접"으로서도 지칭됨), 이것은 폴리펩티드와 결합된 프로브 상에 존재하며 절단유발 부분으로의 근접시에만 절단한다. 이 방법에서, 각 폴리펩티드에 대한 유일한 전기영동 태그는 결합 발생시에만 전기영동 프로브로부터 방출될 수 있다. 방출된 전기영동 태그는 그 다음 분리되고 표적 폴리펩티드의 존재 및/또는 양은 해당 태그의 식별 및 양에 기초하여 측정된다. 바람직하게, 각 전기영동 태그는 유일한 광학적 및/또는 전하량적 특성을 갖는다.
본 발명의 또다른 구체예는 표적 폴리펩티드가 인산화를 거친 샘플에서 다수의 표적 폴리펩티드를 측정하는 복합 검정의 실행 방법이다. 샘플은 절단유발 부분을 포함하는 제 1 시약 및 친화도 지지물 및 다수의 전기영동 프로브를 포함하는 제 1 결합제와 결합된다. 각 전기영동 프로브는 각각의 표적 폴리펩티드 및 절단가능한, 또는 가역적인 전기영동 태그에 대한 결합 부분을 포함한다. 결합은 제 1 결합제와 표적 폴리펩티드의 결합을 위한 조건을 필요로 한다. 각 전기영동 프로브에서 전기영동 태그는 i) 절단유발 부분으로의 근접시에만 절단할 수 있는 절단가능 결합, 및 ii) 유일한 전기영동 및/또는 광학적 성질을 갖는 검출가능한 부분을 포함한다. 제 1 결합제와 표적 폴리펩티드 사이의 상호작용은 절단유발 부분이 절단가능 결합에 매우 근접하도록 한다. 전기영동 태그는 표적 폴리펩티드에 결합된 전기영동 프로브로부터 절단가능 결합의 절단에 의해 방출된다. 방출된 태그는 분리 수단 및 각 태그에서 유일한 광학적 특성에 의해 확인되어 각 샘플에서 표적 폴리펩티드의 존재가 측정된다. 바람직하게, 전기영동 태그는 유일한 전기영동 이동성 및/또는 형광 특성을 갖는다.
본 발명의 또다른 구체예는 인산화 단백질, 글리코단백질, 지질-유래 단백질 등과 같은, 사전 결정된 번역후 부류에서 다수의 표적 폴리펩티드의 존재 및/또는 양 및/또는 활성을 검출하는데 사용되는 조성물이다. 조성물은 절단유발 부분을 포함하는 제 1 시약 및 표적 폴리펩티드의 번역후 변형을 포함하는 결합 부위를 위한 제 1 결합제를 포함한다. 측정은 표적 폴리펩티드 자체에 대한 것일 수도 있고 또는 표적 폴리펩티드의 번역후 변형에 관련된 작용제에 대한 것일 수도 있다. 조성물은 키트의 일부로서, 이것은 또한 포장된 조합에서 다수의 전기영동 프로브를 포함하는데 여기에서 각 전기영동 프로브는 각 표적 폴리펩티드에 대한 제 2 결합제 및 절단가능한 전기영동 태그를 포함한다. 각각의 전기영동 프로브에 있는 절단가능한 태그는 절단유발 부분으로의 근접시에만 절단될 수 있는 절단가능 부분, 및 유일한 전기영동 및/또는 광학 특성을 갖는 적어도 하나의 검출가능한 부분을 포함한다.
본 발명은 폴리펩티드의 검출 및 정량에서의 사용을 위한 분리가능한 조성물, 방법, 및 키트에 관련된다. 본 발명은 번역후 활성에 관련된 단백질을 포함하는 폴리펩티드의 복합 검정의 분야로의 특별한 적용을 나타낸다.
도 1은 시중 구입가능한 6-카르복시 플루오레세인으로 시작한 하나의 예시적 합성 접근법을 나타내는데, 여기에서 페놀 히드록실기는 안히드리드를 이용하여 보호된다. 표준 추출 작업 후, 95% 수율의 생성물을 얻는다. 이 물질은 포스피틸화되어 포스포르아미디트 단량체를 생성한다.
도 2는 2차 아민을 갖는 아미노 알콜로서의 대칭형 비스-아미노 알콜 링커의 사용을 나타내며 이것은 그 다음 다수의 카르복시산 유도체와 커플링된다.
도 3은 이동성 변형제로서 작용할 수 있는 몇몇 벤조산 유도체의 구조를 나타낸다.
도 4는 시작 물질로서의 5-아미노플루오레세인 및 이것을 보호된 포스포르아미디트 단량체로 전환하는 동일한 일련의 단계를 사용하는 대안적 전략의 이용을 나타낸다.
도 5는 아미노 염료를 e-태그 포스포르아미디트 단량체로 전환하는데 사용될 수 있는 몇몇 이동성 변형제를 나타낸다.
도 6 A-B는 본 발명의 전기영동 태그를 구성하는데 이용될 수 있는 플루오레세인 유도체를 나타낸다.
도 7은 프로테오믹스 연구에 있어서 본 발명의 사용을 나타낸다.
도 8은 세포 주기의 주요 시기 및 활성 분자 및 각 시기에서의 프로세싱을 나타낸다.
도 9 A-C는 e-태그 시약 및 천연 생성물로의 세포-기재 검정을 이용한 표적 발견 및 확인을 예시한 일렉트로페로그램 (electropherogram)이다. 도 9 A는 동조화되지 않은 세포 집단으로부터의 가설적 결과를 나타내고; 도 9 B는 초기 G1에 억류된 세포로부터의 결과를 나타내고; 도 9 C는 후기 G1에 억류된 세포로부터의 결과를 나타낸다.
도 10 A-F는 산화-불안정 결합 및 단일항 산소에 의해 중재되는 각각의 절단 반응을 나타낸다.
도 11은 리간드-세포 표면 수용체 상호작용의 효과를 검출하기 위한 본 발명의 시약의 사용을 묘사한 것이다.
도 12는 리간드-세포 표면 수용체 상호작용의 효과를 검출하기 위한 본 발명의 시약의 사용을 더욱 묘사한 것이다.
도 13 A는 세포 경로에서 단백질-단백질 상호작용의 분석을 묘사한 것이다. 도 13 B는 여섯개의 명시된 단백질 상호작용에 대한 약물 치료 효과의 가설적 결과를 나타낸다.
도 14 A-B는 e-태그 프로브를 형성하기 위해 e-태그 부분이 항체에 접합하는 일반 방법학, 및 결과 프로브가 단일항 산소와 반응하여 방출된 e-태그 수용체로서 설핀산 부분을 생성하는 것을 나타낸다.
도 15 A-J는 디자인되고 합성된 e-태그 부분의 구조를 나타낸다 (Pro1은 Molecular Probes, Inc.로부터 구입가능하다).
도 16 A-I는 도 15에 나타난 e-태그 부분의 합성 화학을 나타낸다.
도 17 A-C는 본 발명에서 사용되는 CE2LabCard™의 개요적 설명이다. 도 17A는 장치를 설명하고; 도 17B 및 17C는 각각 주입 및 분리를 위한 장치에 사용되는 예시적인 고전압 기계구성을 나타낸다.
도 18는 CE2LabCard를 이용하여 e-태그 리포터 분석을 예증한 두 개의 일렉트로페로그램을 나타낸다.
도 19는 CE2LabCard를 이용하여 e-태그 리포터 분석을 예증한 다수의 일렉트로페로그램을 나타낸다.
도 20은 광감작 비드 농도의 작용으로서 e-태그 리포터의 방출에 대한 직선 눈금 곡선을 나타낸다.
도 21은 e-태그 리포터 방출 상에 표지된 아미노덱스트란의 농도 효과의 데이터 곡선을 나타낸다.
도 22는 ABI310 상에 8개의 e-태그 리포터의 전기영동 분리를 나타낸다.
도 23은 사이토카인 IL-4 및 IL-5의 양화를 위한 샌드위치 검정을 묘사한 것이다.
도 24는 IL-4 적정 연구에서 e-태그 리포터 (Pro1) 분석을 설명한 일련의 일렉트로페로그램을 나타낸다.
도 25는 IL-6 적정 연구에서 e-태그 리포터 (Pro10) 분석을 설명한 일련의 일렉트로페로그램을 나타낸다.
도 26는 IFNγ 적정 연구에서 e-태그 리포터 (Pro8) 분석을 설명한 일련의 일렉트로페로그램을 나타낸다.
도 27은 TNFα 적정 연구에서 e-태그 리포터 (Pro7) 분석을 설명한 일련의 일렉트로페로그램을 나타낸다.
도 28은 IL-10 적정 연구에서 e-태그 리포터 (Pro4) 분석을 설명한 일련의일렉트로페로그램을 나타낸다.
도 29는 IL-8 적정 연구에서 e-태그 리포터 (Pro2) 분석을 설명한 일련의 일렉트로페로그램을 나타낸다.
도 30은 단일 및 이중 사이토카인 연구에서 e-태그 리포터 분석을 설명한 일렉트로페로그램을 나타낸다.
도 31은 5가지 사이토카인의 복합 연구에서 e-태그 리포터 분석을 설명한 일렉트로페로그램을 나타낸다.
도 32는 복합 사이토카인 연구에서 e-태그 리포터 분석을 설명한 일렉트로페로그램을 나타낸다.
도 33은 인간 IgG의 직접 양화에 대한 동종 검정을 묘사한 것이다.
도 34는 인간 IgG 적정 연구에서 e-태그 리포터 분석을 설명한 일렉트로페로그램을 나타낸다.
도 35는 도 34의 결과를 정량한 눈금 곡선을 나타낸다.
정의
여기에서 사용될 때, "알킬디일"은 근원 알칸, 알켄 또는 알킨의 각각 두 개의 상이한 탄소 원자로부터 하나의 수소 원자의 제거에 의해, 또는 근원 알칸, 알켄 또는 알킨의 단일 탄소 원자로부터 두 개의 수소 원자의 제거에 의해 유래된 포화되거나 불포화된, 분지되거나 직쇄이거나 또는 고리형인 2가의 탄화수소 라디칼이다. 두 개의 1가 라디칼 중심 또는 각 원자가의 2가 라디칼 중심은 동일 또는상이한 원자와 결합을 형성할 수 있다. 전형적인 알킬디일은 메탄디일; 에탄-1,1-디일, 에탄-1,2-디일, 에텐-1,1-디일, 에텐-1,2-디일과 같은 에틸디일; 프로판-1,1-디일, 프로판-1,2-디일 프로판-2,2-디일, 프로판-1,3-디일, 시클로프로판-1,1-디일, 시클로프로판-1,2-디일, 프로프-1-엔-1,1-디일, 프로프-1-엔-1,2-디일, 프로펜-1,2-디일, 프로프-1-엔-1,3-디일, 시클로프로프-1-엔-1,2-디일, 시클로프로프 엔-1,2-디일, 시클로프로프 엔-I,I-디일, 프로프 인-1,3-디일 등과 같은 프로필디일; 부탄-I,I-디일, 부탄-1,2-디일, 부탄-1,3-디일, 부탄-1,4-디일, 부탄-2,2-디일, 2-메틸-프로판-I,I-디일, 2-메틸프로판-1,2-디일, 시클로부탄-1,1-디일, 시클로부탄-1,2-디일, 시클로부탄-1,3-디일, 부트-1-엔-1,1-디일, 부트-1-엔-1,2-디일, 부트-1-엔-1,3-디일, 부티-1-엔-1,4-디일, 2-메틸-프로프-1-엔-1,17-디일, 2-메타닐리덴-프로판-I,I-디일, 부타-1,3-디엔-I,I-디일, 부타-1,3-디엔-1,2-디일, 부타-1,3-디엔-1,3-디일, 부타-1,3-디엔-1,4-디일, 시클로부트-1-엔-1,2-디일, 시클로부트-1-엔-1,3-디일, 시클로부트 엔-1,2-디일, 시클로부타-1,3-디엔-1,2-디일, 시클로부타-1,3-디엔-1,3-디일, 부트 인-1,3-디일, 부트 인-1,4-디일, 부타-1,3-디인-1,4-디일과 같은 부틸디일 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"항체"는 또다른 분자의 특정한 공간적 및 극성 조직에 특이적으로 결합함으로써, 이 분자의 보체로서 정의되는 면역글로불린을 의미한다. 항체는 단일클론이거나 다클론일 수 있고 숙주의 면역화 및 혈청의 수집(다클론)과 같은 업계에 주지된 기술에 의해 또는 연속적인 혼성 세포주의 제조 및 분비된 단백질의 수집(단일클론)에 의해, 또는 천연 항체의 특이적 결합에 필요한 적어도 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 그것의 돌연변이체의 클로닝 및 발현에 의해 제조될 수 있다. 항체는 완전한 면역글로불린 또는 그것의 단편을 포함할 수 있는데, 이 면역글로불린은 IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b IgG3, IgM 등과 같은 다양한 부류 및 이소형을 포함한다. 그것의 단편은 Fab, Fv 및 F(ab')2, Fab' 등을 포함할 수 있다. 게다가, 면역글로불린 또는 그것의 단편의 응집체, 중합체, 및 접합체는 특정 폴리펩티드에 대한 결합 친화도가 유지되는 한 사용될 수 있다.
"항체 결합 조성물"은 하나 이상의 항체를 포함하는 본자 또는 분자의 복합체를 의미하며 항체로부터 그것의 결합 특이성을 유도한다. 항체 결합 조성물은 제 1 항체가 표적 분자에 특이적으로 결합하고 제 2 항체가 제 1 항체의 불변 구역에 특이적으로 결합한 항체 쌍; 표적 분자에 특이적으로 결합하는 바이오틴화 분자 및 전기영동 태그 또는 광감작제와 같은 부분으로 유도된 스트렙타비딘; 표적 분자에 특이적이고 덱스트란과 같은 중합체에 접합되어 전기영동 태그 또는 광감작제와 같은 부분으로 유도되는 항체; 표적 분자에 특이적이고 비드, 또는 마이크로비드, 또는 다른 고체상 지지물에 접합되어, 전기영동 태그 또는 광감작제와 같은 부분, 또는 후자를 함유한 중합체로 유도되는 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"모세관 전기영동법"은 모세관 튜브 또는 모세관 플레이트에서의 전기영동을 의미하는데, 여기에서 분리 컬럼의 직경 또는 분리 플레이트의 두께는 약 25 내지 500 마이크론으로, 분리 매질 전체에서 효과적인 열 소산을 허용하여 결과적으로 매질 내에서의 낮은 열 대류를 일으킨다.
"체질 매트릭스" 또는 "체질 매질"은 매트릭스를 통한 대전된 종의 전기영동이동을 효과적으로 감속시키는 교차연결되거나 비-교차연결된 중합체를 함유한 전기영동 매질을 의미한다.
두 분자 또는 한 분자와 분자 복합체의 결합에 있어서 "특이적"은 다른 분자의 실질적으로 더 적은 인식 및 다른 분자와의 안정한 복합체 형성 부족에 비해, 다른 것에 대한 하나의 특이적 인식 및 안정한 복합체의 형성을 지칭한다. 바람직하게, 결합에 있어서 "특이적"은 분자가 다른 분자 또는 복합체와 복합체를 형성하는 정도로, 그 분자가 특이성을 갖는 분자 또는 복합체와 적어도 50 퍼센트의 복합체를 형성하는 것을 의미한다. 일반적으로, 분자 또는 복합체는 그것의 표면 또는 공동에 두 분자 사이의 특이적 인식을 일으키는 영역을 갖는다. 특이적 결합의 예는 항체-항원 상호작용, 효소-기질 상호작용, 폴리뉴클레오티드 상호작용, 세포 수용체-리간드 상호작용 등이 있다.
여기에서 사용될 때, 다수의 형광 표지에 있어서 용어 "스펙트럼 분해가능"은 표지의 형광 발광 밴드가 충분히 뚜렷하여, 즉 겹치지 않게 충분히 벌어져서 각각의 표지가 부착된 전기영동 태그가 각 표지에 의해 생성된 형광 신호를 기초하여, 예를 들어 밴드 패스 필터의 시스템 및 광배율 튜브 등을 이용한 표준 광검출 시스템에 의해 구별될 수 있는 것을 의미한다 (예를 들어, 미국 특허 No. 4,230,558, 4,811,218 등, 또는 Wheeless et al, pp. 21-76, Flow Cytometry: Instrumentation and Data Analysis (Academic Press, New York, 1985)).
특정 구체예의 설명
한 양태에서 본 발명은 표적 폴리펩티드를 함유한 것을 생각되는 샘플에서이러한 폴리펩티드 부류의 구성원의 존재 및/또는 양을 결정하는 방법에 관련된다. 본 발명의 검정 목적인 단백질의 부류는 통상적인 물리적, 기능적, 또는 화학적 성질을 갖는 단백질로서 물리적 또는 화학적 확인을 위한 수단을 제공한다. 단백질의 바람직한 부류는 막-결합 단백질; DNA-결합 단밸질과 같은, 일반적인 결합 성질을 갖는 단백질; 및 인산화, 글리콜화, 리보실화 등과 같은 번역후 변형의 특정 타입을 갖는 단백질을 포함한다. 표적 폴리펩티드의 바람직한 부류는 번역후 변형된 폴리펩티드이다.
본 발명의 또다른 양태에서, 폴리펩티드에서 어떤 부위가 변형되었는지, 변형된 폴리펩티드에 어떻게 다수의 변형이 존재하는지, 폴리펩티드에 변형이 어디 존재하는지, 폴리펩티드의 위치 등을 결정하는 것이 요구될 수 있다. 반면, 표적 폴리펩티드의 존재 및/또는 양은 표적 폴리펩티드의 번역후 변형을 일으키는 것에 연관된 작용제의 존재 및/또는 양 및/또는 활성을 측정하는데 사용될 수 있다. 이 구체예에서, 작용제가 존재하고/또는 활성인지를 아는 것이 요구된다. 작용제는 예를 들어, 효소, 수용체, 복합체 (예를 들어, 다량체 단백질 또는 다수-서브유닛 홀로효소), 단백질-핵산 등과 같은 폴리펩티드일 수 있다.
폴리펩티드는 한 아미노산의 카르복실기와 또다른 아미노산의 아미노기 사이에서 물이 제거되는 아미드 결합에 의해 화학적으로 결합된 아미노산 잔기로 구성된 화합물의 부류이다. 폴리펩티드는 아미노산 잔기의 중합체인데, 이것은 매우 많은 수의 이러한 잔기를 포함할 수 있다. 펩티드는 폴리펩티드와 유사하지만, 일반적으로 더 적은 수의 아미노산으로 구성된다. 펩티드는 종종 올리고펩티드로서지칭된다. 폴리펩티드와 펩티드 사이에 명확한 구분은 없다. 편의상, 본 개시 및 청구범위에서, 용어 "폴리펩티드"는 일반적으로 펩티드 및 폴리펩티드를 지칭하는데 사용될 것이다. 아미노산 잔기는 천연이거나 합성일 수 있다.
단백질은 정의된 3차원 구조로 폴딩된 폴리펩티드 사슬이다. 이것은 탄소, 수소, 질소 및 황을 함유한 복잡한 고중합체이고 펩티드 연결에 의해 결합된 아미노산의 직쇄로 구성된다. 단백질은 일반적으로 약 5,000 내지 약 5,000,000 이상, 더 일반적으로는 약 5,000 내지 약 1,000,000인 분자량을 갖는다. 다양한 단백질이 유사한 특징을 갖는 단백질, 특정한 생물학적 기능을 갖는 단백질, 특정 미생물, 특히 병을 유발하는 미생물에 관련된 단백질 등의 패밀리와 같이 고려될 수 있다. 이러한 단백질은 사이토카인 또는 인터류킨; 키나아제, 프로테아제, 갈락토시다제 등과 같은 효소; 프로타민, 히스톤, 알부민, 면역글로불린, 공막단백질, 인단백질, 점액단백질, 크롬단백질, 지질단백질, 핵단백질, 글리코단백질, T-세포 수용체, 프로테오글리칸, 미분류 단백질 (예를 들어, 소마토트로핀, 프로락틴, 인슐린, 펩신, 인간 혈장 단백질, 혈액 응고 인자, 혈액형 인자, 단백질 호르몬, 암 항원, 조직 특이적 항원, 펩티드 호르몬, 영양 마커, 및 합성 펩티드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바람직한 촛점은 번역후 프로세싱과 같은 천연 프로세싱에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 이러한 변형은 기초 교재에 그리고 더욱 상세한 모노그래프에는 물론이고 여러 권의 연구 문헌에 잘 설명된다. 변형은, 펩티드 백본, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카르복실 말단을 포함하는,폴리펩티드의 어느 장소에서든 일어날 수 있다. 동일한 타입의 변형은 주어진 폴리펩티드에 있는 몇몇 부위에서 동일하거나 변화하는 정도로 존재할 수 있다는 것이 인정될 것이다. 또한, 주어진 폴리펩티드는 많은 타입의 변형을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 유비퀴틴화의 결과로서 분지될 수 있고, 분지되거나 또는 분지되지 않은 고리형일 수 있다. 고리형, 분지형 및 분지된 고리형 폴리펩티드는 번역후 천연 프로세싱으로부터 발생할 수 있다. 변형이 화학적 변형과 같은 비-천연적 활성의 결과라는 것 또한 본 발명의 범위 내에 있다.
변형은 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 결합, 헴 (heme) 부분의 공유 결합, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 결합, 지질 또는 지질 유도체의 공유 결합, 포스포티딜이노시톨의 공유 결합, 교차 결합, 고리화, 이황화 결합 형성, 탈메틸화, 공유 교차 결합의 형성, 시스틴의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 마이리스토일화, 산화, 단백질가수분해 프로세싱, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황화, 아르키닐화와 같은 전령-RNA 중재된 단백질로의 아미노산 첨가, 및 유비퀴틴화를 포함한다 (예를 들어, Proteins--Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993; Wold, F., Post-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs. 1-12 in Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983 ; Seifter et al.,"Analysis for protein modifications and non-protein cofactors", Meth Enzymol (1990) 182 : 626-646 and Rattan et al.,"Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci (1992) 663: 48-62 참조).
번역후의 변형 활성을 측정하기 위한 샘플은 일반적으로 세포로부터 유래된 물질이다. 샘플은 세포의 용해에 의해, 혈청, 혈장, 타액, 혈액, 또는 다른 체액으로부터 얻을 수 있다. 생물학적 경로는 완충제에서 분석될 수 있다 (예를 들어, 효소 또는 또다른 수용체에 의한 수용체의 번역후 변형의 검출).
부류-특이적 시약
본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 시약은 부류-특이적 시약, 또는 속에 특유한 시약으로서, 표적 폴리펩티드 부류의 모든, 또는 실질적으로 모든, 구성원 상의 결합 부위에 대한 절단유발 부분 및 결합제를 포함한다. 이 시약은 어느 정도 속에 특유하여 그것의 결합제는 특정 부류 단백질의 모든 또는 거의 모든 구성원에 결합한다. 바람직하게, 부류-특이적 시약의 결합제는 결합되지 않은 물질이 필요시에 결합된 물질로부터 손쉽게 분리될 수 있도록 선택된다.
한 구체예에서, 고정 금속 친화도 크로마토그래피 (IMAC)는, 예를 들어 Holmes, J. Liquid Chromatography and Rel. Technol., 20: 123-142 (1997); Posewitz et al, Anal. Chem., 71: 2883-2892 (1999); 등에 개시된 것과 같이, 세포 용해물과 같은 샘플에 함유된 모든 인산화된 단백질을 비드와 같은 고체 상에서 포획하는데 이용된다. 결합 후, 비드는 여과에 의해 세척된다. 포획 및 세척 단계는 인단백질을 농축하고 검정으로부터 오염된 비-인산화 단백질 및 다른 세포 찌꺼기를 제거한다. 비드에 결합된 단백질은 관심있는 후보 단백질에 대한 항체를 함유한 용액에 재현탁된다. 항체는 관심있는 하나 이상의 명시된 단백질 표적에 특이적일 수도 있고, 또는 전-세포 용해물에 대해 제조된 다클론 항체 시약일 수도 있다. 바람직하게는, 단일클론 항체의 집합체를 사용하는 것으로, 여기에서 하나 이상의 상이한 단일클론 항체는 단백질의 사전결정된 세트에서 각각의 인산화된 단백질에 대해 특이적이다. 항체 시약은 여기에 절단가능하게 결합된 하나 이상의 e-태그 부분을 갖는데, 여기에서 결합은 IMAC-24 DNP와 같은 IMAC 레진에 포함된 절단유발 부분에 의해 절단되는 것으로 생각된다. 상이한 명시된 단백질에 각각 특이적이고 명시된 단백질에 유일하게 할당되는 명시된 e-태그 부분에 각각 연결된 다수의 항체 시약은 복합의 표적-특이적 측정을 위해 조합될 수 있다. 항체 결합 후, e-태그 부분의 결합은 해당 e-태그 리포터를 방출하도록 절단될 것이며, 이것은 IMAC24 DNP 비드에 의한 명시된 표적의 포획을 가리킨다. 단백질-특이적 또는 에피토프-특이적 단일클론 항체는 직접 부착되는 e-태그 부분을 가질 수도 있고, 또는 e-태그는 선택된 단백질에 결합된 단일클론 항체의 불변 구역에 특이적인 2차 항체에 부착될 수도 있다.
폴리펩티드 상의 결합 부위는 일반적으로 폴리펩티드의 번역후 변형의 결과이다. 따라서, 결합 부위는 상기 언급된 변형 중 하나일 수 있다. 폴리펩티드 상의 결합 부위를 위한 결합제는, 그러므로, 결합 부위 또는 변형의 성질에 의존한다. 일반적으로 결합제는 변형을 특이적으로 인식할 수 있는 친화도 시약이다. 하기 표 (표 1a)는 다양한 번역후 변형 및 해당 결합제를 설명한다.
변형 결합제
인산화 금속 친화제 + 금속항체바이오틴-O-PO3 -의 공유결합 변형
글리코실화 붕소산-함유 작용제렉틴항체
지질화 항체시클로데스친렉틴
이황화 다리의 형성 항체
니트로티로신 항체
유비퀴틴화 항체
금속 친화제
본 발명의 한 구체예에서 적절한 금속과 조합된 금속 친화제가 결합제로서 사용될 수 있다. 금속 친화제는 특이적 집단에 대하여 선택성을 갖는 어떤 금속 이온을 킬레이팅하도록 디자인된 것이다. 따라서, 번역후 변형으로 발생된 결합 부위에 결합하는 금속 이온에 대한 친화도를 갖는 어떠한 리간드도 사용될 수 있다. 따라서, 킬레이팅 리간드의 성질은 금속 이온에 의존하고, 번역후 변형에 의존한다. 용어 "금속 이온"은 예를 들어, 단순한 염 (예를 들어, AlCl3, NiCl2, 등), 유기 및 무기 리간드 모두를 포함하는 복합 또는 혼합염 및 금속 복합체로부터 유래된 이온을 지칭한다. 본 발명의 실행에 사용되는 금속 이온은, 예를 들어, 주족 금속 이온, 전이 금속 이온, 란탄 이온 등을 포함한다. 0가 금속 전구체는 이 정의에 포함된다. 이러한 금속 이온의 예는 갈륨, 알루미늄, 철, 납, 수은, 니켈, 카드뮴, 탈륨, 안티몬, 은, 크롬, 망간, 백금, 금, 비스무트, 철, 구리, 아연, 코발트, 몰리브덴, 셀레늄, 바나듐, 칼슘, Eu, Gd, Tb, Sm 등의 이온을 포함하지만이에 제한되지 않는다.
폴리펩티드의 인산화로부터 발생한 것과 같은 인산-함유 부분에 있어서, 적합한 금속 이온은 2 또는 3 원자가의 것을 포함한다. 특히 바람직한 금속 이온은 갈륨 Ⅲ, 알루미늄 Ⅲ, 철 Ⅲ, CO+3, EU+3, Gd+3, SM+3, Tb+3이다.
킬레이팅 리간드는 킬레이팅 리간드가 약 2 내지 약 4 금속 배위 부위를 포함하는 2좌배위, 3좌배위, 또는 4좌배위이다. 배위 부위는 이미노, 니트릴로, 피리디닐, 피라졸릴, 이미다졸릴, 이소시아니딜 등과 같은 질소; 카르복시, 히드록시, 에테르, 케토 등과 같은 산소; 포스핀 등과 같은 인; 아르신 등과 같은 비소; 스틸빈과 같은 안티몬; 티오에테르, 티오케토 등과 같은 황; 셀레노에테르 등과 같은 셀레늄; 텔루로에테르 등과 같은 텔루르; 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 티오카르복시, 포스핀이미노, 옥사졸, 옥사졸린, 티오펜, 티아졸, 이속사졸, 이소트라졸 등과 같은, 전술한 것의 조합 또한 포함된다. 아렌, 아세틸렌, 올레핀 등과 같은 유기 부분 또한 포함된다. 전술한 기를 포함하는 킬레이팅 리간드의 특정 예는 이미노디아세테이트, 트리스(카르복시메틸)에틸렌디아민, 알킬 (1-30 탄소 원자)에 의해 알파 위치에서 일반적으로 치환된 니트릴로트리아세트산, 카르복시메틸화된 아스파르트산, 2-히드록시-3[N-(2-피리딜메틸)글리신]프로필 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
킬레이팅 리간드는 예를 들어, (GHHPH)nG와 같은 금속 결합 펩티드일 수 있는데 여기에서 n은 1 (SEQ ID NO : 1), 2 (SEQ ID NO : 2), 3 (SEQ ID NO : 3) 또는 5 (SEQ ID NO : 4)) 등이다 (예를 들어, Hutchens,et al., J. Chromatogr.(1992)604: 125-132 및 133-141을 참조한다).
전술한 금속 킬레이팅 리간드 중 다수는 시중 구입가능하고, 다른 것들은 합성되었으며 그 합성법은 문헌의 일부이다. 다른 금속 킬레이팅 리간드는 업계에 주지된 방법에 의해 합성될 수 있다.
붕소산-함유 작용제
본 발명의 한 구체예에서 결합제는 붕소산 부분으로서, 이것은 폴리펩티드 상에서 결합 부위의 상호작용성 기능을 갖는 복합체 형성을 허용하는 적어도 하나의 붕소 원자를 포함한다. 일반적으로 붕소산 부분은 탄소, 산소, 질소, 황, 및 인산으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 약 2 원자를 갖는 유기 부분으로 치환된 붕소산으로부터 유래된다. 일반적으로 유기 부분은 치환되거나 또는 치환되지 않은 적어도 약 2 탄소 원자를 갖는다. 유기 부분은 지방족일 수도 있고 방향족일 수도 있다. 붕소산 부분에 있어서 중요한 고려사항은 그것의 산성도이다. 일반적으로, 붕소산 부분의 산성도가 높을 수록, 결합 부위의 반응성 기능을 갖는 복합체로의 능력은 더욱 양호해진다. 바람직하게, 붕소산 부분의 pKa는 약 11 미만이고, 바람직하게는 약 9 미만, 더욱 바람직하게는 약 8.75 미만이다. 붕소산 부분의 pKa가 낮을 수록, 폴리펩티드의 결합 부위에 결합하는 능력은 더욱 양호해진다. 따라서, 붕소산의 산성도를 상회하도록 산성도를 향상시키는 붕소 상의 치환기가 바람직하다. 예를 들어, 페닐 및 (아미노, 니트로 등과 같은 하나 이상의 작용기로 치환된) 치환된 페닐과 같은, 붕소 상의 방향족 치환기가 바람직하다.붕소산 부분의 산성도를 향상시키기 위해, 방향족 치환기는 예를 들어, 니트로와 같은 하나 이상의 전자 끄는 기를 함유하는 것이 바람직하다. 붕소산 부분에 있어서 유기 부분의 특정 예는 페닐, 아미노페닐 등을 포함한다. 특정 붕소산 부분은 페닐 붕소산 및 (3-아미노페닐) 붕소산을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 예는 미국 특허 No. 5,623,055, 5,876,938, 6,013,783, 5,831,045에 나타나며, 관련 개시물은 참고문헌으로서 여기 포함된다.
전술한 붕소산 함유 작용제의 다수는 시중 구입가능하고, 다른 것들은 합성되었으며 합성법은 문헌의 일부이다. 다른 금속 붕소산 함유 작용제는 업계에 주지된 방법에 의해 합성될 수 있다.
렉틴 작용제
본 발명의 또다른 구체예에서, 렉틴은 결합제로서 사용될 수 있다. 렉틴은 특별한 당에 대한 수용체 부위 특이성을 갖되 다른 당에 대해서는 그렇지 않은 단백질 또는 글리코단백질이다. 따라서, 렉틴은 글리코실화의 검출을 위한 결합제로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 콘카나발리안 (Concanavalian) A (Con A)는 알파-D-글루코스 및 알파-D-만노스에 대한 특이성을 갖는다. 글루코스와 같은 리간드가 폴리펩티드에 존재하면, Con A는 글리코실화된 폴리펩티드에 결합한다. 렉틴은 예를 들어, 식물, 포유류, 미생물 등과 같은 어떠한 적합한 공급원 유래일 수 있다. 공지된 렉틴의 수는 여기에 나열하기에는 너무 많다. 상기 지적된 것과 같이, 렉틴은 특별한 당에 대하여 특이적이다. 따라서, 렉틴은 폴리펩티드에 있어서 기대되는 글리코실화 부분에 기초하여 선택된다. 렉틴의 예는 콘카나발리안 A, 밀 배아 응집소, 삼부쿠스 니그라 (Sambucus nigra) 응집소 (SNA), 아라키스 히포가에아 (Arachis Hypogaea) 응집소, 바우히니아 (Bauhinia Purpurea) 응집소, 갈란투스 니발리스 (Galanthus nivalis) 응집소 (GNA), 다투라 스트라미오늄 (Datura stramionium) 응집소 (DSA), 막키아 아무렌시스 (Maackia amurensis) 응집소 (MAA), 땅콩 응집소 등과 같은 응집소, 엘더베리 수피 렉틴, 울렉스 유로피우스 (Ulex Europeus) (UEA I), 울렉스 유로피우스 (UEA II), 리물루스 폴리헤무스 (Limulus Polyhemus) (LPA), 로투스 테트라고놀로부스 (Lotus Tetragonolobus) (Lotus A) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
항체 작용제
한 구체예에서 결합제는 폴리펩티드 상의 변형에 대한 항체일 수 있다. 예를 들어, 인산기를 인식하는 항체는 인산화된 폴리펩티드에 대하여 사용될 수 있고, 또는 당 부분을 인식하는 항체는 글리코실화된 폴리펩티드에 대하여 사용될 수 있고, 또는 아세틸화를 인식하는 항체는 아세틸화된 폴리펩티드에 대하여 사용될 수 있다. 항체는 단일클론이거나 다클론일 수 있다. 다수의 적합한 항체가 업계에 공지되고/또는 업계에 주지된 기술에 의해 제조될 수 있다. 이러한 기술은 연속적인 혼성 세포주의 제조 및 분비된 단백질의 수집(단일클론)에 의한, 또는 천연 항체의 특이적 결합에 필요한 적어도 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 그것의 돌연변이체의 클로닝 및 발현에 의한 숙주의 면역화 및 혈청의 수집(다클론)을 포함한다. 항체는 완전한 면역글로불린 또는 그것의 단편을 포함할 수 있는데, 이 면역글로불린은 IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b IgG3, IgM등과 같은 다양한 부류 및 이소형을 포함한다. 그것의 단편은 Fab, Fv 및 F(ab')2, Fab' 등을 포함할 수 있다. 게다가, 면역글로불린 또는 그것의 단편의 응집체, 중합체, 및 접합체는 특정 폴리펩티드에 대한 결합 친화도가 유지되는 한 사용될 수 있다.
적합한 항체의 제조를 위한 접근법에서, (다클론) 항체를 함유한 항혈청은 적절한 면역원을 이용한 토끼, 기나아 피그, 또는 양과 같은 동물의 면역화를 포함하고 적당한 대기 기간 후 면역화된 동물의 혈액으로부터 항혈정을 얻는, 확립된 기술에 의해 얻을 수 있다. 최신의 리뷰는 Parker, Radioimmunoassay of Biologically Active Compounds, Prentice-Hall (Englewood Cliffs, N. J., U. S., 1976), Butler, J. Immunol. Meth. 7: 1-24 (1975); Broughton and Strong, Clin. Chem. 22: 726-732 (1976); 및 Playfair, et al., Br. Med. Bull. 30: 24-31 (1974)에 의해 제공된다. 항체는 또한 체세포 혼성화 기술에 의해 얻을 수 있는데, 이런 항체는 통상적으로 단일클론 항체로서 지칭된다. 단일클론 항체는 Kohler 및 Milstein,Nature 265: 495-497, 1975의 표준 기술에 따라 제조될 수 있다. 단일클론 항체 기술의 리뷰는 Lymphocyte Hybridomas, ed. Melchers9 et al. Springer-Verlag (New York 1978), Nature 266: 495 (1977), Science 208 : 692 (1980), 및 Methods of Enzymology 73 (Part B) : 3-46 (1981)에 나타난다. 하이브리도마 세포를 수용하는 포유동물 숙주의 복강 내로 하이브리도마 세포를 주입하는 것과 같이, 단일클론 항체의 수율을 향상시키고, 복수 체액을 수확하기 위한 다양한 기술이 존재한다. 부족한 양의 단일클론 항체가 복수 체액에서 수집되면, 항체는 숙주의 혈액으로부터 수확된다. 대안으로, 원하는 항체를 생산하는 세포를 속이 빈 섬유 세포 배양 장치 또는 스피너 플라스크 장치에서 배양할 수 있는데, 이 둘 모두는 업계에 주지된다. 다른 단백질 및 다른 오염물질로부터 단일클론 항체의 분리 및 정제를 위한 다양한 기존의 방법이 존재한다 (Kohler and Milstein, 상기 참조). 항체의 제조를 위한 또다른 접근법에서 염색체 DNA로부터 항체 결합 부위로 코딩되는 서열을 절제하여, 박테리아에서 발현될 수 있는 클로닝 벡터 내로 삽입할 수 있는데 이 벡터는 박테이라에서 발현되어 해당 항체의 결합 부위를 갖는 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 일반적으로, 항체는 크로마토그래피 (예를 들어, DEAE 크로마토그래피, ABx 크로마토그래피 등), 여과 등과 같은 공지된 기술에 의해 정제될 수 있다.
바이오틴 작용제
한 구체예에서, 인단백질의 인산기는 바이오틴화 되어 스트렙타비딘에 의해 단백질이 분리될 수 있다 (Goshe et al, Anal. Chem., 73: 2578 (2001)).
절단유발 부분
절단유발 부분은 바람직하게는 산화에 의해, 절단가능 결합을 절단할 수 있는 활성종을 생산하는 기이다. 바람직하게, 활성종은 단기간의 활성을 나타내어 그것의 절단유발 효과가 그것의 생성 부위 근처에서만 존재하는 화학종이다. 활성종은 원래 생존기간이 짧아서, 그것의 생성의 근접으로 인한 유의한 백그라운드를 생성하지 않을 것이고, 그렇지 않으면 활성종을 효과적으로 청소하는 스캐빈져를 사용하여, 활성종의 생성 부위로부터 짧은 거리 너머에 있는 절단가능 결합과 반응할 수 없다. 예시적인 활성종은 단일항 산소, 과산화 수소, NADH, 및 히드록시 라디칼, 페녹시 라디칼, 초과산화물 등을 포함한다. 산화를 일으키는, 활성종에 대한 예시적인 퀀칭제는 폴리엔, 카로테노이드, 비타민 E, 비타민 C, 및 티로신, 히스티딘 및 글루타티온의 아미노산-피롤 N-접합체 등을 포함한다 (Beutner et al, Meth. Enzymol., 319: 226241 (2000)).
절단유발 부분 및 절단가능 결합에 있어서 중요한 고려사항은 여태까지는 표적 단백질에 결합될 때 서로로부터 제거되지 않아서 증감제에 의해 생성된 활성종이 확산하여 절단가능 결합과 상호작용할 수 있기 전에 그의 활성을 잃는다는 것이다. 따라서, 절단가능 결합은 1000 nm 이내인 것이 바람직하며, 바람직하게는 결합 절단유발 부분의 20-100 nm이다. 절단유발 부분의 이러한 유효 범위는 여기에서 그것의 "유효 근접"으로서 지칭된다.
활성종의 생성제는 산화효소와 같은 효소를 포함하는데, 이러한 산화효소는 글루코스 산화효소, 크산텐 산화효소, D-아미노산 산화효소, NADH-FMN 산화환원효소, 갈락토스 산화효소, 글리세릴 인산 산화효소, 사르코신 산화효소, 콜린 산화효소 및; 과산화수소를 생산하는 알콜 산화효소, 히드록시 라디칼을 생산하는 고추냉이 퍼록시다제, NADH 또는 NADPH를 생산하는 다양한 탈수소효소, 암모니아를 생산하여 높은 국소 pH를 야기하는 유레아제를 포함한다. 하나의 절단가능 결합은 황 또는 셀레늄의 산화에 기초할 수 있는데, 여기에서, 티오에테르, 설폭시드 또는 그것의 셀레늄 유사체는 활성기에 관련하여 α- 또는 β-지점에 존재할 수 있고, 이것은 활성화기에 대한 수소 α를 산성으로 만들고 염기에 의해 제거될 수 있게 하여, e-태그의 방출 가능 위치에 부착된 산화 작용기를 방출하거나, 또는 e-태그의 방출로 산화된다. 대안으로, 하나의 산화 단계에서는 안정하고 또다른 산화단계에서는 불안정한 금속 킬레이트가 사용될 수 있다. 다른 화합물은 α-치환된 메틸퀴논을 포함하는데, 이것은 설포닐, 옥시, 아미노 등과 같은 이탈기를 통해 결합된 시약의 방출가능한 위치를 갖는다.
증감제는 반응성 중간물질을 생성하도록 유도될 수 있는 화합물 또는 종으로서 일반적으로는 단일항 산소이다. 바람직하게, 본 발명에 따라 사용되는 증감제는 광감작제이다. 그러나, 예를 들어 외부 광원에 의한 활성화를 동반하거나 또는, 덜 바람직하게는 동반하지 않고 단일항 산소를 생산할 수 있는 다른 물질 및 조성물을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 화학-활성화되는 (예를 들어, 효소 및 금속염) 다른 증감제가 본 발명에 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어 몰리브데이트 (MoO4 =) 염 및 클로로퍼록시다제 및 미엘로퍼록시다제 및 브롬 또는 염소 이온은 단일항 산소 및 물로의, 과산화수소의 전환을 촉매작용하는 것으로 나타난다. 상기 증감제의 예에 있어서, 과산화수소는 보조적인 시약으로서 포함될 수 있고, 클로로퍼록시다제는 표면에 결합될 수 있고 몰리브데이트는 리포솜의 수성상에 포함될 수 있다. 본 발명의 범위 내에 포함되는 다른 증감제는 진정한 증감제는 아니지만 열, 빛, 이온화 방사선, 또는 화학적 활성화에 의한 여기로 단일항 산소의 분자를 방출하는 화합물이다. 이 부류의 화합물 중 가장 잘 공지된 구성원은 1,4-비스카르복시에틸-1,4-나프탈렌 엔도퍼록시드, 9,10-디페닐안트라센-9,10-엔도퍼록시드 및 5,6,11,12-테트라페닐 나프탈렌 5,12-엔도퍼록시드와 같은 엔도퍼록시드를 포함한다. 가열 또는 이 화합물에 의한 빛의 직접 흡수는 단일항 산소를 방출한다. 그 이상의 증감제는 하기 참고문헌에 개시된다: Di Mascio et al, FEBS Lett., 355: 287 (1994) (퍼록시다제 및 옥시게나제); Kanofsky, J. Biol. Chem. 258: 5991-5993 (1983) (락토퍼록시다제) ; Pierlot et al, Meth. Enzymol., 319: 3-20 (2000) (엔도퍼록시드의 열 용해); 등.
절단유발 부분에 결합제가 부착하는 것은 직접 또는 간접적이거나, 공유 또는 비공유일 수 있고 문헌에서 통상적으로 이용가능한 주지된 기술에 의해 성취될 수 있다. 예를 들어, "Immobilized Enzymes", Ichiro Chibata, Halsted Press, New York (1978); Cuatrecasas, J. Biol. Chem., 245: 3059 (1970)를 참조한다. 다양한 작용기가 이용가능하거나 또는 포함될 수 있다. 작용기는 카르복시산, 알데히드, 아미노기, 시아노기, 에틸렌기, 히드록시기, 머캅토기 등을 포함한다. 다양한 화합물을 연결하는 방식은 주지되며 문헌에 상세히 예시된다 (상기 참조). 결합테에 대한 연결기의 길이는 광범위하게 변화할 수 있으며, 연결되는 화합물의 성질, 특정 결합 성질에 대한 거리 효과 등에 의존한다.
렉틴은 공지된 공유 결합 기술에 의해 절단유발 부분에 부착될 수 있다. 이러한 결합은 이작용기 교차-결합제를 통해 렉틴을 절단유발 부분 또는 중추 분자와 교차결합함으로써 적절하게 수행된다. 적합한 이작용기 화합물은 Peters, K. 및 Richards, F. M.에 의한 리뷰 (Ann. Rev. Biochim. 46 (1977) 523)에 나타난다. 알킬 이미데이트는 단백질에 의해 나타나는 작용기 중에서 고도의 특이성을 나타낸다. 반응은 1차 아미노기에 대하여 특이적이다. 특이적 커플링 시약은 디메틸 말론이미데이트와 같은 아미노에스테르, 아미노기와 반응하여 아미드결합을 생성하는 타르트릴 디아지드의 아크릴 아지드와 같은 아지드, 아릴 디할리드 (예를 들어, 1, 5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠, 또는 4,4'-디플루오로-3,3'-디니트로페닐설폰), 글루타르알데히드, 디말레이미드, 혼합 안히드리드, 혼합 방향족 또는 지방족 디카르복실, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 및 다른 공지된 교차-결합제를 포함한다. 1-에틸-3(3-디메틸아미노 프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드와 같은 촉매 시약은 한 분자의 아미노기와 또다른 분자의 카르복시기 사이의 공유 결합을 형성하는데 사용될 수 있다.
부류-특이적 시약은 본래의 위치에서 수행되거나 형성될 수 있다. 형성체 환경에서 부류-특이적 시약은 본 발명의 방법에 사용되기 앞서 함께 결합된 그것의 구성 성분 전부를 갖는다. 후의 상황에서 부류-특이적 시약의 적어도 몇몇 성분은 본 방법이 수행되는 매질에 독립적으로 첨가된다. 한 접근법에서 결합제는 절단유발 부분의 부착을 위한 부분을 포함한다. 일반적으로, 이것은 제 2의 부분을 포함하는데, 이는 절단유발 부분 상에 존재하며, 제 2의 부분 및 결합제의 부분이 상호작용하여 결합제로의 절단유발 부분의 부착 및 본래 위치에서 부류-특이적 시약의 형성을 제공한다. 전형적으로, 부분은 비-공유 부착에 의해 상호작용 한다. 이 상황은 작은 분자 (약 100 내지 약 1500의 분자량)을 포함하는 두 부분 중 하나 및 작은 분자를 위한 결합 파트너를 포함하는 또다른 부분에 의해 예시될 수 있다. 예를 들어, 작은 분자는 바이오틴, 디곡신, 플루오레세인, 디니트로페놀 등이 될수 있고, 작은 분자의 파트너는 아비딘, 디곡신에 대한 항체, 플루오레세인에 대한 항체, 디니트로페놀에 대한 항체 등이다.
예를 들어, 생성되는 활성 종의 수를 증가시키기 위해 결합제에 부착된 다수의 절단유발 부분을 갖는 것이 바람직할 수 있다. 한 접근법에서 결합제는 예를 들어, 항체, 렉틴 등과 같은 부착을 위한 다수의 부위를 갖는다. 절단유발 부분의 수를 더욱 향상시키기 위하여, 중추 분자 또는 핵이 사용된다. 중추 핵은 다작용기 물질로, 보통 중합체이며, 연결을 위한 부위로서 예를 들어, 히드록시, 아미노, 머캅토, 카르복시, 에틸렌, 알데히드 등과 같은 다수의 작용기를 갖는다. 중추에 있는 작용기는 절단유발 부분 또는 부착되는 결합제에 대한 작용기와 반응하는 것이어야 한다. 중추 핵의 고찰은 다른 시약에 관하여 아래에서 설명되며 아래 고찰된 원리는 이 예에 또한 적용될 수 있다.
어떤 구체예에서 부류-특이적 시약은 부류-특이적 시약의 구성 성분 중 하나와 결합된 지지체를 포함한다. 지지체는 유기 또는 무기, 고체 또는 유체, 비수용성 물질로 구성될 수 있는데, 이것은 투명하거나 부분적으로 투명할 수 있다. 지지체는 비드, 필름, 막, 튜브, 웰, 스트립, 막대 등을 포함하는 입자와 같은, 어떤 다수의 형태를 가질 수 있다. 광감작제가 포함되는 지지체에 있어서, 지지체의 표면은 친수성이거나 친수성이 되도록 할 수 있는 것이 바람직하며 지지체의 본체는 소수성인 것이 바람직하다. 지지체는 사용되는 매질에서 현탁될 수 있다. 현탁가능한 지지체의 예는 라텍스, 지질 이중막, 유적, 세포 및 히드로겔과 같은 중합체 물질이 될 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 다른 지지체 조성물은 유리, 금속,니트로셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 폴리(비닐 클로라이드), 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(4-메틸부텐), 폴리스티렌, 폴리메트아크릴레이트, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 나일론, 폴리(비닐 부티레이트) 등과 같은 중합체를 포함하고, 이것 자체로 사용되거나 또는 다른 물질과 조합으로 사용된다. 지지체에 대한 결합제의 부착은 직접 또는 간접, 공유 또는 비-공유일 수 있고 상기 고찰된 것과 같이 문헌에서 일반적으로 이용가능한, 주지된 기술에 의해 성취될 수 있다. 예를 들어, "Immobilized Enzymes," Ichiro Chibata, 를 참조한다. 지지체의 표면은 보통 다작용기거나 또는 다기능화될 수 있거나 또는 공유 또는 특이적 또는 비-특이적 비-공유성 상호작용을 통해 표적-결합 부분등에 결합할 수 있을 것이다.
절단유발 부분은 지지체의 표면에 공유적 또는 비-공유적으로 부착됨으로써 또는 지지체의 본체 내로 포함됨으로써 지지체와 결합할 수 있다. 표면으로의 연결은 상기 고찰된 것과 같이 성취될 수 있다. 절단유발 부분은 지지체의 제조 도중이나 아니면 후에 지지체의 본체 내로 포함될 수 있다. 일반적으로, 절단유발 부분은 필요한 양의 활성종을 성취하는데 필요한 양으로 지지체와 결합된다. 일반적으로, 절단유발 부분의 양은 실험적으로 결정된다.
절단유발 부분으로서의 광감작제
상기 언급된 것과 같이, 본 발명에 따른 바람직한 절단유발 부분은 단일항 산소를 생산하는 광감작제이다. 여기에서 사용될 때, "광감작제"는 빛에 의해 활성화될 때 산소 분자를 단일항 산소로 전환하는 광-흡수 분자를 지칭한다. 광감작제는 공유 또는 비-공유 연결을 통해, 부류-특이적 시약의 결합제에 직접 또는 간접으로 부착될 수 있다. 이러한 조성물의 구성에 대한, 특히 결합제로서의 항체에 대한 지침은, 예를 들어 광역학 요법, 면역진단법 등의 분야에 있는, 문헌에서 이용가능하다. 다음은 예가 되는 참고문헌이다: Ullman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,5426-5430 (1994); Strong et al, Ann. New York Acad. Sci., 745: 297-320 (1994); Yarmush et al, Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Syst., 10: 197-252 (1993); Pease et al, 미국 특허 5,709,994; Ullman et al, 미국 특허 5,340,716; Ullman et al, 미국 특허 6,251,581; McCapra, 미국 특허 5,516,636; 등.
이와 마찬가지로, 본 발명의 사용에 적합한 광감작제의 성질 및 선택에 관한 지침이 문헌에 있다. 다음은 예가 되는 참고문헌이다: Wasserman and R. W. Murray. Singlet 옥시gen. (Academic Press, New York, 1979); Baumstark, Singlet 옥시gen, Vol. 2 (CRC Press Inc., Boca Raton, FL 1983); 및 Turro, Modern Molecular Photochemistry (University Science Books, 1991).
광감작제는 광 여기에 의해 단일항 산소를 생성하는 증감제이다. 광감작제는 염료 및 방향족 화합물을 포함하며, 보통은 다중 접합된 이중 또는 삼중 결합을 갖는, 공유 결합된 원자로 구성된 화합물이 일반적이다. 화합물은 전형적으로 여기 파징인 약 500 M-1cm-1, 바람직하게는, 약 5,000 M-1cm-1, 더 바람직하게는, 약 50,000 M-1cm-1보다 큰 그것의 최대 흡광도에서 흡광 계수로, 약 200 내지 약 1,100nm, 일반적으로는, 약 300 내지 약 1,000 nm, 바람직하게는, 약 450 내지 약 950 nm의 파장 범위에서 빛을 흡수한다. 산소의 부재에서 빛의 흡수 후 생산되는 여기 상태의 존속시간은 일반적으로 적어도 약 100 나노초, 바람직하게는, 적어도 약 1 밀리초일 것이다. 일반적으로, 존속시간은 본 발명에 따른 시약에서 연결의 절단을 허용하기에 충분히 길어야 한다. 이러한 시약은 보통 아래 고찰된 것과 같은 농도로 존재한다. 광감작제 여기 상태는 일반적으로 그것의 바닥 상태와는 상이한 회전 양자수(S)를 가지며 일반적인 경우에서와 같이 바닥 상태가 단일항일 때 (S=0) 보통은 삼중항 (S=1)이다. 광감작제는 높은 인터시스템 교차 수율을 갖는 것이 바람직하다. 즉, 광감작제의 광여기는 보통 적어도 약 10%, 바람직하게는 적어도 약 40%, 더 바람직하게는 약 80% 이상의 효율로 삼중항 상태를 생산한다.
선택된 광감작제는 상대적으로 빛에 안정하며, 바람직하게는 단일항 산소와 효과적으로 반응하지 않는다. 몇몇 구조적 특징은 대부분의 유용한 광감작제에 존재한다. 대부분의 광감작제는 경직된, 빈번하게는 방향족 구조에 포함된 적어도 하나 및 종종 셋 이상의 접합된 이중 또는 삼중 결합을 갖는다. 이것은 종종 카르보닐 또는 아민기와 같은 또는 주기율표의 3-6 주기로부터 선택된 중원소, 특히 요오드 또는 브롬과 같은 적어도 하나의 기를 함유할 것이며, 또는 확장된 방향족 구조를 가질 수도 있다.
광원의 거대한 다양성은 단일항 산소를 생성하는 광감작제를 광-활성화하는데 이용가능하다. 다색 및 단색 광원 모두는 광원이 실행 시간 지속에서 충분한 단일항 산소를 생산하기에 충분히 강한 한 사용될 수 있다. 방사의 길이는 광감작제의 성질, 절단가능한 결합의 성질, 광원의 방사력, 및 샘플로부터 그것의 거리 등에 의존한다. 일반적으로, 방사 주기는 약 마이크로초 미만 내지 약 10분 정도이고, 보통은 1 밀리초 내지 약 60 초의 범위이다. 방사의 강도 및 길이는 적어도 약 0.1%의 광감작제 분자, 보통은 적어도 약 30%의 광감작제 분자 및 바람직하게는 실질적으로 모든 광감작제 분자를 여기시키기에 충분해야 한다. 예가 되는 광원은 예를 들어, 헬륨-네온 레이저, 아르곤 레이져, YAG 레이저, He/Cd 레이저, 및 루비 레이저와 같은 레이저; 포토다이오드; 수은, 나트륨 및 크세논 증기 램프; 예를 들어, 텅스텐 및 텅스텐/할로겐과 같은 백열 램프; 플래쉬램프 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용될 수 있는 광감작제의 예는 상기 성질을 가지며 다음 참고문헌에서 열거된 것이다: Turro, Modern Molecular Photochemistry (cited above); Singh 및 Ullman, 미국 특허 5,536,834; Li et al, 미국 특허 5,763,602; Ullman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,5426-5430 (1994); Strong et al, Ann. New York Acad. Sci., 745: 297-320 (1994); Martin et al, Methods Enzymol., 186: 635-645 (1990); Yarmush et al, Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Syst., 10: 197-252 (1993); Pease et al, 미국 특허 5,709,994; Ullman et al, 미국 특허 5,340,716; Ullman et al, 미국 특허 6,251,581; McCapra, 미국 특허 5,516,636; Wohrle, Chimia, 45: 307-310 (1991); Thetford, European patent publ. 0484027 ; Sessler et al, SPIE, 1426: 318-329 (1991); Madison et al. Brain Research, 522: 90-98 (1990); Polo et al, Inorganica Chimica Acta, 192:1-3 (1992); Demas et al, J. Macromol. Sci., A25: 1189-1214 (1988); 등. 예가 되는 광감작제는 표 1b에 열거된다.
예시적 광감작제
히포크렐린 A히포크렐린 B하이퍼리신플루오레세인 염료의 할로겐화 유도체로즈 벵갈메로시아닌 540메틸렌 블루9-티옥산톤클로로필페날레온프로토포르피린벤조포르피린 A 1산 테트라페닐포르피린로다민 염료의 할로겐화 유도체메탈로-포르피린프탈로시아닌나프탈로시아닌텍사피린형 마크로사이클헤마토포르피린9,10-디브로모안트라센벤조페논염소6페릴렌벤조포르피린 B 1산
어떤 구체예에서 광감작제 부분은 절단유발 부분에 관하여 상기 고찰된 것과 같이, 지지체를 포함한다. 광감작제는 지지체의 표면에 공유 또는 비-공유적으로 부착됨으로써 또는 상기 고찰된 것과 같이 지지체의 본체 내에 포함됨으로써 지지체와 결합할 수 있다. 일반적으로, 광감작제는 필요량의 단일항 산소를 성취하기에 필요한 양으로 지지체와 결합된다. 보통, 광감작제의 양은 실험적으로 결정된다. 예를 들어, Pease 등의 미국 특허 5,709,994에 개시된 것과 같이, 광감작제로서 사용되는 광감작제는 상대적으로 무극성이어서 광감작제가 예를 들어, 라텍스 입자에 포합되어 광감작제 비드를 형성할 때 친유성 막 내로의 용해를 보장하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 광감작제 로즈 벵갈은 J. Amer. Chem. Soc., 97: 3741 (1975)에 설명된 것과 같이, 라텍스 상의 클로로메틸기에 의해 0.5 마이크론의 라텍스 비드에 공유적으로 부착되어 에스테르 결합기를 제공한다.
본 발명의 한 양태에서, 부류-특이적 시약은 항체인 제 1 결합제와 광감작제인 절단유발 부분을 포함하므로, 예를 들어 Strong et al (상기 언급됨); Yarmush et al (상기 언급됨); 등에서 개시된 것과 같은 주지된 기술을 이용하여 광감작제는 항체에 공유 결합된다. 대안으로, 부류-특이적 시약은 비드와 같은 고체상 지지체를 포함하고 여기에 직접 또는 아미노-덱스트란 등과 같은 기능화된 중합체에 의해 광감작제가 공유 또는 비-공유적으로 부착되고 바람직하게는 공유적으로, 항체가 부착된다.
전기영동 프로브 조성물
본 발명의 중요한 특성에 있어서, 전기영동 프로브 세트가 제공되는데 각각은 유일한 폴리펩티드-결합 부분 및, 유일한 전하:질량 비 및/또는 광학적 성질을 갖는 결합된 "e-태그 부분"을 갖는다. 편의상, e-태그 부분의 유일한 전하:질량 비는 이동성 변형체의 화학적 구조로 인한 것인데, 이것은 검출기 및 연결기 잔기는 (만약 존재한다면) 어떤 전기영동 프로브 세트에 있어서도 공통일 것이기 때문이다. 그러나, e-태그 리포터에 대한 유일한 전하 및/또는 질량 기여는 검출기에 의해서도 이루어질 수 있다는 것이 인정된다. 예를 들어, 전기영동 프로브 세트는, 하나의 정의된 전하 및/또는 질량을 갖는 검출기와 조합된 서브세트에 유일한 전기영동 이동성을 부여하는 이동성 변형제의 기를 갖는 제 1 서브세트, 및 상이한 전하 및/또는 질량을 갖는 제 2 검출기와 조합된 이동성 변형제의 동일한 기을 갖는 제 2 서브세트로 제조되어, 두 서브세트 모두에서 유일한 전기영동 이동성을 부여할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 다수의 전기영동 프로브로 이루어진 조성물을 포함한다. 전기영동 프로브는 표적 폴리펩티드에 특이적인 결합 부분 및 하나 이상의 전기영동 태그를 포함한다. 전기영동 태그는 1차 항체의 불변 구역에 특이적인 2차 항체와 같은, 결합 부분에 특이적으로 결합하는 2차 결합 분자에 의해 직접 또는 간접적으로 결합 부분에 부착될 수 있다. 바람직하게, 전기영동 프로브의 결합 부분은 항체이다. 보통, 전기영동 프로브는 다음 식으로 정의되는데,
T-(L-E)k
상기 식에서 T는 결합 부분, 또는 더 구체적으로는 폴리펩티드-결합 부분이고; L은 절단가능한 결합이고; 그리고 E는 전기영동 태그, 또는 "e-태그"이다. 바람직하게, 절단가능한 결합인 L은, 산화-불안정 결합이고, 더욱 바람직하게는 단일항 산소에 의해 절단될 수 있는 결합이다. 부분 "-(L-E)k"는 단일 결합 부분이 절단가능한 결합을 통해 부착된 하나 이상의 전기영동 태그를 가질 수 있다는 것을 가리킨다. k는 1보다 크거나 같은 정수이고; 바람직하게, k는 1 내지 500 범위에 있는 정수이고; 더 바람직하게는, k는 1 내지 100 또는 1 내지 50 범위에 있는 정수이고; 더욱 바람직하게, k는 1 내지 10 범위에 있는 정수이다. 바람직하게, 전기영동 프로브의 수는 적어도 5이고, 더 바람직하게는 적어도 10이다. 더욱 바람직하게, 프로브의 수는 5 내지 200의 범위이고, 더 바람직하게는 5 내지 100, 또는 5 내지 50, 또는 10 내지 30이다. 바람직하게는, 다수 내에서, 각각의 상이한 결합 부분, T는, 상이한 전기영동 태그, E를 갖는다. 산화-불안정 결합 및 태그, E는, 기존의 결합 화학에 의해 T에 부착된다. 바람직하게는, T가 폴리펩티드일 때 아미노, 설피드, 카르복시와 같은 공통 반응성 기능을 통해 부착될 수 있다.
바람직하게, 결합 부분 T는, 표적 단백질, 또는 폴리펩티드에 특이적인 항체이거나 또는 항체를 포함한다. 후자의 경우에서, T는 표적 단백질에 근접하여 전기영동 태그를 붙잡도록 함께 작동하는 다수의 결합 구성 성분을 포함한다. 예를 들어, T는 e-태그가 부착된 2차 항체를 동반한 항체, e-태그가 부착된 2차 항-헵텐 항체를 동반한 헵텐화된 항체, e-태그가 부착된 스트렙타비딘을 동반한 바이오틴화 항체, 기능화된 중합체로 유도된 후 e-태그가 부착된 항체 등이 될 수 있다. 다수의 전기영동 프로브는 본 발명의 방법에서 바람직하게 사용되며, 여기에서 각 프로브는 상이한 결합 부분 T를 갖는다.
바람직하게, L은 티오에테르 또는 그것의 셀레늄 유사체이거나; 또는 올레핀인데, 이는 탄소-탄소 이중 결합을 함유하며, 여기에서 옥소기에 대한 이중 결합의 절단은 e-태그, E를 방출한다. 예시적인 올레핀은 비닐 설피드, 비닐 에테르, 엔아민, 및 탄소 원자에서 α-메틴 (CH, 적어도 하나의 수소 원자를 갖는 탄소 원자)으로 치환된 이민을 포함하는데, 여기에서 비닐기는 고리에 있을 수 있고, 헤테로원자는 고리에 있거나 또는 고리형 올레핀 탄소 원자 상에서 치환될 수도 있고, 그리고 올레핀 탄소 원자에 결합된 적어도 1 내지 4개까지의 헤테로원자가 있을 것이다. 결과적 디옥세탄은 대기 온도 이상, 보통은 약 75℃ 미만으로 가열함으로써, 산 또는 염기와의 반응에 의해, 또는 광감작제의 부재 또는 존재에서의 광활성화에 의해 자발적으로 분해될 수 있다. 이러한 반응은 하기 예시적 참고문헌에서 설명된다: Adam and Liu, J. Amer. Chem. Soc. 94, 1206-1209, 1972, Ando, et al., J. C. S. Chem. Comm. 1972,477-8, Ando, et al., Tetrahedron 29, 1507-13, 1973, Ando, et al., J. Amer. Chem. Soc. 96, 6766-8, 1974, Ando and Migita, ibid. 97, 5028-9, 1975, Wasserman and Terao, Tetra. Lett. 21, 1735-38, 1975, Ando and Watanabe, ibid. 47, 4127-30, 1975, Zaklika, et al., Photochemistry and Photobiology 30, 35-44, 1979, 및 Adam, et al., Tetra. Lett. 36, 7853-4, 1995. 또한 미국 특허 no. 5,756,726을 참조한다.
디옥세탄의 형성은 하나의 탄소 원자에서 e-태그 부분으로 치환된 활성화 올레핀과 단일항 산소의 반응 및 올레핀의 다른 탄소 원자에 있는 결합 부분에 의해 얻는다. 예를 들어, 미국 특허 No. 5,807,675를 참조한다. 이 절단가능 결합은 다음 식으로 나타낼 수 있는데,
-W-(X)nCα=Cβ(Y)(Z)-
상기 식에서:
W는 결합, 예를 들어, O, S, N, P, M (안정한 공유 결합을 형성하는 금속을 의도함)과 같은 헤테로원자, 또는 카르보닐, 이미노 등과 같은 작용기일 수 있고, 그리고 X 또는 Cα에 결합될 수도 있고; 적어도 하나의 X는 지방족, 방향족, 지방족 고리 또는 헤테로고리일 것이고 예를 들어, N, O, 또는 S와 같은 헤테로 원자를 통해 결합될 것이고 다른 X는 동일하거나 상이할 수 있고 수소, 지방족, 방향족, 지방족 고리 또는 헤테로고리일 수 있고, 보통은 방향족 또는 방향족 헤테로고리인데여기에서 하나의 X는 Y와 함께 취합되어 수소 이외의 것들이 일반적으로는 약 1 내지 20, 보통은 1 내지 12, 더 일반적으로는 1 내지 8개의 탄소 원자일 때 이들이 부착되는 탄소 원자를 갖는, 보통은 헤테로고리인 고리를 형성할 수 있고, 하나의 X는 0 내지 6, 보통은 0 내지 4 헤테로원자를 가지는 반면, 다른 X는 적어도 하나의 헤테로원자 및 6개 까지의 헤테로원자, 보통은 1 내지 4 개의 헤테로원자를 가질 것이고;
Y는 X의 정의 내에 있을 것이고, 보통은 헤테로원자를 통해 Cα에 결합되고 지적된 것과 같이 X와 취합되어 헤테로고리를 형성할 수 있고;
Z는 보통 약 4 내지 12, 보통은 4 내지 10 탄소 원자 및 0 내지 4 헤테로원자의 헤테로고리 방향족을 포함하는 방향족일 것이고, 상기 설명된 것과 같이 Cβ에 직접 또는 헤테로원자를 통해 결합되고;
n은 e-태그 부분이 Cα에 결합하였는가 아니면 X에 결합하였는가에 의존하여. 1 또는 2이고;
상기 식에서 하나의 Y 및 Z는 결합 부분에 결합하기 위한 작용기를 갖거나, 또는 결합 부분, T에 대한 결합기로서 작용하거나, 이를 포함하는 결합 부분에 결합된다.
W, X, Y, 및 Z는 절단 후 전기영동 태그, E가 아래 설명된 크기 제한 내에 있도록 선택되는 것이 바람직하다.
화학식에 설명되지는 않지만, 한쪽 또는 양쪽 X에 결합된 하나 이상의 e-태그 부분을 가짐으로써, 단일 분자에 다수의 e-태그를 가질 수 있다.
예시적인 절단가능 결합은 S-3-티올아크릴산, -N,N-메틸 4-아미노-4-부텐산, -O,3-히드록시아크롤레인, N-(4-카르복시페닐) 2-이미다졸, 옥사졸, 및 티아졸을 포함한다.
아래 식의 2가기로 9번 위치에서 치환된, N-알킬 아크리디닐 유도체 또한 관심있는 것으로,
-(CO)X1(A)
상기 식에서:
Xl은 O, S, N, 및 Se로 구성된 군으로부터 선택되는, 보통은 처음 세 개중 하나인 헤테로원자이고;
A는 적어도 2 탄소 원자 및 보통은 e-태그 리포터로 치환된 6 탄소 원자를 넘지 않는 사슬인데, 여기에서 A의 다른 원자가는 수소에 의해 만족되는 것이 바람직하지만, 사슬은 알킬, 아릴, 헤테로고리기 등과 같은 다른 기로 치환될 수 있고, A는 일반적으로 10 탄소 원자를 넘지 않는다.
치환된 이미다졸, 티아졸, 옥사졸 등으로 예시되는, 디헤테로시클로펜타디엔과 같은 헤테로고리 화합물 또한 관심있는 것으로, 여기에서 고리는 보통 적어도 하나의 방향족 기로 치환될 것이고 몇몇 예에서 가수분해는 e-태그 리포터를 방출하는데 필요할 것이다.
텔루르 (Te) 유도체 또한 관심있는 것으로, Te는 Te 원자에 수소 원자 β를갖는 에틸렌기에 결합되는데, 여기에서 에틸렌기는 지방족고리 또는 헤테로고리의 일부이고, 옥소기를 가질 수 있으며, 바람직하게는 방향족 고리에 융합되고 Te의 다른 원자가는 3-태그 리포터에 결합된다. 고리는 쿠머린, 벤족사진, 테트랄린 등이 될 수 있다.
몇몇 바람직한 절단가능 결합 및 그것의 절단 생성물은 도 10 A-F에 예시된다. 도 10A에 나타난, 티아졸 절단가능 결합, "-CH2-티아졸-(CH2)n-C(=O)-NH-단백질은 부분 "-CH2-C(=O)-NH-CHO"를 갖는 전기영동 태그를 야기한다. 바람직하게, n은 1 내지 12의 범위에 있으며, 더 바람직하게는 1 내지 6이다. 도 10B에 나타난 옥사졸 절단가능 결합, "-CH2-옥사졸-(CH2)n-C(=O)-NH-단백질"은 부분"-CH2-C(=O)0-CHO"를 갖는 전기영동 태그를 야기한다. 올레핀 절단가능 결합 (도 10C)은 전기영동 프로브 구체예 "T-L-M-D"와 결합으로 나타나고, 상기 설명된 것과 같이 D는 플루오레세인 염료이다. 올레핀 절단가능 결합은 또한 다른 구체예에서 사용될 수 있다. 예시적 올레핀 결합의 절단은 "R-(C=O)-M-D" 형태의 전기영동 태그를 야기하는데, 여기에서 "R"은 상기 제공된 전기영동 태그, E의 일반 설명 내에 있는 어떠한 치환기일 수 있다. 바람직하게, R은 전자-공여기이다 (예를 들어 Ullman et al, 미국 특허 6,251,581; Smith and March, March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 5판 (Wiley-Interscience, New York, 2001); 등). 더 바람직하게, R은 1 내지 8 탄소 원자 및 O, S, 및 N으로 구성된 군으부터 선택되는 0 내지 4 헤테로원자를 갖는 전자-공여기이다. 더욱 바람직하게, R은 -N(Q)2, -OQ, p-[C6H4N(Q)2], 푸라닐, n-알킬피롤릴, 2-인돌릴 등이고, 여기에서 D는 알킬 또는 아릴이다. 10C의 올레핀 절단가능 결합에 더욱 관련하여, 치환기 "X" 및 "R"은 절단가능 결합, L을 설명한 상기 식의 치환기 "X" 및 "Y"와 동등하다. 특히, 도 10C에서 X는 모르폴리노, -OR', 또는 SR"인 것이 바람직한데, 여기에서 R' 및 R"은 1 내지 8 탄소 원자 및 O, S 및 N으로 구성된 군으로부터 선택되는 0 내지 4 헤테로원자를 갖는 지방족, 방향족, 지방족고리 또는 헤테로고리이다. 바람직한 티오에테르 절단가능 결합은 "-(CH2)2-S-CH(C6H5)C(=O)NH-(CH2)n-NH-"의 형태를 갖는 도 10D에서 예시되는데, 여기에서 n은 2 내지 12의 범위이고, 더 바람직하게는 2 내지 6의 범위이다. 도 10D에 나타난 티오에테르 절단가능 결합형은 도 10E 및 도 10F에 나타난 전구체 화합물에 의해 결합 부분 T, 및 전기영동 태그 E에 부착될 수 있다. 결합 부분 T에 아미노기를 부착시키기 위하여, 말단 히드록실은 종래 화학에 의해 NHS 에스테르로 전환된다. 아미노기와의 반응 및 부착 후, Fmoc 보호기를 제거하여 최종 반응 단계가 포스포르아미디트기 대신 NHS 에스테르의 첨가인 것을 제외하면 도 1, 2 및 4의 계획에 의해 제조되는 화합물과 같은, e-태그의 NHS와 반응하는 유리 아민을 생산한다.
전기영동 태그, E는 수용성 유기 화합물로서 활성종, 특히 단일항 산소에 관하여 안정하고, 검출 또는 리포터 기를 포함한다. 그렇지 않으면, E는 크기 및 구조에서 광범위하게 변화할 수 있다. 바람직하게, E는 중성 pH에서 전하를 가지며 약 150 내지 약 10,000 달톤, 더 바람직하게는 약 150 내지 약 5000 달톤, 그리고가장 바람직하게는 약 150 내지 약 2500 달톤의 분자량을 갖는다. E의 바람직한 구조는 아래에서 좀더 충분히 설명된다. 바람직하게, 검출기는 전기화학의, 또는 형광성, 또는 발생성 신호를 생성한다. 가장 바람직하게는, 검출기는 형광 신호를 생성한다. 본 발명의 조성물은 본 발명의 복합 검정을 수행하는데 함께 사용될 수 있는 다수의 전기영동 태그를 포함한다. 바람직하게, 조성물에 있는 전기영동 태그의 수는 적어도 5, 더 바람직하게는 적어도 10이다. 더욱 바람직하게는, 5 내지 200의 범위이고, 더 바람직하게는 5 내지 100, 또는 5 내지 75, 또는 5 내지 50, 또는 10 내지 30이다. 바람직하게, 다수의 조성물 내에 있는 전기영동 태그 각각은 동일한 수의 다른 구성원에 대하여 유일한 전하:질량 비 및/또는 유일한 광학 성질을 갖는다. 바람직하게, 광학 성질은 방사 스펙트럼, 형광 존속시간 등과 같은 형광 성질이다. 더 바람직하게, 형광 성질은 방사 스펙트럼이다. 예를 들어, 다수의 전기영동 태그 중 각각은 동일한 형광 방사 성질을 가질 수 있지만, 각각은 유일한 전하:질량 비에 의해 서로 상이할 것이다. 반면, 둘 이상의 전기영동 태그가 동일한 전하:질량 비를 가질 수는 있지만, 그러나 이들은 예를 들어 스펙트럼으로 분해가능한 방사 스펙트럼과 같은 유일한 형광 성질을 가질 것이므로, 모든 구성원은 전기영동 분리 및 형광 측정의 조합에 의해 구별될 수 있다.
바람직하게, 다수의 전기영동 태그는 전기영동 분리 및 형광에 의해 검출된다. 바람직하게, 실질적으로 동일한 형광 성질을 갖는 전기영동 태그는 상이한 전기영동 이동성을 가지므로 분리 조건 하에서 일렉트로페로그램의 별개의 피크가 형성된다. 인접한 피크의 독특함, 또는 중복 결여의 측정은 전기영동적 분해능으로,이것은 피크들의 2개의 표준 편차중 큰것의 4배로 나눈 인접한 피크 최대값들 사이의 거리이다. 바람직하게, 인접 피크는 적어도 1.0의 분해능이고, 더 바람직하게는 적어도 1.2, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 1.5이다. 주어진 분리 및 검출 시스템에서, 원하는 분해능은 다수의 전기영동 태그를 선택함으로써 얻을 수 있는데 이 태그의 구성원은 적어도 피크-분해량으로 상이한 전기영동 이동성을 갖고, 이러한 양은 신호 검출 시스템, 형광 부분의 성질, 태그의 확산 계수, 체질 매트릭스의 존재여부, 전기영동 기구의 성질 (예를 들어, 채널의 존재여부, 분리 채널의 길이 등)을 포함하는, 당업자에게 주지된 몇몇 인자에 의존한다. 바람직하게, 본 발명의 다수의 전기영동 태그는 종래의 체질 매트릭스의 존재 또는 부재 하에서, 종래의 모세관 전기영동 기구에 의해 분리된다. 예가 되는 모세관 전기영동 기구는 Applied Biosystems (Foster City, CA) 모델명 310, 3100 및 3700; Beckman (Fullerton, CA) 모델명 P/ACE MDQ; Amersham Biosciences (Sunnyvale, CA) MegaBACE 1000 또는 4000; SpectruMedix 유전 분석 시스템 등을 포함한다. 바람직하게, 이러한 종래의 기구에서, 다수의 전기영동 태그의 전기영동 이동성은 적어도 1%, 그리고 더 바람직하게는 적어도 1 내지 10%의 범위로 상이하다.
전기영동 이동성은 q/M2/3에 비례하는데, 여기에서 q는 분자 상의 전하량이고 M은 분자의 질량이다. 바람직하게, 가장 가까운 전기영동 표지 간의 측정 조건 하에서 이동성에서의 차이점은 적어도 약 0.001, 보통은 0.002, 더 일반적으로는 적어도 약 0.01일 것이고, 0.02 이상일 수도 있다.
전기영동 태그 E의 바람직한 구조는 (M,D)인데, 여기에서 M은 이동성-변형 부분이고 D는 검출 부분이다. 기호 "(M,D)"는 M 및 D 부분의 순서는 어떤 부분이든 절단가능 결합 L에 인접할 수 있다는 것을 나타내는데 사용된다. 즉, "T-L- (M,D)"는 "T-L-M-D" 또는 "T-L-D-M"의 두 형태를 갖는 전기영동 프로브를 나타낸다.
검출 부분, D는, 형광 표지 또는 염료, 발색 표지 또는 염료, 전기화학 표지 등이 될 수 있다. 바람직하게, D는 형광 염료이다. 본 발명에서의 사용에 있어서 예가 되는 형광 염료는 수용성 로다민 염료, 플루오레세인, 4,7-디클로로플루오레세인, 벤족산텐 염료, 및 에너지 수송 염료를 포함하며, 이것은 하기 참고문헌에 개시된다: Handbook of Molecular Probes and Research Reagents, 8th ed., (Molecular Probes, Eugene, 2002); Lee et al, 미국 특허 6,191,278; Lee et al, 미국 특허 6,372,907; Menchen et al, 미국 특허 6,096,723; Lee et al, 미국 특허 5,945,526; Lee et al, Nucleic Acids Research, 25: 2816-2822 (1997); Hobb, Jr., 미국 특허 4,997,928; Khanna et al., 미국 특허 4,318,846; Reynolds, 미국 특허 3,932,415; Eckert et al, 미국 특허 2,153,059; Eckert et al, 미국 특허 2, 242,572; Taing et al, 국제 특허 출원 WO 02/30944 등. 그 이상의 특정 예가 되는 형광 염료는 5- 및 6-카르복시로다민 6G; 5- 및 6-카르복시-X-로다민, 5- 및 6-카르복시테트라메틸로다민, 5- 및 6-카르복시플루오레세인, 5- 및 6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인, 2',7'-디메톡시-5- 및 6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인, 2',7'디메톡시-4',5'-디클로로-5- 및 6-카르복시플루오레세인, 2',7'-디메톡시-4',5'-디클로로-5- 및 6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인, 1',2',7',8'-디벤조 -5- 및 6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인, 1',2',7',8'-디벤조-4',5'-디클로로 -5- 및 6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인, 2',7'-디클로로-5- 및 6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인, 및 2', 4', 5', 7'-테트라클로로-5- 및 6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인을 포함한다. 가장 바람직하게는, D는 플루오레세인 또는 플루오레세인 유도체이다. 본 발명의 사용에 있어서 가장 바람직한 예시적 염료는 도 6A 및 6B에 나타난다.
M은 일반적으로 특정 전하:질량 비를 가짐으로 인해, 정의된 전기영동 시스템에서 특정 전기영동 이동성을 갖도록 디자인된 화학기 또는 부분이다. 이동성-변형 부분의 예가 되는 타입은 아래에서 고찰된다. 한 세트의 n 전기영동 프로브에서, 각각의 유일한 이동성 변형제는 Mj로 명명되고, 여기에서 j=1 내지 n이고, n은 상기 설명된 것과 같은 값을 갖는다. 이동성-변형 부분은 질량-변형 구역 및/또는 전하-변형 구역 또는 질량- 및 전하-변형 구역 모두로 작용하는 단일 구역을 포함하도록 고려될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 프로브에서, 이동성-변형 부분은, (i) 전하가 아닌, 질량에서의 변화로 인한 유일한 전하:질량 비; (ii) 질량 및 전하 모두에서의 변화로 인한 유일한 전하:질량 비; 및 (iii) 약 -0.0001 내지 약 0.5, 보통은 약 -0.001 내지 약 0.1 사이의 유일한 전하:질량 비 중 하나 이상의 특징을 가질 수 있다. 상기 언급된 것과 같이, D는 전형적으로 하나의 세트 또는 다수의 상이한 전기영동 프로브에서 공통이지만, 프로브 세트에서 또한 상이하여방출된 e-태그의 유일한 전기영동 이동성을 부여할 수 있다.
이동성-변형 부분, M의 크기 및 조성은 한 사슬에서 하나의 결합 내지 약 100 원자, 보통은 약 60 원자 이하, 더 일반적으로는 약 30 원자 이하로 다양할 수 있는데, 여기에서 원자는 탄소, 산소, 질소, 인, 붕소 및 황이다. 일반적으로, 하나의 결합이 아닐 경우, 이동성-변형 부분은 약 0 내지 약 40, 더 일반적으로는 약 0 내지 약 30개의 헤테로원자를 갖는데, 이것은 상기 지적된 헤테로원자 외에 할로겐 또는 다른 헤테로원자를 포함할 수 있다. 수소를 제외한 원자의 총수는 일반적으로 약 200 원자 미만, 보통은 약 100 원자 미만이다. 산성기가 존재하면, 이동성-변형 부분이 존재하는 매질의 pH에 의존하여, 다양한 양이온이 산성기에 결합될 수 있다. 산은 카르복시산, 티오노카르복시산, 티오카르복시산, 히드록삼산, 인산, 아인산, 인산염, 아인산염, 황산염, 아황산염, 붕소산, 질산, 아질산 등을 포함하는 유기 또는 무기산일 수 있다. 양전하에 있어서, 치환기는 아미노 (암모늄 포함), 포스포늄, 설포늄, 옥소늄 등을 포함하고, 여기에서 치환기는 일반적으로 약 1-6 탄소 원자의 지방족이고, 헤테로원자 당 탄소 원자의 총 수는 보통 약 12 미만, 보통은 약 9 미만이다. 측쇄는 아민, 암모늄염, 히드록시기를 포함하며, 페놀기, 카르복실기, 에스테르, 아미드, 포스페이트, 헤테로고리를 포함한다. M은 호모-올리고머 또는 헤테로-올리고머일 수 있고, 예를 들어, 뉴클레오티드 및 아미노산과 같은, 동일하건 상이한 화학적 특징의 상이한 단량체를 갖는다.
대전된 이동성-변형 부분은 일반적으로 음 또는 양전하만을 갖지만, 어떤 것은 특히 이동성-변형 부분이 부착되는 구역이 대전되고 이동성-변형 부분이 반대전하를 가지면, 전하의 조합을 가질 수도 있다. 이동성-변형 부분은 올리고머화를 위한 상이한 작용기를 제공하는 단일 단량체를 가질 수 있고 전하를 갖거나 또는 두 단량체가 사용될 수도 있다. 치환된 디올이 사용될 수도 있는데, 여기에서 치환기는 대전된, 2염기성 산이다. 이러한 올리고머의 예는 2,3-디히드록시프로피온산, 2,3-디히드록시숙신산, 2,3-디아미노숙신산, 2,4-디히드록시글루타르산 등과 같은, 디올 또는 디아미노의 조합이다. 디올 또는 디아미노 화합물은 2염기성 산에 의해 결합될 수 있는데, 2염기성 산은 상기 지적된 무기 2염기성 산은 물론이고, 옥살산, 말론산, 숙신산, 말산, 푸마르산 카르보산 등과 같은 2염기성 산을 포함한다. 에스테르를 사용하는 대신, 아미드를 사용할 수 있는데, 아미노산 또는 디아민 및 2산이 사용될 수 있다. 대안으로, 히드록실 또는 아민을 알킬렌 또는 아릴렌 기와 결합할 수 있다.
전하를 제공하거나, 또는 전하를 제공하도록 변형될 수 있는 치환기를 가진 단량체를 사용함으로써, 원하는 전하:질량 비를 갖는 이동성-변형 부분이 제공될 수 있다. 예를 들어, 세린 또는 트레오닌을 사용함으로써, 음으로 대전된 이동성-변형 부분을 제공하도록 인산을 갖는 히드록시기를 변형시킬 수 있다. 아르기닌, 리신 및 히스티딘으로는, 양으로 대전된 이동성-변형 부분이 제공된다. 올리고머화는 종래 방식으로 수행되어 적절한 크기의 이동성-변형 부분을 제공할 수 있다. 보통 1 내지 20 단량체 단위, 더 일반적으로는 약 1 내지 12를 갖는, 상이한 순서의 올리고머를 갖는 상이한 이동성-변형 부분에서, 단위는 1 내지 2의 상이한 단량체를 가질 수 있는 반복 단위를 의미한다. 대부분에 있어서, 올리고머는 핵산 표적-결합 구역 외의 것으로 사용될 수 있다. 단량체 단위의 다중작용기는 다른 부분과의 접합에서 사용될 수 있는 말단에서의 작용기를 제공하여, 상이한 작용기를 제공하는 반응에 이용가능한 기능을 사용할 수 있다. 예를 들어, 카르복실기와 아미노에틸티올기를 반응시켜, 활성화된 올레핀과의 반응을 위해 카르복실기를 티올 작용기로 교체할 수 있다.
약 1 내지 약 3 전하를 갖는 단량체를 사용함으로써, 적은 수의 단량체를 사용할 수 있고 분자량에서의 변화에 이동성 변화를 제공할 수 있다. 특히 관심있는 것은 타르타르산, 2,3-디히드록시테레프탈산, 3,4-디히드록시프탈산, Δ5-테트라히드로-3,4-디히드록시프탈산 등과 같은, 약 2 내지 4의 각 작용기를 갖는 폴리올폴리카르복시산이다. 추가의 음전하를 제공하기 위해, 이들 단량체는 인산 유도체와 같은 2염기성 산으로 올리고머화 되어 포스페이트 디에스테르를 형성할 수 있다. 대안으로, 카르복시산은 폴리아미드를 형성하기 위해 디아민으로 사용될 수 있고, 반면 히드록시기는 포스페이트 에스테르와 같은 에스테르, 또는 글리콜산의 에테르 등과 같은 에테르를 형성하는데 사용될 수 있다. 이동성을 변화시키기 위하여, 폴리메틸렌, 폴리옥시알킬렌, 폴리할로지방족 또는 방향족 기, 폴리올 (예를 들어, 당)과 같은, 상이한 분자량의 다양한 지방족 기가 사용될 수 있고, 여기에서 이동성은 적어도 약 0.01, 더 일반적으로는 적어도 약 0.02 그리고 더욱 일반적으로는 적어도 약 0.5만큼 다를 것이다.
또다른 양태에서, (M,D) 부분은 결합 라이브러리의 생성에 사용되는 화학적 스캐폴드로부터 구성된다. 예를 들어, 하기 참고문헌은 다양한 이동성 변형 부분의 생성에 유용한 스캐폴드 화합물을 설명한다: 펩토이드 (PCT 출원 No WO 91/19735, Dec. 26, 1991), 암호화된 펩티드 (PCT 출원 WO 93/20242, Oct. 14 1993), 무작위적 생물-올리고머 (PCT 출원 WO 92/00091, Jan. 9,1992), 벤조디아제핀 (미국 특허 No. 5,288,514), 히단토인, 벤조디아제핀 및 디펩티드와 같은 변량체 (Hobbs DeWitt, S. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 90: 6909-6913 (1993)), 비닐성 폴리펩티드 (Hagihara et al. J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568 (1992)), 베타-D-글루코스 스캐폴딩을 갖는 비펩티드성 펩티도미메틱스 (Hirschmann, R. et al., J. Amer. Chem. Soc. 114: 9217-9218 (1992)), 소형 화합물 라이브러리의 유사 유기 합성 (Chen, C. et al. J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661 (1994)), 올리고카르바메이트 (Cho, C. Y. et al. Science 261: 1303 (1993)), 펩티딜 포스포네이트 (Campbell, D. A. et al., J. Org. Chem. 59: 658 (1994)); Cheng et al, 미국 특허 6,245,937 ; Heizmann et al, "Xanthines as a scaffold for molecular diversity", Mol. Divers. 2: 171-174 (1997); Pavia et al, Bioorg. Med. Chem., 4: 659-666 (1996); Ostresh et al, 미국 특허 5,856,107; Gordon, E. M. et al., J. Med. Chem. 37: 1385 (1994) 등. 바람직하게는, 이 양태에서, D는 스캐폴드 상의 치환기이고 M은 스캐폴드의 나머지이다.
또다른 양태에서, (M,D) 부분은 특히 합성의 전부 또는 일부에 있어서 상업적 DNA 또는 펩티드 합성기를 이용하여, 하나 이상의 동일한 또는 상이한 통상적인 또는 시중 구입가능한 결합, 교차-결합, 및 표지 시약으로부터 구성되는데, 이 시약은 손쉬운 집합을 허용한다. 이 양태에서, (M,D) 부분은 보통 포스포디에스테르및 아미드 결합에 의해 결합된 서브유닛으로 제조된다. 예가 되는 전구체는 디메톡시트리틸 (DMT)-보호된 헥사에틸렌 글리콜 포스포르아미디트, 6-(4-모노메톡시트리틸아미노)헥실-(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)-포스포르아미디트, 12-(4- 모노메톡시트리틸아미노)도데실-(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)-포스포르아미디트, 2-[2-(4-모노메톡시트리틸)아미노에톡시]에틸-(2-시아노에틸), N,N-디이소프로필)-포스포르아미디트, (S-트리틸-6-머캅토헥실)-(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)-포스포르아미디트, 5'-플루오레세인 포스포르아미디트, 5'-헥사클로로-플루오레세인 포스포르아미디트, 5'-테트라클로로-플루오레세인 포스포르아미디트, 9-O-디메톡시트리틸-트리에틸렌 글리콜, 1-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미디트, 3(4,4'디메톡시트리틸옥시)프로필-l-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]포스포르아미디트, 5'-O-디메톡시트리틸-1',2'-디데옥시리보오스-3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미디트, 18-O 디메톡시트리틸헥사에틸렌글리콜, 1-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미디트, 12-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)도데실-1-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미디트, 1,3-비스-[5-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)펜틸아미노]프로필-2-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미디트, 1-[5-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)펜틸아미노]-3- [5-플루오레노메톡시카르보닐옥시펜틸아미노]-프로필-2-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미디트, 트리스-2,2,2-[3-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)프로필옥시메틸]에틸-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미디트, 숙신이미딜 트랜스-4-(말레이미딜메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 숙신이미딜 3 (2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜 아세틸티오아세테이트, Texas Red-X-숙신이미딜에스테르, 5- 및 6-카르복시테트라메틸로다민 숙신이미딜에스테르, 비스-(4-카르복시피페리디닐)설폰로다민 디(숙신이미딜에스테르), 5- 및 6-( (N-(5-아미노펜틸)아미노카르보닐)테트라메틸로다민, 숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트 (SMPB); N-γ-말레이미도부티릴-옥시숙신이미드 에스테르 (GMBS) ; p-니트로페닐 요오드아세테이트 (NPIA) ; 4-(4-N-말레이미도페닐) 부티르산 히드라지드 (MPBH); 등의 시약을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 시약은 예를 들어 Glen Research (Sterling, VA), Molecular Probes (Eugene, OR), Pierce Chemical 등의 시약 제조사로부터 구입가능하다. 종래 합성 계획에 상기 시약의 사용은 예를 들어 Hermanson, Bioconjugate Techniques (Academic Press, New York, 1996)에서와 같이 업계에 주지된다. 특히, M은 하기 시약으로부터 구성될 수 있다: 디메톡시트리틸 (DMT)-보호된 헥사에틸렌 글리콜 포스포르아미디트, 6 (4-모노메톡시트리틸아미노)헥실-(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)-포스포르아미디트, 12-(4-모노메톡시트리틸아미노)도데실-(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)-포스포르아미디트, 2-[2-(4-모노메톡시트리틸)아미노에톡시]에틸-(2-시아노에틸), N,N-디이소프로필)-포스포르아미디트, (S-트리틸-6-머캅토헥실)-(2-시아노에틸)-(N ,N-디이소프로필)-포스포르아미디트, 9-O-디메톡시트리틸-트리에틸렌 글리콜, l-[( 2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미디트, 3-(4,4'디메톡시트리틸옥시 )프로필-1-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미디트, 5'-O-디메톡시트리틸-1',2'-디데옥시리보오스-3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미디트, 18-O 디메톡시트리틸헥사에틸렌글리콜, 1-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미디트, 12-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)도데실-1-[(2-시아노에틸)-(N, N-디이소프로필)]-포스포르아미디트, 1,3-비스-[5-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)펜틸아미노]프로필-2-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]포스포르아미디트, 1-[5-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)펜틸아미노]-3-[5-플루오레노메톡시카르보닐옥시펜틸아미노]-프로필-2-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미디트, 트리스-2,2,2-[3-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)프로필옥시메틸]에틸-[(2-시아노에틸)-(N,N -디이소프로필)]-포스포르아미디트, 숙신이미딜 trans-4-(말레이미딜메틸)시클로헥산-l-카르복실레이트(SMCC), 숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜아세틸티오아세테이트, 숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐) 부티레이트 (SMPB); N-γ-말레이미도부티릴-옥시숙신이미드 에스테르 (GMBS); p-니트로페닐 요오드아세테이트 (NPIA); 및 4-(4-N-말레이미도페닐) 부티르산 히드라지드 (MPBH)를 포함한다.
M은 또한 공지된 중합체 서브유닛 합성 방법에 의해 제조된 중합체 사슬을 포함한다. 선택된-길이의 폴리에틸렌 산화물-함유 사슬은 주지된다 (예를 들어, Grossman et al, 미국 특허 5,777,096). 정의된 크기의, 다중-서브유닛 중합체 단위를 직접 또는 결합기를 통해 서로 커플링하는 단계를 포함하는 이들 방법은, 폴리에테르 (예를 들어, 폴리에틸렌 산화물 및 폴리프로필렌 산화물), 폴리에스테르 (예를 들어, 폴리글리콜산, 폴리락트산), 폴리펩티드, 올리고당, 폴리우레탄, 폴리아미드, 폴리설폰아미드, 폴리설폭시드, 폴리포스포네이트, 및 대전되거나 또는 대전되지 않은 결합기에 의해 결합된 다수의 서브유닛의 단위로 구성된 중합체를 포함하는, 그것의 블록 공중합체와 같은, 다양한 중합체에 적용될 수 있다는 것이 인정될 수 있다. 호모중합체 외에, 본 발명에 사용되는 중합체 사슬은 예를 들어, 폴리프로필렌 단위로 변경된 폴리에틸렌 산화물 단위의 공중합체와 같은, 선택된 길이의 공중합체를 포함한다. 또다른 예로서는, 호모중합체 또는 혼합 중합체로서의, 선택된 길이의 폴리펩티드 및 아미노산 조성물 (즉, 천연 발생 또는 인공의 아미노산 잔기 함유)이다.
또다른 양태에서, (M,D)의 검출 부분은 에너지 운반 기작에 의한 형광 신호를 생성한다. 바람직하게는, 이 양태에서, D는 "D1-g-D2"의 형태를 갖는데, 여기에서 D1및 D2는 분자의 수용체-공여체 쌍이고 (예를 들어 Wu et al, Anal. Biochem., 218: 1-13 (1994)), g는 실질적으로 불변인 거리에서 Dl및 D2를 유지하는 고정된 링커이다. 고정된 링커인 g를 선택하는 지침은 We et al (상기 인용) 및 미국 특허 5,863,727; 5,800,996; 5,945,526; 및 6,008,379에 나타난다. D1 또는 D2 중 하나가 수용체이고 다른 것은 쌍에서 공여체 분자이다. 본 발명에서의 사용을 위한, 예가 되는 에너지 운반 검출 부분은 Lee et al, 미국 특허 5,945,526; Lee et al, Nucleic Acids Research, 25: 2816-2822 (1997); Taing et al, 국제 특허 출원 WO 02/30944; 등의 참고문헌에서 개시된다. 바람직하게, 고정된 링커 g는 Dl및 D2사이의 거리가 10-100 옹스트롬의 범위 내에 있는 실질적으로 불변인 거리에서 유지되도록 선택된다. 다양한 결합기가 사용될 수 있지만, 단 결합은 단일항 산소의존재에 대하여 안정해야 한다. 바람직하게, Dl및 D2는 플루오레세인, 로다민, 로다민 6G, 로다민 110, 로다민 X, 테트라메틸로다민, 및 그것의 할로겐화 유도체의 세트로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, Dl및 D2는 둘 모두 플루오레세인 염료이다.
한 양태에서, g는 Rl-R2-Rl및 Rl-R2-C(=O)-Xl-R3중 어떤 것으로부터도 선택될 수 있는데, 후자는 Dl및 D2에 관하여 어느 한쪽 방향으로 존재하는데; 여기에서 X1은 O, S, 또는 NH이고; Rl은 (Cl-C5알킬디일, X1, C(=O))인데 여기에서 괄호 안의 것들은 어떤 직선 순서로 배열되고; R2는 시클로펜텐, 시클로헥센, 시클로펜타디엔, 시클로헥사디엔, 푸란, 피롤, 이소피롤, 이소아졸, 피라졸, 이소이미다졸, 피란, 피론, 벤젠, 피리딘, 피리다진, 피리미딘, 피라진, 옥사진, 인덴, 벤조푸란, 티오나프텐, 인돌 및 나프탈렌으로 구성된 군으로부터 선택되는 5 내지 6 원 고리이고; R3은 Cl-C5알키디일이다.
바람직한 양태에서, 방출 후, 전기영동 태그 E는 하기식,
A-M-D
에 의해 정의되는데, 상기 식에서:
A는 -C(=O)R이고, 여기에서 R은 1 내지 8 탄소 원자, 및 O, S, 및 N; -CH2-C(=O)-NH-CHO; -SO2H ;-CH2-C(=O)O-CHO; -C(=O)NH-(CH2)n-NH-C(=O)C(=O)-(C6H5)로 구성된 군으로부터 선택되는, 0 내지 4 헤테로원자를 갖는 지방족, 방향족, 지방족고리 또는 헤테로고리이고, 여기에서 n은 2 내지 12의 범위이고;
D는 형광 염료이고; 그리고
M은 상기 설명된 것과 같지만, 단 A-M-D의 전체 분자량은 약 150 내지 약 5000 달톤의 범위 내에 존재한다.
바람직한 양태에서, D는 예를 드어, 상기 설명되고 도 6A 및 6B에 나타난 것과 같이 플루오레세인이고, A-M-D의 전체 분자량은 약 150 내지 약 2500 달톤의 범위이다.
또다른 바람직한 양태에서, D는 상기 설명된 것과 같이 "D1-g-D2" 형태이다.
몇몇 구체예에서 e-태그 부분은 다르게 대전될 필요는 없지만 질량에서는 상이하다. 따라서, 카르복시산의 에스테르 및 아미드와 같은, 작용기가 중성이거나 또는 중성으로 만들어진, 동일한 또는 유사한 단량체를 사용할 수 있다. 또한,2H,180,14C, 등과 같은 동위원소 치환에 의해 e-태그 부분을 변화시킬 수 있다.
다수의 전기영동 태그는 전하를 제공하기 위한 올리고펩티드, 특히 2-6, 보통은 2-4 단량체의 올리고펩티드를 포함할 수 있고, 아르기닌 및 히스티딘으로부터 양전하가 발생하거나 또는 아스파르트산 및 글루탐산으로부터 음전하가 발생한다. 천연 아미노산은 물론이고, 타우린, 포스페이트 치환된 세린 또는 트레오닌, S-α-숙시닐시스테인, 디아민 및 아미노산의 공올리고머 등과 같은 비천연 또는 합성 아미노산을 사용할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 전하-부여 부분은 1차적으로 아미노산으로 구성되지만 티오산 및 1 내지 5 탄소 원자를 갖는 다른 카르복시산 또한 포함할 수 있다. 전하 부여 부분은 부분 당 약 1 내지 약 30, 바람직하게는 약 1 내지 약 20, 더 바람직하게는 약 1 내지 약 10 아미노산을 가질 수 있고 또한 약 1 내지 약 3의 티오산 또는 다른 카르복시산을 포함할 수도 있다. 그러나, 대전되지 않은 하위-구역으로 사용될 때, 대전된 하위-구역은 일반적으로 약 1 내지 약 4, 종종 약 1 내지 약 3 아미노산을 가질 것이다. 상기 언급된 것과 같이, 모든 아미노산은 천연인 것과 합성인 것 모두가 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, T-L-M-D는 하기 식,
T-L-(아미노산)n-L'-형광물질
으로 나타날 수 있는데, 상기 식에서 L'은 결합 또는 수소 외에 1 내지 20 원자의 결합기이고, n은 1 내지 20이고, L은 폴리펩티드-결합 부분에 대한 절단가능 결합이다. 이 구체예에서 T는 절단가능 결합에 의해 말단 아미노산에 결합된다. 이 구체예의 예는 형광물질이 플루오레세인이고, L'이 플루오레세인의 메타-카르복실 및 리신의 말단 아미노기를 포함하는 아미드 결합의 형태인 결합이고, 그리고 T가 폴리펩티드-결합 부분인 것이지만 이에 제한되지 않는다.
이러한 표지 접합에 기초된 전기영동 태그의 예는 하기 식,
플루오레세인-(CO)NH-(CH2)4-NH-(아미노산)n
과 같이 나타낼 수 있는데, 여기에서 특정 화합물에 있어 중성 pH인 식 및전하는 표 2에서 설명된다.
번호 (아미노산)n 전하(q) 분자량(M) q/M2/3
1 없음 -1 446 -.0178
2 리신 -1 591 -.0148
3 (리신)2 중성 737 .0128
4 알라닌 -2 534 -.0298
5 아스파르트산 -3 578 -.0423
6 (아스파르트산)2 -4 711 -.0491
7 (아스파르트산)3 -5 844 -.0877
8 (아스파르트산)4 -6 977 -.0595
9 (아스파르트산)5 -7 1110 -.0638
10 (아스파르트산)6 -8 1243 -.0675
11 (아스파르트산)7 -9 1376 -.0710
12 알라닌-리신 -2 680 -.0253
13 아스파르트산-리신 -2 724 -.0243
14 (아스파르트산)2-리신 -3 857 -.0325
15 (아스파르트산)3-리신 -4 990 -.0393
16 (아스파르트산)4-리신 -5 1123 -.0452
17 (아스파르트산)5-리신 -6 1256 -.0503
18 (아스파르트산)6-리신 -7 1389 -.0549
19 (아스파르트산)7-리신 -8 1522 -.0590
20 (아스파르트산)8-리신 -9 1655 -.0627
21 (리신)4 +2 1029 .0192
22 (리신)5 +2 1170 .0264
여기에서 q는 전하량, M은 질량이고 이동성은 q/M2/3에 비례한다.
또다른 구체예에서, 이동성-변형 부분 M은, (약 1 내지 약 2 지방족 구역 및 약 1 내지 약 2 방향족, 일반적으로는 벤젠 구역을 포함하는) 알킬렌 또는 아랄킬렌의 사용에 의존하는데, 여기에서 기는 약 2 내지 약 16, 더 일반적으로는 약 2 내지 약 12 탄소원자로 치환되거나 또는 치환되지 않지만, 일반적으로는 치환되지 않고, 여기에서 이동성-변형 부분은 예를 들어, 뉴클레오티드와 같은 단량체 단위에 동일하거나 상이한 형광물질을 결합시킬 수 있다. 이동성-변형 부분은 카르복시, 히드록시 또는 아미노기로 종결되며, 에스테르 또는 아미드로서 존재한다. 형광단에 있는 치환기를 변화시킴으로써, 적어도 5 이상, 보통은 적어도 약 9의 단위에서 질량을 변화시킬 수 있고, 모세관 전기영동에서의 만족스러운 분리를 얻을 수 있다. 더 나아간 변화를 제공하기 위하여, 질소 및 황의 위치에 알킬렌 또는 아랄킬렌기가 결합되도록 티오숙신이미드기를 사용할 수 있으며, 그럼으로써 탄소 원자의 총 수는 약 2 내지 약 30, 더 일반적으로는 약 2 내지 약 20의 범위일 수 있다. 상기 기 및 친수성의 첨가 대신에 또는 이와 조합으로, 알킬렌옥시 기를 사용할 수 있다.
이동성-변형 부분의 성질 외에, 이미 지적된 것과 같이, 다양성은 표지의 화학적 및 광학적 특성, 에너지 운반 복합체의 사용, 폴딩과 같이 이동성에 영향을 미치는 이동성-변형 부분의 화학적 성질에서의 변화, 용매 중 용매 및 이온과의 상호작용 등에 의해 성취될 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 이동성 변형 부분은 올리고머인데, 여기에서 이동성 변형 부분은 지지체 상에서 합성되거나 적절한 숙주에서의 클로닝 또는 발현에 의해 생산될 수 있다. 전통적으로, 폴리펩티드는 하나의 시스테인 또는 세린/트레오닌/티로신, 아스파르트산/글루탐산, 또는 리신/아르기닌/히스티딘이 말단기 이외에 존재하여, 상이하게 기능화될 수 있는 유일한 작용기일 때 생산될 수 있다. 보호기를 사용함으로써, 하나의 측쇄 작용기와 말단 아미노산 작용기를 구별할 수 있다. 또한, 적절하게 디자인함으로써, 이동성 변형 부분 상의 상이한 부위에 존재하는 동일한 작용기 간의 우선적 반응을 제공할 수 있다. 올리고펩티드의 제조에 합성을 이용하는가 아니면 클로닝을 이용하는가는이동성 변형 부분의 길이에 의존하는 실질적인 정도이다.
치환된 아릴기는 질량- 및 전하-변형 구역 모두로서 작용할 수 있다. 다양한 작용기는 페닐과 같은 방향족 기에서 치환되어 e-태그 리포터에게 질량은 물론이고 전하량을 제공할 수 있다. 아릴기는 말단기가 될 수 있는데, 여기에서 오직 하나의 결합 작용기가 필요하기 때문에, 유리 히드록실 기는 아실화될 수 있고, e-태그 리포터 사슬에 존재하는 히드록실에 측쇄로서 부착될 수도 있고, 또는 두 작용기를 가질 수도 있으며, 예를 들어, 페놀 히드록실은 포스피트 에스테르 형성, 및 할로, 할로알킬, 니트로, 시아노, 알콕시카르보닐, 알킬티오 등과 같은 다른 치환기로 제공될 수 있고 여기에서 기는 대전되거나 또는 대전되지 않을 수 있다.
표지 접합체는 업계에 주지된 접합 기술을 이용하여 제조될 수 있다. M은 서로에게 분자의 결합을 제공하는 작용기를 갖는 더 작은 분자로부터 합성될 수 있고, 일반적으로는 직쇄이다. 이러한 작용기는 카르복시산, 아민 및 히드록시- 또는 티올기를 포함한다. 본 발명에 있어서 전하-부여 부분은 중심 사슬에 매달린 하나 이상의 측기를 가질 수 있다. 측기는 표지 또는 전하-부여 부분의 또다른 분자에 결합을 제공하는 작용기를 갖는다. 사용된 작용기의 반응으로부터 귀결되는 공통의 작용기는 접합되는 분자들 간의 공유 결합을 형성함으로써 예증된다. 이러한 작용기는 디설피드, 아미드, 티오아미드, 디티올, 에테르, 유레아, 티오유레아, 구아니딘, 아조, 티오에테르, 카르복실레이트, 및 설포네이트, 포스페이트 에스테르, 설폰아미드, 티오에스테르 등과 같은 황 및 인을 함유한 에스테르 및 아미드 등이다.
e-태그 부분 구성 성분의 결합은 상기 고찰된다. 검출가능 부분과 이동성 변형 부분 간의 결합은 일반적으로 절단유발 부분의 작용에 대해 안정하여, 이동성 변형 부분 및 검출가능 부분은 e-태그 프로브 유래의 e-태그 리포터 절단 도중, e-태그 프로브로부터 고유의 단위로서 방출될 수 있다.
대부분, 이동성 변형 부분은 결합일 수 있는데, 여기에서 검출가능 부분 또는 표지는 표적-결합 부분에, 또는 사슬에서 약 1 내지 약 500 이상, 보통은 약 1 내지 약 300 원자, 더 일반적으로는 약 2 내지 약 100 원자의 결합에 결합된다. 이 구체예에서, 사슬에 있는 원자의 총 수는 측정되는 모든 표적을 인식하는데 필요한 다양성 상의 실질적인 정도에 의존할 것이다. 대부분의 이동성 변형 부분 사슬은 탄소, 질소, 산소, 인, 붕소 및 황으로 구성된다. 다양한 치환기가 이동성 변형 부분에 존재할 수 있는데, 이것은 천연 단량체의 일부로서 자연적으로 존재하거나 합성에 의해 도입될 수 있다. 사슬에 존재하는 작용기는 아미드, 포스페이트 에스테르, 에테르, 에스테르, 티오에테르, 디설피드, 보레이트 에스테르, 설페이트 에스테르 등을 포함한다. 측쇄는 아민, 암모늄 염, 페놀기를 포함하는 히드록실기, 카르복실기, 에스테르, 아미드, 포스페이트, 헤테로고리, 특히 뉴클레오시드 염기와 같은 질소 헤테로고리, 및 이미다졸 및 퀴논과 같은 아미노산 사슬, 티오에테르, 티올, 또는 전기영동 태그의 이동성을 변화시키는 다른 기를 포함한다.
이동성 변형 부분은 호모올리고머 또는 헤테로올리고머일 수 있고, 예를 들어 뉴클레오티드 및 아미노산과 같이 동일하거나 상이한 화학적 특성의 상이한 단량체를 가진다. 한 구체예에서, e-태그 부분은 링커를 가질 것이고, 이것은 이동성 변형 부분 및 검출가능 표지 분자, 일반적으로는 형광물질 간의, 또는 검출가능 표지 분자로의 결합에 사용될 수 있는 작용기 간의 결합을 제공한다. 검출가능 표지 분자에 개별적으로 결합되는 상이한 작용기를 가짐으로써, 전기영동 태그의 다양성을 위한 기회를 향상시킬 수 있다. 상이한 작용기와의 결합에 상이한 형광물질을 사용하면, 상이한 형광물질은 전기영동 태그에 대한 발광 및 전하:질량 비에서의 차이를 제공할 수 있다.
결합 부분에 다수의 전기영동 태그의 부착
폴리펩티드를 포함하는 검정에서, 개개의 표적 분자를 포함하는 결합 사건을 위해 다수의 e-태그 리포터의 방출을 갖는 것이 유리하다. 어떤 면에서, 이것은 신호의 증폭을 일으킨다. 바람직하게, 이러한 각각의 결합 사건을 위해 방출되는 e-태그 리포터의 수는 약 6 x 103내지 약 6 x 1010이고,바람직하게는, 약 6 x 104내지 약 6 x 108이다. 폴리펩티드-결합 부분이 예를 들어 항체와 같은, 다수의 부착 부위를 가지면, e-태그 부분의 부착을 위한 항체 상에 다수의 결합 부위가 존재한다. e-태그 프로브의 폴리펩트디-결합 부분이 폴리펩티드에 결합하고 제 1 결합제의 제 1 결합 부분이 폴리펩티드 상의 유도된 결합 부위에 결합하여 절단유발 부분을 절단가능 결합에 근접하도록 하면, 다수의 e-태그 리포터는 단일 폴리펩티드를 포함하는 결합 사건을 위해 방출된다. 예를 들어, e-태그 부분의, 항체로의 부착은 항체 분자 당 약 2 내지 약 10 분자의 e-태그 부분을 일으킬 수 있다.
방출되는 e-태그 리포터의 수를 더욱 향상시키기 위해, e-태그 부분은 중추에 절단가능하게 부착되는데, e-태그 프로브의 폴리펩티드-결합 부분은 또한 상대적으로 영구적인 방식으로 여기 부착된다. 다수의 부착 부위를 갖는 폴리펩티드-결합 부분에 있어서, 다수의 중추는 각 중추가 방출을 위한 다수의 e-태그 부분을 갖는 폴리펩티드-결합 부분에 부착될 수 있다. 중추 핵은 그러므로, 다기능 물질이고, 보통은 중합체이고, 결합을 위한 부위로서 예를 들어, 히드록시, 아미노, 머캅토, 카르복시, 에틸렌, 알데히드 등과 같은 다수의 작용기를 갖는다. 중추 상의 작용기는 e-태그 부분 또는 부착되는 폴리펩티드-결합 부분 상의 작용기와 반응성인 것이어야 한다. 몇몇 작용기는 원하지 않는 부반응에 관여하는 것을 저항하는 그 능력으로 인해 다른 것들 보다 우선적이다. 중추 핵은 수용성이거나 비수용성일 수 있다. 중추 핵은 보통 적어도 약 35,000의 분자량을 가지며 약 1천만 이상의 분자량을 가질 수도 있지만, 보통은 약 600,000 이하, 더 일반적으로는 약 300,000 이하이다. 예시적인 중추 핵은 다당류, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 이온 교환 수지 등을 포함한다. 중추는 한 양태에서 분지된 링커인데, 이것은 e-태그 부분의 부착을 위한 복수의 부위를 갖는다. 다수 부위 링커는 폴리펩티드-결합 부분의 부착을 위한 부위 및 복수의 e-태그 부분의 부착을 위한 복수의 부위를 갖는다. 물론, e-태그 부분은 본 발명에 따른 절단유발 부분에 의해 절단될 수 있는 작용기를 포함하는 연결에 의해 부착되어야 한다.
한 구체예에서, 중추 핵은 친수성 중합체이고, 일반적으로는, 복수의 부분의 부착을 허용하는 다수의 작용기를 갖는 첨가 또는 축합 중합체이다. 본 발명의 시약에 유용한 중합체의 한 부류는 다당류 중합체를 포함한다. 덱스트란, 세파로스,폴리리보오스, 폴리자일로스 등과 같은 다당류가 사용될 수 있다. 중합체의 다른 부류는 치환된 에틸렌 또는, 프로필렌과 같은 단쇄 비치환된 단량체를 포함하는 부타디엔형 단량체의 첨가 중합화로 생긴 것으로, 여기에서 단량체는 친수성 기이거나 또는 친수성 기로 유도될 수 있는 치환기를 갖는다. 에틸렌에 부착될 수 있는 적합한 친수성 기는 히드록시, 카르복시 및 그것의 에스테르 및 아미드, 아민 등을 포함한다. 아크릴산 단량체를 사용하면, 산은 중합반응에 앞서 또는 그 후 적합한 반응기로 유도될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 에틸렌 글리콜 및 아크릴산으로부터 형성된 에스테르는 e-태그 프로브의 구성 성분으로 유도되는 히드록실기를 제공한다. 다른 적합한 중합체는 폴리알릴 아민 및, 예를 들어 폴리비닐 알콜과 같은 알콜을 포함한다. 단일 단량체로부터 유래된 중합체의 사용 외에, 혼합된 중합체 또한 사용될 수 있다. 이 경우, 친수성은 폴리에틸렌 글리콜과 같은 비-반응성 구성 성분에 의해 제공될 수 있는데, 이것은 그 다음 e-태그 프로브의 구성 성분과의 반응을 위한 적절한 작용기를 산출하는 단량체로 더욱 중합된다. 이러한 중합체 중 하나는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리비닐 알콜의 공중합체이다. 중추의 한 특정 예는 덱스트란으로 덱스트란 한 분자당 약 10 내지 약 300 분자의 e-태그 부분이 부착될 수 있다.
입자는 e-태그 프로브에 존재하는 e-태그 부분의 수를 향상시키는데 사용될 수 있다. 입자는 (예를 들어, 유기 및 무기 중합체 또는 라텍스로 구성된) 고체, 유적 (예를 들어, 탄화수소, 탄화플루오르, 실리콘액), 또는 인지질과 같은 합성 또는 세포 및 세포소기관과 같은 천연의) 비히클일 수 있다. 고체 입자는 보통 중합체로서, 첨가 또는 축합 중합체인데, 이것은 검정 매질에 손쉽게 분산될 수 있다. e-태그 부분은 본 발명과 일치하는 절단가능한 결합에 의해 결합된다. 이 방법에서 약 100 내지 약 105e-태그 부분이 단일 입자에 결합될 수 있다. 입자는 보통 여기에 부착된 적어도 하나의 폴리펩티드-결합 부분을 갖는다. 입자에 다수의 덱스트란 분자를 접합시키는 것 및 상기 고찰된 것과 같은 절단가능한 결합에 의해 다수의 e-태그 부분을 덱스트란에 결합시키는 것 또한 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명의 e-태그 프로브의 특정 구체예에서, 폴리펩티드-결합 부분은 항체이다. 다수의 상이한 반응은 항체에 화합물을 공유적으로 부착시키는데 사용될 수 있다. 이것은 리신의 아민기, 글루탐산 및 아스파르트산의 유리 카르복시산 기, 시스테인의 설피드릴기 및 방향족 아미노산의 다양한 부분을 포함하는, 항체 분자의 아미노산 잔기의 반응에 의해 성취되었다. 항체로의 접합은 무작위적이거나 부위-특이적이다. 부위-특이적 접합에 있어서, 링커 또는 이동성 변형 부분은 어떤 전통적인 방식으로 항체의 Fc 부분 또는 경첩 구역에 있는 디설피드와 같은 표적-결합 부분의 단위에 결합될 수 있다. 무작위 접합에 있어서 항체의 아민기 (예를 들어, N-말단 또는 리신)가 사용될 수 있다. 대안으로, 카르복실레이트 기 (예를 들어, C-말단, 아스파르트산, 글루탐산)가 사용될 수 있다. 다른 예는 티올기를 포함한다. 항체와의 결합에서 1차적인 고려사항은 항체 인식 성질 또는 특이성의 보유 또는 활성이다.
항체로의 부착에 대한 특정 접근법이 공지된다. 이러한 접근법 중 하나는항체의 아미노 (또는 카르복시)기에 화합물의 카르복시 (또는 아미노)기를 결합시키는 카르보디이미드 반응이다. 대안으로, 디알데히드 또는 이미도에스테르와 같은 2기능성 작용인자가 항체 분자의 아미노기에 화합물의 아미노기를 결합시키는데 사용되었다. 또다른 접근법에서 항체 분자에 화합물을 결합시키기 위해 Schiff 염기 반응이 사용된다. 이 방법은 글리콜 또는 히드록시기를 함유한, 결합되는 화합물의 과요오드산염 산화를 포함하여, 알데히드를 형성한 다음 항체 분자와 반응한다. 부착은 항체 분자의 아미노기를 갖는 Schiff 염기의 형성을 통해 일어난다. 더욱이, 이소시아네이트는 항체에 화합물을 공유적으로 부착시키기 위한 커플링 작용제로서 사용되었다. 산화된 항체 또는 산화된 항체 단편과의 반응에 적합한 링커는 1차 아민, 2차 아민, 히드라진, 히드라지드, 히드록실아민, 페닐히드라진, 세미카르바지드 및 티오카르바지드기로 구성된 군으로부터 선택되는 아민을 함유한 것들을 포함한다. 이러한 반응성 작용기는 링커의 구조 중 일부로서 존재할 수도 있고, 또는 이러한 기를 함유하지 않은 링커의 적합한 화학적 변형에 의해 도입될 수도 있다.
특정 접근법에서 다당류 사슬을 함유한 항체는 산화되어 반응성 알데히드기를 생산한다. 이러한 산화는 예를 들어, 업계에 공지된 과요오드산염에 의해 성취될 수 있다. 예를 들어, 아미노-덱스트란 분자와 같은, 절단가능한 결합에 의해 부착된 e-태그 부분을 갖는 중추 분자는 2차아민 결합을 형성하는 환원성 아민화에 의해 항체 상의 알데히드기에 부착된다.
따라서, 본 발명에서 하나 이상의 중추 분자는 전술된 접근법 중 하나에 의해 항체에 부착되어 본 발명에서 본 방법에 사용되는 조건 하에서 상대적으로 영구적인 결합을 성취할 수 있다. 물론, 본 발명과 일치되게 e-태그 부분은, 절단가능한 결합에 의해 중추에 부착되거나 또는 이러한 절단가능한 결합에 의해 직접 항체에 부착된다. e-태그 프로브를 절단유발 시약에 근접하게 하는, 제 1 결합제에 의한 그리고 항체를 포함하는 e-태그 프로브에 의한 결합 후, 다수의 e-태그 리포터는 이후의 검출을 위해 그리고 폴리펩티드의 존재 및/또는 양에 관련하여 방출된다.
여기에서 사용될 때, 용어 "포획 리간드"는 e-태그 프로브의 표적-결합 부분 내에 전형적으로 포함되고 "포획 작용인자" 또는 리포터에 특이적으로 결합할 수 있는 기를 지칭한다. 이러한 포획 리간드와 상응하는 포획 작용인자 간의 상호작용은 방출된 e-태그 리포터로부터 절단되지 않은 e-태그 프로브를 분리하는데 사용될 수 있다. 원한다면, 리포터는 리간드를 보유한 폴리펩티드-결합 구역 또는 변형된 폴리펩티드-결합 구역을 함유한 고유의 e-태그 프로브를 완전히 제거하여, 그것에 결합하는 분자를 물리적으로 격리하는데 사용될 수 있다. 이러한 변형된 폴리펩티드-결합 구역은 시작 물질의 분해, 제조 도중의 오염, 탈선적인 절단 등의 결과일 수도 있고, 또는 폴리펩티드-결합 부분의 다른 비특이적 분해 생산물일 수도 있다. 상기와 같이, 바이오틴으로 예시되는 리간드는 폴리펩티드-결합 구역에 부착되어 절단 후 e-태그 리포터로부터 분리된다.
리간드용 수용체가 사용될 수 있다. 이러한 수용체는 면역글로불린, 렉틴, 효소, 아비딘과 같은, 천연 또는 합성 수용체를 포함한다. 바람직하게, 수용체는양전하로 대전되는데, 아비딘의 경우에서는 자연적이거나, 또는 암모늄기, 염기성 아미노산 등과 같은 양전하로 대전된 부분 또는 부분군의 첨가에 의해 이렇게 제조된다. 아비딘은 검출 프로브 및 그것의 분해 생성물에 부착된 바이오틴에 결합한다. 아비딘은 양전하로 대전되고, 반면 절단된 전기영동 태그는 음전하로 대전된다. 따라서, 절단되지 않은 프로브로부터 뿐만 아니라 그것의 분해 생성물로부터의, 절단된 전기영동 태그의 분리는 기존의 분리 방법에 의해 손쉽게 성취된다. 대안으로, 리포터는 고체 지지체 또는, 혈관벽과 같은 고분자량 거대분자, 예를 들어, 자기 입자, 셀룰로스, 아가로스 등과 같은 입자에 결합될 수 있고, 물리적인 분리 또는 원심분리, 투석 등에 의해 분리될 수 있다. 이 방법은 검정의 특이성을 더욱 향상시키고 더 높은 정도의 복합화를 허용한다.
일반적인 물질로서, 폴리펩티드-결합 부분의 성질이 허용한다면, 두 개의 리간드를 가질 수 있다. 상기 설명된 것과 같이, 하나의 리간드는 폴리펩티드-결합 구역에 결합된 e-태그 부분을 격리하는데 사용될 수 있고, 이것은 제 1 리간드가 없는 생성물로부터 제 1 리간드를 유지한다. 제 1 리간드가 없는 변형된 폴리펩티드-결합 구역에 결합된 e-태그 부분의 분리 및 농축은 그 다음에 수행된다. 두 개의 리간드를 사용함에 있어서, 우선 제 1 리간드를 보유한 폴리펩티드-결합 구역을 제거하기 위해 제 1 리간드를 위한 제 1 수용체를 갖는 반응 혼합물을 조합할 수 있다. 조성물로부터 제 1 수용체를 분리하거나 또는 상기 설명된 것과 같이, 제 1 수용체가 조성물에 유지될 수 있다. 이 후 결과 조성물이 조합되는데, 여기에서 제 1 리간드를 함유한 폴리펩티드-결합 구역은, 제 1 리간드는 부족하지만 제 2 리간드는 보유하고 있는 변형된 폴리펩티드-결합 구역을 분리하거나 부유하게 할 수 있는 제 2 수용체와 함께 제 1 수용체에 결합된다. 제 2 리간드는 검출가능한 표지일 수 있는데; 예를 들어 헵텐과 같은, 수용체가 이용가능한 작은 분자 또는 e-태그 프로브의 한 부분은 제 2 리간드로서 작용할 수 있다. 생성물이 분리되거나 부유하게 된 후, e-태그 리포터는 리포터의 변성, 생성물의 교체, 높은 염 농도 및/또는 유기 용매 등에 의해 방출될 수 있다.
상기 고찰된 것과 같이 e-태그 부분이 부착되는 시약에 의존하여, 단일 e-태그 부분 또는 다수의 e-태그 부분이 존재할 수 있는데, 일반적으로는 약 1 내지 약 105, 더 일반적으로는 약 1 내지 300, 더 자세히는 약 1 내지 약 20으로서 중추 또는 입자가 사용되었는가에 의존한다. 단일 표적-결합 구역에 결합된 e-태그 부분의 수는 필요한 민감성, e-태그 부분의 용해도, 복수의 e-태그 부분의 검정 효과 등에 의존한다.
e-태그 프로브의 합성
펩티드 사슬로서 전하-분배 부분 또는 이동성 변형제를 형성하기 위한 타입의 합성을 수행하기 위한 화학은 당업계에 잘 공지된다. 예를 들어, Marglin, et al., Ann. Rev. Biochem. (1970) 39: 841-866을 참조하라. 일반적으로, 그러한 합성은 적절한 보호기와 함께, 차단을 수반하고, 그들 작용기는 반응에 수반되지 않는다. 유리 작용기는 그후 반응하여 원하는 결합을 형성한다. 펩티드는 Merrifield 합성에서와 같이 수지 위에서 제조될 수 있다(Merrifield, J. Am.Chem. Soc. (1980) 85: 2149-2154 및 Houghten et al., Int. J. Pep. Prot. Res. (1980) 16: 311-320. 그후 펩티드는 공지된 기술에 따라 수지로부터 제거된다.
펩티드 합성에 이용가능한 많은 기술의 개요는 J. M. Stewart, et al.,"고상 펩티드 합성, W. H. Freeman Co, San Francisco (1969); 및 고상 펩티드 합성을 위한, Academic Press (New York); 및 E. Schroder, et al.,"펩티드", 용액 합성을 위한 vol. 1, Academic Press (New York), 1965. 에서 찾아볼 수 있다.
일반적으로, 이들 방법은 성장 펩티드 사슬에, 하나 이상의 아미노산 또는 적절하게 보호된 아미노산의 순차적인 첨가를 포함한다. 정상적으로, 적절한 보호기는 제 1 아미노산의 아미노 또는 카르복실기 둘중 한가지를 보호한다. 보호된 또는 유도된 아미노산은 그후 불활성 고체 지지체에 부착되거나 또는 아미노 연결을 형성하기에 적합한 조건하에서, 적절하게 보호된 상보성(아미노 또는 카르복실) 기를 갖는 서열에서 다음의 아미노산을 첨가함으로써 용액에서 이용될 수 있다. 그후 보호기는 이러한 새롭게 첨가되는 아미노 산 잔기로부터 제거되고 그후 (적절히 보호된) 아미노산이 첨가되는 등 한다. 원하는 모든 아미노산이 적절한 순서로 연결된 후에, 어떠한 남아있는 보호기(및 어떠한 고체 지지체)는 순차적으로 또는 동시발생적으로 제거되어 최종 펩티드를 얻는다. 보호 기는 원할때, 이용되는 특정 보호 기에 의존하는 공지의 방법에 따라서 제거된다. 예를 들어, 보호 기는 수소 및 목탄상 팔라듐, 액체 암모니아 중 나트륨 등으로 환원함으로써; 트리플루오로아세트산, 히드로플루오르산 등으로 가수분해함으로써 제거될 수 있다.
포스포라미다이트, 또는 관련된 화학을 채택하는 e-태그 프로브의 합성을 위해, 다음 문헌에서 많은 가이드를 이용할 수 있다: Handbook of Molecular Probes and Research Products, 제 8 판 (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, 2002); Beaucage and Iyer, Tetrahedron, 48: 22232311 (1992); Molko et al, 미국 특허 출원 4,980,460; Koster et al, 미국 특허 출원 4,725,677; Caruthers et al, 미국 특허 출원 4,415,732; 4,458,066; 및 4,973,679; 등. 이들 여러 화학은 전기영동 프로브의 성분들이 자동 DNA 합성기 예를 들어, Applied Biosystems, Inc. (Foster City, California) 모델 392 또는 394 DNA/RNA Synthesizer 등에서 편리하게 합성되도록 한다.
이동성-변형 부분의 일부로서 뉴클레오티드를 포함하는 e-태그 시약의 합성은 표준 포스포라미다이트 화학을 사용하여 고체상 지지체에서 집합을 통해 쉽고 효율적으로 달성될 수 있다. 결과로 생기는 이동성 변형 부분은 상기에 논의된 바와 같이, 표지 및/또는 폴리펩티드-결합 부분에 연결될 수 있다.
다른 전기영동 이동성을 갖는, 앞서 언급된 표지 접합체는 유도된 결합 부위를 갖는 다중 폴리펩티드의 다중복합 검출을 허용한다. 그것은 물론, 다중복합 결정을 수행하기 위한 어떠한 수의 표지 접합체를 제조하는 본 발명의 범위내에 있다.
전기영동 태그를 위한 전형적인 합성 접근
한가지 전형적인 합성 접근이 도 1에 개략적으로 나와있다. 시중에서 입수가능한 6-카르복시 플루오레신을 가지고 시작하여, 페놀 히드록실 기는 안히드리드를 사용하여 보호된다. 피리딘 중의 이소부티르 안히드리드가 채택되지만 다른 변이체들도 똑같이 적합하다. 보호기로서 에스테르 작용기를 선택하는 중요성을 유념하는 것이 중요하다. 이러한 종들은 올리고뉴클레오티드를 구성하는 동안에는 물론이고 포스포라미다이트 모노머 합성 전체에 걸쳐 손상되지 않고 남아있다. 이들 기들은 합성된 올리고가 암모니아를 사용하여 탈호보될 때까지 제거되지 않는다. 보호 후에 미정재 재료는 그후 커플링제로서 DCC를 사용하여 N-히드록시숙신이미드 에스테르(NHS-에스테르)의 형성을 통해 제자리 활성화된다. 부산물 DCU는 여과되어 버리고 아미노 알콜이 첨가된다. 많은 아미노 알콜은 시중에서 입수가능하며 그들중 일부는 아미노산의 환원으로부터 유도된다. 아미노 알콜이 "H2N-(CH2)n-OH"의 형태일때, n은 2 내지 12의 범위이고, 보다 바람직하게는 2 내지 6의 범위이다. 오직 아민만이 N-히드록시숙신이미드를 대체하기에 충분한 반응성이다. 표준 추출 작업에서, 생성물의 95% 수율이 얻어진다. 이러한 물질은 포스피틸화되어 포스포라미다이트 모노머를 생성한다. 추가적인 e-태그 부분의 합성을 위해, 아미노 알콜로서 대칭 비스-아미노 알콜 링커가 사용된다(도 2). 그러한 것으로서, 제 2 아민은 그후 포스피틸화 반응에 앞서 다수의 카르복실산 유도체(도 3에 나타낸 몇가지 가능한 벤조산 유도체에 의해 예증됨)로 커플링된다. 이러한 방법론을 사용하여, 수백, 심지어 수천개의 e-태그 부분이 표준 화학을 사용하여 DNA 합성기에서 프로브 합성동안에 쉽게 집합될 수 있다.
대안으로서, e-태그 부분은 출발 물질로서 5-아미노플루오레신을 사용하는 대안적인 전략을 통해 접근된다(도 4). 5-아미노플루오레신을 다량의 용매중에 과다량의 이산 이염화물에 첨가하는 것은 다이머 형성보다 모노아실화 생성물의 지배적인 형성을 허용한다. 페놀 기는 이러한 조건하에서 반응성이 아니다. 수성 마무리작업은 말단 산 염화물을 카르복실산으로 변환시킨다. 이러한 생성물은 6-카르복시플루오레신과 유사하고, 동일한 일련의 단계를 사용하여 그것의 보호된 포스포라미다이트 모노머로 변환된다. 시중에서 입수가능한 많은 이산 이염화물 및 SOCl2또는 염화아세틸을 사용하여 이산 이염화물로 변환될 수 있는 이산이 있다. 이러한 방법론은 제 2 이동성 변형제가 사용된다는 점에서 매우 매력적이다. 그러한 것으로서, 만일 하나가 10 시중의 변경된 포스포라미다이트 및 10 이산 이염화물 및 10 아미노 알콜에 접근을 갖는다면, 1000 다른 e-태그 부분에 대한 전위가 있다. 많은 시중 이산 이염화물 및 아미노 알콜이 있다(도 5). 이들 합성 접근은 이론적으로 결합 화학에 적합하다.
도 1, 2 및 4의 계획으로 구성된 전기영동 태그는 예를 들어 하기한 바와 같은 화학을 사용하여 절단가능한 결합에 부착하는 포스피틸화전 또는 후에 더욱 반응된다.
e-태그 부분은 폴리펩티드 결합 부분에 연결을 위해 하나의 단부에서 적절한 작용기를 갖고 집합될 수 있다. 다양한 작용기가 채택될 수 있다. 따라서, 보통 카르복시, 아미노, 히드록시 및 티올과 같은 펩티드에 존재하는 작용기는 공유 결합을 형성하기 위한 반응성 작용기의 표적이 될 수 있다. e-태그 부분은 폴리펩티드 결합 부분에서 연결기의 화학 및 작용기의 이용가능성에 따라 연결될 것이다.예를 들어, 항체 및 폴리펩티드에 대해 특유한, Fab'단편과 같은 그들의 단편에 대해 상기 논의된 바와 같이, 티올 기는 티오에테르 형성을 위해, 활성 올레핀, 예를 들어 말레이미드를 사용하는데 이용가능할 것이다. 리신이 이용가능할 때, 우리는 니트로페닐 에스테르 또는 펜타플루오로페닐 에스테르와 같이, 물에서 반응할 수 있는 활성화 에스테르, 또는 카르보디이미드 및 반-에스테르 카본산으로 혼합된 안히드리드를 사용할 수 있다. 문헌에는 접합을 위해 충분한 화학이 있고, 따라서 각각의 특정 상황을 위해, 접합에 대한 문헌에서 충분한 전례가 있다.
예증에서 합성 디올이 채택된다. 그러한 디올의 예는 2 내지 3 탄소 원자의 알킬렌, 알킬렌 아민 또는 폴리(알킬렌 아민)디올과 함께, 알킬렌 디올, 폴리알킬렌 디올을 포함하고, 이때 알킬렌은 2 내지 3 탄소 원자이고 질소는 예를 들어 1-6 탄소 원자의 차단 기 또는 알킬 기로 치환되며, 여기서 하나의 디올은 디메틸트리틸 기와 같은 종래의 보호기로 차단된다. 이러한 기는 질량-변형 영역으로서 역할을 할 수 있고 아미노기로는 전하-변경 영역으로서 또한 작용할 수 있다. 원한다면, 질량 변경제는 포스포라미다이트 화학을 통해 결합되는 빌딩 블록을 사용함으로써 집합될 수 있다. 이러한 식으로 전하 변경제는 질량 변경제 사이에 산재될 수 있다. 예를 들어, 1,2,3, n 단위를 갖는 일련의 폴리에틸렌 산화물 분자가 제조될 수 있다. 다수의 음의 전하를 도입하기 위해서, 작은 폴리에틸렌 산화물 단위를 채택할 수 있다. 질량 및 전하-변경 영역은 포스페이트 단위에 의해 결합된 복수의 폴리에틸렌 산화물 단위를 가짐으로써 축적될 수 있다. 대안으로서는, 큰 스페이서를 채택함으로써, 더 적은 포스페이트 기가 존재할 것이고, 따라서 큰 질량 차이가 없으면, 질량-대 전하 비에서의 큰 차이가 실현될 수 있다.
채택되는 화학은 올리고뉴클레오티드 합성에 사용된 종래의 화학이며, 뉴클레오티드가 아닌 빌딩 블록이 사용되지만, 반응은 종래의 포스포라미다이트 화학이고 차단 기는 종래의 디메톡시트리틸 기이다. 물론, 자동 합성기와 호환가능한 다른 화학도 또한 사용될 수 있다. 그러나, 공정의 복잡성을 최소화하는 것이 바람직하다.
상기 언급된 바와같이, 하나의 구체예에서, 허브 핵은 친수성 폴리머이고, 일반적으로, 다중 작용기를 갖는 첨가 또는 축합 폴리머는 다중 부분의 부착을 허용한다. 본 발명의 시약에 유용한 한가지 부류의 폴리머는 덱스트란, 세파로스, 폴리리보스, 폴리실로스 등과 같은 폴리사크라이드 폴리머를 포함한다. 예를 들어, 허브는 본 발명과 일관되는 절단가능한 방식으로 다중 e-태그 리포터들이 부착될 수 있는 덱스트란이 될 수 있다. 덱스트란의 안히드리드 부분은 거의 남아있지 않고 환원성 아민화에 의해 올리고뉴클레오티드에서 덱스트란 분자를 아민 기에 부착시키는데 사용될 수 있다. 허브 핵으로서 덱스트란을 사용하는 또다른 실시예에서, 덱스트란은 숙신 안히드리드로 캐핑될 수 있고 결과의 물질은 아미드 형성에 의해 아민-함유 올리고뉴클레오티드에 연결될 수 있다.
이미 지시된 바와 같이, 링커 및 이동성-변경 부분의 성질 외에도, 다양성은 형광 물질의 화학 및 광학 특성, 에너지 이동 복합체의 사용, 링커의 화학적 성질의 변화에 의해 달성될 수 있고, 이는 폴딩, 용매와 용매중 이온과의 상호작용 등과 같은 이동성에 영향을 준다. 이미 제안된 바와 같이, 한가지 구체예에서, 링커는 올리고머이고, 여기서 링커는 지지체 위에서 합성되거나 또는 적절한 숙주에서 클로닝 또는 발현에 의해 제조될 될 수 있다. 편리하게는, 폴리펩티드가 제조될 수 있고 이때 말단 기 이외에, 오직 하나의 시스테인 또는 세린/트레오닌/티로신/아스파르트/글루탐산 또는 리신/아르기닌/히스티딘이 존재하고, 따라서 유일한 작용기가 있고, 그것은 차별적으로 작용화될 수 있다. 보호기를 사용함으로써, 우리는 말단 아미노 산 작용기로부터 측쇄 작용기를 구분할 수 있다. 또한, 적절한 설계에 의해, 연결기 상의 다른 부위에 존재하는 동일한 작용기들 사이에 선택적인 반응을 제공할 수 있다. 우리가 올리고펩티드의 제조를 위해 합성 또는 클로닝을 사용하는지 여부는 실질적인 정도로 링커의 길이에 의존할 것이다.
20 다른 e-태그 리포터에 대해서, 오직 5개의 다른 질량-변경 영역인 하나의 절단가능 링크와 4개의 다른 검출가능한 영역이 필요하다. 120 e-태그 리포터에 대해서, 하나는 오직 10개의 다른 질량-변경 영역, 3개의 다른 전하-변경 영역 및 4개의 다른 영역을 가질 필요가 있다. 500 다른 e-태그 리포터에 대해서, 하나는 오직 25개 다른 질량-변경 영역, 5개 다른 전하-변경 영역 및 4개 다른 검출가능 영역을 가질 필요가 있다.
e-태그 시약의 사용을 위한 방법
특정 검정의 방법 및 예의 하기 일반적인 논의는 예증에 의한 것이고 제한이 아니다. 당업자들은 여기서 특히 단백질 검정 및 화학 유전학의 영역의 기술자들에게 명백할 대부분의 검정 포맷으로 어떠한 분석물을 검정하는데 있어서 그 기술을 적용할 수 있을 것이다.
검정을 수행하는데 있어서, 성분들 즉, 샘플, 제 1 시약 및 전기영동 프로브는 어떠한 순서로 일반적으로는 동시에, 검정 매질에서 결합된다. 대안으로서는, 한가지 이상의 시약은 한가지 이상의 남아있는 시약과 결합되어 종속화합물을 형성할 수 있다. 종속화합물은 그후에 배양될 수 있다. 그리고 나서, 남아있는 시약 또는 그들의 하위결합물은 결합될 수 있고 혼합물은 배양된다. 시약의 양은 보통 실험적으로 결정된다. 일반적인 규칙으로서, 적어도 동일한 양의 제 1 시약과 전기영동 프로브는 가장 높은 예상 양의 관심의 폴리펩티드에 채택되고, 보통 적어도 약 1.5 배 초과, 보다 통상적으로는 적어도 약 2 배 초과량이고 약 10배 초과량 이상을 가질 수 있다. 성분들은 결합 조건하에서, 보통 수성 매질에서, 일반적으로 약 5 내지 약 10의 범위의 pH에서, 약 10 내지 약 200 mM 범위의 농도로 결합된다. 이들 조건은 전통적이며, 염, 안정화제, 유기 용매 등과 같은 다른 종래의 첨가제는 물론이고, 포스페이트, 카보네이트, HEPES, MOPS, 트리스, 보레이트 등과 같은, 종래의 완충제가 사용될 수 있다. 수성 매질은 단독으로 물이 될 수 있고 또는 0.01 내지 80 이상 부피 퍼센트의 공동-용매를 포함할 수 있다.
결합된 시약은 실질적인 수의 결합 사건이 일어나도록 하는 시간과 온도에서 배양된다. 일반적으로, 시약의 전부 또는 일부의 결합 후에 배양을 위한 시간은 혼합물을 조사(照射)하거나 남아있는 시약을 첨가하기 전에, 적어도 약 5분이고, 보다 통상적으로는 적어도 약 15분이다. 배양 온도는 통상 약 5°내지 99℃, 일반적으로는 약 15° 내지 70℃, 보다 일반적으로는 20 내지 45℃의 범위일 것이다. 측정하는 동안의 온도는 일반적으로 약 10°내지 70℃, 보다 일반적으로는 약 20내지 45℃, 더욱 통상적으로는 20 내지 25℃의 범위일 것이다.
적절한 배양 기간후에 그리고 모든 시약이 결합되어 제 1 시약 또는 분열-유도 시약, 샘플 및 전기영동 프로브 또는 e-태그 프로브를 포함하는 결합물을 형성한 후에, 혼합물을 처리하여 분열-유도 부분을 활성화하였다. 활성의 성질은 물론, 분열-유도 부분의 성질에 의존한다.
주제 발명은 다양한 시약 시스템을 채택하며, 결합 사건은 e-태그 부분의 방출을 초래한다. 분열-유도 부분의 영향은 물리적, 화학적 또는 효소적 수단에 의해 결합을 만들거나 깨는 것이다. 유도된 결합 부위를 수반하는 결합 사건의 발생을 결정하기 위해서, 폴리펩티드-결합 부위를 함유하는 다른 전기영동 프로브 또는 e-태그 프로브의 생성물의 각각은 정확하게 검출될 수 있다. 결합 사건에 이어, e-태그 프로브 또는 반응 생성물이 유도되는 프로브와 다른 이동성을 나타내는 하나 이상의 반응 생성물이 제조된다. e-태그 리포터라고 하는 e-태그의 방출 형태는 그것이 유도되는 e-태그와는 다른 이동성 및/또는 질량을 나타낸다. 본 발명은 공지된 재료 및 공지되지 않은 재료를 스크리닝하기 위한 높은 정도의 다능을 제공한다. 전기영동 장치는 e-태그 리포터의 분리 및 검출을 위해 채택될 수 있다. 전기영동 장치는 전기영동 장치를 작동시키는 것은 물론이고, 장치로부터의 데이타를 받아들이고 프로세싱하기 위해 데이타 프로세서에 연결될 수 있다.
시스템은 이동성-변경 부분이 부착되는 실재물로 전기이동에 의해 분리가능하도록, 적어도 복수의 다른 이동성-변경 부분을 포함하는 복수의 e-태그 시약을 포함하는 라이브러리를 갖는 것에 기반한다. 이동성-변경 부분은 반응의 생성물에보유되고, 여기서 생성물은 질량을 변화시키는 기의 증가 및/또는 손실에 의해 변경되고 또한 출발 물질에 비교할때, 생성물을 전하를 변화시킬수 있다. 이동성-변형 부분은 절단가능한 결합에 의해 폴리펩티드 결합 영역에 연결되고, 따라서 이동성-변경 부분은 제 1 결합제에 대한 유도된 결합 부위의 결합에 이어지는 분석을 위해 방출된다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명은 다른 것들 중에서, 번역-후 변경의 영역에 대한 용도를 갖는다. 본 발명자들은 복수의 경로, 표면 단백질 집단에서의 변화, 노화, 종양형성, 활성화 또는 자연적으로 일어나는 다른 현상으로 인한 변화와 관련하여, 화학적 물리적 환경에서 변화에 대한 숙주 세포, 세포기관 등의 반응을 결정할 수 있고, 여기서 단백질의 양은 정량화할 수 있다. 채택될 수 있는 방법론은 이종 또는 동종이 될 수 있다. 이종의 기술은 보통 분리 단계를 수반하고, 이때 미결합 표지는 결합 표지로부터 분리된다. 한편으로는, 동종 검정은 꼭 필요로 하는 것은 아니지만, 분리 단계를 포함할 수도 있다.
게다가, 많은 이종 검정에서 미결합 표지화된 시약이 결합 표지화된 시약으로부터 분리가능한 것이 요구된다. 이는 다양한 방식으로 달성될 수 있고, 각각은 표지화된 시약과 폴리펩티드의 복합체 사이를 구분하는 고체 지지체에 결합된 시약을 필요로한다. 고체 지지체는 자성 비드, 리포솜 등을 포함하여, 용기 벽 예를 들어, 마이크로타이터 웰 플레이트 웰, 모세관, 플레이트, 슬라이드, 비드가 될 수 있다. 고체 지지체의 주요 특성은 그것이 미결합 프로브로부터 결합 표지화된 특정 결합 맴버의 분리를 허용하고 지지체가 결합 복합체의 형성을 방해하지 않고,결정의 다른 작업도 방해하지 않는다는 것이다.
고체 지지체는 지지체에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된 복합체를 가질 수 있다. 직접적인 결합을 위해서, 제 1 시약 또는 공유결합으로 또는 비공유결합으로 지지체에 결합된 e-태그 프로브를 가질 수 있다. 표면은 제 1 시약으로 공유결합을 형성할 다양한 작용기로 활성화될 수 있다. 이들 기는 이미노 할라이드, 활성화 카르복실 기 예를 들어 혼합된 안히드리드 또는 아실 할라이드, 아미노 기, α-할로 또는 위-할로케톤 등을 포함할 수 있다. 지지체의 표면에 결합된 특정 결합 맴버는 복합체의 맴버를 구속하는데 사용될 수 있다.
보통, 이종 모드에서, 미결합 표지화 시약 또는 e-태그 프로브는 결합 재료를 세척함으로써 제거될 것이다. 입자들 또는 비즈가 채택될 때, 이들은 여과, 원심분리, 자기장 분리 등에 의해, 세척전에 상청액으로부터 분리될 수 있다. 세척후에, 지지체는 액체와 결합될 수 있고, 거기로 e-태그 리포터가 방출되고 및/또는 e-태그 부분의 작용기는 검출가능한 표지와 반응되고, 이어서 방출이 진행된다. 절단가능 결합의 성질 및 절단 방법에 따라, 액체는 절단을 위한 어떠한 추가적인 시약을 포함할 수 있다. 절단을 위한 시약이 요구되지 않을때, 액체는 편리하게는 전기영동 완충제이다. 예를 들어, 절단가능 결합이 광불안정일때, 매질은 e-태그 리포터를 방출하기 위한 적절한 파장의 빛으로 조사될 수 있다. 검출가능한 표지가 e-태그 부분에 존재하지 않을때, e-태그 리포터는 검출가능한 표지와 반응될 수 있다. 어떤 경우에 검출가능 표지는 절단가능 결합을 절단하는 시약의 일부 예를 들어, 티올을 갖는 디술피드가 될 수 있다. 표지와의 반응을 위한 다른 결합 부재에서 복수의 다른 작용기가 있을때, 다른 표지는 작용기 중 하나와 반응하는 작용기를 갖는다. 다른 표지들은 함께 또는 개별적으로 순차적인 방식으로 첨가된다. 예를 들어, 작용기는 티올, 카르복실 기, 안히드리드 및 올레핀을 수반할때, 표지는 각각 활성화된 올레핀, 알콜, 아민 및 티올 기를 가질 수 있다. 하나 이상의 작용기를 위해 제거가능한 보호 기를 가짐으로써, 보호 기는 순차적으로 제거될 수 있고 표지는 순차적으로 첨가될 수 있다. 이러한 식으로, 교차-반응성은 피할 수 있다. 하나가 초기에 존재하는 검출가능한 표지를 갖거나 또는 하나가 검출가능한 표지를 추가하는지 여부는 본 발명에서 중요하지 않고 폴리펩티드 자체가 분열-유발 부분에 의해 절단되는지 여부에 의해 또는 폴리펩티드 및 제 1 시약 및 전기영동 프로브의 성질에 의해 지배된다.
일부 구체예에서, e-태그 리포터는 시약 용액으로부터 분리될 필요가 있고, 여기서 시약은 전기영동 분석을 방해한다. e-태그 리포터 및 시약의 성질에 따라, 이온 교환 컬럼, 액체 크로마토그래피, 초기 전기영동 분리 등을 사용함으로써, 시약으로부터 e-태그 리포터를 격리시킬 수 있다. 대안으로서는, 앞서 논의된 바와 같이, 혼합물에서 어떠한 방해 성분을 제거하기 위해, 하나는 e-태그 부분에 결합된 캡쳐 리간드 또는 e-태그 리포터를 분리시키기 위한 표적-결합 영역의 보유된 부분을 가질 수 있다. e-태그 리포터의 용액이 제조되고 어떠한 방해하는 성분이 없는 용액은 전기영동적으로 분석될 수 있다. 분석은 개별적인 e-태그 리포터의 분해된 밴드를 제공하는, 모세관 전기영동 장치, 마이크로플루이드 장치 또는 복수의 화합물을 전기영동으로 분리할 수 있는 다른 장치를 채택할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 검정은 동종 방식으로 수행된다. 주제 동종 검정을 위한 프로토콜은 일반적으로 유사한 이종 검정을 위한 과정을 따른다. 이들 프로토콜은 e-태그 프로브의 표지, 경우에 따라서는 e-태그 프로브 또는 폴리펩티드와 관련된 절단가능한 결합, 전자기 방사 또는 반응에 수반된 또는 배경 신호를 줄이기 위한 다른 시약을 포함하는 신호 생산 시스템을 채택한다. 단일체 산소의 제조를 수반하는 검정에 있어서, 결합과 미결합 표지-함유 시약에 의해 제조된 과산화수소 사이의 반응을 피하기 위해서, 그것의 수명을 줄이는 과산화수소를 저하시키는 용액중 분자를 가지는 것이 바람직할 수 있다.
일반적으로, 신호 생산 시스템에 수반된 다양한 약제의 농도는 분석되는 샘플에서 개별적인 폴리펩티드의 농도 범위에 따라 변할 것이고, 일반적으로 약 10nM 내지 약 10mM의 범위이다. 완충제는 통상 약 10 내지 약 200mM의 범위의 농도에서 채택될 것이다. 각 폴리펩티드의 농도는 일반적으로 약 1pM 내지 약 100μM의 범위이고, 보다 일반적으로는 약 100pM 내지 약 10μM의 범위일 것이다. 특정 상황에서 농도는 다른 고려사항은 물론이고, 분석물의 성질, 상반 결합 맴버의 친화력, e-태그 리포터의 방출의 효율, e-태그 리포터가 검출되는 민감도, 및 폴리펩티드의 수에 따라, 더 높거나 더 낮을 수 있다.
본 발명의 한 양태에 있어서, 일련의 폴리펩티드를 복합화한 반응에서 모니터링할 수 있다. 이 경우에, 각 폴리펩티드가 결합제에 결합하고 매질이 처리되어 단일항 산소를 생성할 때 e-태그 리포터가 시약으로부터 방출되는 조건에서 단일 반응 용기에서 다양한 폴리펩티드에 대응하는 복수의 e-태그 프로브을 샘플과 결합시킨다. 검출을 위해서 e-태그 리포터를 표지하거나 e-태그 부분에 존재하는 반응적인 작용기을 수단으로 표지을 첨가한다. 반응의 표지된 e-태그 리포터는 전기 영동 기구에서 분해되었고 검출기를 지날 때 모니터링되었다. 전기 영동 기구에서 e-태그 리포터의 지정된 세트사이에서 얻을 수 있는 분해 정도로 이 체계에서 가능한 복합 수준을 제한한다.
e-태그 부분이 표지된 단계가 있으면 검정을 탄력적으로 할 수 있다. 위에서 묘사된 것과 같이, 각 e-태그 부분은 반응에 도입되었을 때 검출가능한 표지을 포함하고 있다. 대안으로는 e-태그 부분은 샘플과 반응이 끝난 후에 표지에 결합하는 작용기가 있다. 이 구체예에서 검출 가능한 표지에 결합하는 작용기를 가진 e-태그 프로브는 샘플과 결합한다. 표적 폴리펩티드가 이 샘플에 존재한다면 e-태그 프로브의 운동성을 변경하기 위한 반응 후에 추가 시약이 첫번째 반응의 산물과 샘플 용기에서 결합하고 첫번째 반응의 산물은 검출가능한 표지을 추가하기 위해서 변경된 e-태그 프로브와 반응한다.
정량을 위해서, 존재하거나 도입된 표적양에 관련하여 신호를 보내는 대조군을 사용할 수 있다. 전기 영동으로 e-태그 리포터를 분리하기 전에 형광발생단을 각 샘플에 첨가하여 상대적인 형광 신호를 절대량으로 전환하기 위한 대조군을 만들 수 있다. e-태그 리포터 신호의 검출을 방해하지 않는 형광발색단은 형광신호를 표준화하는데 사용한다. 대조 신호는 샘플의 e-태그 리포터와는 다른 전기 영동 운동성이 있고 같거나 다른 방출 파장을 가질 수 있다. 형광물질의 예로는 ROX, FAM, 플루오레세인 등이 있다.
본 발명에 따라서 검정의 한 예가 폴리펩티드의 인산화를 검출하는 것이다. 샘플은 세포 물질을 포함하고 번역후 변경은 여기서 표적 폴리펩티드라고 언급된 특정 폴리펩티드를 인산화하는 것이다. 금속이 결합된 금속 친화 물질과 연결된 광감작제를 포함하는 첫번째 시약과 샘플을 혼합한다. 인산화된 표적 폴리펩티드가 존재한다면, 인산그룹은 금속 친화 물질 복합체에 결합한다. 전기영동 프로브를 위 반응의 혼합물과 혼합한다. 전기영동 프로브는 e-태그 리포터가 결합된 표적 폴리펩티드에 대한 항체를 포함한다. 절단가능한 결합은 단일항 산소에 의해 절단가능한 부분을 포함한다. 전기영동 프로브를 첨가하고 적절한 기간동안 배양한 후에, 반응 혼합물에 빛을 조사하여 단일항 산소를 생성하는 광감작제를 자극시킨다. 절단가능한 부분은 광감작제와 근접하고 활성화된 종, 즉 단일항 산소는 절단가능한 부분을 절단하고 e-태그 리포터를 방출하기에 충분한 활성을 가지고 있기 때문에 절단가능한 부분은 단일항 산소에 의해 절단된다. 단일항 산소의 활성이 수명이 짧고 인산화된 표적 폴리펩티드가 존재하여 첫번째 시약에 결합하지 않은 전기영동 프로브의 절단가능한 부분은 절단된 e-태그 리포터를 만들지 않기 때문에 표적 폴리펩티드 또는 과량의 전기영동 프로브, 인산화되지 않은 폴리펩티드에 결합하는 전기영동 프로브가 존재하지 않기 때문에 표적 폴리펩티드에 결합하지 않은 전기영동 프로브은 절단된 e-태그 리포터를 만들어내지 않는다. 방출된 e-태그 리포터는 유동성 차이로 분리하고 유동성 변경 부분에 부착된 검출 부분을 근거로 검출한다. 방출된 e-태그 리포터의 존재, 양은 표적 폴리펩티드의 존재, 양을 나타낸다.
본 발명으로 표적 폴리펩티드의 다중 검정에서 특정한 사용을 알게 된다. 본 발명의 이 관점에 따른 검정의 한 예가 다중 폴리펩티드의 인산화를 검출하는 것이다. 샘플은 세포 물질을 포함하고 번역후 변경은 표적 폴리펩티드로 언급된 여러 폴리펩티드를 인산화하는 것이다. 금속이온이 결합된 금속 친화제와 연결된 광감작제를 포함하는 첫번째 시약과 샘플을 혼합한다. 반응 혼합물에 존재하는 인산 그룹과 결합한다는 점에서 첫번째 시약은 등급 특이적 시약이다. 인산화된 표적 폴리펩티드가 존재한다면, 인산 그룹은 금속-금속 친화제 복합체에 결합한다. 여러 전기영동 프로브을 위 반응 혼합물과 혼합한다. 각 전기영동 프로브은 특정 표적 폴리펩티드에 대한 프로브을 포함한다. 각 전기영동 프로브은 특정 표적 폴리펩티드에 특이한 e-태그 리포터가 연결된 특정 표적 폴리펩티드에 대한 항체를 포함한다. 분리가능한 연결은 단일항 산소에 의해 절단가능한 부분을 포함한다. 전기영동 프로브을 첨가하고 적절한 기간동안 배양한 후에, 빛으로 반응 혼합물을 조사하여 단일항 산소를 생성하는 광감작제를 자극한다.
절단가능한 부분은 광감작제와 근접하고 활성화된 종, 즉 단일항 산소는 절단가능한 부분을 절단하고 등급 특이적인 시약과 결합한 표적 폴리펩티드에 결합된 모든 전기영동 프로브으로부터 e-태그 리포터를 방출하기에 충분한 활성을 가지고 있기 때문에 절단가능한 부분은 단일항 산소에 의해 절단된다. 다시, 등급 특이적인 시약과 결합한 표적 폴리펩티드에 결합하지 않은 전기영동 프로브은 위에서 언급된 이유로 분리된 e-태그 리포터를 만들지 않는다. 방출된 e-태그 리포터를 유동성 차이에 따라 분리하고 e-태그 리포터의 유동성 변경 부분에 부착된 검출 부분에 근거하여 검출한다. 각각의 방출된 e-태그 리포터의 존재와 양은 각 표적 폴리펩티드의 존재와 양을 나타낸다. 이 방식으로, 리포터 세포 경로를 실시간으로 연구할 수 있다. 단백질 인산화 와 비인산화 반응을 연구하여 대사 조절과 신호 전달 경로에 대한 더 많은 정보를 얻을 수 있다. 위 방법은 세포 주기동안 여러번 반복되어 세포가 진행된다.
본 발명을 다르게 응용한 것으로 다중 인산화된 표적 폴리펩티드를 검출하는 것이다. 예를 들어서, 폴리펩티드가 한번 인산화, 두번 인산화 또는 그이상 인산화되었는지 아는 것이 바람직하다. 본 발명의 이 관점에 따라서 검정의 예는 표적 폴리펩티드의 인산화 정도를 검출하는 것과 관련된다. 세포 물질을 포함하는 샘플은 허브 입자와 연결된 다중 광감작제를 포함하는 첫번째 시약과 결합하고 이 허브 입자에는 결합된 금속이 연결된 금속 친화제가 있는 다중 입자가 연결되어 있다. 등급 특이적인 시약을 적절히 적정하여 표적 폴리펩티드의 인산화를 결정할 수 있다. 인산화된 표적 폴리펩티드가 존재하면, 인산 그룹은 금속-금속 친화제 복합체에 결합한다. 전기 영동 프로브은, 특정 표적 폴리펩티드에 독특한 e-태그 리포터가 연결된 특정 표적 폴리펩티드에 대한 항체를 포함한다. 분리가능한 연결은 단일항 산소에 의해 분리가능한 부분을 포함한다. 전기영동 프로브을 첨가하고 적절히 배양한 후에, 반응 혼합물을 빛으로 조사하여 단일항 산소를 생성하는 광감작제를 자극한다. 절단가능한 부분은 단일산소에 의해 절단된다.
광감작제와 근접하기 때문에 절단가능한 부분은 절단된다. 활성종, 즉 단일항 산소는 등급 특이적 시약에 결합된 표적 폴리펩티드에 결합된 전기영동 프로브으로부터절단가능한 부분을 절단하고 전기영동 프로브으로부터 e-태그 보고자를 방출하기에 충분한 활성을 가지고 있다. 다시, 계급 특이적 시약에 결합된 표적 폴리펩티드와 결합하지 않은 전기영동 프로브은 위에서 언급된 이유때문에 절단된 e-태그 보고자를 생성하지 않는다. 방출된 e-태그 보고자를 유동성 차이에 의해 분리하고 e-태그 보고자의 유동성 변경 부분에 부착되어 있는 검출 부분을 기초로 검출한다. 방출된 e-태그 보고자의 존재와 양은 표적 폴리펩티드의 인산화 수준을 결정하기 위해서 첨가된 계급 특이적 시약과 관련이 있다. 본 발명은 표적 폴리펩티드의 인산화 위치를 결정하기 위해서 사용한다. 본 발명의 이 관점에 따른 검정예에서, 세포 물질을 포함하는 샘플은 금속 이온이 결합한 금속 친화제에 결합된 화학적 단백질 분해효소를 포함하는 첫번째 시약과 결합한다. 인산화된 표적 폴리펩티드가 존재하면, 인산기는 금속-금속 친화제 복합체에 결합한다. 빛으로 조사하면 화학적 단백질 분해효소가 활성화되고 인산기가 금속 친화-금속 복합체와 결합한 표적 폴리펩티드에서 위치 특이적으로 절단된다. 절단 산물은 예를 들어 전기 분리로 직접적으로 분석되는 독특한 부분이나 e-태그 부분을 나타낸다. 반면에, 하나 또는 그 이상의 전기영동 프로브은 위 반응 혼합물과 혼합되어서 독특한 부분에 대한 검출 부분을 제공한다. 각 전기영동 프로브은 검출 부분이 부착된 절단된 부분에 대한 항체를 포함한다. e-태그 리포터를 유동성 차이에 따라서 분리하고 부착된 검출 부분의 차이로 검출한다. e-태그 리포터가 존재하는 것은 표적 폴리펩티드의 인산화 위치를 나타낸다.
본 발명에 따른 검정의 다른 예는 복합 폴리펩티드의 글리코실레이션의 검출과 관련된다. 샘플은 세포 물질을 포함하고, 번역후 변경은 표적 폴리펩티드라고 언급된 여러 폴리펩티드를 글리코실레이션하는 것이다. 샘플은, 붕소산을 포함하는 시약에 연결된 광감작제를 포함하는 첫번째 시약과 결합한다. 반응 혼합물에 존재하는 탄수화물 부분에 결합한다는 점에서 첫번째 시약은 계급 특이적인 시약이다. 글리코실화된 표적 폴리펩티드에 존재한다면, 탄수화물 그룹은 붕소산을 포함하는 시약과 결합한다. 여러 전기영동 프로브은 위의 반응 혼합물과 결합한다. 각 전기영동 프로브은, 특정 표적 폴리펩티드에 독특한 e-태그 리포터가 연결된 특정 표적 폴리펩티드에 대한 항체를 포함한다. 절단가능한 연결은 단일항 산소에 의해 절단가능한 부분을 포함한다. 전기영동을 첨가하고 배양을 적절히 한 후에, 반응 혼합물에 빛을 조사하여 단일항 산소를 생성하는 광감작제를 자극시킨다. 분리가능한 부분은 단일항 산소에 의해 절단되고 계급 특이적 시약에 결합된 표적 폴리펩티드와 결합한 전기영동 프로브으로부터 e-태그 리포터를 방출한다. 다시, 계급 특이적인 시약과 결합한 표적 폴리펩티드에 결합하지 않은 전기영동 프로브은 위에서 제시된 이유 때문에 절단된 e-태그 리포터를 생산하지 않는다. 방출된 e-태그 리포터를 유동성 차이에 의해 분리하고 e-태그 리포터의 유동성 변경 부분에 부착되어 있는 검출 부분을 근거로 검출한다. 방출된 e-태그 리포터의 존재와 양은 각 표적 폴리펩티드, 즉, 글리코실화된 폴리펩티드의 존재와 양을 나타낸다. 위 방법은 여러번 세포 주기동안 반복되어 세포가 진행된다.
본 발명은 예시를 통해서 MAP 카이나아제 경로, Ras/ERK MAPK 경로, JNK/SAPK, 다른 MAPK 경로, JAK/STAT 경로, NF- B 그리고 NF-AT 이중 신호 경로,림프구 기능 조절, T 세포 항원 수용 신호 전달, 다양한 신호 트랜스듀서, 전사 활성자, 세포 분열 주기 체크 포인트 등등을 포함하는 세포 신호 경로의 연구에 널리 응용된다.
미토젠-활성화된 단백질 카이나아제(MAPK`s)로 성장 요소와 사이토카인 수용체 신호체계의 세포 사건을 더 잘 이해할 수 있다. 세포외 신호 전달 단백질 카이나아제 또는 ERK라고 언급된 MAP 카이나아제는 3개의 효소 일련 반응에서 마지막 효소이다. 관련되거나 분명한 신호 경로에 대한 3개의 효소 일련 반응을 반복하면 각 효소가 인산화하고 연속적으로 다음 요소를 활성화시키는 한 경로내에서 연속적으로 작용하는 다기능 신호 요소로서 MAPK 경로를 생성한다. 진핵세포내에서 보존된 MAPK 일련 반응을 최근에 확인한 것에 의하면 MAPK 기본단위는 세포와 신호의 다양한 배열을 해석하기 위해서 변경되었다. 효소의 MAPK 상위계열은 다양한 세포외, 세포내 중개자에 의해 생산되어 들어오는 신호를 모니터링하는 중앙 교환대의 구성요소이다. MAPK모듈에서 효소의 특정 인산화와 활성화는 신호를 일련반응을 따라서 전달하여 다른 단백질 카이나아제, 전사 요소, 세포골격 단백질과 다른효소를 포함하여 세포내의 상당한 조절 기능을 가진 많은 단백질을 인산화하게 된다. (Cobb, et al., Promega Notes Megazine(1996)59:37,et seq.)
예를 들어서 번역후 변경, 단백질의 기능과 발현을 변경하고 모니터링하는 작은 분자, 알려진 작은 분자을 사용하여 새 단백질을 동정, 카이나아제, 펩티드와 같은 특성화된 표적를 스크리닝, 카이나아제, 포스파타아제, DNA 또는 RNA 결합 단백질, 펩티드, 프로타아제 등과 같은 새로운 표적를 확인하기 위한 기능적인 계층의 단백질을 스크린하는 것을 연구하기 위해서 다른 등급의 검정은 광감작제 시약과 세포를 연관시키는 것과 관련된다. 예를 들어서, 해당 표적에 결합할 것이라 생각되는 작은 분자는 작은 분자-감광약 복합체를 형성하여 광감작제 분자와 결합할 수 있다. 다양한 표적와 결합할 수 있는 항체 분자는 e-태그 항체 복합체를 형성하여 다른 e-태그 부분으로 표지될 수 있다. 특정 표적의 존재 여부는 e-태그 항체::표적::작은 분자-광감작제 복합체를 형성하여 연구할 수 있고 측량할 수 있다. 항체와 작은 분자를 표적와 연관시키면 e-태그 부분과 광감작제를 근접시킬 수 있고 e-태그 리포터를 방출할 수 있다. 광감작제를 작은 분자. 펩티드, 억제제, 지방, 탄수화물, 항체 분자, 올리고뉴클레오티드 등에 결합시킬 수 있다. 광감작제를 위 구조를 가진 미생물이나 세포의 표면에 부착시킬 수 있고 두가지 개별 세포의 표면 분자사이의 상호작용을 모니터링할 수 있다. 세포 표면 연구를 위해서, 특정 세포 표면 부분에 부착하거나 광감작제가 막 내에서 자유롭게 확산하는 방식으로 세포막에 비특이적으로 결합하여 광감작제 시약을 세포와 관련시킬 수 있다.
카이나아제 상호작용에 대한 특정 검정은 발전할 수 있는 많은 종류의 검정의 예이다. 특정 카이나아제 상호작용은 샌드위치 에세이 형식을 사용하여 연구할 수 있다. 예를 들어서, 첫번째 항카이나아제-항체를 e-태그 부분으로 표지할 수 있고 인산화된 분자를 결합시키는 두번째 항체를 광감작제로 표지할 수 있다. 면역 복합체를 형성한 후에 적정 파장에서 빛을 비추어서 방출하고 모세관 전기영동으로 분리할 수 있다. 다른 형식에서, 다양한 특이성을 가진 카이나아제를 연구할수 있다. 항-카이나아제 항체를 같은 광감작제(광감작제1-항 카이나아제1, 광감작제1-항 카이나아제2, 광감작제1-항카이나아제3등)으로 표지할 수 있다. 특정 카이나아제 기질 또는 억제제는 특정 e-태그 부분(기질1-e-태그1, 기질2-e-태그1, 기질2-e-태그1등)으로 표지한다. 결합 복합체가 안정하게 또는 일시적으로 형성된다. 조명 그리고 전기영동 분리 후에, 샘플에 있는 선택된 카이나아제 표적의 다양한 수준을 나타내는 동시에 결정되는 특정 패턴을 형성할 수 있다. 신호 패턴이 설정되면, 다양한 시약, 치료 혹은 유전적 변형의 영향을 이 패턴으로 변경한 것으로 평가할 수 있다.
프로테오믹스에 대한 본 발명의 다른 예가 도7에 제시된다. 이 구체적인 예에서, 세포 샘플을 첫번째로 분해하여 검정을 수행한다. 세포 용해물의 모든 단백질은 절단유발된 부분으로 표지된다. 단백질 당 적어도 하나 이상의 절단유발 부분을 획득하기 위해서 표지링을 한다. 도7에 도시된 바와 같이, 단백질은 수용체 혹은 항체인 항-단백질 리간드(APL)로 통합된다. APL은 절단가능한 결합을 통해서 특정 e-태그 수용체 분자로 표지되고 각 리간드는 APL과 관련된 독특한 e-태그 리포터를 가진다. 결합한 후에, 절단유발 부분은 활성화되어서 다른 리포터(Y)를 방출한다. 절단유발 부분과 절단가능한 부분은 방출된 e-태그 리포터에 근접해야 한다. 리포터는 모세관 전기영동을 통해서 분리되고 측량된다. 이 기술로 인해서 단백질, 작은 분자, 효소-기질 그리고 세포 표면 수용체를 동일한 검정 포멧으로 복합적으로 윤곽을 그릴 수 있다.
단백질의 세포 기능을 결정하는 것은 기능을 변경하는 수단이 필요하다. 한 방법은 단백질을 암호화하는 유전자에서 비활성화 혹은 활성화 돌연변이를 사용하는 유전적 방법이다. 비활성화는 삭제 혹은 불능화하는 방법이고 활성화 혹은 과도 발현은 암과 관련된 방법이다. 작은 분자가 결합하는 단백질의 기능을 변경하는 작은 분자를 사용하는 방법이다. 단백질 기능을 비활성화 혹은 활성화할 수 있는 리간드가 존재한다. 자연적 산물에 대해서 특이성은 유전자 불능화하는 방법을 사용하면 되는 것으로 검정되었다.(Schreiber, Bioorganic and Medicinal Chemistry, 6(1998)1127-1152; Stockwell,et al, Chemistry and Biology,6(1999)71-83). 작은 분자와 자연 산물은 예를 들어서 세포 집단이 동시발생하도록 하는 세포 주기에서 특정 지점에서 정지와 같은 여러 경로에서 세포 주기 사건의 복잡한 경로를 풀어낼 수 있다. 특정 결합 상호관계가 설정되면, 세포-투과적 자연 산물을 살아있는 세포에서 표적 단백질의 기능을 이해하는데 사용할 수 있다. 어떤 자연 산물은 조용한 상태에서 G1 전이 상태로 전이되는 데 필요한 신호 전달 경로를 방해한다. 작은 분자는 단백질 글리코실레이션, 메틸레이션, 리피데이션, 이소프레닐레이션, 유비퀴티네이션, 인산화, 아세틸레이션과 같은 번역후 사건에 영향을 줄 수 있다.
세포 주기로 들어가고 나가는 것은 전사 그리고 단백질 합성과 같은 많은 활성적 기능을 포함하여 세포의 기본적 대사가 침체된 활성적인 증식과 조용한 상태 또는 G0 상태사이의 세포 통과 형태로 나타난다. 성장 요소로 자극하면 세포가 활성적인 주기에 다시 들어가도록 신호하는 반면에 성장 요소를 제거하면 세포가조용한 상태로 들어갈 수 있다. 세포는 세포 주기를 나와서 차별화 혹은 예정된 세포 죽음(아폽토시스)의 경로를 거친다. 한 경로에서 다음 경로로 세포 주기가 움직이도록 하는 요소는 서로를 활성화하고 비활성화하는 일련의 단백질 카이나아제와 포스파타아제이다. 시클린-의존 카이나아제는 세포 주기 경로에 결정적인 다양한 기질을 인산화하는데 관여한다. 시클린 의존 카이나아제의 수준은 세포 주기동안 변하지 않지만 이들의 활동은 수준이 변동하는 시클린이라 불리는 다른 세트 단백질과 상호작용에 의해 모니터링된다. 추가적으로 세포 원형질막에 있는 많은 수용체는, 궁극적인 종말점이 세포 증식이고 활성화되면 세포내 신호 전달 경로를 시작하는 티로신 카이나아제이다. 본발명의 방법과 시약은 앞서 언급된 분석 영역에 잘 맞다. 다양한 작은 분자로 인해 카이나아제, 포스파타아제, 막수용체, 프로타아제, 이소프레닐 트랜스퍼라아제, 폴리머라아제를 포함한 같은 종류의 표적가 상실된다. 본 발명의 결과로서, 단백질 기능을 세포내 환경에서 연구할 수 있다. 본 발명의 단백질을 측량화한다. 시클린과 같은 하류부분 단백질 수준이 미치는 영향을 본발명의 시약을 이용하여 연구할 수 있다. 활성적, 비활성적 시클린 의존 카이나아제(Cdk's)를 시클린 발현과 함께 측정할 수 있다. Cdk-시클린 복합체를 측량화할 수 있다. 신호 전달 경로를 본 시약으로 연구할 수 있다.
G1 단계는 세포가 분열 순환에 도입하는지 평가하는 결정적인 지점이다. G1 단계의 단백질은 인간 암에서 빈번하게 돌연변이되고 치료제로 좋은 표적이다. 치료제인 화합물을 확인하기 위해서 초기 G1 단계 또는 후기 G1 단계인지 보는 것이 바람직하다. 현재 방법은 화합물을 평가할 때 세포증식인지 세포 죽음인지 평가하는 것이다. 관련된 여러 단계가 도8에 묘사되어 있다.
한 구체적인 예에서, 우물과 같은 적절한 용기 바닥에서 세포를 배양할 수 있다. 세포가 고정된 후에, 본 발명에 따라서 스크리닝 방법으로 특정 항원에 대해서 검출할 수 있다. 세포막으로 통합되는 광감작제 시약을 사용하거나 대안으로는 광감작제 시약은, 항원이나 세포 표면에 있는 한 종류의 단백질에 대한 항체에 부착된 광감작제를 포함한다. 항원에 대한 항체는 절단가능한 결합으로 e-태그 부분에 연결되어 있는 e-태그 시약을 사용할 수 있다. 세포막에 결합하고 항원에 결합하는 조건에서 광감작제 시약을 적절한 매질에서 고정된 세포에 첨가한다. 그다음, e-태그 프로브을 첨가하고 항원에 대한 항체를 항원에 결합하는 조건에서 매질을 처리한다. 다음에, 절단가능한 결합을 세포막에 있는 광감작제에 근접시키기 위해서 항원이 세포에 존재한다면 e-태그 프로브의 절단가능한 결합을 절단하는 단일항 산소를 생성하기 위해서 빛으로 조사하여 광감작제를 활성화시킨다. 매질을 방출된 e-태그 리포터에 대해서 관찰하고 e-태그 리포터가 있다면 항원이 있다는 것을 나타낸다. 다른 항원이 존재하여 생성되는 e-태그 리포터와 e-태그 리포터를 차별화하는 유동성 변경 부분을 포함하는 e-태그 부분에 절단가능한 결합으로 연결된 특정 항원에 특이적인 항체와 함께 다양한 e-태그 프로브을 사용하여 동시에 많은 항원을 검사한다. 위 단계후에, 매질은 e-태그 리포터를 각 유동성 차이에 따라서 분리하는 분리 단계의 영향을 받는다. 이러한 방식으로 세포에 의한 단백질 발현을 연구한다.
위에서 언급된 방식으로 수행된 검정 결과는 도 9A, 9B, 9C에 예시되어 있다. (광감작제와 같은 올로뮤신 표지된 방출유도 시약을 사용하여 카이나아제 활성화)Cdk와 시클린 A-E의 수준을 동시에 모니터링하기 위한 세포 수준의 검정이 있다. 전기영동 프로브은,하나 이상의 독특한 e-태그가 각 항체에 연결된 발현 단백질에 특이적인 항체를 사용한다. 도 9A를 참고하여 대조 세포의 경우에 실험된 화합물이 없을 때 Cdk2, Cdk6, Cdk4, Cdc2, 시클린 A,D,E,B를 대표하는 8개의 피크가 나타났다. 실험된 화합물이 초기 G1 정지로 나타나면(도 9B), Cdk6, Cdk4, 시클린D의 3개의 피크가 나타난다. 실험된 화합물이 후기 G1 정지로 나타나면(도 9C), Cdk2, Cdk6,Cdk4, 시클린D, 시클린 E의 5개의 피크가 나타난다. 두 개의 화합물 처리에서, 실험된 화합물은 환자를 치료하는데 효과적인 시약이다. 다른 검정은 작은 분자 라이브러리를 사용한, 단백질의 번역후 조절을 연구하는 것이다.
다른 검정은, 단백질의 역으로 가능한 공유 변경 조절자에 대한 작은 물질의 라이브러리를 사용하여 단백질의 번역후 조절을 연구하는 것과 관련된다. 각 e-태그 프로브은 변경되거나 변경되지 않은 상태에 있는 단백질에 대한 항체를 포함하며 항체는 e-태그 프로브 한 세트내에 독특한 e-태그 부분과 연결되어 있는 e-태그 프로브 한 세트를 준비한다. 막이나 시토졸 또는 다른 적절한 위치에서 광감작제 시약은 세포로 통합된다. 적절한 반응 용기에서 프로브은 세포와 결합한다. 라이브러리의 각 작은 물질을 각 용기에 첨가한다. 위에서 묘사된 대로 매질에 빛을 비춘다. 각 용기로부터 매질은 e-태그 보고자를 분리하고 동정하도록 처리한다. 하나 이상의 e-태그 보고자가 존재하는 것은 각 작은 분자가 단백질의 공유 변경을 조절하는 능력과 관련이 있다.
단백질의 번역후 변경을 연구하기 위한 다른 시도에서, 라이브러리의 하나의 작은 분자가 각 e-태그 프로브에 대한 e-태그 부분과 연결된 한 세트의 e-태그 프로브을 준비한다. 적절한 용기내의 세포를 광감작제와 처리하여서 광감작제를 적절한 세포 위치에 통합시킨다. 작은 분자가 단백질 변경을 유도하는 조건에서 e-태그 프로브 전체 세트 혹은 그 일부를 용기에 첨가한다. 변경에 관련된 작은 분자만이 절단가능한 결합을 광감작제에 근접하게 한다. 용기로부터 매질은 e-태그 리포터를 분리하고 동정하도록 처리한다. 하나이상의 e-태그 리포터가 존재하는 것은 각 작은 분자가 단백질의 공유 변경을 조절하는 능력과 관련이 있다.
위 방식으로 억제자, 활성자, 잠정적 시약, 호르몬, 효소 조효소, 다른 형태의 조절 요소로 작용하는 작은 분자에 의해 변경되는 일련의 세포 사건의 정황에서 단백질 경로를 연구한다. 작은 분자가 유전자 발현과 단백질 기능에 미치는 영향을 연구하여 작은 분자를 신규 단백질을 동정하는데 사용한다. 작은 분자를 사용하는 것은 유전자 불능화만큼 특이적이다. 본발명은 고전적 유전학에서 가능하지 않은, 즉시 기능을 변경하는 작은 분자를 발견하는데 사용할 수 있다. 작은 분자들을 단백질의 기능을 모니터링하는데 사용하고 카이나아제 스크리닝, 펩티드 스크리닝, 카이나아제, 펩티드, 프로타아제, GPCR과 같은 무작위적 스크린에서도 사용한다. 세포 주기 정지제의 작은 분자 억제제를 검정하는 것은 현재 시약을 사용하여 수행한다.
본 발명에 따른 전기영동 프로브을 사용하는 다른 방법을 도11에 묘사하였다. 표면에 수용체R을 포함하여 많은 수용체를 가지고 있는 세포막을 도시한다.수용체R에 명확하게 결합하는 항원을 첨가하고 수용체R이 존재한다면 항원은 조효소 Co과 수용체R에 결합한다. 효소 Ea는 위 복합체에 결합하고 이 복합체는 Ea를 활성화시켜서 P1을 인산화된 상대물 P1a로 전환시킨다. 카이나아제 P2는 P1a에 결합하여 활성화된 복합체를 형성한다. 이 체계는 작은 분자나 시약과 같은 활성화된 복합체의 저해제를 검색하는데 사용된다. 따라서, 이 검정에 대한 시약은 억제제로 스크린되는 각 분자를 포함하고 각 분자는 방출 유도 시약에 결합되어 있다. 전기영동 프로브은 복합체 즉 복합체 P1a에 대한 항체이고 항체는 다중 전기영동 부분에 결합되어 있다. 스크린된 분자중 하나가 결합하고 복합체의 활성을 방해하면, 방출-유도 시약은 전기영동 프로브에 근접하게 되고 e-태그 부분을 방출, 검출하며 측량한다.
특정 수용체에 결합하는 능력에 대해서 단백질을 스크린하기 위해서 위 방법을 사용한다. 도11의 계획안과 일치하는 이 방법에서, 잘 정의된 표적를 가진 시약을 사용한다. 수용체R에 결합하는 단백질을 사용하여 하나 이상의 표적가 제시되면 e-태그 보고자를 검출할 수 있다. 제시된 바와 같이, 본 발명의 방법은 융통성이 있다.
도11 계획안의 변형을 도12에 묘사하였다. 이 구체적인 예에서, 방출 유도 시약은 항체 Ab1이고 항체 Ab1은 P2a와 P1a의 활성 복합체에 결합한다. 전기영동 프로브은 항체 Ab2이고 다양한 e-태그 부분이 항체 Ab2에 연결되어 있다. 리간드L은 세포의 표면에 있는 수용체R에 결합하는 능력에 대해 연구되었다. L이 R에 결합하면, P2a와 P1a의 활성 복합체가 형성된다. 항체Ab1와 Ab2가 활성복합체에 결합하면, 방출가능한 결합과 방출 유도제와의 거리를 가깝게 한다. e-태그 보고자가 방출, 검출되고 측량된다.
도13A는 본 방법과 구성분이 응용된 다양한 인산화 과정과 관련된 단백질-단백질 상호작용 경로의 이론적 예를 묘사한다. 이 예에서, 단백질-단백질 결합은 작은 분자에 의해 진척된다. 영양분과 미토젠 그리고 세포 표면에 있는 수용체의 상호작용으로 FRAP이 형성된다. 도13A에서 볼 수 있는 바와 같이, 라파마이신이 있는 조건에서 FKBP단백질은 FRAP(결합사건1)에 결합하여 4E-BP1을 형성하고, 4E-BP1은 mRNA 번역 시작을 조절하는 것에 관련되어 있다. S6 단백질 결합(결합사건5)하게 하는 칼리귤린-A이 있을 때 FRAP에 의해 활성화되는 카이나아제(결합사건2) PP2A는 p70S6K을 형성한다. 후자인 단백질은 mRNA 번역 시작 조절에 관여한다. 세포 표면에 있는 다른 수용체 RTK는 성장 요소에 의해 활성화되어서 카이나아제 PI3K를 형성한다. 워트마닌이 있을 때, PI3K는 PDK1(결합사건6)으로 전환된다. PDK1은 p70S6을 생산하여 S6 단백질을 형성한다. PDK1은 PKB(결합사건3)을 생산하고 PKB은 FRAP(결합사건4)을형성한다. 도13B의 그래프는 시약이 존재하지 않거나 워트마닌, 라파마이신, 칼리귤린-A이 존재할 때 검정의 결과를 도시하고 방출-유도 시약에 각각 결합되어 있고 전기영동 부분에 연결된 결합 사건에 관련된 단백질 중 하나에 대한 항체를 포함하는 전기영동 프로브이 사용된다. 위의 경로로 다양한 결합 사건, 하나이상의 결합 사건의 억제제, 하나이상의 결합 사건에서 억제제, 하나이상의 결합 사건에서 경쟁자, 카이나아제 활성의 모니터링자 등을 볼 수 있다. 본 발명의 방법과 시약으로, 위에 언급된 것 중 하나 또는 그이상을 다중의 전기영동 프로브을 사용한 단일 검정에서 동시에 모니터링할 수 있다.
반응 산물의 분석
공시된 전기영동 방법은 예를 들어, Krylov et al, Anal.Chem., 72:111R-128R(2000);P.D.Grossman and J.C. Colburn, 모세관 전기영동: Theory and Practice, Academic Press, Inc.,NY(1992);U.S.Patents 5,374,527; 5,624,800; 5,552,028; ABI PRISM 377 DNA sequencer User's Manual, Rev.A,January 1995, Chapter2(Applied Biosystems, Foster City, CA)등에 잘 묘사되어 있다. 다양한 적절한 전기영동 매체는 Applied Biosystems과 교차가능하지 않은 매체를 포함하여 Applied Biosystems "3700"과 "3100"도구와 같은 자동화된 도구와 같이 다른 회사에서 시중구입 가능하다. 폴리머 농도, pH, 온도, 전압, 변성제의 농도와 같은 최적 전기영동 조건은 분리되는 화합물의 크기 범위, 주성분 등을 포함하여 많은 요소에 의존한다. 본 발명의 응용은 특정 분리 조건을 최적화하기 위해서 표준 예비 검정이 필요하다. 전기영동 분리동안 혹은 후에, 분리된 화합물의 형광 신호와 이동시간(이동거리)를 기록하거나 상대적 형광 차트를 만들고 전기영동 태그의 이동 서열을 만들어서 전기영동 태그를 검출하거나 확인할 수 있다. 그러한 검출을 수행하기 위해서, 고강도 수은 증기 램프, 레이저 등과 같은 표준 수단을 사용하여 전기영동 태그를 조사할 수 있다. 전형적으로, He-Ne 가스 레이저나 고체상태 다이오드 레이저에 의해 생산된 레이저빛을 전기영동태그에 조사한다. 광복합 튜브, 충전-연결 장치 등과 같은 빛에 민감한 검출기로 형광 신호를 검출할 수 있다. 대표적인 전기영동 검출 체계를 미국 특허 Nos.5,543,026; 5,274,240; 4,879,012;5,091,652;6,142,162 등에 기술하였다.
모니터링할 수 있는 반응을 끝낸 후에 위에서 묘사된 형광과 같은 신호 변화를 모니터링하거나 일정량을 취하고 전체 e-태그 리포터를 검정하여 혼합물을 분석할 수 있다. 도구에 따라서 빛 원천에 의해 활성화된 하나에서 4개의 다른 형광 물질을 사용할 수 있다. 진보되면 다섯개 또는 그 이상의 다른 형광물질을 구입할 수 있고 추가적인 빛 원천이 필요하다. 전기화학적 검출이 미국 특허 No. 6,045,676에 기술되어 있다.
한 실시예에서 절단된 e-태그 리포터가 존재하는지는 e-태그 부분에 포함된 형광 표지에 의해서 결정된다. 표지된 e-태그 리포터의 혼합물을 전기분리로 분리할 수 있고 전기 분리는 e-태그 리포터의 혼합물을 각 구획이나 밴드로 분리하면서 전기장을 걸거나 동전기(동전기적 흐름) 또는 전기영동 흐름, 전기침투내의 전기영동 흐름을 조합하는 것과 관련된다. 전기분리는 유동성 차이에 따라서 전기장에서 분자를 이동시키고 분리하는 것과 관련된다. 전기분리의 다양한 형태에는 자유 지역 전기영동, 젤 전기영동, 등전기 포커싱, 이소타크로포리시스, 모세관 전기크로마토그래피, 미셀 전기역학 크로마토그래피 등이 있다. 모세관 전기영동에는 1~200 마이크로미터, 10~100 마이크로미터 횡단 용적인 튜브 혹은 채널에서 수행되는 전기영동, 유전체 혹은 전기침투적 흐름을 포함하여 전기역학 흐름에 의한 전기분리와 관련된다. 모세관은 실리콘, 석영, 유리 혹은 플라스틱을 포함하는 웨이퍼 또는 필름에 있는 긴 독립적 모세관 튜브 혹은 채널이다. 모세관 전기분리에서,증폭과 다른 반응이 수행되는 모세관 장치의 일부인 전기분리 채널에 일정량을 도입하여 e-태그 리포터를 포함하는 반응 혼합물의 일정량을 전기분리할 수 있다. 전기 전위를, 채널안에 포함된 전기적으로 유도된 매체에 적용하면 조합안의 구성분 이동에 영향을 미친다. 일반적으로, 기술서에 공시된 관행에 따라서 적용된 전기 전위는 바람직한 구성분의 전기분리를 하기에 충분하다. 당업계에서 숙련된 사람은 본발명에서 사용된 한 세트의 시약, 절단된 표지의 성질, 반응 매체의 성질에 대해서 적절한 전기 전위를 결정할 수 있다. 매체에 대한 변수와 전기 전위를 포함하여 전기분리의 척도는 바람직한 구성분을 최대분리할 수 있도록 최적화된다. 이것은 경험적으로 달성할 수 있고 숙련된 이의 영역내에 있다.
동종 검정에서, 샘플, 첫번째 그리고 전기영동 프로브 그리고 보조시약이 연결 지역의 절단를 지지하는 반응 혼합물에서 혼합된다. 혼합물은 혼합물의 다른 구성분으로부터 e-태그 리포터를 분리하도록 진행한다. e-태그 리포터 농축이 있거나 없을 때 혼합물은 미세유체 혹은 모세관 전기영동 장치 대개는 전기영동 도구, 전기영동에 필요하게 변경된 매체로 전이된다. 분리 채널로부터 제거하고 싶을 때, 완전한 e-태그 리포터 분자, 리간드가 e-태그 리포터가 방출되었을 때 방출되지 않은 e-태그 리포터에 결합한다. 대안으로는, e-태그 리포터의 반대 전위를 가진 상호교환적인 결합막을 첨가하여 전체 전위는 e-태그 리포터의 전위와 반대이고, 이러한 분자는 방출된 e-태그 리포터 분자로부터 반대 전극으로 이동한다. 예를 들어서, 바이오틴과 스트렙타비딘을 사용할 수 있고 스트렙타비딘은 양전위가 있다. 펩티드 분석물의 경우에, 구체예에서 리간드가 펩티드 분석물과 함께 남아있는 위치에 절단가 있다. 예를 들어서, 메티오닌의 메틸 그룹을 대체하는 e-태그 부분이 있다. 변경된 메티오닌의 피라졸원을 사용하여, 유용한 라이신에 결합할 수 있다. 피라졸원의 아미노그룹은 바이오틴으로 대체된다. e-태그 리포터를 방출하면서 시아노겐 브로마이드로 절단할 수 있고 바이오틴은, 결합막으로부터 방출되지 않은 펩티드와 e-태그 부분과 함께 남아있다. 극성을 변경하고 분석물의 표적-결합 부분에 연결된 e-태그 부분이나 표적-결합 부분을 고립시키기 위해서 아비딘을 사용한다.
모세 전기영동에 대해서, 분리된 절단 표지을 검출하기 위해서 하나 또는 그이상의 검출 지역을 사용한다. 반응의 성질, 유동성-변경 부분 등에 따라서 여러 검출 지역을 이용하는 것은 본 발명의 범위내이다. 단일 채널 혹은 다양한 채널과 관련있는 검출 구간이 있다. 검출 구간내에 유용한 적절한 검출기는 광배율 튜브, 광다이오드, 광다이오드 배열, 전자 눈사태 광다이오드, 직선 그리고 배열 전위 커플 장치(CCD)칩, CCD 카메라 모듈, 분광화학계 등이 있다. 예를 들어서, 자극 원천에는 여과 램프, LED, 레이저 다이오드, 기체, 액체 고체 상태의 레이저 등이 있다. 검출에는 레이저 스캔 자극, CCD 카메라 검출, 공동축 광학 섬유, 단일 혹은 배열 형상에서 공초점의 앞,뒤 형광 검출 등이 있다.
미국 특허 Nos. 5,560,811(column 11, line19-30)에 도시된 방법을 포함하여 모세관 전기영동 칼럼 분석과 관련되어 알려진 방법으로 검출할 수 있고 적절한 개시는 참고문헌으로 통합되어 있다. 전기영동에 숙련된 이들은 넓은 범위의 전기 전위를 인지하고 예를 들어서 10~1000 V/cm 장 더 구체적으로 200~600 V/cm의 전기력을 사용할 수 있다. 모세관 길이는 약 40~60 cm이고 상업적 체계에 대한 상위 전위 한계는 약 30 kV이며 최대장은 약 600 V/cm 이다. DNA의 경우에, 전형적으로 모세관은 전기침투 흐름을 감소시키도록 막을 입히고 모세관의 주입말단은 음전위로 유지되었다.
검출을 용이하게 하기 위해서, 전체 도구는 전도 손실이 낮도록 200 ~ 800 nm, 대개는 450 ~ 700 nm, 180 ~ 1500nm 범위 파장의 빛을 허용하고 시각적으로 투명한 플라스틱 물질로 제조한다. 적절한 물질에는 융합된 실리카, 플라스틱, 석영, 유리 등이 있다.
e-태그 시약을 사용하기 위한 키트
편리하도록 본 발명에 사용된 시약의 미리결정된 양을 포장된 조합에 있는 키트에서 제공한다. 패키지된 조합에서 폴리펩티드 분석용 키트는 절단유발 부분과 번역후 변경이 일어나는 폴리펩티드에서 결합위치에 결합하기 위한 결합제를 포함하는 첫번째 시약을 포함한다. 키트는 e-태그 리포터에 절단적으로 결합된 특정 폴리펩티드에 대한 특이적 결합제를 포함하는, 하나 이상의 전기영동 프로브를 포함한다. 예를 들어서, 각 e-태그 프로브는 e-태그 부분에 절단적으로 결합된 항체와 같은 폴리펩티드 결합부분을 포함한다. 각 e-태그 프로브의 유동성 변경 부분에는 e-태그 리포터와 다른 것을 차별화하는 유동성이 있고 특정 단백질에 특이적이다. 키트는 유동성 차이로 분리할 수 있고 e-태그 리포터를 형성할 수 있는 프로브를 적어도 1, 적어도 10, 그리고 20개 이상, 종종 50개 이상 포함한다. 반면에, 폴리펩티드가 특이적으로 절단되어 e-태그 부분을 제공하는 곳에서, 각 시약은특이적으로 절단된 e-태그 부분에 결합하기 위한 부분에 연결된 검출 부분을 포함한다.
키트는 모세관 전기영동을 수행하기 위한 도구와 절단유발 시약의 절단유발 부분을 활성화하기에 필요한 시약을 포함한다. 키트는 다양하게 완충제된 매체, 이들중 일부는 위 시약의 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 목적을 달성하기에 필요한 시약 농도를 제공하기 위해서 키트의 다양한 시약의 상대적 양은 변경될 수 있다. 적절한 조건에서 키트의 하나 이상의 시약은 첨가제를 포함하여 동결건조되어 건조된 가루로 제공되고 이 가루는 용해되어서 본 발명에 따른 방법이나 검정을 수행하기 위한 적절한 농도를 가지고 있는 시약 용액을 제공한다. 각 시약은 분리된 용기로 포장되거나 일부 시약은 교차 상대성과 수명이 허용되는 하나의 용기에서 조합된다. 위에서 기술된 본 발명과 일치하여 키트는 방법의 기술을 포함한다.
본 발명은 다음 합성과 실시예에 의해 검증된다. 다르게 명시되지 않으면 부분과 비율은 질량 비율이다. 다르게 명시되지 않으면 온도는 섭씨온도이다. 다음 제조법과 실시예는 본 발명을 예로 든 것이고 영역을 한정짓지 않는다. 다르게 명시되지 않으면 다음 실시예에서 사용된 펩티드는 자동 합성기를 사용한 합성으로 제조하였고 젤 전기영동 또는 HPLC를 사용하여 순수분리하였다.
다음 축약은 아래에 제시된 의미를 갖는다.
Tris HCl - BioWhittaker, Walkersville,MD에서 제조한 Tris(hydroxymethyl)
aminomethane-HCl
HPLC-고성능 액체 크로마토그래피
TLC- 얇은 층 크로마토그래피
BSA - Sigma시약 회사 (St. Louis, MO) 또는 다른 시약회사에서 공급한
bovine serum albumin, e.g.
EDTA - Sigma시약 회사에서 공급한 에틸렌 디아민 테트라아세테이트
g - 그람
mM - 밀리몰
FAM - 카복시플루오로레신
EMCS - N-말레이미도카프로일옥시-숙신이미드 에스테르
EDC - 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드
NHS - N-하이드록시숙신아마이드
DCC- 1,3-디시클로헥실카보디이미드
DMF-디메틸포름아마이드
Fmoc-N-(9-플루오레닐메톡시카르보닐)-
실시예1
검정 시약과 광감작제 분자의 접합
감광성 분자를 금속 친화제, 붕소산을 포함한 물질, 허브 분자, 다양한 종래 방법과 배열에 결합시킨다. 예를 들어, 활성화된(NHS 에스테르, 알데히드, 술포닐 염소) 광감작제(Rose Bengal, 프탈로시아닌)를 활성화된 아미노기 포함 부분(아미노덱스트란, 아미노기 포함 물질(금속 결합 위치를 적절히 보호), 다른 크고 작은 분자와 반응시킬 수 있다. 형성된 결합제는 (예를 들어 항체-광감작제 결합물질, 바이오틴-LC-광감작제) 직접적으로 다양한 검정에서 사용될 수 있다. 또한, 형성된 결합체는 항체(예를 들어, 20-200개의 광감작제를 포함한 아미노덱스트란-광감작제 결합체와 200-500 아미노기는 산화된 요오드 항체 분자에 결합하여 항체-덱스트란 광감작제 결합체를 생성할 수 있다)와 결합할 수 있다. 예를 들어, 20-200개의 광감작제와 200-500 아미노기를 포함한 아미노덱스트란-광감작제 결합체는 EDC 결합 방법으로 카르복실화 폴리스티렌 비즈에 결합하여 광감작제-아미노덱스트란-입자 결합체를 형성할 수 있다. 광감작제를 입자에 혼합하는 방법은 미국 특허 5,340,716에 제시되어 있다. 다음에 나트륨-요오드 산화된 항체 분자는 아미노덱스트란 분자의 아미노기와 반응하여 여기서 "광감작제 비즈"라고 인용된 항체-덱스트란-광감작제 입자 결합체를 생성할 수 있다. 항제 분자 대신에 아비딘 또는 다른 분자가 사용될 수 있다.
실시예2
e-태그 부분의 접합과 e-태그 리포터의 방출
도14는 항체 또는 다른 결합 부분의 e-태그 부분을 아미노기에 결합하고, 생성된 결합체와 단일항 산소와 반응하여 방출된 e-태그 리포터로서 술폰산을 생성하는 방법을 요약한 것이다. 도15 A-I는 시작 물질로서 5-또는 6-카복실형광물질을 사용하는 여러가지 e-태그 시약을 제시한다.
실시예3
Pro2, Pro4, Pro6, Pro13의 제조
도16A에 제시된 계획은 카복실형광물질에서 유도된 e-태그 부분 즉, Pro2, Pro4, Pro6, Pro7, Pro8, Pro9, Pro10, Pro11, Pro12, Pro13을 제조하는 5단계 과정을 나타낸다.
첫번째 단계는 5 또는 6-FAM과 N-하이드록시숙신아미드(NHS)와 1,3-디시클로헥실카보디이미드(DCC)를 DMF에 반응하여 해당하는 에스테르를 생산하는 단계를 포함한다. 이 에스테르는 다양한 디이민과 반응하여 해당하는 아미드, 화합물1을 생성한다. 화합물1과 N-숙시님이딜 요오드화 아세테이트를 처리하면 요오드화 아세트아미드 유도체를 생성하고 이 요오드화 아세트아미드 유도체는 분리되지는 않지만 트리에틸아민이 있는 조건에서 3-머캅토프로피오산과 반응한다. 마지막으로, 생성된 β-티온산(화합물2)는 위에서 제시된 대로 NHS 에스테르로 전환된다. 다양한 e-태그부분은 5 또는 6-FAM과 다양한 다이아민을 시작으로 합성된다. 다이아민은 도16A의 첫번째 반응에서 H2N＾X＾H2N으로 제시된다. 다이아민내의 FAM의 이성체와 "X"의 화학 부분은 합성된 각 e-태그부분에 대해 아래의 표에 제시된다. 명확하게 다이아민 X는 유동성 변경제 부분의 토론에 제시된 것과 같이 다양한 첨가 형태를 가진다.
e-태그부분 FAM X
Pro2 5-FAM C(CH3)2
Pro4 5-FAM 탄소 없음
Pro6 5-FAM (CH2)8
Pro7 5-FAM CH2OCH2CH2OCH2
Pro8 5-FAM CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2
Pro9 5-FAM 1,4-페닐
Pro10 6-FAM C(CH3)2
Pro11 6-FAM 탄소 없음
Pro12 6-FAM CH2OCH2CH2OCH2
Pro13 6-FAM CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2
화합물1의 합성
건조한 DMF(5mL)에 있는 5-또는 6-카복시형광체(0.5mmol)의 용액에 N-하이드록시숙신이미드(1.1 당량)과 1,3-디시클로헥실카보디이민(1.1당량)을 첨가하였다. 10분 후에, 하얀 고체(디시클로헥실우레아)가 형성되기 시작한다. 반응 혼합체를 상온에서 밤새 질소가 있는 조건에서 섞는다. TLC(9:1 CH2Cl2-MeOH)가 나타나면 시작 물질이 완전히 사라졌다는 것을 나타낸다.
위 혼합물의 상층액을 DMF(10mL)와 diamine(2-5당량) 혼합 용액에 한방울씩 첨가한다. TLC(40:9:1 CH2Cl2-MeOH-H20)에서 보듯이, 반응은 즉시 완료되었다. 용매는 낮은 압력에서 제거되었다. 의약비즈 실리카위의 잔재물의 섬광크로마토그래피로 아민(화합물1)을 58-59% 수익율로 얻는다. 화합물1의1H NMR (300 MHZ, DMSO-d6)은 배당된 구조와 일치한다.
화합물2의 합성
아민(화합물1)(0.3mmol)에 연속적으로 건조 DMF(10ml)와 N-숙신이미딜 요오드화아세테이트(1.1당량)을 첨가하였다. 명확한 용액을 얻을 때까지 화합물은 상온에서 혼합되었다. TLC(40:9:1 CH2Cl2-MeOH-H20)는 반응이 완결됨을 나타낸다.
위 반응 용액을 트리에틸아민(1.2당량)과 3-머캅토프로판산(3.2당량)으로 처리하였다. 혼합물을 상온에서 밤새 혼합하였다. 다음에 섬광 크로마토그래피로 낮은 압력에서 용매를 제거하면 β-티오산(화합물2)를 62-91% 수익율로 얻을 수 있다. 화합물2의 구조는1H NMR (300 MHZ, DMSO-d6)로 정한다.
Pro2, Pro4, Pro6, Pro13의 합성
건조 DMF(2mL)에 있는 β-티오산(화합물2)(0.05mm)의 혼합 용액에 N-히드록시숙신이미드(1.5당량)와 1,3-디시클로헥실카보디이미드(1.5당량)을 첨가한다. 화합물은 24-48h동안 질소존재하에 상온에서 혼합한다.(모든 반응 물질이 반응할 때까지) 반응 혼합물은 낮은 압력하에서 응축하고 섬광 크로마토그래피로 분리정제하여 표적 물질을 41-92% 수익률로 획득하였다.
Pro1의 제조
이 반응의 화합물을 도 16B에 제시하였다. 건조 DMF(2mmol)에 있는 5-요오드화아세트아마이드형광물질(화합물4)(24mg,0.047mmol)의 혼합 용액에 트리에틸아민(8uL, 0,057 mmol)과 3-머캅토프로판산(5uL, 0,057 mmol)을 첨가하였다. 생성된 용액은 상온에서 1.5 시간 동안 혼합하였다. TLC(40:9:1 CH2Cl2-MeOH-H20)는 반응이 완결되었음을 나타낸다. 다음으로, N-히드록시숙신이미드(9 mg, 0,047 mmol)와 1,3-디시클로헥실카보디이미드(18mg, 0,087 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물은 19h동안 질소에서 상온에서 혼합하고 19 시간 동안 TLC에서 시작 물질이 완전히 사라졌다. 낮은 압력에서 용매를 제거하고 용리액으로 25:1, 15:1 CH2Cl2-MeOH를 사용한 섬광 크로마토그래피로 Pro1 (23mg, 83%)을 제조할 수 있다.
Pro3의 제조
이 반응의 화합물은 도 16C에 제시하였다. 건조 DMF(2mL)에 있는 6-요오드화아세트아미드형광제(화합물5) (26mg, 0.050 mmol)의 혼합 용액에 트리에틸아민 (8uL, 0,057 mmol)과 3-머캅토프로판산(5uL, 0,057 mmol)을 첨가한다. 형성된 용액은 상온에서 1.5h 동안 혼합한다. TLC(40:9:1 CH2Cl2-MeOH-H20)는 반응이 완결되었음을 나타낸다. 따라서. N-히드록시숙신이미드(11 mg, 0.096 mmol)와 1,3-디시클로헥실카보디이미드 (18mg, 0,087 mmol)을 첨가한다. 반응 혼합물을 질소가 있을 때 19h동안 상온에서 혼합하고 그 시간동안 TLC는 반응이 완결되었음을 나타낸다. 낮은 압력에서 용매를 제거하고 용리액으로 30:1, 20:1 CH2Cl2-MeOH를 사용한 섬광 크로마토그래피로 Pro3(18mg, 61%)을 제조할 수 있다.
Pro5의 제조
이 반응의 화합물은 도 16D에 제시된다.
화합물7의 합성
건조 DMF(5mL)에 있는 6-(브롬메틸)형광제(화합물6) (40mg, 0.095 mmol)의 혼합 용액에 트리에틸아민(15uL, 0.018 mmol)과 3-머캅토프로판산(10uL, 0.115 mmol)을 첨가하였다. 형성된 용액은 상온에서 2일 동안 혼합하였다. TLC(40:9:1 CH2Cl2-MeOH-H20)는 반응이 완결되었음을 나타낸다. 반응 용액은 낮은 압력에서 증발되었다. 마지막으로, 용리액으로 30:1, 20:1 CH2Cl2-MeOH를 사용한 섬광 크로마토그래피로 β-티오산(화합물7)(28mg, 66%)를 만들 수 있다.
화합물5의 합성
건조 DMF(2mL)에 있는 (화합물7)(27mg, 0.060 mmol)의 산 용액에 N-히드록시숙신이미드(11 mg, 0.096 mmol)와 1,3-디시클로헥실카보디이미드(20mg, 0,097 mmol)을 첨가하였다. 반응 용액은 상온에서 2일 동안 혼합하였고 그 시간동안 TLC(9:1 CH2Cl2-MeOH)는 시작 물질이 완전히 사라졌음을 나타낸다. 낮은 압력에서 용매를 제거하고 30:1 CH2Cl2-MeOH로 섬광 크로마토그래피를 하면 Pro5(24mg, 73%)을 제조할 수 있다.
Pro14의 제조
이 반응의 화합물을 도 16E에 제시하였다.
화합물9의 합성
5-아미노아세트아미드형광제(화합물8) (49mg, 0.121 mmol)에 건조 DMF(4mL)와 N-숙신이미딜 요오드아세테이트(52mg, 0.184 mmol)를 첨가하였다. 맑은 용액이 형성되었고, TLC(40:9:1 CH2Cl2-MeOH-H20)는 시작 물질이 완전히 사라졌음을 나타낸다.
위의 반응 용액을 트리에틸아민(30uL, 0.215 mmol)과 3-머캅토프로판산(30uL, 0.344mol)로 처리하였다. 반응 화합물을 2h동안 혼합한다. 용리액으로 20:1, 15:1 CH2Cl2-MeOH를 사용한 섬광 크로마토그래피로 β-티오산(화합물9)(41mg, 62%)를 생성한다. 구조 분석은1NMR (300 MHZ, DMSO-d6)로 한다.
Pro14의 합성
건조 DMF(2mL)에 있는 화합물9 (22mg, 0.04 mmol)의 혼합 용액에 N-히드록시숙신이미드(9mg, 0.078 mmol)와 1,3-디시클로헥실카보디이미드(16mg, 0.078mmol)를 첨가하였다. 형성된 용액은 질소에서 24h동안 상온에서 혼합한다. 반응 혼합물을 낮은 압력에서 응축하고 용리액으로 30:1 그리고 20:1 CH2Cl2-MeOH를 사용한 섬광 크로마토그래피로 Pro14(18mg, 70%)을 생성한다.
Pro15, Pro20, Pro22, Pro28의 합성
전기영동 꼬리표 Pro15, Pro20, Pro22, Pro28의 NHS 에스테르를 생산하는 합성 계획은 도 16 F-I에 각각 제시하였다. 기술문의 모든 반응제와 반응 조건은 통상적이고 위에서 묘사된 반응과 유사하게 진행된다.
실시예4
단백질 분석을 위한 e-태그 리포터 실험
A.아미노덱스트란(분자량 500,000이상까지)을 e-태그 부분과 biotin으로 표지
아미노덱스트란은 분자량이 많은 분자에 상대적으로 e-태그 리포터 방출을 검증하는 모델로 사용되었고 분자량이 많은 분자는 단백질에 대한 모델로 작용한다. 10mg 아미노덱스트란에 대한 아미노 그룹의 숫자는 2×10-8몰로 계산되었다. 1:4 바이오틴과 e-태그 부분과의 비율에서 메일이미드 NHS 에스테르의 숫자는 7.4×10-6이었다. 아미노덱스트란의 10.9 mg은 6mL 0.1% PBS 완충제에 녹였다.
바이오틴-x-x NHS 에스테르 10mg와 EMCS 23.7mg을 1mL DMF에 함께 녹였고 30분 간격으로 50uL분량을 아미노덱스트란 용액에 첨가, 혼합하였으며 빛으로부터 차단하였다. DMF 용액을 마지막으로 첨가한 후에, 혼합물을 밤새 보관하였다(혼합하고 빛으로부터 차단한다). 다음에, 10,000 달톤의 분자량을 가진 막을 사용하여 혼합물을 투석하였다. 혼합하는 동안에 막을 2L의 물이 담긴 비이커에 적시었다. 물은 2시간 간격으로 4번 변경하였다. 막은 물에서 하루밤동안 (혼합되고 빛에서 차단되는 동안에) 보관하였다. 용액은 동결건조되었고 동결건조된 가루는 e-태그 부분 표지에 사용되었다.
B. 바이오틴과 SAMSA로 표지된 아미노텍스트란의 반응
e-태그 부분 표지링으로 SAMSA[5-(((2-(-3)-S-아세틸머캅토)숙시노일)아미노)형광체)을 사용하여서 아미노덱스트란 분자에서 메일이미드와 반응하였다. 이목적으로 바이오틴 0.3mg(~5.3×10-9몰)과 아미노덱스트란으로 표지된 EMCS를 10ul의 물에 녹였다. SAMSA(~1.2×10-6몰) 1.1mg을 120 uL 0.1 M NaOH에 녹였고 상온에서 15분동안 배양하였다(티올기의 활성화를 위해서). 그 다음에, 과량의 NaOH를 6M HCl 2uL 첨가하여 중화하였고 30uL 인산 완충제(200mM, pH7.0)를 첨가하여 용액의 pH는 7로 모니터링하였다. 활성화된 SAMSA용액을 표지된 아미노덱스트란 10uL용액에 첨가하고 1h동안 배양하였다. e-태그 부분 표지된 아미노덱스트란은 세파덱스 G-25(아머샴)을 사용하여 젤투과로 정제하고 정제된 샘플을 수집하였다.
C.표지된 아미노덱스트란으로부터 e-태그 리포터의 방출
스트렙타비딘 표지된 광감작제 비즈(100uL/mL) 2uL를 암조건에서 5uL 정제된 표지된 아미노덱스트란에 첨가하였고 15분동안 배양하였다. 680nm에서 1분동안 용액에 방사선을 조사하였다. e-태그 리포터의 방출을 CE2LabCardTM도구(ACLARA BioSicences, Mountain View, CA)를 사용하여 관찰하였다. 도 17A에 제시된 바와 같이, CE2LabCard 1은 두 부분으로 구성되어 있다: 증발 대조군과 주입/분리 부분. 증발 대조군은 증발 대조 채널2(450 um 너비, 50 um 깊이)와 두개의 공급 완충제 저장기3(반지름 2mm)을 통합시키고 증발 대조군 채널 중간의 증발-대조군 샘플 우물4(반지름 1mm)와 통합시킨다. 공급 완충제 저장기의 부피는 4.7uL이고 샘플 우물의 부피는 1.2uL이고 중간 샘플 밑의 채널2의 부피는 40 nL이다. 주입/분리에 사용되는 CE2도구의 두번째 부분은 주입 미세채널5와 분리 미세채널6으로 구성되고 이 두 채널은 접합7에서 교차하고 120 um 너비, 50 um 깊이의 부피를 가진다. 분리 채널의 양쪽 끝과 주입 채널의 한쪽 끝은 완충제 저장기8과 연결되어 있으며 주입 채널의 두번째 끝은 직접적으로 증발-모니터링된 샘플 우물4에 연결된다. 필름(MT40)을 LabCardTM에 얇은 판으로 씌어서 채널을 둘러싼다. 검출기9는 접합으로부터 10mm에 위치한다. CE2LabCard 도구를 분리완충제(20 mM HEPES, pH 7.4와 0.5% PEO)로 채운후에 실험 혼합물의 300nL를 샘플 우물4에 첨가하였다. 도 17B에 제시된 바와 같이 완충제 저장기에 전압을 걸어서 샘플을 미세채널 접합7에 주입하였다. 샘플은 도17C에 제시된 바와 같이 분리하였다.
도18은 광감작제 비즈가 있을때와 없을때 정제되어 표지된 아미노덱스트란의 전기영동사진을 나타낸다. 680nm에서 주사하면 광감작제에 의해 생산된 단일항 산소를 사용하여 광감작제 비즈를 첨가하여 아미노덱스트란으로부터 e-태그 리포터를 방출한다. 실험 조건: 분리 완충제 20mM HEPES pH7.4, 0.5%PEO, 도17에 묘사된 것과 같이 전압 배치; 실험 혼합물에는 29 ug/ml 스트렙타비딘-표지된 광감작제 비즈가 있고 680±10nm 필터와 150W 램프를 사용하여 680nm에서 1분간 조사하였다. 제시된 바와 같이, 680nm에서 조사하면 광감작제에 의해 생산된 단일항 산소를 사용하여 광감작제 비즈를 첨가하면 아미노덱스트란으로부터 e-태그 리포터를 방출한다. 조사 시간을 최적화하기 위해서 광감작제 비즈를 포함한 반응 혼합물을 1분에서 10분 동안 조사하였다. 1분이상 긴 조사 시간동안 e-태그 리포터 방출은 증가하지 않았다.
도19는 광감작제 비즈 농도가 e-태그 리포터 방출에 미치는 영향을 보여준다. 도면은 다른 농도의 광감작제 비즈를 사용하여 정제되어 표지된 아미노덱스트란의 분리를 보여준다. 광감작제 비즈의 농도가 높으면 표지된 아미노덱스트란으로부터 e-태그 리포터가 많이 방출된다. 실험 조건: 분리 완충제 20mM HEPES pH7.4, 0.5% PEO; 도17에 제시된 바와 같은 전압 배치; 실험 혼합물을 680±10nm 필터와 150W 램프를 사용하여 680nm에서 1분간 조사하였다.
도20은 광감작제 비즈 농도별로 e-태그 리포터의 방출에 대한 평행 측정 곡선을 묘사한다. CE2LabCard를 사용하여 결과를 얻었다. 실험조건: 분리 완충제 20mM HEPES pH7.4, 0.5% PEO; 도17에 제시된 바와 같은 전압 배치; 실험 혼합물은 680±10nm 필터와 150W 램프를 사용하여 680nm에서 1분간 빛을 비춘다.
추가로, 도21에 나타난 결과같이 표지된 아미노덱스트란의 농도가 e-태그 리포터 방출에 미치는 영향을 검사하였다. 이 도에서 검증된 것과 같이, 광감작제 비즈의 주어진 농도에 대한 표지된 아미노덱스트란의 농도가 낮으면 e-태그 리포터가 더 잘 방출된다.(또는 표지된 아미노덱스트란의 양에 대해서 방출된 e-태그 리포터의 농도가 높으면). CE2LabCard 를 사용하여 결과를 얻었다. 실험 조건: 분리 완충제 20mM HEPES pH7.4, 0.5% PEO; 도17에 제시된 바와 같은 전압 배치; 실험 혼합물은 680±10nm 필터와 150W 램프를 사용하여 680nm에서 1분간 조사하였다.
실시예5
단백질 분석을 위한 e-태그 리포터
A. e-태그 부분을 항체에 결합
결합에 대한 2가지 다른 방법을 사용하였다. 첫번째 방법은 e-태그 부분을 항체에 직접 결합시키는 것이고 두번째 방법은 e-태그 부분을 항체에 부착된 덱스트란에 결합시키는 것이다.
(A1)e-태그 부분을 항체에 직접 결합
e-태그 부분을 항체의 1차 아민과 반응한 NHS 에스테르 말단과 합성하여 안정한 아미드 결합을 형성하였다. e-태그 부분을 항체의 표면에 무작위적으로 부착한다. 전형적으로 항체 분자당 분자를 포함한 6~12 NHS 에스테르로 변경하면 항체 결합 활성이 감소하지 않는다. 활성이 조금만 낮아져도 항체에 대한 NHS 에스테르의 농도가 높은 것이 가능하다.
실험 계획안
1.(Sigma-Aldrich에서 구입한)정제된 인간 IgG를 1×PBS에서 희석하였다.
(0,1M 인산 나트륨, 0.15 M NaCl, pH7.2)
2. e-태그 부분을 포함한 NHS 에스테르를 DMF(디메틸포름아미드)에 녹여서 마지막 농도는 10~20 nmol/uL DMF가 되게 한다.
3. 희석된 인간 IgG(6.5nmol) 500uL을 e-태그 부분 (각각 14, 68, 340, 680 nmol) 과 혼합하였다.
4. 용액을 암조건에서 얼음에서 2시간동안 반응시킨다.
5. e-태그 부분-결합 항체를 4℃에서 20시간동안 0.1×PBS(10mM 인산화 나트륨, 15mM 염화 나트륨, pH7.2)에 대해 투석하여 정제한다.
(A2)e-태그 부분-덱스트란을 항체에 결합
두번째 예에서, 위에서 묘사된 바와 같이 e-태그 부분을 아미드 본드로 아민을 포함한 덱스트란에 결합시킨다. 다클론성 그리고 단일클론성 항체는 항체의 FC부분에 항체를 포함한다. 이러한 다당류는 과요오드-산화되어서 반응이 빠른 알데히드 잔류물을 형성한다. e-태그 부분을 포함하는 아미노-덱스트란은 스키프 염기를 형성하여 산화된 항체의 알데히드 잔류물에 결합한다. 이 결합은 시아노보로하이드라이드 나트륨과 2차 아민으로 환원되어 안정된다.
e-태그 부분과 결합에 유용한 50-500 아미노 그룹을 포함한 아미노-덱스트란(분자량 500,000)이 매우 크기 때문에 항체당 e-태그 부분의 숫자가 많게 되고 신호가 증폭된다. 덱스트란은 항체의 FC부분에 있는 탄수화물을 통해서 결합하기 때문에, 포함된 활성없이 항원 결합 위치로부터 충분히 제거된다.
e-태그 부분을 아미노-덱스트란에 결합시키기 위한 실험 계획안
1. 아미노-덱스트란(500아민/몰 덱스트란이 있는 분자량 500,000)을 90% DM에 녹여서 마지막 농도가 2 mg/ml(2 nmol 아민/ul)가 되게 한다.
2. e-태그 부분을 포함하는 NHS 에스테르를 DMF(디메틸포름아마이드)에 녹여서 마지막 농도가 10 ~ 20 nmol/ul DMF가 되게 한다.
3. 아미노-덱스트란(1000nmol 아민) 500ul을 500, 1000, 2000 nmol e-태그 부 분과 혼합하였다.
4. 용액을 암조건에서 얼음에서 2시간동안 반응시켰다.
5. e-태그 부분이 결합된 아미노-덱스트란을 0.1×PBS(10 mM 나트륨 인산염, 15mM 염화나트륨, pH 7.2)에 대해 20시간동안 4℃에서 투석으로 정제하였다.
6. 침전물을 원심분리하여 14,000 ×에서 5분동안 제거하였다.
항체를 나트륨 과요오드로 산화하기 위한 실험 계획안
1. 정제된 비인간 IL-4 다클론성 항체(피어스에서 구입) 500ul을 10 mM 과요오드산 나트륨(알드리치)가 있는 조건에서 산화시킨다.
2. 용액을 암조건에서 상온에서 30분동안 반응시킨다.
3. 에틸렌 글리콜을 100 mM 마지막 농도에 첨가하여 상온에서 10분동안 배양한다.
4. 산화된 항체를 0.1×PBS(10 mM 나트륨 인산염, 15mM 염화나트륨, pH 7.2)에 대해 2시간동안 4℃에서 투석으로 정제하였다.
아미노-덱스트란을 포함하는 e-태그 부분에 과요오드화-산화된 항체를 결합시키기 위한 실험 계획안
1. 200 mM 나트륨 인산염, pH 9.5의 조건에서 산화된 비인간 IL-4 다클론성 항체 54ul(300 pmol)을 e-태그 부분이 결합된 아미노-덱스트란 300 pmol과 혼합한다.
2. 용액을 암조건 상온에서 2시간동안 반응시킨다.
3. 소디움 시아노보로히드라이드(1N NaOH에서 제조된)을 최종 농도 50mM에 첨가하여 상온에서 30분동안 반응시킨다.
4. 반응하지 않은 알데히드는 50 mM 에탄올아민, pH 9.6을 첨가하면 차단되고 상온에서 30분동안 반응시킨다.
5. 결합체는 0.1×PBS(10 mM 나트륨 인산염, 15mM 염화나트륨, pH 7.2)에 대해 20시간동안 4℃에서 투석으로 정제하였다.
B, 표지된 아미노덱스트란에서 e-태그 부분 리포터를 방출
사용된 과정과 장치는 실질적으로 SAMSA e-태그 부분에 대해 위에서 논의된 바와 같다. 총 8개의 e-태그 부분 리포터를 ABI310을 사용해서 분리하였다. 반응 조건은 다음과 같다: 50 마이크론 모세관, 47cm 길이 36cm 말단-검출; 분리 완충제, POP-6(PE 바이오시스템); 3.0 kV에서 60초 주입; 분리 전압 9.4kV. 결과는 도 22의 전기영동사진에 묘사되어 있다.
C. e-태그 부분에 결합된 항체로 면역측정법
위에서 언급된 결합된 e-태그 부분에서 개발된 두가지 형태의 면역측정법을 수행하였다.
(C1)사이토카인에 대한 샌드위치 면역측정법
샌드위치 면역측정법을 수행하였다(도23). 이 측정법으로 알려진 사이토카인 항원을 측량하고 측정하였다. 이 측정법에서 항체의 맞춤쌍은 두 항체를 근접하게 하는 사이토카인 항원주위에 샌드위치를 형성한다. 이러한 항체중 하나는 e-태그 부분과 결합하여 e-태그 프로브를 생성한다. e-태그 프로브는 단일항 산소 불안정 결합을 가지고, 단일항 산소와 반응한 후에 이 결합으로 e-태그 리포터를 방출한다. 두번째 항체는 680nm에서 조사하였을 때 단일항 산소를 생산하는 광감작제 염색약과 결합한다. 단일항 산소의 반감기가 상대적으로 짧기 때문에, 두 개의 항체가 샌드위치를 형성할 때, 단일항 산소가 e-태그 프로브의 절단가능한 결합을 절단한다.
사이토카인에 대한 샌드위치 면역측정법 실험계획안
1. 실험 완충제(0.1×PBS, 40 mg/ml BSA)를 바이오틴-표지된 항인간 IL-4 단일 클론성 항체(피어스에서 구입, 카타로그 번호 M-450-B)와 0~500 nM 농도의 1ul 사이토카인 IL-4 와 혼합한다.
2. 반응을 상온에서 30분동안 진행한다.
3. 100ug/ml 스트렙타비딘 표지된 광감작제 비즈 5ug를 첨가하였고 혼합물을 암조건 상온에서 15분동안 배양하였다.
4. 스트렙타비딘과 e-태그 프로브의 비특이적 상호작용을 제거하기 위해서, 5uM 바이오틴-DNP 2ul을 첨가하고 암조건 상온에서 10분동안 배양하였다.
5. 아미노-덱스트란 e-태그 부분에 결합된 400 nM 항인간 IL-4 다클론 항체 1ul을 첨가하고 암조건 상온에서 30분동안 배양하였다.
6. 반응 혼합물을 시각 필터 680 DF±20 nm가 있는 150 와트 램프를 사용하여 30초동안 조사하였다.
7. ROX T8 기준 1ul, 1:20(PE 바이오시스템으로부터)을 첨가하였고, 방출된 e-태그를 ABI310 또는 ACLARA 플라스틱 랩카드에서 모세관 전기영동으로 분리하였다.
ABI310에서 방출된 e-태그 리포터의 분리 조건은 다음과 같다: 50um 모세관, 47 cm 길이, 36 cm 말단 검출; 분리 완충제, POP-6; 3kV에서 60초 주입, 분리전압, 9.4 kV. e-태그 리포터 Pro1이 있는 IL-4에 대한 결과는 도24에 나타내었다. 위 과정을 다양한 사이토카인과 e-태그 부분에 대해 다음과 같이 반복한다.
IL-6을 e-태그 부분 Pro10을 사용하여 연구하였고 결과를 도25에 묘사하였다. IFNγ을 e-태그 부분 Pro8을 사용하여 연구하였고 결과를 도26에 묘사하였다. TNFα을 e-태그 부분 Pro7을 사용하여 연구하였고 결과를 도27에 묘사하였다. IL-10을 e-태그 부분 Pro4을 사용하여 연구하였고 결과를 도28에 묘사하였다. IL-8을 e-태그 부분 Pro2를 사용하여 연구하였고 결과를 도29에 묘사하였다.
다음과 같이 다른 사이토카인과 이중 반응으로서 IL-4을 연구하였다: IL-4와 IL-6, IL-4와 IL-8, IL-4와 TNFα, IL-4와 TNF γ. 결과를 도30에 묘사하였다. 다섯개 사이토카인(IL-4,IL-6, IL-8, TNFα, TNF γ)에 대한 다단계 검사를 수행하였고 결과를 도31에 묘사하였다. 여섯개 사이토카인(IL-4,IL-6, IL-8, IL-8, TNFα, TNF γ)에 대한 다단계 검사를 수행하였고 결과를 도32에 묘사하였다.
(C2)IgG에 대한 직접 면역측정법
직접 면역측정법에서, IgG 항원을 e-태그 부분에 결합시켜 e-태그 프로브를 형성하였다. e-태그 프로브는 단일항 산소 불안정한 결합을 가지고 이 결합으로 단일항 산소와 반응한 후에 e-태그 리포터를 방출한다. 항체는, 680nm에서 조사하였을 때 단일항 산소를 생산하는 광감작제 염색약과 결합한다. 단일항 산소의 반감기가 상대적으로 짧기 때문에, 2개의 항체가 결합할 때에만 단일항 산소가 절단 가능한 결합을 절단하여 e-태그 리포터를 방출한다.
인간 IgG에 대한 직접 면역측정법 실험계획안
1. 실험 완충제(0.1×PBS, 40 mg/ml BSA) 10ul와 바이오틴-표지된 항인간 IgG 항체 1ul(100 nM)와 0~500 nM 농도의 e-태그 부분 표지된 인간 IgG(시그마 제품) 1ul와 혼합한다.
2. 상온에서 30분동안 반응을 시켰다.
3. 100ug/ml 스트렙타비딘 표지된 광감작제 비즈 5ug를 첨가하였고 혼합물을 암조건 상온에서 15분동안 배양하였다.
4. 스트렙타비딘과 e-태그 프로브의 비특이적 상호작용을 제거하기 위해서, 5uM 바이오틴-DNP 2ul을 첨가하고 암조건 상온에서 10분동안 배양하였다.
5. 반응 혼합물을 시각 필터 680 DF±20 nm가 있는 150 와트 램프를 사용하여 30초동안 조사하였다.
6. ROX T8 기준 1ul을 첨가하였고, 방출된 e-태그를 ABI310 또는 ACLARA 플라스틱 랩카드에서 모세관 전기영동으로 분리하였다.
인간 IgG의 다양한 농도에 대한 결과를 도34에 나타냈고 측정 곡선을 도 35에 나타냈다.
본 발명이 다중 측정에 유용한 구성분을 준비하기 위한 강력한 도구와 그러한 구성분을 사용한 다중 결정을 수행하기 위한 방법을 제공하는 것이 명백하다. 본 방법은 다른 종류의 화합물의 대표로서 단백질과 함께 동종, 이종의 실험계획안을 제공한다.
본 발명은 복합 반응을 수행하기 위해서 과정에 사용중인 구성분과 정확하고 효과적이며 불안정한 과정을 제시한다. 이 실험계획안을 방식에 있어 유용성이 큰방법으로 수행하고 햅틴, 항원, 핵산과 관련된 다양한 상황에 적용하며 실험자는 하나 또는 여러가지 샘플에서 동시에 다양한 결정을 수행하고 여러 사건에 대한 샘플을 통합한다. 결정에 대한 결과는 전기영동과 질량 분석기를 사용하여 단순한 방식으로 읽는다. 샘플과 시약을 첨가한 후에 데이타 분석기의 모니터링을 받으며 전체 과정이 수행되는 체계가 제공되고 결과는 자동적으로 기록된다.
각 출판 또는 특허 출원은 구체적으로 참고문헌으로 통합되도록 예시된 것처럼, 본 명세서에 인용된 모든 출판과 특허 출원은 참고문헌으로 결합되어 있다.
앞서 말한 발명은 이해를 쉽게 하기 위해서 자세하게 예시를 통해서 묘사되어 있지만, 추가된 청구항의 의도와 영역에서 벗어나지 않게 변화와 변경을 하는 본 발명을 교시하는 관점에서 기술서의 일반적 기술에서도 가능하다.

Claims (61)

  1. 표적 폴리펩티드를 함유한 것으로 생각되는 샘플에서 하나 이상의 표적 폴리펩티드의 존재 또는 부재를 측정하는 방법으로서,
    부류-특이적 시약 및 하나 이상의 전기영동 프로브를 제공하는 단계 (부류-특이적 시약은 유효 근접을 갖는 절단유발 부분 및 하나 이상의 표적 폴리펩티드 상의 번역후 변형에 특이적인 제 1 결합제를 갖고, 하나 이상의 전기영동 프로브는 각각 표적 폴리펩티드에 특이적인 결합 부분을 가지며 여기에 하나 이상의 전기영동 태그가 절단가능한 결합에 의해 부착된다);
    샘플, 부류-특이적 시약, 및 하나 이상의 전기영동 프로브를 혼합하여 부류-특이적 시약 및 하나 이상의 전기영동 프로브가 하나 이상의 표적 폴리펩티드에 결합하고 하나 이상의 전기영동 프로브의 적어도 하나의 절단가능한 결합이 절단유발 부분의 유효 근접 내에 있어서 하나 이상의 전기영동 태그가 방출되는 단계;
    방출된 전기영동 태그를 전기영동으로 분리하는 단계; 및
    방출된 전기영동 태그의 존재 또는 부재에 기초하여 하나 이상의 표적 폴리펩티드의 존재 또는 부재를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 하나 이상의 표적 폴리펩티드는 복수의 표적 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 절단유발 부분은 활성종을 생산하는 증감제인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 증감제는 광감작제이고, 상기 절단가능한 결합은 산화-불안정 결합이고, 상기 활성종은 과산화수소, 히드록실 라디칼, 과산화 음이온, 페녹시 라디칼, 및 단일항 산소로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 활성종은 단일항 산소인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 부류-특이적 시약의 상기 결합제는 항체, 단백질 수용체, 단백질 수용체의 리간드, 렉틴, 바이오틴-함유 부분, 붕소산-함유 부분, 압타머 (aptamer), 효소 기질, 효소 보조인자. 및 효소 서브유닛으로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기에서 상기 전기영동 프로브의 상기 결합 부분은 항체 또는 항체 결합 조성물인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 번역후 변형은 인산화, 글리코실화, 리보실화, 아세틸화, 아실화, 메틸화, 지질화, 이소프레닐화 및 유비퀴틴화로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 5 항에 있어서, 상기 복수의 표적 폴리펩티드는 2 내지 100의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 복수의 표적 폴리펩티드는 5 내지 50의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 5 항에 있어서, 상기 광감작제는 포르피린, 프탈로시아닌, 플루오레세인 염료의 할로겐화 유도체, 로다민 염료의 할로겐화 유도체, 및 나프탈로시아닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 5 항에 있어서, 상기 절단가능한 결합은 올레핀, 티오에테르, 셀레노에테르, 티아졸, 옥사졸, 또는 이미다졸을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 5 항에 있어서, 상기 전기영동 프로브는 하기 식
    T-(L-E)k
    로 정의되는데, 상기 식에서 T는 표적 폴리펩티드에 특이적인 결합 부분이고, L은 산화-불안정 결합이고, E는 전기영동 태그이고, 그리고 k는 1 보다 크거나 같은 정수인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, L은 올레핀, 티오에테르, 셀레노에테르, 티아졸, 옥사졸, 및 이미다졸로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, E는 형광성인, 약 150 내지 2500 달톤 범위의 분자량을 갖는 수용성 유기 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 13 항에 있어서, E는 (M,D) 형태를 갖는데, 여기에서 D는 형광 염료이고 여기에서 M은 하나의 결합이거나 또는 수소를 제외한 탄소, 산소, 질소, 인, 붕소, 및 황으로 구성된 군으로부터 선택되는 100 개의 원자를 갖는 유기 분자인 이동성 변형 부분인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 12 항에 있어서, 상기 전기영동 태그, E는, 식
    A-M-D
    로 정의되는데, 상기 식에서 A는 -C(=O)R (여기에서 R은 1 내지 8 탄소 원자 및 O, S 및 N으로 구성된 군으로부터 선택되는 0 내지 4 헤테로원자를 갖는 지방족, 방향족, 지방족고리 또는 헤테로고리);-CH2-C(=O)-NH-CHO; -SO2H; -CH2-C(=O)O-CHO; -C(=O)NH-(CH2)n-NH-C(=O)C(=O)-(C6H5)이고, 여기에서 n은 2 내지 12의 범위이고;
    D는 형광 염료이고; 그리고
    M은 하나의 결합이거나 또는 수소를 제외한 탄소, 산소, 질소, 인, 붕소, 및 황으로 구성된 군으로부터 선택되는 100 개의 원자를 갖는 유기 분자인데, 단 E의 전체 분자량은 약 150 내지 약 5000 달톤의 범위 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, D는 플루오레세인 염료인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 샘플에서 복수의 표적 폴리펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 키트로서,
    절단유발 부분 및 하나 이상의 표적 폴리펩티드 상의 번역후 변형에 특이적인 제 1 결합제를 갖는 부류-특이적 시약; 및
    표적 폴리펩티드에 특이적인 결합 부분 및 절단가능한 결합에 의해 부착된 하나 이상의 전기영동 태그를 각각 갖는 하나 이상의 전기영동 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 절단유발 부분은 광감작제이고 상기 절단가능한 결합은 산화-불안정 결합인 것을 특징으로 하는 키트.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 제 1 결합제는 항체 결합 조성물, 단백질 수용체, 단백질 수용체의 리간드, 렉틴, 바이오틴-함유 부분, 붕소산-함유 부분, 압타머, 효소 기질, 효소 보조인자, 및 효소 서브유닛으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 하나 이상의 전기영동 프로브의 상기 결합 부분은 항체 결합 조성물인 것을 특징으로 하는 키트.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 하나 이상의 전기영동 프로브는 2 내지 50 범위의 복수인 것을 특징으로 하는 키트.
  23. 제 22 항에 있어서, 각각 상이한 전기영동 프로브는 상이한 표적 폴리펩티드에 특이적인 것을 특징으로 하는 키트.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 하나 이상의 전기영동 프로브는 각각 식
    T-(L-E)k
    로 정의되는데, 상기 식에서 T는 표적 폴리펩티드에 특이적인 결합 부분이고, L은 산화-불안정 결합이고, E는 전기영동 태그이고, 그리고 k는 1 보다 크거나 같은 정수인 것을 특징으로 하는 키트.
  25. 하나 이상의 표적 폴리펩티드를 검출하기 위한 물질의 조성물로서, 조성물은 식
    T-(L-E)k
    로 정의되는 복수의 전기영동 프로브를 포함하며, 상기 식에서 T는 표적 폴리펩티드에 특이적인 결합 부분이고, L은 절단가능한 결합이고, E는 전기영동 태그이고, k는 1 보다 크거나 같은 정수인데, 복수 중의 각각 상이한 T는 상이한 E에 부착되고 복수 중의 각 E는 복수의 모든 다른 E와 구별되는 광학적 특성 및/또는 전기영동 이동성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  26. 제 25 항에 있어서, L은 산화-불안정 결합이고, 상기 복수는 2 내지 500의 범위이고, E는 150 내지 10,000 달톤의 범위인 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 전기영동 프로브는 식
    T-(L-(M, D))k
    로 정의되는데, 상기 식에서 T, L, 및 k는 상기와 같이 정의되고; D는 검출 부분이고; 그리고 M은 하나의 결합 또는 수소를 제외한, 탄소, 산소, 질소, 인, 붕소, 및 황으로 구성된 군으로부터 선택되는, 1 내지 100 개의 원자로 구성된 수용성 유기 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  28. 제 27 항에 있어서, D는 형광 표지, 발색 표지, 또는 전기화학 표지인 것을특징으로 하는 조성물.
  29. 제 28 항에 있어서, M은 폴리에테르, 폴리에스테르, 폴리펩티드, 올리고당, 폴리우레탄, 폴리아미드, 폴리설폰아미드, 폴리설폭시드, 폴리포스포네이트, 및 그것의 블록 공중합체 중 어떤 하나로 선택된 중합체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  30. 제 29 항에 있어서, D는 플루오레세인인 것을 특징으로 하는 조성물.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 플루오레세인은 5- 및 6-카르복시플루오레세인, 5- 및 6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인, 2',7'-디메톡시-5- 및 6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인, 2',7'-디메톡시-4',5'-디클로로-5- 및 6-카르복시플루오레세인, 2',7'-디메톡시-4',5'-디클로로-5- 및 6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인, 1',2',7',8'-디벤조-5- 및 6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인, 1',2',7',8' -디벤조-4',5'-디클로로-5- 및 6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인, 2',7'-디클로로-5- 및 6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인, 및 2',4',5',7'-테트라클로로-5- 및 6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  32. 제 27 항에 있어서, L은 올레핀, 티오에테르, 셀레노에테르, 티아졸, 옥사졸, 및 이미다졸로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  33. 제 27 항에 있어서, D는 Dl-g-D2이고, 여기에서 D1및 D2중 하나는 에너지 운반 수용체 분자이고 D1및 D2중 하나는 에너지 운반 공여체 분자이고, 여기에서 g는 에너지 운반이 D1및 D2사이에서 일어나도록 선택되는 길이를 갖는 고정된 링커인 것을 특징으로 하는 조성물.
  34. 제 33 항에 있어서, D1및 D2는 로다민, 플루오레세인, 및 그것의 할로겐화 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  35. 제 27 항에 있어서, T는 항체 결합 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  36. 제 35 항에 있어서, T는 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  37. 제 27 항에 있어서, M은 디메톡시트리틸-보호 헥사에틸렌 글리콜 포스포르아미디트, 6-(4-모노메톡시트리틸아미노)헥실-(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)-포스포르아미디트, 12-(4-모노메톡시트리틸아미노)도데실-(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)-포스포르아미디트, 2-[2-(4-모노메톡시트리틸)아미노에톡시]에틸-(2-시아노에틸), N,N-디이소프로필)-포스포르아미디트, (S-트리틸-6-머캅토헥실)-(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)-포스포르아미디트, 9-O-디메톡시트리틸-트리에틸렌글리콜, 1-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미디트, 3(4,4'디메톡시트리틸옥시)프로필-l-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미디트, 5'-O-디메톡시트리틸-1',2'-디데옥시리보오스-3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미디트, 18-O 디메톡시트리틸헥사에틸렌글리콜, l-[(2-시아노에틸 )-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미디트, 12-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)도데실-1-[(2- 시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미디트, 1,3-비스-[5-(4,4'디메톡시트리틸옥시)펜틸아미노]프로필-2-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미디트, 1-[5-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)펜틸아미노]-3-[5-플루오레노메톡시카르보닐옥시 펜틸아미노]-프로필-2-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미디트, 트리스-2,2,2-[3-(4,4'디메톡시트리틸옥시)프로필옥시메틸]에틸-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미디트, 숙신이미딜 트랜스-4-(말레이미딜메틸)시클로헥산-l-카르복실레이트, 숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트, 숙신이미딜 아세틸티오아세테이트, 숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐) 부티레이트; N-γ-말레이미도부티릴-옥시숙신이미드 에스테르; p-니트로페닐 요오도아세테이트; 및 4- (4-N-말레이미도페닐) 부티르산 히드라지드로 구성된 군으로부터 선택되는 복수의 2 내지 10 개의 화합물을 커플링함으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  38. 제 27 항에 있어서, 상기 복수의 상기 전기영동 프로브는 5 내지 100 개의 범위인 것을 특징으로 하는 조성물.
  39. 제 38 항에 있어서, 상기 복수의 상기 전기영동 프로브는 10 내지 30의 범위인 것을 특징으로 하는 조성물.
  40. 샘플에서 표적 분자의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 물질의 조성물로서, 조성물은 식
    A-M-D
    로 정의되는데, 상기 식에서 A는 -C(=O)R (여기에서 R은 1 내지 8 탄소 원자 및 O, S 및 N으로 구성된 군으로부터 선택되는 0 내지 4 헤테로원자를 갖는 지방족, 방향족, 지방족고리 또는 헤테로고리);-CH2-C(=O)-NH-CHO; -SO2H; -CH2-C(=O)O-CHO; -C(=O)NH-(CH2)n-NH-C(=O)C(=O)-(C6H5)이고, 여기에서 n은 2 내지 12의 범위이고;
    D는 검출 부분이고; 그리고
    M은 하나의 결합이거나 또는 수소를 제외한 탄소, 산소, 질소, 인, 붕소, 및 황으로 구성된 군으로부터 선택되는 100 개의 원자를 갖는 유기 분자인데, 단 A-M-D의 전체 분자량은 약 150 내지 약 5000 달톤의 범위 내에 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  41. 제 40 항에 있어서, D는 형광 표지, 발색 표지, 또는 전기화학 표지인 것을특징으로 하는 조성물.
  42. 제 41 항에 있어서, D는 형광 표지인 것을 특징으로 하는 조성물.
  43. 제 42 항에 있어서, D는 플루오레세인인 것을 특징으로 하는 조성물.
  44. 제 42 항에 있어서, D는 Dl-g-D2이고, 여기에서 D1및 D2중 하나는 에너지 운반 수용체 분자이고 D1및 D2중 하나는 에너지 운반 공여체 분자이고, 여기에서 g는 에너지 운반이 D1및 D2사이에서 일어나도록 선택되는 길이를 갖는 고정된 링커인 것을 특징으로 하는 조성물.
  45. 제 44 항에 있어서, D1및 D2는 로다민, 플루오레세인, 및 그것의 할로겐화 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  46. 제 40 항에 있어서, D는 형광 표지이고 여기에서 상기 복수의 상기 전기영동 태그는 5 내지 100 개의 범위인 것을 특징으로 하는 조성물.
  47. 제 46 항에 있어서, 상기 복수의 각 전기영동 태그는 별개의 전하-질량비 또는 별개의 광학적 특성을 가지므로 각 전기영동 태그가 전기영동 분리에서 검출가능한 피크를 형성하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  48. 제 47 항에 있어서, D는 상기 복수의 각 전기영동 태그에 대해 동일하고 여기에서 상기 복수의 상기 전기영동 태그는 별개의 전하-질량비를 가지므로 각 전기영동 태그는 전기영동 분리에서 별개의 피크를 형성하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  49. 제 40 항에 있어서, M은 폴리에테르, 폴리에스테르, 폴리펩티드, 올리고당, 폴리우레탄, 폴리아미드, 폴리설폰아미드, 폴리설폭시드, 폴리포스포네이트, 및 그것의 블록 공중합체 중 어떤 하나로부터 선택된 중합체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  50. 제 49 항에 있어서, D는 플루오레세인인 것을 특징으로 하는 조성물.
  51. 제 50 항에 있어서, 상기 플루오레세인은 5- 및 6-카르복시플루오레세인, 5- 및 6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인, 2',7'디메톡시-5- 및 6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인, 2',7'-디메톡시-4',5'-디클로로-5- 및 6-카르복시플루오레세인, 2',7'-디메톡시-4',5'-디클로로-5- 및 6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인, 1',2',7',8'-디벤조-5- 및 6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인, 1',2',7',8'-디벤조-4',5'-디클로로-5- 및 6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인, 2',7'-디클로로-5- 및 6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인, 및 2',4',5',7'-테트라클로로-5- 및 6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  52. 티오에테르 절단가능 결합에 의해 결합 부분에 전기영동 태그를 부착하기 위한 조성물로서, 조성물은 식
    HOOC-R1-S-CH(R4)-C(=O)-NH-R2-NH-R3
    으로 정의되는데, 상기 식에서 Rl은 Cl-Cl0알킬디일이고; R2는 C3-Cl0알킬디일이고; R3은 아미노 보호기이고; 그리고 R4는 페닐 또는 전자-공여-치환된 페닐인 것을 특징으로 하는 조성물.
  53. 제 52 항에 있어서, 상기 아미노 보호기는 Fmoc이고 R4는 페닐인 것을 특징으로 하는 조성물.
  54. (a) 단일항 산소와 반응할 수 있는 절단가능한 결합에 의해 부착된 전기영동 태그를 각각 포함하는 다수의 전기영동 프로브; 및
    (b) 여기 상태에서 산소를 단일항 상태로 활성화시킬 수 있는 광감작제를 포함하는 부류-특이적 시약을 포함하는 조성물.
  55. 제 54 항에 있어서, 상기 부류-특이적 시약은 하나 이상의 광감작제 비드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  56. 제 55 항에 있어서, 상기 하나 이상의 광감작제 비드는 부착된 제 1 결합제를 각각 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  57. 제 54 항에 있어서, 상기 절단가능한 결합은 올레핀기 및 상기 올레핀기와 접합된 하나 이상의 전자 공여 치환기를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  58. 제 54 항에 있어서, 상기 복수의 전기영동 프로브는 식
    T-(L-E)k
    로 정의되는데, 상기 식에서 T는 표적 분자에 특이적인 결합 부분이고, L은 절단가능한 결합이고, E는 전기영동 태그이고, 그리고 k는 1 보다 크거나 같은 정수인데, 상기 복수 중의 각각 상이한 T는 상이한 E에 부착되고 복수 중의 각 E는 상기 복수의 모든 다른 E와 구별되는 광학적 특성 및/또는 전기영동 이동성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  59. 제 54 항에 있어서, 상기 부류-특이적 시약은 인산화된 폴리펩티드를 특이적으로 결합시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  60. (a) 표적 폴리펩티드;
    (b) 표적 폴리펩티드에 특이적으로 결합된 전기영동 프로브; 및
    (c) 유효 근접을 갖는 절단유발 부분을 포함하는 부류-특이적 시약을 포함하는 조성물로서, 부류-특이적 시약은 표적 폴리펩티드에 특이적으로 결합하여 전기영동 프로브가 상기 유효 근접 내에 있도록 하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  61. 제 60 항에 있어서, 상기 표적 폴리펩티드는 인산기를 갖고 상기 부류-특이적 시약은 여기에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180129742A (ko) 2016-10-14 2018-12-05 창원대학교 산학협력단 전자전달해리(etd) 질량분석을 이용한 단백질의 정량분석법

Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002310012A1 (en) * 2001-05-21 2002-12-03 Monogram Biosciences, Inc. Methods and compositions for analyzing proteins
JP2005509859A (ja) * 2001-11-09 2005-04-14 アクララ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド タグ標識された微粒子組成物および方法
US20040229380A1 (en) * 2002-05-21 2004-11-18 Po-Ying Chan-Hui ErbB heterodimers as biomarkers
US20040229294A1 (en) 2002-05-21 2004-11-18 Po-Ying Chan-Hui ErbB surface receptor complexes as biomarkers
WO2004011128A1 (en) * 2002-07-26 2004-02-05 Aclara Biosciences, Inc. Methods and compositions for screening cell binding molecules
US20040091850A1 (en) * 2002-11-08 2004-05-13 Travis Boone Single cell analysis of membrane molecules
JP2007504482A (ja) * 2003-01-17 2007-03-01 アクララ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド タグ付加分子ライブラリーを使用した受容体の脱オーファン化
US7029855B1 (en) * 2003-01-28 2006-04-18 Proteomyx Inc. Radioactive multiplexing analytical methods for biomarkers discovery
JP2006521821A (ja) 2003-04-01 2006-09-28 モノグラム バイオサイエンシズ，インコーポレーテッド バイオマーカーとしての表面受容体複合体
US7402398B2 (en) * 2003-07-17 2008-07-22 Monogram Biosciences, Inc. Measuring receptor homodimerization
WO2005019470A2 (en) 2003-08-11 2005-03-03 Monogram Biosciences, Inc. Detecting and profiling molecular complexes
EP1689882B1 (en) * 2003-10-07 2014-11-26 TRAN, Nathaniel Tue Radioactive multiplexing analytical methods
US7402399B2 (en) * 2003-10-14 2008-07-22 Monogram Biosciences, Inc. Receptor tyrosine kinase signaling pathway analysis for diagnosis and therapy
IL160869A0 (en) * 2004-03-15 2004-08-31 Dnr Imaging System Ltd Integrated system for real time gel electrophoresis running and documenting
JP4311319B2 (ja) * 2004-09-22 2009-08-12 ウシオ電機株式会社 ショートアーク型放電ランプ
WO2006042161A2 (en) 2004-10-07 2006-04-20 E.I. Dupont De Nemours And Company Polysaccharide-based polymer tissue adhesive for medical use
US20060100787A1 (en) * 2004-11-09 2006-05-11 Intel Corporation Synthesis of nanocodes, and imaging using scanning probe microscopy
US20060204999A1 (en) * 2005-03-14 2006-09-14 Stephen Macevicz Detecting molecular complexes
WO2006099604A2 (en) * 2005-03-16 2006-09-21 Compass Genetics, Llc Methods and compositions for assay readouts on multiple analytical platforms
US20060281104A1 (en) * 2005-06-13 2006-12-14 Macevicz Stephen C Leuco dye particles and uses thereof
JP4724816B2 (ja) * 2005-09-06 2011-07-13 シャープ株式会社 タンパク質の測定方法
WO2012024613A1 (en) * 2010-08-19 2012-02-23 Wintrance Corporation Synergistic biomolecule-polymer conjugates
CA2706763C (en) 2007-11-27 2013-07-30 Laboratory Corporation Of America Holdings Enhanced method for detecting and/or quantifying an analyte in a sample
US8530182B2 (en) * 2007-12-05 2013-09-10 Centers For Disease Control And Prevention Viral protein quantification process and vaccine quality control therewith
WO2009086197A1 (en) 2007-12-20 2009-07-09 Monogram Biosciences, Inc. Her-2 diagnostic methods
US20100015231A1 (en) * 2008-07-17 2010-01-21 E.I. Du Pont De Nemours And Company Low swell, long-lived hydrogel sealant
WO2010059279A2 (en) * 2008-11-19 2010-05-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Hydrogel tissue adhesive formed from aminated polysaccharide and aldehyde-functionalized multi-arm polyether
WO2010065568A2 (en) 2008-12-01 2010-06-10 Laboratory Corporation Of America Holdings METHODS AND ASSAYS FOR MEASURING p95 AND/OR p95 IN A SAMPLE AND ANTIBODIES SPECIFIC FOR p95
US20100160960A1 (en) * 2008-12-19 2010-06-24 E. I. Du Pont De Nemours And Company Hydrogel tissue adhesive having increased degradation time
ES2535723T3 (es) 2009-01-15 2015-05-14 Laboratory Corporation Of America Holdings Métodos de determinación de la respuesta del paciente mediante la medición de Her-3
CN102439452B (zh) * 2009-01-15 2015-04-15 美国控股实验室公司 通过测量her-2表达确定患者应答的方法
US20120094955A1 (en) * 2009-04-09 2012-04-19 Actamax Surgical Materials Llc Method of dissolving an oxidized polysaccharide in an aqueous solution
US8951989B2 (en) 2009-04-09 2015-02-10 Actamax Surgical Materials, Llc Hydrogel tissue adhesive having reduced degradation time
US8796242B2 (en) 2009-07-02 2014-08-05 Actamax Surgical Materials, Llc Hydrogel tissue adhesive for medical use
ES2574238T3 (es) 2009-07-02 2016-06-16 Actamax Surgical Materials Llc Adhesivo tisular de hidrogel para uso médico
TW201302793A (zh) 2010-09-03 2013-01-16 Glaxo Group Ltd 新穎之抗原結合蛋白
US10373705B2 (en) 2011-06-07 2019-08-06 Koninklijke Philips N.V. Providing nucleotide sequence data
DE102011109063B3 (de) 2011-07-28 2012-12-20 NMI Naturwissenschaftliches und Medizinisches Institut an der Universität Tübingen Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen
US10370409B2 (en) 2011-10-25 2019-08-06 The Scripps Research Institute Synthesis of libraries of peptide tertiary amides
JP5468056B2 (ja) * 2011-12-15 2014-04-09 富士フイルム株式会社 電気泳動組成物、マイクロカプセル、及び、電気泳動表示素子
US8921277B2 (en) 2012-09-26 2014-12-30 Palo Alto Research Center Incorporated Multiplexed flow assay based on absorption-encoded micro beads
EP2904390B1 (en) 2012-10-02 2016-11-16 Roche Diagnostics GmbH Methods of specifically releasing a sub-group of objects
CA2908515A1 (en) 2013-04-05 2014-10-09 Laboratory Corporation Of America Holdings Systems and methods for facilitating diagnosis, prognosis and treatment of cancer based on detection of her3 activation
EP3027659B1 (en) 2013-07-29 2020-12-09 Actamax Surgical Materials LLC Low swell tissue adhesive and sealant formulations
WO2016026046A1 (en) * 2014-08-20 2016-02-25 The Governing Council Of The University Of Toronto Organotellurium compounds, compositions and methods of use thereof
EP3050886A1 (en) * 2015-02-02 2016-08-03 Bürkert Werke GmbH Fluorescent dyes and dye precursors
AU2016295158B2 (en) 2015-07-17 2021-02-25 Nanostring Technologies, Inc. Simultaneous quantification of gene expression in a user-defined region of a cross-sectioned tissue
US10451614B2 (en) * 2016-03-15 2019-10-22 Laboratory Corporation Of America Holdings Methods of assessing protein interactions between cells
US9994713B2 (en) * 2016-03-28 2018-06-12 King Fahd University Of Petroleum And Minerals Fluorescent schiff base conjugate Cu(II) chemosensors and methods thereof
CN107462618B (zh) * 2016-06-03 2019-05-21 中国科学院生态环境研究中心 一种蛋白质O-GlcNAc糖基转移酶活性电化学传感检测方法
KR102187291B1 (ko) 2016-11-21 2020-12-07 나노스트링 테크놀로지스, 인크. 화학적 조성물 및 이것을 사용하는 방법
CN108387435B (zh) * 2018-01-30 2020-09-15 中国计量大学 一种痕量丝素蛋白富集方法
AU2019216973A1 (en) 2018-02-12 2020-08-27 Nanostring Technologies, Inc Biomolecular probes and methods of detecting gene and protein expression
EP4317959A3 (en) * 2018-03-19 2024-03-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Microchip capillary electrophoresis assays and reagents
KR20210061962A (ko) 2018-05-14 2021-05-28 나노스트링 테크놀로지스, 인크. 화학 조성물 및 이의 사용 방법
JP2023543049A (ja) 2020-09-28 2023-10-12 メルス ナムローゼ フェンノートシャップ 細胞表面部分の発現又はクラスター化を検出するための方法
CN113567520B (zh) * 2021-07-08 2024-06-07 西北农林科技大学 一种用于痕量蛋白分子精准检测的电化学传感方法

Family Cites Families (138)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2153059A (en) * 1936-02-26 1939-04-04 Gen Aniline Works Inc Chromable dyestuffs of the triarylmethane series and process of preparing them
US2242572A (en) * 1939-06-21 1941-05-20 Gen Aniline & Film Corp Chromable dyestuffs of the triarylmethane series and a process of preparing them
US3932415A (en) * 1972-04-17 1976-01-13 Eastman Kodak Company Pyrylium dyes having a fused rigidized nitrogen-containing ring
US4331590A (en) 1978-03-13 1982-05-25 Miles Laboratories, Inc. β-Galactosyl-umbelliferone-labeled protein and polypeptide conjugates
FR2431581A1 (fr) 1978-07-18 1980-02-15 Soum Rene Systeme d'assemblage de planchers
US4230558A (en) 1978-10-02 1980-10-28 Coulter Electronics, Inc. Single drop separator
US4318846A (en) * 1979-09-07 1982-03-09 Syva Company Novel ether substituted fluorescein polyamino acid compounds as fluorescers and quenchers
US4458066A (en) * 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4973679A (en) * 1981-03-27 1990-11-27 University Patents, Inc. Process for oligonucleo tide synthesis using phosphormidite intermediates
US4415732A (en) * 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
US4650750A (en) 1982-02-01 1987-03-17 Giese Roger W Method of chemical analysis employing molecular release tag compounds
US4709016A (en) 1982-02-01 1987-11-24 Northeastern University Molecular analytical release tags and their use in chemical analysis
US5516931A (en) 1982-02-01 1996-05-14 Northeastern University Release tag compounds producing ketone signal groups
US5650270A (en) * 1982-02-01 1997-07-22 Northeastern University Molecular analytical release tags and their use in chemical analysis
DE3329892A1 (de) * 1983-08-18 1985-03-07 Köster, Hubert, Prof. Dr., 2000 Hamburg Verfahren zur herstellung von oligonucleotiden
US4562248A (en) 1983-11-25 1985-12-31 Eastman Kodak Company Azo dyes from unsubstituted or substituted 3-amino-pyridine and aryl or heterocyclic couplers
GB8407736D0 (en) 1984-03-26 1984-05-02 Univ London Detecting specific polynucleotide sequences
US4675300A (en) 1985-09-18 1987-06-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Laser-excitation fluorescence detection electrokinetic separation
US4780421A (en) 1986-04-03 1988-10-25 Sclavo Inc. Cleavable labels for use in binding assays
FR2596761B1 (fr) 1986-04-08 1988-05-20 Commissariat Energie Atomique Derives de nucleosides et leur utilisation pour la synthese d'oligonucleotides
US4811218A (en) * 1986-06-02 1989-03-07 Applied Biosystems, Inc. Real time scanning electrophoresis apparatus for DNA sequencing
US5494793A (en) 1986-12-15 1996-02-27 British Technology Group Usa Inc. Monomeric phthalocyanine reagents
JPS641949A (en) * 1987-06-24 1989-01-06 Hitachi Ltd Regeneration of electrophoretic gel
US4894348A (en) * 1987-07-01 1990-01-16 Ronald Robert C Fluorescein-conjugated proteins with enhanced fluorescence
US5057301A (en) * 1988-04-06 1991-10-15 Neorx Corporation Modified cellular substrates used as linkers for increased cell retention of diagnostic and therapeutic agents
WO1989012232A1 (en) 1988-06-08 1989-12-14 London Diagnostics, Inc. Assays utilizing sensitizer-induced production of detectable signals
NL8801826A (nl) * 1988-07-19 1990-02-16 Tno Werkwijze voor het detecteren van mutaties in markergenen.
US4997928A (en) * 1988-09-15 1991-03-05 E. I. Du Pont De Nemours And Company Fluorescent reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5571666A (en) 1988-10-28 1996-11-05 Oklahoma Medical Research Foundation Thiazine dyes used to inactivate HIV in biological fluids
US5064104A (en) * 1988-10-28 1991-11-12 Milancolimited, Inc. Apparatus for vending a product
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5654442A (en) * 1989-11-14 1997-08-05 The Perkin-Elmer Corporation 4,7-dichlorofluorescein dyes as molecular probes
US5274240A (en) 1990-01-12 1993-12-28 The Regents Of The University Of California Capillary array confocal fluorescence scanner and method
US5091652A (en) * 1990-01-12 1992-02-25 The Regents Of The University Of California Laser excited confocal microscope fluorescence scanner and method
WO1991011521A1 (en) * 1990-01-26 1991-08-08 La Jolla Cancer Research Foundation Polypeptides encoding transcriptional activators and uses thereof
IE66205B1 (en) 1990-06-14 1995-12-13 Paul A Bartlett Polypeptide analogs
US5650489A (en) 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
EP0484027B1 (en) 1990-11-02 1996-12-18 Zeneca Limited Polysubstituted phthalocyanines
US6251581B1 (en) 1991-05-22 2001-06-26 Dade Behring Marburg Gmbh Assay method utilizing induced luminescence
US5578498A (en) 1991-05-22 1996-11-26 Behringwerke Ag Metal chelate containing compositions for use in chemiluminescent assays
US5340716A (en) 1991-06-20 1994-08-23 Snytex (U.S.A.) Inc. Assay method utilizing photoactivated chemiluminescent label
US5846717A (en) 1996-01-24 1998-12-08 Third Wave Technologies, Inc. Detection of nucleic acid sequences by invader-directed cleavage
CA2118806A1 (en) 1991-09-18 1993-04-01 William J. Dower Method of synthesizing diverse collections of oligomers
US5254468A (en) * 1991-10-31 1993-10-19 The University Of Toledo Bilayer pellet containing immobilized xylose isomerase and urease for the simultaneous isomerization and fermentation of xylose to ethanol
US5843680A (en) 1992-01-31 1998-12-01 Biometric Imaging, Inc. Differential separation assay methods and test kits
US5137609A (en) 1992-01-31 1992-08-11 Biometric Imaging Inc. Differential separation assay
JP3130629B2 (ja) 1992-03-13 2001-01-31 オリンパス光学工業株式会社 電気泳動における分画処理方法
DE69207580T2 (de) 1992-03-23 1996-08-08 Hoffmann La Roche Verfahren zum DNS-Nachweis
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
DE69322266T2 (de) 1992-04-03 1999-06-02 Perkin Elmer Corp Proben zusammensetzung und verfahren
US5470705A (en) 1992-04-03 1995-11-28 Applied Biosystems, Inc. Probe composition containing a binding domain and polymer chain and methods of use
CA2141451C (en) 1992-07-31 2003-10-07 John S. Pease Photoactivatable chemiluminescent matrices
JP3207933B2 (ja) * 1992-09-09 2001-09-10 株式会社ヤトロン アクリジニウム誘導体の発光方法及びそれを用いた検査対象物質の検出方法
US5288514A (en) * 1992-09-14 1994-02-22 The Regents Of The University Of California Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support
US5958202A (en) 1992-09-14 1999-09-28 Perseptive Biosystems, Inc. Capillary electrophoresis enzyme immunoassay
US5721099A (en) 1992-10-01 1998-02-24 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5565324A (en) 1992-10-01 1996-10-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5719028A (en) 1992-12-07 1998-02-17 Third Wave Technologies Inc. Cleavase fragment length polymorphism
US5374527A (en) 1993-01-21 1994-12-20 Applied Biosystems, Inc. High resolution DNA sequencing method using low viscosity medium
US5324401A (en) 1993-02-05 1994-06-28 Iowa State University Research Foundation, Inc. Multiplexed fluorescence detector system for capillary electrophoresis
US6087186A (en) 1993-07-16 2000-07-11 Irori Methods and apparatus for synthesizing labeled combinatorial chemistry libraries
US5635602A (en) 1993-08-13 1997-06-03 The Regents Of The University Of California Design and synthesis of bispecific DNA-antibody conjugates
WO1995006877A1 (en) 1993-09-03 1995-03-09 Behringwerke Ag Fluorescent oxygen channeling immunoassays
CN1154640C (zh) 1993-10-01 2004-06-23 纽约市哥伦比亚大学理事 用标示物编码的多元组合化学库
US5503994A (en) * 1993-10-08 1996-04-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University System for sample detection with compensation for difference in sensitivity to detection of components moving at different velocities
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
WO1995016910A1 (en) 1993-12-17 1995-06-22 Perkin-Elmer Corporation Uncharged polymers for separation of biomolecules by capillary electrophoresis
US5571680A (en) 1994-01-21 1996-11-05 Beckman Instruments, Inc. Homogeneous immunoassays and enzyme based assays of analytes using capillary electrophoresis
US5623055A (en) * 1994-01-28 1997-04-22 Prolinx, Inc. Phenylboronic acid complexes derived from aminosalicylic acid for bioconjugate preparation
US5543026A (en) * 1994-02-07 1996-08-06 The Perkin-Elmer Corporation Real-time scanning fluorescence electrophoresis apparatus for the analysis of polynucleotide fragments
US5851770A (en) 1994-04-25 1998-12-22 Variagenics, Inc. Detection of mismatches by resolvase cleavage using a magnetic bead support
US5986076A (en) 1994-05-11 1999-11-16 Trustees Of Boston University Photocleavable agents and conjugates for the detection and isolation of biomolecules
US6045995A (en) 1994-08-24 2000-04-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Capillary electrophoretic detection of nucleic acids
US5843666A (en) 1994-09-02 1998-12-01 Lumigen, Inc. Chemiluminescent detection methods using dual enzyer-labeled binding partners
US5691151A (en) 1994-10-07 1997-11-25 Regents Of University Of California Methods of screening for ulcerative colitis and crohn's disease by detecting VH3-15 autoantibody and panca
US5560811A (en) 1995-03-21 1996-10-01 Seurat Analytical Systems Incorporated Capillary electrophoresis apparatus and method
AU5438796A (en) 1995-04-06 1996-10-23 Arqule, Inc. Method for rapid purification, analysis and characterization of collections of chemical compounds
US5591422A (en) 1995-06-02 1997-01-07 Pharmacyclics, Inc. Texaphyrin complexes having improved functionalization
US5843655A (en) 1995-09-18 1998-12-01 Affymetrix, Inc. Methods for testing oligonucleotide arrays
SE9503991D0 (sv) 1995-11-10 1995-11-10 Pharmacia Biotech Ab Method and apparatus for determining the existence of a mutation
US5846839A (en) 1995-12-22 1998-12-08 Glaxo Group Limited Methods for hard-tagging an encoded synthetic library
US6312893B1 (en) 1996-01-23 2001-11-06 Qiagen Genomics, Inc. Methods and compositions for determining the sequence of nucleic acid molecules
PT840804E (pt) 1996-01-23 2000-10-31 Qiagen Genomics Inc Metodos e composicoes para a analise de moleculas de acidos nocleicos usando tecnicas de separacao por dimensoes
DE69700902T2 (de) 1996-01-23 2000-07-20 Rapigene Inc Verfahren zur erkennung von ligandenpaar bindung mit erhöter empfindlichkeit
US6027890A (en) * 1996-01-23 2000-02-22 Rapigene, Inc. Methods and compositions for enhancing sensitivity in the analysis of biological-based assays
US5804400A (en) 1996-02-05 1998-09-08 Igen International, Inc. Electrochemiluminescent assay
US6090947A (en) 1996-02-26 2000-07-18 California Institute Of Technology Method for the synthesis of pyrrole and imidazole carboxamides on a solid support
US5945526A (en) * 1996-05-03 1999-08-31 Perkin-Elmer Corporation Energy transfer dyes with enhanced fluorescence
US5800996A (en) * 1996-05-03 1998-09-01 The Perkin Elmer Corporation Energy transfer dyes with enchanced fluorescence
US5863727A (en) 1996-05-03 1999-01-26 The Perkin-Elmer Corporation Energy transfer dyes with enhanced fluorescence
US5811239A (en) 1996-05-13 1998-09-22 Frayne Consultants Method for single base-pair DNA sequence variation detection
NZ333907A (en) * 1996-07-08 2000-09-29 Burstein Lab Inc Cleavable optically detectable elements on substrate for microanalysis of chemical species
US6780982B2 (en) 1996-07-12 2004-08-24 Third Wave Technologies, Inc. Charge tags and the separation of nucleic acid molecules
US5998140A (en) 1996-07-31 1999-12-07 The Scripps Research Institute Complex formation between dsDNA and oligomer of cyclic heterocycles
US5831046A (en) * 1996-08-05 1998-11-03 Prolinx, Incorporated Boronic acid-contaning nucleic acid monomers
US6045676A (en) 1996-08-26 2000-04-04 The Board Of Regents Of The University Of California Electrochemical detector integrated on microfabricated capilliary electrophoresis chips
US5763602A (en) 1996-10-01 1998-06-09 Li; Ying-Syi Methods of syntheses of phthalocyanine compounds
US5894878A (en) 1996-10-04 1999-04-20 Morgan; Spencer T. Protective and decorative computer cover
FI963989A (fi) 1996-10-04 1998-04-05 Wallac Oy Homogeenisiä määritysmenetelmiä, jotka perustuvat luminesenssienergiasiirtoon
US6245937B1 (en) * 1996-11-29 2001-06-12 Dupont Pharmaceuticals Research Laboratories, Inc. Liquid phase parallel synthesis of chemical libraries
US5856107A (en) 1997-02-04 1999-01-05 Trega Biosciences, Inc. Combinatorial libraries of imidazol-pyrido-indole and imidazol-pyrido-benzothiophene derivatives, methods of making the libraries and compounds therein
CN1270598A (zh) 1997-07-22 2000-10-18 拉普吉恩公司 用于质谱分析核酸的方法和组合物
AU9381598A (en) 1997-09-10 1999-03-29 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Method of amplifying dna and rna mismatch cleavage products
US6008379A (en) 1997-10-01 1999-12-28 The Perkin-Elmer Corporation Aromatic-substituted xanthene dyes
US5952654A (en) 1997-10-29 1999-09-14 Northeastern University Field-release mass spectrometry
US6562567B2 (en) * 1998-01-27 2003-05-13 California Institute Of Technology Method of detecting a nucleic acid
WO1999042838A1 (en) 1998-02-18 1999-08-26 Dade Behring Inc. Chemiluminescent compositions for use in detection of multiple analytes
US6740497B2 (en) 1998-03-06 2004-05-25 The Regents Of The University Of California Method and apparatus for detecting cancerous cells using molecules that change electrophoretic mobility
US6335201B1 (en) 1998-03-06 2002-01-01 The Regents Of The University Of California Method and apparatus for detecting enzymatic activity using molecules that change electrophoretic mobility
WO1999046574A2 (en) * 1998-03-11 1999-09-16 The Wistar Institute Antibodies for assessing protein post-translational modification status and methods of making and using the same
EP1066414B1 (en) 1998-03-25 2009-06-10 Olink AB Rolling circle replication of padlock probes
GB9812596D0 (en) 1998-06-11 1998-08-12 Amersham Pharm Biotech Uk Ltd Energy transfer assay method
US6017769A (en) * 1998-06-17 2000-01-25 Lumigen, Inc. Non-enzymatic methods of generating chemiluminescence from acridan alkenes
US6821402B1 (en) 1998-09-16 2004-11-23 Applera Corporation Spectral calibration of fluorescent polynucleotide separation apparatus
US6013783A (en) * 1999-03-19 2000-01-11 Prolinx Incorporated Boronic acid containing oligonucleotides and polynucleotides
WO2000056925A2 (en) 1999-03-19 2000-09-28 Aclara Biosciences, Inc. Methods for single nucleotide polymorphism detection
US6322980B1 (en) 1999-04-30 2001-11-27 Aclara Biosciences, Inc. Single nucleotide detection using degradation of a fluorescent sequence
US6627400B1 (en) * 1999-04-30 2003-09-30 Aclara Biosciences, Inc. Multiplexed measurement of membrane protein populations
US6649351B2 (en) * 1999-04-30 2003-11-18 Aclara Biosciences, Inc. Methods for detecting a plurality of analytes by mass spectrometry
US20020142329A1 (en) * 1999-04-30 2002-10-03 Aclara Biosciences, Inc. Compositions and methods employing cleavable electrophoretic tag reagents
US6673550B2 (en) * 1999-04-30 2004-01-06 Aclara Biosciences, Inc. Electrophoretic tag reagents comprising fluorescent compounds
US6142162A (en) 1999-06-18 2000-11-07 Odoreyes Technology, Inc. System and method for odorizing natural gas
US6331530B1 (en) 1999-07-13 2001-12-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Hydrophilic carrier for photosensitizers that cleaves when they catalyze the formation of singlet oxygen
US6191278B1 (en) * 1999-11-03 2001-02-20 Pe Corporation Water-soluble rhodamine dyes and conjugates thereof
US6372907B1 (en) * 1999-11-03 2002-04-16 Apptera Corporation Water-soluble rhodamine dye peptide conjugates
US7306904B2 (en) 2000-02-18 2007-12-11 Olink Ab Methods and kits for proximity probing
WO2001096607A2 (en) * 2000-06-13 2001-12-20 The Trustees Of Boston University Use of nucleotide analogs in the analysis of oligonucleotide mixtures and in highly multiplexed nucleic acid sequencing
WO2002029109A2 (en) 2000-10-05 2002-04-11 Aclara Biosciences, Inc. Multiplexed differential displacement for nucleic acid determinations
CA2425663C (en) 2000-10-11 2009-12-29 Applera Corporation Fluorescent nucleobase conjugates having anionic linkers
US6468338B1 (en) * 2000-10-12 2002-10-22 Eastman Kodak Company Dye for ink jet ink
US6743905B2 (en) 2001-04-16 2004-06-01 Applera Corporation Mobility-modified nucleobase polymers and methods of using same
AU2002305658A1 (en) * 2001-05-21 2002-12-03 Aclara Biosciences, Inc. Analyzing phosphorylated proteins
AU2002310012A1 (en) 2001-05-21 2002-12-03 Monogram Biosciences, Inc. Methods and compositions for analyzing proteins
WO2002097112A2 (en) 2001-05-26 2002-12-05 Aclara Biosciences, Inc. Catalytic amplification of multiplexed assay signals
US6949347B2 (en) 2002-03-05 2005-09-27 Aclara Biosciences, Inc. Multiplex analysis using membrane-bound sensitizers
US20040229380A1 (en) 2002-05-21 2004-11-18 Po-Ying Chan-Hui ErbB heterodimers as biomarkers
KR20050025669A (ko) 2002-07-25 2005-03-14 아클라라 바이오사이언시스 인코퍼레이티드 수용체 올리고머화의 검출
JP2006508907A (ja) * 2002-07-26 2006-03-16 アクララ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 親油性電気泳動プローブ

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180129742A (ko) 2016-10-14 2018-12-05 창원대학교 산학협력단 전자전달해리(etd) 질량분석을 이용한 단백질의 정량분석법

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