CN111693500B - 一种基于时间分辨光谱测量实现单态氧量子产率监测的方法 - Google Patents

Abstract

一种基于时间分辨光谱测量实现单态氧量子产率监测的方法，本发明涉及一种基于时间分辨光谱测量实现单态氧量子产率监测的方法。本发明的目的是为了解决现有的Φ_Δ的监测方法误差大、方法复杂以及对检测设备要求高的问题，本发明通过分析Gd³⁺修饰的光敏剂与O₂产生单线态氧的光物理化学过程，从而获得Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处的磷光寿命与单态氧量子产率的物理关系。本发明提供了一种临床测量单态氧量子产率的技术，所使用的测试方法简单，响应快，灵敏度高，有效避免了外界环境改变所带来的影响。本发明应用于单线态氧量子产率检测领域。

Description

一种基于时间分辨光谱测量实现单态氧量子产率监测的方法

技术领域

本发明涉及一种基于时间分辨光谱测量实现单态氧量子产率监测的方法。

背景技术

光动力疗法是利用光激发化学反应从而达到使得细胞凋亡或坏死目的的疾病治疗方法。将光敏剂注射到人体内，经过代谢，光敏剂会选择性聚集到病灶部位，再经过外源性光照射，光敏剂将会通过两种方式作用于病变部位，第一是与病灶部位氧分子发生能量转化，从而使基态氧分子变为单重激发态(¹O₂)。处于单重激发态的氧分子具有生物毒性，可使细胞凋亡或坏死，从而可以达到治疗疾病的目的。第二种方式为光敏剂与生物大分子发生作用，产生自由基，从而杀伤病变细胞。在光动力疗法中，第一种方式被认为是最主要的治疗原理。目前，应用此方法可实现对皮肤病，癌症以及口腔等多种疾病的治疗与手术或术后辅助治疗。相比于传统的治疗方法，如手术，放疗化疗等，使用光动力疗法进行疾病治疗具有副作用小，微创，选择性好等优点。光动力疗法的治疗效果通常用一个物理量来表示—单态氧量子产率(Φ_Δ)。在光动力疗法中，氧这一因素对光动力疗法的治疗结果具有举足轻重的影响，组织中的氧含量会随着治疗过程中的消耗而变得匮乏，当不足以支持光动力治疗过程中所需的氧含量时，治疗效果将会大打折扣，并且治疗结果变得不可控，从而导致Φ_Δ改变。为了能够实时监测反应效果，需要对Φ_Δ进行实时的监测。而监测手段需要能够满足稳定，成熟，可应用于临床等特点。

目前Φ_Δ的监测分为直接法和间接法。直接法为通过测量¹O₂的发光，从而获得Φ_Δ的目的，此种方法被认为是Φ_Δ检测的“金标准”。但目前检测设备灵敏度有限，因此¹O₂发光检测依然无法达到标准，此方法目前还需开发。而间接法是利用不同类型的¹O₂化学捕获剂作为间接检测的探针，通过检测化学捕获剂光物理和化学特性的改变，间接反映¹O₂的存在。目前化学探针主要有EPR探针、吸光度探针、化学探针和荧光探针。EPR探针检测¹O₂的原理为检测EPR自旋捕获剂与¹O₂反映后EPR信号的变化，此探针选择性好，灵敏度高，但是EPR探针的本地干扰较强，在许多情况下会造成信号的失真，并且仪器昂贵，分析过程相对复杂，这些不利的因素限制了该方法的推广应用。吸光度探针通过测定探针在与¹O₂反应后特定波长处吸光度的变化来反映¹O₂的产量。利用吸光度探针来测定Φ_Δ的方法称为对比法，此方法步骤繁琐，操作复杂，并且这种探针水溶性和稳定性差，灵敏度较低，无法应用于临床检测Φ_Δ，只可以用于实验室对药物产生单态氧能力的检测。化学发光探针与¹O₂反应后生成能量较高的化合物，这些产物生成后迅速分解并以光的形式释放能量，检测后来反映¹O₂生成水平，此种方法选择性好，但水溶性差。荧光探针与¹O₂发生化学反应前后荧光特征峰强度的变化来评估光敏化¹O₂的产量。灵敏度高，选择性好，但无法进行定量分析。因此仅用于细胞水平。目前没有临床中可靠的Φ_Δ监测方法。综上所述，利用直接检测法获得Φ_Δ，需要测量¹O₂的发光，由于¹O₂的发光效率较低，并且很难捕捉，因此对测量设备要求较高，目前所存在的测量设备对¹O₂发光捕获效率低，无法实现¹O₂的高灵敏度准确检测，并且发光的测量受许多因素影响，如激发光强度，几何条件等，因此想要应用此方法获得临床PDT实施过程中的Φ_Δ还需要进一步探索。利用间接测量法获得(Φ_Δ)，即应用一些具有与¹O₂结合后性能改变的探针，通过测量其特定性质的改变量来测量Φ_Δ，探针包括EPR探针，吸光度探针，化学发光探针，荧光探针。其中最适合临床检测的为化学发光探针，此类探针捕获¹O₂灵敏度高，便于检测，并且发光探针已被认为无生物毒性，成分安全。但此类探针合成步骤复杂，难以重复制备，并且注射到人体内，也会使得治疗环境变得复杂多变。因此，此方法多用于实验室检测¹O₂的产量以及Φ_Δ的水平。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有的Φ_Δ的监测方法误差大、方法复杂以及对检测设备要求高的问题，提供一种基于时间分辨光谱测量实现单态氧量子产率监测的方法。

一方面，本发明一种基于时间分辨光谱测量实现单态氧量子产率监测的方法，按以下步骤进行：

一、制备Gd³⁺修饰的光敏剂材料，所述Gd³⁺修饰的光敏剂材料为钆掺杂血卟啉单甲醚Gd-HMME；

二、建立如下公式：

三重态量子产率Φ_T的公式：

单态氧量子产率Φ_Δ的公式：

Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处的磷光寿命τ_p的公式：

将公式(3)带入公式(2)中，可得Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处的磷光寿命τ_p与单态氧量子产率Φ_Δ的理论方程：

Φ_Δ＝Φ_T-Φ_Tτ_p(k_p+k_np) (4)；

其中，k_F为处于S₁态的Gd³⁺修饰的光敏剂分子通过辐射弛豫产生荧光回落至基态的弛豫速率；k_nF为处于S₁态的Gd³⁺修饰的光敏剂分子通过无辐射弛豫回落至基态的弛豫速率；k_ISC为处于S₁态的Gd³修饰的光敏剂分子通过系间窜跃跃迁到三重激发态T₁的弛豫速率；k_p为处于三重激发态T₁的Gd³⁺修饰的光敏剂通过辐射弛豫发射磷光跃迁至基态的弛豫速率；k_np为处于三重激发态T₁的Gd³⁺修饰的光敏剂通过无辐射弛豫过程回到基态的弛豫速率；k_q为处于三重激发态T₁的Gd³⁺修饰的光敏剂与氧分子发生碰撞回落至基态的弛豫速率；Φ_Δ为单态氧量子产率；τ_p为Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处的磷光寿命；Φ_T为三重态量子产率；[O₂]为氧浓度；

三、Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处的磷光寿命与单态氧量子产率理论方程中参数的获得：

通过测量不同氧浓度[O₂]下Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处的磷光寿命τ_p，再依据公式k_p+k_np+k_q[O₂]＝τ_p ^-1，即能获得k_p+k_np的数值和k_q的数值；k_p+k_np的数值为0.018μs^-1，k_q的数值为0.0002μs·μM^-1；

三重态量子产率Φ_T是依据公式(2)获得的：将k_p+k_np的数值、k_q的数值以及不同氧浓度下测得的单态氧量子产率Φ_Δ代入上述公式(2)中，即可获得三重态量子产率Φ_T的数值为0.81；

其中，所述的氧浓度的测定方法为：将充满Gd³⁺修饰的光敏剂溶液的3ml石英比色皿与一个容量为100ml装有同种样品的烧杯一起放入一个密闭容器内，然后将密闭容器与氮气和氧气相通，密闭容器内的氧浓度调节是通过调节两个分别与氮气和氧气相连的质量流量计来完成，改变质量流量计的配比，实现对密闭容器内氧浓度的控制，通过充分的氧交换，石英比色皿与烧杯中Gd³⁺修饰的光敏剂溶液的氧浓度稳定，烧杯中放置的溶氧仪显示的数值稳定时，所读取的溶氧量即为石英比色皿内Gd³⁺修饰的光敏剂溶液中的氧浓度；

所述的不同氧浓度下单态氧量子产率Φ_Δ用对比法测得，具体方法为：利用虎红作为对比试剂，DPBF作为单态氧捕获剂，根据关系式Φ_Δ ^stdI_abs ^std/k^std＝Φ_ΔI_abs/k进行计算得到Φ_Δ，其中“std”代表虎红，Φ_Δ ^std为虎红的单态氧量子产率，I_abs ^std为虎红对于激发光的吸收，k^std为虎红和DPBF混合溶液中DPBF的衰减速率，I_abs为Gd³⁺修饰的光敏剂对于激发光的吸收，k为Gd³⁺修饰的光敏剂和DPBF混合溶液中DPBF的衰减速率；

I_abs ^std和I_abs的获得方法为：利用氘灯作为光源，通过透镜将其调节为平行光，分别将装有虎红溶液和Gd³⁺修饰的光敏剂溶液的石英比色皿置于平行光前，利用光纤光谱仪收集透过样品的光，连接电脑后记录下光谱数据，基于比尔朗博定律，得到I_abs ^std和I_abs；

利用532nm激光作为激发光源，调节将其变为平行光束，分别照射在装有DPBF与Gd³⁺修饰的光敏剂的混合溶液的石英比色皿、装有DPBF与虎红的混合溶液的石英比色皿，利用光纤光谱仪接收透过比色皿的光，将光谱显示在电脑中，得到不同光照时间下DPBF与虎红的混合溶液、DPBF与Gd³⁺修饰的光敏剂的混合溶液中DPBF的吸收光谱，其410nm处吸收峰强度随光照时间的变化由如下公式表示：ln([I_DPBF]₀/[I_DPBF])＝kt，t为光照时间，从而即可获得不同混合溶液中的DPBF衰减速率k；由此，测得不同氧浓度下的单态氧量子产率Φ_Δ，代入公式(2)中，得到三重态量子产率Φ_T的数值；

所述的Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处磷光寿命τ_p的测量方法为：

用二极管激光控制器调制405nm激光，输出为方波，照射在Gd³⁺修饰的光敏剂样品上，样品所发出的光被光栅光谱仪接收，光栅光谱仪定位接收样品712nm处的磷光，经过光电倍增管放大后的信号被发送至数字荧光示波器进行平均，最终，通过e指数拟合所得时间分辨信号，获得Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处的磷光寿命τ_p；

四、将步骤三得到的k_p+k_np和Φ_T的数值代入公式(4)中，建立了Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处的磷光寿命τ_p与单态氧量子产率Φ_Δ之间的关系，在需要测量单态氧量子产率时，通过测量Gd³⁺修饰的光敏剂在712nm处的磷光寿命τ_p，即可得到单态氧量子产率Φ_Δ；

其中，利用溶剂热法制备所述钆掺杂血卟啉单甲醚Gd-HMME，具体步骤为：将溶剂咪唑、血卟啉单甲醚HMME和Gd-Cl₃混合，然后加入到三颈瓶中，在氩气保护下，200℃加热搅拌两个小时，然后冷却至室温，再放入甲醇中充分溶解，即完成；所述溶剂咪唑、血卟啉单甲醚HMME和Gd-Cl₃的质量比为6000：12：60。

另一方面，本发明一种基于时间分辨光谱测量实现单态氧量子产率监测的方法，按以下步骤进行：

一、制备Gd³⁺修饰的光敏剂材料，所述Gd³⁺修饰的光敏剂材料为钆掺杂华卟啉钠Gd-DVDMS；

二、建立如下公式：

三重态量子产率Φ_T的公式：

单态氧量子产率Φ_Δ的公式：

Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处的磷光寿命τ_p的公式：

将公式(3)带入公式(2)中，可得Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处的磷光寿命τ_p与单态氧量子产率Φ_Δ的理论方程：

Φ_Δ＝Φ_T-Φ_Tτ_p(k_p+k_np) (4)；

其中，k_F为处于S₁态的Gd³⁺修饰的光敏剂分子通过辐射弛豫产生荧光回落至基态的弛豫速率；k_nF为处于S₁态的Gd³⁺修饰的光敏剂分子通过无辐射弛豫回落至基态的弛豫速率；k_ISC为处于S₁态的Gd³修饰的光敏剂分子通过系间窜跃跃迁到三重激发态T₁的弛豫速率；k_p为处于三重激发态T₁的Gd³⁺修饰的光敏剂通过辐射弛豫发射磷光跃迁至基态的弛豫速率；k_np为处于三重激发态T₁的Gd³⁺修饰的光敏剂通过无辐射弛豫过程回到基态的弛豫速率；k_q为处于三重激发态T₁的Gd³⁺修饰的光敏剂与氧分子发生碰撞回落至基态的弛豫速率；Φ_Δ为单态氧量子产率；τ_p为Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处的磷光寿命；Φ_T为三重态量子产率；[O₂]为氧浓度；

三、Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处的磷光寿命与单态氧量子产率理论方程中参数的获得：

通过测量不同氧浓度[O₂]下Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处的磷光寿命τ_p，再依据公式k_p+k_np+k_q[O₂]＝τ_p ^-1，即能获得k_p+k_np的数值和k_q的数值；k_p+k_np的数值为0.012μs^-1，k_q的数值为0.0013μs·μM^-1；

三重态量子产率Φ_T是依据公式(2)获得的，将k_p+k_np的数值、k_q的数值以及测得不同氧浓度的Φ_Δ代入上述公式，即可获得三重态量子产率Φ_T的数值为0.95；

其中，所述的氧浓度的测定方法为：将充满Gd³⁺修饰的光敏剂溶液的3ml石英比色皿与一个容量为100ml装有同种样品的烧杯一起放入一个密闭容器内，然后将密闭容器与氮气和氧气相通，密闭容器内的氧浓度调节是通过调节两个分别与氮气和氧气相连的质量流量计来完成，改变质量流量计的配比，实现对密闭容器内氧浓度的控制，通过充分的氧交换，石英比色皿与烧杯中Gd³⁺修饰的光敏剂溶液的氧浓度稳定，烧杯中放置的溶氧仪显示的数值稳定时，所读取的溶氧量即为石英比色皿内Gd³⁺修饰的光敏剂溶液中的氧浓度；

所述的不同氧浓度下单态氧量子产率Φ_Δ用对比法测得，具体方法为：利用虎红作为对比试剂，DPBF作为单态氧捕获剂，根据关系式Φ_Δ ^stdI_abs ^std/k^std＝Φ_ΔI_abs/k进行计算得到Φ_Δ，其中“std”代表虎红，Φ_Δ ^std为虎红的单态氧量子产率，I_abs ^std为虎红对于激发光的吸收，k^std为虎红和DPBF混合溶液中DPBF的衰减速率，I_abs为Gd³⁺修饰的光敏剂对于激发光的吸收，k为Gd³⁺修饰的光敏剂和DPBF混合溶液中DPBF的衰减速率；

I_abs ^std和I_abs的获得方法为：利用氘灯作为光源，通过透镜将其调节为平行光，分别将装有虎红溶液和Gd³⁺修饰的光敏剂溶液的石英比色皿置于平行光前，利用光纤光谱仪收集透过样品的光，连接电脑后记录下光谱数据，基于比尔朗博定律，得到I_abs ^std和I_abs；

利用532nm激光作为激发光源，调节将其变为平行光束分别照射在装有DPBF与Gd³⁺修饰的光敏剂的混合溶液的石英比色皿、装有DPBF与虎红的混合溶液的石英比色皿，利用光纤光谱仪接收透过比色皿的光，将光谱显示在电脑中，得到不同光照时间下DPBF与虎红的混合溶液、DPBF与Gd³⁺修饰的光敏剂的混合溶液中DPBF的吸收光谱，其410nm处吸收峰强度随光照时间的变化由如下公式表示：ln([I_DPBF]₀/[I_DPBF])＝kt，t为光照时间，从而即可获得不同混合溶液中的DPBF衰减速率k；由此，测得不同氧浓度下的单态氧量子产率Φ_Δ，代入公式(2)中，得到三重态量子产率Φ_T的数值；

所述的Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处磷光寿命τ_p的测量方法：

用二极管激光控制器调制405nm激光，输出为方波，照射在Gd³⁺修饰的光敏剂样品上，样品所发出的光被光栅光谱仪接收，光栅光谱仪定位接收样品712nm处的磷光，经过光电倍增管放大后的信号被发送至数字荧光示波器进行平均，最终，通过e指数拟合所得时间分辨信号，获得Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处的磷光寿命τ_p；

四、将步骤三得到的k_p+k_np和Φ_T的数值代入公式(4)中，建立了Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处的磷光寿命τ_p与单态氧量子产率Φ_Δ之间的关系，在需要测量单态氧量子产率时，通过测量Gd³⁺修饰的光敏剂在712nm处的磷光寿命τ_p，即可得到单态氧量子产率Φ_Δ；

其中，利用溶剂热法制备钆掺杂华卟啉钠Gd-DVDMS，具体步骤为：将溶剂咪唑、华卟啉钠DVDMS和Gd-Cl₃混合，然后加入到三颈瓶中，在氩气保护下，200℃加热搅拌两个小时，然后冷却至室温，再放入甲醇中充分溶解，即完成；所述溶剂咪唑、华卟啉钠DVDMS和Gd-Cl₃的质量比为6000：12：53。

血卟啉单甲醚(HMME)是一种纯化的单体卟啉，较第一代光敏剂血卟啉衍生物(hematoporphyrinderivative,HpD)具有成分单一、组成稳定、组织选择性好、易被血管内皮吸收、光漂白速率高及治疗后的避光时间短等显著优点。华卟啉钠(DVDMS)同样为卟啉类光敏剂，自2012年8月29日获中国知识产权局颁发的专利证书。它的诞生是由方启程等人利用高效液相色谱法对photofrin类光敏剂进行分离和结构鉴定，分离出其中光敏活性很强的有效部分。已有研究证明其有效成分不低于98％，具有明确的有效成分化学结构，治疗后要求更短的避光时间(仅3天)，由于其较高的光敏活性，因此治疗中所用剂量较小，经济安全。将钆(Gd)掺杂入HMME或DVDMS中，打破了HMME与DVDMS的三重态到基态的跃迁禁阻，使其能够发射磷光。¹O₂的产生也是源于Gd-HMME或Gd-DVDMS三重态向基态的辐射跃迁从而将能量传递给周围存在的O₂分子，使得O₂分子受激发成为具有活性的¹O₂。可以看出磷光的产生与¹O₂产生过程均来源于Gd-HMME或Gd-DVDMS三重态的辐射跃迁，两者存在竞争关系，如图1和6所示，氧浓度的改变会导致Gd-HMME和Gd-DVDMS磷光强度发生改变，氧浓度增加，用来传递给氧分子产生¹O₂的三重态粒子增多，从而使得磷光通道被削弱，磷光强度减弱。磷光的变化可以间接反映出¹O₂的产生效果，因此可以通过测量磷光时间分辨光谱间接监测Φ_Δ的水平。除此之外，Gd-HMME以及Gd-DVDMS被证实也具有光敏性，Gd具有顺磁性，使得Gd-HMME与Gd-DVDMS可以通过核磁共振成像观测到Gd-HMME与Gd-DVDMS作为光敏剂的分布，因此，Gd-HMME与Gd-DVDMS可以同时具备治疗，观测，测量等多功能，简化了治疗环境。

本发明通过简单修饰光敏剂，使其具有磷光发射，基于Gd³⁺修饰的光敏剂与氧之间相互作用的光物理化学反应过程，理论上建立Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处磷光寿命与Φ_Δ之间的关系，从而通过测量Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处的时间分辨光谱与Φ_Δ，得到建立关系所需获得的必要参数，最终确定Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处磷光寿命与Φ_Δ的具体关系。

本发明的有益效果：

1、本发明材料制备工艺安全简便，无需昂贵设备，重现性好。

2、本发明首次提出了利用时间分辨光谱测量实现单态氧量子产率的监测方法。

3、本发明所使用的测试方法简单，响应快，灵敏度高，有效避免了外界环境改变所带来的影响，误差小。

附图说明

图1为Gd-HMME在不同氧浓度下的光致发光光谱；其中a为25.85mg/L，b为32.45mg/L；

图2为光敏剂敏化基态氧分子产生单态氧的光物理和光化学过程图；

图3为不同氧浓度下Gd-HMME712nm处的磷光寿命；

图4为不同光照时间下Gd-HMME溶液中DPBF的吸收光谱；其中曲线1为0min，曲线2为1min，曲线3为2min，曲线4为3min，曲线5为4min；

图5为不同氧浓度下Gd-HMME的单态氧量子产率；

图6为不同氧浓度下Gd-DVDMS的光致发光光谱；其中a为0mg/L，b为7mg/L。

具体实施方式

通过以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例一：本实施例的基于时间分辨光谱测量实现单态氧量子产率监测的方法，按以下步骤进行：

一、Gd³⁺修饰的光敏剂材料钆掺杂血卟啉单甲醚Gd-HMME的制备。

利用溶剂热法制备钆掺杂血卟啉单甲醚Gd-HMME，咪唑作为溶剂(6g)，与血卟啉单甲醚HMME(12mg)过量Gd-Cl₃(60mg)混合加入到250ml的三颈瓶中，在氩气保护下，200℃加热搅拌两个小时。所得混合物冷却至室温，放入甲醇中溶解，溶解充分后备用。

Gd-HMME在不同氧浓度下的光致发光光谱如图1所示，Gd-HMME的光致发光光谱包含585nm和645nm处的荧光峰以及712和790nm处的磷光峰。由于磷光发射源于三重态辐射跃迁，而Gd-HMME与O₂之间的相互作用同样源于三重态与氧分子之间的能量转换。因此磷光发光会随着氧浓度的变化而发生改变，氧浓度越大，磷光强度越低。

二、基于Gd-HMME，712nm处的磷光寿命与单态氧量子产率理论方程的建立。

光敏剂敏化基态氧分子产生单态氧和单态氧的光物理和光化学过程如图2所示，其中各变量的定义如表1所示。光敏剂吸收光子从基态S₀跃迁到单重激发态S₁，处于S₁态的光敏剂分子有三个去向：通过辐射弛豫产生荧光回落至基态，弛豫速率为k_F；通过无辐射弛豫回落至基态，弛豫速率为k_nF；通过系间窜跃跃迁到三重激发态，弛豫速率为k_ISC。跃迁至三重激发态T₁的光敏剂有三种去向：通过辐射弛豫发射磷光跃迁至基态，弛豫速率为k_p；通过无辐射弛豫过程回到基态，弛豫速率为k_np；与氧分子发生碰撞回落至基态，弛豫速率为k_q。

表1描述光敏剂、氧分子的光物理化学过程变量定义

三重态量子产率表示为公式(1)：

单态氧量子产率表示为公式(2)：

其中k_p+k_np+k_q[O₂]可以通过测量Gd-HMME712nm处的磷光寿命获得，具体依据公式(3)：

将公式(3)带入公式(2)中，可得

Φ_Δ＝Φ_T-Φ_Tτ_p(k_p+k_np) (4)

基于Gd-HMME与O₂之间相互作用的光物理化学反应过程，Gd-HMME712nm处的磷光寿命τ_p与Φ_Δ之间的关系式被定为Φ_Δ＝Φ_T-Φ_Tτ_p(k_p+k_np)。

三、方程中必要参数的获得

通过测量不同氧浓度O₂下的Gd-HMME712nm处的磷光寿命τ_p，再依据公式k_p+k_np+k_q[O₂]＝τ_p ^-1，即能获得k_p+k_np的数值为0.018μs^-1，k_q的数值为0.0002μs·μM^-1；405nm激光被二极管激光控制器所调制，输出为方波。激光照射在样品上，样品所发出的荧光被光栅光谱仪所接收，经过光电倍增管放大后的信号被发送至数字荧光示波器进行平均，最终，我们通过e指数拟合所得时间分辨信号，获得Gd-HMME712nm处的磷光寿命。由于Gd-HMME712nm处的磷光寿命与跃迁几率之间存在如下关系：k_p+k_np+k_q[O₂]＝τ_p ^-1,通过测量不同氧浓度下的Gd-HMME712nm处的磷光寿命，k_p+k_np的数值即可获得；其中氧浓度的测定方法为：将充满Gd-HMME溶液的3ml石英比色皿与一个容量为100ml装有同种样品的烧杯一起放入一个密闭容器，然后容器与氮气和氧气相通，密闭容器内的氧浓度调节是通过调节两个分别与氮气和氧气相连的质量流量计来完成，改变质量流量计的配比，实现对容器内氧浓度的控制，通过充分的氧交换，烧杯中Gd-HMME溶液中的氧浓度稳定，烧杯中放置的溶氧仪显示的数值稳定，所读取的溶氧量为Gd-HMME溶液中的氧浓度。

Φ_T是根据公式(2)获得的，因此，已知k_p+k_np的数值为0.018μs^-1，k_q的数值为0.0002μs·μM^-1的前提下，测得不同氧浓度的Φ_Δ，即可获得Φ_T的数值为0.81；

利用虎红作为对比试剂，DPBF作为单态氧捕获剂。根据关系式Φ_Δ ^stdI_abs ^std/k^std＝Φ_ΔI_abs/k，其中“std”代表虎红，I_abs为试剂对于激发光的吸收，k为DPBF的衰减速率。I_abs的获得技术为利用氘灯作为光源，通过透镜将其调节为平行光，分别将装有虎红和Gd-HMME溶液的石英比色皿置于平行光前，利用光纤光谱仪收集透过样品的光，连接电脑后记录下光谱数据。基于比尔朗博定律，得到虎红与Gd-HMME对激发光的吸收。DPBF光照下的衰减速率的测量技术为利用532nm激光作为激发光源，当照射样品时，会有单线态氧产生，DPBF的浓度会减小，通过测量DPBF的吸收光谱，可以观察到410nm处的吸收峰强度随着光照时间的增加而减小。DPBF的吸收谱测量中，采用氘灯作为光源，通过调节将其变为平行光束照射在装有DPBF与Gd-HMME的混合溶液的石英比色皿，利用光纤光谱仪接收透过比色皿的光，将光谱显示在电脑中，基于以上步骤，得到不同光照时间下DPBF、虎红混合溶液与DPBF、Gd-HMME混合溶液中DPBF的吸收光谱。其410nm处吸收峰强度随光照时间的变化可由如下公式表示：ln([I_DPBF]₀/[I_DPBF])＝kt，不同混合溶液中的DPBF衰减速率k即可获得；由此，测得不同氧浓度下的Φ_Δ，可获得Φ_T的数值为0.81。

不同氧浓度下Gd-HMME712nm处的磷光寿命如图3所示，利用时间分辨光谱对Gd-HMME712nm处磷光进行时间分辨光谱测量，所得数据通过e指数拟合后，即获得Gd-HMME712nm处的磷光寿命数值。测得不同氧浓度下Gd-HMME712nm处的磷光寿命，可获得Gd-HMME三重态不同方式的跃迁几率。

不同光照时间下Gd-HMME溶液中DPBF的吸收光谱如图4所示，有图4可知，532nm光照条件下，在Gd-HMME溶液中DPBF的吸收随光照时间增加而减小。

四、将步骤三得到的k_p+k_np和Φ_T的数值代入公式(4)中，建立了Gd-HMME712nm处磷光寿命与Φ_Δ之间的关系，在需要测量单态氧量子产率时，通过测量Gd-HMME712nm处的磷光寿命，即可得到单态氧量子产率。

实施例二：本实施例的基于时间分辨光谱测量实现单态氧量子产率监测的方法，按以下步骤进行：

一、Gd³⁺修饰的光敏剂材料钆掺杂华卟啉钠Gd-DVDMS的制备。

利用溶剂热法制备钆掺杂华卟啉钠Gd-DVDMS，咪唑作为溶剂(6g)，与华卟啉钠DVDMS(12mg)过量Gd-Cl₃(53mg)混合加入到250ml的三颈瓶中，在氩气保护下，200℃加热搅拌两个小时。所得混合物冷却至室温，放入甲醇中溶解，溶解充分后备用。

Gd-DVDMS在不同氧浓度下的光致发光光谱如图6所示，Gd-DVDMS的光致发光光谱包含580nm和624nm处的荧光峰以及712和790nm处的磷光峰。由于磷光发射源于三重态辐射跃迁，而Gd-DVDMS与O₂之间的相互作用同样源于三重态与氧分子之间的能量转换。因此磷光发光会随着氧浓度的变化而发生改变，氧浓度越大，磷光强度越低。

二、基于Gd-DVDMS，712nm处磷光寿命与单态氧量子产率理论方程的建立。

光敏剂吸收光子从基态S₀跃迁到单重激发态S₁，处于S₁态的光敏剂分子有三个去向：通过辐射弛豫产生荧光回落至基态，弛豫速率为k_F；通过无辐射弛豫回落至基态，弛豫速率为k_nF；通过系间窜跃跃迁到三重激发态，弛豫速率为k_ISC。跃迁至三重激发态T₁的光敏剂有三种去向：通过辐射弛豫发射磷光跃迁至基态，弛豫速率为k_p；通过无辐射弛豫过程回到基态，弛豫速率为k_np；与氧分子发生碰撞回落至基态，弛豫速率为k_q。

三重态量子产率表示为公式(1)：

单态氧量子产率表示为公式(2)：

其中k_p+k_np+k_q[O₂]可以通过测量Gd-DVDMS712nm处磷光寿命获得，具体依据公式(3)：

将公式(3)带入公式(2)中，可得

Φ_Δ＝Φ_T-Φ_Tτ_p(k_p+k_np) (4)

基于Gd-DVDMS与O₂之间相互作用的光物理化学反应过程，Gd-DVDMS712nm处的磷光寿命τ_p与Φ_Δ之间的关系式被定为Φ_Δ＝Φ_T-Φ_Tτ_p(k_p+k_np)。

三、方程中必要参数的获得

通过测量不同氧浓度O₂下的Gd-DVDMS712nm处的磷光寿命τ_p，再依据公式k_p+k_np+k_q[O₂]＝τ_p ^-1，即能获得k_p+k_np的数值为0.012μs^-1，k_q的数值为0.0013μs·μM^-1；405nm激光被二极管激光控制器所调制，输出为方波。激光照射在样品上，样品所发出的光被光栅光谱仪所接收，光栅定位在712nm处，经过光电倍增管放大后的信号被发送至数字荧光示波器进行平均，最终，我们通过e指数拟合所得时间分辨信号，获得Gd-DVDMS712nm处的磷光寿命。由于712nm处的磷光寿命与跃迁几率之间存在如下关系：k_p+k_np+k_q[O₂]＝τ_p ^-1,通过测量不同氧浓度下的Gd-DVDMS712nm处的磷光寿命，k_p+k_np的数值即可获得；其中氧浓度的测定方法为：将充满Gd-DVDMS溶液的3ml石英比色皿与一个容量为100ml装有同种样品的烧杯一起放入一个密闭容器，然后容器与氮气和氧气相通，密闭容器内的氧浓度调节是通过调节两个分别与氮气和氧气相连的质量流量计来完成，改变质量流量计的配比，实现对容器内氧浓度的控制，通过充分的氧交换，烧杯中Gd-DVDMS溶液中的氧浓度稳定，烧杯中放置的溶氧仪显示的数值稳定，所读取的溶氧量为Gd-DVDMS溶液中的氧浓度。

Φ_T是根据公式(2)获得的，因此，在已知k_p+k_np的数值为0.012μs^-1，k_q的数值为0.0013μs·μM^-1前提下，测得不同氧浓度的Φ_Δ，即可获得Φ_T的数值为0.95；

利用虎红作为对比试剂，DPBF作为单态氧捕获剂。根据关系式Φ_Δ ^stdI_abs ^std/k^std＝Φ_ΔI_abs/k，其中“std”代表虎红，I_abs为试剂对于激发光的吸收，k为DPBF的衰减速率。I_abs的获得技术为利用氘灯作为光源，通过透镜将其调节为平行光，分别将装有虎红和Gd-DVDMS溶液的石英比色皿置于平行光前，利用光纤光谱仪收集透过样品的光，连接电脑后记录下光谱数据。基于比尔朗博定律，得到虎红与Gd-DVDMS对激发光的吸收。DPBF光照下的衰减速率的测量技术为利用532nm激光作为激发光源，当照射样品时，会有单线态氧产生，DPBF的浓度会减小，通过测量DPBF的吸收光谱，可以观察到410nm处的吸收峰强度随着光照时间的增加而减小。DPBF的吸收谱测量中，采用氘灯作为光源，通过调节将其变为平行光束照射在装有DPBF与Gd-DVDMS的混合溶液的石英比色皿，利用光纤光谱仪接收透过比色皿的光，将光谱显示在电脑中，基于以上步骤，得到不同光照时间下DPBF、虎红混合溶液与DPBF、Gd-DVDMS混合溶液中DPBF的吸收光谱。其410nm处吸收峰强度随光照时间的变化可由如下公式表示：ln([I_DPBF]₀/[I_DPBF])＝kt，不同混合溶液中的DPBF衰减速率k即可获得；由此，测得不同氧浓度下的Φ_Δ，可获得Φ_T的数值为0.95。

四、将步骤三得到的k_p+k_np和Φ_T的数值代入公式(4)中，建立了Gd-DVDMS712nm处磷光寿命与Φ_Δ之间的关系，在需要测量单态氧量子产率时，通过测量Gd-DVDMS712nm处的磷光寿命，即可得到单态氧量子产率。

Claims (6)

1.一种基于时间分辨光谱测量实现单态氧量子产率监测的方法，其特征在于：该方法是按以下步骤进行：

一、制备Gd³⁺修饰的光敏剂材料，所述Gd³⁺修饰的光敏剂材料为钆掺杂血卟啉单甲醚Gd-HMME；

二、建立如下公式：

三重态量子产率Φ_T的公式：

单态氧量子产率Φ_Δ的公式：

Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处的磷光寿命τ_p的公式：

将公式(3)带入公式(2)中，可得Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处的磷光寿命τ_p与单态氧量子产率Φ_Δ的理论方程：

Φ_Δ＝Φ_T-Φ_Tτ_p(k_p+k_np)(4)；其中，k_F为处于S₁态的Gd³⁺修饰的光敏剂分子通过辐射弛豫产生荧光回落至基态的弛豫速率；k_nF为处于S₁态的Gd³⁺修饰的光敏剂分子通过无辐射弛豫回落至基态的弛豫速率；k_ISC为处于S₁态的Gd³修饰的光敏剂分子通过系间窜跃跃迁到三重激发态T₁的弛豫速率；k_p为处于三重激发态T₁的Gd³⁺修饰的光敏剂通过辐射弛豫发射磷光跃迁至基态的弛豫速率；k_np为处于三重激发态T₁的Gd³⁺修饰的光敏剂通过无辐射弛豫过程回到基态的弛豫速率；k_q为处于三重激发态T₁的Gd³⁺修饰的光敏剂与氧分子发生碰撞回落至基态的弛豫速率；Φ_Δ为单态氧量子产率；τ_p为Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处的磷光寿命；Φ_T为三重态量子产率；[O₂]为氧浓度；

三、Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处的磷光寿命与单态氧量子产率理论方程中参数的获得：

通过测量不同氧浓度[O₂]下Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处的磷光寿命τ_p，再依据公式k_p+k_np+k_q[O₂]＝τ_p ^-1，即能获得k_p+k_np的数值和k_q的数值；k_p+k_np的数值为0.018μs^-1，k_q的数值为0.0002μs·μM^-1；

三重态量子产率Φ_T是依据公式(2)获得的：将k_p+k_np的数值、k_q的数值以及不同氧浓度下测得的单态氧量子产率Φ_Δ代入上述公式(2)中，即可获得三重态量子产率Φ_T的数值为0.81；

其中，所述的氧浓度的测定方法为：将充满Gd³⁺修饰的光敏剂溶液的3ml石英比色皿与一个容量为100ml装有同种样品的烧杯一起放入一个密闭容器内，然后将密闭容器与氮气和氧气相通，密闭容器内的氧浓度调节是通过调节两个分别与氮气和氧气相连的质量流量计来完成，改变质量流量计的配比，实现对密闭容器内氧浓度的控制，通过充分的氧交换，石英比色皿与烧杯中Gd³⁺修饰的光敏剂溶液的氧浓度稳定，烧杯中放置的溶氧仪显示的数值稳定时，所读取的溶氧量即为石英比色皿内Gd³⁺修饰的光敏剂溶液中的氧浓度；

所述的不同氧浓度下单态氧量子产率Φ_Δ用对比法测得，具体方法为：利用虎红作为对比试剂，DPBF作为单态氧捕获剂，根据关系式Φ_Δ ^stdI_abs ^std/k^std＝Φ_ΔI_abs/k进行计算得到Φ_Δ，其中“std”代表虎红，Φ_Δ ^std为虎红的单态氧量子产率，I_abs ^std为虎红对于激发光的吸收，k^std为虎红和DPBF混合溶液中DPBF的衰减速率，I_abs为Gd³⁺修饰的光敏剂对于激发光的吸收，k为Gd³⁺修饰的光敏剂和DPBF混合溶液中DPBF的衰减速率；

I_abs ^std和I_abs的获得方法为：利用氘灯作为光源，通过透镜将其调节为平行光，分别将装有虎红溶液和Gd³⁺修饰的光敏剂溶液的石英比色皿置于平行光前，利用光纤光谱仪收集透过样品的光，连接电脑后记录下光谱数据，基于比尔朗博定律，得到I_abs ^std和I_abs；

利用532nm激光作为激发光源，调节将其变为平行光束，分别照射在装有DPBF与Gd³⁺修饰的光敏剂的混合溶液的石英比色皿、装有DPBF与虎红的混合溶液的石英比色皿，利用光纤光谱仪接收透过比色皿的光，将光谱显示在电脑中，得到不同光照时间下DPBF与虎红的混合溶液、DPBF与Gd³⁺修饰的光敏剂的混合溶液中DPBF的吸收光谱，其410nm处吸收峰强度随光照时间的变化由如下公式表示：ln([I_DPBF]₀/[I_DPBF])＝kt，t为光照时间，从而获得不同混合溶液中的DPBF衰减速率k；由此，测得不同氧浓度下的单态氧量子产率Φ_Δ，代入公式(2)中，得到三重态量子产率Φ_T的数值；

所述的Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处磷光寿命τ_p的测量方法为：

用二极管激光控制器调制405nm激光，输出为方波，照射在Gd³⁺修饰的光敏剂样品上，样品所发出的光被光栅光谱仪接收，光栅光谱仪定位接收样品712nm处的磷光，经过光电倍增管放大后的信号被发送至数字荧光示波器进行平均，最终，通过e指数拟合所得时间分辨信号，获得Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处的磷光寿命τ_p；

四、将步骤三得到的k_p+k_np和Φ_T的数值代入公式(4)中，建立了Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处的磷光寿命τ_p与单态氧量子产率Φ_Δ之间的关系，在需要测量单态氧量子产率时，通过测量Gd³⁺修饰的光敏剂在712nm处的磷光寿命τ_p，即可得到单态氧量子产率Φ_Δ。

2.根据权利要求1所述的一种基于时间分辨光谱测量实现单态氧量子产率监测的方法，其特征在于：利用溶剂热法制备所述钆掺杂血卟啉单甲醚Gd-HMME，具体步骤为：将溶剂咪唑、血卟啉单甲醚HMME和Gd-Cl₃混合，然后加入到三颈瓶中，在氩气保护下，200℃加热搅拌两个小时，然后冷却至室温，再放入甲醇中充分溶解，即完成。

3.根据权利要求2所述的一种基于时间分辨光谱测量实现单态氧量子产率监测的方法，其特征在于：所述溶剂咪唑、血卟啉单甲醚HMME和Gd-Cl₃的质量比为6000：12：60。

4.一种基于时间分辨光谱测量实现单态氧量子产率监测的方法，其特征在于：该方法是按以下步骤进行：

一、制备Gd³⁺修饰的光敏剂材料，所述Gd³⁺修饰的光敏剂材料为钆掺杂华卟啉钠Gd-DVDMS；

二、建立如下公式：

三重态量子产率Φ_T的公式：

单态氧量子产率Φ_Δ的公式：

Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处的磷光寿命τ_p的公式：

将公式(3)带入公式(2)中，可得Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处的磷光寿命τ_p与单态氧量子产率Φ_Δ的理论方程：

Φ_Δ＝Φ_T-Φ_Tτ_p(k_p+k_np)(4)；其中，k_F为处于S₁态的Gd³⁺修饰的光敏剂分子通过辐射弛豫产生荧光回落至基态的弛豫速率；k_nF为处于S₁态的Gd³⁺修饰的光敏剂分子通过无辐射弛豫回落至基态的弛豫速率；k_ISC为处于S₁态的Gd³修饰的光敏剂分子通过系间窜跃跃迁到三重激发态T₁的弛豫速率；k_p为处于三重激发态T₁的Gd³⁺修饰的光敏剂通过辐射弛豫发射磷光跃迁至基态的弛豫速率；k_np为处于三重激发态T₁的Gd³⁺修饰的光敏剂通过无辐射弛豫过程回到基态的弛豫速率；k_q为处于三重激发态T₁的Gd³⁺修饰的光敏剂与氧分子发生碰撞回落至基态的弛豫速率；Φ_Δ为单态氧量子产率；τ_p为Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处的磷光寿命；Φ_T为三重态量子产率；[O₂]为氧浓度；

三、Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处的磷光寿命与单态氧量子产率理论方程中参数的获得：

通过测量不同氧浓度[O₂]下Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处的磷光寿命τ_p，再依据公式k_p+k_np+k_q[O₂]＝τ_p ^-1，即能获得k_p+k_np的数值和k_q的数值；k_p+k_np的数值为0.012μs^-1，k_q的数值为0.0013μs·μM^-1；

Φ_T是依据公式(2)获得的：将k_p+k_np的数值、k_q的数值以及不同氧浓度下测得的单态氧量子产率Φ_Δ代入上述公式(2)中，即可获得Φ_T的数值为0.95；

其中，所述的氧浓度的测定方法为：将充满Gd³⁺修饰的光敏剂溶液的3ml石英比色皿与一个容量为100ml装有同种样品的烧杯一起放入一个密闭容器内，然后将密闭容器与氮气和氧气相通，密闭容器内的氧浓度调节是通过调节两个分别与氮气和氧气相连的质量流量计来完成，改变质量流量计的配比，实现对密闭容器内氧浓度的控制，通过充分的氧交换，石英比色皿与烧杯中Gd³⁺修饰的光敏剂溶液的氧浓度稳定，烧杯中放置的溶氧仪显示的数值稳定时，所读取的溶氧量即为石英比色皿内Gd³⁺修饰的光敏剂溶液中的氧浓度；

所述的不同氧浓度下单态氧量子产率Φ_Δ用对比法测得，具体方法为：利用虎红作为对比试剂，DPBF作为单态氧捕获剂，根据关系式Φ_Δ ^stdI_abs ^std/k^std＝Φ_ΔI_abs/k进行计算得到Φ_Δ，其中“std”代表虎红，Φ_Δ ^std为虎红的单态氧量子产率，I_abs ^std为虎红对于激发光的吸收，k^std为虎红和DPBF混合溶液中DPBF的衰减速率，I_abs为Gd³⁺修饰的光敏剂对于激发光的吸收，k为Gd³⁺修饰的光敏剂和DPBF混合溶液中DPBF的衰减速率；

I_abs ^std和I_abs的获得方法为：利用氘灯作为光源，通过透镜将其调节为平行光，分别将装有虎红溶液和Gd³⁺修饰的光敏剂溶液的石英比色皿置于平行光前，利用光纤光谱仪收集透过样品的光，连接电脑后记录下光谱数据，基于比尔朗博定律，得到I_abs ^std和I_abs；

利用532nm激光作为激发光源，调节将其变为平行光束，分别照射在装有DPBF与Gd³⁺修饰的光敏剂的混合溶液的石英比色皿、装有DPBF与虎红的混合溶液的石英比色皿，利用光纤光谱仪接收透过比色皿的光，将光谱显示在电脑中，得到不同光照时间下DPBF与虎红的混合溶液、DPBF与Gd³⁺修饰的光敏剂的混合溶液中DPBF的吸收光谱，其410nm处吸收峰强度随光照时间的变化由如下公式表示：ln([I_DPBF]₀/[I_DPBF])＝kt，t为光照时间，从而即可获得不同混合溶液中的DPBF衰减速率k；由此，测得不同氧浓度下的单态氧量子产率Φ_Δ，代入公式(2)中，得到三重态量子产率Φ_T的数值；

所述的Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处磷光寿命τ_p的测量方法为：

用二极管激光控制器调制405nm激光，输出为方波，照射在Gd³⁺修饰的光敏剂样品上，样品所发出的光被光栅光谱仪接收，光栅光谱仪定位接收样品712nm处的磷光，经过光电倍增管放大后的信号被发送至数字荧光示波器进行平均，最终，通过e指数拟合所得时间分辨信号，获得Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处的磷光寿命τ_p；

四、将步骤三得到的k_p+k_np和Φ_T的数值代入公式(4)中，建立了Gd³⁺修饰的光敏剂712nm处的磷光寿命τ_p与单态氧量子产率Φ_Δ之间的关系，在需要测量单态氧量子产率时，通过测量Gd³⁺修饰的光敏剂在712nm处的磷光寿命τ_p，即可得到单态氧量子产率Φ_Δ。

5.根据权利要求4所述的一种基于时间分辨光谱测量实现单态氧量子产率监测的方法，其特征在于：利用溶剂热法制备所述钆掺杂华卟啉钠Gd-DVDMS，具体步骤为：将溶剂咪唑、华卟啉钠DVDMS和Gd-Cl₃混合，然后加入到三颈瓶中，在氩气保护下，200℃加热搅拌两个小时，然后冷却至室温，再放入甲醇中充分溶解，即完成。

6.根据权利要求5所述的一种基于时间分辨光谱测量实现单态氧量子产率监测的方法，其特征在于：所述溶剂咪唑、华卟啉钠DVDMS和Gd-Cl₃的质量比为6000：12：53。

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