JPH10158258A - 標的核酸の検出方法及び定量方法、及び化学発光分析に用いられるピリリウム化合物 - Google Patents

標的核酸の検出方法及び定量方法、及び化学発光分析に用いられるピリリウム化合物

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JPH10158258A
JPH10158258A JP27144397A JP27144397A JPH10158258A JP H10158258 A JPH10158258 A JP H10158258A JP 27144397 A JP27144397 A JP 27144397A JP 27144397 A JP27144397 A JP 27144397A JP H10158258 A JPH10158258 A JP H10158258A
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nucleic acid
target nucleic
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double
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JP27144397A
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English (en)
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Hisashi Okamoto
尚志 岡本
Nobuko Yamamoto
伸子 山本
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Original Assignee
Canon Inc
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 試料中の標的核酸を感度よく検出し、また正
確に定量できる化学発光物質を利用した方法及び該方法
に好適に用い得る化学発光化合物を提供すること。 【解決手段】 二本鎖核酸に挿入可能な化学発光物質を
二本鎖核酸に挿入し、該二本鎖核酸に挿入される該化学
発光性物質の化学発光を検出し、あるいは測定する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は化学発光を利用した
標的核酸の検出方法及び定量方法、化学発光分析に用い
得るピリリウム化合物に関する。
【０００２】
【従来の技術】医薬品、犯罪掃査、農業等の様々な分野
で二本鎖核酸を検出する作業や、特定の遺伝子、すなわ
ち特定の塩基配列を有する一本鎖核酸を検出する作業が
日常的に行われるようになってきている（以降これら二
本鎖核酸や一本核酸を標的核酸と称する）。
【０００３】試料中の二本鎖核酸を検出する手段として
は、例えばポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲ
ルを用いた電気泳動により二本鎖核酸を分離し、これ
を、二本鎖核酸の隣接する塩基対の間にインターカレー
トして蛍光の増強を示す性質を有する蛍光色素（例え
ば、ＥＢ：エチジウムブロマイド）で染色し、紫外線ラ
ンプを光源とするトランスイルミネーターで励起させ
て、発生する二本鎖核酸中の蛍光色素が出す蛍光を検出
する蛍光検出法がある。
【０００４】また、溶液中の二本鎖核酸を同様に、蛍光
色素、例えばエチジウムブロマイド、ジアミジノフェニ
ルインドールジハイドロクロライド（ＤＡＰＩ）、ヘキ
スト３３２５８等で染色して、その蛍光により検出する
ことも可能である。
【０００５】二本鎖核酸に相互作用して蛍光が増強する
一般的な蛍光色素を用いて溶液中の二本鎖核酸を検出す
る問題点のひとつは検出感度が低い場合が多いことであ
る。蛍光検出法自体は、より一般的な比色法等に比べれ
ば高感度ではあるが、励起光に由来する漏れ光、また、
試料が液体であれば、溶媒分子からのラマン散乱光等、
蛍光測定法特有の問題点によって絶対的な感度の限界は
数ｎＭであって、特に生体由来の微量、低濃度の二本鎖
核酸をそのまま検出可能な感度は有していない。
【０００６】また、蛍光色素を用いる蛍光検出法におけ
る他の問題点は、蛍光色素が二本鎖核酸と相互作用して
いない遊離の状態でも紫外線照射により蛍光を発し、検
出時のバックグラウンドの上昇をもたらすことである。
このバックグラウンドの上昇もまた、検出感度の低減の
要因となる。
【０００７】かかるバックグラウンドの上昇という問題
を解決手段として、特開平７−１７４７５９号公報（Ｕ
Ｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５６２４７９８）には、二本
鎖核酸と相互作用したときのみに蛍光を発する特定の構
造のピリリウム化合物を蛍光色素として用いる方法が開
示されており、この方法に検出感度の大幅な改善が可能
となり、蛍光検出法の実用性も大幅に向上した。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、バック
グラウンドを低下させて検出感度を向上させても、先に
挙げたような光の漏れやラマン散乱光の発生による蛍光
を利用する場合に特有の問題は十分には解決されておら
ず、検出感度を更に向上させる方法が求められている。
【０００９】また特定の塩基配列を有する一本鎖核酸の
検出方法としては、例えば標識した核酸をプローブとし
て用いるいわゆる核酸プローブ法においては高感度を得
る方法として、ラジオアイソトープや生物発光法、ある
いは化学発光法を用いる方法が開発されてきている。
【００１０】ラジオアイソトープ法による検出は、放射
性の原子（ラジオアイソトープ）を含む標識を用いるも
ので、原理的には支持体上に１分子（１コピー）の標的
核酸が存在すれば検出できるほどの感度を有している
が、特殊な施設を必要とする上に、作業に危険が伴うと
いう問題がある。また、ラジオアイソトープは不安定な
のでこれを標識として結合させたプローブ核酸を安定に
長期保存できないという問題もある。
【００１１】これに対して、従来の化学発色法及び酵素
的発色法は、特殊な施設を必要とせず、また、比較的安
全に使用することができるので、より実用的な方法であ
るが、ラジオアイソトープ法に比べると感度が著しく低
く、生体試料から得られる核酸のように極微量でしか得
られない核酸の検出には十分対応できないものであっ
た。また、これらの方法で用いる標識物質を結合したプ
ローブ核酸も不安定で長期保存できない場合が多い。
【００１２】本発明の目的は、試料中の標的核酸を感度
よく検出する方法を提供する点にある。また、本発明の
他の目的は、試料中の標的核酸を正確に定量する方法を
提供する点にある。更に本発明の他の目的は、化学発光
分析に用いる化合物を提供する点にある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明標的核酸の検出方
法は、試料中の標的核酸の検出方法であって、二本鎖核
酸と相互作用可能な化学発光性物質を該標的核酸を有す
る二本鎖核酸と相互作用させ、該二本鎖核酸と相互作用
した該化学発光性物質の化学発光を検出する工程を有す
ることを特徴とする。
【００１４】本発明の標的核酸の定量方法は、試料中の
標的核酸の定量方法であって、二本鎖核酸と相互作用可
能な化学発光性物質を、二本鎖核酸に相互作用させ、該
二本鎖核酸と相互作用した該化学発光性物質の化学発光
の量を測定する工程を有する。
【００１５】本発明の化学発光分析に用いる為のピリリ
ウム化合物は、下記式（１）で示される。
【００１６】
【化４６】 （上記式中ＸはＯ，Ｓ，Ｓｅ又はＴｅであって、Ｒ1、
Ｒ2及びＲ3から選ばれる２つの置換基は置換もしくは未
置換のアリール基で有り、残りの置換基は、水素原子、
ハロゲン原子、スルホネート基、アミノ基、スチリル
基、ニトロ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、シア
ノ基、置換もしくは未置換のアルキル基、または置換も
しくは未置換のシクロアルキル基、または−Ａもしくは
−Ｌ−Ａであり、Ｌは−Ｌ1−、−Ｌ2−Ｌ3−または−
Ｌ4−Ｌ5−Ｌ6−であり、Ｌ1〜Ｌ6はそれぞれ独立し
て、−（ＣＨ＝ＣＨ）−、置換もしくは未置換のアリー
ル基から誘導される２価の基、置換もしくは未置換の低
級アルキレン基、または−ＣＨ＝Ｒ4−（Ｒ4はオキソ基
を有する環構造を示す）を表し、Ａは、置換もしくは未
置換のアリール基、−ＣＨ＝Ｒ5（Ｒ5は、置換もしくは
未置換の複素環、置換もしくは未置換のシクロアルキル
基、又は置換もしくは未置換の芳香環を示す）を表し、
Ｙ- はアニオンを示す。） 本発明によれば、標的核酸の検出感度が極めて高いため
標的核酸の増幅工程、例えばＰＣＲ法等を併用する必要
がない。また、二本鎖核酸の検出、定量には化学発光を
用いるので蛍光法における前述の問題点を解決できる。
【００１７】また、化学発光性物質はハイブリタイゼー
ション後に加えてもよくプローブ核酸に予め結合させて
おく必要がない。そのためプローブ核酸を標識化したと
きに生じることがあるプローブ核酸の不安定化という問
題を回避できる。
【００１８】化学発光性物質による二本鎖核酸の検出
を、化学発光性物質が前記二本鎖核酸に相互作用下にお
いて、または相互作用を通して初めて化学発光可能な状
態となる条件下で行うことで、二本鎖核酸を作用してい
ない化学発光性物質を反応系から除去する操作が不要と
なり、操作の簡便化が図れ、更にバックグラウンドが効
果的に低減された高感度での検出が可能となる。
【００１９】これらの実施態様は、蛍光色素を用いる場
合の先に挙げた問題点、すなわち励起光に由来する漏れ
光やラマン散乱等の問題を解決して、高感度な二本鎖核
酸の検出を可能とする。例えば、これらの実施態様をフ
ォトカウンティング法と組み合わせることにより、二本
鎖核酸との相互作用を生じた化学発光性物質を１分子の
レベルからの検出への可能性を開くものとする。すなわ
ち、本発明によれば、二本鎖核酸の検出法における検出
感度を、例えば蛍光検出法等に比較して更に大幅に向上
させることが可能となる。
【００２０】また、上記の実施態様における化学発光の
検出工程を二本鎖核酸と相互作用した化学発光性物質の
みが化学発光可能な条件下で行うことで、あるいは化学
発光性物質として二本鎖核酸との相互作用を通して初め
て化学発光を起す物質を用いることで、二本鎖核酸に相
互作用していない化学発光性物質を分離しなくてもバッ
クグラウンドもない極めて高感度（例えば、濃度０．１
ｆＭ、絶対量として０．１アトモル、いずれも塩基対換
算）な二本鎖核酸の検出、定量が可能となる。
【００２１】この実施態様は、二本鎖核酸と化学発光性
物質との相互作用、例えば接触、結合反応等によって、
例えば化学発光性物質の構造が変化し、その結果として
初めて化学発光可能な状態となることを利用するもので
ある。かかる相互作用の具体例としては、化学発光性物
質が二本鎖核酸の互いに隣接する塩基対の間に入り込む
ことによって起こるインターカレーション、グルーブバ
インディング等を好適なものとして挙げることができ
る。
【００２２】この実施態様では、化学発光性物質は、二
本鎖核酸との相互作用の結果初めて発光可能な状態とな
るので、二本鎖核酸との相互作用を生じていない遊離の
状態では発光しないので、検出時におけるバックグラウ
ンドの影響を排除でき、より高感度な検出が可能とな
る。
【００２３】更に本発明にかかる化学発光用色素の一実
施態様は、下記式（１）で示される化合物である。
【００２４】
【化４７】 （上記式中ＸはＯ，Ｓ，ＳｅまたはＴｅであって、
Ｒ1，Ｒ2及びＲ3から選ばれる２つの置換基は置換もし
くは未置換のアリール基であり、残りの置換基は、水素
原子、ハロゲン原子、スルホネート基、アミノ基、スチ
リル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、
シアノ基、置換もしくは未置換のアルキル基、または置
換もしくは未置換のシクロアルキル基、または−Ａもし
くは−Ｌ−Ａであり、Ｌは−Ｌ1−、−Ｌ2−Ｌ3−また
は−Ｌ4−Ｌ5−Ｌ6−であり、Ｌ1−Ｌ6はそれぞれ独立
して、−（ＣＨ＝ＣＨ）−、置換もしくは未置換のアリ
ール基から誘導される２価の基、置換もしくは未置換の
低級アルキレン基、または−ＣＨ＝Ｒ4−（Ｒ4はオキソ
基を有する環構造を示す）を表し、Ａは、置換もしくは
未置換のアリール基、−ＣＨ＝Ｒ5（Ｒ5は、置換もしく
は未置換の複素環、置換もしくは未置換のシクロアルキ
ル基、または置換もしくは未置換の芳香環を示す）を表
し、Ｙ-はアニオンを示す。） 上記式（１）で示されるピリリウム塩化合物は、化学発
光させたときに強い発光強度を示す。また、該ピリリウ
ム化合物はインターカレーターとして二本鎖核酸に取り
込まれたときにだけ化学発光させることができ、二本鎖
核酸の検出に極めて有効に用い得るものである。
【００２５】
【発明の実施の形態】本発明の各実施態様における検出
または定量対象の核酸、すなわち標的核酸としては、一
本鎖または二本鎖ＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲ
ＮＡ）から酵素的に合成されたコンプレメンタリ−ＤＮ
Ａ（ｃＤＮＡ）等の各種ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、トランスフ
ァーＲＡＮ（ｔＲＮＡ）、リボゾーマルＲＮＡ（ｒＲＮ
Ａ）等の各種ＲＮＡを挙げることができる。なお、検出
対象としての試料中には、複数の、異なる核酸が含まれ
ていてもよく、例えば、生体から抽出された全ｍＲＮＡ
（total ｍＲＮＡ）の分析等に本発明は好適に適用可能
である。
【００２６】本発明によれば、プローブ核酸に対して標
識物質を担持させないので、標識を結合させるための構
造を有する必要がなく、この点に関するプローブ核酸の
構造についての制限がなくなる。プローブ核酸として
は、所望のハイブリダイゼーションに必要な配列を有す
るＤＮＡ、ＲＮＡ、その他修飾核酸が使用可能である。
【００２７】本発明で用いる化学発光性物質としては、
二本鎖核酸に相互作用させた際にそこに安定に保持さ
れ、その状態で十分な強度の化学発光を生じ得るものが
好ましく用いられる。
【００２８】化学発光性物質と二本鎖核酸との相互作用
としては、例えば二本鎖核酸への吸着や結合、あるいは
二本鎖核酸内への取り込み等種々の態様を挙げることが
できる。本発明においては中でも、グルーブバインディ
ングやインターカレーション等によって化学発光性物質
が二本鎖核酸に挿入される形態が望ましい。
【００２９】グルーブバインディングを生じるタイプの
化合物で二本鎖核酸との相互作用により蛍光を発する化
合物としては、例えば、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジ
ノ−２−フェニルインドール ジハイドロクロライド；
フナコシ薬品（株））、ＹＯＹＯ−１（モレキュラープ
ローブ社製）等を挙げることができる。また化学発光性
物質が二本鎖核酸の二重らせん構造にインターカレート
するインターカレーターの場合、インターカレーション
の結果、化学発光性物質のおかれている環境が変化する
（例えば、化学発光性物質と二本鎖核酸が水系の溶媒に
溶解している場合には、化学発光性物質はインターカレ
ーションすることにより、より疎水性の強い環境下にお
かれることになる）。それに加えてインターカレートし
た化学発光性物質は、二本鎖核酸のオリゴヌクレオチド
間に挟まれることにより構造変化することになる。この
インターカレーションによる構造変化は、二本鎖核酸へ
の他の相互作用様式、例えば、グルーブバインディング
に比べると大きく、本発明で利用する相互作用による構
造変化としてはより好ましい。そして化学発光性物質が
インターカレーターの場合、上記の環境変化及び／また
は構造変化によってインターカレートしている化学発光
性物質のみを化学発光させることができる。
【００３０】かかるインターカレーターとしての特性を
有する化学発光性物質としては、例えば、アクリジンオ
レンジ、エチジウムブロマイド、及び下記式（１）で示
されるピリリウム化合物等が挙げられる。
【００３１】
【化４８】 上記式（１）中、ＸはＯ、Ｓ、ＳｅまたはＴｅであっ
て、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3から選ばれる２つの置換基はアリ
ール基であり、残りの置換基は、水素原子、ハロゲン原
子、スルホネート基、アミノ基、スチリル基、ニトロ
基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、シアノ基、置換
もしくは未置換のアルキル基、または置換もしくは未置
換のシクロアルキル基、または−Ａもしくは−Ｌ−Ａで
あり、Ｌは−Ｌ1−、−Ｌ2−Ｌ3−または−Ｌ4−Ｌ5−
Ｌ6−であり、Ｌ1〜Ｌ6はそれぞれ独立して、−（ＣＨ
＝ＣＨ）−、アリール基から誘導される２価の基、置換
もしくは未置換の低級アルキレン基、または−ＣＨ＝Ｒ
4 −（Ｒ4 はオキソ基を有する環構造を示す）を表し、
Ａは、アリール基または−ＣＨ＝Ｒ5（Ｒ5は、置換もし
くは未置換の複素環、置換もしくは未置換のシクロアル
キル基、または置換もしくは未置換の芳香環を示す）を
表し、Ｙ-はアニオンを示す。
【００３２】Ｒ1〜Ｒ3のうちの２つの置換基が構成する
アリール基としては、フェニル基、アミノフェニル基、
ジアルキルアミノフェニル基（例えば、ジメチルアミノ
フェニル基、ジエチルアミノフェニル基など）、カルボ
キシフェニル基、アズレニル基（シクロペンタシクロヘ
プテニル基）等を挙げることができる。また、これらの
基は、ハロゲン原子、アルキル基等によって置換されて
いてもよく、更にアズレニル基の場合はジアルキルアミ
ノフェニル基（例えばジメチルアミノフェニル基、ジエ
チルアミノフェニル基等）で置換されていても良い。
【００３３】また、Ｒ1〜Ｒ3のうちアリール基でない残
りの基を構成するアルキル基としては、メチル基、エチ
ル基、プロピル基、ブチル基等の炭素数１〜６の直鎖状
あるいは分岐状のアルキル基が挙げられる。
【００３４】また、シクロアルキル基としては、例えば
シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル
基、シクロヘキシル基等が挙げられ、これらの基はハロ
ゲン原子、アルキル基等で置換されていても良い。
【００３５】Ｌ1〜Ｌ6 におけるアリール基から誘導さ
れる２価の基としては、例えば、ｏ−フェニレン基、ｍ
−フェニレン基、ｐ−フェニレン基等が挙げられ、ま
た、これらの２価の基はハロゲン原子、アルキル基等に
よって置換されていても良い。
【００３６】Ｒ3におけるアルキレン基としては、例え
ばメチレン基、エチレン基等の炭素数１〜６の直鎖状あ
るいは分岐状の低級アルキレン基が挙げられ、これらの
基はハロゲン原子、アルキル基等で置換されていても良
い。
【００３７】Ａにおけるアリール基としては、例えばＲ
1〜Ｒ3のうちの２つの置換基が構成するアリール基に用
い得るのと同様の基を用いることができる。
【００３８】Ｒ5における複素環としては、例えばフラ
ン環、チオフェン環、ピロール環、ピラン環、チオピラ
ン環、ピリジン環、イミダゾール環等を挙げることがで
きる。また、その置換基としては、ハロゲン原子、炭素
数１〜６の直鎖状あるいは分岐状アルキル基、ジアルキ
ルアミノフェニル基（例えば、ジメチルアミノフェニル
基、ジエチルアミノフェニル基など）等を挙げることが
できる。
【００３９】Ｒ5におけるシクロアルキル基としては、
例えばＲ1〜Ｒ3のうちの１つの置換基に用い得る置換も
しくは未置換のシクロアルキル基等を挙げることができ
る。
【００４０】Ｒ5における芳香環としては、例えばベン
ゼン環、ナフタレン環やアズレン環等を挙げることがで
きる。また、その置換基としては、ハロゲン原子、アル
キル基、ジアルキルアミノフェニル基（例えば、ジメチ
ルアミノフェニル基、ジエチルアミノフェニル基など）
等を挙げることができる。
【００４１】Ｙ-はアニオンであり、例えば、Ｃｌ-、Ｂ
ｒ-、Ｉ-、ＣｌＯ4 -、ＳｂＦ6 -、ＢＦ4 -等を挙げること
ができ、なかでもＩ-、ＣｌＯ4 -が好ましい。
【００４２】更に、上記式（１）における−Ｌ−の好ま
しい態様としては、下記式（２）、（３）、（４）、
（５）または（６）：
【００４３】
【化４９】 （上記式（２）中、Ｚは水素原子または置換もしくは未
置換低級アルキル基を表し、ｎは０、１または２であ
る）、
【００４４】
【化５０】 （上記式（３）中、ｎは０、１または２であり、Φは置
換もしくは未置換ｏ−、ｍ−またはｐ−フェニレン基を
表す）、
【００４５】
【化５１】 （上記式（４）中、Φは置換もしくは未置換ｏ−、ｍ−
またはｐ−フェニレン基を表す）、
【００４６】
【化５２】
【００４７】
【化５３】 で表される基を挙げることができる。
【００４８】なお、上記の式（２）における低級アルキ
ル基としては、例えば炭素数１〜６の直鎖状あるいは分
岐状のアルキル基を、また、その置換基としてはハロゲ
ン原子等を挙げることができる。
【００４９】上記式（３）及び（４）におけるフェニレ
ン基の置換基としては、ハロゲン原子、アルキル基等を
挙げることができる。
【００５０】式（１）で表される化合物のより好ましい
具体例としては、下記式（７）〜（１５）で示されるピ
リリウム化合物が挙げられる。
【００５１】
【化５４】
【００５２】
【化５５】
【００５３】
【化５６】
【００５４】
【化５７】
【００５５】
【化５８】
【００５６】
【化５９】
【００５７】
【化６０】
【００５８】
【化６１】
【００５９】
【化６２】 （上記式（７）〜（１５）中、Ｘ及びＹは式（１）と同
様に定義される）で表される化合物を挙げることができ
る。
【００６０】更に、好ましい化合物の具体例としては、
表１の公知の方法で合成可能な各化合物、及び表１の化
合物のうちで−Ｎ（ＣＨ3）2を−Ｈに変換した化合物を
挙げることができる。
【００６１】
【表１】
【００６２】
【表２】
【００６３】
【表３】
【００６４】
【表４】
【００６５】
【表５】
【００６６】
【表６】
【００６７】
【表７】
【００６８】
【表８】
【００６９】
【表９】
【００７０】
【表１０】
【００７１】
【表１１】
【００７２】
【表１２】
【００７３】
【表１３】
【００７４】
【表１４】
【００７５】
【表１５】
【００７６】
【表１６】
【００７７】
【表１７】
【００７８】
【表１８】
【００７９】
【表１９】 更に、特に好ましい化合物としては以下の化合物を挙げ
ることができる。
【００８０】２−メチル−４，６−ビス（４−Ｎ，Ｎ−
ジメチルアミノフェニル）ピリリウムアイオダイド（式
（７）：Ｘ＝Ｏ，Ｙ＝Ｉ）；２−メチル−４，６−ビス
（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリムパー
クロレート（式（７）：Ｘ＝Ｏ，Ｙ＝ＣｌＯ4 ）；２−
メチル−４，６−ビス（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフ
ェニル）チアピリリウムアイオダイド（式（７）：Ｘ＝
Ｓ，Ｙ＝Ｉ）；２−メチル−４，６−ビス（４−Ｎ，Ｎ
−ジメチルアミノフェニル）チアピリリウムパークロレ
ート（式（７）：Ｘ＝Ｓ，Ｙ＝ＣｌＯ4 ）；２−メチル
−４，６−ジフェニルピリリウムアイオダイド（式
（８）：Ｘ＝Ｏ，Ｙ＝Ｉ）；２−メチル−４，６−ジフ
ェニルピリリウムパークロレート（式（８）：Ｘ＝Ｏ，
Ｙ＝ＣｌＯ4）；２−メチル−４，６−ジフェニルチア
ピリリウムアイオダイド（式（８）：Ｘ−Ｓ，Ｙ＝
Ｉ）；２−メチル−４，６−ジフェニルチアピリリウム
パ−クロレート（式（８）：Ｘ＝Ｓ，Ｙ＝ＣｌＯ4）；
４−メチル−２，６−ビス（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミ
ノフェニル）ピリリウムアイオダイド（式（９）：Ｘ＝
Ｏ，Ｙ＝Ｉ）；４−メチル−２，６−ビス（４−Ｎ，Ｎ
−ジメチルアミノフェニル）ピリリウムパークロレート
（式（９）：Ｘ＝Ｏ，Ｙ＝ＣｌＯ4）；４−メチル−
２，６−ビス（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）
チアピリリウムアイオダイド（式（９）：Ｘ＝Ｓ，Ｙ＝
Ｉ）；４−メチル−２，６−ビス（４−Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアミノフェニル）チアピリリウムパークロレート（式
（９）：Ｘ＝Ｓ，Ｙ＝ＣｌＯ4 ）；４−メチル−２，６
−ジフェニルピリリウムアイオダイド（式（１０）：Ｘ
＝Ｏ，Ｙ＝Ｉ）；４−メチル−２，６−ジフェニルピリ
リウムパークロレート（式（１０）：Ｘ＝Ｏ，Ｙ＝Ｃｌ
Ｏ4）；４−メチル−２，６−ジフェニルチアピリリウ
ムアイオダイド（式（１０）：Ｘ＝Ｓ，Ｙ＝Ｉ）；４−
メチル−２，６−ジフェニルチアピリリウムパークロレ
ート（式（１０）：Ｘ＝Ｓ，Ｙ＝ＣｌＯ4）；４−（４
−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−２，６−ジフェ
ニルピリリウムアイオダイド（式（１１）：Ｘ＝Ｏ，Ｙ
＝Ｉ）；４−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）
−２，６−ジフェニルピリリウムパークロレート（式
（１１）：Ｘ＝Ｏ，Ｙ＝ＣｌＯ4）；４−（４−Ｎ，Ｎ
−ジメチルアミノフェニル）−２，６−ジフェニルチア
ピリリウムアイオダイド（式（１１）：Ｘ＝Ｓ，Ｙ＝
Ｉ）；４−（４−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−
２，６−ジフェニルチアピリリウムパークロレート（式
（１１）：Ｘ＝Ｓ，Ｙ＝ＣｌＯ4）；２−フェニル−
４，６−ビス（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）
ピリリウムアイオダイド（式（１２）：Ｘ＝Ｏ，Ｙ＝
Ｉ）；２−フェニル−４，６−ビス（４−Ｎ，Ｎ−ジメ
チルアミノフェニル）ピリリウムパークロレート（式
（１２）：Ｘ＝Ｏ，Ｙ＝ＣｌＯ4）；２−フェニル−
４，６−ビス（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）
チアピリリウムアイオダイド（式（１２）：Ｘ＝Ｓ，Ｙ
＝Ｉ）；２−フェニル−４，６−ビス（４−Ｎ，Ｎ−ジ
メチルアミノフェニル）チアピリリウムパークロレート
（式（１２）：Ｘ＝Ｓ，Ｙ＝ＣｌＯ4）；４−フェニル
−２、６−ビス（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニ
ル）ピリリウムアイオダイド（式（１３）：Ｘ＝Ｏ，Ｙ
＝Ｉ）：４−フェニル−２，６−ビス（４−Ｎ，Ｎ−ジ
メチルアミノフェニル）ピリリウムパークロレート（式
（１３）：Ｘ＝Ｏ，Ｙ＝ＣｌＯ4）；４−フェニル−
２，６−ビス（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）
チアピリリウムアイオダイド（式（１３）：Ｘ＝Ｓ，Ｙ
＝Ｉ）；４−フェニル−２，６−ビス（４−Ｎ，Ｎ−ジ
メチルアミノフェニル）チアピリリウムパークロレート
（式（１３）：Ｘ＝Ｓ，Ｙ＝ＣｌＯ4）；２，４，６−
トリス（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリ
ウムアイオダイド（式（１４）：Ｘ＝Ｏ，Ｙ＝Ｉ）；
２，４，６−トリス（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェ
ニル）ピリリウムパークロレート（式（１４）：Ｘ＝
Ｏ，Ｙ＝ＣｌＯ4）；２，４，６−トリス（４−Ｎ，Ｎ
−ジメチルアミノフェニル）チアピリリウムアイオダイ
ド（式（１４）：Ｘ＝Ｓ，Ｙ＝Ｉ）；２，４，６−トリ
ス（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）チアピリリ
ウムパークロレート（式（１４）：Ｘ＝Ｓ，Ｙ＝ＣｌＯ
4）；２，４，６−トリフェニルピリリウムアイオダイ
ド（式（１５）：Ｘ＝Ｏ，Ｙ＝Ｉ）；２，４，６−トリ
フェニルピリリウムパークロレート（式（１５）：Ｘ＝
Ｏ，Ｙ＝ＣｌＯ4）；２，４，６−トリフェニルチアピ
リリウムアイオダイド（式（１５）：Ｘ＝Ｓ，Ｙ＝
Ｉ）；２，４，６−トリフェニルチアピリリウムパーク
ロレート（式（１５）：Ｘ＝Ｓ，Ｙ＝ＣｌＯ4）；更
に、上記式（１）の化合物は、上述したピリリウム環ま
たはピリリウム類似環の置換基に、更に親水性基、例え
ばカルボキシル基、スルホネート基などを導入して、水
系での検出の際の溶解性を高めたものであっても良い。
【００８１】ピリリウム色素それ自体についてはすでに
２０世紀の初頭から研究が行われてきており、論文、成
書も数多く出版されている。本発明のピリリウム色素の
具体例の一部もR. Wizinger ら(Helv. Chim. Acta, 39,
5, 1956) 、また、N. Yamamoto ら（欧州特許公開公報
ＥＰ６０３７８３）、その他によって合成されている。
また、ピリリウム色素の蛍光特性に関してはA.R. Katri
tzky編の成書「Advance in Heterocycle Chemistry sup
plement 2 Pyrylium Salt 」、前記欧州特許公開公報、
あるいは、米国特許公報ＵＳＰ４，５５５，３９６、Ｕ
ＳＰ４，８４０，７８４等に記載がある。
【００８２】また、本発明者らはすでに前記式（１）で
示されるピリリウム化合物がインターカレーターである
ことを明らかとしており（Nucleic Acid Symposium Ser
ies,No. 29, 83-84, 1993) 、また、これらのピリリウ
ム化合物を用いた蛍光法による二本鎖核酸の定量方法に
ついても検討を行ってきている（Nucleic Acids Resear
ch, 23, 8, 1995, 1445-1446) 。
【００８３】しかしながら、これらを含むピリリウム色
素を扱った文献のいずれにもピリリウム色素の化学発光
特性に関する記載はない。
【００８４】また、上記式（１）に示したピリリウム化
合物は化学発光の効率が従来の発光物質の化学発光効率
と比較しても同等以上であり、中には極めて強い発光効
率を示すものもある。
【００８５】更にまた、上記式（１）の化合物は、二本
鎖核酸中にインターカレートした状態での安定性も高く
容易には脱離しない。また、二本鎖核酸の約２５塩基対
に１分子の割合（エチジウムブロマイドは約４塩基対に
１分子の割合）でインターカレートするので、ミスマッ
チによって生じる短い二本鎖部分による検出ノイズを除
去したい場合に極めて有効であり、また、ｔＲＮＡやｒ
ＲＮＡが部分的に有する短い二本鎖部分は検出されない
ので、ｔＲＮＡやｒＲＮＡをそのまま標的核酸として用
いることが可能となる、という点においてより好まし
い。
【００８６】なお、化学発光性物質が、二本鎖核酸に作
用させていない遊離の状態でも化学発光を生じ、その化
学発光が検出のバックグラウンドを上昇させるものであ
れば、例えば洗浄操作によってこれを発光のための反応
系から除去するのが好ましい。この場合にも、より強固
な相互作用が得られるインターカレーションによる二本
鎖核酸との相互作用を生じる化学発光性物質が好まし
い。
【００８７】更に、化学発光性物質を発光させる際の条
件を、化学発光性物質が二本鎖核酸との相互作用下にあ
る、あるいは相互作用を通して初めて発光可能となるよ
うに設定することで、上記の洗いの操作を不要として操
作を更に簡便化することができ、しかもバックグランド
を効果的に低減させて検出感度の向上が図れる。このよ
うな条件設定は、化学発光性物質自体としてかかる性質
を有するものを用いる、あるいは反応系の物理的、化学
的条件を適宜設定する等の方法によって行うことができ
る。
【００８８】すなわち、二本鎖核酸への挿入前の構造を
Ａとし、二本鎖核酸への挿入後の構造をＢとしたとき
に、構造Ａでは発光を起さず、構造Ｂで発光を起すこと
が可能な化合物は、発光物質の発光を起す状態と、発光
を起こさない状態の区別が明確で、Ｓ／Ｎ比が良好で、
高感度の二本鎖核酸の測定が可能となり、本発明に好適
に利用可能である。
【００８９】更に、かかる化学発光性物質における二本
鎖核酸との相互作用としても、グルーブバインディング
やインターカレーション等を挙げることができるが、イ
ンターカレーションを生じるものがより好ましい。すな
わち、化学発光性物質がインターカレーターであれば、
インターカレーションの結果、化学発光性物質のおかれ
ている環境が変化する（例えば、化学発光性物質と二本
鎖核酸が水系の溶媒に溶解している場合には、化学発光
性物質はインターカレーションすることにより、より疎
水性の強い環境下におかれることになる）。また、イン
ターカレートした化学発光性物質は、二本鎖核酸の塩基
対間に挟まれることにより構造変化する。このインター
カレーションによる構造変化は、化学発光性物質と二本
鎖核酸との他の相互作用様式、例えば、グルーブバイン
ディングに比べると大きく、本発明で利用する相互作用
による構造変化としてはより好ましい。
【００９０】前記式（１）の化合物は、エチジウムブロ
マイド等のインターカレーター等に比べると、構造上大
きな差を有している。すなわち、エチジウムブロマイド
はその中心構造として縮合環構造を有しているために、
インターカレート前でも発光するという性質を有する。
従って、式（１）の化合物は、構造的に、二本鎖核酸と
の相互作用によって初めて発光可能となり、あるいは発
光反応の条件を適宜選定することでかかる二本鎖核酸に
インターカレートしたピリリウムのみを発光させること
ができる。
【００９１】なお、構造的にすでにこのような発光特性
を有するものについて、以下のような作用が考えられ
る。すなわち、式（１）の化合物は、縮合環構造をもた
ず、ピリリウム環が芳香環を有する基で置換されている
場合でも、これらは単結合で結合している。そのため、
二本鎖核酸にインターカレートしていない遊離の状態で
は単結合している置換基と基本骨格としてのピリリウム
環とが数十度の傾きで結合し、結果として発光を起こし
にくい構造が形成されている。そして、これが二本鎖核
酸中にインターカレートして塩基対に挟まれることによ
り、ピリリウム環とその置換基の立体的位置関係に変化
が生じ、結果として発光を起こし易い構造となる。この
構造変化としては、ピリリウム環とその置換基の角度が
なくなり、これらがほぼ平面状に配置される構造変化が
起きる。そして、かかる構造変化によって上記の二本鎖
核酸が非存在下では発光を生じないという特性を発揮で
きる。
【００９２】また、例えば、式（１）の化合物は、有機
溶媒中、例えばフタル酸ジメチル等の粘度の高い有機溶
媒中では、過酸化水素及びビスジニトロフェニルオキザ
レートの存在下では二本鎖核酸が共存しない状態でも化
学発光を生じることがある。しかしこの反応を水性媒体
中で行った場合には二本鎖核酸の非存在下では発光を生
じない。
【００９３】従って、このような化合物を水性媒体、例
えば水や水系の緩衝液（リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液
等）中で発光試薬の存在下で二本鎖核酸にインターカレ
ートさせると、二本鎖核酸にインターカレートしたピリ
リウム化合物だけを化学発光させることができ、標的核
酸の高感度でかつ簡易な検出、あるいは標的核酸の正確
な定量に極めて有効である。
【００９４】化学発光のメカニズは、基本的に、なんら
かの物質が化学的に励起されて励起状態に至り、それが
基底状態に戻る際に発光するというものである。この化
学発光反応を起す反応系としては、様々なものが開発さ
れているが、代表的なものを以下に挙げる。
【００９５】（１）ルミノールまたはルミノール誘導体
が触媒の存在下、過酸化水素により励起されて発光す
る。
【００９６】（２）Ｎ−メチルアクリジニウムがアルカ
リ性で過酸化水素によって励起されて発光する。
【００９７】（３）ルシニゲンがアルカリ性で還元性物
質によって励起され発光する。
【００９８】（４）シュウ酸エステルまたはその誘導体
が過酸化物によって励起中間体となり、この励起中間体
が分解する際に放出されるエネルギーによって共存する
蛍光色素を励起し、励起された蛍光色素が基底状態に戻
るときにエネルギーを化学発光として放出する。
【００９９】本発明における化学発光性物質による発光
にも上記（１）〜（４）の方法を含む種々の発光反応系
が利用できるが、（４）の方法が特に好ましい。例え
ば、式（１）のピリリウム化合物を化学発光性物質とし
て用いる場合、シュウ酸エステルと過酸化物との組み合
わせが好適であり、かかる目的に用いる発光用の試薬系
を構成するシュウ酸エステルとしては、以下に示す式
（１６）〜（２４）で示される化合物等のオキザレート
や、式（２５）〜（３０）で示される化合物等のオキサ
ミドを挙げることができる。
【０１００】
【化６３】
【０１０１】
【化６４】
【０１０２】
【化６５】
【０１０３】
【化６６】 また、シュウ酸エステルと組み合わせる過酸化物として
は、シュウ酸エステルから励起中間体を形成し得るもの
であれば制限なく利用でき、例えば過酸化水素を好適な
ものとして使用することができる。
【０１０４】化学発光の検出は、二本鎖核酸に相互作用
した化学発光性物質の発光を得ることのできる適当な媒
体中で行うことができ、例えば、水または水系の緩衝液
（リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液等）等の水性媒体を好
適なものとして挙げることができる。水性媒体のｐＨと
しては、二本鎖核酸部分及び化学発光性物質が安定であ
る範囲が好ましく、式（１）の化合物であれば、例え
ば、５．０〜８．０の範囲が好ましい。なお、式（１）
の化合物の中には、有機溶媒中、中でもフタル酸ジメチ
ル等の粘度の高い有機溶媒中では、過酸化水素及びビス
ジニトロフェニルオキザレート（化合物５９）の存在下
では二本鎖核酸が共存しない状態でも化学発光を生じる
が、上記のような水性媒体中ではこのようなことはな
い。
【０１０５】一方、水性媒体中での発光用試薬の溶解性
を更に向上させる目的で、水性媒体に可溶な有機溶媒
を、本発明の目的を損なわない範囲で適当量添加しても
良い。この有機溶媒としては、メタノール、エタノー
ル、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチル
スルホキシド等を挙げることができ、どの有機溶媒をど
のような量で用いるかは化学発光性物質、発光用試薬の
種類との組合せに応じて適宜選択することができるが、
一般的には、２容量％〜５０容量％が望ましく、その下
限は５容量％が、その上限は２０容量％、更には１０容
量％がより望ましい。
【０１０６】本発明にかかる標的核酸の検出・定量方法
において、該標的核酸として特定の塩基配列を有する一
本鎖核酸の検出・定量を行なう場合には、該塩基配列に
対して相補的な塩基配列を有するプローブ核酸を用意
し、それらをハイブリダイズさせて二本鎖核酸を形成
し、次いで該二本鎖核酸に前記式（１）で示したような
化学発光性物質を挿入し、該二本鎖核酸に挿入された該
化学発光性物質のみが化学発光する条件下で該化学発光
性化合物の化学発光を測定することで該標的核酸の検出
を行うことができる。
【０１０７】この実施態様によれば、二本鎖核酸の検出
には化学発光を用いるので、蛍光法における前記したよ
うな問題点を解決できる。更に化学発光性物質としてハ
イブリダイゼーション後にハイブリッドに挿入可能なも
のを用いることで、プローブ核酸に予め標的物質を結合
させておく必要がない。このためプローブ核酸を標識化
したときに生じることがあるプローブ核酸の不安定化と
いう問題を回避することができる。
【０１０８】また、より強い化学発光強度が必要な場合
には、更に固相上で形成される標的核酸とプローブ核酸
とのハイブリッド体における二本鎖部分を伸長して拡大
させることで、化学発光性物質との相互作用を生じる部
位を広げることができ、二本鎖核酸の検出が更に容易に
なり、検出感度を更に高めることができる。例えば、核
酸プローブの長さを平均で２０量体、標的核酸の長さを
２００〜１０００量体とした場合、検出感度を、例えば
１桁〜２桁、場合によっては３桁の向上が可能となる。
【０１０９】そしてここで該標的核酸または該プローブ
核酸として固相に固定化したものを用いて上記の反応を
行っても良い。これによって例えば化学発光性物質が挿
入された二本鎖核酸と該二本鎖核酸に挿入されていな
い、フリーの化学発光性物質の分離等を容易に行うこと
ができる。
【０１１０】標的核酸またはプローブ核酸の一方の固相
への固定は、固定される核酸の種類や固相材料の種類等
に応じて公知の方法を選択して用いれば良い。固相を形
成する支持体としては、本発明で所望とする核酸の固定
状態、標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーシ
ョン、ハイブリッド体と化学発光性物質との相互作用及
び化学発光性物質の発光が得られるものであれば制限な
く利用できる。発色法や蛍光法と異なり、検出光の散乱
が大きなニトロセルロースフィルターやナイロンフィル
ター等の支持体でも使用可能である。
【０１１１】簡便に発色光を定量的に測定するという点
からは、例えばマイクロプレートリーダーで検出可能な
マイクロタイタープレート等のプラスチックプレートが
好ましい。マイクロタイタープレートへの固定方法とし
ては、例えば、共有結合、物理的結合等が利用できる
が、操作性及び検出の確実性という意味からは共有結合
を利用した固定方法が望ましい。この共有結合による固
定は、例えば特表平７−５０６４８２号公報に記載のよ
うに、マイクロタイタープレート表面の官能基と核酸の
官能基とを共有結合させることによって行うことができ
る。
【０１１２】試料中の標的核酸とプローブ核酸との反応
は、固相ハイブリダイゼーション法において用いられて
いる通常の方法を適用して行うことができる。
【０１１３】一方、固相上で標的核酸とプローブ核酸と
のハイブリッド体が形成される際に、ハイブリッド体に
二本鎖からなる部分と一本鎖からなる部分とを形成させ
るようにプローブ核酸の構造を選択しておき、ハイブリ
ッド体の一本鎖部分を鋳型として二本鎖部分を伸長させ
て検出感度を更に上昇させることができる。この二本鎖
部分の伸長にも、公知の方法が利用できる。なお、生体
から抽出されたｍＲＮＡ（例えば全ｍＲＮＡ）の場合に
は、ｍＲＮＡの３プライム末端にオリゴリボアデニル酸
部分を有しているので、ブローブ核酸をオリゴもしくは
ポリデオキシリボチミジル酸、またはオリゴもしくはポ
リウラジル酸とし、核酸プローブと標的核酸のオリゴリ
ボアデニル酸部分とのハイブリッド部分（二本鎖形成
部）を二本鎖部分の伸長の開始部分とするのが望まし
い。
【０１１４】本発明によれば、標的核酸の検出が、化学
発光の検出（測定）を通して行われるので、例えば、フ
ォトカウンティング法と組み合わせることにより、化学
発光性物質の１分子からの発光が検出可能なものであれ
ば、二本鎖核酸に相互作用している１分子の化学発光性
物質からの発光によって検出が可能であり、極めて高感
度での標的核酸の検出を達成することができる。
【０１１５】本発明の核酸の検出法は、標的核酸の定量
にも好適に利用できる。例えば、各種濃度の標的核酸を
用いて検出を行って発光強度と標的核酸濃度との関係か
ら検量線を作成し、未知試料で測定される発光強度から
検量線を利用して未知試料中の標的核酸の定量を行うこ
とができる。
【０１１６】
【実施例】以下、実施例に基づき本発明を更に詳細に説
明する。
【０１１７】実施例１（発光波長、相対発光強度の測
定） （１）試薬溶液の調整 Ａ．０．２Ｍ Ｈ2Ｏ2溶液：ジメチルスルホキシド５ｍ
ｌと１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）９３ｍｌの混
合液に、３０重量％のＨ2Ｏ2水溶液の２ｍｌを加えよく
混和して調製した。
【０１１８】Ｂ．化学発光性物質溶液 表２に挙げた化合物ａ〜ｒの必要量を個々にジメチルス
ルホキシドの適当量に溶解させた後、これを１０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で２０倍に希釈し、化学発光
性物質の濃度を５μ〜５０μＭの範囲内で、吸光度（可
視部の最大吸収波長における）が０．５となるように調
製した。
【０１１９】Ｃ．２．５ｍＭ ビスジニトロフェニルオ
キザレート（ＤＮＰＯ）溶液：ＤＮＰＯ４２ｍｇをジメ
チルスルホキシド４ｍｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
６．０）３６ｍｌに溶解させて調製した。
【０１２０】Ｄ．塩基対として１００ｎＭの二本鎖核酸
溶液：Salmon Testea DNA (Sigma 10mg/ml) をソニケー
ションにより平均２００塩基対の長さの二本鎖核酸とし
た後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で段階的に
希釈して１００ｎＭ（塩基対として）の二本鎖核酸溶液
とした。
【０１２１】（２）化学発光の検出 上記（１）で調製した試薬Ａ及びＢの各４００μｌを１
ｃｍ×１ｃｍ（光路長×光路幅）の蛍光測定用石英セル
に採り、よく混和後、試薬Ｃ及びＤの各４００μｌを加
え、速やかに混ぜ合せ、該化学発光性物質を二本鎖核酸
にインターカレートさせ、その発光スペクトルを瞬間マ
ルチ測光システム ＩＭＵＣ−７０００（大塚電子工
業）によって測定した。表２に各化学発光性化合物の最
大発光強度を示した発光波長と、相対発光強度を示す。
相対発光強度（Ｌn）は、式： Ｌn＝［Ｉn／Ｉa］×１００ ［ただし、Ｉn＝［ｒＩn／Ｃn］（ｒＩnは実測発光強
度、Ｃnは発光性物質濃度、ｎは化合物番号である。］
により算出されるものである。
【０１２２】
【表２０】 なお、同様の実験を試薬Ｄを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）に代えて行ったところ、化学発光は検出され
なかった。
【０１２３】この結果により、表２に挙げた化合物は、
水系媒体中では二本鎖核酸の存在下のみにおいて化学発
光を生じるものであり、二本鎖核酸の検出に有効である
ことがわかる。また、化合物によって様々な波長での発
光を起すにも拘らず、良好な発光強度を示すこともわか
る。
【０１２４】実施例２（二本鎖核酸の定量） （１）試薬の調製 Ｅ．化学発光性物質溶液：上記表２の化合物ｃの必要量
をジメチルスルホキシドの適当量に溶解後、これを１０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で２０倍希釈し、濃度
が１０μＭの溶液を調製した。
【０１２５】Ｆ．二本鎖核酸溶液：実施例１で調製した
試薬Ｄを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で段階的
に希釈し、０．０５、０．５、５、５０、５００ｆＭ
（塩基対として）の各濃度の二本鎖核酸溶液をそれぞれ
調製した。
【０１２６】（２）発光強度の測定 実施例１で調製した試薬Ａ、上記試薬Ｅ及びＦの各２０
０μｌをBioOrbit社製１２５１ルミノメーター用ポリス
チレンセルに採り、ルミノメーターの試料室に送った
後、装置に備えられている攪拌装置によって常時攪拌し
ながら実施例１で調製した試薬Ｃの４００μｌの付属の
ディスペンサーを用いて加えた。ディスペンサーを作動
後５秒後から１５秒後まで（最大発光強度時を含む）の
発光強度を測定し、その積分値を計測した。図１に計測
結果を示す（なお、二本鎖核酸溶液の代りに同量の１０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えた際のブランク
値を便宜上過酸化水素濃度０．００１ｆＭとしてプロッ
トした）。図１から、化合物ｃを用いて二本鎖核酸の定
量が可能であること、更にその検出限界がほぼ０．１ｆ
Ｍ（塩基対として）であることがわかる。
【０１２７】実施例３（二本鎖核酸の定量） 化合物ｃの代りに化合物ａを用いる以外は、実施例２と
同様にして二本鎖核酸の検出を行った。得られた結果を
図２に示す。この化合物での検出限界もほぼ０．１ｆＭ
（塩基対として）であった。
【０１２８】実施例４（二本鎖核酸の定量） 化合物ｃの代りに化合物ｐを用いる以外は、実施例２と
同様にして二本鎖核酸の検出を行った。得られた結果を
図３に示す。この化合物での検出限界もほぼ０．１ｆＭ
（塩基対として）であった。
【０１２９】以下の実施例５〜１４（標的一本鎖核酸の
検出方法）において、試料とプローブ核酸とのハイブリ
ダイゼーションのための操作は「バイオ実験イラストレ
イテッド 遺伝子解析の基礎 細胞工学別冊」（秀潤
社）１９９５年９月２５日、１３７〜１５２頁の記載、
また、発光反応のための操作については「生物発光と化
学発光 基礎と実験」（廣川書店１９８９年１０月１０
日発行、２５７〜２５８頁に記載の方法に従った。ま
た、実施例５〜１４で共通で用いた試薬の調製は以下の
ようにして行った。
【０１３０】（１）ハイブリダゼーション用緩衝液：１
Ｍチャーチリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）５０ｍｌ、５０
０ｍＭ ＥＤＴＡ２００μｌ及びドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ：粉末）７ｇを混合し、純水を加えて全量を
１００ｍｌとしてハイブリダイゼーション用緩衝液を得
た。
【０１３１】（２）洗浄液：また、１Ｍチャーチリン酸
緩衝液（ｐＨ７．２）４０ｍｌ、１０重量％ＳＤＳ１０
０ｍｌ、純水８６０ｍｌを混合し、洗浄液とした。
【０１３２】実施例５（アクリジンオレンジによる一本
鎖ＤＮＡの検出） （１）ハイブリダイゼーション ＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５）１０μｌに一本鎖ＤＮＡ Ｍ
１３ｍｐ１８（宝酒造社製）をそれぞれ０．００１、
０．０１、０．１、１．０、１０、１００、１００アト
モル含む試料液（計７種）を得た。
【０１３３】次に、ブロッティングメンブラン［商品
名：Hybond Ｎ+；アマシャム・インターナショナル（AM
ERSHAM INTERNATIONAL plc.）］を直径１６．５ｍｍの
円形にカットしたものを７枚用意し、それぞれの中央に
上記試料液を個々に含浸させ、室温に３０分間放置して
乾燥させた後、更に、２×ＳＳＣ緩衝液中で６０秒洗っ
てから８０℃で２時間乾燥させて各々のメンブランに試
料を固定した。
【０１３４】試料を固定した各メンブランを２４ウエル
組織培養用平底マイクロプレート（コーニング社製）の
ウエルの底面にそれぞれ敷き、６０℃に予め加熱したハ
イブリダイゼ−ション用緩衝液１ｍｌで各ウエルを満た
した後、６０℃、５分間プレハイブリダイゼーションを
行った。
【０１３５】次に、プローブとしてＭ１３ Ｐｒｉｍｅ
ｒ Ｍ４ ｄ（ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ）
（宝酒造社製）を各１ピコモル含むＴＥ緩衝液５μｌ
に、予め９０℃でヒートショックをかけた後、上記の各
ウエルに加えた。この状態で、プレートにカバーをし、
６０℃で振盪させながら１８時間ハイブリダイゼーショ
ンを行った。
【０１３６】ハイブリダイゼーション終了後、各ウエル
から溶液を取り除き、洗浄液１ｍｌを加え６０℃で５分
間洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した後、室温で
ＴＥ緩衝液１ｍｌで二回洗浄し、ＴＥ緩衝液を各ウエル
から除去したものを以下の（２）の操作に用いた。
【０１３７】（２）発光の検出 発光の検出に用いた試薬は以下のとおりである。
【０１３８】０．１Ｍ Ｈ2Ｏ2溶液：ｔ−ブチルアル
コール２０ｍｌとフタル酸ジメチル８０ｍｌに、３０重
量％のＨ2Ｏ2水溶液の１ｍｌを加えよく混和して調製し
た。
【０１３９】化学発光性物質溶液：０．１ｍＭ（３ｍ
ｇ／１０ｍｌ）アクリジンオレンジのフタル酸ジブチル
溶液を１０００倍に希釈し、０．１μＭとして調製し
た。
【０１４０】２．３ｍＭ ビス（２，４，６−トリク
ロロフェニル）オキザレート（ＴＣＰＯ：化合物５６）
溶液：ＴＣＰＯ４５ｍｇをフタル酸ジメチル４０ｍｌに
溶解させて調製した。
【０１４１】また、測定装置としては、蛍光自動測定シ
ステムＣｙｔｏＦｌｏｕｒ II（日本パーセプティブリ
ミテッド製）の励起用フィルター部分に遮蔽板を置き、
励起光が測定箇所に到達しないようにし、また、蛍光用
のフィルター部分を素通しとし、全ての発光を検知でき
るように修正を加えたものを使用した。なお、検出器の
ゲインは８０に設定した。
【０１４２】前記（１）の処理を行ったプレートの各ウ
エルをフタル酸ジメチル１ｍｌで１回洗浄した後、上記
の溶液１ｍｌを加え５分間室温に放置し、更に、この
溶液を捨ててから、フタル酸ジメチル１ｍｌで３回洗浄
した。次に、洗浄液としてのフタル酸ジメチルを除去し
た各ウエル内に、上記の溶液６００μｌ、の溶液４
００μｌを加え、速やかに混和後、測定装置内に備えら
れている攪拌装置によって常時攪拌しながら、溶液を加
えてから１０秒後の発光強度を測定した。結果を図４に
示す。図４から、検出感度はおおよそ１．０アトモルで
あることがわかる。
【０１４３】なお、比較のため、化学発光性物質溶液
のウエルへの添加後のプレートの洗浄を行わない以外は
同様の操作を繰り返して発光を測定したところ、測定の
バックグラウンドが高すぎて良好な測定結果を得ること
ができなかった。
【０１４４】実施例６（２，４，６−トリフェニルピリ
リウムパークロレートによる一本鎖ＤＮＡの検出；非水
系溶媒系） （１）ハイブリダイゼーション 実施例５の（１）と同様にしてハイブリダイゼーション
及び洗浄等の操作を行った。
【０１４５】（２）発光の検出 発光の検出に用いた試薬は以下のとおりである。
【０１４６】０．１Ｍ Ｈ2Ｏ2溶液：ｔ−ブチルアル
コール２０ｍｌとフタル酸ジメチル８０ｍｌに、３０重
量％のＨ2Ｏ2水溶液の１ｍｌを加えよく混和して調製し
た。
【０１４７】化学発光性物質溶液：０．１ｍＭ（４．
５ｍｇ／１０ｍｌ）の２，４，６−トリフェニルピリリ
ウムパークロレートのフタル酸ジメチル溶液を１０００
倍に希釈した０．１μＭとして調製した。
【０１４８】２．５ｍＭ ビス（２，４−ジニトロフ
ェニル）オキザレート（ＤＮＰＯ、化合物５９）溶液：
ＤＮＰＯ４２ｍｇをフタル酸ジメチル４０ｍｌに溶解さ
せて調製した。
【０１４９】上記（１）のハイブリダイゼーション及び
洗浄を行ったプレートの各ウエルをフタル酸ジメチル１
ｍｌで１回洗浄した後、上記の溶液１ｍｌを加え、５
分間室温に放置した。次いで、この溶液を捨て、フタル
酸ジメチル１ｍｌで３回洗浄した。更にフタル酸ジメチ
ルを除いた各ウエルに、上記の溶液６００μｌ及び上
記の溶液４００μｌを加え、速やかに混和後、実施例
１と同様に設定した測定装置内に備えられている攪拌装
置によって常時攪拌しながら、溶液を加えてから１０秒
後の発光強度を測定した。結果を図５に示す。図５か
ら、検出感度はおおよそ１．０アトモルであることがわ
かる。
【０１５０】なお、比較のため、化学発光性物質溶液
のウエルへの添加後の洗浄を行わない以外は同様の操作
を繰り返して発光を測定したところ、測定のバックグラ
ンドが高すぎて良好な測定結果を得ることができなかっ
た。
【０１５１】実施例７（２−メチル−４，６−ビス（４
−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウムアイオ
ダイドによる一本鎖の検出） （１）ハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーション後の洗浄液での洗浄後のＴＥ緩
衝液での２回の洗浄操作を、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）１ｍｌで行う以外は、実施例５の（１）と同
様にしてハイブリダイゼーション等の操作を行った。
【０１５２】（２）発光の検出 発光の検出に用いた試薬は以下のとおりである。
【０１５３】０．２Ｍ Ｈ2Ｏ2溶液：ジメチルスルホ
キシド（ＤＭＳＯ）５ｍｌと１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）９３ｍｌの混合液に、３０重量％のＨ2Ｏ2水
溶液の２ｍｌを加え、よく混和して調製した。
【０１５４】化学発光性物質溶液：４．５ｍｇの２−
メチル−４，６−ビス（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフ
ェニル）ピリリウムアイオダイドを１ｍｌのＤＭＳＯに
溶解させた後、９ｍｌの１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ
６．０）に注入し、混和した。これをＤＭＳＯを５重量
％の濃度で含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）
で４００倍に希釈し、０．２５μＭとして調製した。
【０１５５】２．５ｍＭ ＤＮＰＯ溶液：ＤＮＰＯ４
２ｍｇをＤＭＳＯ４ｍｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
６．０）３６ｍｌに溶解させて調製した。
【０１５６】上記（１）のハイブリダイゼーション及び
洗浄を行ったプレートの各ウエルに上記の溶液４００
μｌを加え、室温で５分間放置し二本鎖核酸にインター
カレートさせた後、更に、上記の溶液２００μｌ及び
の溶液４００μｌを加え、速やかに混和後、実施例６
と同様に設定した測定装置内に備えられている攪拌装置
によって常時攪拌しながら、溶液を加えてから１０秒後
の発光強度を測定した。結果を図６に示す。図６から、
検出感度はおおよそ０．１アトモルであることがわか
る。
【０１５７】実施例８（ＹＯＹＯ−１による二本鎖ＤＮ
Ａの検出） （１）ハイブリダイゼーション エッペンドルフチューブ中に、純水５μｌに二本鎖ＤＮ
Ａ Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ（宝酒造社製）をそれぞれ０．
００１、０．０１、０．１、１．０、１０、１００及び
１０００アトモル含む試料液を調製した後、各チューブ
内に１．５ＭＮａＯＨ水溶液５μｌを加え、３０分間室
温で放置して、二本鎖ＤＮＡを一本鎖に変性させて試料
溶液とした。
【０１５８】次に、プロッティングメンブラン（商品
名：Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ+ ：アマシャム・インターナショ
ナル社製）を直径１６．５ｍｍの円形にカットしたもの
を７枚用意し、それぞれの中央に上記試料液を個々に含
浸させ、室温に３０分間放置して乾燥させた後、更に、
２×ＳＳＣ緩衝液中で６０秒、３回洗ってから８０℃で
２時間乾燥させて、各々のメンブランに試料を固定し
た。
【０１５９】試料を固定した各メンブランを２４ウエル
組織培養用平底マイクロプレート（コーニング社製）の
ウエルの底面にそれぞれ敷き、６０℃に予め加熱したハ
イブリダイゼ−ション用緩衝液１ｍｌで各ウエルを満た
した後、６０℃、５分間プレハイブリダイゼーションを
行った。
【０１６０】次に、プローブとしてＭ１３ Ｐｒｉｍｅ
ｒ Ｍ３ ｄ（ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ）
（寳酒造社製）を各１ピコモル含むＴＥ緩衝液５μｌ
に、予め９０℃でヒートショックをかけた後、上記の各
ウエルに加えた。この状態で、プレートにカバーをし、
６０℃で振盪させながら１８時間ハイブリダイゼーショ
ンを行った。
【０１６１】ハイブリダイゼーション終了後、各ウエル
から溶液を取り除き、洗浄液１ｍｌを加え６０℃で５分
間洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した後、室温で
ＴＥ緩衝液１ｍｌで二回洗浄し、ＴＥ緩衝液を各ウエル
から除去したものを以下の（２）の操作に用いた。
【０１６２】（２）発光の検出 発光の検出に用いた試薬は以下のとおりである。
【０１６３】０．１Ｍ Ｈ2Ｏ2溶液：ｔ−ブチルアル
コール２０ｍｌとフタル酸ジメチル８０ｍｌに、３０重
量％のＨ2Ｏ2水溶液の１ｍｌを加えよく混和して調製し
た。
【０１６４】化学発光性物質溶液：０．１ｍＭ（１３
ｍｇ／１０ｍｌ）ＹＯＹＯ−１（モレキュラープローブ
社製）のフタル酸ジブチル溶液を１０００倍に希釈し、
０．１μＭとして調製した。
【０１６５】２．３ｍＭ ＴＣＰＯ溶液：ＴＣＰＯ４
５ｍｇをフタル酸ジメチル４０ｍｌに溶解させて調製し
た。
【０１６６】上記（１）のハイブリダイゼーション及び
洗浄を行ったプレートの各ウエルを、更に、フタル酸ジ
メチル１ｍｌで１回洗浄した後、上記の溶液１ｍｌを
加え、室温で５分間放置した後、更に、フタル酸ジメチ
ル１ｍｌで３回洗浄した。次に、このフタル酸ジメチル
を除去した各ウエルに、上記の溶液６００μｌ及び
の溶液４００μｌを加え、速やかに混和後、実施例１と
同様に設定した測定装置内に備えられている攪拌装置に
よって常時攪拌しながら、溶液を加えてから１０秒後の
発光強度を測定した。結果を図７に示す。図７から、検
出感度はおおよそ１０アトモルであることがわかる。
【０１６７】なお、比較のため、化学発光性物質溶液
のウエルへの添加後の洗浄を行わない以外は同様の操作
を繰り返して発光を測定したところ、測定のバックグラ
ウンドが高すぎて良好な測定結果を得ることができなか
った。
【０１６８】実施例９（２−メチル−４，６−ジフェニ
ルピリリウムパークロレートによる二本鎖ＤＮＡの検
出；非水系溶媒系） （１）ハイブリダイゼーション 実施例８と同様にしてハイブリダイゼーション及び洗浄
等の操作を行った。
【０１６９】（２）発光の検出 発光の検出に用いた試薬は以下のとおりである。
【０１７０】０．１Ｍ Ｈ2Ｏ2溶液：ｔ−ブチルアル
コール２０ｍｌとフタル酸ジメチル８０ｍｌに、３０重
量％のＨ2Ｏ2水溶液の１ｍｌを加えよく混和して調製し
た。
【０１７１】化学発光性物質溶液：０．１ｍＭ（４．
５ｍｇ／１０ｍｌ）の２−メチル−４，６−ジフェニル
ピリリウムパークロレートのフタル酸ジブチル溶液を１
０００倍に希釈し、０．１μＭとして調製した。
【０１７２】２．５ｍＭ ＤＮＰＯ溶液：ＤＮＰＯ４
２ｍｇをフタル酸ジメチル４０ｍｌに溶解させて調製し
た。
【０１７３】上記（１）のハイブリダイゼーション及び
洗浄を行ったプレートの各ウエルを、更に、フタル酸ジ
メチル１ｍｌで１回洗浄した後、上記の溶液１ｍｌを
加え、室温で５分間放置し二本鎖核酸にインターカレー
トさせた後、更に、フタル酸ジメチル１ｍｌで３回洗浄
した。次に、このフタル酸ジメチルを除去した各ウエル
に、上記の溶液６００μｌ及びの溶液４００μｌを
加え、速やかに混和後、実施例１と同様に設定した測定
装置内に備えられている攪拌装置によって常時攪拌しな
がら、溶液を加えてから１０秒後の発光強度を測定し
た。結果を図８に示す。図８から、検出感度はおおよそ
１．０アトモルであることがわかる。
【０１７４】なお、比較のため、化学発光性物質溶液
のウエルへの添加後の洗浄を行わない以外は同様の操作
を繰り返して発光を測定したところ、測定のバックグラ
ウンドが高すぎて良好な測定結果を得ることができなか
った。
【０１７５】実施例１０（４−メチル−２，６−ビス
（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウムア
イオダイドによる二本鎖ＤＮＡの検出） （１）ハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーション後の洗浄液での洗浄後のＴＥ緩
衝液での２回の洗浄操作を、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）１ｍｌで行う以外は、実施例８の（１）と同
様にしてハイブリダイゼーション等の操作を行った。
【０１７６】（２）発光の検出 発光の検出に用いた試薬は以下のとおりである。
【０１７７】０．２Ｍ Ｈ2Ｏ2溶液：ＤＭＳＯ５ｍｌ
と１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）９３ｍｌの混合
液に、３０重量％のＨ2Ｏ2水溶液の２ｍｌを加えよく混
和して調製した。
【０１７８】化学発光性物質溶液：４．５ｍｇの２−
メチル−４，６−ビス（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフ
ェニル）ピリリウムアイオダイド１ｍｌのＤＭＳＯに溶
解させた後、９ｍｌの１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ
６．０）に注入し、混和した。これをＤＭＳＯを５重量
％の濃度で含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）
で４００倍に希釈し、０．２５μＭとして調製した。
【０１７９】２．５ｍＭ ＤＮＰＯ溶液：ＤＮＰＯ４
２ｍｇをＤＭＳＯ４ｍｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
６．０）３６ｍｌに溶解させて調製した。
【０１８０】上記（１）のハイブリダイゼーション及び
洗浄を行ったプレートの各ウエルに、上記の溶液４０
０μｌを加え、室温で５分間放置し二本鎖核酸にインタ
ーカレートさせた後、更に、上記の溶液２００μｌ及
びの溶液４００μｌを加え、速やかに混和後、実施例
５と同様に設定した測定装置内に備えられている攪拌装
置によって常時攪拌しながら、溶液を加えてから１０秒
後の発光強度を測定した。結果を図９に示す。図９か
ら、検出感度はおおよそ０．１アトモルであることがわ
かる。
【０１８１】実施例１１（４−メチル−２，６−ビス
（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウムア
イオダイドによるｍＲＮＡの検出） （１）ハイブリダイゼーション ヒトβ2アドレナリン作用受容体ｍＲＮＡの塩基配列の
一部分に相補的な塩基配列を有し、かつ５’末端にアミ
ノ基を有するプローブ核酸を合成した。合成は、ＡＢＩ
社製３８１Ａ ＤＮＡ合成器を用いて行い、また、５’
末端へのアミノ酸の結合は、グレンリサーチ社製５’−
アミノモディファイア−Ｃ６を用いて行った、なお、Ｈ
ＰＬＣによる精製は常法に従って行った。この合成され
たプローブ核酸の塩基配列は以下のとおりである。
【０１８２】５’−ＮＨ2 −ＡＴＧＣＴＧＧＣＣＧＴＧ
ＡＣＧＣＡＣＡＧＣＡ−３’マイクロプレート（住友ベ
ークライト社製ＭＳ−３７９６Ｆ）の各ウエル内に上記
のプローブ核酸を入れ、１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、
Ｎ−ヒドロキシスルホスクシイミド（スルホ−ＮＨＳ）
を用いてプローブ核酸のアミノ基とプレート表面のカル
ボキシル基を共有結合させて、これを固定した。
【０１８３】一方、常法により、ヒトβ2アドレナリン
作用受容体ｃＤＮＡからＴ7ＲＮＡボリメレースを用い
てヒトβ2アドレナリン作用受容体ｍＲＮＡを合成し、
ＤＮａｓｅ処理後精製した。
【０１８４】先のプローブ核酸を固定したプレートの各
ウエルを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５０μ
ｌで４５℃、１時間処理し、溶液とともにＤＮａｓｅを
除去した。次に、各ウエルに、それぞれヒトβ2アドレ
ナリン作用受容体ｍＲＮＡを０．００１、０．０１、
０．１、１．０、１０、１００及び１０００アトモルの
濃度で含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）各５０
μｌを個々に加え、７０℃で１０分間加熱した後、室温
に戻るまで放置して、プローブ核酸と標的核酸をハイブ
リダイズさせた。ハイブリダイゼーション終了後、溶液
を各ウエルから除去して以下の（２）の操作に用いた。
【０１８５】（２）発光の検出 発光の検出に用いた試薬は以下のとおりである。
【０１８６】０．２Ｍ Ｈ2Ｏ2溶液：ＤＭＳＯ５ｍｌ
と１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）９３ｍｌの混合
液に、３０重量％のＨ2Ｏ2水溶液の２ｍｌを加えよく混
和して調製した。
【０１８７】化学発光性物質溶液：４．５ｍｇの２−
メチル−４，６−ビス（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフ
ェニル）ピリリウムアイオダイドを１ｍｌのＤＭＳＯに
溶解させた後、９ｍｌの１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ
６．０）に注入し、混和した。これをＤＭＳＯを５重量
％の濃度で含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）
で４００倍に希釈し、０．２５μＭとして調製した。
【０１８８】２．５ｍＭ ＤＮＰＯ溶液：ＤＮＰＯ４
２ｍｇをＤＭＳＯ４ｍｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
６．０）３６ｍｌに溶解させて調製した。
【０１８９】上記（１）のハイブリダイゼーション処理
を行ったプレートの各ウエルに、上記の溶液１００μ
ｌを加え、よく混和後、室温で５分間放置し二本鎖核酸
にインターカレートさせた後、ウエル内の溶液を除去し
てから、上記の溶液５０μｌ及びの溶液１００μｌ
を加え、速やかに混和後、実施例５と同様に設定した測
定装置内に備えられている攪拌装置によって常時攪拌し
ながら、溶液を加えてから１０秒後の発光強度を測定し
た。結果を図１０に示す。図１０から、検出感度はおお
よそ０．１アトモルであることがわかる。
【０１９０】実施例１２（４−メチル−２，６−ビス
（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウムア
イオダイドによる未知の試料からのｍＲＮＡの検出） （１）検量線の作成 実施例１１と同様にして、プローブ核酸を固定したプレ
ートを用意し、更に、各種既知濃度のヒトβ2アドレナ
リン作用受容体ｍＲＮＡを各ウエルに添加してハイブリ
ダイゼーション及び発光の検出を行い、検量線を作成し
た。
【０１９１】（２）試料の調製 ヒトＨＬ６０の前骨髄球白血病細胞を遠心分離で集め、
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した後、１×１０3 、１×
１０4 、１×１０5 、１×１０6 及び１×１０ 7 細胞／
ｍｌの濃度で再懸濁させ、２１ゲージ付きプラスチック
シリンジを繰り返し通過させ、その後４５℃でＰＢＳ中
で１時間インキュベートした。各試料から、クローンテ
ック社製トータルＲＮＡセパレーターキットを用いて全
ＲＮＡを抽出、精製した。得られた各全ＲＮＡ試料をそ
れぞれＰＢＳに溶解させ、実施例１１と同様にして各ウ
エルに固定されたプローブ核酸と反応させた後、発光の
検出を行った。得られた発光強度を先に作成した検量線
に適用して試料中のヒトβ 2アドレナリン作用受容体ｍ
ＲＮＡの量を定量した。その結果、１×１０4 の細胞数
のサンプルからの試料においては、１ゼプトモル（１×
１０-21モル）（グラム換算１ｆｇ）／細胞の標的核酸
が検出された。
【０１９２】実施例１３（伸長法を組み合わせた標的核
酸の検出） （１）プローブ核酸の固定 プローブ核酸としてＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４ ｄ
（ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ）の配列を選択
し、実施例１１の方法に基づき、５’末端にアミノ基を
有するＤＮＡを合成し、マイクロプレートに共有結合さ
せた。
【０１９３】（２）ハイブリダイゼーション及び二本鎖
部分の伸長 ０．０１、０．１、１．０、１０及び１００ゼプトモル
の標的核酸Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡをそれぞれ上記
のマイクロプレートの各ウエルに加えて、実施例７と同
様の操作によってハイブリダイゼーションを行った。な
お、このマイクロプレートには標的核酸を加えないウエ
ルも用意しておいた。ハイブリダイゼーション終了後、
東洋紡社製Ｔａｑ ＤＮＡポリメレースを用いて二本鎖
部分に隣接する一本鎖を鋳型とする二本鎖部分の伸長を
行った（条件は奨励プロトコールにしたがった。また反
応時間は１時間とした）。
【０１９４】（３）発光の検出 １０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で伸長反応を行
った各ウエルを洗浄して、ＤＮＡポリメレース及び各ヌ
クレオチドモノマーを除去した後、実施例１１と同様に
して、４−メチル−２，６−ビス（４−Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアミノフェニル）ピリリウムアイオダイドによる発光
の検出を行った。得られた結果を図１１に示す。図１１
から検出感度はおおよそ０．１〜１．０ゼプトモルであ
ることがわかる。すなわち、二本鎖部分の伸長を行うこ
とで、実施例７に比較して検出感度は２〜３桁向上し
た。
【０１９５】実施例１４（伸長法を組み合わせた標的核
酸の検出） （１）プローブ核酸の固定 実施例１１の（１）と同様にしてβ2アドレナリン作用
受容体ｍＲＮＡ検出用のプローブ核酸をプレートに固定
した。
【０１９６】（２）ハイブリダイゼーション 実施例１１の（２）と同様にして、所定の濃度のヒトβ
2アドレナリン作用受容体ｍＲＮＡを各ウエルに加えハ
イブリダイゼーションを行った。
【０１９７】（３）二本鎖部分の伸長 上記（２）のハイブリダイゼーションが終了したプレー
トの各ウエルを洗浄後、クローンテック社製1st-strand
cDNA Synthesis Kit を用いてプローブ核酸をプライマ
ーとし、標的核酸側の一本鎖部分をテンプレートとして
核酸伸長反応を、常法により行った。
【０１９８】（４）発光の検出 １０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で伸長反応終了
後の各ウエルを洗浄して、リバーストランスクリプテー
ス及び各ヌクレオチドモノマーを除去した後、実施例１
１と同様にして、４−メチル−２，６−ビス（４−Ｎ，
Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウムアイオダイド
による発光の検出を行った。得られた結果を図１２に示
す。図１２から検出感度はおおよそ０．１〜１．０ゼプ
トモルであることがわかる。すなわち、二本鎖部分の伸
長を行うことで、実施例１１に比較して検出感度は２〜
３桁向上した。
【０１９９】実施例１５ ［２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチル
アミノフェニル）ピリリウムアイオダイドの合成］ 無水酢酸１００ｍｌと濃硫酸３０ｍｌとを冷却しながら
混合し、得られた混合液をウォーターバスで８０℃に保
ちながら３時間加温した。そこに無水酢酸２０ｍｌ、ｐ
−ジメチルアミノアセトフェノン３０ｍｌを室温下で加
え、その後４５℃に温度を上昇させて２４時間攪拌し反
応させた。この反応液に等量のエタノールを加え、冷却
し、更にヨウ化カリウム水溶液を加えると粗結晶が析出
した。この粗結晶を濾過により回収し、エタノール／エ
ーテルの混合液（容量比、１：４）で再結晶させて、２
−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミ
ノフェニル）ピリリウムアイオダイド（表１の化合物１
（ただしＹはＩである））の緑色の結晶を得た。
【０２００】得られた化合物１（Ｙ：Ｉ）の分析結果 融点：２５４〜２５７℃ ＵＶ／可視（ＣＨ3 ＣＮ ε×１０-4 ）λｍａｘ：４
４４ｎｍ（２．４３）、５５０ｎｍ（８．２４） ＮＭＲ（ 1Ｈ、ＤＭＳＯ）δｐｐｍ：８．３７３７（１
Ｈ、ｓ）、８．２７２９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．０Ｈ
ｚ）、８．１７９５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）、
７．８８６４（１Ｈ、ｓ）、６．９１１７（４Ｈ、ｔ、
ＪAB＝ＪAB＝９．７７）、３．１８２９（６Ｈ、ｓ）、
３．１３４０（６Ｈ、ｓ）、２．６８０９（３Ｈ、ｓ）
ＦＡＢ ｍａｓｓ ｍ／ｚ ３３３ ＩＲ（ＫＢｒ）νｃｍ-1：１６４５、１６１０（ｓ
ｈ）、１５８０（ｓ）、１４９０（ｓ）、１２７０、１
２００、１１６０ ［試薬溶液の調整］ （１）０．２Ｍ Ｈ2Ｏ2溶液：ｔ−ブチルアルコール２
０ｍｌとフタル酸ジメチル８０ｍｌに３０％Ｈ2Ｏ2の２
ｍｌを加えよく溶解した。
【０２０１】（２）化学発光性物質溶液：さきに合成し
た２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチル
アミノフェニル）ピリリウムアイオダイドをフタル酸ジ
メチルに溶解し、溶液の吸光度を０．５とした。
【０２０２】［発光強度の測定］上記（１）、及び
（２）の溶液各１ｍｌを１ｃｍ×１ｃｍ（光路長×光路
幅）の蛍光測定用石英セルに採り、よく混和後、（３）
の溶液１ｍｌを加え速やかに混ぜ合せ、その発光スペク
トルを瞬間マルチ測光システムＩＭＵＣ−７０００（大
塚電子工業）によって測定した。化学発光性物質の最大
発光強度の積分値を濃度で規格化し、かつ、ローダミン
Ｂの発光強度を１００とした相対発光強度と、化学発光
性物質の最大発光強度を示す波長を表３に示した。
【０２０３】実施例１６ 実施例１５において、化学発光性物質を表３のａからｂ
〜ｒ及びローダミンＢの各々に代えた以外は実施例１５
と同様にして各化学発光性物質の相対発光強度及び最大
発光強度を示す波長を表３に示した。
【０２０４】
【表２１】 表４に代表的なシュウ酸エステルであるビスジニトロフ
ェニルオキザレート（ＤＮＰＯ）と過酸化水素を発光試
薬として用いた際の種々の蛍光物質の相対発光強度を示
す（今井一洋編「生物発光と化学発光基礎と実験」廣川
書店１９８９年１月１０日発行、７７〜１０８頁、相対
発行強度はローダミンＢを１００とした。また、発光波
長に関しては本発明者の測定による。）。
【０２０５】
【表２２】 表４からわかるように一般的に蛍光量子収率の大きな蛍
光物質（例えば、フルオロセイン）が必ずしも発光強度
が強いとは言えない。
【０２０６】表３を表４と比較することにより本発明に
おける化学発光性物質が従来の発光物質に比べはるかに
強い発光強度を有するか、あるいは、同等以上の発光強
度を有することがわかる。また、これらの強い発光強度
をもつ発光物質が、ピリリウム、もしくは、チアピリリ
ウムに属するために、溶解性等の化学的性質が同質であ
り、従って、同一の系での複数の発光物質の使用が容易
となる。また、発光強度が強いだけでなく、強度のばら
つき幅が一桁の範囲におさまるので、例えば、測定装置
に特に工夫をすることなく複数の発光物質の使用が可能
となる。更に、表３から本発明の発光物質はその発光波
長が近紫外から近赤外の領域にわたるので先に述べた特
徴と合わせて、同一の系での多パラメーター解析に非常
に有利となることがわかる。
【０２０７】実施例１７ （表３の化合物ｃ：２−メチル４，６−ジフェニルピリ
リウムパークロレートによる過酸化水素の定量） ［試薬溶液の調製］ （１）Ｈ2Ｏ2溶液：ｔ−ブチルアルコールとフタル酸ジ
メチルに適当量のＨ2Ｏ2（３０％溶液を適宜希釈したも
の）を加えよく混和し、０．５、１．０、５．０、５
０、５００、５０００ｆＭの溶液を調製した。
【０２０８】（２）発光物質溶液：表３の化合物ｃをフ
タル酸ジメチルに溶解し、５０μＭの溶液とした。
【０２０９】（３）２．５ｍＭ ＤＮＰＯ溶液：ＤＮＰ
Ｏ ４２ｍｇをフタル酸ジメチル４０ｍｌに溶解した。
【０２１０】［発光強度の測定］上記（１）の溶液２０
０μｌ、（２）の溶液４００μｌのBioOrbit社製１２５
１ルミノメーター用のポリスチレンセルに採り、ルミノ
メーターの試料室に送った後、装置に備えられている攪
拌装置によって常時攪拌しながら（３）の溶液４００μ
ｌを付属のディスペンサーを用いて加えた。ディスペン
サーを作動後５秒後から１５秒後まで（最大発光強度時
を含む）の発光強度の積分値を測定した。図１３に測定
値を示す（なお、過酸化水素を加えないブランク値を便
宜上過酸化水素濃度０．０１ｆＭとしてプロットし
た）。
【０２１１】図１３から化合物ｃによる過酸化水素の検
出限界はほぼ１ｆＭである。
【０２１２】実施例１８ （表３の化合物ａ：２−メチル−４，６−ビス（４−
Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウムアイオダ
イトによる過酸化水素の定量） 化合物ｃを化合物ａに代えた以外は実施例１７と同様に
して過酸化水素の定量を行った。
【０２１３】図１４に測定値を示す（なお、過酸化水素
を加えないブランク値を便宜上過酸化水素濃度０．０１
ｆＭとしてプロットした）。
【０２１４】図１４から化合物ａによる過酸化水素の検
出限界は化合物ｃと同様ほぼ１ｆＭである。
【０２１５】実施例１９ （表３の化合物ｐ：２，４，６−トリス（４−Ｎ，Ｎ−
ジメチルアミノフェニル）チアピリリウムアイオダイド
による過酸化水素の定量） 化合物ｃを化合物ｐに代えた以外は実施例１７と同様に
して過酸化水素の定量を行った。
【０２１６】図１５の測定値を示す（なお、過酸化水素
を加えないブランク値を便宜上過酸化水素濃度０．０１
ｆＭとしてブロットした）。
【０２１７】図１５から化合物ｐによる過酸化水素の検
出限界はほぼ１０ｆＭである。
【０２１８】比較例１ （ローダミンＢによる過酸化水素の定量）化合物ａをロ
ーダミンＢに代えた以外は実施例１７と同様にして過酸
化水素の定量を行った。
【０２１９】図１６に測定値を示す（なお、過酸化水素
を加えないブランク値を便宜上過酸化水素濃度０．０１
ｆＭとしてプロットした）。
【０２２０】図１６からローダミンＢによる過酸化水素
の検出限界ほぼ１０ｆＭである。
【０２２１】実施例１７〜１９、及び比較例１から、式
（１）にかかるピリリウム化合物は従来の発光物質に対
して近紫外〜近赤外の波長領域で十分な検出感度を有し
ていることがわかる。
【０２２２】実施例２０ 表１の化学発光性物質Ｎｏ．６及び１６の化学発光特性
を調べた。発光条件は前記実施例１５と同様であり、相
対発光強度はローダミンＢを１００とした。結果を表５
に示す。これらの化学発光性物質は長波長領域において
も十分な発光強度を有していることがわかる。
【０２２３】
【表２３】
【０２２４】
【発明の効果】本発明によれば、バックグランドのない
極めて高感度（例えば、濃度で０．１ｆＭ、絶対量とし
て０．１アトモル、いずれも塩基対換算）な二本鎖核酸
の検出、定量が可能となる。
【０２２５】本発明によれば、二本鎖核酸の検出に化学
発光を用いるので蛍光法における先に述べた問題を解決
できるとともに、化学発光性物質は二本鎖形成後に使用
されるので化学発光性物質を標識としてプローブ核酸に
結合させる場合における不安定性等の問題もない。
【０２２６】化学発光性物質による二本鎖核酸の検出
を、化学発光性物質が前記二本鎖核酸に相互作用下にお
いて、または相互作用を通して初めて化学発光可能な状
態となる条件下で行うことで、二本鎖核酸に作用してい
ない化学発光性物質を反応系から除去する操作が不要と
なり、操作の簡便化が図れ、更にバックグランドが効果
的に低減された高感度での検出が可能となる。
【０２２７】更に、固相上で形成される標的核酸とプロ
ーブ核酸とのハイブリッド体における二本鎖部分を伸長
して拡大させることで、化学発光性物質との相互作用を
生じる部位を拡げることができ、二本鎖核酸の検出が更
に容易になり、検出感度を更に高めることができる。
【０２２８】本発明の化学発光性物質は従来の発光物質
に比べはるかに強い発光強度を有するか、あるいは、同
等以上の発光強度を有する。また、これらの化学発光性
物質はピリリウム、もしくは、チアピリリウムを有する
化合物群に属するので、溶解性等の化学的性質が同質で
あり、従って、同一の系での複数の発光物質の使用が容
易となる。また、発光強度が強いだけではなく、強度の
ばらつきの幅が一桁の範囲におさまるので、測定装置に
特に工夫をすることなく複数の発光物質の使用が可能と
なる。更に、表３、表５に示したように本発明の化学発
光物質の発光波長は近紫外から近赤外の領域にわたるた
め、先に述べた特徴とあわせ、同一の系での多パラメー
ター解析に非常に有利となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２において得られた結果を示す図であ
る。
【図２】実施例３において得られた結果を示す図であ
る。
【図３】実施例４において得られた結果を示す図であ
る。
【図４】実施例５において得られた結果を示す図であ
る。
【図５】実施例６において得られた結果を示す図であ
る。
【図６】実施例７において得られた結果を示す図であ
る。
【図７】実施例８において得られた結果を示す図であ
る。
【図８】実施例９において得られた結果を示す図であ
る。
【図９】実施例１０において得られた結果を示す図であ
る。
【図１０】実施例１１において得られた結果を示す図で
ある。
【図１１】実施例１３において得られた結果を示す図で
ある。
【図１２】実施例１４において得られた結果を示す図で
ある。
【図１３】表３の化合物ｃによる過酸化水素定量におけ
る過酸化水素の濃度と発光強度との関係を示す図であ
る。
【図１４】表３の化合物ａによる過酸化水素の定量にお
ける過酸化水素の濃度と発光強度との関係を示す図であ
る。
【図１５】図３の化合物ｐによる過酸化水素の定量にお
ける過酸化水素の濃度と発光強度との関係を示す図であ
る。
【図１６】ローダミンＢによる過酸化水素の定量におけ
る過酸化水素の濃度と発光強度との関係を示す図であ
る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｄ 421/02 Ｃ０７Ｄ 421/02 Ｃ０９Ｋ 11/07 Ｃ０９Ｋ 11/07 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 // Ｇ０１Ｎ 21/76 21/76

Claims (115)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 試料中の標的核酸の検出方法であって、
    二本鎖核酸と相互作用可能な化学発光性物質を該標的核
    酸を有する二本鎖核酸と相互作用させ、該二本鎖核酸と
    相互作用した該化学発光性物質の化学発光を検出する工
    程を有することを特徴とする標的核酸の検出方法。
  2. 【請求項２】 該標的核酸が該二本鎖核酸である請求項
    １に記載の標的核酸の検出方法。
  3. 【請求項３】 該標的核酸が第１の塩基配列を有する一
    本鎖核酸であって、該標的核酸を有する二本鎖核酸が該
    一本鎖核酸と、第１の塩基配列と相補的な第２の塩基配
    列を有するプローブ核酸とのハイブリッドである請求項
    １に記載の標的核酸の検出方法。
  4. 【請求項４】 試料中の該一本鎖核酸と該プローブ核酸
    とをハイブリダイズさせ、該化学発光性物質と相互作用
    する該二本鎖核酸を形成する工程を更に有する、請求項
    ３に記載の標的核酸の検出方法。
  5. 【請求項５】 該標的核酸がＤＮＡまたはＲＮＡである
    請求項３又は４に記載の標的核酸の検出方法。
  6. 【請求項６】 該ＤＮＡがｃＤＮＡである請求項５に記
    載の標的核酸の検出方法。
  7. 【請求項７】 該ＲＮＡがｍＲＮＡ、ｔＲＮＡまたはｒ
    ＲＮＡである請求項５に記載の標的核酸の検出方法。
  8. 【請求項８】 該プローブ核酸がＤＮＡまたはＲＮＡで
    ある請求項３又は４に記載の標的核酸の検出方法。
  9. 【請求項９】 該標的核酸がオリゴリボアデニル酸から
    なる部分を有するｍＲＮＡであり、該プローブ核酸が、
    該標的核酸とのハイブリダイゼーションに関与する塩基
    配列としてオリゴデオキシリボチミジル酸またはポリデ
    オキシリボチミジル酸からなる部分を有する請求項３又
    は４に記載の標的核酸の検出方法。
  10. 【請求項１０】 該二本鎖核酸が固相に固定されている
    クレーム１〜９の何れかの標的核酸に記載の検出方法。
  11. 【請求項１１】 該固相に固定されている該二本鎖核酸
    が、 固相に固定された該標的核酸と、該プローブ核酸として
    該標的核酸の３’末端側の塩基配列に相補的な塩基配列
    を３’末端側に有する一本鎖核酸とを用意する工程；及
    び次いで該標的核酸と該プローブ核酸とをハイブリダイ
    ズさせて部分的二本鎖核酸を形成し、次いで各々の核酸
    の３’末端側に伸展反応によってヌクレオチドを重合せ
    しめて二本鎖部分を伸長させる工程、によって形成され
    たものであるクレーム１０の標的核酸の検出方法。
  12. 【請求項１２】 該固相に固定されている該二本鎖核酸
    が、 該プローブ核酸として該標的核酸の３’末端側の塩基配
    列に相補的な塩基配列を３’末端側に有する一本鎖核酸
    を用意し、該プローブ核酸を固相に固定する工程；及び
    次いで該標的核酸と該プローブ核酸とをハイブリダイズ
    させて部分的二本鎖核酸を形成し、次いで各々の核酸の
    ３’末端側に伸展反応によってヌクレオチドを重合せし
    めて二本鎖部分を伸長させる工程、によって形成された
    ものである請求項１０に記載の標的核酸の検出方法。
  13. 【請求項１３】 該固相がプラスチックプレートである
    請求項１０〜１２の何れかに記載の標的核酸の検出方
    法。
  14. 【請求項１４】 該化学発光性物質が該二本鎖核酸の二
    重らせん構造にインターカレーターとして挿入されるも
    のである請求項１〜１３の何れかに記載の標的核酸の検
    出方法。
  15. 【請求項１５】 該化学発光性物質が下記式（１）で示
    されるピリリウム色素である請求項１４の標的核酸に記
    載の検出方法。 【化１】 （上記式中ＸはＯ，Ｓ，Ｓｅ又はＴｅであって、Ｒ1、
    Ｒ2及びＲ3から選ばれる２つの置換基は置換もしくは未
    置換のアリール基で有り、残りの置換基は、水素原子、
    ハロゲン原子、スルホネート基、アミノ基、スチリル
    基、ニトロ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、シア
    ノ基、置換もしくは未置換のアルキル基、または置換も
    しくは未置換のシクロアルキル基、または−Ａもしくは
    −Ｌ−Ａであり、 Ｌは−Ｌ1−、−Ｌ2−Ｌ3−または−Ｌ4−Ｌ5−Ｌ6−で
    あり、Ｌ1〜Ｌ6はそれぞれ独立して、−（ＣＨ＝ＣＨ）
    −、置換もしくは未置換のアリール基から誘導される２
    価の基、置換もしくは未置換の低級アルキレン基、また
    は−ＣＨ＝Ｒ4−（Ｒ4はオキソ基を有する環構造を示
    す）を表し、 Ａは、置換もしくは未置換のアリール基、−ＣＨ＝Ｒ5
    （Ｒ5は、置換もしくは未置換の複素環、置換もしくは
    未置換のシクロアルキル基、又は置換もしくは未置換の
    芳香環を示す）を表し、 Ｙ-はアニオンを示す。）
  16. 【請求項１６】 該式（１）中のＬが下記式（２）〜
    （６）の何れかである請求項１５に記載の標的核酸の検
    出方法。 【化２】 （上記式［２］中、Ｚは水素原子、または、置換もしく
    は未置換低級アルキル基を表し、ｎは０、１または２で
    ある。） 【化３】 （上記式［３］中、ｎは０、１または２であり、Φは置
    換もしくは未置換のｏ - 、ｍ- 、または、ｐ−フェニレ
    ン基を表す） 【化４】 （上記式［４］中、Φは置換もしくは未置換のｏ-、
    ｍ-、または、ｐ−フェニレン基を表す） 【化５】 【化６】
  17. 【請求項１７】 該式（１）で示される化学発光性物質
    が下記式（７）である請求項１５に記載の標的核酸の検
    出方法。 【化７】 （上記式［７］中、ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ、または、Ｔｅを
    表し、Ｙ-はアニオンを表す）
  18. 【請求項１８】 該式（７）において、ＸがＯまたはＳ
    であって、ＹがＩまたはＣｌＯ4である請求項１７に記
    載の標的核酸の検出方法。
  19. 【請求項１９】 該式（１）で示される化学発光性物質
    が下記式（８）で示される請求項１５の標的核酸に記載
    の検出方法。 【化８】 （上記式［８］中、ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ、または、Ｔｅを
    表し、Ｙ-はアニオンを表す）
  20. 【請求項２０】 該式（８）において、ＸがＯまたはＳ
    であって、ＹがＩまたはＣｌＯ4である請求項１９に記
    載の標的核酸の検出方法。
  21. 【請求項２１】 該式（１）で示される化学発光性物質
    が下記式（９）で示される請求項１５の標的核酸に記載
    の検出方法。 【化９】 （上記式［９］中、ＸはＯ、Ｓ、Ｔｅ、Ｓｅを表し、Ｙ
    -はアニオンを表す）
  22. 【請求項２２】 該式（９）において、ＸがＯまたはＳ
    であって、ＹがＩまたはＣｌＯ4である請求項２１の標
    的核酸の検出方法。
  23. 【請求項２３】 該式（１）で示される化学発光性物質
    が下記式（１０）で示される請求項１５に記載の標的核
    酸の検出方法。 【化１０】 （上記式［１０］中、ＸはＯ、Ｓ、Ｔｅ、Ｓｅを表し、
    Ｙ-はアニオンを表す）
  24. 【請求項２４】 該式（１０）において、ＸがＯまたは
    Ｓであって、ＹがＩまたはＣｌＯ4である請求項２３に
    記載の標的核酸の検出方法。
  25. 【請求項２５】 該式（１）で示される化学発光性物質
    が下記式（１１）で示される請求項１５に記載の標的核
    酸の検出方法。 【化１１】 （上記式［１１］中、ＸはＯ、Ｓ、Ｔｅ、Ｓｅを表し、
    Ｙ-はアニオンを表す）
  26. 【請求項２６】 該式（１１）において、ＸがＯまたは
    Ｓであって、ＹがＩまたはＣｌＯ4である請求項２５に
    記載の標的核酸の検出方法。
  27. 【請求項２７】 該式（１）で示される化学発光性物質
    が下記式（１２）で示される請求項１５の標的核酸に記
    載の検出方法。 【化１２】 （上記式［１２］中、ＸはＯ、Ｓ、Ｔｅ、Ｓｅを表し、
    Ｙ-はアニオンを表す）
  28. 【請求項２８】 該式（１２）において、ＸがＯまたは
    Ｓであって、ＹがＩまたはＣｌＯ4である請求項２７に
    記載の標的核酸の検出方法。
  29. 【請求項２９】 該式（１）で示される化学発光性物質
    が下記式（１３）で示される請求項１５の標的核酸に記
    載の検出方法。 【化１３】 （上記式［１３］中、ＸはＯ、Ｓ、Ｔｅ、Ｓｅを表し、
    Ｙ-はアニオンを表す）
  30. 【請求項３０】 該式（１３）において、ＸがＯまたは
    Ｓであって、ＹがＩまたはＣｌＯ4である請求項２９に
    記載の標的核酸の検出方法。
  31. 【請求項３１】 該式（１）で示される化学発光性物質
    が下記式（１４）で示される請求項１５の標的核酸に記
    載の検出方法。 【化１４】 （上記式［１４］中、ＸはＯ、Ｓ、Ｔｅ、Ｓｅを表し、
    Ｙ-はアニオンを表す）
  32. 【請求項３２】 該式（１４）において、ＸがＯまたは
    Ｓであって、ＹがＩまたはＣｌＯ4である請求項３１に
    記載の標的核酸の検出方法。
  33. 【請求項３３】 該式（１）で示される化学発光性物質
    が下記式（１５）で示される請求項１５の標的核酸に記
    載の検出方法。 【化１５】 （上記式［１５］中、ＸはＯ、Ｓ、Ｔｅ、Ｓｅを表し、
    Ｙ-はアニオンを表す）
  34. 【請求項３４】 該式（１５）において、ＸがＯまたは
    Ｓであって、ＹがＩまたはＣｌＯ4である請求項３３に
    記載の標的核酸の検出方法。
  35. 【請求項３５】 該ピリリウム環の置換基に更に親水性
    基が導入されている請求項１５〜３４の何れかに記載に
    記載の標的核酸の検出方法。
  36. 【請求項３６】 該化学発光性物質が、該二本鎖核酸に
    グルーブバインディングによって挿入されるものである
    請求項１〜１３の何れかに記載の標的核酸の検出方法。
  37. 【請求項３７】 該化学発光を検出する工程を、該二本
    鎖核酸に挿入された該化学発光性物質のみが化学発光可
    能な条件下で行なう請求項１〜３６の何れかに記載の標
    的核酸の検出方法。
  38. 【請求項３８】 該条件が、二本鎖核酸に挿入されてい
    ない該化学発光性物質が化学発光を示さない水性媒体中
    である請求項３７の標的核酸に記載の検出方法。
  39. 【請求項３９】 該水性媒体が水である請求項３８の標
    的核酸に記載の検出方法。
  40. 【請求項４０】 該水性媒体が水系緩衝液である請求項
    ３８の標的核酸に記載の検出方法。
  41. 【請求項４１】 該水性媒体が水と相溶性を有する有機
    溶媒と水との混合溶液である請求項３８に記載の標的核
    酸の検出方法。
  42. 【請求項４２】 該有機媒体がメタノール、エタノー
    ル、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチル
    スルホキシド及びイソプロパノールからなる群から選ば
    れる少なくとも１つである請求項４１に記載の標的核酸
    の検出方法。
  43. 【請求項４３】 水との相溶性を有する有機媒体と水と
    の混合溶液における該有機溶媒の混合比が、水に対して
    ２〜５０容量％である請求項４１に記載の標的核酸の検
    出方法。
  44. 【請求項４４】 該混合比が５〜２０容量％である請求
    項４３に記載の標的核酸の検出方法。
  45. 【請求項４５】 該水性媒体がｐＨ５〜８の範囲にある
    請求項３８に記載の標的核酸の検出方法。
  46. 【請求項４６】 該化学発光性物質の化学発光を検出す
    る工程において、該化学発光性物質と該二本鎖核酸をシ
    ュウ酸エステル及び過酸化水素と共存させる請求項１〜
    ４５の何れかに記載の標的核酸の検出方法。
  47. 【請求項４７】 該シュウ酸エステルがビスジニトロフ
    ェニルオキザレートである請求項４６に記載の標的核酸
    の検出方法。
  48. 【請求項４８】 試料中の標的核酸の定量方法であっ
    て、二本鎖核酸と相互作用可能な化学発光性物質を、二
    本鎖核酸に相互作用させ、該二本鎖核酸と相互作用した
    該化学発光性物質の化学発光の量を測定する工程を有す
    る標的核酸の定量方法。
  49. 【請求項４９】 該二本鎖核酸が、定量されるべき標的
    核酸である請求項４８に記載の定量方法。
  50. 【請求項５０】 該二本鎖核酸が第１の塩基配列を有す
    る一本鎖核酸と該第１の塩基配列に対して相補的な第２
    の塩基配列を有するプローブ核酸とのハイブリッドであ
    って、該一本鎖核酸が定量されるべき標的核酸である請
    求項４８に記載の定量方法。
  51. 【請求項５１】 試料中の該一本鎖核酸と該プローブ核
    酸とをハイブリダイズさせ、該化学発光性物質と相互作
    用する該二本鎖核酸を形成する工程を更に有する、請求
    項５０に記載の標的核酸の定量方法。
  52. 【請求項５２】 該標的核酸がＤＮＡまたはＲＮＡであ
    る請求項５０又は５１の標的核酸に記載の定量方法。
  53. 【請求項５３】 該ＤＮＡがｃＤＮＡである請求項５２
    に記載の標的核酸の定量方法。
  54. 【請求項５４】 該ＲＮＡがｍＲＮＡ、ｔＲＮＡまたは
    ｒＲＮＡである請求項５２に記載の標的核酸の定量方
    法。
  55. 【請求項５５】 該プローブ核酸がＤＮＡまたはＲＮＡ
    である請求項５０又は５１に記載の標的核酸の定量方
    法。
  56. 【請求項５６】 該標的核酸がオリゴリボアデニル酸か
    らなる部分を有するｍＲＮＡであり、該プローブ核酸
    が、該標的核酸とのハイブリダイゼーションに関与する
    塩基配列としてオリゴデオキシリボチミジル酸またはポ
    リデオキシリボチミジル酸からなる部分を有する請求項
    ５０又は５１に記載の標的核酸の定量方法。
  57. 【請求項５７】 該二本鎖核酸が固相に固定されている
    請求項４８〜５６の何れかに記載の標的核酸の定量方
    法。
  58. 【請求項５８】 該固相に固定されている該二本鎖核酸
    が、 固相に固定された該標的核酸と、該プローブ核酸として
    該標的核酸の３’末端側の塩基配列に相補的な塩基配列
    を３’末端側に有する一本鎖核酸とを用意する工程；及
    び次いで該標的核酸と該プローブ核酸とをハイブリダイ
    ズさせて部分的二本鎖核酸を形成し、次いで各々の核酸
    の３’末端側に伸展反応によってヌクレオチドを重合せ
    しめて二本鎖部分を伸長させる工程、によって形成され
    たものである請求項５７に記載の標的核酸の定量方法。
  59. 【請求項５９】 該固相に固定されている該二本鎖核酸
    が、 該プローブ核酸として該標的核酸の３’末端側の塩基配
    列に相補的な塩基配列を３’末端側に有する一本鎖核酸
    を用意し、該プローブ核酸を固相に固定する工程；及び
    次いで該標的核酸と該プローブ核酸とをハイブリダイズ
    させて部分的二本鎖核酸を形成し、次いで各々の核酸の
    ３’末端側に伸展反応によってヌクレオチドを重合せし
    めて二本鎖部分を伸長させる工程、によって形成された
    ものである請求項５７に記載の標的核酸の定量方法。
  60. 【請求項６０】 該固相がプラスチックプレートである
    請求項５７〜５９の何れかに記載の標的核酸の定量方
    法。
  61. 【請求項６１】 該化学発光性物質が該二本鎖核酸の二
    重らせん構造にインターカレーターとして挿入されるも
    のである請求項４８〜６０の何れかに記載の標的核酸の
    定量方法。
  62. 【請求項６２】 該化学発光性物質が下記式（１）で示
    されるピリリウム色素である請求項６１に記載の標的核
    酸の定量方法。 【化１６】 （上記式中ＸはＯ，Ｓ，Ｓｅ又はＴｅであって、Ｒ1、
    Ｒ2及びＲ3から選ばれる２つの置換基は置換もしくは未
    置換のアリール基で有り、残りの置換基は、水素原子、
    ハロゲン原子、スルホネート基、アミノ基、スチリル
    基、ニトロ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、シア
    ノ基、置換もしくは未置換のアルキル基、または置換も
    しくは未置換のシクロアルキル基、または−Ａもしくは
    −Ｌ−Ａであり、 Ｌは−Ｌ1−、−Ｌ2−Ｌ3−または−Ｌ4−Ｌ5−Ｌ6−で
    あり、Ｌ1〜Ｌ6はそれぞれ独立して、−（ＣＨ＝ＣＨ）
    −、置換もしくは未置換のアリール基から誘導される２
    価の基、置換もしくは未置換の低級アルキレン基、また
    は−ＣＨ＝Ｒ4−（Ｒ4はオキソ基を有する環構造を示
    す）を表し、 Ａは、置換もしくは未置換のアリール基、−ＣＨ＝Ｒ5
    （Ｒ5は、置換もしくは未置換の複素環、置換もしくは
    未置換のシクロアルキル基、又は置換もしくは未置換の
    芳香環を示す）を表し、 Ｙ-はアニオンを示す。）
  63. 【請求項６３】 該式（１）中のＬが下記式（２）〜
    （６）の何れかである請求項６２に記載の標的核酸の定
    量方法。 【化１７】 （上記式［２］中、Ｚは水素原子、または、置換もしく
    は未置換低級アルキル基を表し、ｎは０、１または２で
    ある。） 【化１８】 （上記式［３］中、ｎは０、１または２であり、Φは置
    換もしくは未置換のｏ - 、ｍ- 、または、ｐ−フェニレ
    ン基を表す） 【化１９】 （上記式［４］中、Φは置換もしくは未置換のｏ-、
    ｍ-、または、ｐ−フェニレン基を表す） 【化２０】 【化２１】
  64. 【請求項６４】 該式（１）で示される化学発光性物質
    が下記式（７）である請求項６２に記載の標的核酸の定
    量方法。 【化２２】 （上記式［７］中、ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ、または、Ｔｅを
    表し、Ｙ-はアニオンを表す）
  65. 【請求項６５】 該式（７）において、ＸがＯまたはＳ
    であって、ＹがＩまたはＣｌＯ4である請求項６４に記
    載の標的核酸の定量方法。
  66. 【請求項６６】 該式（１）で示される化学発光性物質
    が下記式（８）で示される請求項６２に記載の標的核酸
    の定量方法。 【化２３】 （上記式［８］中、ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ、または、Ｔｅを
    表し、Ｙ-はアニオンを表す）
  67. 【請求項６７】 該式（８）において、ＸがＯまたはＳ
    であって、ＹがＩまたはＣｌＯ4 である請求項６６に記
    載の標的核酸の定量方法。
  68. 【請求項６８】 該式（１）で示される化学発光性物質
    が下記式（９）で示される請求項６２に記載の標的核酸
    の定量方法。 【化２４】 （上記式［９］中、ＸはＯ、Ｓ、Ｔｅ、Ｓｅを表し、Ｙ
    -はアニオンを表す）
  69. 【請求項６９】 該式（９）において、ＸがＯまたはＳ
    であって、ＹがＩまたはＣｌＯ4である請求項６８に記
    載の標的核酸の定量方法。
  70. 【請求項７０】 該式（１）で示される化学発光性物質
    が下記式（１０）で示される請求項６２に記載の標的核
    酸の定量方法。 【化２５】 （上記式［１０］中、ＸはＯ、Ｓ、Ｔｅ、Ｓｅを表し、
    Ｙ-はアニオンを表す）
  71. 【請求項７１】 該式（１０）において、ＸがＯまたは
    Ｓであって、ＹがＩまたはＣｌＯ4である請求項７０に
    記載の標的核酸の定量方法。
  72. 【請求項７２】 該式（１）で示される化学発光性物質
    が下記式（１１）で示される請求項６２に記載の標的核
    酸の定量方法。 【化２６】 （上記式［１１］中、ＸはＯ、Ｓ、Ｔｅ、Ｓｅを表し、
    Ｙ-はアニオンを表す）
  73. 【請求項７３】 該式（１１）において、ＸがＯまたは
    Ｓであって、ＹがＩまたはＣｌＯ4である請求項７２に
    記載の標的核酸の定量方法。
  74. 【請求項７４】 該式（１）で示される化学発光性物質
    が下記式（１２）で示される請求項６２に記載の標的核
    酸の定量方法。 【化２７】 （上記式［１２］中、ＸはＯ、Ｓ、Ｔｅ、Ｓｅを表し、
    Ｙ-はアニオンを表す）
  75. 【請求項７５】 該式（１２）において、ＸがＯまたは
    Ｓであって、ＹがＩまたはＣｌＯ4である請求項７４に
    記載の標的核酸の定量方法。
  76. 【請求項７６】 該式（１）で示される化学発光性物質
    が下記式（１３）で示される請求項６２に記載の標的核
    酸の定量方法。 【化２８】 （上記式［１３］中、ＸはＯ、Ｓ、Ｔｅ、Ｓｅを表し、
    Ｙ-はアニオンを表す）
  77. 【請求項７７】 該式（１３）において、ＸがＯまたは
    Ｓであって、ＹがＩまたはＣｌＯ4である請求項７６に
    記載の標的核酸の定量方法。
  78. 【請求項７８】 該式（１）で示される化学発光性物質
    が下記式（１４）で示される請求項６２に記載の標的核
    酸の定量方法。 【化２９】 （上記式［１４］中、ＸはＯ、Ｓ、Ｔｅ、Ｓｅを表し、
    Ｙ-はアニオンを表す）
  79. 【請求項７９】 該式（１４）において、ＸがＯまたは
    Ｓであって、ＹがＩまたはＣｌＯ4である請求項７８に
    記載の標的核酸の定量方法。
  80. 【請求項８０】 該式（１）で示される化学発光性物質
    が下記式（１５）で示される請求項６２に記載の標的核
    酸の定量方法。 【化３０】 （上記式［１５］中、ＸはＯ、Ｓ、Ｔｅ、Ｓｅを表し、
    Ｙ-はアニオンを表す）
  81. 【請求項８１】 該式（１５）において、ＸがＯまたは
    Ｓであって、ＹがＩまたはＣｌＯ4である請求項８０に
    記載の標的核酸の定量方法。
  82. 【請求項８２】 該ピリリウム環の置換基に更に親水性
    基が導入されている請求項６２〜８１の何れかに記載に
    記載の標的核酸の定量方法。
  83. 【請求項８３】 該化学発光性物質が、該二本鎖核酸に
    グルーブバインディングによって挿入されるものである
    請求項４８〜６０の何れかに記載の標的核酸の定量方
    法。
  84. 【請求項８４】 該化学発光を検出する工程を、該二本
    鎖核酸に挿入された該化学発光性物質のみが化学発光可
    能な条件下で行なう請求項４８〜８３の何れかに記載の
    標的核酸の定量方法。
  85. 【請求項８５】 該条件が、二本鎖核酸に挿入されてい
    ない該化学発光性物質が化学発光を示さない水性媒体中
    である請求項８４に記載の標的核酸の定量方法。
  86. 【請求項８６】 該水性媒体が水である請求項８５に記
    載の標的核酸の定量方法。
  87. 【請求項８７】 該水性媒体が水系緩衝液である請求項
    ８５に記載の標的核酸の定量方法。
  88. 【請求項８８】 該水性媒体が水と相溶性を有する有機
    溶媒と水との混合溶液である請求項８５に記載の標的核
    酸の定量方法。
  89. 【請求項８９】 該有機媒体がメタノール、エタノー
    ル、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチル
    スルホキシド及びイソプロパノールからなる群から選ば
    れる少なくとも１つである請求項８８に記載の標的核酸
    の定量方法。
  90. 【請求項９０】 水との相溶性を有する有機媒体と水と
    の混合溶液における該有機溶媒の混合比が、水に対して
    ２〜５０容量％である請求項８８に記載の標的核酸の定
    量方法。
  91. 【請求項９１】 該混合比が５〜２０容量％である請求
    項９０に記載の標的核酸の定量方法。
  92. 【請求項９２】 該水性媒体がｐＨ５〜８の範囲にある
    請求項８５に記載の標的核酸の定量方法。
  93. 【請求項９３】 該化学発光性物質の化学発光を検出す
    る工程において、該化学発光性物質と該二本鎖核酸をシ
    ュウ酸エステル及び過酸化水素と共存させる請求項４８
    〜９２の何れかに記載の標的核酸の定量方法。
  94. 【請求項９４】 該シュウ酸エステルがビスジニトロフ
    ェニルオキザレートである請求項９３に記載の標的核酸
    の定量方法。
  95. 【請求項９５】 化学発光分析に用いる為の、下記式
    （１）で示されることを特徴とするピリリウム化合物。 【化３１】 （上記式中ＸはＯ，Ｓ，Ｓｅ又はＴｅであって、Ｒ1、
    Ｒ2及びＲ3から選ばれる２つの置換基は置換もしくは未
    置換のアリール基で有り、残りの置換基は、水素原子、
    ハロゲン原子、スルホネート基、アミノ基、スチリル
    基、ニトロ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、シア
    ノ基、置換もしくは未置換のアルキル基、または置換も
    しくは未置換のシクロアルキル基、または−Ａもしくは
    −Ｌ−Ａであり、 Ｌは−Ｌ1−、−Ｌ2−Ｌ3−または−Ｌ4−Ｌ5−Ｌ6−で
    あり、Ｌ1〜Ｌ6はそれぞれ独立して、−（ＣＨ＝ＣＨ）
    −、置換もしくは未置換のアリール基から誘導される２
    価の基、置換もしくは未置換の低級アルキレン基、また
    は−ＣＨ＝Ｒ4−（Ｒ4はオキソ基を有する環構造を示
    す）を表し、 Ａは、置換もしくは未置換のアリール基、−ＣＨ＝Ｒ5
    （Ｒ5は、置換もしくは未置換の複素環、置換もしくは
    未置換のシクロアルキル基、又は置換もしくは未置換の
    芳香環を示す）を表し、 Ｙ- はアニオンを示す。）
  96. 【請求項９６】 該式（１）中のＬが下記式（２）〜
    （６）の何れかである請求項９５のピリリウム化合物。 【化３２】 （上記式［２］中、Ｚは水素原子、または、置換もしく
    は未置換低級アルキル基を表し、ｎは０、１または２で
    ある。） 【化３３】 （上記式［３］中、ｎは０、１または２であり、Φは置
    換もしくは未置換のｏ - 、ｍ- 、または、ｐ−フェニレ
    ン基を表す） 【化３４】 （上記式［４］中、Φは置換もしくは未置換のｏ-、
    ｍ-、または、ｐ−フェニレン基を表す） 【化３５】 【化３６】
  97. 【請求項９７】 該式（１）で示される化学発光性物質
    が下記式（７）である請求項９５のピリリウム化合物。 【化３７】 （上記式［７］中、ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ、または、Ｔｅを
    表し、Ｙ-はアニオンを表す）
  98. 【請求項９８】 該式（７）において、ＸがＯまたはＳ
    であって、ＹがＩまたはＣｌＯ4である請求項９７のピ
    リリウム化合物。
  99. 【請求項９９】 該式（１）で示される化学発光性物質
    が下記式（８）で示される請求項９５のピリリウム化合
    物。 【化３８】 （上記式［８］中、ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ、または、Ｔｅを
    表し、Ｙ-はアニオンを表す）
  100. 【請求項１００】 該式（８）において、ＸがＯまたは
    Ｓであって、ＹがＩまたはＣｌＯ4である請求項９９の
    ピリリウム化合物。
  101. 【請求項１０１】 該式（１）で示される化学発光性物
    質が下記式（９）で示される請求項９５のピリリウム化
    合物。 【化３９】 （上記式［９］中、ＸはＯ、Ｓ、Ｔｅ、Ｓｅを表し、Ｙ
    -はアニオンを表す）
  102. 【請求項１０２】 該式（９）において、ＸがＯまたは
    Ｓであって、ＹがＩまたはＣｌＯ4である請求項１０１
    のピリリウム化合物。
  103. 【請求項１０３】 該式（１）で示される化学発光性物
    質が下記式（１０）で示される請求項９５のピリリウム
    化合物。 【化４０】 （上記式［１０］中、ＸはＯ、Ｓ、Ｔｅ、Ｓｅを表し、
    Ｙ-はアニオンを表す）
  104. 【請求項１０４】 該式（１０）において、ＸがＯまた
    はＳであって、ＹがＩまたはＣｌＯ4である請求項１０
    ３のピリリウム化合物。
  105. 【請求項１０５】 該式（１）で示される化学発光性物
    質が下記式（１１）で示される請求項９５のピリリウム
    化合物。 【化４１】 （上記式［１１］中、ＸはＯ、Ｓ、Ｔｅ、Ｓｅを表し、
    Ｙ-はアニオンを表す）
  106. 【請求項１０６】 該式（１１）において、ＸがＯまた
    はＳであって、ＹがＩまたはＣｌＯ4である請求項１０
    ５のピリリウム化合物。
  107. 【請求項１０７】 該式（１）で示される化学発光性物
    質が下記式（１２）で示される請求項９５のピリリウム
    化合物。 【化４２】 （上記式［１２］中、ＸはＯ、Ｓ、Ｔｅ、Ｓｅを表し、
    Ｙ-はアニオンを表す）
  108. 【請求項１０８】 該式（１２）において、ＸがＯまた
    はＳであって、ＹがＩまたはＣｌＯ4である請求項１０
    ７のピリリウム化合物。
  109. 【請求項１０９】 該式（１）で示される化学発光性物
    質が下記式（１３）で示される請求項９５のピリリウム
    化合物。 【化４３】 （上記式［１３］中、ＸはＯ、Ｓ、Ｔｅ、Ｓｅを表し、
    Ｙ-はアニオンを表す）
  110. 【請求項１１０】 該式（１３）において、ＸがＯまた
    はＳであって、ＹがＩまたはＣｌＯ4である請求項１０
    ９のピリリウム化合物。
  111. 【請求項１１１】 該式（１）で示される化学発光性物
    質が下記式（１４）で示される請求項９５のピリリウム
    化合物。 【化４４】 （上記式［１４］中、ＸはＯ、Ｓ、Ｔｅ、Ｓｅを表し、
    Ｙ-はアニオンを表す）
  112. 【請求項１１２】 該式（１４）において、ＸがＯまた
    はＳであって、ＹがＩまたはＣｌＯ4である請求項１１
    １のピリリウム化合物。
  113. 【請求項１１３】 該式（１）で示される化学発光性物
    質が下記式（１５）で示される請求項９５のピリリウム
    化合物。 【化４５】 （上記式［１５］中、ＸはＯ、Ｓ、Ｔｅ、Ｓｅを表し、
    Ｙ-はアニオンを表す）
  114. 【請求項１１４】 該式（１５）において、ＸがＯまた
    はＳであって、ＹがＩまたはＣｌＯ4である請求項１１
    ３のピリリウム化合物。
  115. 【請求項１１５】 該ピリリウム環の置換基に更に親水
    性基が導入されている請求項９５〜１１４の何れかに記
    載のピリリウム化合物。
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