JPH09503660A

JPH09503660A - エネルギー移動による核酸検出

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Publication number: JPH09503660A
Application number: JP7509653A
Authority: JP
Inventors: サメス，ピーター・ジョージ; ガーマン，アンドリュー・ジョン
Original assignee: ゼネカ・リミテッド
Priority date: 1993-09-23
Filing date: 1994-09-23
Publication date: 1997-04-15
Also published as: GB2283095B; GB9419218D0; WO1995008642A1; AU7662794A; GB2283095A; US5827653A; EP0720659A1

Abstract

(57)【要約】相補的プローブハイブリダイゼーション、及び光の照射により特徴的な遅延発光放射を生じるキレート化ランタニド複合体を形成することにより核酸分析対象物を検出する方法。

Description

【発明の詳細な説明】エネルギー移動による核酸検出ＤＮＡ又はＲＮＡ配列のような分析対象物を検出する方法を開示する。本方法は、分析対象物及び相補的結合体を含む複合体の形成を含み、ＤＮＡ又はＲＮＡについては、ハイブリダイゼーションによりデュプレックスを形成する。マッチしている複合体は、デュプレックス配列（デュプレックス結合体）に挿入(inter calate)又は溝状に結合(groove bind)する第三の増感体成分を添加することにより観察される。相補的結合体はランタニドイオンを含むように設計され、デュプレックス結合体は増感体としても機能できるランタニドイオンに対する配位子を含む。あるいは、相補的結合体を、増感体及びランタニド配位子に対するデュプレックス結合体に結合することができる。協働的な形態で結合が得られる場合、三成分系を、増感体により選択的に吸収され得る光で照射する。励起された増感体は、金属エネルギー移動機構の直接配位子によりそのエネルギーをランタニドイオンに供与し、ランタニドイオンを励起することができる。その後の励起したランタニドイオンからの放射が、複合体の形成、即ち分析対象物の存在を示す。ランタニド種からの発光は、バックグラウンドの蛍光信号の減衰後に測定され得る遅延した放射過程を含む長寿命により特徴づけられる。本方法は不均質(heter ogeneous)又は好ましくは均質(homogeneous)アッセイに応用でき、また定性的又は定量的に使用できる。分析対象物のインビトロ検出の方法は、当分野でよく知られている。該方法は、イムノアッセイにおけるような抗体−抗原複合体の形成と、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションにおけるような核酸複合体の生成を含む。標的ポリヌクレオチドの存在を確かめるためのポリヌクレオチドプローブを用いたポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイは、よく知られている方法である。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列が相補的ｄｎａ又はｒｎａ鎖と複合体を形成する能力に基づいている。単一鎖ポリヌクレオチドプローブを、定義された条件下で、単一鎖標的分子と溶液中でインキュベートすると、相補的塩基配列対が二重鎖ハイブリッド分子を形成する。そのようなハイブリダイゼーションは溶液中で起こり得る。あるいは、標的鎖又はプローブを支持体に固定でき、従ってその場合はハイブリダイゼーションにより固定された二重鎖ハイブリッド分子が生成する。この場合は、分離され、固定された、支持体に結合したデュプレックスポリヌクレオチド結合を残して、非結合ポリヌクレオチド分子を洗浄除去できる[M．Grunstein and J．Wallis，Methods in Enzymology , 1979，68，pp．379-469; A．R．Sambrook，Methods in Enzymology，1980,65( part 1)，pp．468-478; 'Modified Nucleotides and Methods of Preparing and Using the Same'，by D．C．Ward，A．A．Waldrop and P．R．Langer，欧州特許公報，063,879; 'DNA Probes for Infectious Disease' by A．J．Berry，and J．B．Peter，Diagnostic Medicine，1984，March，pp．1-8.を参照]。ポリヌクレオチドプローブは、ポリヌクレオチド部分及びポリヌクレオチドに結合された潜在的な信号を発生する部分を含む。プローブのポリヌクレオチド部分は、標的ポリヌクレオチド（標的）内の対象となる相補的配列に対しハイブリダイズする能力（塩基対）を持つ。プローブの潜在的な信号を発生する部分は、分析対象物の存在を確認できる手段をもたらす。方法には、例えば蛍光発光、燐光、放射能、色原体形成又は電子密度を使用することができるが、本出願は遅延発光の使用に関するものである。標的ポリヌクレオチドの存在を検出する方法は、一般的に数段階を含み、その一つは、不均質又はサンドイッチ型アッセイにおけるのと同様に、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドプローブのハイブリダイズしていないプローブ又はミスマッチ標的からの分離を含む。典型的には、二重鎖ポリヌクレオチドを、標的ポリヌクレオチド配列を含んでいると考えられる試料から単離する。二重鎖ポリヌクレオチドを、制限エンドヌクレアーゼ酵素消化によってより小さな部分に切断し、その部分をゲル電気泳動により分離し、必要であれば例えばニトロセルロース紙のような支持体に、その部分をゲルから移す。あるいは、二重鎖ポリヌクレオチドを、前もって酵素消化することなく支持体上に直接固定するか、又は溶液中に取る。必要であれば、上述された方法でプローブポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを行う前に、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)[欧州特許出願0201184; 'PCR Technology' ed．H．A．Erlich，St ockton Press，New York，1989を参照]の使用のような標準の増幅方法を用い、標的ポリヌクレオチドの濃度を高めることができる。固定または遊離ポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドプローブを含む溶液と接触させ、支持体又は溶液を 50〜95℃に加熱してポリヌクレオチド二重鎖を変性する。その後系を適当な時間適当な温度に冷却し、ハイブリダイゼーションを起こす。結合した標的又はプローブポリヌクレオチドを使用する不均質方法の利点は、ハイブリダイゼーション後に、固定したハイブリダイズしたポリヌクレオチドを洗浄して全ての非結合ポリヌクレオチドを除去できることである。しかしながら、不均質方法の欠点は、時間がかかり、洗浄中に全ての非結合物質を完全に除去できたかどうかが不確かなことである。このような理由から、配列を探索するための、相補的なハイブリッド標的の直接の均質検出を行うための手段が望ましい。均質アッセイのためには、一般に標的ポリヌクレオチドへの一度だけの試薬添加を必要とし、結果的に時間と労力の節約となり、分離、洗浄及び電気泳動のような前処理を、発光測定の前に必要としない。さらにそのような均質アッセイは、より容易に大量の試料の処理のための自動化方法に向いたものとすることができる。均質プロセスを用いて不均質アッセイの限界を克服することを目指したいくつかの方法が報告されている（例えば、Matthews J．A，et al，Anal．Biochem.,1 988，169，1-25 を参照）。一つの方法は、いずれも光感受性標識を含む二種の単一鎖プローブポリヌクレオチドと、試料からの相補的単一鎖ポリヌクレオチド標的とのハイブリダイゼーションを使用し、第一及び第二のポリヌクレオチドプローブの光感受性標識との間で非放射活性エネルギー移動が起こるようにするものである。少なくとも一方の光感受性標識は吸収−放射型のものであり、この標識により吸収された他方の光感受性標識の放射からのエネルギーが異なった波長で再放射されるようにする。これらの二次放射は、標的ポリヌクレオチドに対する第一及び第二の両方の単一鎖ポリヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションが起こった場合のみ起こり得る。試料中の標的ポリヌクレオチドの量は、二次放射の量に関連している［欧州特許公報第070685号参照］。この方法の欠点は、標的ポリヌクレオチドの存在を検出するために、二つの別のポリヌクレオチド鎖を必要とすることである。さらにこの方法は、完全に異なった光吸収特性を持ち、そのため第二標識の直接の励起は起こらず、第一から第二標識へのエネルギー移動のみが可能となる光感受性プローブか、又は化学放射試薬並びに放射が化学放射触媒の添加により促進されるものである吸収−放射物質の存在を必要とする。後者の方法については、光感受性標識が末端ヌクレオシドの糖部分に結合しているので、ポリヌクレオチドプローブあたり一つの標識のみしか結合でない。均質アッセイによる標的ポリヌクレオチド検出のもう一方の方法は、標的ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドプローブ間のハイブリッドの形成を含み、ハイブリッドが、その一方が第一標識を、他方が第二標識を含む二種の特定の結合試薬に対する結合部位を持つ。第一及び第二標識間の相互作用は、二つの標識試薬が同じハイブリッドに結合していないときと比較して、二つの標識試薬が両方とも同じハイブリッドに結合した場合、測定可能なように異なった検出可能な応答を与える。ハイブリッドアッセイ生成物の形成は、例えば継続的な触媒（酵素）相互作用とエネルギー移動の場合のように、互いに近い相互作用距離内に二つの標識をもたらす。標識がハイブリダイズしたプローブに結合している場合にのみ区別できる応答を標識が与えるので、分離段階は不要である［欧州特許出願第14 4,914 号参照］。この方法は二つの主要な態様を持つ。第一の態様は、その後に色を生じる成分の生成を含む。この態様は、二つの別個の化学反応、すなわち拡散性媒介物質を生成するための第一標識の反応、及び検出可能生成物を得るための媒介物質と第二標識との反応の使用を必要とするという欠点がある。加えて検出は、溶液中の他の部分と比較した場合に、標識付近での媒介物質の極度に偏った濃度の生成と持続に依存している。さらに両反応は、ポリヌクレオチドプローブに結合している大きい酵素分子の使用を必要とする。これらの大きい分子は互いに立体的に衝突するであろう。第二の態様は、エネルギー移動、すなわち第一標識からの光子の放射、例えば蛍光発光を使用し、その後第二標識による光子の吸収が起こり、放射を抑制するか又は第二の放射を与える。この方法は、そのようなエネルギー移動プロセスの効率は一般的に低く、ひいては方法の感受性を低下させるという欠点を有する。さらに、バックグラウンド蛍光による第二標識の偶発的な励起を伴うバックグラウンド蛍光も、この方法の特異性を損ねている。欧州特許出願第242,527 号は、全空間(through space)エネルギー移動プロセスを詳述している。これは一つの態様として、全空間エネルギー結合メカニズムによるエネルギー受容体としてのランタニド種の使用を含むが、それは本発明が基づいている鍵となる知見、即ち、エネルギー移動に関してはるかに効率的で、発光信号の生成においてはるかに特異的である直接の配位子金属荷電移動メカニズムを使用できることを予測させるものではない。いくつかの関連する他のＤＮＡ認識のための手法が報告されている。Heleneとその同僚等は蛍光挿入ハンドルが結合したプローブＤＮＡ鎖を使用した［国際特許出願WO88,04301; C．Helelne and N．T．Thuong，Pont．Acad．Sci．Scripta Varia，1988，70，205-222］。ハイブリダイジングに際し、このハンドルは隣接する二重鎖中に挿入され得、これが蛍光発光特性を変える。しかしながらこの方法は、ハイブリダイズしないプローブ分子が初期蛍光発光特性を保持し、これがバックグラウンド蛍光発光干渉の問題を付加するために感度の欠如に見まわれる。BartonらはHeleneのものと同様の方法を用いたが、有機蛍光体(fluorophores) の代わりにルテニウムの複合体を挿入体として使用する［国際特許出願WO-88/04 301; J.K．Barton et al.，Biochemistry，1992，31，10809-10816 を参照］。これら後者の複合体の有利な点は、発光効率は水中で低いが、挿入環境では高いということである。後者の場合は共働作用はなく、従って挿入が起こることが発光を導くので、それらの選択性は特には高くない。さらに別の方法(欧州特許出願第0382433A2)は、蛍光試薬で標識されたポリヌクレオチドプローブを利用し、蛍光発光の偏光現象を使用して標的ポリヌクレオチドへのプローブの結合を調べるものである。上記の例で指摘したように、蛍光検出はハイブリダイゼーションアッセイで広く用いられている。蛍光分光法では、液体中又は固相に存在する測定されるべき物質を、例えば限定された帯域幅の光のような既知のスペクトル分布源からの放射にさらす。発生した蛍光放射は励起放射より長い波長を有し、この放射は測定される物質に特異的である。蛍光放射の強度の測定は、測定する物質の定量化となる。ポリヌクレオチドに結合している蛍光部分が最も効率的であるのは、それらが高強度で、比較的長い放射波長（500nm 以上）、高いストーク(Stoke)シフト及びハイブリダイゼーション能力に影響しないポリヌクレオチドとの結合能を持つ場合である。生化学系で使用される強い蛍光を与える芳香族試薬は、よく知られている。蛍光発光は一般的に分光蛍光計で測定される。分光蛍光計で信号を発する基を検出する現在の方法の欠点は、干渉する蛍光発光やバックグラウンドを増加させる励起及び検出システムにおけるノイズのために、検出感度が制限されることである。特に小さいストークシフト（50nm以下）である芳香族有機試薬を使用する場合、干渉を引き起こす強い散乱によってもバックグラウンドが影響される。蛍光検出のバックグラウンドの問題を克服しようと試みたいくつかの方法が記載されている。一つの方法［米国特許第4,058,732 号］は、ノイズやバックグラウンド源の蛍光よりもずっと長く発光する信号を発する基を用い、遅延した発光を測定するものである。レーザーパルスが試料を励起するために使用され、信号を発する基からの発光の検出は、ノイズやバックグラウンド源からの蛍光が減衰した十分に長い時間の後にのみ測定される。この方法はこれまでのところ、商業的用途に容易に適用できず、均質アッセイのために受け入れることができないという欠点を有している。二番目の方法［米国特許第4,374,120 号］は、まず抗体に配位子を結合し、ランタニド金属を配位子に錯化し、その後標識した抗体を抗原に結合することにより抗原の存在を測定する方法を含む。錯体を非錯化抗体及び抗原−抗体複合体から分離し（不均質アッセイ）、続いてランタニドイオンを第二の光感受性配位子へ移動することにより測定しなければならない。ランタニドイオン量の測定を放射により行って第二配位子を励起し、そしてこれによりノイズ源より長い波長で長い時間放射を発するキレート化金属にエネルギーを移動する。この方法の欠点は、均質アッセイに用いることができないということと、数段階を必要とするということである。本発明は、特徴的な遅延した発光放射を生じる直接の配位子−金属エネルギー移動システムにより、ポリヌクレオチド鎖ＤＮＡのような分析対象物を検出及び測定する方法に関するものである。ユーロピウム(III)のようなランタニドイオンに、直接キレート化した増感体の励起の後、配位子−金属エネルギー移動が起こる。金属イオンからの発光は長寿命であることを特徴とし、これはバックグラウンド蛍光信号の減衰後に測定でき、この光放射は分析対象物の存在の信号となる。本発明の目的は、例えばランタニドキレート基であるエネルギー移動システムの一つのパートナーが結合した結合体に分析対象物を複合化することにより、分析対象物を検出する方法であって、前記複合体の形成により、第二のパートナーの特定の結合距離内に、エネルギー移動システムの第一パートナーとして作用する増感体を位置させることが可能となり、第一及び第二成分が閉鎖キレートシステムをランタニドイオンの周りに形成し、その結果第一成分により吸収されたエネルギーをキレート化ランタニドイオンを励起するために直接使用できる方法を提供することである。励起放射線の周波帯が、エネルギー移動システムの第一パートナーにより実質的に吸収され、励起されたランタニドイオンである第二パートナーにより放射された光が、励起段階で使用されたものより長い波長を有し、発光の持続が、好ましくは照射プロセスにより生じたバックグラウンドの蛍光発光又はノイズよりも十分に長い期間であることが本システムの要件である。本発明はまた、例えば増感体であるエネルギー移動システムの第一パートナーが結合した結合体に分析対象物を複合化することにより分析対象物を検出する方法であって、その複合体の形成により、第一パートナーの特定の結合距離内に、エネルギー移動システムの第二パートナーとして作用するランタニドキレート基が位置することを可能とし、第一及び第二成分が閉鎖キレートシステムをランタニドイオンの周りに形成し、その結果第一成分により吸収されたエネルギーをキレート化ランタニドイオンを励起するために直接使用できる前記方法を含む。励起した放射線の周波帯が、金属エネルギー移動システムに対する配位子の第一パートナーにより実質的に吸収されるのみであり、励起されたランタニドイオンである第二パートナーにより放射された光が、励起段階で使用されたものより長い波長を有し、好ましくは放射の寿命が、照射プロセスにより生じたバックグラウンドの蛍光又はノイズよりも十分に長い期間であることがこのシステムの要件である。本発明はさらに、複合化されたランタニドイオン及び複合化された増感体から成る配位子−金属エネルギー移動システムの第一又は第二成分が結合しているポリヌクレオチドプローブに、標的ポリヌクレオチドをハイブリダイズすることによりハイブリッドを形成し、エネルギー移動システムの第二成分が挿入又は溝型結合により第一成分の特定の結合距離内に位置して閉鎖キレートシステムをランタニドイオンの周りに形成し、その結果第一成分により吸収されたエネルギーをキレート化したランタニドイオンの励起に直接使用できるようにすることにより溶液中の標的ポリヌクレオチドの存在を検出する方法を提供する。本発明はまた、支持体に標的ポリヌクレオチドを固定し、複合化されたランタニドイオン及び複合化増感体からなるエネルギー移動システムの第一又は第二成分が結合しているポリヌクレオチドプローブを含む溶液に標的ポリヌクレオチドを接触させてハイブリッドを形成し、配位子−金属エネルギー移動システムの他の成分が挿入又は溝型結合により第一成分の特定の結合距離内に位置し、閉鎖キレートシステムをランタニドイオンの周りに形成し、その結果第一成分により吸収されたエネルギーをキレート化ランタニドイオンの励起に直接使用できるようにすることによる、標的ポリヌクレオチドの存在を検出する方法も含む。本発明はさらに、複合化したランタニド及び複合化増感体よりなるエネルギー移動システムの第一又は第二成分が結合しているポリヌクレオチドプローブを支持体に固定し、プローブを標的ポリヌクレオチドを含む溶液に接触させてハイブリッドを形成し、エネルギー移動システムの他方の成分が挿入又は溝型結合により第一成分の特定の結合距離内に位置して閉鎖キレートシステムをランタニドイオンの周りに形成し、その結果第一成分により吸収されたエネルギーがランタニドイオンの励起に直接使用できるようにすることによる標的ポリヌクレオチドの存在を検出する方法を含む。これらのアッセイシステムでは、プローブポリヌクレオチドは、標的分析対象物中のポリヌクレオチド配列に完全に相補的であってもよく、その場合は高レベルの発光反応が得られ、あるいはプローブポリヌクレオチドは適当なポリヌクレオチド設計を与えられ、標的配列に対して一又はそれ以上の、ミスマッチ塩基を含んでもよく、この場合はより低い発光信号が得られる。この方法では、標的ポリヌクレオチド鎖中の突然変異（単数または複数）の発生とその部位を調査できる。エネルギー移動システムの成分は、増感体として働き得る光吸収部位である。そのようなエネルギー移動のメカニズムは十分に文献に記載されている。一重項 −一重項状態エネルギー移動は種間の直接接触によるか、又はエネルギーの交換プロセスにより起こり得る。金属複合体中におけるように、例えば配位子−金属エネルギー移動プロセスによるような衝突、又は隣接のパートナー同士を保持することによる直接接触により、三重項状態エネルギー移動はより効率的である。受容体は、芳香族試薬又はランタニド金属であってよい。ランタニド金属を受容体として使用しているエネルギー移動の後者のプロセスを本発明で使用する。多くのエネルギー移動信号発生システムに見られる欠点の一つは、得られる信号が短寿命（蛍光）の放射であり、バックグラウンド信号と同時に収集しなければならず、結果として感度と選択性を低下させるという事実である。これを克服する方法は、遅延した蛍光及び燐光（遅延した発光）におけるような長寿命の発光体を使用する。そのようなプローブシステムのためには、速いバックグラウンド放射が消えるまで放射光子の収集を遅らせ、その後遅延した発光信号を収集することができ、これはゲイティング(gating)と呼ばれるプロセスである。そのような手順によりバックグラウンド蛍光発光とノイズに関連する問題が回避される。発明の詳細な説明１．一般的説明本発明は、ポリヌクレオチド分析対象物の存在を検出するための均質アッセイを開示する。均質溶液は、液相中に溶質を有する溶液の任意のものを含む。これはまた、発光測定が行える十分に透明であるか非散乱性の微小懸濁物又はコロイドの懸濁液、又は同様の混合物も含む。均質アッセイは、直接金属−配位子エネルギー移動プロセスによる分析対象物の検出を可能にする。アッセイは、分析対象物を相補的プローブポリヌクレオチドにハイブリダイズすること及びエネルギー移動成分の一つのパートナーが結合している挿入剤を添加することを含む。結合していない結合プローブ又は結合していない挿入剤を、検出を行い得る前にアッセイ媒体から除去する必要はない。アッセイのいくつかの態様においては、全成分を溶液中（液相）に溶解する。その他の態様では、一又はそれ以上の成分を固体支持体に固定する。エネルギー移動システムは二つの部分を含み、ユーロピウム(III)イオンのようなランタニドイオンに特異的なキレート化配位子で、これに対してアッセイで用いるpH値の範囲で配位子が強く結合される。ランタニドイオンの周りの配位部位を完全にふさがないように配位子を選択する。エネルギー移動システムの第二成分は増感配位子であり、これはランタニドイオンがまだ他のキレート化配位子に結合されていてもランタニドイオンに結合できる。増感配位子は、励起状態を生成するために光吸収能を持つ芳香族基を含む。この励起状態のエネルギーを次にランタニドイオンに移す。増感体及びキレート化ランタニドイオンが、結合による直接の接触のように極めて接近している場合にのみ、励起状態のエネルギー移動が起こり得るということが本発明の重要な要件である。この二成分の複合体（結合したユーロピウムと増感体）中の増感体により吸収されたエネルギーを、特異的で、偏在した金属−配位子エネルギー移動により移すことができ、結果としてランタニドイオンの励起状態を形成する。この励起したランタニドイオンは、増感体により吸収された波長よりも長い波長の発光を放射でき、さらに放射された蛍光発光は、増感体により放射された蛍光又は他のバックグラウンド蛍光のものより十分に長い持続時間を有する。この遅延した発光の存在は、分析対象物の存在を示す。本方法はポリヌクレオチドの検出に適用でき、単一相システム、均質溶液アッセイ、又は二相システム、すなわち固体支持体上の溶液中で行うことができる。標的ポリヌクレオチドと、エネルギー移動システム成分の一つが結合している相補的プローブポリヌクレオチド間で、ハイブリダイズした複合体を形成することにより検出を行う。エネルギー移動成分の結合部位は、標的ポリヌクレオチドと相補的プローブ間の相補性を妨げないようにする。エネルギー移動システムの第二成分を、挿入剤又は溝型結合体のようなデュプレックス結合体につなぐ。第二成分は、プローブポリヌクレオチドと標的ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションの後にのみ、例えば挿入剤がそのように生成されたポリヌクレオチドの二重鎖中に挿入するか又は溝型結合が起こるようなものである。例えば、挿入によりエネルギー移動の第二成分を第一成分に接近させることができる。挿入が可逆プロセスであるので、他方の成分の結合距離内になるまで、前記作用剤がデュプレックスの種々の塩基対間を移動すると考えられる。この方法はまた、増感配位子をキレート化したランタニドイオンへ直接結合することにより促進でき、この結合が標的とされた分析対象物で起こる場合、増感配位子とキレート化したランタニドイオン間の効率的なエネルギー移動が起こり得、従って遅延した発光を観測できる。いくつかの態様を例として以下に述べる。１．分析対象物が標的ポリヌクレオチドであり、結合体がキレート化ランタニドイオンが結合した相補的プローブポリヌクレオチドを含むもの。増感配位子はデュプレックス結合剤であるか又はデュプレックス結合剤に結合されている。全成分を液相に溶解する。本態様の説明として図１を参照。２．分析対象物が標的ポリヌクレオチドであり、結合体が増感配位子が結合した相補的プローブポリヌクレオチドを含むもの。キレート化ランタニドイオンをデュプレックス結合剤に結合する。全成分を液相に溶解する。３．分析対象物が標的ポリヌクレオチドであり、固体支持体上に固定されるもの。結合体はキレート化ランタニドイオンが結合した相補的プローブポリヌクレオチドを含む。増感配位子はデュプレックス結合剤であるか又はデュプレックス結合剤に結合されている。エネルギー移動システムの両成分を最初に液相に溶解する。４．分析対象物が標的ポリヌクレオチドであり、固体支持体上に固定されているもの。結合体は増感配位子が結合した相補的プローブポリヌクレオチドを含む。キレート化ランタニドイオンをデュプレックス結合剤に結合する。エネルギー移動システムの両成分を最初に液相に溶解する。。５．キレート化ランタニドイオンが結合した相補的プローブポリヌクレオチドを含む結合体を、固体支持体上に固定するもの。分析対象物は標的ポリヌクレオチドであり、増感配位子はデュプレックス結合剤であるか又はデュプレックス結合剤に結合されている。分析対象物と増感配位子の両方を最初に液相に溶解する。６．増感配位子が結合した相補的プローブポリヌクレオチドを含む結合体を固体支持体上に固定するもの。分析対象物は標的ポリヌクレオチドであり、キレート化ランタニドイオンはデュプレックス結合剤に結合される。分析対象物と挿入剤の両方を最初に液相に溶解する。デュプレックス結合剤は挿入体、溝型結合体又はデュプレックスに結合している任意の他の部分であるが、単一鎖核酸ではない。好ましくは、デュプレックス結合剤は挿入体である。理論的考察に拘束されることは望むものではないが、本アッセイ法は、キレート化によりランタニドイオンに直接結合している増感体の照射を含む。これにより基底状態より高いエネルギーの励起した状態の種を形成する。得られた励起状態が十分なエネルギーを持つならば、これはランタニドイオンに直接的に移動され得、直接結合の利点により非常に効率のよいエネルギー移動プロセスが得られる。全空間エネルギー移動プロセスは一般的に効率的でない。エネルギー移動により、光エネルギーの放射により基底状態に戻れる励起状態のランタニドイオンを形成する。ランタニドイオンの励起状態から基底状態への変換が、内核電子を含むため、光放射のパターンは非常に特徴的で、そこでは放射波長が周辺環境により大きな影響を受けない。放射波長は、初期吸収プロセスのものからはるかに離れている（大きなストークスシフト）。さらに放射プロセスの特徴により長寿命（遅延発光）が得られ、これが任意のバックグラウンド及びノイズプロセスからの任意の蛍光発光放射が減衰する短時間の合間の後に、放射光の測定を可能とする。重要な制限は、ランタニドイオンのキレート化配位子の結合が強く、アッセイで用いる濃度やpHでは、ランタニドの配位子の解離は起こらないか又は非常に限定された量のみで起こることである。さらに、キレート化ランタニドイオンの増感配位子の結合定数は、アッセイで用いる濃度では、これらのエネルギー移動作用剤間のランダムな結合が標的ポリヌクレオチドの非存在下でほとんど起こらないようなにしなければならず、これはそのようなランダムな結合がエネルギー移動を引き起こし、そのためバックグラウンドの遅延発光信号の放射を引き起こすからである。例示として、分析対象物が溶液中のポリヌクレオチドである単一相アッセイの例は、キレート化ランタニドイオンが結合している相補的ポリヌクレオチドプローブを増感配位子が結合しているデュプレックス結合剤と共に添加するものである。ポリヌクレオチドプローブ及び増感配位子の濃度は、これらの成分のランダムな結合がほとんど起こらないものとする。さらに標的ポリヌクレオチドとプローブポリヌクレオチド成分をハイブリダイズさせ、ポリヌクレオチドの二重鎖を形成する。二重鎖ポリヌクレオチドの存在により増感剤による挿入が可能となる。挿入の結合定数により、増感体を二重鎖核酸に位置させ、挿入体の局所的濃度は上昇する。挿入は動的な結合−解離プロセスであり、挿入剤の移動が、マッチした二重鎖ポリヌクレオチド配列に沿った異なった挿入部位間で起こり得る。ランタニドキレートのすぐそばで、キレート配位子による金属イオンへの結合がさらに起こり、このような協働的な方法で成分の固定が助けられる。ポリヌクレオチド標的、ポリヌクレオチドプローブ及び増感体の三成分の全てが、この協働的方法で集まる場合にのみ、増感体の照射が遅延した発光信号を与え、標的の同定が陽性であることを示す。その信号強度は分析対象物の定量に使用できる。相補的ポリヌクレオチド配列に出会わないポリヌクレオチドプローブについては、ハイブリダイゼーションは起こり得ず、このため遅延発光の協働的な増強は観察されないことになる。二相アッセイの例は、ポリヌクレオチド標的をニトロセルロースシートのような固体支持体に最初に結合する場合である。次いで例えばキレート化ランタニド増感体が結合したプローブポリヌクレオチド、及び増感配位子が結合した挿入剤の二つの試薬の溶液を固定化したポリヌクレオチドに添加することによりアッセイを行う。ポリヌクレオチドはハイブリダイズさせられる。平衡化の後、余分な試薬を洗い流し、さらに結合複合体を光で照射し、遅延発光を測定する。標的ポリヌクレオチドが存在しない場合は挿入は起こり得ず、このためランタニドイオンの増感は観察されず、即ち遅延発光は起こらない。ポリヌクレオチド標的を含むアッセイのためには、プローブに対する分析対象物の完全な塩基配列マッチは必ずしも必須ではない。従って例示として、プローブに相補的な領域に塩基突然変異（単数または複数）を有する標的を分析することができる。これはこの位置でミスマッチを起こし、その結果、生じるポリヌクレオチドデュプレックスにおいて「バブル」が形成される。理論上の考察から及び／又は実験により、デュプレックス結合剤−増感体が複合体内で結合するであろう領域内にこのバブルが位置するようにプローブを設計することが可能である。挿入又は溝型結合はこの領域でより弱いであろうことから、マッチしたものより弱い発光信号を生ずるであろう。これをマッチしているプローブの強度と比較することにより、突然変異の存在と位置の情報を得られる。突然変異検出の別の方法は、突然変異の不在はハイブリダイゼーションや発光信号をもたらすが、突然変異はプローブをハイブリダイズしなくするように設計した対立遺伝子−特異プローブを使用するものである。ヘテロ接合体は減少した信号を与えるであろう。特に好都合な形態では、本発明の方法はPCR 生成物を標的ポリヌクレオチドとして用いる均質な一段階アッセイであり、相補的プローブポリヌクレオチドのような一又はそれ以上のアッセイ成分をPCR 増幅の開始時に存在させるものである。好ましくはアッセイ成分の全てが存在する。即ち、該方法は自己に含まれる増幅及び検出システムを含むものである。特に有利な点は汚染を回避できることであり、これは例えば増幅後に別の試薬を必要としないため、反応器を開ける必要がないということによる。他の好適なシステムの例は、通常の知識を有する分子生化学者には明らかであろう。核酸ハイブリダイゼーションのための適切なハイブリダイゼーション条件は、日常的な実験により決定できる。B．D．Hames とS．J．Higgins により編集された"Hybridisation-A Practical Approach"(IRL Press，Oxford，1988)に概説されている条件は好適である。２．ポリヌクレオチドプローブ体の説明これは、ポリヌクレオチド認識部分と信号発生成分の一つの二つの部分から構成される。認識部分は選択した標的ポリヌクレオチドを認識するポリヌクレオチドプローブを含む。ポリヌクレオチドプローブは、検出すべき標的ポリヌクレオチド中の塩基の相補的配列とのハイブリダイゼーションをし得る。プローブポリヌクレオチドの配列は、プローブに特異性を与え、それとその標的間の確実な結合を確保にするために、少なくとも６塩基、好ましくは６から５０の間、最適には１２と３０の間であるものである。しかしながらそのような塩基配列は、単一の連続した相補的ポリヌクレオチド配列である必要はなく、非相補的配列により中断された２又はそれ以上の個々の相補的配列で構成できる。さらにプローブの相補的領域は非相補的配列によって3'- 及び5'- 末端に結合するものとすることができ、それらは増幅のための均質配列又は例えば転写プロセス中の認識を妨げるための様々なブロック基を挿入したDNA 又はRNA ベクターを含むものである。どちらの場合でも、分析試薬として与えられたプローブが、対象の試料ポリヌクレオチドと一つ又はそれ以上の位置で検出可能なハイブリダイゼーションを示すことになる。あるいは、ポリヌクレオチド認識部分は、標的へのハイブリダイゼーションの後に、例えば結合により加えられるか、例えば制限酵素により開裂される二つ又はそれ以上のポリヌクレオチド配列よりなる。対象の標的配列は、一つ又はそれ以上のポリヌクレオチド配列に相補的であってもよい。信号を発生する成分を、多くの方法で上記ポリヌクレオチド配列に結合できることが理解されるであろう。前記成分を同じポリヌクレオチド配列により、あるいは隣接したポリヌクレオチド配列により結合してもよい。即ち例えば、キレート配位子及び増感配位子は、別々のポリヌクレオチド配列に結合されていてもよい。ポリヌクレオチド配列は、連続しているか又は、適切なdNTPを用いて「充填」される欠失部分により分離されていてもよい。ポリヌクレオチド配列の長さは、実用的な観点から決定される。一般にこれらは少なくとも８個のヌクレオチドを含む。２．１．ポリヌクレオチド部分実質的に標的ポリヌクレオチドに相補的なプローブのポリヌクレオチド部分の調製方法は、本分野ではよく知られており日常的なものである。一つの方法は、 'M13 Cloning and Sequencing Handbook'，Amersham International(1983)発行及び'Molecular Cloning'，T．Maniatis，E．F．Fritsch and J．Sambrook，Col d Spring Harbor Laboratory(1982)発行で詳述したような組換えDNA と別のクローニングを使用する。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)も、標的ポリヌクレオチド鎖を増幅するために使用できる(K．Kleppe，et al．J．Mol．Biol.，1971，56,341 -346; 'PCR Technology' ed by H．A．Erlich，Stockton Press，New York 1989 )。特定のポリヌクレオチドもまた、Applied Biosystems，Foster City，Califo rnia 製380B型、又はMillipore Corporation，U.S.A．により供給される合成装置のCyclone シリーズのようなDNA 合成装置を用いて調製できる。ポリヌクレオチドという用語は、標的に特異的にハイブリダイズできるDNA 、RNA 及びそのアナログを含む。信号を発生する成分は、遅延発光を導くエネルギー移動プロセスに使用されるポリヌクレオチドプローブの部分である。信号を発生する部分を、ポリヌクレオチド認識部分に、直接またはリンカーアームを介して結合する。信号を発生する部分は、ランタニドキレート化剤又は増感配位子とすることができる。遅延発光は、ポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分が、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズされるときにのみ起こるものでなければならない。ハイブリッド鎖がどれも標的ポリヌクレオチドのものでない場合は、ハイブリッドの存在下で遅延発光が起こってはならない。ポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分がハイブリダイズしている標的ポリヌクレオチドは、試料起源のものでなければならない。従って、ポリヌクレオチドプローブは、単一鎖型で標的ポリヌクレオチド試料に与えなければならず、それ自身と二重鎖ハイブリッドを形成する能力を有してはいけない。もし後者の状態が優勢である場合、二重鎖プローブポリヌクレオチドが挿入剤と相互作用し、増感体とキレート化ランタニドイオンの協働的な組み合わせが生じ、従って遅延発光の観測が起こる。これは誤った陽性の結果を生み出すであろう。ポリヌクレオチドプローブ中のヘアピンループの形成も、挿入剤の存在下で誤った陽性の結果を生じ得る。プローブ配列の選択は、これらの可能性を考慮しなければならないが、適切な対照測定を行うことで容易にチェックすることができる。調査される塩基配列を注意深く選択し、通常は約３０塩基配列より長くないポリヌクレオチドプローブを使用することにより、プローブポリヌクレオチドのそれ自身との相互作用による二重鎖物質の形成の可能性は最小限にできる。２．２．信号発生部分の結合ポリヌクレオチドプローブの信号発生部分は、アッセイ手順の全体を通じて使用される条件下で強く、本質的に非可逆的に金属イオンに結合するランタニドキレート基であるか又は増感配位子である。これをポリヌクレオチド部分に直接結合するか、又は共有結合するリンカーアームを介して結合してもよい。ポリヌクレオチドとの結合場所は、核酸塩基基、糖基又はリン酸基であり得る。塩基基は、ピリミジン又はプリン単位であり得る。リンカーアームの結合は、好ましくは相補的塩基のWatson−Crick 型対形成を妨害しないようにしなければならない。適切な位置は、例えばウラシルの５及び６位、シトシンの５及び６位又は環の外にある４−アミノ基、デアザプリンの７及び８位、グアニンの８位、及びアデニンの８位及び環の外にある６−アミノ基である。好ましい塩基部分との結合のためのリンカーアームはアリルアミンである［欧州特許第063,879 号参照］。例えば、デオキシリボースの3'−又は5'−末端ヒドロキシ基とのエステル又はエーテル結合により、ヒドロキシ基による結合を得ることができる。リン酸基結合は、ポリヌクレオチドの3'−又は5'−末端位とのアルキルリン酸エステル結合によるものでもよい。アッセイ手順中で使用される条件下で安定であるように、リンカーアームを選択しなければならない。リンカーアームの結合方法は、ハイブリダイゼーションに必要な塩基の官能基の改変又はブロック又は塩基の糖からの開裂を生じないものでなければならない。好適には5'及び／又は3'末端、好ましくは5'末端を結合に使用する。２．３．リンカーアームリンカーアームは、ポリヌクレオチド認識部分をキレート−金属複合体又は増感体に結合している原子団を含む。リンカーアームは、多くの方法でポリヌクレオチド認識部分に結合できる。リンカーアームはそれを認識部分に結合できる第一官能基、及びそれをランタニド金属キレート化剤又は増感配位子に結合できる第二官能基を持っていなければならない。リンカーアームは、例えば炭素−炭素単結合、炭素−炭素二重結合、炭素−炭素三重結合、炭素−窒素単結合、炭素− 窒素二重結合、炭素−酸素単結合、炭素−硫黄単結合、炭素−けい素単結合、硫黄−窒素結合、硫黄−酸素結合、リン−酸素結合又はリン−窒素結合により結合できる。適した官能基としては、水酸基、アミノ基、チオ基、アルキル硫酸塩、及びハロゲン化物が挙げられるが、これらに制限されるものではない。リンカーアームが、一つの断片としてポリヌクレオチド認識部分に結合している必要はない。２．４．リンカーのポリヌクレオチド認識部分への結合リンカーをポリヌクレオチドの5'又は3'末端に結合する場合、好適な結合としてはリン酸、カルボキシ又はエーテル結合が挙げられ、特にリン酸結合が好適である。適当なリン酸リンカーとしては、アミノアルキルホスホリル基で、Ｃ１− １２アルキル鎖、特にＣ６アルキル鎖を含むものは特に適している。これらのリンカーは、固相合成中に容易に合成オリゴヌクレオチドに結合することができる。例えばS．Agrawal et al，Nucleic Acids Research，1986，14，6227及びWO-8 8/02004(Applied Biosystems)を参照。そしてアミノ基はキレート化剤−金属複合体又は増感体の結合に使用できる。あるいはリンカーは、第一断片を認識部分に結合し、続いて第二断片を第一断片に結合することにより形成できる。適切な第一断片の例は、-NH-CH₂-CH=CH-，SH-CH₂-CH₂-CH=CH-， -NH-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH=CH-，-(CH₂)n-O-（n は１から２０までの整数）を含む。適切な第二断片の例は、N-O-CO-R; N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、R- C(=NH)-OR;イミデート、R-CO-O-CO-R;無水物、R-N=C=S;イソチオシアネート、 R-CO-SR ;チオエステル及びR-(C=S)-SR; ジチオエステルにより導入されたものを含む。第二断片又はキレート化剤又は増感剤はアミン反応性官能基、例えば、R-COO- Su（ここでSuはスクシンイミジル基を意味する）、R-(C=NH)-OR、R-COO-CO-R、R -N=C=S 及びR-CS-SR により導入でき、又はチオール反応性官能基、例えば、-R- O-C(=O)-CH₂-X（ここでX=はハライド基である）、R-Ma（ここでMaはマレイミド基を示す）、R-S-S-Y，（ここでＹは好ましくはピリジル基のような電子引抜基である）により導入できる。上記の全断片中で、上記で定義したように、R はリンカー基を意味する。リンカーアームをポリヌクレオチド塩基に結合するための他の一般的な方法は、J．L．Ruth and D．E．Bergstrom，J．Org．Chem.，1978，43，2870; D．E．B ergstrom and M．K．Ogawa，J．Amer．Chem．Soc.，1978，10，8106;及びC．F.B igge，P．Kalaritis，J．R．Deck and M．P．Mertes，J．Amer．Chem．Soc.，19 80, 102 2033 で論じられている。一つの好ましい方法は、欧州特許出願第063,8 79 号で詳しく開示されており、これは引用により本明細書の一部とする。この方法は、リンカーアーム又はα−ビニル基を含むリンカーアーム断片を、K₂PdCl₄ の存在下で水銀と化合した塩基と反応させることを含み、ここで水銀はHg＋としてリンカーアームと反応する塩基の位置に結合しているものである。その目的を達成できる限り、リンカーアームの大きさや含有量は特に制限されない。リンカーアームは約二個から任意の数の炭素を含むことができる。リンカーアームはヘテロ原子や不飽和を含んでもよい。リンカーアームは脂肪族、脂環式、芳香族又は複素環式基を含んでもよい。-(CH₂)n-を含むものが好適である。しかしながら、水溶解性の保持を助ける-O-、-CHOH-、-COO- 及び-CH₂CH₂O- のような他の基を含んでもよい。リンカーが-(CH₂)n-でｎが８又はそれ以上である場合は、好ましくは、それはメチレンのみを含むのではなく上述した他の基を含み、又は上述のように二成分により導入されなければならない。リンカーアームのポリヌクレオチドの糖基への結合は、1'- アルデヒドに対するシッフ塩基とその後の予め選択した塩基の脱プリン化又は脱ピリミジン化、あるいは糖がリボースである場合は2'- ヒドロキシに対するものにより行うことができる。リンカーアームのリン酸塩部分への結合は、リン酸塩基のアルキル化により行うことができる。米国特許第4,469,863 号を参照。これは引用により本明細書の一部とする。リンカーアームを塩基グループに結合する場合、ポリヌクレオチドの生成前に塩基と結合することが望ましい。これは、リンカーアームを塩基に結合するのに必要とされ得る反応条件がポリヌクレオチドに望ましくない副反応を起こすかもしれないからである。さらにポリヌクレオチドレベルでの結合は、不揃いで再現できない収率を生じる。ヌクレオシド又はヌクレオチドレベルでの結合により、修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを最初に精製し、次にポリヌクレオチドに取り込むことができる。取り込みは、例えばＭ１３ベクター中でのクローニングか、又は上述したポリヌクレオチド合成装置中での合成により行うことができる。Ｍ１３ベクターによる取り込みのためには、修飾ヌクレオチドは、一般に研究された核酸ポリメラーゼの比較的効率のよい基質でなければならない。即ち、リンカーアームは、酵素上の活性部位又は修飾ヌクレオチドの相補的塩基対形成のどちらも立体的に干渉してはならない。標準の「アンチ」ヌクレオシド配座を変える位置での置換も、そのような配座変化が通常修飾ヌクレオチドをポリメラーゼ酵素についての適当でない基質とするため、避けなければならない。リンカーアームが糖の1'- アルデヒドに結合する場合、リンカーアームをポリヌクレオチドプローブのポリヌクレオチド部分の形成の後に結合しなければならない。これは、糖の結合が糖の1'- 位の遊離アルデヒドを必要とするからである。遊離アルデヒドは脱プリン化又は脱ピリミジン化により形成する。塩基のない糖とリン酸を含む基は、ポリメラーゼ酵素の基質ではない。従ってリンカーアームは、所望のポリヌクレオチド配列をまず選択的に脱プリン化又は脱ピリミジン化し、その後にリンカーアームを糖にアルデヒドにより結合することにより結合しなければならない。リンカーアームがリボース糖の2'- ヒドロキシ基に結合する場合は、リンカーアームをヌクレオシド、ヌクレオチド又はポリヌクレオチドレベルで結合してもよい。これは、リンカーアームにより修飾されたヌクレオチドが、ポリヌクレオチド合成装置によりポリヌクレオチドに取り込まれる得るからである。リンカーアームをリン酸に結合する場合は、結合がリン酸以外の位置で起こらないようにするため、望ましくはヌクレオシド又はヌクレオチドレベルでリンカーアームを結合する。ホスホルアミダイト技術を核酸合成装置中で使用して、ポリヌクレオチドの５’又は３’末端へリンカーを取り込んでもよい。２．５．キレート化剤のリンカーへの結合キレート化剤は、金属陽イオンを封鎖でき、それに結合できる基である。キレート化剤は、金属と非共有結合的に相互作用する２又はそれ以上の官能基を持つ。金属キレート基のポリヌクレオチドへの結合は、当分野では知られている［引用により本明細書の一部とする欧州特許第097,373 、150,844 及び157,788 号を参照］。キレート化剤はランタニドを水から保護するように働く。増感配位子を収容するためにイオンの周囲で空間を利用できなければならないので、キレート化剤でランタニドイオンの周囲の可能な結合部位の全てを飽和しないということが本発明の重要な要件である。キレート化剤の例は、限定するものではないが、エチレンジアミン四酢酸(EDT A)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)；トランス−1,2 −ジアミノシクロヘキサン四酢酸(DCTA)；1,4,10−トリオキサ−7,13−ジアザシクロペンタデカン−7, 13−二酢酸及びビシクロ[5.5.2]1,4,7,10-テトラアザシクロテトラデカン−4,10 −二酢酸のような多環式アザクラウン系である。１−フェニルエチレンジアミン四酢酸のような上記のものの修飾した誘導体は、芳香族環中にジアゾニウム又はイソチオシアネート誘導体のような結合基を配置する位置を可能とする。適当なキレート化剤の他の例は、クラウンエーテル、かご型化合物、ランタニドに結合するための適切な供与基を有する包接化合物のような多官能化合物を含む。これらの基が、窒素、例えばエーテル上の酸素、又はカルボン酸基を含むことが好都合である。適切なキレート化剤の選択は、化学者又は通常の技術者には明らかであろう。他のキレート化剤及びそれらの効率に影響する要因は、Marcel Dekker，New York 1990により発行された'Cation Binding by Macrocycles' ed . Y．Inoue and G．W．Gokel，pp 203-251 by T．M．Fyles 中で概説されている。別の概説は、Arnaud-NeuによりChemical Society Reviews，1994，23，4，235 -241中に提供されており、これは中でも、コロナンド、クリプタンド、カリキサレン及びそれらの修飾したものを使用して、全てのランタニドイオンの使用可能な部位が占有されていない、安定したランタニド複合体を生成することを記載している。キレート化剤を、多数の基によりそのリンカーに結合できる。例えば、限定するものではないが、-O-，-NH.CO-，-NH.C(NH)-，-NH.C(S)-，-N=N-，-NH.SO₂-， -S-，-O.PO₂-，-O.SO₂-，-NH-N=N-，-NH-CH₂-，-CH₂.NH-，-NR-，-O.CH₂-， -O.CO-，-NH.CO.CH₂.S-，-NH.CO.CH₂.NH-，-O.CH₂.CH₂.O-，-O.CO.CH₂-,-S.CH₂- 及び-O.CO.NH- である。あるいは、上記で概説したキレート化剤のカルボキシ基の一つを、リンカーの結合に使用してもよい。無水物、例えばEDTA無水物の使用は、特に好適である。一定の環境では、キレート化剤が金属に対する増感体として働く基を含み得ることが理解されるであろう。種々の条件をキレート化剤のリンカーアームへの結合に用いることができる。一般的に、pH、温度、溶媒又はバッファーが基又はポリヌクレオチド部分のどれも改変しない限り、約４から約10、好ましくは約５から約８の任意のpH域、約20 ℃から約100 ℃の任意の温度、好ましくは水である任意の溶媒、及び任意のバッファー又は触媒を使用できる。従って、例えば、ポリヌクレオチドを脱プリン又は脱アミノできる試薬や条件は避けるべきである。反応時間に関しても制限はほとんどない。キレート化剤をリンカーアームへの結合のための最適pH、温度、溶媒又は反応時間は、リンカーアーム、キレート化剤及び反応する官能基に依存しており、通常の技能の科学者により決定され得る。これらの結合反応に必要な反応物質の化学量論は大きく変化し得る。一般的に、より容易に調製される成分の過剰分は、キレート化剤のポリヌクレオチドへの結合のために使用される。やはり量は反応条件、キレート化剤、リンカーアーム及びそれらの反応官能基に依存して変化する。リンカーアームのポリヌクレオチドへの取り込み後、又はリンカーアームのヌクレオチドへの取り込み前にキレート化剤をリンカーアームに結合することができる。キレート化剤がポリヌクレオチド合成を妨害する場合は、取り込み前にそれを結合できないという制限があるだけである。結合体は一つのキレート化剤又は一つ以上のキレート化剤を含むことができる。ポリヌクレオチド認識部分のために、キレート化剤をポリヌクレオチドプローブの末端位又は非末端位に結合できる。キレート化剤の数が多くなればなるほど、結合体は感度がより高くなるであろう。しかしながら、分析対象物の結合体との効果的な複合化が実質上妨害されるような数で、キレート化剤を存在させるべきではない。結合され得るキレート化剤の数は、認識部分の組成、大きさ及び長さに依存する。２．６．金属の結合テルビウム、ユーロピウム、サマリウム及びジスプロシウムのものであるランタニド金属キレートは、ミリセカンド域までの長寿命発光を示すことができる。テルビウムは４８０から６３０ｎｍの範囲で、ユーロピウムは５８０から７００ｎｍの範囲で発光する。ユーロピウムは好ましい金属である。これらのイオンはいずれも水溶液中では強い吸収（消光係数）を示さず、例えばＥＤＴＡである非増感配位子とのキレートも非常に低い消光係数を示し、２７０−３２０ｎｍ及び約４８８ｎｍの不連続域でテルビウムの、及び３２０−３６０ｎｍ及び約５８０ｎｍの不連続域でユーロピウムの弱い吸収が起こる。これらの金属の励起状態を、適切な増感体からのエネルギー移動を使用し達成できる。全空間フォルスターエネルギー交換機構を用いている一重項状態のエネルギー増感体は効果が無く、これはこれらのランタニドイオンの励起状態は形式上許容されず、プロセスが三重項状態の増感作用を必要とすると考えられるからである。三重項状態増感体は、そのエネルギーを移動するために、衝突のように密接な接触を要求し、空間で効果的にエネルギーを移動しない。励起プロセスは、配位子として働き得る、すなわちそれらが常に金属イオンと密接な接触が保たれている、三重項状態増感体を用いて効果的に得られる。溶媒中のキレート化剤の溶液を、pH５から10、好ましくは６と８の間の範囲のハロゲン化物又は硝酸塩のような金属塩の溶液と攪拌することにより、金属イオンをキレート化剤にキレート化できる。キレート化ランタニドの形成は遅く、数時間かかることがある。しかし一旦形成されると、結合定数が大きいので解離は極端に遅くなり、pH５から１０の範囲内ではプロセスは本質的に不可逆である。キレート化剤のリンカーへの結合の代わりとして、以下に詳述するように増感体を結合できる。３．増感体の説明増感体はエネルギー移動プロセスのアンテナである。これは結合により達成されるようそれらが接近している場合に、励起状態エネルギーをランタニドに効率的に伝えるように働く。増感体は、三重項増感体として挙動し得る、存在し得る有機、芳香族又はヘテロ芳香族系の範囲の任意のものであり得る。本発明の重要な要件は、イオン周辺のキレート基を移すことなく、システムがランタニドイオンの配位子として挙動することができるものであり、分析対象物の存在下で増感体及びキレート化剤の両方が同時にランタニドイオンに到達し、結合できなければならないということである。適する配位子増感体は、R1、R2、R3がアルキル、ヘテロ環式、芳香族、ヘテロ芳香族基、エーテル、エステル、アミド等である一般式Ｉのβ−ジケトンを含むが、それらに限定されるものではない。ヘテロ環式系は、R1、R2が-CO₂H,-CO.NHR，-CO.NR₂，-CO.NR1.R2，-CO.NH.OH, -CH₂CO₂H，-CH₂.CO.NHOH，-CH₂PO.(OH)₂，-CH₂.PO(R)OH，-CH₂OH，-CH₂SH，-PO( OH)₂，-PO(R)OH，-CH₂N(CH₂.CO₂H)₂ のようなキレート化基である一般式IIの置換ジピリジル化合物、及び一般式III のフェナントロリンを含むが、それらに限定されるものではない。他の好適なヘテロ環式系は文献に記載されており、通常の技能の科学者には明らかであろう。増感体はまたリンカー(R3)を有していてもよく、リンカーアームは増感体をプローブポリヌクレオチド又は挿入体に結合する原子団を含む。多くの基によりリンカーを増感体に結合することができる。そのような基の例は、限定されるものではないが、リンカーのキレート化剤への結合で詳述したものである。４．デュプレックス結合剤の説明水素が結合した塩基対の隣接したセット間に、作用剤自体を挿入する挿入プロセスによるか、又はデュプレックスの主要な又は小さな溝における結合により、多数の芳香族試薬又は染料を、二重鎖ポリヌクレオチドに結合できる。二重鎖ポリヌクレオチドは、DNA-DNA，DNA-RNA又はRNA-RNA であってよい。挿入の結果、隣接した塩基対の分離間隔を通常の約二倍に広げ、デュプレックスの分子長を増加させる。挿入剤を収容するために、二重螺旋の巻き戻しも起こるであろう[M．J．Waring and L．P．G．Wakelin，Nature，(London)，1974，25 2，653; L．P．G．Wakelin，Med．Chem．Rev.，1986，6,275を参照]。挿入剤の例は、それに限定されるものではないが、例えばアクリジンオレンジやアクリフラビンであるアクリジン染料、例えばエチジウムであるフェナントリジン類、例えばアドリアマイシンであるアントラサイクリン類、例えばダクチノマイシンであるキノキサロン類、フェナジン類、キノリン類、アントラセン類、フロクマリン類及びフェノチアジン類である。挿入剤はデュプレックスDNA と可逆性複合体を形成し、結合及び解離速度が大変速く、温度依存性であり、結合定数は10⁴ から10⁸ mol ^-1であり、通常は10⁶m ol ^-1である。本プロセスの速度がかなり速く、活性複合体を形成するために、作用剤がキレート化ランタニドイオンの到達距離内になるまで異なった塩基対間で挿入が起こることが重要である。溝型結合作用剤の例は、限定するものではないが、ポリピロール抗生物質ネトロプシン及びジスタマイシン、ジアミジンベベニル及びヒドロキシスチバミジン、ヘキスト（Hoechst）33258、DAPI(4',6-ジアミジノ-2- フェニルインドール) 、クロモマイシン、オリボマイシン、ミトラマイシン及びクリスタルバイオレットである。デュプレックス結合剤は、好ましくはリンカーに結合されており、リンカーアームは挿入剤を増感配位子又はキレート化剤に結合している原子又は原子団を含む。そのような基の例は、限定するものではないが、リンカーのキレート化剤への結合で詳述したものである。５．結合したデュプレックス結合剤−増感体成分部分を前の３及び４の項で記載した、一般式(IV)に記載した挿入剤を結合した増感体化合物は新規化合物であり、本発明の一部として特許請求している。デュプレックス結合体の増感体／キレート化剤への結合はリンカーアームを用いて好適に行なわれ、そのリンカーアームは-(CH₂)n-を含みｎが２から２０の間、好ましくは４から１２の間であるものが好適である。増感体又はキレート化剤及びデュプレックス結合剤との結合は、それらの部分の化学特性に依存し、それらの部分の機能を保持する任意の適当な方法を用いることができる。そのような結合は、通常の技能の化学者には明らかであろう。好ましくは、結合は大きな原子群を含まない。好ましくは、デュプレックス結合剤付近のリンカーは親水性でなく、好ましくは負電荷を含まない。６．分析対象物本発明の方法は、例えば微生物、植物細胞又は哺乳動物の細胞のような任意の適当な真核細胞又は原核細胞種からの標的ポリヌクレオチドを検出するために使用できる。微生物は細菌、真菌類、ウイルス又は酵母であってよい。標的ポリヌクレオチドは、特定の病原ウイルスに特有であるもの、非天然的作用性タンパク質を生成する突然変異した哺乳動物の遺伝子中に存在するもの、又は細菌に対する耐性を与えるものであってもよい。それはまた、ポリメラーゼ連鎖反応を用いたポリヌクレオチドの増幅で生じたものであるか、又はクローニング法により調製されたポリヌクレオチド生成物であってもよい。特定のポリヌクレオチド生成物は、例えば欧州特許第0201184 号に記載されたようなポリメラーゼ連鎖反応(P CR)の使用により、又は欧州特許第0332435 B1号(Zeneca Limited)中で特許請求されたようにAmplification Refractory Mutation System（ARMS）の使用により生じるものである。別のポリヌクレオチド生成物は、国際特許出願公開WO-87/06 270 号で記載されたようにQ-βレプリカーゼの使用により、国際特許出願公開WO -88/10315 で記載されたようにSiska Corporation の転写に基づく核酸増幅(TAS )の使用により、欧州特許出願公開0469755 号(SYNTEX)で記載されたように単一プライマー増幅(SPA)の使用により、持続配列複製(3SR)の使用により、リガーゼ連鎖反応(LCR)の使用により、あるいは修復連鎖反応(RCE)の使用で得られるものである。 PCR 増幅及びいくつかの用途ではARMS増幅が本発明の検出方法の好ましい第一段階である。アッセイされる試験試料は、関心のある媒体であれば任意のものでよいが、通常は医学、獣医学、環境、食物、又は工業的意義を有する液体試料である。人間や動物の標本、及び体液を本方法でアッセイでき、それ等には尿、血液（リンパ液又は血漿）、羊水、乳、脳脊髄液、唾液、排泄物、肺吸出物質、咽喉スワブ、生殖器スワブ及び滲出物、直腸スワブ、及び上咽頭吸出物質を含む。患者や試験される他のソースから得た試験試料が、細胞中に含まれているような二重鎖核酸を主に含む場合は、核酸を変性するために試料を処理し、必要であればはじめに細胞から核酸を放出させる。核酸の変性は、好ましくは沸騰水中での加熱又は例えば0.1M水酸化ナトリウムにより行われるアルカリ処理で行われ、所望ならば細胞を溶解するために同時に使用してもよい。また核酸の放出は、例えば機械的粉砕（凍結／解氷、摩砕、超音波崩壊）、物理的／化学的粉砕（Triton，Tween，ナトリウムドデシレートのような洗浄剤、アルカリ処理、浸透ショック、又は熱）又は酵素溶解（リゾチーム、プロティナーゼ、ペプシン）により行うことができる。得られる試験媒体は、本発明のハイブリダイゼーション法によりその後アッセイされ得る単一鎖型の核酸を含む。図１は、挿入剤の使用により例示された本発明の主要部分を説明するものである。用いた結合が、増感体とキレート化剤が互いに接触する可能性を妨げないということが要件である。それらの全長が長すぎることも短かすぎることもないようにそれらを選択しなければならない。一般に、二つの結合体の合わせた長さが、４〜４０原子の間、最適には１０〜３０原子の間であるように、それぞれの結合の原子数は２〜２０原子の間でなければならない。試験試料は好適には標的真核細胞から得られ、例えば先天性又は後天性疾患、父系を含む身元決定、疾病や特異条件に対する素質、及び個体群多型性の分析のためのゲノムDNA 及び／又はRNA の試料を含む。本発明は特にＨＬＡタイプ分け及び膀胱線維症、鎌状赤血球貧血及び癌の検出及び／又は診断に有用である。７．マルチプレックス試験本発明の方法は、一より多くの標的ポリヌクレオチドを同時に検出するために使用できるということが理解されるであろう。本発明の発光性ランタニド複合体からエネルギーを受容することができる一又はそれ以上のフォルスターエネルギー移動受容体の使用を含む方法が好適である。異なった波長の光を放射する多数の異なるそのような受容体を選択し使用し、それぞれのエネルギー移動が異なる核酸配列を示すようにする。発光エネルギー移動はDNA の検出のために開示されている。例えばP．R．Selvin et at．J．Am ．Chem．Soc．116，6029-6030(1994)を参照。エネルギー移動受容体を用いた多数のバリエーションは可能である。バリエーション１：エネルギー移動受容体を、本発明のポリヌクレオチドプローブに結合する。従って変化する配列の多数の検出のために、各オリゴヌクレオチドプローブが異なった波長の光を放射し、そのプローブに相補的な標的核酸の存在を示す。エネルギー移動受容体のプローブへの結合は、その機能を妨害しない任意の好適な位置にある。好ましくは、選択されたエネルギー移動対のRo値内に位置する。増感体又はキレート化配位子をポリヌクレオチドの一方の末端に置いた場合は、エネルギー移動受容体を反対側の末端に結合するのが好適である。あるいはそれを塩基に結合する。バリエーション２：エネルギー移動受容体を、増感体又はキレート化配位子を有するポリヌクレオチドに隣接した標的核酸に結合するため選択されたポリヌクレオチドプローブに結合する。従って、両方のポリヌクレオチドプローブが標的核酸に結合する場合のみ信号が測定される。やはりポリヌクレオチドプローブへの結合は、機能に影響しない任意の好適な位置にあり、ポリヌクレオチドプローブ配列の選択と共に、発光性ランタニド複合体からの有用な程度のエネルギー移動が起こるように選択される。バリエーション３：バリエーション２を用いるが、エネルギー移動受容体を有する隣接したポリヌクレオチドプローブが、対立遺伝子特異性プローブである。従って、受容体発光の有無は、標的DNA 上の特定の対立遺伝子の有無を決定する。このものの別の使用は、例えばHLA 遺伝子座で近くに結合した突然変異の段階を検出するためのミスマッチポリヌクレオチドと共に使用するものである。この方法では、光発光の波長は一方又は両方の突然変異の存在を示す。エネルギー移動受容体の使用は、単一核酸配列の検出（非複数アッセイ）にもあてはまる一定の利点を有すると考えられる。例えば本明細書に記載された隣接したポリヌクレオチドプローブの使用は、アッセイに非常に高い特異性を与え、これはある状況で有利となり得る。さらに、発光エネルギー移動を用いたシステムの全体の光放射効率は、ランタニド放射のみを使用する場合より高いと考えられ、従ってより敏感なアッセイが行える。好適なエネルギー移動受容体は、特定の蛍光タンパク質（例えばアロフィコシアニン）、特定のフタロシアニン、Cy-5（Biological Detection Systems）及びランタニド放射により励起し得る他の蛍光化合物を含む。適当な化合物とそれらをアッセイ成分に結合する手段は、上で概説した方法や材料及び／又は日常的な実験法を用い確認され得る。適当な受容体、及び供与体と受容体間の距離の選択に関係している問題の好適な認識は、Selvinの前掲書で示されている。別の形態は、デュプレックス結合剤に抱合したエネルギー移動受容体である。この新規な物は、発光性ランタニド複合体付近のデュプレックスDNA に結合し、ランタニド放射からエネルギーを受け、光を放射する。発光エネルギー移動を用いたシステムの光放射の効率は、ランタニド放射のみを含む場合より高いと考えられ、従ってより感受性の高いアッセイが得られる。あるいはマルチプレックス試験は、異なった放射スペクトルを使用し、即ち励起波長及び／又は異なるランタニドを用いて異なった標的ポリヌクレオチドでハイブリダイゼーション生成物を識別して、好適に行われる。適当なシステムの例は、通常の技能の科学者には明らかであろう。我々は理論的考察に拘束されることを望むものではないが、同時に検出される標的ポリヌクレオチドの数は、主に実用的観点から制限される。８．その他の特徴本発明の別の特徴は、得られた結果の有効性を確実にするために、一又はそれ以上の対照反応を使用することである。ハイブリダイゼーションで、検出される異なった放射スペクトルを生ずる対照ポリヌクレオチドの使用により、特定の対照反応を得られる。本発明のさらに別の形態では、ハイブリダイゼーション中の信号変化速度の測定が、診断目的のために使用され得る。非限定例であるが、信号変化速度は標的ポリヌクレオチドのコピー数を示すことができる。これは例えば、遺伝子座の特定の対立遺伝子に対して、個体が同型接合体か、異型接合体のどちらであるかを示し得る。あるいは、正常対立遺伝子のバックグラウンドに対する突然変異対立遺伝子の存在を示し得る。これは癌の検出や診断で特に有用なものとなり得る。信号変化の速度も、ハイブリダイゼーションプローブとその標的ポリヌクレオチドの組成を反映でき、分析手段として役立つ。前に述べたように、本発明の方法は、Amplification Refractory Mutation Systems(ARMS)と共に使用して特定の用途を有する。一又はそれ以上のARMS増幅プライマーを、本発明で使用するための信号を発生する成分を有するものとして提供できる。あるいは、ARMS増幅の生成物を分析のために標的ポリヌクレオチドとして使用する。好適なアッセイ形式はマルチプレックス反応を含む。個々の突然変異に関する情報が要求される場合は、別々の試料アリコートを例えば異なったマイクロタイタープレート上で分析する。あるいは、本発明の好ましい形態では、Eastman Ko dak により開発された「パウチ（pouch）」技術により提供されたような閉鎖系内で、分析対象物を保持し動かす。これは汚染を減らし、結果の判定をしやすくするであろう。９．アッセイキット本発明はまた、標的ポリヌクレオチドのような分析対象物の検出用アッセイキットに関する。そのようなキットは好適には次の要素の一つ以上を含む。即ち、１又はそれ以上の(i)ポリヌクレオチドプローブ、(ii)増感体、(iii)挿入体、(i v)結合した挿入体−増感体、(v)バッファー、(vi)ＰＣＲ増幅プライマー及び(v) 使用説明書である。アッセイ成分のいくつか又は全てを、増幅手順の開始時に提供してもよく、例えばプライマー及び／又はプローブ及び／又は挿入体及び／又は（結合した）増感体である。上述のキットは本発明の方法で使用するために好適に修正し適応させる。非制限例であるが、キットは「パウチ」システム又は単一反応器及び／又はマイクロタイタープレートを含んでもよい。上述の種類は、好ましくは、信号検出を容易にするための光透過性容器を含む。１０．配列依存型挿入エネルギー移動システムの第二成分が、挿入により第一成分の特異的な近い距離内に位置させられていることは上述より明らかである。プローブ結合が正しいときにのみ信号が発生するように、ポリヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列を適応させることが理解されるであろう。即ち、一又はそれ以上の可能性のある非相補的領域をポリヌクレオチドプローブ配列内に組み入れることができ、標的ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにおいて診断上のミスマッチが存在する場合、挿入は起こらず、信号は生成しない。所望の場合は本態様の感度を高めるために追加の不安定化ミスマッチを使用することができる。１１．機器本発明の方法は、アッセイの方式により、蛍光を測定するために様々な機器を使用できる。マイクロタイタープレート中で行うアッセイのためには、プレート内の時間分解型蛍光を測定できる蛍光光度計、例えばDELFIA蛍光光度計(Wallac) が望ましい。もしくは、キュベットや試験管に適した蛍光光度計も使用可能である。PCR 及びARMS生成物の測定のためには、容器を開ける必要なく（場合によっては増幅反応の間に）増幅器内で信号を測定するために機器を工夫してもよい。これは汚染の問題を回避する。本発明をここで以下の図及び実施例を参照することにより説明するが、限定するものではない。図１は、プローブＤＮＡの標的ＤＮＡへの結合を表す。挿入体、結合、増感体、ランタニドイオン、キレート化剤及びキレート化剤とプローブＤＮＡとの結合を示す。図２は、実施例１に記載された112 倍希釈及び約1.7 ×10^-8 Mのプローブと標的の濃度を有するアッセイ溶液の出力を示す。曲線ａはマッチング標的Ａ、曲線ｂはミスマッチ標的Ｂである。図３は、実施例４に記載された両方とも２×10^-7 Mの濃度である正常標的3860 及び正常プローブ3922を有するアッセイ溶液の出力を示す。図４は、実施例４に記載された両方とも２×10^-7 Mの濃度である突然変異標的 3288及び正常プローブ3922を有するアッセイ溶液の出力を示す。図５は、実施例４に記載された２×10^-7 Mの濃度である正常プローブ3922を有するアッセイ溶液の出力を示す。標的は存在しない。図６は、実施例４に記載された64倍希釈で，（i）両方とも3.1 ×10^-9 Mの濃度である正常プローブ3922と突然変異標的3288［実線］及び(ii)両方とも3.1 × 10^-9 Mの濃度である正常プローブ3922と正常標的3860［点線］を有するアッセイ溶液の出力を示す。［図２から６中で、上記の強度はＹ軸に、波長はナノメートルでＸ軸に示す。］方法及び材料プローブヌクレオチドの調製(1): ホスホルアミダイト法を用いたApplied Biosystemsポリヌクレオチド合成装置を用いて行った。結合反応中の9-フルオレニルメトキシカルボニルアミノヘキシルβ−シアノエチルN ，N'−ジイソプロピル−アミノホスフィットを使用するホスホルアミダイト合成の特別なサイクルを用いることにより、6-アミノヘキシル基を5'−末端リン酸基上に導入し化学構造(1)を得た。キレート化剤の調製(2): オリゴヌクレオチド(1)(250 μｌ，10^-6Ｍ)を、最初に100ul 10mM炭酸ナトリウムを添加し、次に希塩酸(0.1M)を添加することにより、pH7.5 に調整した。溶液をEDTA二無水物（25倍）と室温で5 時間攪拌した。攪拌溶液に、次にEuCl₃.6H₂ O（25倍）を加え、さらに5 時間攪拌し続けた。混合物を遠心分離し、上澄み液を、0.1M塩酸でpH7.5 に調整した10mmolトリスバッファーを溶出液として用い、 Sephadexカラム(NAP 5カラム,Pharmacia)に通し、50 μｌずつのフラクションを集めた。フラクションを260nm の吸光度によりモニターし、吸収を示すフラクションを合わせ、必要なときまで2 ℃で貯蔵した。挿入体の調製(3): ａ．5-ニトロ-2,9−ジメチルフェナントロリン(4) ネオクプロイン(2,9−ジメチルフェナントロリン半水和物；10ｇ)を、冷やした発煙硫酸(44ml)に室温で攪拌しながら分割して加え、次に発煙硝酸(50ml)を加え溶液を窒素下で1 時間140 ℃で加熱した。この後、反応混合物を冷却し、砕氷上に慎重に注ぎ、固体炭酸ナトリウムでpH6 に中和した。黄色固体生成物を集め、3M硫酸溶液から再沈殿により精製してニトロ化生成物(4)(6.6g，50%)，m.p．1 76-180℃(dec.)を得た。半水和物として分析された物質、C₁₄H₁₁N₃O₂.1/2H₂O : 計算値C，64.12; H，4.60; N，16.02、測定値C，64.52; H，4.23; N,15.68%。ｂ．5-ニトロ−2,9-ビス-(トリクロロメチル)-1,10−フェナントロリン(5) 四塩化炭素(150ml)及びクロロホルム（25ml）中のニトロ化合物(4)(5.06 g,20 mmol)を、N-クロロスクシンイミド(18.7g，140 mmol)及び触媒量の3-クロロ安息香酸の存在下、加熱還流した。24時間後混合物を室温に冷却しろ過した。ろ過液を10% w/v 炭酸ナトリウム溶液で数回洗浄し、乾燥し、溶媒を除去して粗生成物を得、ろ過した固形物をクロロホルムと共に粉砕し同様の方法で処理することにより別の生成物を得、7.08 g(77%)の全収率を得た。クロロホルムを溶出液として用いたシリカゲルのカラムクロマトグラフィーで分析的に純粋な物質(5)を得た。純粋な物質は、m.p．228-231℃を示した。測定値C，36.16; H，1.11; N，8.91．、C₁₄H₅N₃O₂Cl₆計算値C，36.56; H，1.10; N，9.14%. ｃ．5-ニトロ-1,10-フェナントロリン−2,9-ジカルボン酸(6) ヘキサクロライド(5)(1.5g，3.3 mmol)を９８％硫酸(8ml)と混合し、窒素下で８０から９０℃に加熱した。６時間後、粘性の溶液を砕氷上に注ぎ、二塩基酸（ diacid）を淡黄色固形物として沈殿した。固形物を集め、温テトラヒドロフラン水溶液から再結晶して純粋な二塩基酸(0.9g，89%)を得た。m.p．218-220℃，測定値C,52.46; H，2.77; N，12.95．C₁₄H₇N₃O₆.1/2H₂O計算値C，52.18;H，2.50;N ,13.04% ｄ．5-ニトロ-2,9−ビス(メトキシカルボニル)-1,10−フェナントロリン(7) ヘキサクロライド(5)(2.0g，4.35 mmol)を９８％硫酸(5ml)と混合し、窒素下で２時間９０℃に加熱した。混合物を氷中で冷却し、次にメタノール(10ml)にゆっくり加えた。４５分以上加熱還流後、余分なメタノールを真空で除去し、残留物を炭酸ナトリウム飽和水溶液によりpH６−７に中和した。粗生成物を真空ろ過により集め、純粋なジエステル(1.27g，86%)を得るために乾燥した。m.p．260℃ 付近（分解）測定値C，56.42; H，3.24; N，12.05． C₁₆H₁₁N₃O₆ 計算値C，56. 31; H,3.24; N,12.31% ｅ．5-アミノ-2,9−ビス(メトキシカルボニル)-1,10−フェナントロリン(8) メタノール(100ml)中のニトロ化合物(7)(1.0g，3 mmol)をシクロヘキセン(1.4 g，17 mmol)及びPd/C(10%，0.2g)と加熱し、3 時間還流を続けた。混合物を冷却し、残留物を色が出なくなるまで別のメタノール(50 ml)で洗浄しながらCelite でろ過した。ろ液を合わせて蒸発させ、明るい黄色の固形物(0.73g,77%)として生成物アミンを得た。m.p．240℃付近（分解）M/e 311 (M+; 57%)，253(86)，19 5(56)．ｆ．5-アミノ-1,10-フェナントロリン-2,9−ジカルボン酸(9) 蟻酸(15ml)中のニトロジカルボン酸(6)(0.3g，0.93mmol)をPd/C(10%，0.3g)で処理し、混合物を2 日間窒素下で加熱還流した。混合物を冷却し、ろ過し、固形物を別の蟻酸(10ml)で洗浄し、ろ液を集め、溶媒の蟻酸を蒸発除去し生成物アミンをオレンジ色の固形物(0.26g，96%)として得た。この物質は、ほとんどの有機溶媒に非常に溶け難かった。これは対応するジメチルエステル(8)への転換で特徴付けられたものである。そこで酸(9)の少量の試料(30mg)を、一滴の98％硫酸を含むメタノール(3ml)中で室温で16時間攪拌した。溶液を固体炭酸ナトリウムにより中和し、ろ過し、溶媒を除去して上述した物質と物理的及びクロマトグラフ的挙動が同じであるジエステル(8)を得た。ｇ．5-(6−ブロモヘキサノイル)アミノ-2,9−ビス(メトキシカルボニル)-1,10− フェナントロリン(10) アミン(8)(0.5g，1.6mmol)を6-ブロモヘキサノイルクロリド(0.425g，2mmol) と、過剰のHunig 塩基を含む乾燥クロロホルム(5ml)中で反応させた。室温で2時間攪拌後、溶液を水及び希塩酸で、最後に水で洗浄し、その後乾燥し、ろ過し、溶媒を蒸発させてアミド(0.65g，85%)を得た。m.p．129-132℃（分解）測定値C, 52.18; H,4.66; N，8.24．Br，15.91 C₂₂H₂₂N₃O₅Br.H₂O計算値C，52.18;H,4.7 7; N,8.30; Br，15.78% ｈ．5-[6-(N-フェナントリジニウム)ヘキサノイル]アミノ-2,9−ビス（メトキシカルボニル）−1,10−フェナントロリンブロミド(11) フェナントリジン(0.52g，2.9mmol)を、その融点まで窒素下で120 ℃に加熱し、次にその融解物に臭化物(10)(0.525g，1.04mmol)を10分以上かけて少しずつ添加した。混合物を120 ℃で90分間加熱し、冷却し、クロロホルム(8ml)中に固体生成物を溶解した。溶液にエーテル(15ml)を加え、黄色沈殿物を生成し、その沈殿物をろ過で集め、塩(11)(0.677g，95%)を得た。生成物を水から再結晶し、一水和物の淡黄色針晶を得た。m.p．160℃（分解）測定値C，61.45; H，4.66; N， 8.23．C₃₅H₃₁N₄O₅Br.H₂O 計算値C，61.32; H,4.85; N,8.17% ｉ．5-[6-(N-フェナントリジニウム)ヘキサノイル]アミノ-1,10-フェナントロリン-2,9−ジカルボン酸ブロミド(3) ジメチルエステル(11)(0.10g，0.15mmol)を蒸留水(7ml)に加え、希ＨＢｒでpH を４に調整し、混合物を還流加熱し、そこへ固形物をゆっくり溶解し黄色溶液を生成した。20時間後溶液をろ過し、微量の固形物を除去し、次に凍結乾燥して必要なm.p．>180 ℃（分解）の酸(50mg，52%)を得た。この物質は、エステル(11) を再形成するＨＢｒ触媒条件下でのメタノールとの再エステル化により特徴付けられた。挿入体の調製(12) ｊ．4-(ニトロフェニル)-2,9-ジメチル−1,10−フェナントロリン(13) 98% 硫酸中(4ml)の4-フェニル-2,9−ジメチル−1,10−フェナントロリン(0.5g ,1.75mmol)を氷塩浴中で10℃以下に冷却し、温度を15℃以下に保った98 %硫酸(1 ml)及び65% 硝酸(1ml)の混合物を滴下添加した。添加後、混合物を20分にわたって周囲温度まで暖め、砕氷上に注ぎ、7N水酸化ナトリウムでpH７に中和し、ベージュ色の沈殿物を生成した。沈殿物をクロロホルム(3×25ml)中に抽出し、ブライン(25ml)で洗浄し、乾燥し、ろ過し及び蒸発させてオルト−、メタ−及びパラ −ニトロフェニル異性体の混合物(0.58g，100%)として生成物を得た。ｋ．4-(ニトロフェニル)-2,9-ビス(トリクロロメチル)-1,10−フェナントロリン (14) ニトロ化合物(13)(0.5g，1.6mmol)をクロロホルム(5ml)中に溶解し、次に四塩化炭素(30ml)で希釈した。溶液にN-クロロスクシンイミド(1.54g，11.5mmol)と触媒量の3-クロロ過安息香酸を添加した。この混合物を一晩加熱還流し、冷却し、固形物をクロロホルムで洗浄しながらろ過した。ろ液を5 ％w/v 炭酸ナトリウム溶液(3×30 ml)、0.1Mチオ硫酸ナトリウム溶液(50ml)、ブライン(50ml)で洗浄し、次に乾燥及びろ過した。溶媒を除去して黄色固形物を残し、これを4:6 ジクロロメタン−軽石油エーテルを溶出液として用いてシリカゲルでクロマトグラフィーにかけた。主要フラクションからビス（トリクロロメチル）誘導体(14)(0.8 1g，91%)m.p．>180℃（分解）を得た。ｌ．4-(ニトロフェニル)-2,9-ビス(メトキシカルボニル)-1,10−フェナントロリン(15) ヘキサクロライド(14)(1.00g，1.86mmol)を98 %硫酸(2.5ml)中に溶解し、窒素下で2 時間９０℃に加熱した。次に混合物を氷塩浴中で冷却し、メタノール(6ml )中で注意して急冷した。溶液を45分間加熱還流し、冷却し砕氷で急冷した。混合物を7N水酸化ナトリウム溶液で中和し、黄白色沈殿物を集め、乾燥し、メタノール／クロロホルムから再結晶し、ニトロジメチルエステルを一水和物として得た(0.60g，77%)。ｍ．4-(アミノフェニル)-2,9-ビス(メトキシカルボニル)-1,10−フェナントロリン(16) ニトロジエステル(15)(0.25g，0.6mmol)をメタノール(50ml)及びシクロヘキセン(5ml)中にスラリー化し、10% Pd/C(50mg)を添加した。混合物を窒素下で16時間加熱還流し、冷却しCeliteでろ過した。固形物を温クロロホルム(30ml)で洗浄し、合わせたろ過液を少容量に減らして赤色固形物を得た。生成物をクロロホルム中の2 ％v/v メタノールを溶出液として用いたシリカゲルを通したクロマトグラフィーにより精製した。生成物を一水和物として得た(90mg，35%)。ｎ．アクリジンとアミンの結合(16) 乾燥クロロホルム(2ml)中のアミン(16)(39mg，0．1mmol)を9-クロロアクリジン(50mg，2.35mmol)と共に5 時間加熱還流した。ジエチルエーテル(25ml)を加え、オレンジ色結晶状固形物として目的のエステル(17)(40mg,65%)を沈殿させた。ｏ．エステル(17)の加水分解エステル(17)(25mg)を蒸留水中、5 時間加熱還流した。溶液を冷却して結晶状固形物を得、これを集め、乾燥して目的挿入剤の酸(12)(20mg)を得た。挿入体(18)の調製ｐ．４−(4−ブロモブトキシ)-2,9-ジメチル−1,10−フェナントロリン(20) 4-ヒドロキシ−2,9-ジメチル−1,10−フェナントロリン(19)(2.0g，5.9mmol) を、1,4-ジブロモブタン(10g)及び炭酸カリウム(2.0g)の存在下、還流中のアセトニトリル(50ml)中で加熱した。10時間後に溶液をろ過し、溶媒を除去し、残留物をクロロホルム−ジエチルエーテルと粉砕して表題化合物(20)を固形物(2.5g) として得た。これをさらに精製することなく使用した。ｑ．4-(4−ブロモブトキシ)-2,9-ビス(トリクロロメチル)-1,10−フェナントロリン(21) 還流中の四塩化炭素(30ml)中で、エーテル(20)(0.4g,1.11mmol)にN-クロロスクシンイミド(98mg，7.33mmol)及び触媒量の3-クロロ過安息香酸を添加した。12 時間還流させた後、溶液を冷却し、ろ過し、溶媒をろ過液から蒸発し、淡黄色残留物を残し、これを1:1 ベンゼン：アセトンを溶出液として使用してシリカゲルを通してクロマトグラフィーにかけ、表題化合物(0.50g，70%)を得た。m.p．>15 0 ℃（分解）測定値C，37.74; H，2.32; N，4.95. C₁₈H₁₃N₂Cl₆BrO計算値C, 38.20; H,2.32; N,4.95% ｒ．4-(4−ブロモブトキシ)-1,10−フェナントロリン−2,9-ジカルボン酸(22) ヘキサクロライド(21)(0.4g，0.7mmol)を、酢酸水溶液(1:4)(50ml)中、加熱還流させた。酢酸ナトリウムの部分(3×350mg,無水)を30分間隔で添加し、合計で12時間加熱し続けた。溶液をろ過し、大量の溶媒を減圧下で蒸発により除去して微粉末を残し、これをテトラヒドロフラン水溶液から再結晶化して酸(80mg，2 7%)を得た。m.p．>180 ℃（分解）測定値C，49.31; H,3.68; N，6.93. C₁₈H₁₇N₂O₅Br.H₂O計算値C，49.45; H,3.92; N,6.91%. ｓ．4-[4-(N-フェナントリジニウム)ブチルオキシ]-1,10−フェナントロリン-2, 9−ジカルボン酸ブロミド(18) 小さいスパチュラで攪拌しながら、酸(22)(50mg，0.11mmol)を窒素下、フェナントリジン(150mg)中で、その融点で加熱した。20分後混合物を室温に冷却し、ジエチルエーテルで粉砕し、明褐色の固形物(40mg)を得た。固形物は水にほんの少しだけ溶ける。分子イオンは質量スペクトルでは観測できなかった。実施例１アッセイ方法：プローブ(2)のユーロピウム(III)複合体の試料(100μl，1.75 ×10^-5 M)を、標的物質(A)（200μl，2.6×10^-5 M）及びDenhardt's溶液(100μl)に添加し、容量をバッファー溶液(0.01MM Tween 20，1M NaCl，0.1M HEPES)で全体で1mになるようにした。溶液を42℃で3 時間加熱してハイブリダイズさせ、室温に冷却した。溶液に増感体(1ml，バッファー中1 ×10^-5M)を添加し、室温で1 時間保持し、前記バッファーで連続的に希釈し(448倍まで)、290nm で照射し、615nm 付近の領域で遅延放射を測定することにより発光の測定を行った。図２は56倍希釈(濃度：標的，4.46×10^-8M,プローブ: 1.56×10^-8M，増感体: 8.9 ×10^-8M)でアッセイした溶液の出力を示す。参照用の溶液は、同じ濃度のプローブポリヌクレオチド及び挿入体から成っていたが、無関係の標的(B)が存在していた。実施例２上記のアッセイ方法の別の試験として、プローブ3284（GAGATCAACGAGCAAGAATT TCTT）及び3 つの異なる標的、すなわちマッチ3288(GCTAAAGAAATTCTTGCTCGTTGAT CTCCACT),ミスマッチ2638（GATCATTCATGACATTTTAAAAATTACAGG）及び一つの塩基対が異なった3287（GCTAAAGAAATTCTTGCTCGTTGACCTCCACT）を用いた。前と同様の標識化、精製及びハイブリダイゼーションの手順を続けて行った。結果を以下に示す。３つのオリゴヌクレオチド、すなわち3288（マッチ）、3287（一塩基対ミスマッチ）及び2638（ミスマッチ）間で明らかな差異が認められる。マッチ及びミスマッチオリゴヌクレオチド間で差異があるだけでなく、一塩基対が異なるオリゴヌクレオチドがマッチオリゴヌクレオチドより小さい値を示した。これは異なる希釈物でも起こった。4 ×10^-9M に近い濃度で、三標的間に顕著な差異が認められる。この差異は、希釈により一層大きくなる。実施例３ＰＣＲ生成物を用いたアッセイ方法：ユーロピウム標識したプローブ3284(GAGATCAACGAGCAAGAATTTCTT)の合成は、前に概説した通りである。G551D-ユーロピウム（突然変異体特異的）オリゴヌクレオチドプローブを試験するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物が必要であった。１）突然変異体配列のみ、エクソン 11 ホモ接合体２）突然変異体及び正常配列、エクソン 11 ヘテロ接合体３）正常配列、エクソン 11 野性型４）無関係な正常配列、エクソン 10 野性型ゲノムＤＮＡのエクソン11及びエクソン10領域を増幅するＰＣＲプライマーを合成した。ＰＣＲ生成物の反応反応混合物エクソン 11 H₂O 2240 μl 10X ARMS バッファー 400 μl 1mM dNTP's 400 μl 50 μM 3108プライマー 80 μl 50 μM 3109プライマー 80 μl アリコート： 60×40μl 試験管番号： 1,2,3(各20本) エクソン 10反応混合物 H₂O 700 μl 10X ARMS バッファー 125 μl 1mM dNTP's 125 μl 50 μM 2090プライマー 25 μl 50 μM 2091プライマー 25 μl アリコート： 20×40μl 試験管番号： 4(20本)ＤＮＡ希釈物前記反応のための鋳型は、前に増幅した生成物である。ＰＣＲ生成物を希釈して、それぞれの新たな反応に約10,000のコピーを加えるようにする。エクソン 11 生成物：エクソン 10 生成物：ＰＣＲ生成物の電気泳動次の各ＤＮＡ試料のアリコートを電気泳動した。 1．10μl 貯蔵した生成物 2． 5μl 貯蔵した生成物 3． 2μl 貯蔵した生成物 4．10μl 1:10貯蔵した生成物 5． 5μl 1:10貯蔵した生成物 6． 2μl 1:10貯蔵した生成物 7．10μl 濃縮した生成物 8． 5μl 濃縮した生成物 9． 2μl 濃縮した生成物 10．10μl 1:10濃縮した生成物 11．5μl 1:10濃縮した生成物 12． 2μl 1:10濃縮した生成物ＰＣＲ生成物バンド強度をox174/Hae III 分子量標準のバンド強度と比較することにより、濃縮生成物のＤＮＡ濃度を次のように試算した。 GD/GD 15ng-μl ^-1 100μl 中 150nM 溶液 0.66 μl =１×10^-9M GD/+ 10ng-μl ^-1 100μl 中 100nM 溶液 1.00 μl =１×10^-9M +/+(Ex11) 8ng-μl ^-1 100μl 中 80nM 溶液 1.25 μl =１×10^-9M +/+(Ex10) 5ng-μl ^-1 100μl 中 35nM 溶液 2.86 μl =１×10^-9M 生成物を次のように希釈した：原液 10¹⁰ 分子/ μl 1．10 μl 生成物 + 990μl H₂O = 10⁸ 分子/ μl 2．10 μl (1.) + 990μl H₂O = 10⁶ 分子/ μl 3．10 μl (2.) + 990μl H₂O = 10⁴ 分子/ μl 4．100μl (3.) + 990μl H₂O = 10³ 分子/ μl対応するＤＮＡの 5μl を各反応混合物に添加した GD/GD 2.4×10⁴ 分子 GD/+ 2.1×10⁴ 分子 +/+(Ex11) 1.8×10⁴ 分子 +/+(Ex10) 1.3×10⁴ 分子ＰＣＲ生成物濃縮、精製及び洗浄増幅後、ＰＣＲ生成物をそれぞれに応じて貯蔵し、貯蔵した生成物の20μl をゲル分析のために取っておいた。残りの生成物をマイクロコン濾過膜に通した。 400 μl 貯蔵生成物をマイクロコンに添加 - 5000rpm 10分間 400 μl 貯蔵生成物をマイクロコンに添加 - 5000rpm 10分間 500 μl H₂O をマイクロコンに添加 - 5000rpm 5分間 500 μl H₂O をマイクロコンに添加 - 5000rpm 5分間 180 μlのH₂Oを添加することによりＤＮＡを膜から溶離し、3500rpm で3 分間遠心分離した。濃縮生成物の20μl をゲル分析のために保持した。結果 -VE GD/GD EX10++ GC/+ EX11++ INt 7.1 38.5 21.1 35 18.5 （同一プローブ3284を使用）実施例４本発明のランタニド強化信号発生システムを使用する別の例は、オリゴヌクレオチドプローブ3922(GAGGTCAACGAGCAAGAATTTCTTGC)とオリゴヌクレオチド標的38 60(GCTAAAGAAATTCTTGCTCGTTGACCTCCACT)及び3288(GCTAAAGAAATTCTTGCTCGTTGATCT CCACT)とのハイブリダイゼーションにより得た。標的3860は、G551D 突然変異により影響を受けないCFTR遺伝子のエキソン11より得た正常ＤＮＡ配列を含む。標的3288は、G551D 突然変異を含むCFTRエキソン11配列を含む。プローブ3922の5' の24塩基は、標的3860に含まれた配列に相補的である。プローブ3922の5'末端の 24塩基の23は、標的3288に相補的であるが、5'-4位のグアノシン残基はその標的中のチミジン残基にミスマッチである。標識化、精製及びハイブリダイゼーションの方法は、上述の通りである。ハイブリダイゼーション反応は、プローブ、標的及び挿入体の等モル比、および２× １０^-7M の濃度で行った。陰性対照ハイブリダイゼーションは標的オリゴヌクレオチドを含まなかった。得られた結果を図3-5 に示す。溶液を3.1 ×10^-9M(すなわち64倍)に希釈し、図6 に示されたように新しい記録を得た。データは、標的3860及び3288間のプローブ3922による明らかな区別を示す。5' 末端でその標的に完全にマッチする場合(3860)に、ミスマッチである場合(3288) よりさらに大きなハイブリダイゼーション信号がプローブ3922により発生する。標的3860と3288間の相違点は、64倍希釈液中で一層顕著になり、標的の無い対照からのバックグラウンド信号は、この希釈物では検出できなかった。プローブ3922の別の設計上の特徴は、その3'末端および終わりから二番目の塩基が、標的3860及び3288の両方にミスマッチであるということに注意しなければならない。これらのミスマッチをプローブ3922に導入してそのプローブの末端を不安定にし、PCR 中の増幅又は他の遺伝子の増幅システムに抵抗性を有するようにした。そのためプローブをPCR プライマー自体として提供することなくCFTR遺伝子のエキソン11を増幅するように設計されたPCR 反応にプローブ3922が含まれてもよい。あるいはブロッキング基又はジデオキシヌクレオチドをそのようなプローブの3'末端に含ませ、PCR の間にTaq ポリメラーゼによる延長を防止してもよい。上記の出願書類で引用した化学式は次の通りである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．試料中の核酸分析対象物を検出する方法であって、試料を(i)分析対象物に相補的であり、金属エネルギー移動システムに対する配位子の第一パートナーが結合している結合体、(ii)ランタニドイオン、及び(iii)デュプレックス結合剤が結合している前記システムの第二パートナーと接触させ、分析対象物と結合体とが相補的結合して核酸デュプレックスを形成する際に、デュプレックス結合剤とデュプレックスとの相互作用が起こり、前記システムの第一及び第二パートナーにランタニドイオンの周辺に閉鎖したキレートシステムを形成させ、照射後にランタニドイオンからの光の放射が試料中の分析対象物の存在を示す前記方法。２．金属エネルギー移動システムに対する配位子の第一パートナーが複合増感体であり、第二パートナーがキレート化剤であるかまたはその逆である請求項１に記載の方法。３．結合体が、第一及び第二パートナーが結合しているポリヌクレオチドである請求項１に記載の方法。４．結合体が、ブロックされた末端ヌクレオチドを含む請求項３に記載の方法。５．結合体が、相補的な分析対象物核酸配列に対抗する一又はそれ以上のミスマッチ塩基を含む請求項１〜４のいずれかに記載の方法。６．一又はそれ以上のミスマッチ塩基の位置が、デュプレックス結合、従ってランタニドイオン周辺の閉鎖したキレートシステムの形成が調整されるように選択された請求項５に記載の方法。７．ランタニドイオンがユウロピウムイオンである請求項１〜６のいずれかに記載の方法。８．複合増感体が芳香族基を含む請求項１〜７のいずれかに記載の方法。９．複合増感体がヘテロ環式芳香族基を含む請求項１〜８のいずれかに記載の方法。 10．複合増感体が場合により置換されたジピリジル又はフェナントロリン基を含む請求項１〜９のいずれかに記載の方法。 11．複合増感体が場合により置換されたフェナントロリン−2,6-ジカルボン酸基を含む請求項１〜10のいずれかに記載の方法。 12．キレート化剤が、アッセイ媒体への添加前にランタニドイオンとキレート化される請求項１〜11のいずれかに記載の方法。 13．結合体が、キレート化したランタニドイオンが結合したポリヌクレオチドである請求項１〜12のいずれかに記載の方法。 14．金属エネルギー移動システムに対する配位子の一つのパートナーがデュプレックス結合剤に結合した複合増感体である請求項１〜13のいずれかに記載の方法。 15．結合体が対立遺伝子特異ポリヌクレオチドである請求項１〜14のいずれかに記載の方法。 16．核酸分析対象物を得るための標的配列の増幅を含む請求項１〜15のいずれかに記載の方法。 17．請求項１〜16のいずれかに記載の一又はそれ以上のアッセイ成分が、標的配列の増幅中に存在する請求項16に記載の方法。 18．結合体が二又はそれ以上のポリヌクレオチド配列を含む請求項１〜17のいずれかに記載の方法。 19．金属エネルギー移動システムに対する配位子の第一及び第二パートナーが異なったポリヌクレオチド配列に結合している請求項18に記載の方法。 20．キレート化剤を使用し、これがカルボン酸、アミド及び／又はエーテル部分を含む多官能化合物である請求項１〜19のいずれかに記載の方法。 21．キレート化剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）及びトランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＤＣＴＡ）の任意の一つの誘導体である請求項20に記載の方法。 22．フォルスターエネルギー移動受容体を使用し、ランタニドイオン周辺の閉鎖したキレートシステムからエネルギーを受け、光を放射する請求項１〜21のいずれかに記載の方法。 23．フォルスターエネルギー移動受容体を、本発明の方法で使用されるポリヌクレオチドに結合する請求項22に記載の方法。 24．試料中の一以上の核酸分析対象物を検出するための請求項１〜23のいずれかに記載の方法。 25．光放射の特性を測定し、核酸分析対象物の性質及び／又は量を示す請求項１〜24のいずれかに記載の方法。 26．均質アッセイである請求項１〜25のいずれかに記載の方法。 27． (i)分析対象物に相補的で、金属エネルギー移動システムに対する配位子の第一パートナーが結合した結合体、(ii)ランタニドイオン、及び(iii)デュプレックス結合剤が結合している前記システムの第二パートナーを含み、さらに以下のもの；バッファー、増幅プライマー及びキットの使用説明書の一又はそれ以上を含むアッセイキット。 28．結合体、ランタニドイオン、金属エネルギー移動システムに対する配位子の第一及び第二パートナー、及びデュプレックス結合剤が請求項１〜27のいずれかに記載のものであるアッセイキット。 29．増幅プライマーが対立遺伝子特異増幅のためのものである請求項27に記載のアッセイキット。 30．増感体に結合したデュプレックス結合剤を含む化合物。 31．キレート化剤に結合したデュプレックス結合剤を含む化合物。 32．エネルギー移動受容体に結合したデュプレックス結合剤を含む化合物。 33．デュプレックス結合剤が該当する種に共有結合している請求項30〜32のいずれかに記載の化合物。 34．フェナントリジン基に結合したフェナントロリン-2,6−ジカルボン酸基を含む請求項30に記載の化合物。 35．上記に記載した構造式３の請求項34に記載の化合物。