KR100442568B1

KR100442568B1 - Ｐｃｒ 반응후 유전자 증폭여부 확인방법

Info

Publication number: KR100442568B1
Application number: KR10-2001-0016171A
Authority: KR
Inventors: 이기세; 김경주; 장덕진; 이동훈; 이규호; 조장천
Original assignee: 이기세; 이동훈
Priority date: 2001-03-28
Filing date: 2001-03-28
Publication date: 2004-07-30
Also published as: KR20020076381A

Abstract

본 발명은 PCR 반응후 PCR 반응액에 1,10-페난트롤린 철(II)을 첨가하여 PCR 반응액의 색변화만을 살핌으로써 PCR 반응의 결과 유전자가 증폭되었는지의 여부를 신속하게 확인하고 증폭된 유전자의 농도를 확인함으로써 PCR 미반응 용액의 붉은색이 DNA가 증폭된 용액의 색과 육안으로 구분할 수 있기 때문에 전기영동시간을 생략하고도 그 병원균이 존재하는지를 바로 판단할 수 있으며 1~2분의 흡광도 검사만으로 상대적인 DNA양을 산출할 수 있어서 PCR반응이 필요한 실험에 소요되는 시간과 노력을 최소화 할 수 있고 PCR결과를 쉽게 확인할 수 있어 비전문가도 그 결과를 이용할 수 있다는 뛰어난 효과가 있다.

Description

ＰＣＲ 반응후 유전자 증폭여부 확인방법{following the polymerase chain reaction, method of detection of amplification polymerase chain reaction product}

본 발명은 PCR 반응후 유전자 증폭여부 확인방법에 관한 것이다. 보다 자세하게는 본 발명은 PCR 반응후 PCR 반응액에 특정화합물을 첨가하여 PCR 반응액의 색변화만을 살핌으로써 PCR 반응의 결과 유전자가 증폭되었는지의 여부를 신속하게확인하고 증폭된 유전자의 농도를 확인할 수 있는 방법에 관한 것이다.

효소중합연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)은 유전자를 이용한 연구, 실험 및 미생물 검출 등을 수행하기 위하여 적은 양의 유전자 시료로부터 유전자복제효소(DNA polymerase)를 이용하여 DNA를 많은 양으로 증폭시키는 방법이다.

상기 효소중합연쇄반응(PCR)을 수행한 후에 유전자가 증폭되었는지를 확인하기 위해서 일반적으로 젤 전기영동(gel electrophoresis)후 자외선을 투시하는 방법을 이용하고 있다. 이 방법으로 PCR 반응 후 유전자가 증폭되었는지를 확인하기 위해서는 PCR로 유전자를 증폭시킨 후 증폭된 유전자가 포함되어 있는 PCR 반응물을 젤에 일정량을 투입한 다음 전기영동을 하고, 전기영동으로 이동한 유전자가 들어있는 젤을 에티디엄 브로마이드(ethidium bromide)염료로 염색하면 상기 염료가 더블 스트랜드(double stranded)유전자에 결합하게 되고 이것을 자외선 투시기를 통하여 육안으로 보거나 사진을 찍어 확인하여야 하므로 종래의 젤 전기영동방법을 사용하는 경우에는 전기영동을 위하여 여러시간이 소요되고 파워 서플라이(power supply), 전기영동장치 영동 젤 등 전기영동에 여러 장치와 재료들이 필요하며, 유전자를 염색하기 위해 발암물질인 에티디엄 브로마이드를 사용해야 한다는 문제점이 있다.

또한, 전기영동 방법은 한 종류 이상의 유전자가 섞여 있거나 증폭된 유전자의 크기를 확인할 필요없이 단순히 PCR이 일어났느냐 여부와 증폭된 유전자 양이 얼마인가 만을 판단하기 위해서는 시간과 비용이 불필요하게 많이 드는 방법이라는 문제점이 있다.

예를 들면 물시료, 식품류 등과 같은 특정시료에 특정 병원균이 존재하는지 여부만을 확인하고 싶은 경우에는 보통 그 병원균의 유전자 일부를 프라이머(primer)로 사용하여 PCR을 수행하여 유전자의 증폭여부로 병원균의 존재를 확인하는데 이와 같은 판단에 있어서는 많은 시간이 소요되고 많은 장치가 필요한 전기영동방법을 수행할 필요가 없이 단지 유전자가 증폭되었는지만 확인하면 되므로 별도의 장치 없이도 빠른시간에 PCR 반응의 결과를 확인할 수 있는 방법이 필요하게 되었다.

이에 본 발명의 목적은 PCR 반응 후 유전자 증폭여부를 확인하는 간단하고 신속하게 확인하는 방법을 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적은 PCR 반응 후 유전자 증폭여부를 색 변화로 확인하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 상기 목적은 효소중합연쇄반응(PCR) 후 반응에 사용한 시험관에 직접 1,10-페난트롤린 철(II)을 가하고 섞어서 생기는 색변화를 통하여 PCR 결과 DNA가 증폭되었는지 여부와 증폭된 농도를 판단하게 함으로써 달성하였다.

이하 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.

도 1은Giardia lamblia유전자를 PCR로 증폭한 후 종래의 젤 전기영동방법으로 전기영동한 사진이고,

도 2는Giardia lamblia유전자를 PCR로 증폭한 후 1,10-페난트롤린 철(II)을 첨가한 결과를 나타낸 사진이고,

도 3은Giardia lamblia유전자를 PCR로 증폭한 후 1,10-페난트롤린 철(II)을 첨가한 후 510nm에서 흡광도를 측정한 결과에 대한 그래프이다.

본 발명은 효소중합연쇄반응(PCR)수행단계; PCR 반응액에 1,10-페난트롤린 철(II) (ferrous 1,10-phenanthrolin)을 첨가하는 단계; PCR 반응액의 색변화를 확인하는 단계로 구성된다.

본 발명의 PCR 반응 수행단계에서는 온도순환 PCR장치 이외에 증폭되는 DNA, 두 개의 프라이머(primer), 고온에서 견딜 수 있는 DNA 중합효소(polymerase)와 PCR buffer및 dNTP(dATP, dTTP, dTTP, dGTP)가 사용된다.

본 발명에서는 DNA를 증폭하기 위해서 상기 온도순환 PCR 장치(독일 Eppendorf 사 Mastercycler 제품)를 사용하여 90~97℃의 온도에서 2분동안 denaturation하고 50~53℃온도에서 1분동안 annealing하고 70~73℃의 온도에서 2분 동안 extention 하여 30~40회 정도 반복하며, 그 결과 시료에 존재하던 DNA의 두 primer 사이 부분이 초기 양의 최대 2³⁵배 정도 증폭된다. PCR 반응이 끝나면 5℃에서 5분간 냉각시킴으로써 PCR 반응을 중단시킨다.

상기와 같이 PCR 반응을 수행하는 경우에 도 1에 도시된 바와 같이 사용되는 DNA양이 증가함에 따라서 증폭되어지는 DNA양도 증가하게 된다. 도 1은Giardia lamblia유전자를 PCR로 증폭한 후 종래의 젤 전기영동방법으로 전기영동한 사진으로 PCR 반응이 끝난후 냉각시켜 PCR 반응을 중단시킨 다음 반응액 중 일부를 미리 준비한 전기영동용 agarose gel에 5 ㎕를 loading 하고 30 volt로 2시간 이동시킨다. DNA가 들어있는 gel을 에티디엄 브로마이드로 염색시킨 후 자외선 형광램프로 투과하면서 사진을 찍은 것이다. 사진상의 1, 2, 3, 4번은Giardia lambliaDNA 용액을 각각 1 ㎕, 1.5 ㎕, 2 ㎕, 4㎕ 씩 PCR 반응액에 넣고 PCR을 수행했을 때 얻어진 결과이다. 즉, PCR반응결과 증폭되어 얻어진 DNA양이 대략적으로 1 : 1.5 : 2 :4로 증가하고 있고 사진상의 S는 gel 상에 얻어진 DNA의 대략적 크기(bp)를 보기 위하여 이미 크기를 알고 있는 여러 DNA 조각들의 혼합물을 대조구로 동시에 전기영동한 것이다.

본 발명에서는Giardia lamblia의 16S ribosomal RNA를 전사하는 DNA 중 두 부분 5'-CATCCGGTCGATCCTGCC-3’과 5'-AGTCGAACCCTGATTCTCCGCCAG G-3’primer로 사용하였으며 이 Primer DNA는 Artman Bioscience(한국)에서 주문 합성한 것이다. 두 primer 사이의 길이는 약 300bp로서 PCR을 수행하면 두 primer 사이의 300bp 부분이 계속 복제 증폭된다. 또한, DNA 중합효소는 Taq DNA polymerase를 사용하였다. PCR buffer는 PCR반응에 사용되는 DNA 중합효소의 특성에 따라 그 조성이 결정되는 것으로 본 발명에서는 10mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 0.01% 젤라틴으로 조성하여 사용하였다. 이들 시약은 모두 미국 Promega사 제품을 사용하였다.

본 발명의 PCR 반응액에 1,10-페난트롤린 철(II)을 첨가하는 단계에서는 1,10-페난트롤린 철(II)이 사용되는데 이는 세 분자의 1,10-페난트롤린(1,10-phenanthrolin; o-phenanthrolin라고도 함) 분자에 수 개의 2가 철 이온이 착 화합물로 이루고 있고 철이온 결합상태에서는 빨간색을 띠며 철이온이 없을 때에는 무색을 띄는 것으로 그 구조는 하기의 화학식1과 같다.

상기 1,10-페난트롤린 철(II)은 1,10-페난트롤린 용액에 용해성이 좋은 2가 철 화합물을 섞어 용이하게 제조할 수 있다.

유전자 중합효소에 의해 PCR 반응이 일어날 때, 증폭 DNA를 구성하도록 넣어주는 dNTP(deoxynucleotide triphosphate; dATP, dTTP, dGTP, dCTP)는 세개의 인산기 중 인산기가 하나만 붙어 있는 dNMP(deoxiribose monophosphate)만 증폭되는 DNA 사슬에 결합되므로 dNTP 한 분자가 반응할 때마다 두 개의 인산기가 붙은 피로인산 한분자가 생성되게 된다. 따라서, PCR 반응물에 1,10-페난트롤린 철(II)을 첨가할 경우에 PCR에 의해 DNA가 증폭되었다면 이에 비례하여 피로인산이 반응액 중에 축적되고 이 피로인산은 다음의 반응식1과 같은 반응이 일어나서 1,10-페난트롤린과 경쟁적으로 철 이온에 대해 착화합물을 형성할 수 있다.

즉, 피로인산의 농도가 높아지면 1,10-페난트롤린 철(II)로부터 철 이온을 빼앗아 피로인산-철(II) 착화합물을 형성하면서 1,10-페난트롤린 철(II)의 붉은색을 잃게 만든다.

〈PCR〉

(DNA)N-1 + dNTP → (DNA)N + PPi

PPi + phenanthrolin-Fe → PPi-Fe + phenanthrolin

(붉은색) (무색)

결과적으로 PCR 반응물에 1,10-페난트롤린 철(II)을 첨가했을 때 DNA가 증폭되지 않았으면 빨간색이 유지되며 증폭되었으면 빨간색이 흐려지며, 이 때 흐려지는 정도는 증폭된 양에 비례하고 증폭된 DNA 양이 충분히 크면 무색이 된다.

위와 같은 색변화는 수용액은 물론 일반적인 PCR 반응용액에서도 쉽게 일어나며, 10℃~90℃ 의 온도범위에서 모두 가능하며, 특히 온도가 높아질수록 색 변화가 보다 빠르게 일어난다.

본 발명의 PCR 반응액의 색변화를 확인하는 단계에서 1,10-phenanthroline Fe(II) 용액 1㎕을 첨가한 PCR반응액을 10~90℃에서 30초 내지 10분간 방치한 다음 색을 관찰한다. 증폭되어 얻어진 DNA양이 많을수록 1,10-phenanthroline Fe(II)의 붉은색이 약해지고 DNA양이 적을 수록 붉은색이 강하게 남아 있게 되고 이러한 색의 차이는 육안으로도 확인할 수 있다. 도 2에 도시되어 있는 바와 같이, 증폭된 DNA양을 1X, 1.5X, 2X, 4X로 증가할 경우 Giardia lamblia가 존재하지 않는 미반응은 붉은색이 그대로 남아 있으며, PCR로 DNA가 증폭된 경우는 붉은색이 흐려지고 거의 무색에 가까워 진다.

이러한 색변화를 정량화하기 위해서 도3에서 도시되어 있는 바와 같이 510nm에서흡광도를 측정하면 붉은색의 강도에 따라 흡광도의 값이 커지며 반대로 붉은색이 약하면 낮은 흡광도 값을 나타내게 되고, 증폭된 DNA양을 1X, 1.5X, 2X, 4X로 증가할 경우 붉은색 에 대한 흡광도가 0.45. 0.32. 0.28, 0.13으로 대략 선형적으로 낮아진다.

Giardia lamblia가 없는 물시료 5 ㎕를 이용하여 PCR반응을 수행하고, 이 PCR 반응액 20㎕에 2 mM의 1,10-phenanthroline Fe(II) 용액 1 ㎕을 첨가하고 70℃에서 10분간 방치하여도 생성된 DNA가 없기 때문에 첨가해준 1,10-phenanthrolin Fe(II)의 붉은색이 강하게 남아 있고 510 nm의 흡광도가 0.55 정도로 높게 나타났다 (도2와 도3의 미반응시료 참조).

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 효소중합연쇄반응(PCR)수행

Giardia lamblia가 들어 있는 물시료를 액체질소를 이용하여 freezing-thawing(냉동-해동)을 4, 5차례 반복하여 세포벽을 분해하여Giardia lamblia의 DNA를 체외로 유출되게 한 후, 상기Giardia lambliaDNA 용액을 각각 1 ㎕, 1.5 ㎕, 2 ㎕, 4㎕에Giardia lamblia가 다른 미생물과 구별되게 특이적으로 갖고 있는 DNA 서열에 대해 상보적으로 결합할 수 있는 합성 DNA조각 한 쌍을 primer로 2.5 pmol씩 첨가하였다. 상기 primer는Giardia lamblia의 16S ribosomal RNA를 전사하는 DNA중 두 부분 5'-CATCCGGTCGATCCTGCC-3’과 5'-AGTCGAACCCTGATTCTCCGCCAG G-3’이며 두 primer 사이의 길이는 약 300bp이다. 여기에 PCR buffer (10mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 0.01% gelatin)를 넣고 중합효소 Taq DNA polymerase 2 unit은 dNTP(dATP, dTTP, dTTP, dGTP)를 각각 200 μmol을 가하여 최종 25㎕가 되게 혼합하였다. 상기 혼합물을 온도순환 PCR 장치(독일 Eppendorf사 Mastercycler 제품)를 이용하여 95℃에서 2분 denaturation, 52℃에서 1분 annealing, 72℃에서 2분 extension시키고 이를 35회 반복한 다음, 반응이 끝나면 5℃에서 5분간 냉각시킴으로써 PCR 반응을 중단시켰다.

실시예 2: PCR 반응액에 1,10-페난트롤린 철(II) (ferrous 1,10-phenanthrolin)을 첨가

Giardia lambliaDNA 용액을 각각 1 ㎕, 1.5 ㎕, 2 ㎕, 4㎕ 씩 PCR 반응액에 넣고 상기 실시예 1의 방법으로 PCR을 수행한 다음, 각각 20㎕에 2mM의 1,10-phenanthroline Fe(II)용액 1㎕을 첨가하고 70℃에서 10분간 방치하였다.

실시예 3: PCR 반응액의 색변화를 확인

상기 실시예 2의 방법으로 1,10-phenanthroline Fe(II) 용액 1㎕을 첨가한 PCR반응액의 색을 육안으로 관찰하면 증폭되어 얻어진 DNA양이 많을수록 1,10-phenanthroline Fe(II)의 붉은색이 약해지고 DNA양이 적을수록 붉은색이 강하게 남으며 이는 도 2에 도시되어 있는 바와 같다. 증폭된 DNA양을 1X, 1.5X, 2X, 4X로 증가할 경우 PCR로 DNA가 증폭된 경우는 붉은색이 흐려지고 거의 무색에 가까워 진다. 이러한 색변화를 정량화하기 위해서 510nm에서 흡광도를 측정한 결과는 도 3에 도시된 바와 같다. 증폭된 DNA양을 1X, 1.5X, 2X, 4X로 증가할 경우 붉은색에 대한 흡광도가 0.45. 0.32. 0.28, 0.13으로 대략 선형적으로 낮아진다.

비교실시예1 : 생성된 DNA가 없는 경우의 색변화 확인

Giardia lamblia가 없는 물시료 5 ㎕를 이용하여 상기 실시예1과 같이 PCR반응을 수행하고, 이 PCR 반응액 20㎕에 상기 실시예2와 같이 2 mM의 1,10-phenanthroline Fe(II) 용액 1 ㎕을 첨가하고 70℃에서 10분간 방치하여도 생성된 DNA가 없기 때문에 첨가해준 1,10-phenanthrolin Fe(II)의 붉은색이 강하게 남아 있고 510 nm의 흡광도가 0.55 정도로 높게 나타났다 (도 2와 도 3의 미반응시료 참조).

상기에서 설명한 바와 같이, 본원발명의 방법과 같이 효소중합연쇄반응(PCR) 후 반응에 사용한 시험관에 직접 1,10-페난트롤린 철(II)을 가하여 이로인한 색변화를 확인하는 방법으로 PCR 결과 DNA가 증폭되었는지 여부를 확인하면 PCR 미반응 용액의 붉은색이 DNA가 증폭된 용액의 색과 육안으로 구분할 수 있기 때문에 전기영동시간을 생략하고도 그 병원균이 존재하는지를 바로 판단할 수 있으며 1~2분의 흡광도 검사만으로 상대적인 DNA양을 산출할 수 있어서 PCR반응이 필요한 실험에 소요되는 시간과 노력을 최소화 할 수 있고 PCR결과를 쉽게 확인할 수 있어 비전문가도 그 결과를 이용할 수 있다는 뛰어난 효과가 있으므로 유전공학의 연구와 이를 이용한 생물의약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

효소중합연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; PCR 반응액에 2mM의 1,10-페난트롤린 철(Ⅱ) 용액을 상기 PCR 반응액의 1/20㎕ 만큼 첨가하는 단계; 및 상기 1,10-페난트롤린 철(Ⅱ) 용액을 첨가한 PCR 반응액을 10~90℃에서 30초 내지 10분간 방치한 다음 그 붉은색이 흐려지는 정도를 육안으로 확인하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 PCR 반응후 유전자 증폭여부 확인방법.
제1항 있어서, 상기 PCR 반응액의 색변화 확인은 흡광도를 이용하여 확인하는 것을 특징으로 하는 PCR 반응후 유전자 증폭여부 확인방법.
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