CN114606329A - 沙门氏菌的可视化检测试剂盒 - Google Patents

沙门氏菌的可视化检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN114606329A
CN114606329A CN202210418809.0A CN202210418809A CN114606329A CN 114606329 A CN114606329 A CN 114606329A CN 202210418809 A CN202210418809 A CN 202210418809A CN 114606329 A CN114606329 A CN 114606329A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
detection
tube
sample
salmonella
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210418809.0A
Other languages
English (en)
Inventor
徐颖
王岩
闫吉辉
陈晓光
刘海江
张瑾
梁洁
侯伟
张娟
徐翮
滕新栋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao International Travel Health Care Center Qingdao Customs Port Outpatient Department
Original Assignee
Qingdao International Travel Health Care Center Qingdao Customs Port Outpatient Department
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qingdao International Travel Health Care Center Qingdao Customs Port Outpatient Department filed Critical Qingdao International Travel Health Care Center Qingdao Customs Port Outpatient Department
Priority to CN202210418809.0A priority Critical patent/CN114606329A/zh
Publication of CN114606329A publication Critical patent/CN114606329A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供沙门氏菌的可视化检测试剂盒，包括：标准结果对照品、阳性标准品、阴性标准品、核酸提取管、核酸检测管、检测液I、检测液II、检测液III；本发明在核酸提取过程和核酸扩增过程不需要昂贵的仪器设备，检测特异性强，灵敏度是PCR检测10‑100倍，结果判读简单，成本低廉，现场环境或者基层都可以满足条件并开展检测，适合推广使用。

Description

沙门氏菌的可视化检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种腹泻性病原菌的提取检测试剂盒，特别是涉及一种沙门氏菌的检测试剂盒。
背景技术
现行的国家标准GB4789，其方法是先对样本增菌，然后用平板法进行多次筛选及生化试验鉴别，传统细菌检测法分析时间通常需要2～3d，操作繁琐成本高且周期很长，限制了在基层实验室和现场的应用。
目前对沙门氏菌的分子生物学的检测方法有很多种，检测沙门氏菌的常用方法包括传统的PCR检测、荧光PCR、LAMP法检测、微流控传感器检测法等。这些方法使用较广泛，PCR法虽然缩短检测周期，特异性、敏感性都很好，但样本预处理时间长，易被污染，容易出现假阴性、假阳性结果；而且检测周期依然在120min左右，更需要依赖昂贵的仪器设备。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明根据沙门氏菌的invA基因保守序列，设计RPA检测方法，结合可视化的核酸染色液，建立可视化检测方法，并检测其特异性和敏感性，本研究建立的方法综合一步核酸提取试剂，满足快速检测沙门氏菌，不需要复杂的仪器设备且操作简单、灵敏度高，可以在基层实验室或现场环境等使用，适合推广。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供沙门氏菌的可视化检测试剂盒包括：标准结果对照品、阳性标准品、阴性标准品、核酸提取管、核酸检测管、检测液I、检测液II、检测液III；所述核酸提取管为包含100μL-500μL的核酸提取试剂的无菌EP管；所述标准结果对照品为可密封的PCR 8联排管中，其中5管装有不同颜色液体；所述阳性标准品为含有沙门氏菌标准菌株基因组DNA的溶液，其中的DNA浓度为10-2ng/μL-100ng/μL，优选1ng/μL；所述阴性标准品为不含有核酸的无菌去离子水；所述核酸检测管为包含RPA通用反应试剂冻干制剂的带盖PCR反应管；所述检测液I为含有沙门氏菌检测上游引物F2和沙门氏菌检测下游引物R2的RPA通用反应检测液，所述检测液I中含有沙门氏菌检测上游引物F2浓度为0.28μM-0.85μM；所述沙门氏菌检测下游引物R2浓度为0.28μM-0.85μM；所述检测液II为醋酸镁的溶液；其中醋酸镁浓度为280mM；所述检测液III为浓度在100×-10000×之间的SYBRGreen I溶液。
优选地，所述标准结果对照品获取方法为：按照本发明检测待测样本中的沙门氏菌的步骤检测沙门氏菌基因组DNA浓度为10-3ng/μL、10-4ng/μL、10-5ng/μL的三个样本以及阴性标准品、阳性标准品，检测完成后得到5个带颜色的核酸检测管，参照上述核酸检测管结果颜色，用橙色和绿色染料配制5份颜色与之对应一致的染色液，依次按顺序将5份配制的染色液加入可密封的PCR 8联排管的5个管中，盖上8联排盖子，在盖子或8联排管的外侧依次标注为10-3ng/μL、10-4ng/μL、10-5ng/μL、0、+，整体作为标准结果对照品；所述标准结果对照品中的液体容量为50μL-200μL，优选为50μL；所述5个带颜色的核酸检测管结果颜色依次分别为绿色、黄绿色、浅黄绿色、橙红色、绿色；所述本发明检测待测样本中的沙门氏菌的步骤为：(1)待测样本核酸提取；(2)配制本发明的待测样本的检测体系：33.5μL检测液I加入到核酸检测管；加入12μL待测核酸；2.5μL检测液II加入到核酸检测管；将2μL的检测液III滴加在核酸检测管的盖子内侧上；(3)盖上核酸检测管盖子，将核酸检测管放置35℃-45℃中反应5min-25min；(4)结果检测：将核酸检测管上下颠倒，充分混匀核酸检测管中液体；核酸检测管在室温放置1min-5min；每次检测反应均同步检测阳性标准品、阴性标准品各一份；(5)结果判读：首先检测阳性标准品的核酸检测管，比对标准结果对照品，与标准结果对照品中标注为“+”的管的颜色一致为绿色，且检测阴性标准品的核酸检测管比对标准结果对照品，与标准结果对照品中标注为“0”的管的颜色一致为橙红色，判断本次检测结果可信，否则结果不可信，需要重新检测；检测待测样本的核酸检测管比对标准结果对照品，颜色为橙红色且与标注为“0”的管的颜色一致，判断为阴性；检测待测样本的核酸检测管颜色为绿色且与标准结果对照品中标注为“+”的管的颜色相近，判断为阳性，同时判断待测核酸浓度大于10-3ng/μL；检测待测样本的核酸检测管颜色与标注为“10-4ng/μL”的管的颜色相近，判断为待测核酸浓度接近10-4ng/μL；检测待测样本的核酸检测管颜色与标准结果对照品中标注为“10-5ng/μL”的管的颜色相近判断待测核酸浓度接近10-5ng/μL；所述步骤(1)待测样本核酸提取的具体操作为：1)待测样本为液体时每份样本取100μL-500μL，待测样本为胶状或膏状或半固体状或固体时，每份待测样本取100mg-500mg，充分剪碎；2)所述待测样本加入核酸提取管，充分混匀；3)核酸提取管放置90℃-100℃孵育5min-25min；4)将核酸提取管12000g离心，1min-5min，保留上清液，上清液即为提取得到的待测核酸。
优选地，所述本发明的待测样本核酸提取步骤的1)中，优选的，所述待测样本的取样量与核酸提取管内的核酸提取试剂的用量相同；更优选的，所述核酸提取管中装有200μL的核酸提取试剂；更优选的，所述待测样本为液体时每份样本取200μL，待测样本为胶状或膏状或半固体状或固体时，每份待测样本取200mg。
优选地，所述待测样本核酸提取步骤3)中，更优选的，100℃孵育10min；待测样本核酸提取步骤4)中，更优选的，12000g离心3min。
优选地，所述本发明检测待测样本中的沙门氏菌的步骤(3)中更优选的温度为35℃；其中，优选的反应时间为5min-20min。
优选地，所述本发明检测待测样本中的沙门氏菌的步骤(3)更优选的反应时间为10min。
优选地，所述阳性标准品获取方法：按照通用细菌基因组DNA提取试剂盒操作提取沙门氏菌标准菌株基因组DNA，从细菌样本中获得DNA，溶于TE溶液或无菌去离子水中，检测核酸浓度后，用TE溶液或无菌去离子水稀释沙门氏菌标准菌株基因组DNA浓度为10-2ng/μL-100ng/μL，更优选的稀释沙门氏菌标准菌株基因组DNA浓度为1ng/μL。
优选地，所述核酸提取管中核酸提取试剂为：0.5mol/LNaOH、2％浓度的Chelex-100、0.05mol/L的TrisHCl，三者以1:1:1的体积比例配制。
优选地，所述沙门氏菌检测上游引物F1序列为:5'-CGTACCGTTGATATTACTTGTGCCGAAGAG-3'(SEQ ID NO1)，所述沙门氏菌检测下游引物序列R1为:5'-CTGCTACCTTGCTGATGGATTGTTGGATTA-3'(SEQ ID NO 2)。
优选地，所述待测样本的检测体系优选为50μL的体系，体系为：12μL提取待测样本后得到的待测核酸、33.5μL检测液I、2.5μL检测液II、2μL的检测液III；共50μL，所述检测液I为含有0.7μM的沙门氏菌检测上游引物F2和0.7μM的沙门氏菌检测下游引物R2的RPA通用反应检测液，检测液III为含有1000×的SYBR Green I溶液。
如上所述，本发明的沙门氏菌的可视化检测试剂盒，具有以下有益效果：
(1)核酸提取过程和核酸扩增过程对仪器要求低，一个水浴锅和一台离心机即可能够满足条件；(2)能特异性的检测沙门氏菌，且与其他腹泻病原体无交叉反应；(3)沙门氏菌检测下限可以达到10-5ng/μL，是PCR方法的10-100倍；(4)核酸提取效率高，不会受到腹泻时的粪便污染(5)本发明核酸提取简单、检测步骤少、判读方法简单，对操作员的要求低；(6)本发明检测样本中的沙门氏菌，从核酸提取到结果判读在最好效率的情况下，最快能在20min内完成，满足敏感性和特异性的同时比其他方法快速很大；(7)结果判读简单，肉眼直接判读，且室温时间放置越长，显色效果越好，对于核酸浓度很低的样本，可以适当增加反应时间和室温放置时间，如果出现颜色变化，可以判断为阳性，不会因为核酸浓度太低而不出现反应，被误判成阴性。
附图说明
图1显示为本发明方法用不同扩增引物检测沙门氏菌的电泳结果，其中M为Marker，1-5：1-3号引物扩增产物。
图2显示为本发明方法用不同扩增温度检测沙门氏菌的电泳结果，其中M：Marker，1-5：4℃、15℃、25℃、35℃、45℃。
图3显示为本发明方法用不同扩增时间检测沙门氏菌的电泳结果，其中M：Marker，1-5：5min、10min、15min、20min、25min
图4显示为本发明方法用RPA扩增检测不同菌株的电泳结果，其中M：Marker，1-6：志贺氏菌、EHEC O157:H7、沙门氏菌、副溶血弧菌、粪肠球菌、菌株混合液
图5显示为本发明方法用RPA扩增检测不同浓度沙门氏菌核酸的电泳结果，其中M：Marker，1-8：100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、10-1ng/μL、10-2ng/μL、10-3ng/μL、10-4ng/μL、10- 5ng/μL
图6显示为用不同浓度核酸检测PCR扩增敏感性的电泳结果，其中M：Marker，1-8：100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、10-1ng/μL、10-2ng/μL、10-3ng/μL、10-4ng/μL、10-5ng/μL
图7显示为本发明方法用不同浓度SYBR Green I检测沙门氏菌的检测结果，其中N：阴性对照，1-5：1.25μL SYBR Green I(100×)、0.5μL SYBR Green I(1000×)、1μL SYBRGreen I(1000×)、2μL SYBR Green I(1000×)、4μL SYBR Green I(1000×)。
图8显示为本发明方法检测不同菌株的检测结果，其中N：阴性对照，1-6：志贺氏菌、EHEC O157:H7、沙门氏菌、副溶血弧菌、粪肠球菌、菌株混合液
图9显示为本发明方法检测不同浓度沙门氏菌核酸的检测结果，其中N：阴性对照，1-8：10-5ng/μL、10-4ng/μL、10-3ng/μL、10-2ng/μL、10-1ng/μL、1ng/μL、10ng/μL、100ng/μL。
图10为本发明方法检测沙门氏菌样本的检测流程示意图
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供沙门氏菌的可视化检测试剂盒，包括：标准结果对照品、阳性标准品、阴性标准品、核酸提取管、核酸检测管、检测液I、检测液II、检测液III；
具体的，所述核酸提取管为包含100μL-500μL的核酸提取试剂的无菌EP管；v
具体的，所述标准结果对照品为装有5个不同颜色液体管的可密封的PCR 8联排管；
具体的，所述标准结果对照品为可密封的PCR 8联排管中，其中5管装有不同颜色液体；
具体的，所述阳性标准品为含有沙门氏菌标准菌株基因组DNA的溶液，其中的DNA浓度为10-2ng/μL-100ng/μL，优选1ng/μL；
具体的，所述阴性标准品为不含有核酸的无菌去离子水；
具体的，所述核酸检测管为包含RPA通用反应试剂冻干制剂的带盖PCR反应管；
具体的，所述检测液I为含有沙门氏菌检测上游引物F2和沙门氏菌检测下游引物R2的RPA通用反应检测液，所述检测液I中含有沙门氏菌检测上游引物F2浓度为0.28μM-0.85μM；所述沙门氏菌检测下游引物R2浓度为0.28μM-0.85μM；
具体的，所述检测液II为醋酸镁的溶液；其中醋酸镁浓度为280mM；
具体的，所述检测液III为浓度在100×-10000×之间的SYBR Green I溶液；
具体的，所述SYBR Green I溶液为核酸染料，不影响反应体系中酶的活性、扩增反应和显色过程；
具体的，所述标准结果对照品获取方法为：按照本发明检测待测样本中的沙门氏菌的步骤检测沙门氏菌基因组DNA浓度为10-3ng/μL、10-4ng/μL、10-5ng/μL的三个样本以及阴性标准品、阳性标准品，检测完成后得到5个带颜色的核酸检测管，参照上述核酸检测管结果颜色，用橙色和绿色染料配制5份颜色与之对应一致的染色液，依次按顺序将5份配制的染色液加入可密封的PCR 8联排管的5个管中，盖上8联排盖子，在盖子或8联排管的外侧依次标注为10-3ng/μL、10-4ng/μL、10-5ng/μL、0、+，整体作为标准结果对照品；所述标准结果对照品中的液体容量为50μL-200μL，优选为50μL；
具体的，所述5个带颜色的核酸检测管结果颜色依次分别为绿色、黄绿色、浅黄绿色、橙红色、绿色；
具体的，所述本发明检测待测样本中的沙门氏菌的步骤为：(1)待测样本核酸提取；(2)配制本发明的待测样本的检测体系：33.5μL检测液I加入到核酸检测管；加入12μL待测核酸；2.5μL检测液II加入到核酸检测管；将2μL的检测液III滴加在核酸检测管的盖子内侧上；(3)盖上核酸检测管盖子，将核酸检测管放置35℃-45℃中反应5min-25min；(4)结果检测：将核酸检测管上下颠倒，充分混匀核酸检测管中液体；核酸检测管在室温放置1min-5min；每次检测反应均同步检测阳性标准品、阴性标准品各一份；(5)结果判读：首先检测阳性标准品的核酸检测管，比对标准结果对照品，与标准结果对照品中标注为“+”的管的颜色一致为绿色，且检测阴性标准品的核酸检测管比对标准结果对照品，与标准结果对照品中标注为“0”的管的颜色一致为橙红色，判断本次检测结果可信，否则结果不可信，需要重新检测；检测待测样本的核酸检测管比对标准结果对照品，颜色为橙红色且与标注为“0”的管的颜色一致，判断为阴性；检测待测样本的核酸检测管颜色为绿色且与标准结果对照品中标注为“+”的管的颜色相近，判断为阳性，同时判断待测样本中提取得到的待测核酸浓度大于10-3ng/μL；检测待测样本的核酸检测管颜色且与标准结果对照品中标注为“10-4ng/μL”的管的颜色相近判断待测核酸浓度接近10-4ng/μL；检测待测样本的核酸检测管颜色为与标准结果对照品中标注为“10-5ng/μL”的管的颜色相近判断待测核酸浓度接近10-5ng/μL；
具体的，核酸检测管在检测待测样本中的沙门氏菌的步骤(4)室温放置过程中，因为本发明RPA的扩增反应仍然在继续，检测过程依然进行，随着室温放置的时间延长，阳性的检测结果显现出的绿色会越明显；阴性的检测结果不会随着时间延长而变化；
具体的，所述步骤(1)待测样本核酸提取的具体操作为：1)待测样本为液体时每份样本取100μL-500μL，待测样本为胶状或膏状或半固体状或固体时，每份待测样本取100mg-500mg，充分剪碎；2)所述待测样本加入核酸提取管，充分混匀；3)核酸提取管放置90℃-100℃孵育5min-25min；4)将核酸提取管12000g离心，1min-5min，保留上清液，上清液即为提取得到的待测核酸。
具体的，所述本发明的待测样本核酸提取步骤的1)中，优选的，所述待测样本的取样量与核酸提取管内的核酸提取试剂的用量相同；更优选的，所述核酸提取管中装有200μL的核酸提取试剂；更优选的，所述待测样本为液体时每份样本取200μL，待测样本为胶状或膏状或半固体状或固体时，每份待测样本取200mg。
具体的，所述所述待测样本核酸提取步骤3)中，更优选的，100℃孵育10min；待测样本核酸提取步骤4)中，更优选的，12000g离心3min。
具体的，所述所述本发明检测待测样本中的沙门氏菌的步骤(3)中更优选的温度为35℃；其中，优选的反应时间为5min-20min。
具体的，更优选的反应时间为10min。
具体的，所述阳性标准品获取方法：按照通用细菌基因组DNA提取试剂盒操作提取沙门氏菌标准菌株基因组DNA，从细菌样本中获得DNA，溶于TE溶液或无菌去离子水中，检测核酸浓度后，用TE溶液或无菌去离子水稀释沙门氏菌标准菌株基因组DNA浓度为10-2ng/μL-100ng/μL，更优选的稀释沙门氏菌标准菌株基因组DNA浓度为1ng/μL。
具体的，所述核酸提取管中核酸提取试剂为：0.5mol/L NaOH、2％浓度的Chelex-100、0.05mol/L的TrisHCl，三者以1:1:1的体积比例配制。
具体的，所述沙门氏菌检测上游引物F1序列为:5'-CGTACCGTTGATATTACTTGTGCCGAAGAG-3'(SEQ ID NO 1)，所述沙门氏菌检测下游引物序列R1为:5'-CTGCTACCTTGCTGATGGATTGTTGGATTA-3'(SEQ ID NO 2)。
具体的，所述待测样本的检测体系优选为50μL的体系，体系为：12μL提取待测样本后得到的待测核酸、33.5μL检测液I、2.5μL检测液II、2μL的检测液III；共50μL，所述检测液I为含有0.7μM的沙门氏菌检测上游引物F2和0.7μM的沙门氏菌检测下游引物R2的RPA通用反应检测液，检测液III为含有1000×的SYBR Green I溶液。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例一
请参阅图1，本发明筛选对沙门氏菌特异性高、灵敏性强的扩增引物
从NCBI数据库中检索到沙门氏菌的invA基因序列，通过比对数据库中已有序列，选择相对保守区域，利用Primer Premier 5.0软件，参照TwistDx公司说明书上的引物设计原则设计引物，通过在NCBI数据库中blast比对，选出3对可扩增出invA基因序列的引物(表1)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。
核酸提取管：配制0.5mol/LNaOH，配制2％浓度的Chelex-100，配制0.05mol/L的TrisHCl，以1:1:1的体积比例将上述3种溶液进行混合，充分混匀，配制成为核酸提取试剂；在无菌EP管中加入上述核酸提取试剂200μL，作为沙门氏菌的核酸提取管。
核酸制备：以标准沙门氏菌菌液为待测样本，取菌液200μL，加入核酸提取管，充分混匀，100℃孵育5min，离心12000g，3min，保留上清液，上清液即为提取得到的沙门氏菌基因组DNA。将沙门氏菌基因组DNA进行稀释，调整核酸浓度为100ng/μL，即为待测核酸。
检测液II：280mM的醋酸镁。
配制RPA扩增反应体系50μL一共3份：30.5μLRPA通用反应检测液加入到核酸检测管；分别加入10μM上游引物2.5μL，加入10μM下游引物2.5μL；加入12μL待测核酸；2.5μL检测液II加入到核酸检测管。
RPA扩增反应：37℃下反应扩增40min；
结果检测：制备2％浓度的琼脂糖凝胶，取5μL扩增产物进行检测，3V/cm恒压电泳20min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。
以标准沙门氏菌菌液为待测样本，对设计的5对引物进行扩增的电泳结果见图1，所设计引物的扩增条带与目的条带大小一致，且扩增条带单一、清晰、无弥散、无拖尾。结果说明这几对引物扩增效率高，可以被准确检测到。根据RPA引物扩增要求，同时为后续设计引物探针实验继续进行，选择第1对引物对EQ ID NO 1、SEQ ID NO 2作为本发明的特异性引物，扩增产物长度为285bp。
表1沙门氏菌的RPA扩增引物
Figure BDA0003606031040000081
实施例二
请参阅图2-3，本发明方法RPA扩增反应的建立及优化
1.优化RPA扩增最佳反应温度
以标准沙门氏菌菌液为待测样本，取菌液200μl加入含有200μl核酸提取试剂的核酸提取管，充分混匀，100℃孵育5min，离心12000g，3min，保留上清液，上清液即为提取得到的沙门氏菌基因组DNA。将沙门氏菌基因组DNA进行稀释，调整核酸浓度为100ng/μL，即为待测核酸。
配制检测液I：首先在沙门氏菌检测上游引物F1(SEQ ID NO 1)粉末中加入适量RPA通用反应检测液，配制成带有0.7μM的上游引物的RPA通用反应检测液，再取适量的上述溶液溶解沙门氏菌检测下游引物R1(SEQ ID NO 2)粉末，最终配制成含有0.7μM的沙门氏菌检测上游引物F2和0.7μM的沙门氏菌检测下游引物R2的RPA通用反应检测液，即为本发明中的检测液I，分装后备用。
配制RPA检测体系50μL一共5份：35.5μL检测液I加入到核酸检测管；加入12μL待测核酸；2.5μL检测液II加入到核酸检测管。
RPA扩增反应：分别在4℃、15℃、25℃、35℃、45℃下各放置一份核酸检测管，反应扩增20min；
结果检测：制备2％浓度的琼脂糖凝胶，取5μL扩增产物进行检测，3V/cm恒压电泳20min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。
以沙门氏菌标准菌株的基因组DNA为模板，RPA反应管分别在4℃、15℃、25℃、35℃、45℃下扩增的结果见图2，检测结果显示，在扩增温度为5℃时出现微弱的目的扩增条带，随着温度升高目的条带逐渐明亮，但是在4℃、15℃、25℃时目的条带比较暗淡，在35℃时目的条带最清晰明亮，在45℃下条带又有些变暗，说明温度在5℃-45℃范围内，本方法可以检测沙门氏菌，但是在35℃-45℃可以达到比较理想的扩增效果，在35℃时扩增效率最高。
2.RPA扩增最短有效反应时间
核酸制备：以标准沙门氏菌菌液为待测样本，取菌液200μl加入含有200μl核酸提取试剂的核酸提取管，充分混匀，100℃孵育5min，离心12000g，1min-5min，保留上清液，上清液即为提取得到的沙门氏菌基因组DNA。将沙门氏菌基因组DNA进行稀释，调整核酸浓度为100ng/μL，即为待测核酸。
配制RPA检测体系50μL一共5份：35.5μL检测液I加入到核酸检测管；加入12μL待测核酸；2.5μL检测液II加入到核酸检测管。
RPA扩增反应：将5份核酸检测管放置在35℃下，分别扩增5min、10min、15min、20min、25min。
结果检测：制备2％浓度的琼脂糖凝胶，取5μL扩增产物进行检测，3V/cm恒压电泳20min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。
结果：在35℃下分别扩增5min、10min、15min、20min、25min的检测结果见图3，在5min时可以检测到明显的目的条带，且随着反应时间的延长，RPA扩增的效果越好，也就是说需要扩增5min以上本发明方法可以看到明显的扩增条带，随着时间的延长可以达到更为理想的检测结果。
实施例三
请参阅图4，检测本发明方法RPA反应的特异性
核酸制备：准备志贺氏菌标准菌株溶液、EHEC O157:H7标准菌株溶液、沙门氏菌标准菌株溶液、副溶血弧菌标准菌株溶液、粪肠球菌标准菌株溶液、五种标准菌株按照体积1：1：1：1：1比例混合的菌液。以上6种菌液分别为待测样本，各自取菌液200μl加入含有200μl核酸提取试剂的核酸提取管，充分混匀，100℃孵育5min，离心12000g，3min，保留上清液，上清液即为提取得到的基因组DNA。将6种基因组DNA进行稀释，调整核酸浓度为100ng/μL，即为待测核酸。
配制RPA检测体系50μL一共6份：35.5μL检测液I加入到核酸检测管；分别加入12μL待测核酸；2.5μL检测液II加入到核酸检测管。
RPA扩增反应：将6份核酸检测管放置在35℃下，扩增5min。
结果检测：制备2％浓度的琼脂糖凝胶，取5μL扩增产物进行检测，3V/cm恒压电泳20min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。
结果：分别以志贺氏菌标准菌株、EHEC O157:H7标准菌株、沙门氏菌标准菌株、副溶血弧菌标准菌株、粪肠球菌标准菌株、菌株混合液的基因组DNA为模板，RPA反应扩增结果见图4，除了沙门氏菌和混合菌液扩增出目的片段，其他菌株未见扩增，说明RPA检测方法的特异性好，不会被其他肠道致病菌干扰。
实施例四
请参阅图5-6，检测本发明方法RPA反应的灵敏性
核酸制备：以标准沙门氏菌菌液为待测样本，取菌液200μl加入含有200μl核酸提取试剂的核酸提取管，充分混匀，100℃孵育5min，离心12000g，3min，保留上清液，上清液即为提取得到的核酸。将沙门氏菌基因组DNA进行稀释，调整核酸浓度为100ng/μL，再将沙门氏菌基因组DNA进行10倍的倍比稀释，最终获得基因组DNA浓度分别为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、10-1ng/μL、10-2ng/μL、10-3ng/μL、10-4ng/μL、10-5ng/μL，即为待测核酸。
配制RPA检测体系50μL一共8份：35.5μL检测液I加入到核酸检测管；加入12μL待测核酸；2.5μL检测液II加入到核酸检测管。
RPA扩增反应：将8份核酸检测管放置在35℃下，扩增20min。
PCR扩增反应：参照已有文献《多重PCR技术同时检测四种肠道致病菌方法的建立与初步应用》记载的PCR方法检测沙门氏菌的灵敏性的检测，PCR反应检测引物为：Sal-F：5’-GCCGGTAAACTACACGATGA-3’，Sal-R：5’-GAGTTACTGAACCAACAGCT-3’，目标扩增产物长度为526bp。
结果检测：制备2％浓度的琼脂糖凝胶，取5μL扩增产物进行检测，3V/cm恒压电泳20min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。
结果：以浓度为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、10-1ng/μL、10-2ng/μL、10-3ng/μL、10- 4ng/μL、10-5ng/μL的沙门氏菌基因组DNA为模板，进行RPA扩增结果见图5，结果表明RPA检测沙门氏菌的核酸浓度为10-5ng/μL时，扩增条带清晰可见；PCR检测结果见图6，结果表明PCR检测的核酸最低检测限为10-2ng/μL，随着核酸浓度的升高，目的条带逐渐变亮。由于RPA方法DNA使用量接近PCR法的10倍，因此本发明建立的PRA的检测方法的灵敏度至少是标准PCR方法的100倍。
实施例五
请参阅图7，本发明方法RPA反应可视化检测方法的建立及优化
核酸制备：以标准沙门氏菌菌液为待测样本，取菌液200μl加入含有200μl核酸提取试剂的核酸提取管，充分混匀，100℃孵育5min，离心12000g，3min，保留上清液，上清液即为提取得到的沙门氏菌基因组DNA。将沙门氏菌基因组DNA进行稀释，调整核酸浓度为1ng/μL，即为待测核酸。
配制本发明的部分检测体系48μL一共5份：33.5μL检测液I加入到核酸检测管；加入12μL待测核酸；2.5μL检测液II加入到核酸检测管。
配制本发明检测体系：在上述48μL的本发明的检测体系的基础上，分别将1.25μLSYBR Green I(100×)、0.5μL SYBR Green I(1000×)、1μL SYBR Green I(1000×)、2μLSYBR Green I(1000×)、4μL SYBR Green I(1000×)滴加在5份核酸检测管的盖子内侧上。
阴性对照核酸检测管1份：35.5μL检测液I、2.5μL检测液II、12μL阴性标准品、2μLSYBR Green I(1000×)加入到核酸检测管。
RPA扩增反应：将6份核酸检测管放置在35℃下，扩增10min。
结果检测：RPA扩增反应结束后，上下颠倒核酸检测管，充分混匀后室温放置1min，观察结果。
结果：在扩增10min后的本发明的检测体系中加入不同浓度的SYBR Green I，进行可视化检测结果见图7，结果表明阴性对照的核酸检测管为橙红色，其他的5份核酸检测管观察发现50μL的检测体系中加入超过1μL的SYBR Green I(1000×)，核酸检测管的颜色即从橙红色变向绿色，2μL的SYBR Green I(1000×)变色就非常明显。
实施例六
请参阅图8，检测本发明方法的特异性
核酸制备：准备志贺氏菌标准菌株溶液、EHEC O157:H7标准菌株溶液、沙门氏菌标准菌株溶液、副溶血弧菌标准菌株溶液、粪肠球菌标准菌株溶液、五种标准菌株按照体积1：1：1：1：1比例混合的菌液。以上6种菌液分别为待测样本，各自取菌液200μl加入含有200μl核酸提取试剂的核酸提取管，充分混匀，100℃孵育5min，离心12000g，3min，保留上清液，上清液即为提取得到的基因组DNA。将6种基因组DNA进行稀释，调整核酸浓度为1ng/μL，即为待测核酸。
检测液III：含有1000×的SYBR Green I溶液。
配制本发明方法的检测体系50μL一共6份：33.5μL检测液I加入到核酸检测管；加入12μL待测核酸；2.5μL检测液II加入到核酸检测管。2μL的检测液III滴加到核酸检测管的盖子内侧上。
阴性对照核酸检测管1份：35.5μL检测液I、2.5μL检测液II、12μL阴性标准品、2μL检测液III加入到核酸检测管。
RPA扩增反应：将6份核酸检测管放置在35℃下，扩增10min。
结果检测：RPA扩增反应结束后，上下颠倒核酸检测管，充分混匀后室温放置5min，观察结果。
结果：分别以志贺氏菌标准菌株、EHEC O157:H7标准菌株、沙门氏菌标准菌株、副溶血弧菌标准菌株、粪肠球菌标准菌株、菌株混合液的基因组DNA为待测核酸模板，本发明方法的检测结果如图8，除了检测沙门氏菌和混合菌液的核酸检测管出现阳性结果反应，其他核酸检测管均为橙黄色的阴性结果，说明本发明方法检测的沙门氏菌特异性好，不会被其他肠道致病菌干扰。
实施例七
请参阅图9，检测本发明方法的灵敏性
核酸制备：以标准沙门氏菌菌液为待测样本，取菌液200μl加入含有200μl核酸提取试剂的核酸提取管，充分混匀，100℃孵育5min，离心12000g，1min-5min，保留上清液，上清液即为提取得到的核酸。将沙门氏菌基因组DNA进行稀释，调整核酸浓度为100ng/μL，再将沙门氏菌基因组DNA进行10倍的倍比稀释，最终获得基因组DNA浓度分别为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、10-1ng/μL、10-2ng/μL、10-3ng/μL、10-4ng/μL、10-5ng/μL，即为待测核酸。
配制本发明方法的检测体系50μL一共8份：33.5μL检测液I加入到核酸检测管；加入12μL待测核酸；2.5μL检测液II加入到核酸检测管。2μL的检测液III滴加到核酸检测管的盖子内侧上。
阴性对照核酸检测管1份：35.5μL检测液I、2.5μL检测液II、12μL阴性标准品、2μL检测液III加入到核酸检测管。
RPA扩增反应：将8份核酸检测管放置在35℃下，扩增10min。
结果检测：RPA扩增反应结束后，上下颠倒核酸检测管，充分混匀后室温放置5min，观察结果。
结果：以浓度为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、10-1ng/μL、10-2ng/μL、10-3ng/μL、10- 4ng/μL、10-5ng/μL的沙门氏菌基因组DNA为模板，本发明方法的检测结果见图9，结果表明，当沙门氏菌的DNA浓度为10-5ng/μL时，反应管与阴性对照相比依然有比较明显的变色反应，检测结果与实施例四的结果一致，本研究建立的可视化RPA检测沙门氏菌方法，灵敏性达到10-5ng/μL，至少是标准PCR方法灵敏性的100倍。
实施例八
请参阅图10，本发明检测样本中检测沙门氏菌的检测流程，检测本发明方法的重复性
核酸制备：以标准沙门氏菌菌液为待测样本，取菌液200μl加入含有200μl核酸提取试剂的核酸提取管，充分混匀，100℃孵育5min，离心12000g，3min，保留上清液，上清液即为提取得到的核酸。将沙门氏菌基因组DNA进行稀释，调整核酸浓度为100ng/μL，再将沙门氏菌基因组DNA进行稀释，最终获得基因组DNA浓度分别为20ng/μL、2×10-1ng/μL、2×10- 3ng/μL，即为3份待测核酸；稀释并获得基因组DNA浓度为1ng/μL的液体，即为阳性标准品。
配制本发明的检测体系50μL：33.5μL检测液I加入到核酸检测管；加入12μL待测核酸；2.5μL检测液II加入到核酸检测管。2μL的检测液III滴加到核酸检测管的盖子内侧上。
标准结果对照品：参照待测核酸浓度为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、10-1ng/μL、10-2ng/μL、10-3ng/μL、10-4ng/μL、10-5ng/μL时本发明方法核酸检测管的颜色，在待测核酸浓度大于10-3ng/μL时，核酸检测管颜色均呈现绿色，随着浓度升高也没有明显变化，因此根据待测核酸浓度为10-3ng/μL、10-4ng/μL、10-5ng/μL以及检测阴性标准品、阳性标准品时，本发明方法检测完毕后的核酸检测管的颜色，用水溶性染料首先用日落黄染料调配出半透明的橙红色液体，用荧光绿染料调配出半透明的绿色液体，再用橙红色液体和绿色液体配制出5份颜色与待测核酸浓度为10-3ng/μL、10-4ng/μL、10-5ng/μL以及检测阴性标准品、阳性标准品时，本发明方法检测完毕后的核酸检测管的颜色对应、一样且半透明的液体，颜色顺序为依次为绿色、黄绿色、浅黄绿色、橙红色、绿色，取上述5份液体200μL，依次按顺序加入可密封的PCR 8联排管的5个管中，盖上8联排盖子，在盖子或8联排管的外侧依次标注为10-3ng/μL、10-4ng/μL、10-5ng/μL、0、+；作为标准结果对照品颜色顺序显示见表2。
批间重复性检测：对3份待测核酸，在反应体系相同的条件下，连续3天重复检测，每次检测反应均同步检测阳性标准品、阴性标准品各一份；
批内重复性检测：对3份待测核酸，在同一反应体系中，同时进行3次重复测定，每次检测反应均同步检测阳性标准品、阴性标准品各一份；
RPA扩增反应：核酸检测管放置在35℃下，扩增10min。
结果检测：RPA扩增反应结束后，上下颠倒核酸检测管，充分混匀后室温放置5min，观察结果。
定量判读：核酸检测管，对比标准结果对照品，颜色相近则说明待测核酸的浓度相近，初步进行判读沙门氏菌核酸浓度。
结果：批间重复性结果显示见表3，结果表明相同浓度待测核酸的连续3天检测结果一致，批内重复性结果见表4，结果表明对相同浓度待测核酸，在同一反应体系中，同时进行3次重复检测结果一致。说明本方法的检测重复性好。
表2标准结果对照品颜色与浓度对照
Figure BDA0003606031040000141
表3批间重复性检测结果
Figure BDA0003606031040000142
表4批内重复性检测结果
Figure BDA0003606031040000143
实施例九
本发明方法检测实验室样本
核酸制备：实验室保存25份经参照标准《WS 271-2007感染性腹泻诊断标准》检测为阳性的样本，10份为治疗恢复后再次检测为阴性的样本，一共15份样本用本发明进行检测。取样本200μl加入核酸提取管，充分混匀，100℃孵育5min，离心12000g，3min，保留上清液，上清液即为提取得到的待测核酸。
配制本发明的检测体系50μL：33.5μL检测液I加入到核酸检测管；加入12μL待测核酸；2.5μL检测液II加入到核酸检测管。2μL的检测液III滴加到核酸检测管的盖子内侧上。
，每次检测反应均同步检测阳性标准品、阴性标准品各一份；
RPA扩增反应：核酸检测管放置在35℃下，扩增10min。
结果检测：RPA扩增反应结束后，上下颠倒核酸检测管，充分混匀后室温放置1min，观察结果。
定量判读：核酸检测管，对比标准结果对照品，颜色相近则说明待测核酸的浓度相近，初步进行判读沙门氏菌核酸浓度。
结果：检测实验室样本的结果见表4，结果表明15份阳性样本本发明方法检测也均为阳性，10份阴性样本本发明方法检测10份为阴性，本发明方法与标准方法检测结果一致。
表5标准方法与本发明方法检测结果的比较
Figure BDA0003606031040000151
Figure BDA0003606031040000161
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
序列表
<110> 青岛国际旅行卫生保健中心（青岛海关口岸门诊部）
<120> 沙门氏菌的可视化检测试剂盒
<130> 04142022
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 1
cgtaccgttg atattacttg tgccgaagag 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 2
ctgctacctt gctgatggat tgttggatta 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 3
agtaatggta tctgctgaag ttgaggatgt 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 4
aacattcact gacttgctat ctgctatctc 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 5
agatgtcatt aaccttgtgg agcatattcg 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 6
catcctcaac ttcagcagat accattactg 30

Claims (10)

1.沙门氏菌的可视化检测试剂盒，其特征在于，所述沙门氏菌的可视化检测试剂盒包括：标准结果对照品、阳性标准品、阴性标准品、核酸提取管、核酸检测管、检测液I、检测液II、检测液III；
所述核酸提取管为包含100μL-500μL的核酸提取试剂的无菌EP管；
所述标准结果对照品为可密封的PCR 8联排管中，其中5管装有不同颜色液体；
所述阳性标准品为含有沙门氏菌标准菌株基因组DNA的溶液，其中的DNA浓度为10-2ng/μL-100ng/μL，优选1ng/μL；
所述阴性标准品为不含有核酸的无菌去离子水；
所述核酸检测管为包含RPA通用反应试剂冻干制剂的带盖PCR反应管；
所述检测液I为含有沙门氏菌检测上游引物F2和沙门氏菌检测下游引物R2的RPA通用反应检测液，所述检测液I中含有沙门氏菌检测上游引物F2浓度为0.28μM-0.85μM；所述沙门氏菌检测下游引物R2浓度为0.28μM-0.85μM；
所述检测液II为醋酸镁的溶液；其中醋酸镁浓度为280mM；
所述检测液III为浓度在100×-10000×之间的SYBR Green I溶液。
2.根据权利要求1所述的沙门氏菌的可视化检测试剂盒，其特征在于：所述标准结果对照品获取方法为：按照本发明检测待测样本中的沙门氏菌的步骤检测沙门氏菌基因组DNA浓度为10-3ng/μL、10-4ng/μL、10-5ng/μL的三个样本以及阴性标准品、阳性标准品，检测完成后得到5个带颜色的核酸检测管，参照上述核酸检测管结果颜色，用橙色和绿色染料配制5份颜色与之对应一致的染色液，依次按顺序将5份配制的染色液加入可密封的PCR 8联排管的5个管中，盖上8联排盖子，在盖子或8联排管的外侧依次标注为10-3ng/μL、10-4ng/μL、10- 5ng/μL、0、+，整体作为标准结果对照品；所述标准结果对照品中的液体容量为50μL-200μL，优选为50μL；
所述5个带颜色的核酸检测管结果颜色依次分别为绿色、黄绿色、浅黄绿色、橙红色、绿色；
所述本发明检测待测样本中的沙门氏菌的步骤为：(1)待测样本核酸提取；(2)配制本发明的待测样本的检测体系：33.5μL检测液I加入到核酸检测管；加入12μL待测核酸；2.5μL检测液II加入到核酸检测管；将2μL的检测液III滴加在核酸检测管的盖子内侧上；(3)盖上核酸检测管盖子，将核酸检测管放置35℃-45℃中反应5min-25min；(4)结果检测：将核酸检测管上下颠倒，充分混匀核酸检测管中液体；核酸检测管在室温放置1min-5min；每次检测反应均同步检测阳性标准品、阴性标准品各一份；(5)结果判读：首先检测阳性标准品的核酸检测管，比对标准结果对照品，与标准结果对照品中标注为“+”的管的颜色一致为绿色，且检测阴性标准品的核酸检测管比对标准结果对照品，与标准结果对照品中标注为“0”的管的颜色一致为橙红色，判断本次检测结果可信，否则结果不可信，需要重新检测；检测待测样本的核酸检测管比对标准结果对照品，颜色与标注为“0”的管的颜色一致，判断为阴性；检测待测样本的核酸检测管颜色与标准结果对照品中标注为“+”的管的颜色相近，判断为阳性，同时判断待测核酸浓度大于10-3ng/μL；检测待测样本的核酸检测管颜色与标准结果对照品中标注为“10-4ng/μL”的管的颜色相近，判断待测核酸浓度接近10-4ng/μL；检测待测样本的核酸检测管颜色与标准结果对照品中标注为“10-5ng/μL”的管的颜色相近判断待测核酸浓度接近10-5ng/μL；
所述步骤(1)待测样本核酸提取的具体操作为：1)待测样本为液体时每份样本取100μL-500μL，待测样本为胶状或膏状或半固体状或固体时，每份待测样本取100mg-500mg，充分剪碎；2)所述待测样本加入核酸提取管，充分混匀；3)核酸提取管放置90℃-100℃孵育5min-25min；4)将核酸提取管12000g离心，1min-5min，保留上清液，上清液即为提取得到的待测核酸。
3.根据权利要求2所述的沙门氏菌的可视化检测试剂盒，其特征在于：本发明的待测样本核酸提取步骤的1)中，优选的，所述待测样本的取样量与核酸提取管内的核酸提取试剂的用量相同；更优选的，所述核酸提取管中装有200μL的核酸提取试剂；更优选的，所述待测样本为液体时每份样本取200μL，待测样本为胶状或膏状或半固体状或固体时，每份待测样本取200mg。
4.根据权利要求2所述的沙门氏菌的可视化检测试剂盒，其特征在于：待测样本核酸提取步骤3)中，更优选的，100℃孵育10min；待测样本核酸提取步骤4)中，更优选的，12000g离心3min。
5.根据权利要求2所述的沙门氏菌的可视化检测试剂盒，其特征在于：所述本发明检测待测样本中的沙门氏菌的步骤(3)中更优选的温度为35℃；其中，优选的反应时间为5min-20min。
6.根据权利要求2所述的沙门氏菌的可视化检测试剂盒，其特征在于：更优选的反应时间为10min。
7.根据权利要求1所述的沙门氏菌的可视化检测试剂盒，其特征在于：所述阳性标准品获取方法：按照通用细菌基因组DNA提取试剂盒操作提取沙门氏菌标准菌株基因组DNA，从细菌样本中获得DNA，溶于TE溶液或无菌去离子水中，检测核酸浓度后，用TE溶液或无菌去离子水稀释沙门氏菌标准菌株基因组DNA浓度为10-2ng/μL-100ng/μL，更优选的稀释沙门氏菌标准菌株基因组DNA浓度为1ng/μL。
8.根据权利要求1所述的沙门氏菌的可视化检测试剂盒，其特征在于：所述核酸提取管中核酸提取试剂为：0.5mol/L NaOH、2％浓度的Chelex-100、0.05mol/L的TrisHCl，三者以1:1:1的体积比例配制。
9.根据权利要求1所述的沙门氏菌的可视化检测试剂盒，其特征在于所述沙门氏菌检测上游引物F1序列为:5'-CGTACCGTTGATATTACTTGTGCCGAAGAG-3'(SEQ ID NO1)，所述沙门氏菌检测下游引物序列R1为:5'-CTGCTACCTTGCTGATGGATTGTTGGATTA-3'(SEQ ID NO 2)。
10.根据权利要求2所述的沙门氏菌的可视化检测试剂盒，其特征在于：所述待测样本的检测体系优选为50μL的体系，体系为：12μL提取待测样本后得到的待测核酸、33.5μL检测液I、2.5μL检测液II、2μL的检测液III；共50μL，所述检测液I为含有0.7μM的沙门氏菌检测上游引物F2和0.7μM的沙门氏菌检测下游引物R2的RPA通用反应检测液，检测液III为含有1000×的SYBR Green I溶液。
CN202210418809.0A 2022-04-20 2022-04-20 沙门氏菌的可视化检测试剂盒 Pending CN114606329A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210418809.0A CN114606329A (zh) 2022-04-20 2022-04-20 沙门氏菌的可视化检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210418809.0A CN114606329A (zh) 2022-04-20 2022-04-20 沙门氏菌的可视化检测试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114606329A true CN114606329A (zh) 2022-06-10

Family

ID=81869933

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210418809.0A Pending CN114606329A (zh) 2022-04-20 2022-04-20 沙门氏菌的可视化检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114606329A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20020076381A (ko) * 2001-03-28 2002-10-11 이기세 Ｐｃｒ 반응후 유전자 증폭여부 확인방법
CN103983642A (zh) * 2014-06-03 2014-08-13 三棵树涂料股份有限公司 基于硫化物比色检测金属铅离子的检测方法
CN106868152A (zh) * 2017-03-14 2017-06-20 宁波海洋研究院 一种食源性致病菌沙门氏菌的检测方法
CN110907446A (zh) * 2019-12-12 2020-03-24 湖北师范大学 一种谷胱甘肽的快速检测方法
CN113684321A (zh) * 2021-09-30 2021-11-23 华南农业大学 香蕉线条病毒ol rpa检测引物、检测试剂盒及应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20020076381A (ko) * 2001-03-28 2002-10-11 이기세 Ｐｃｒ 반응후 유전자 증폭여부 확인방법
CN103983642A (zh) * 2014-06-03 2014-08-13 三棵树涂料股份有限公司 基于硫化物比色检测金属铅离子的检测方法
CN106868152A (zh) * 2017-03-14 2017-06-20 宁波海洋研究院 一种食源性致病菌沙门氏菌的检测方法
CN110907446A (zh) * 2019-12-12 2020-03-24 湖北师范大学 一种谷胱甘肽的快速检测方法
CN113684321A (zh) * 2021-09-30 2021-11-23 华南农业大学 香蕉线条病毒ol rpa检测引物、检测试剂盒及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101570783A (zh) 水产品中9种致病性微生物检测试剂盒及检测方法
CN109913565B (zh) 一种用于检测副溶血弧菌的试剂盒、引物对、探针及方法
CN112410405B (zh) 一种复杂样品中细菌的快速检测方法
CN109355407B (zh) 一种psr等温扩增反应检测铜绿假单胞菌的引物、试剂盒及其方法
CN106544436B (zh) 一种检测纺织品中沙门氏菌的方法
CN108277289A (zh) 大肠埃希氏菌o157:h7干粉化lamp快速检测试剂盒
CN108277290A (zh) 金黄色葡萄球菌干粉化lamp快速检测试剂盒
CN109929936B (zh) 一种检测人类y染色体快速突变str基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及应用
CN114606329A (zh) 沙门氏菌的可视化检测试剂盒
CN111518935A (zh) 一种用于检测阪琦肠杆菌的试剂盒、引物对、探针及方法
CN110093402A (zh) 一种食源性致病菌的高通量定量检测试剂盒
CN114561481B (zh) 志贺氏菌快速一体化检测试剂盒
CN114606330A (zh) 一种rpa可视化快速检测出血性大肠埃希氏菌o157:h7的检测试剂盒
CN109628624B (zh) 一种检测牛巴贝斯虫的引物组、探针及试剂盒
CN108060211B (zh) 一种定量检测芒果炭疽菌的方法
CN111662996A (zh) 一种引物组及其在基于微流控芯片用于快速检测向日葵黑茎病菌的应用
CN112111584A (zh) 快速检测水中大肠埃希氏菌的方法
CN112779319B (zh) 一种基于lamp的纳米材料及其应用于食品耐药金黄色葡萄球菌的可视化检测方法
CN212955181U (zh) 用于新型冠状病毒核酸检测的数字pcr试剂盒
CN109517915A (zh) 溶藻弧菌干粉化lamp快速检测试剂盒
CN111172305B (zh) 一种检测大肠埃希菌的方法及试剂盒
CN109971876B (zh) 一种牛泰勒虫检测试剂盒
CN111020050B (zh) 用于香鱼格留虫lamp-lfd检测的引物和探针序列
CN118186112A (zh) 一种快速鉴别鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌的pcr-hrm试剂盒及其应用
CN107604085B (zh) 微小脲原体的lamp检测引物组、试剂盒及方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination