CN111662996A - 一种引物组及其在基于微流控芯片用于快速检测向日葵黑茎病菌的应用 - Google Patents
一种引物组及其在基于微流控芯片用于快速检测向日葵黑茎病菌的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111662996A CN111662996A CN202010363054.XA CN202010363054A CN111662996A CN 111662996 A CN111662996 A CN 111662996A CN 202010363054 A CN202010363054 A CN 202010363054A CN 111662996 A CN111662996 A CN 111662996A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- amplification
- primer group
- microfluidic chip
- helianthus annuus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 title claims abstract description 39
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 title claims description 23
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 49
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 49
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 241000683658 Phoma helianthi Species 0.000 claims abstract description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 3
- 241000567497 Leptoderma Species 0.000 claims description 2
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 claims description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims 1
- 241000208818 Helianthus Species 0.000 abstract description 16
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 8
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 abstract description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 14
- 241000269335 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum Species 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- 241001503951 Phoma Species 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 235000020238 sunflower seed Nutrition 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 241001480007 Phomopsis Species 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- LVYZJEPLMYTTGH-UHFFFAOYSA-H dialuminum chloride pentahydroxide dihydrate Chemical compound [Cl-].[Al+3].[OH-].[OH-].[Al+3].[OH-].[OH-].[OH-].O.O LVYZJEPLMYTTGH-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000223600 Alternaria Species 0.000 description 1
- 241000223602 Alternaria alternata Species 0.000 description 1
- 241001508802 Diaporthe Species 0.000 description 1
- 241001273252 Didymella aurea Species 0.000 description 1
- 241001273843 Didymella musae Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241001273457 Peyronellaea Species 0.000 description 1
- 241001557902 Phomopsis sp. Species 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 244000000004 fungal plant pathogen Species 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009400 out breeding Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种引物组及其在基于微流控芯片用于快速检测向日葵黑茎病菌的应用，引物组由下列引物构成：LI‑F3‑4，LI‑B3‑2/3/4，LI‑FIP‑4，LI‑BIP‑4，LI‑LF‑4，LI‑LB‑4。本发明中的引物组扩增特异性强，灵敏度高，最低检测限可达101copies/μL。本发明中的检测方法检测速度快，可同时检测多种病菌，起峰时间为7‑12min，整个过程耗时0.5小时，大大加快了检测速度，提高工作效率，并且灵敏度高，反应体系小，节约成本，不需要昂贵的仪器，操作简便，更适宜用于口岸等非实验室场所的快速筛查。
Description
技术领域
本发明涉及植物病原真菌的检测技术，具体涉及一种引物组及其在基于微流控芯片用于快速检测向日葵黑茎病菌的应用。
背景技术
由向日葵黑茎病菌，是向日葵在生长过程中极易感染的一种毁灭性病害。2010年该病菌被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，是我国进境植物检疫性有害生物。
目前，向日葵黑茎病多分布于加拿大、前南斯拉夫、法国、阿根廷、匈牙利、罗马尼亚、澳大利亚、伊朗、巴基斯坦和美国等国家和地区。2008年，首次报道在新疆地区有此病害发生，之后吉林、内蒙古、河北也有发生。向日葵黑茎病发病初期在向日葵叶柄基部出现黑色斑点，并迅速沿茎杆扩展至整个植株，导致小、空、瘪的向日葵籽产生，使种子产量和油产量严重降低，早期发病植株枯死，发病较晚者则矮化瘦弱，倒伏，重病田发病率100％，死亡率达50％以上。仅新疆伊犁河谷地区2007年受害面积已达13000hm2，约占当地总种植面积的1/2。向日葵黑茎病是由向日葵种子携带传播的重要种传病害。进境向日葵种子多来自疫区，病菌随进境种子传入风险极高。
向日葵黑茎病菌的检测方法主要包括：传统的形态学鉴定、实时荧光PCR、特异性引物PCR、基因序列分析、RFLP标记技术等。其中，生物学鉴定方法耗工费时，并且向日葵黑茎病菌和其他茎点霉病菌从形态上很难区分，鉴定难度较高。而利用PCR方法对样品进行初筛检测所需硬件平台较昂贵，基层检测机构不易普及。同时，由于特异性引物PCR灵敏度不高，无法检测较低含量的DNA样品，无法满足检测精度。此外，如果采用基因序列分析，虽然获得生物信息量大，但是需要测序，检测周期长。而虽然RFLP标记技术不需要测序，但是多种酶切也费时费工。并且上述分子检测方法都要进行电泳，实验人员也需要接触有毒试剂，还易发生交叉污染而造成假阳性结果。
发明内容
本发明提供了一种引物组及其在基于微流控芯片用于快速检测向日葵黑茎病菌的应用。通过结合微流控芯片技术，不但避免了反应时LAMP引物受污染而引起的假阳性，且在结果判定时，可以用仪器检测，比单纯通过沉淀或变色判断更直观、更敏感。也避免了电泳时气溶胶污染，比通过电泳判断更便捷、更安全。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种引物组，其特征在于，所述引物组包括由下列引物构成：
LI-F3-4，其核苷酸序列为：5′-CATTGCGCCCCTTGGTAT-3′；
LI-B3-2/3/4，其核苷酸序列为：5′-TGATCCGAGGTCAAGAGCT-3′；
LI-FIP-4，其核苷酸序列为：
5′-TGAGGCGAGTTTCCCAAGGG-GTTCGAGCGTCATTTGTACC-3′；
LI-BIP-4，其核苷酸序列为：
5′-ACAATTGGCAGCCGGCATATG-TGGATGCCAACAATCAAAGC-3′；
LI-LF-4，其核苷酸序列为：5′-CAACACCAAGCAATGCTTGAG-3′；
LI-LB-4，其核苷酸序列为：5′-GCCTGGAGCGCAGCACATT-3′。
本发明还提供了上述引物组在快速检测向日葵黑茎病菌的应用，该应用具体包括如下步骤：
S01、将待检测样本反应液与所述的引物组的混合，并加入模版核酸进行扩增，得到扩增结果。
作为优选，在步骤S01之前，还包括步骤S00，所述步骤S00为：
将所述的引物组中包含的多个引物分别固定于微流控芯片上不同的反应容腔内，再将待检测样本反应液和模版核酸依次分配流入到反应容腔内。
作为优选，多个引物分别固定于微流控芯片不同的反应容腔内的方法为：将所述的引物组中的各引物与适量海藻糖溶液混合后加入至微流控芯片的加样孔中，室温下晾干至固态，即完成引物组在微流控芯片上的固定。引物组中的各引物与适量海藻糖溶液的质量比为：1：0.5～3。
作为优选，所述待检测样本核酸和荧光扩增预混液的混合液。
作为优选，扩增的条件为：扩增温度为63.5℃，扩增时间为30min，荧光通道为FAM。
作为优选，所述的引物组中各引物的浓度均为100μM。
作为优选，所述的引物组中LI-F3-4、LI-B3-2/3/4、LI-FIP-4、LI-BIP-4、LI-LF-4和LI-LB-4的体积比为1:1:8:8:4:4。
本发明的有益效果为：
在本发明中，本发明中的用于向日葵黑茎病菌微流控芯片快速检测的引物组扩增特异性强，灵敏度高，最低检测限可达101copies/μL。同时，上述方法在实际检测过程中，检测速度快，并可同时检测多种病菌，起峰时间为7～12min，整个过程耗时0.5h，大大加快了检测速度，提高工作效率，并且灵敏度高，最低检测限可达101copies/μL，反应体系小(单孔5μL)，节约成本，不需要昂贵的仪器，操作简便，适合口岸等非实验室场所快速筛查工作。
附图说明
图1为本发明实施例1中向日葵黑茎病菌阳性样本的扩增曲线图；
图1-1为实施例1中微流控芯片孔对应顺序统计表；
图1-2为实施例1中扩增结果统计表；
图1-3为实施例2中微流控芯片孔对应顺序统计表；
图1-4为实施例2中扩增结果统计表；
图1-5为实施例3中微流控芯片孔对应顺序统计表；
图1-6为实施例3中扩增结果统计表；
图1-7为实施例4中微流控芯片孔对应顺序统计表；
图1-8为实施例4中微流控芯片孔对应顺序统计表；
图1-9为实施例4中扩增结果统计表；
图1-10为实施例4中扩增结果统计表；
图2为本发明实施例2中106copies/μL浓度下质粒的扩增曲线图；
图3为本发明实施例2中105copies/μL浓度下质粒的扩增曲线图；
图4为本发明实施例2中104copies/μL浓度下质粒的扩增曲线图；
图5为本发明实施例2中103copies/μL浓度下质粒的扩增曲线图；
图6为本发明实施例2中102copies/μL浓度下质粒的扩增曲线图；
图7为本发明实施例2中101copies/μL浓度下质粒的扩增曲线图；
图8为本发明实施例2中100copies/μL浓度下质粒的扩增曲线图；
图9为本发明实施例3中104copies/μL浓度下质粒重复样本的扩增曲线图；
图10-1为本发明实施例4中芯片一向日葵黑茎病、向日葵上其它致病菌及向日葵黑茎病菌近似样品的扩增曲线；
图10-2为本发明实施例4中芯片二向日葵黑茎病、向日葵上其它致病菌及向日葵黑茎病菌近似样品的扩增曲线。
具体实施方式
本发明中的目标基因为向日葵黑茎病菌的基因序列中的保守片段，其具体序列为(5'-3')：
TCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCATTGCTTGGTGTTGGGTGTATGTTTCCCCCTTGGGAAACTCGCCTCAAAACAATTGGCAGCCGGCATATGAGCCTGGAGCGCAGCACATTTTGCGCCTCTTGCTTTGATTGTTGGCATCCATCAAGACCTTTTATTAGCTCTTGACCTCGGATCAGGTA。
本发明中用于向日葵黑茎病菌微流控芯片快速检测的引物组由以下引物组成：
LI-F3-4(5'-3')：CATTGCGCCCCTTGGTAT(如SEQ ID N0.1所示)。
LI-B3-2/3/4(5'-3')：TGATCCGAGGTCAAGAGCT(如SEQ ID N0.2所示)。
LI-FIP-4(5'-3')：
TGAGGCGAGTTTCCCAAGGG-GTTCGAGCGTCATTTGTACC(如SEQ ID N0.3所示)。
LI-BIP-4(5'-3')：
ACAATTGGCAGCCGGCATATG-TGGATGCCAACAATCAAAG(如SEQ ID N0.4所示)。
LI-LF-4(5'-3')：CAACACCAAGCAATGCTTGAG(如SEQ ID N0.5所示)。
LI-LB-4(5'-3')：GCCTGGAGCGCAGCACATT(如SEQ ID N0.6所示)。
上述引物组中的各引物由申请人委托上海百力格生物技术有限公司合成。
本发明中向日葵黑茎病菌的快速检测方法为：首先将待检测样本反应液与上述引物组的各引物混合，接着加入模板核酸进行扩增并读取扩增结果。其中，上述反应液为荧光等温扩增预混液(宁波爱基因科技有限公司生产)，扩增条件为：扩增温度为63.5℃，扩增时间为30min，荧光通道为FAM(微流控荧光检测仪MA2000，宁波爱基因科技有限公司生产)。上述引物组中的各引物的浓度均为100μM，并且引物组中LI-F3-4、LI-B3-2/3/4、LI-FIP-4、LI-BIP-4、LI-LF-4以及LI-LB-4的体积比为1:1:8:8:4:4，具体地，本实施例中，芯片的各加样孔(8孔)中加入的溶液总体积为50μL每个加样孔对应四个反应孔)，其中，模板核酸的量为29.4μL，反应液的量为18μL，引物组的量为2.6μL，其中LI-F3-4、LI-B3-2/3/4、LI-FIP-4、LI-BIP-4、LI-LF-4以及LI-LB-4的体积分别为0.1μL、0.1μL、0.8μL、0.8μL、0.4μL以及0.4μL。
本发明中上述引物组中的各引物可以预先固定在微流控芯片上，然后再依次加入待检测样本反应液和模版核酸。引物固定采用以下方法：将上述引物组中的各引物与适量琼脂糖溶液混合后点入至芯片的加样孔中，室温下晾干至固态，即完成引物组在芯片上的固定。
实施例1：向日葵黑茎病菌阳性样本测试实验
将向日葵黑茎病菌阳性样本的DNA(实验室自提P40～P43均为向日葵黑茎病菌DNA)作为模板核酸加入至微流控芯片的各加样孔中，按上述扩增方法进行扩增。其中，本实施例中的阴性对照为双蒸水，微流控芯片孔对应顺序如图1-1所示，扩增结果如图1-2所示，扩增曲线如图1所示。
实施例2：灵敏度实验
将不同浓度的质粒作为模板加入至芯片的各加样孔中，按上述扩增方法进行扩增，其中，本实施例中的阴性对照为双蒸水，芯片孔对应顺序如图1-3所示(注：图1-3中质粒的浓度单位为copies/μL)，扩增结果如图1-4所示，各浓度质粒的扩增曲线如图2～8所示。其中，上述质粒为puc57质粒(宁波爱基因科技有限公司生产)，puc57质粒经酶切后，将其与上述目的基因片段进行拼接，筛选连接成功的质粒进行实验，具体方法均采用常规的质粒拼接技术。
由本实施例的实验结果可知，本发明中检测方法的最低检测限能达到101copies/μL。
实施例3：重复性实验
将上述实施例2中的104copies/μL的质粒作为模板加入到芯片的各加样孔中，其他实验条件与实施例2相同，芯片孔对应顺序如图1-5所示，扩增结果如图1-5所示，各重复样本的扩增曲线如图9所示。
由实施例的实验结果可知，本发明中引物组的CV值等于3.56％(小于5％)，即重复性较好。
实施例4：特异性实验
将向日葵黑茎病菌P41、向日葵上其它致病菌及向日葵黑茎病菌近似种，如：BL-9-1(Botryotinia fuckeliana)、BL-16-1(Alternaria Helianthiinficiens)、BL-19-1(Alternaria alternate)、BL-24-1(Phomopsis sp.)、BL-26-1(Sclerotiniasclerotiorum)、P117(Diaporthe helianthi)、CBS 269.93(Peyronellaea aurea)、CBS377.92(Peyronellaea obtuse)、CBS 463.69(Peyronellaea musae)、CBS 843.84(Peyronellaea glomerata)、Ph1(Phoma macrostoma)、Ph3(Peyronellaea lethalis)、Ph5(Phoma sorghina)的DNA(以上DNA均为本实验室自提)作为模板分别加入到芯片的各加样孔中，按上述扩增方法进行扩增，其中，上述各病菌样品的核酸浓度均相同，本实施例中的阴性对照为双蒸水，芯片孔对应顺序如图1-7，图1-8所示，扩增结果如图1-9，图1-10所示，扩增曲线如图10-1，10-2所示。
从上述结果可见，本实施例中只有向日葵黑茎病菌样本起峰，其余样品均无起峰，说明本发明中的引物组具有较强的扩增特异性。
通过上述实验可知，本发明中的向日葵黑茎病菌微流控芯片快速检测方法具有以下优点：
1、检测速度快：起峰时间为7～12min，整个过程耗时0.5小时，大大加快了检测速度，提高工作效率。
2、灵敏度高：本申请中的检测方法的灵敏度在101copies/μL。
3、更适合快速筛查工作：本申请中的检测方法反应体系小(单孔5μL)，节约成本，不需要昂贵的仪器，操作简便，更适宜用于口岸等非实验室场所的快速筛查。
序列表
<110> 宁波检验检疫科学技术研究院
<120> 一种引物组及其在基于微流控芯片用于快速检测向日葵黑茎病菌的应用
<141> 2020-04-28
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
cattgcgccc cttggtat 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
tgatccgagg tcaagagct 19
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
tgaggcgagt ttcccaaggg gttcgagcgt catttgtacc 40
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
acaattggca gccggcatat gtggatgcca acaatcaaag c 41
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
caacaccaag caatgcttga g 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
gcctggagcg cagcacatt 19
Claims (8)
1.一种引物组，由下列引物构成：
LI-F3-4，其核苷酸序列为：5′-CATTGCGCCCCTTGGTAT-3′；
LI-B3-2/3/4，其核苷酸序列为：5′-TGATCCGAGGTCAAGAGCT-3′；
LI-FIP-4，其核苷酸序列为：
5′-TGAGGCGAGTTTCCCAAGGG-GTTCGAGCGTCATTTGTACC-3′；
LI-BIP-4，其核苷酸序列为：
5′-ACAATTGGCAGCCGGCATATG-TGGATGCCAACAATCAAAGC-3′；
LI-LF-4，其核苷酸序列为：5′-CAACACCAAGCAATGCTTGAG-3′；
LI-LB-4，其核苷酸序列为：5′-GCCTGGAGCGCAGCACATT-3′。
2.如权利要求1所述的引物组在快速检测向日葵黑茎病菌的应用，其特征在于，包括如下步骤：
S01、将待检测样本反应液与所述的引物组的混合，并加入模版核酸进行扩增，得到扩增结果。
3.如权利要求2所述的引物组在快速检测向日葵黑茎病菌的应用，其特征在于，在步骤S01之前，还包括步骤S00，所述步骤S00为：
将所述的引物组中包含的多个引物分别固定于微流控芯片上不同的反应容腔内，再将待检测样本反应液和模版核酸依次分配流入到反应容腔内。
4.如权利要求3所述的引物组在快速检测向日葵黑茎病菌的应用，其特征在于，多个引物分别固定于微流控芯片不同的反应容腔内的方法为：将所述的引物组中的各引物与适量海藻糖溶液混合后加入至微流控芯片的加样孔中，室温下晾干至固态，即完成引物组在微流控芯片上的固定。
5.如权利要求2所述的引物组在快速检测向日葵黑茎病菌的应用，其特征在于，所述待检测样本核酸和荧光扩增预混液的混合液。
6.如权利要求2所述的引物组在快速检测向日葵黑茎病菌的应用，其特征在于，扩增的条件为：扩增温度为63.5℃，扩增时间为30min，荧光通道为FAM。
7.如权利要求2所述的引物组在快速检测向日葵黑茎病菌的应用，其特征在于，所述的引物组中各引物的浓度均为100μM。
8.如权利要求2所述的引物组在快速检测向日葵黑茎病菌的应用，其特征在于，所述的引物组中LI-F3-4、LI-B3-2/3/4、LI-FIP-4、LI-BIP-4、LI-LF-4和LI-LB-4的体积比为1:1:8:8:4:4。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010363054.XA CN111662996A (zh) | 2020-04-30 | 2020-04-30 | 一种引物组及其在基于微流控芯片用于快速检测向日葵黑茎病菌的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010363054.XA CN111662996A (zh) | 2020-04-30 | 2020-04-30 | 一种引物组及其在基于微流控芯片用于快速检测向日葵黑茎病菌的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111662996A true CN111662996A (zh) | 2020-09-15 |
Family
ID=72383079
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010363054.XA Pending CN111662996A (zh) | 2020-04-30 | 2020-04-30 | 一种引物组及其在基于微流控芯片用于快速检测向日葵黑茎病菌的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111662996A (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102747137A (zh) * | 2011-12-05 | 2012-10-24 | 内蒙古农业大学 | 向日葵黑茎病菌的鉴定方法 |
| CN104404151A (zh) * | 2014-12-02 | 2015-03-11 | 宁波检验检疫科学技术研究院 | 向日葵黑茎病菌的检测试剂盒 |
| CN104946638A (zh) * | 2015-07-01 | 2015-09-30 | 中华人民共和国伊犁出入境检验检疫局 | 一种向日葵白锈病菌和黑茎病菌的多重dpo-pcr检测试剂盒及其应用 |
| CN110656037A (zh) * | 2019-09-02 | 2020-01-07 | 北京百康芯生物科技有限公司 | 一种用于病原体核酸检测的微流控芯片及检测方法 |
| CN111057799A (zh) * | 2019-11-22 | 2020-04-24 | 浙江大学 | 微流控芯片快速检测甘薯羽状斑驳病毒的方法及所用引物 |
-
2020
- 2020-04-30 CN CN202010363054.XA patent/CN111662996A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102747137A (zh) * | 2011-12-05 | 2012-10-24 | 内蒙古农业大学 | 向日葵黑茎病菌的鉴定方法 |
| CN104404151A (zh) * | 2014-12-02 | 2015-03-11 | 宁波检验检疫科学技术研究院 | 向日葵黑茎病菌的检测试剂盒 |
| CN104946638A (zh) * | 2015-07-01 | 2015-09-30 | 中华人民共和国伊犁出入境检验检疫局 | 一种向日葵白锈病菌和黑茎病菌的多重dpo-pcr检测试剂盒及其应用 |
| CN110656037A (zh) * | 2019-09-02 | 2020-01-07 | 北京百康芯生物科技有限公司 | 一种用于病原体核酸检测的微流控芯片及检测方法 |
| CN111057799A (zh) * | 2019-11-22 | 2020-04-24 | 浙江大学 | 微流控芯片快速检测甘薯羽状斑驳病毒的方法及所用引物 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 宋娜: "向日葵黑茎病病原菌分离鉴定及快速检测体系的建立", 《全国优秀硕士学位论文（电子期刊） 农业科技辑》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Böhm et al. | Real‐time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants | |
| CN112094948B (zh) | 一种靶标基因组合在非洲猪瘟病毒检测中的应用及试剂盒 | |
| CN110551853A (zh) | 一种快速区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的三重pcr检测引物及试剂盒 | |
| CN106011246B (zh) | 基于微流体芯片技术的5种根结线虫等温扩增检测引物序列及其应用 | |
| CN113201594A (zh) | 一种食源性唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测方法 | |
| CN112094928A (zh) | 一种用于检测昆虫细胞dna残留的引物、试剂盒及检测方法 | |
| CN114231665A (zh) | 一种菜豆金色花叶病毒属rpa-lfd检测试剂盒及其应用 | |
| CN110184387B (zh) | 用于检测anssv的rt-lamp检测引物及其应用、检测试剂和检测方法 | |
| CN114058738B (zh) | 一种检测中华绒螯蟹呼肠孤病毒荧光定量pcr检测试剂盒 | |
| CN115044710A (zh) | 一种检测穿山甲β冠状病毒的引物组、试剂盒和应用 | |
| CN109929936B (zh) | 一种检测人类y染色体快速突变str基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及应用 | |
| CN109371110B (zh) | 一种杨树细菌性溃疡病菌的lamp检测试剂盒 | |
| CN109762910B (zh) | 一种用于同时检测两型包虫病的引物及试剂盒 | |
| CN110735003A (zh) | 细胞制品中真菌污染检测的通用引物、试剂盒及检测方法 | |
| CN116516036A (zh) | 一种lamp法检测菠萝泛菌的引物和探针组合及应用 | |
| del Campo et al. | A rapid and cost–efficient DMSO–based method for isolating DNA from cultured lichen photobionts | |
| CN111662996A (zh) | 一种引物组及其在基于微流控芯片用于快速检测向日葵黑茎病菌的应用 | |
| CN110592269A (zh) | 草鱼出血病2型病毒（gcrv-2）的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
| CN114438263A (zh) | 一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧光定量pcr引物组及试剂盒 | |
| CN108642190B (zh) | 基于14个常染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒 | |
| CN114164296B (zh) | 一种用于检测寡雄腐霉菌的引物探针组合物、试剂盒及应用和检测方法 | |
| CN107435064B (zh) | 小球藻培养中危害金藻的快速定量检测qPCR方法 | |
| CN113493846B (zh) | 柑桔黄龙病菌分子荧光raa检测引物探针组、试剂盒及方法 | |
| CN116144660B (zh) | 基于新crispr靶点的mrsa菌检测 | |
| CN112359131B (zh) | 一种检测青稞条纹病的lamp引物组及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200915 |