CN106011246B - 基于微流体芯片技术的5种根结线虫等温扩增检测引物序列及其应用 - Google Patents

基于微流体芯片技术的5种根结线虫等温扩增检测引物序列及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于微流体芯片技术的5种根结线虫等温扩增检测引物序列及其应用，特点是根据苹果根结线虫的rDNA‑ITS、北方根结线虫的rDNA‑ITS、花生根结线虫的IGS2序列、爪哇根结线虫的SCAR序列、以及南方根结线虫的RAPD序列各设计三对引物序列，建立等温扩增微流体芯片检测体系，完成苹果根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫，以及南方根结线虫的检测，其中各引物序列如SEQ ID NO.1‑30所示，优点是检测物种数和样本数多、操作简单快捷，高灵敏度和特异性。

Description

基于微流体芯片技术的5种根结线虫等温扩增检测引物序列 及其应用
技术领域
本发明涉及根结线虫的检测，尤其是涉及一种基于微流体芯片技术的5种根结线虫等温扩增检测引物序列及其应用。
背景技术
根结线虫(Meloidogyne spp.)是植物病原线虫中种类最多、分布最广、危害最严重的类群之一。目前，已经得到鉴定的在中国境内有分布主要有23种，其中以南方根结线虫、北方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫等4种线虫分布较广；象耳豆根结线虫因其可克服Mi抗原基因的抗性且无法令穿刺巴氏杆菌寄生等生物学特性，颇具研究价值。而苹果根结线虫、山茶根结线虫为我国口岸检疫中截获的常见根结线虫(非中国种)。
传统的根结线虫种类鉴定主要依据雌虫、雄虫和二龄幼虫的形态学特征分析结合鉴别寄主测定等方法，然而根结线虫的形态特征常存在种内变异，对专业知识要求高，鉴别寄主鉴定又费时。随着分子生物学技术的发展，同工酶电泳、限制性片段长度多态性、随机扩增多态性DNA (random amplified polymorphic DNA, RAPD)、实时荧光定量PCR等技术应用到了根结线虫的检测与鉴定中。这些技术克服了线虫生长周期、寄主和地理来源等限制，在一定程度上增加了鉴定的准确性。然而，这些方法需配备PCR仪、凝胶成像系统等昂贵精密的仪器，易接触到溴化乙锭(EB)等致癌物，而且对于检测人员的专业知识要求较高。新发展起来的基于等温条件下的核酸扩增技术，以环介导等温扩增技术（LAMP）为典型代表，克服了热循环等造成的仪器的复杂程度，在微生物的即时快速检测中展示出一定的应用前景。尽管针对单一病原的快速检测技术得到了快速发展，病原的检测与鉴定越发变得快速和准确，但多病原的混合感染也已成为一种常态，多种病原针对同一宿主也可引起相似的症状或体征变化。而在进出口物品的检验检疫中，同一进出口商品也往往需要检测多种病原微生物。在此种情况下，这种同一检测手段的多次平行操作也在极大地限制着检测的时效和工效。因此，基于多样本或多病原同步检测的高通量方法称为当下检测类技术开发的重要领域。在此背景下发展起来的生物芯片技术，其具有的高通量、微型化，以及自动化等特点，完美地迎合了多样本、多病原检测的需求，极大地推动了检测技术的发展。
目前生物芯片北京国家工程研究中心将微流体芯片技术和等温扩增技术联合应用，开发了等温扩增芯片检测控制系统，并已于2014年上市(如图1所示)。同时，设计完成了1款等温扩增芯片(碟式芯片)，1张芯片有24 个反应池，每个反应池的体积约1.4 μL，LAMP反应在芯片的反应池中完成，大幅度地减少了反应体系的体积，适合多项指标并行检测(如图1所示)。目前，该技术已成功应用于多重呼吸道病原菌、多重水产养殖病原微生物（细菌和病毒），以及多重食源性病原菌的同步检测，国内外还未见报道将该技术应用于根结线虫的检测与鉴定。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测速度快，检测物种多，检测灵敏度和准确性高的基于微流体芯片技术的5种根结线虫等温扩增检测引物序列及其应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于微流体芯片技术的5种根结线虫等温扩增检测引物序列，根据苹果根结线虫的核糖体DNA的内转录间隔区序列（rDNA-ITS）、北方根结线虫的核糖体DNA的内转录间隔区序列（rDNA-ITS）、花生根结线虫的基因间隔区序列（IGS2）、爪哇根结线虫的SCAR序列、以及南方根结线虫的RAPD序列各设计三对引物序列，其中用于检测苹果根结线虫的引物序列是：
Mma-F3：TGCTGCTGGATCATTACAC，
Mma-B3: TCCTGGGCTCATTAAGTCT，
Mma-FIP: CGACGTATCCTCCCAATCTTGTCGCAATGAGCCTTGTTATTG，
Mma-BIP: CGACTCTCGTCGTGTAACGGGATGGCACAACTGCTCAG，
Mma-LF：CGTGGAGTAGACGAAGAAATCT，
Mma-LB：CTACGCTGGTGTCTGTGT；
用于检测北方根结线虫的引物序列是：
Mha-F3：GGGTTTAAGACTTAATGAGCCT，
Mha-B3：CGCTGCGTACCAACATTA，
Mha-FIP：GCAGTTCGCACAAATTATCGCATTTTATCCTTGTCGGTGGATC，
Mha-BIP：TTTGAATGCAAATTGCGGCACTAAAATGACCCTGAACCAGAC，
Mha-LF：AGCTGCGTTCTTCATGGAT，
Mha-LB：GGGTAGAACCCTTTGCCA；
用于检测花生根结线虫、爪哇根结线虫和南方根结线虫的通用引物序列是：
Mar-F3： GCGGTATGGTCGTAATCAAT，
Mar-B3：AATGACAGCTGATAACATACT，
Mar-FIP：TTTCTCTCCACGAGTTTCTAGATTCGATGTTCGCTGTTCG，
Mar-BIP：TCCTTTATTGACTCTCGCTGCAATCGGCTAAATTCCTGACAA，
Mar-LF：AGCCCAATTTGAGTTTTCCTTT，
Mar-LB：AAATTAATTTGGCTTCTGGCAA；
用于检测爪哇根结线虫的引物序列是：
Mja-F3: ACACTGTTACGTATCAACTTGT，
Mja-B3：TAAACCCAGCTAGGAACCA，
Mja-FIP：CGATTTCCGACTTTTGAGCCATAATGACGAAGGTGTCGGA，
Mja-BIP：TCGGAAATCGGAATTCCAGCCATTTTCCCCATTTATTCGCAAG，
Mja-LF：CGATTTCCGACAGTTCCCA，
Mja-LB：GGGGTAATAATGGGGTGTTGT；
用于检测南方根结线虫的引物序列是：
Min-F3：TTTCCTCAATAGGACGGTATAC，
Min-B3：ACGAACCGCGATATTTCAA，
Min-FIP：AAAATCTGTTTCGGCACACCCTATCCAAGACCCAATGGC，
Min-BIP：AAAAGCAAAAGACGAAGCACCAATACCAGGGATGTGCCTT，
Min-LF：CCCTGGTTTCAGGACCTATG，
Min-LB：GACGAAAATTCGGCAAAAAGC。
一种上述基于微流体芯片技术的5种根结线虫等温扩增检测引物序列的应用，具体检测步骤如下：
1）碟式芯片的设计与点制
将微流体碟式芯片由原来的单样本24个反应池改进为二样本22个反应池，芯片分I和II两个片区，每个片区11个反应池；在芯片点制过程中，首先将选好的苹果根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫以及南方根结线虫的引物依次点至芯片各反应池，并脱水处理，每个反应池内的引物包括F3/B3各0.2 pmol，FIP/BIP各1.6 pmol，LF/LB各0.4 pmol，以无菌水作为阴性对照，同时设置阳性内对照；
2) 配置反应体系
反应体系各成分的终浓度分别为：dNTPs 1.4mmol/L，Tris-HCl(pH 8.8) 20mmol/L，KCl 10mmol/L，MgSO4 6.5mmol/L，(NH4)2SO4 10mmol/L，Triton X-100 0.1%，1´EvaGreen染料，8U Bst DNA聚合酶大片段，加双蒸水补足反应体系，1个片区所需的反应体系为22 µL；
3) 碟式芯片上的LAMP反应
将上述反应体系22 µL与2 µL样品模板混合后，通过进样孔，一次性加入进微流体碟式芯片，6000 rpm离心30 s，将液体均匀分散到各反应池，每个反应池内的体积约为1.4µL，将芯片放置在晶芯RTisochip-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪进行荧光信号的采集，反应结果以荧光曲线的形式实时呈现，其中阳性结果以“+”表示，阴性结果以“-”表示。
LAMP扩增反应的温度为63℃，反应时间为60 min。
与现有技术相比，本发明的优点在于
1、检测指标数多，本方法一次性可以检测并鉴定出苹果根结线虫、北方根结线虫、爪哇根结线虫，以及南方根结线虫等4种线虫；使用单条线虫的基因组DNA，可完成对苹果根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫，以及南方根结线虫的区别鉴定；
2、检测样本数多：本方法在一次性可检测5种线虫的同时，还可以一次性检测2个样本；
3、样品用量少：每个反应池的体积为 1.4 μL，即每个检测指标所需的反应体积仅为1.4μL，大大节省反应试剂；
4、样品的加样过程非常方便：本方法的样品加样过程非常简单，使用200μL量程的移液枪可实现样本的一次性加样，即只需加样一次，即可实现上述5种线虫的同时检测；
5、检测时间短：提取的DNA样本，加入芯片后，整个扩增反应时间为60 min，大幅度提高了检测效率；
6、灵敏度高：以单条线虫的基因组DNA为模板，本方法可以检测到单条线虫基因组DNA的1/100-1/1000；
7、特异性强：应用于每个线虫物种检测/鉴定的引物序列均是根据各自物种的目标基因的8个不同保守区域设计，具有更强的特异性，且芯片独特的生产工艺可最大程度地避免不同反应池间的交叉污染，降低检测结果的假阳性；
8、结果判断简单：可通过出现的荧光曲线实时判读结果，也可以借助仪器配套的人工智能判读软件判读；
9、对人身和环境更加安全，检测过程中不涉及EB等有毒试剂。
综上所述，使用本发明的引物采用等温扩增微流体芯片方法对根结线虫进行检测，通过微流体芯片上进行的LAMP反应，实现实时荧光即时检测，或反应结束后终点判读，实现多种根结线虫的快速检测，具有更好的便捷性，更高的快捷性、特异性和灵敏度，有利于根结线虫的即时检测和快速鉴定，可满足对应检测机构和现场疫源地检测的需要。
附图说明
图1为微流体碟式芯片的单样本碟式芯片简图；
图2为本发明改进后的微流体碟式芯片的二样本碟式芯片简图；
图3为苹果根结线虫微流体芯片等温扩增检测方法的特异性实验结果；PC：阳性对照，以苹果根结线虫的gDNA(103 pg/µL)为模板；
图4为北方根结线虫微流体芯片等温扩增检测方法的特异性实验结果；PC：阳性对照；以北方根结线虫的gDNA(103 pg/µL)为模板；
图5为花生根结线虫微流体芯片等温扩增检测方法的特异性实验结果；PC：阳性对照；以花生根结线虫的gDNA(103 pg/µL)为模板；
图6为爪哇根结线虫微流体芯片等温扩增检测方法的特异性实验结果；PC：阳性对照；以爪哇根结线虫的gDNA(103 pg/µL)为模板；
图7为南方根结线虫微流体芯片等温扩增检测方法的特异性实验结果；PC：阳性对照；以南方根结线虫的gDNA(103 pg/µL)为模板；
图8为利用LAMP方法初步测定的用于微流体芯片等温扩增检测的苹果根结线虫引物的灵敏度结果，NC：蒸馏水；104、103、102、101、100、10-1为苹果根结线虫基因组DNA浓度，单位：pg/μL；
图9为利用LAMP方法初步测定的用于微流体芯片等温扩增检测的北方根结线虫引物的灵敏度结果，1~6：分别以1.78´103、1.78´102、1.78´101、1.78´100、1.78´10-1、1.78´10-2pg/µL的北方根结线虫gDNA为模板，7：以蒸馏水为模板作为阴性对照；
图10为利用LAMP方法初步测定的用于微流体芯片等温扩增检测的通用引物的灵敏度结果，1~6：分别以2.33´104、2.33´103、2.33´102、2.33´101、2.33´100、2.33´10-1 pg/µL的花生根结线虫为模板；7：以蒸馏水为模板作为阴性对照；
图11为利用LAMP方法初步测定的用于微流体芯片等温扩增检测的通用引物的灵敏度结果，1~6：分别以1.82´104、1.82´103、1.82´102、1.82´101、1.82´100、1.82´10-1 pg/µL的爪哇根结线虫为模板，7：以蒸馏水为模板作为阴性对照；
图12为利用LAMP方法初步测定的用于微流体芯片等温扩增检测的通用引物的灵敏度结果，1~6：分别以7.8´104、7.8´103、7.8´102、7.8´101、7.8´100、7.8´10-1 pg/µL的南方根结线虫gDNA为模板，7：以蒸馏水为模板作为阴性对照；
图13为利用LAMP方法初步测定的用于微流体芯片等温扩增检测的爪哇根结线虫引物的灵敏度结果，1~5分别以1.82´104、1.82´103、1.82´102、1.82´101、1.82´100 pg/µL的爪哇根结线虫为模板，6：以蒸馏水为模板作为阴性对照；
图14为利用LAMP方法初步测定的用于微流体芯片等温扩增检测的南方根结线虫引物的灵敏度结果，1~6：分别以7.8´104、7.8´103、7.8´102、7.8´101、7.8´100、7.8´10-1 pg/µL的南方根结线虫gDNA为模板，7：以蒸馏水为模板作为阴性对照；
图15为以浓度为1´100 pg/µL的苹果根结线虫gDNA为模板，微流体芯片等温扩增检测方法的灵敏度实验结果，PC：阳性对照；
图16为以浓度为1.78´10-1 pg/µL的北方根结线虫gDNA为模板，微流体芯片等温扩增检测方法的灵敏度实验结果，PC：阳性对照；
图17为以2.33´100 pg/µL的花生根结线虫gDNA为模板，微流体芯片等温扩增检测方法的灵敏度实验结果，PC：阳性对照；
图18为以1.82´101 pg/µL的爪哇根结线虫gDNA为模板，微流体芯片等温扩增检测方法的灵敏度实验结果，PC：阳性对照；
图19为以7.8´100 pg/µL的南方根结线虫gDNA为模板，微流体芯片等温扩增检测方法的灵敏度实验结果，PC：阳性对照；
图20为以花生根结线虫、爪哇根结线虫、南方根结线虫的混合gDNA为模板，微流体芯片等温扩增检测方法的多指标同步检测的结果；；
图21为以苹果根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫、南方根结线虫5种根结的混合gDNA为模板，微流体芯片等温扩增检测方法的多指标同步检测的结果；；
图22为以1/1000条苹果根结线虫2龄幼虫gDNA为模板，微流体芯片等温扩增的灵敏度结果；PC：阳性对照；
图23为以1/1000条北方根结线虫2龄幼虫gDNA为模板，微流体芯片等温扩增的灵敏度结果；PC：阳性对照；
图24为以1/1000条花生根结线虫2龄幼虫gDNA为模板，微流体芯片等温扩增的灵敏度结果；PC：阳性对照；
图25为以1/100条爪哇根结线虫2龄幼虫gDNA为模板，微流体芯片等温扩增的灵敏度结果；PC：阳性对照；
图26为以1/1000条南方根结线虫2龄幼虫gDNA为模板，微流体芯片等温扩增的灵敏度结果；PC：阳性对照。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
等温扩增微流体芯片检测根结线虫的方法的建立
1、引物设计：分别根据苹果根结线虫的核糖体DNA的内转录间隔区序列（rDNA-ITS）、北方根结线虫的核糖体DNA的内转录间隔区序列（rDNA-ITS）、花生根结线虫的基因间隔区序列（IGS2）、爪哇根结线虫的SCAR序列、以及南方根结线虫的RAPD序列各设计三对引物序列，建立等温扩增微流体芯片检测体系，完成苹果根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫，以及南方根结线虫的检测，其中，
用于检测苹果根结线虫的引物序列是：
Mma-F3：TGCTGCTGGATCATTACAC，
Mma-B3: TCCTGGGCTCATTAAGTCT，
Mma-FIP: CGACGTATCCTCCCAATCTTGTCGCAATGAGCCTTGTTATTG，
Mma-BIP: CGACTCTCGTCGTGTAACGGGATGGCACAACTGCTCAG，
Mma-LF：CGTGGAGTAGACGAAGAAATCT，
Mma-LB：CTACGCTGGTGTCTGTGT；
用于检测北方根结线虫的引物序列是：
Mha-F3：GGGTTTAAGACTTAATGAGCCT，
Mha-B3：CGCTGCGTACCAACATTA，
Mha-FIP：GCAGTTCGCACAAATTATCGCATTTTATCCTTGTCGGTGGATC，
Mha-BIP：TTTGAATGCAAATTGCGGCACTAAAATGACCCTGAACCAGAC，
Mha-LF：AGCTGCGTTCTTCATGGAT，
Mha-LB：GGGTAGAACCCTTTGCCA；
用于检测花生根结线虫、爪哇根结线虫和南方根结线虫的通用引物序列是：
Mar-F3： GCGGTATGGTCGTAATCAAT，
Mar-B3：AATGACAGCTGATAACATACT，
Mar-FIP：TTTCTCTCCACGAGTTTCTAGATTCGATGTTCGCTGTTCG，
Mar-BIP：TCCTTTATTGACTCTCGCTGCAATCGGCTAAATTCCTGACAA，
Mar-LF：AGCCCAATTTGAGTTTTCCTTT，
Mar-LB：AAATTAATTTGGCTTCTGGCAA；
用于检测爪哇根结线虫的引物序列是：
Mja-F3: ACACTGTTACGTATCAACTTGT，
Mja-B3：TAAACCCAGCTAGGAACCA，
Mja-FIP：CGATTTCCGACTTTTGAGCCATAATGACGAAGGTGTCGGA，
Mja-BIP：TCGGAAATCGGAATTCCAGCCATTTTCCCCATTTATTCGCAAG，
Mja-LF：CGATTTCCGACAGTTCCCA，
Mja-LB：GGGGTAATAATGGGGTGTTGT；
用于检测南方根结线虫的引物序列是：
Min-F3：TTTCCTCAATAGGACGGTATAC，
Min-B3：ACGAACCGCGATATTTCAA，
Min-FIP：AAAATCTGTTTCGGCACACCCTATCCAAGACCCAATGGC，
Min-BIP：AAAAGCAAAAGACGAAGCACCAATACCAGGGATGTGCCTT，
Min-LF：CCCTGGTTTCAGGACCTATG，
Min-LB：GACGAAAATTCGGCAAAAAGC。
2. 样品DNA提取
线虫群体基因组DNA的提取：取各群体的80-100条根结线虫的2龄幼虫，用组织基因组DNA提取试剂盒（Tissue DNA Kit D3396-01，Omega Bio-Tek，USA）提取基因组DNA，将提取的DNA溶解于50 μL ddH2O中，用Nanodrop 2000分光光度计测定浓度，用作微流体芯片等温扩增的模板，-30℃贮存备用。
单条2龄幼虫线虫基因组DNA的提取，具体步骤如下：将单条线虫放入预先加有10μL ddH2O的离心管中，-80℃冷冻过夜。85℃温育5 min后加入2 μL蛋白酶K(10 mg/mL)和8μL 10×Easy Taq Buffer，震荡混合后5000 g离心1 min，56℃温育1 h，95℃ 15 min。所得基因组DNA用作微流体芯片等温扩增的模板，-30℃贮存备用。
3. 碟式芯片的设计与点制
碟式芯片采用的是北京博奥晶典生物技术有限公司的微流体碟式芯片，并将其改进为二样本22个反应池（即2*11型）（如图2所示）。芯片分I和II两个片区。每个片区包括反应池、缓冲池、主通道、进(出)样孔。芯片点制前，首先自主设计并确定各检测引物与反应池之间的对应关系（表1），过程中，首先将选好的各根结线虫的引物依次点至芯片各反应池，并脱水处理。每个反应池内的引物包括F3/B3各0.2 pmol，FIP/BIP各1.6 pmol，LF/LB各0.4pmol。以不含DNA的无菌水作为阴性对照，同时设置阳性内对照以保证试剂、芯片点制、仪器运行无误。通过空压机(北京北仪兴源涛机电设备有限公司)对芯片进行冲压，保证芯片的密闭性。
表1等温扩增微流体芯片各指标排布
4. 配置反应体系：反应体系各成分的终浓度分别为：dNTPs 1.4mmol/L， Tris-HCl(pH 8.8) 20mmol/L，KCl 10mmol/L，MgSO4 6.5mmol/L，(NH4)2SO4 10mmol/L，Triton X-100 0.1%，1´EvaGreen (Biotium Inc., California, USA) 染料，8U Bst DNA聚合酶大片段(New England Biolabs)，F3/B3各0.2 pmol，FIP/BIP各1.6 pmol，LF/LB各0.4 pmol，加双蒸水补足反应体系，1个片区所需的反应体系为22 µL。
5. 碟式芯片上的LAMP反应：将上述反应体系22 µL与2 µL样品模板混合后，通过进样孔，一次性加入进芯片，6000 rpm离心30 s，将液体均匀分散到各反应池，每个反应池内的体积约为1.4µL。将芯片放置在晶芯RTisochip-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪(北京博奥晶典生物技术有限公司)上，进行LAMP反应。该仪器会采用末端检测法的方式进行荧光信号的采集，反应结果以荧光曲线的形式实时呈现，亦可在反应结束后由该仪器自行完成结果判定，其中阳性结果以“+”表示，阴性结果以“-”表示。LAMP扩增反应的温度为63℃，反应时间为60 min。
实施例2
使用本发明的引物进行根结线虫微流体芯片等温扩增检测的特异性测定
采用上述实施例1的步骤2线虫群体基因组DNA的提取方法，提取各线虫的基因组DNA。利用所设计的引物，分别以苹果根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫以及南方根结线虫等5个种的基因组DNA(103 pg/µL)为模板，按上述实施例1的步骤3、4和5进行微流体芯片等温扩增反应，验证引物的特异性，蒸馏水作为阴性对照。结果如图3-图7所示，针对除花生根结线虫以外的4个种设计的特异性LAMP引物皆能特异地扩增出各自的目标种。花生根结线虫的判断可结合爪哇根结线虫的引物、南方根结线虫的引物，以及花生、爪哇和南方根结线虫3个物种的通用引物完成，即通用引物扩增阳性，而爪哇根结线虫和南方根结线虫的引物扩增均为阴性时，判定花生根结线虫检测阳性。同时发现一张芯片上，同个指标的阳性扩增时间基本趋于一致。
实施例3
使用本发明的引物进行根结线虫微流体芯片等温扩增检测的灵敏度测定
采用上述实施例1的步骤2线虫群体基因组DNA的提取方法，提取各线虫的基因组DNA，并进行10倍梯度稀释。首先，选择各物种的引物，以不同浓度的线虫基因组DNA为模板，在PCR管中进行实时荧光LAMP反应，初步确定各自引物的检测灵敏度；其次，以各个种PCR管中LAMP灵敏度浓度及继续稀释10倍后的gDNA为模板，按上述实施例1的步骤3、4和5进行芯片上的LAMP反应，确定其灵敏度。结果如图9-19所示，使用本发明提供的引物进行管中LAMP反应（图9- 13所示）和微流体芯片反应（图14- 19所示）时获得的灵敏度是一致的，因此，微流体芯片检测的灵敏度依次为：苹果根结线虫1 pg/µL、北方根结线虫0.18 pg/µL、花生根结线虫2.33 pg/µL、爪哇根结线虫18.2 pg/µL、南方根结线虫7.8 pg/µL。
实施例4
用本发明等温扩增微流体芯片技术进行多指标同步检测的测定。
采用上述实施例1的步骤2线虫群体基因组DNA的提取方法，提取各线虫的基因组DNA，并进行10倍梯度稀释。将5种根结线虫的基因组DNA以不同组合进行混合，混合使用的基因组DNA浓度是比芯片灵敏度浓度提高5倍。组合1：花生根结线虫、爪哇根结线虫、南方根结线虫（如图20所示）；组合2：苹果根结线虫、山茶根结线虫、北方根结线虫、象耳豆根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫、南方根结线虫（如图21所示）。混合后的基因组DNA为模板，依据实施例1步骤4和步骤5，进行微流体芯片的LAMP反应。结果如图20-21所示，在模板浓度为5倍灵敏度浓度的条件下，各模板间未出现互相干扰的情况，两组样本均能获得预期的扩增。其中象耳豆根结线虫的LAMP等温扩增方法参见文献：Evaluation of loop-mediatedisothermal amplification (LAMP) assays based on 5S rDNA-IGS2 regionsfor detecting Meloidogyne enterolobii；，J. H. Niuabc, H. Jiana*, Q. X. Guoa,C. L. Chena, X. Y. Wanga, Q. Liua and Y. D. Guoc，Plant Pathology (2012) 61,809–819；山茶根结线虫的LAMP等温扩增方法参见文献：山茶根结线虫的LAMP-LFD快速检测方法，农业生物技术学报，蔡怡，周前进，顾建锋，陈先锋，陈炯，2016年01月17日。
实施例5
使用本发明的引物进行根结线虫微流体芯片等温扩增检测的单虫灵敏度的测定
采用上述实施例1的步骤2单条2龄幼虫线虫基因组DNA的提取方法，提取各线虫的基因组DNA，并进行10倍梯度稀释，并以此为模板，按上述实施例1的步骤3、4和5进行芯片上的LAMP反应。结果如图22-26所示，5个种的单条2龄幼虫在一定的基因组DNA浓度下均可利用微流体芯片等温扩增方法进行检测，单条虫体的检测灵敏度分别为：苹果根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫以及南方根结线虫可检测到1/1000条2龄幼虫的基因组DNA，爪哇根结线虫可检测到1/100条2龄幼虫的基因组DNA。
实施例6
用本发明的的引物建立的基于微流体芯片技术的等温扩增检测根际土壤中的根结线虫
1. 样本收集
收集中国5个省份(山东，云南，福建，海南，江苏)不同植物(番茄(Lycopersicon esculentum)，日本枫树，罗汉松(podocarpus macrophyllus)，茶梅(Camellia sasanqua))的根际土壤样品共54份。
2. 线虫分离及虫体基因组DNA提取
先用贝尔曼漏斗法将土壤样品中的线虫进行分离，以传统形态学方法进行鉴定，然后依据上述实施例1的步骤2单条2龄幼虫线虫基因组DNA的提取方法，提取各线虫的基因组DNA。
3.微流体芯片上进行等温扩增LAMP反应
以本实施例步骤2获取的基因组DNA为模板，按上述实施例1的步骤3、4和5进行芯片上的LAMP反应。
结果表明，用贝尔曼漏斗法将根结线虫分离之后，通过形态学方法鉴定出阳性样本16个，检测到的根结线虫包括南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫、象耳豆根结线虫；未检测到山茶根结线虫和苹果根结线虫。利用该芯片体系成功从田间样品中检测出17个阳性样本，与传统方法鉴定结果一致的有15个样本。 (表2)。表2 利用传统的形态学方法和等温扩增微流体芯片对实际样品中根结线虫的检测结果
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种基于微流体芯片技术的5种根结线虫等温扩增检测引物组，其特征在于包括用于检测苹果根结线虫的引物：
Mma-F3：TGCTGCTGGATCATTACAC，
Mma-B3: TCCTGGGCTCATTAAGTCT，
Mma-FIP: CGACGTATCCTCCCAATCTTGTCGCAATGAGCCTTGTTATTG，
Mma-BIP: CGACTCTCGTCGTGTAACGGGATGGCACAACTGCTCAG，
Mma-LF：CGTGGAGTAGACGAAGAAATCT，
Mma-LB：CTACGCTGGTGTCTGTGT；
用于检测北方根结线虫的引物：
Mha-F3：GGGTTTAAGACTTAATGAGCCT，
Mha-B3：CGCTGCGTACCAACATTA，
Mha-FIP：GCAGTTCGCACAAATTATCGCATTTTATCCTTGTCGGTGGATC，
Mha-BIP：TTTGAATGCAAATTGCGGCACTAAAATGACCCTGAACCAGAC，
Mha-LF：AGCTGCGTTCTTCATGGAT，
Mha-LB：GGGTAGAACCCTTTGCCA；
用于检测花生根结线虫、爪哇根结线虫和南方根结线虫的通用引物：
Mar-F3： GCGGTATGGTCGTAATCAAT，
Mar-B3：AATGACAGCTGATAACATACT，
Mar-FIP：TTTCTCTCCACGAGTTTCTAGATTCGATGTTCGCTGTTCG，
Mar-BIP：TCCTTTATTGACTCTCGCTGCAATCGGCTAAATTCCTGACAA，
Mar-LF：AGCCCAATTTGAGTTTTCCTTT，
Mar-LB：AAATTAATTTGGCTTCTGGCAA；
用于检测爪哇根结线虫的引物：
Mja-F3: ACACTGTTACGTATCAACTTGT，
Mja-B3：TAAACCCAGCTAGGAACCA，
Mja-FIP：CGATTTCCGACTTTTGAGCCATAATGACGAAGGTGTCGGA，
Mja-BIP：TCGGAAATCGGAATTCCAGCCATTTTCCCCATTTATTCGCAAG，
Mja-LF：CGATTTCCGACAGTTCCCA，
Mja-LB：GGGGTAATAATGGGGTGTTGT；
和用于检测南方根结线虫的引物：
Min-F3：TTTCCTCAATAGGACGGTATAC，
Min-B3：ACGAACCGCGATATTTCAA，
Min-FIP：AAAATCTGTTTCGGCACACCCTATCCAAGACCCAATGGC，
Min-BIP：AAAAGCAAAAGACGAAGCACCAATACCAGGGATGTGCCTT，
Min-LF：CCCTGGTTTCAGGACCTATG，
Min-LB：GACGAAAATTCGGCAAAAAGC。
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