CN101691613B - 一种利用lamp检测溶珊瑚弧菌的引物组、快速诊断试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种利用lamp检测溶珊瑚弧菌的引物组、快速诊断试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

一种利用LAMP检测溶珊瑚弧菌的引物组、快速诊断试剂盒和检测方法，该引物组由下述外引物对和内引物对组成：外引物对为：VCF3：TGGTTGCAGGTGACATCAC，VCB3：TCTACTGGGCTGTACGTAGC；内引物对为：VCFIP：CATWGCGATCTCAGCGTTGTCTTTTGATCGCTAACCCAGAACACG，VCBIP：TGGTTACGTTCCAGCTTCAGCTTTCAACCAGTAGGCGACCRAT其中W＝A和T；R＝A和G。还公开了含有上述引物组的快速诊断试剂盒及检测方法，该引物组、快速诊断试剂盒和检测方法检测时间短、特异性强，检测灵敏度高。

Description

一种利用LAMP检测溶珊瑚弧菌的引物组、快速诊断试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及一种利用LAMP检测溶珊瑚弧菌的引物组、快速诊断试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。 
背景技术
杂色鲍养殖自2001年开始，人工繁殖幼苗在附苗后10-21天陆续发白、脱落及大量死亡，影响种苗来源与成贝价格，危及整个鲍养殖产业。养殖鲍苗脱落或成鲍死亡疫情，不仅发生于中国南方沿海，中国台湾沿海一带亦发生类似疾病。经过长时间的监测研究，确定引起此大规模“掉板症”的主要病原是溶珊瑚弧菌Vibriocorallilyticus，属于弧菌科弧菌属。 
为防止该病原菌的传染和流行是能够采取的主要措施，早期快速诊断溶珊瑚弧菌是减少损失的有效途径，因此，简便快速、特异性好、灵敏度高的诊断试剂盒及其检测方法对于疾病的预防意义重大。 
目前常用的检测技术是以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的病原核酸检测技术，但是这些检测技术在实际应用中存在一些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点；荧光实时定量聚合酶链式反应技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，不适用于现场快速检测，而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度；免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。 
所以及时运用生物技术发展的最新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。 
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP技术)，是近年来新出现的一种体外扩增特异DNA片段的技术，具有快速、敏感、特异性强等特点，LAMP主要是利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区段，在 聚合酶和等温条件下高效、快速、高特异地扩增靶序列，扩增反应结束后，通常是采用染色剂对反应产物进行分析。LAMP中所用到的聚合酶通常都选用具有链置换特性的DNA聚合酶，如BstDNA聚合酶。 
对LAMP来说，4种特异性引物的设计是其关键所在，对于引物设计有许多的要求，如各个引物之间的距离、Tm值以及引物末端稳定性等，因此从200～300个碱基的靶序列中设计四条符合要求的引物存在很大的难度。 
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用LAMP检测溶珊瑚弧菌的引物组，该引物组在很大程度上减少了扩增反应的背景影响，大大改善了溶珊瑚弧菌检测的特异性。 
本发明的目的还在于提供利用上述引物组进行LAMP检测溶珊瑚弧菌的快速诊断试剂盒，该试剂盒检测灵敏度高、扩增时间短，产率高。 
本发明的目的还在于提供利用上述试剂盒进行LAMP检测溶珊瑚弧菌的方法，该方法具有快速、高效和高特异性等特点。 
为达到本发明的第一个目的，本发明提供的利用LAMP检测溶珊瑚弧菌的引物组，所述的引物组由下述外引物对和内引物对组成： 
所述的外引物对为： 
VCF3：TGGTTGCAGGTGACATCAC 
VCB3：TCTACTGGGCTGTACGTAGC 
所述的内引物对为： 
VCFIP：CATWGCGATCTCAGCGTTGTCTTTTGATCGCTAACCCAGAACACG 
VCBIP：TGGTTACGTTCCAGCTTCAGCTTTCAACCAGTAGGCGACCRAT 
其中W＝A和T；R＝A和G。 
本发明提供的利用LAMP检测溶珊瑚弧菌的快速诊断试剂盒，它含有下述引物组、阳性对照品、LAMP反应液、Bst DNA聚合酶和显色液。 
所述的引物组由下述外引物对和内引物对组成： 
所述的外引物对为： 
VCF3：TGGTTGCAGGTGACATCAC 
VCB3：TCTACTGGGCTGTACGTAGC 
所述的内引物对为： 
VCFIP：CATWGCGATCTCAGCGTTGTCTTTTGATCGCTAACCCAGAACACG 
VCBIP：TGGTTACGTTCCAGCTTCAGCTTTCAACCAGTAGGCGACCRAT 
其中W＝A和T；R＝A和G。 
所述引物组中外引物对和内引物对的添加摩尔比为1∶1～10。 
所述LAMP反应液含有1×反应缓冲液、0～1.0mmol/LdNTPs、0.2～1.0mmol/L甜菜碱和0.2～0.8mmol/L MgSO4。 
所述的1×反应缓冲液含有20mmol/LpH为8.8的Tris-HCl、10mmol/L KCl、10mmol/L(NH4)2SO4、2mmol/L MgSO4和占反应缓冲液体积百分比为0.1％TritonX-100。 
所述的显色液为含荧光染料，所述的荧光染料优选SYBR Green I或EvaGreen。 
所述的阳性对照品为含有溶珊瑚弧菌的基因组DNA。 
上述试剂盒的生产工艺，包括如下步骤： 
(1)将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，分装后抽样质检； 
(2)将LAMP反应液无菌分装，抽样质检； 
(3)将Bst DNA聚合酶无菌分装，抽样质检； 
(4)将显色液无菌分装，抽样质检； 
(5)将阳性对照标本制备，分装，抽样质检； 
(6)准备带有小孔的泡沫板； 
(7)组装试剂盒。 
作为本发明的具体实施方式，上述泡沫板的设计可以为：其大小与本发明试剂盒的底面相同，泡沫板上有不少于试剂盒中所装试剂小管数量的小孔，这样试剂盒中所用试剂分装成的小管可以分别对应放置于这些小孔中，从而使得试剂都能处于小管的下部，方便取用和吸取，也可以使取用时残留在管壁上的液体自动回到管底，节约试剂。 
本发明提供的利用LAMP检测溶珊瑚弧菌的方法，该方法包括以下步骤：提取待测样品基因组的DNA，在LAMP反应体系中加入上述引物组、LAMP反应液、Bst DNA聚合酶，混匀，进行恒温扩增反应后进行灭活，取灭活后部分产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，剩余产物加入显色液，观察显色结果，并同时对比阳性对照品 的显色结果，若显示结果一致，则说明待测样品中含有溶珊瑚弧菌，若显色结果不一致，则说明待测样品中不含有溶珊瑚弧菌。 
所述的引物组由下述外引物对和内引物对组成： 
所述的外引物对为： 
VCF3：TGGTTGCAGGTGACATCAC 
VCB3：TCTACTGGGCTGTACGTAGC 
所述的内引物对为： 
VCFIP：CATWGCGATCTCAGCGTTGTCTTTTGATCGCTAACCCAGAACACG 
VCBIP：TGGTTACGTTCCAGCTTCAGCTTTCAACCAGTAGGCGACCRAT 
其中W＝A和T；R＝A和G。 
所述的恒温反应的温度范围为56～66℃，反应时间为40～70min。 
所述灭活的温度为80℃，灭活时间为10min。 
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 
(1)本发明根据靶基因序列设计了溶珊瑚弧菌检测用引物组，能特异性识别靶序列上的六个独立区域，在BstDNA聚合酶的作用下启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物，由于LAMP技术只有在四条引物完全识别靶序列六个结合区的情况下才能顺利进行，所以本发明的引物组在很大程度上减少了扩增反应的背景影响，大大改善了溶珊瑚弧菌检测的特异性； 
(2)采用本发明的引物组对溶珊瑚弧菌进行检测，因为特异性高，所以可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否； 
(3)本发明的快速诊断试剂盒是利用环介导等温扩增技术快速检测溶珊瑚弧菌，检测灵敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少； 
(4)本发明的快速诊断试剂盒不但反应条件温和，且所需仪器简单，也不需要特殊试剂，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点； 
(5)本发明的快速诊断试剂盒扩增快速且高效，在不到1h即可完成扩增，且产率高； 
(6)本发明的快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物-焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显 色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠； 
(7)本发明的快速诊断试剂盒操作简单，对检测人员的技术素质要求较低，可建立成本低廉的快速筛选体系，实现现场高通量快速检测； 
(8)本发明的快速诊断试剂盒建立了一套经过优化的反转录-环介导等温扩增反应(RT-LAMP)体系，不但使得溶珊瑚弧菌定性检测更加简便快速、特异性高、灵敏度高，而且可用于鱼、贝类养殖过程中各时期的溶珊瑚弧菌跟踪检测，避免该病原菌传播流行，提高科学管理效率，具有很高的实用价值。 
附图说明
图1是LAMP检测溶珊瑚弧菌灵敏度的试验结果； 
其中：M：Marker2000：1：660ng；2：66ng；3：6.6ng；4：660fg；6：66fg；7：6.6fg；8：阴性对照； 
图2是LAMP检测溶珊瑚弧菌特异性的试验结果； 
其中：M：Marker2000；1：菌株NA0301；2：哈维氏弧菌；3：溶藻弧菌(1.1883T)；4：溶藻弧菌V2；5、黄杆菌Myroides odoratus；6：副溶血弧菌(1.1997)；7：枯草芽孢杆菌；8：大肠杆菌；9：塔式弧菌；10、阴性对照。 
具体实施方式
以下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。 
实施例1 
本实施例提供的利用LAMP检测溶珊瑚弧菌的引物组，该引物组由下述外引物对和内引物对组成： 
其中外引物对为： 
VCF3：TGGTTGCAGGTGACATCAC， 
VCB3：TCTACTGGGCTGTACGTAGC； 
内引物对为： 
VCFIP：CATWGCGATCTCAGCGTTGTCTTTTGATCGCTAACCCAGAACACG， 
VCBIP：TGGTTACGTTCCAGCTTCAGCTTTCAACCAGTAGGCGACCRAT 
其中W＝A和T；R＝A和G。 
实施例2 
本实施例提供的利用LAMP检测溶珊瑚弧菌的试剂盒，所采用的引物组参见实施例1，其含有以下可分离包装的试剂： 
a)含有实施例1所述的引物组，该引物组中外引物对和内引物对的添加摩尔比为1∶1～10； 
其中外引物对为： 
VCF3：TGGTTGCAGGTGACATCAC， 
VCB3：TCTACTGGGCTGTACGTAGC； 
内引物对为： 
VCFIP：CATWGCGATCTCAGCGTTGTCTTTTGATCGCTAACCCAGAACACG， 
VCBIP：TGGTTACGTTCCAGCTTCAGCTTTCAACCAGTAGGCGACCRAT 
其中W＝A和T；R＝A和G； 
b)阳性对照品：含有溶珊瑚弧菌的基因组DNA，其浓度为5～20mg/mL； 
c)LAMP反应液：含有1×反应缓冲液、0～1.0mmol/LdNTPs、0.2～1.0mol/L甜菜碱和0.2～0.8mmol/L MgSO4，所述的1×反应缓冲液含有20mM pH为8.8的Tris-HCl、10mmol/L KCl、10mmol/L(NH4)2SO4、2mmol/L MgSO4和占反应缓冲液体积百分含量为0.1％Triton X-100； 
d)BstDNA聚合酶； 
e)显色液：含有常规荧光染料，该荧光染料可选择SYBR Green I或EvaGreen； 
本发明的试剂盒里还可以包括一个泡沫板，该泡沫板的设计可以为：其大小与本发明试剂盒的底面相同，泡沫板上有不少于试剂盒中所装试剂小管数量的小孔，这样试剂盒中所用试剂分装成的小管可以分别对应放置于这些小孔中，从而使得试剂都能处于小管的下部，方便取用和吸取，也可以使取用时残留在管壁上的液体自动回到管底，节约试剂。 
上述试剂盒的生产工艺，包括如下步骤： 
(1)将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，分装后抽样质检； 
(2)将LAMP反应液无菌分装，抽样质检； 
(3)将Bst DNA聚合酶无菌分装，抽样质检； 
(4)将显色液无菌分装，抽样质检； 
(5)将阳性对照标本制备，分装，抽样质检； 
(6)准备带有小孔的泡沫板； 
(7)组装试剂盒。 
实施例3 
本实施例提供的利用LAMP检测溶珊瑚菌的方法，所采用的快速诊断试剂盒参见实施例2。 
该LAMP检测溶珊瑚弧菌的方法为：提取待测样品基因组的DNA，在LAMP反应体系中加入上述引物组、LAMP反应液、Bst DNA聚合酶，混匀，进行恒温扩增反应，80℃灭活10min后，取灭活后部分液体产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，剩余液体产物加入显色液，观察显色结果，并同时对比阳性对照品的显色结果，若显示结果一致，则说明待测样品中含有溶珊瑚弧菌，若显色结果不一致，则说明待测样品中不含有溶珊瑚弧菌。 
当该反应体系为每管25μL时，每管反应体系中外引物对和内引物对的添加摩尔比优选为1∶8，MgSO4的浓度优选为1.2mmol/L，甜菜碱的浓度优选为1.0mmol/L，dNTPs的浓度优选为1.0mmol/L。 
1×反应缓冲液包括：20mM pH为8.8的Tris-HCl、10mmol/L KCl、10mmol/L(NH4)2SO4、2mmol/LMgSO4和占反应缓冲液体积百分比为0.1％TritonX-100。 
恒温反应的温度范围为56～66℃，反应时间为40～70min；优选的，温度为64.5～65℃，反应时间为70min。 
其中灭活的温度为80℃，灭活时间为10min。 
其中外引物对为： 
VCF3：TGGTTGCAGGTGACATCAC， 
VCB3：TCTACTGGGCTGTACGTAGC； 
内引物对为： 
VCFIP：CATWGCGATCTCAGCGTTGTCTTTTGATCGCTAACCCAGAACACG， 
VCBIP：TGGTTACGTTCCAGCTTCAGCTTTCAACCAGTAGGCGACCRAT 
其中W＝A和T；R＝A和G； 
其中，待测样品基因组DNA的提取过程如下： 
(1)取0.1g生物样品，或1mL水样离心浓缩，10,000rpm(～11,500×g)离心1min，尽量吸净上清； 
(2)向沉淀中加入200μL缓冲液GA，振荡至其彻底悬浮； 
(3)向管中加入20μL蛋白酶K溶液，混匀； 
(4)加入220μL缓冲液GB，振荡15s，70℃放置10min，溶液应变清亮，短暂离心以去除管盖内壁的水珠； 
加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯； 
(5)加220μL无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，短暂离心以除去管盖内壁的水珠； 
(6)将步骤(5)所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中； 
(7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中； 
(8)向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30s，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中； 
(9)向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，12,000rpm(～13,400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中； 
(10)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液； 
这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验； 
(11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2～5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。 
为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温 放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，洗脱缓冲液体积不应少于50μL，体积过小影响回收效率，洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0～8.5范围内(可以用NaOH将水的pH值调到此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。 
采用上述快速诊断试剂盒和方法进行LAMP检测溶珊瑚弧菌灵敏度和特异性的试验结果如附图1和2所示。 
如图1所示，灵敏度试验结果表明：LAMP扩增的特异性良好，无假阳性出现；溶珊瑚弧菌的基因组DNA最低检测限约为：66fg；细菌纯培养物检测限为：36cfu/mL。 
如图2所示，特异性试验结果表明：仅溶珊瑚弧菌株NA0301出现了明显的LAMP扩增，其余菌株包括弧菌属细菌和大肠杆菌等都未有阶梯状的扩增特征条带，表明特异性强。
                      序列表 
<110>中国水产科学研究院南海水产研究所 
<120>一种利用LAMP检测溶珊瑚弧菌的引物组、快速诊断试剂盒及检测方法 
<140>200910192203.4 
<141>2009-09-09 
<160> 
<210>4 
<211>19 
<212>DNA 
<213>Vibirio.coralliilyticus 
<400>1 
tggttgcaggtgacatcac                                    19 
<210>2 
<211>20 
<212>DNA 
<213>Vibirio.coralliilyticus 
<400>2 
tctactgggctgtacgtagc                                   20 
<210>3 
<211>45 
<212>DNA 
<213>Vibirio.coralliilyticus 
<400>3 
catwgcgatctcagcgttgtcttttgatcgctaacccagaacacg          45 
<210>4 
<211>21 
<212>DNA 
<213>Vibirio.coralliilyticus 
<400>4 
tggttacgttccagcttcagctttcaaccagtaggcgaccrat            43 

Claims (7)

1.一种利用LAMP检测溶珊瑚弧菌的引物组，其特征在于，所述的引物组由下述外引物对和内引物对组成：
所述的外引物对为：
VCF3：TGGTTGCAGGTGACATCAC
VCB3：TCTACTGGGCTGTACGTAGC
所述的内引物对为：
VCFIP：CATWGCGATCTCAGCGTTGTCTITTGATCGCTAACCCAGAACACG
VCBIP：TGGTTACGTTCCAGCTTCAGCTTTCAACCAGTAGGCGACCRAT
其中W＝A和T；R＝A和G。
2.一种利用LAMP检测溶珊瑚弧菌的快速诊断试剂盒，其特征在于，它含有权利要求1所述的引物组、阳性对照品、LAMP反应液、Bst DNA聚合酶和显色液。
3.根据权利要求2所述的快速诊断试剂盒，其特征在于，所述引物组中外引物对和内引物对的添加摩尔比为1∶1～10。
4.根据权利要求2所述的快速诊断试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应液含有1×反应缓冲液、1.0mmol/LdNTPs、0.2～1.0mmol/L甜菜碱和0.2～0.8mmol/LMgSO4。
5.根据权利要求4所述的快速诊断试剂盒，其特征在于，所述的1×反应缓冲液含有20mmol/L pH为8.8的Tris-HCl、10mmol/L KCl、10mmol/L(NH4)2SO4、2mmol/L MgSO4和占反应缓冲液体积百分比为0.1％Triton X-100。
6.根据权利要求2所述的快速诊断试剂盒，其特征在于，所述的显色液为含荧光染料，所述的荧光染料为SYBR Green I或EvaGreen。
7.根据权利要求2所述的快速诊断试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照品为含有溶珊瑚弧菌的基因组DNA。
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