CN109971870B

CN109971870B - 一种多重pcr试剂盒及用其快速检测藤黄微球菌的方法

Info

Publication number: CN109971870B
Application number: CN201910179199.1A
Authority: CN
Inventors: 王利; 张楠驰
Original assignee: Southwest Minzu University
Current assignee: Southwest Minzu University
Priority date: 2019-03-11
Filing date: 2019-03-11
Publication date: 2022-06-14
Anticipated expiration: 2039-03-11
Also published as: CN109971870A

Abstract

本发明属于微生物鉴定领域，具体涉及一种多重PCR试剂盒及用其快速检测藤黄微球菌的方法。本发明利用藤黄微球菌的三个特异性强的靶基因，扩增获得三对引物对，进行电泳检测；并据此提供了一种可快速检测出藤黄微球菌的多重PCR试剂盒。利用本发明提供的方法和试剂盒，可快速检测出藤黄微球菌，检测的特异性强、灵敏度高、操作简单、成本低，适合进行推广使用。

Description

一种多重PCR试剂盒及用其快速检测藤黄微球菌的方法

技术领域

本发明属于微生物鉴定领域，具体涉及一种多重PCR试剂盒及用其快速检测藤黄微球菌的方法。

背景技术

藤黄微球菌(Micrococcus luteus)为微球菌属的革兰氏阳性菌，广泛分布于土壤、空气、水体等生活环境以及动物体表，在机体免疫力低下时，可能引起体表伤口组织或体内组织感染。研究表明，该菌可引起人类的脑脊液感染、脑膜炎、藤黄微球菌关节炎等疾病，也可引起鱼类肝脏、体表等部位出血症。同时，藤黄微球菌也具有一定的利用价值，如可在食品生产中作为发酵菌种等。无论是对其进行合理防治还是进行合理利用，都需要使用恰当的手段对其进行检测和鉴定。

目前鉴定细菌的主流方法是16Sr DNA高通量测序法，使用这种方法，需将PCR扩增产物送至生物公司测序，耗时长、成本高，已经无法满足高速发展的经济社会的需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种多重PCR试剂盒及用其快速检测藤黄微球菌的方法。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：可特异性鉴定出藤黄微球菌的靶基因，所述靶基因包括：CBS基因、Sig基因和Pol基因；所述CBS基因的序列如SEQ IDNO：1所示；所述Sig基因的序列如SEQ ID NO：2所示；所述Pol基因的序列如SEQ ID NO：3所示。

相应的，利用所述CBS基因扩增获得的引物对，其序列如SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：5所示。

相应的，利用所述Sig基因扩增获得的引物对，其序列如SEQ ID NO：6和SEQ IDNO：7所示。

相应的，利用所述Pol基因扩增获得的引物对，其序列如SEQ ID NO：8和SEQ IDNO：9所示。

相应的，一种检测藤黄微球菌的试剂盒，所述试剂盒中至少包括利用CBS基因和/或Sig基因和/或Pol基因扩增获得的引物对。

优选的，所述试剂盒中至少同时包括利用CBS基因、Sig基因、Pol基因中的任意两个基因扩增获得的引物对。

优选的，所述试剂盒中同时包括利用CBS基因、Sig基因、Pol基因扩增获得的引物对。

相应的，一种检测藤黄微球菌的方法，所述方法利用藤黄微球菌的CBS基因和/或Sig基因和/或Pol基因进行。

优选的，所述方法同时利用藤黄微球菌的CBS基因、Sig基因、Pol基因进行。

优选的，所述方法具体为：利用所述各基因扩增出引物对进行检测。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供了藤黄微球菌的全新鉴定靶基因：CBS基因、Sig基因和Pol基因，并相应扩增出对应的引物。使用所述靶基因鉴定藤黄微球菌，特异性强，灵敏度高。

2、本发明利用所述全新的靶基因，提供了一种多重PCR试剂盒，使用该试剂盒检测藤黄微球菌，快速、有效、准确、灵敏度高、特异性强，可实际应用于生产过程中或科研工作中。

附图说明

图1为藤黄微球菌单一引物的PCR扩增结果示意图；

图2为藤黄微球菌三重PCR扩增结果示意图；

图3为本发明特异性试验结果示意图；

图4为本发明灵敏度试验结果示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进行进一步阐释。

实施例中涉及的培养基均为常规培养基，基本组分和来源如下：

1、LB液态培养基(g/L)：TRYPTONE 10.0、YEAST EXTRACT 5.0、氯化钠10.0。

2、LB固态培养基(g/L)：TRYPTONE 10.0、YEAST EXTRACT 5.0、氯化钠10.0、琼脂粉15。

3、MBS液态培养基(g/L)：葡萄糖3.8，TRYPTONE 3.8，淀粉2.3，氯化钠3.3，KH₂PO₄3.3。

4、MBS固态培养基(g/L)：葡萄糖3.8，TRYPTONE 3.8，淀粉2.3，氯化钠3.3，KH₂PO₄3.3，琼脂粉15。

5、MRS液态培养基、MRS固态培养基均购于青岛高科园海博生物技术有限公司。

实施例一：PCR扩增引物的设计及效果展示

1、PCR扩增引物设计与合成

选择GeneBank中藤黄微球菌基因组中的CBS基因、Sig基因和Pol基因作为靶基因。所述CBS基因的序列如SEQ ID NO:1所示；所述Sig基因的序列如SEQ ID NO:2所示；所述Pol基因的序列如SEQ ID NO:3所示。

根据各所述基因的序列，分别选择各所述基因序列中最能代表藤黄微球菌的一部分，用Primer Premier 5.0软件分别对应设计三对引物，所述各对引物的具体序列如表1所示。其中，引物对1为TCBS-1F和TCBS-1R，分别扩增CBS基因的正向和反向序列；引物对2为Tsig-2F和Tsig-2R，分别扩增Sig基因的正向和反向序列；引物对3为TPol-1F和TPol-1R，分别扩增Pol基因的正向和反向序列。所述3对引物在GeneBank上的登录号为：CP001628.1。上述引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 PCR扩增引物序列展示

2、DNA模板的制备

按照无菌操作要求，将藤黄微球菌保种菌株接种于LB固态培养基活化培养，挑取单菌落接于LB液态培养基37℃恒温摇床培养三代，取1～5ml菌液提取DNA。所用藤黄微球菌菌株保种于西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用重点实验室。

使用TIANGEN公司的DNA提取试剂盒进行DNA提取，所述DNA提取试剂盒为细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)，目录号：DP302。所述菌液中提取DNA的操作步骤如下：

(1)取细菌培养液1～5ml，10000rpm(～11500×g)离心，吸净上清，获得菌体沉淀。

(2)向菌体沉淀中加入200μl缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。

(3)向管中加入20μl蛋白酶K溶液(Proteinase K)，混匀。

(4)加入220μl缓冲液GB，振荡15s，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

(5)加220μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3(吸附柱放入收集管中)，12000rpm(～13400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(7)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm(～13400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(8)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm(～13400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(9)重复操作步骤(8)。

(10)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm(～13400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液。

(11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50～200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2～5min，12000rpm(～13400×g)离心2min。

(12)将步骤(11)中离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12000rpm(～13400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。

3、单一引物的PCR扩增

取步骤2提取的藤黄微球菌基因组DNA作为模板，分别取步骤1中的三对引物按照以下程序分别扩增：

(1)扩增CBS基因

PCR总体系为25μl，各组分含量分别为：

1.1×T3 Super PCR Mix，22μl；DNA模板，1μl；TCBS-1F(10ppm)，1μl；TCBS-1R(10ppm)，1μl。

反应条件：98℃预变性5min；98℃变性30s，61.3℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃再延伸4min。反应完成后，取5μl PCR扩增产物，采用1％琼脂糖凝胶电泳(即电泳凝胶中含1％质量的琼脂糖)，在恒压120V条件下电泳45min，置于凝胶成像系统下观察PCR扩增结果。

如图1所示，1号泳道为使用引物对1进行扩增的结果，出现大小约为173bp的扩增片段；在NCBI数据库中进行BLAST比对分析，比对结果显示，测序结果与数据库中对应基因序列的相似性为97％。

(2)扩增Sig基因

PCR总体系为25μl，各组分含量分别为：

1.1×T3 Super PCR Mix，22μl；DNA模板，1μl；TSig-2F(10ppm)，1μl；TSig-2R(10ppm)，1μl。

反应条件：98℃预变性5min；98℃变性30s，61.3℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃再延伸4min。反应完成后，取5μl PCR扩增产物，采用1％琼脂糖凝胶电泳，在恒压120V条件下电泳45min，置于凝胶成像系统下观察PCR扩增结果。

如图1所示，2号泳道为使用引物对2进行扩增的结果，出现大小约为292bp的扩增片段；在NCBI数据库中进行BLAST比对分析，比对结果显示，测序结果与数据库中对应基因序列的相似性为98％。

(3)扩增Pol基因

PCR总体系为25μl，各组分含量分别为：1.1×T3 Super PCR Mix，22μl；DNA模板，1μl；TPol-1F(10ppm)，1μl；TPol-1R(10ppm)，1μl。

如图1所示，3号泳道为使用引物对3进行扩增的结果，出现大小约为389bp的扩增片段；在NCBI数据库中进行BLAST比对分析，比对结果显示，测序结果与数据库中对应基因序列的相似性为97％。

4、三重PCR扩增

取步骤2提取的藤黄微球菌基因组DNA作为模板，取步骤1中的三对引物，按照以下程序进行三重PCR扩增：

PCR总体系为25μl，各组分含量分别为：

1.1×T3 Super PCR Mix，21μl；DNA模板，1.2μl；TCBS-1F，0.4μl；TCBS-1R，0.4μl；Tsig-2F，0.6μl；Tsig-2R，0.6μl；TPol-1F，0.4μl；TPol-1R，0.4μl。

反应条件：98℃预变性5min；98℃变性30s，61.3℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃再延伸4min。

反应完成后，取5μl PCR扩增产物，采用1％琼脂糖凝胶电泳，在恒压120V条件下电泳45min，置于凝胶成像系统下观察PCR扩增结果。结果如图2所示，4号泳道为使用三对引物进行扩增的结果，出现三条清晰条带，片段大小分别约为173bp、292bp和389bp。

结果表明，使用本发明所设计的三对特异性引物能分别扩增出目的基因序列，即扩增出藤黄微球菌基因组中CBS基因、Sig基因和Pol基因，且无其他杂带；三对引物之间无干扰，扩增准确。

另外，需要说明的是，本发明中使用的PCR反应条件和反应体系是根据长期经验积累，并经过大量前期试验后才得出的最优组合。各引物间会相互影响，如果调整PCR反应体系中引物的用量，则需要相应调整PCR反应体系中的其它组分含量；如果调整PCR反应条件中的某一参数，也需要相应调整其余参数；否则会影响扩增效果甚至导致个别条带无法扩增出来。

实施例二：特异性检测

1、DNA模板的制备

按照无菌操作要求，将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)保种菌株接种于MBS固态培养基活化培养，挑取单菌落接于MBS液态培养基37℃培养三代，取1～5ml菌液提取DNA；将粪肠球菌(Enterococcus faecalis)保种菌株接种于MRS固态培养基活化培养，挑取单菌落接于MRS液态培养基37℃培养三代，取1～5ml菌液提取DNA；将藤黄微球菌、链球菌(Streptococcus)、杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)、血短杆菌(Brevibacterium sanguinis)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、厦门希瓦氏菌(Shewanella xiamenensis)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)保种菌株分别接种于LB固态培养基活化培养，挑取单菌落接于LB液态培养基37℃培养三代，取1～5ml菌液提取DNA。上述所用试验菌株均保种于西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用重点实验室。上述涉及液体培养基培养时，均采用37℃恒温摇床培养。所述DNA的提取方法与实施例一中方法相同。

2、各株细菌的基因组PCR扩增

取步骤1所制备的各株细菌DNA模板，使用表1中的引物分别进行PCR扩增。

PCR总体系为25μl，各组扩增的体系中，各组分含量分别为：1.1×T3 Super PCRMix，21μl；DNA模板，1.2μl；TCBS-1F，0.4μl；TCBS-1R，0.4μl；Tsig-2F，0.6μl；Tsig-2R，0.6μl；TPol-1F，0.4μl；TPol-1R，0.4μl。

3、分别对各组取5μl PCR扩增产物，采用1％琼脂糖凝胶电泳，在恒压120V条件下电泳30min，置于凝胶成像系统下观察PCR扩增结果。如图3所示，1号泳道为藤黄微球菌三重PCR扩增结果；2～11号泳道分别为链球菌、杀鱼爱德华氏菌、血短杆菌、温和气单胞菌、霍乱弧菌、蜡样芽胞杆菌、厦门希瓦氏菌、维氏气单胞菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌三重PCR扩增结果。仅藤黄微球菌三重PCR扩增出现三条清晰条带，片段大小分别约为173bp、292bp和389bp；其他菌株均未出现目的条带。

结果表明，本发明提供的检测方法特异性强，可以准确鉴定出藤黄微球菌。

实施例三：灵敏度检测

1、DNA模板制备：按实施例一的方法制备藤黄微球菌的DNA模板。测定提取的藤黄微球菌基因组DNA浓度后，对DNA样品依次按照10倍、20倍、50倍、10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍、10⁷倍进行稀释。

2、PCR扩增：取步骤1获得的各浓度的DNA模板，分别使用表1的各引物进行PCR扩增。PCR总体系、各组分及反应条件与实施例一中步骤4的“三重PCR扩增”相同。

3、取5μl PCR扩增产物，采用1％琼脂糖凝胶电泳，在恒压120V条件下电泳45min，置于凝胶成像系统下观察PCR扩增结果。藤黄微球菌DNA模板稀释前的浓度测定结果为58.220ng/μl，稀释后的DNA模板浓度分别为5.822ng/μl、2.911ng/μl、1.164ng/μl、5.822×10^-1ng/μl、5.822×10^-2ng/μl、5.822×10^-3ng/μl、5.822×10^-4ng/μl、5.822×10^-5ng/μl、5.822×10^-6ng/μl。

引物灵敏度试验结果如图4所示，1～7号泳道均能出现清晰的目的条带，7号泳道所对应的DNA模板浓度为5.822×10^-3ng/μl。即使用本发明提供的试剂盒检测待检样本可准确检测藤黄微球菌DNA模板浓度不低于5.822×10^-3ng/μl。结果表明，本发明提供的藤黄微球菌的检测方法灵敏度非常高。

序列表

<110> 西南民族大学

<120> 一种多重PCR试剂盒及用其快速检测藤黄微球菌的方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1059

<212> DNA

<213> 藤黄微球菌(CBS)

<400> 1

atgaacgggg acgtcgtcgg actgctgtgg ctggtggtcc tgttggccgc caacgccttc 60

ttcgtggcgg gcgagttcgc cgtcatgggc gcccgtcggg cgcagatcga gccgagggcc 120

gaggccggct cccgccaggc ccaggtggcg ctctacgcga tggagcacgt ctcccagatg 180

ctggccgtct gccagctcgg catcacggtg tgctccctgc tcatcctcaa cgtgtccgag 240

ccggcgctgc accacctgct cgtcgtcccg atggccgccc tcggggtgcc ggccgcggcg 300

gcggatgtca ccgccttcgt gctcgcgctg ctggtggtca ccttcctgca cgtgaccctg 360

ggcgagatgg tgcccaagaa cgccgccgtc tcgttcgcgg accgcgccgt gatgctgctg 420

gccccgccgc tcgtgtggct ctcgaagctg ctgcatccgg tcgtggccgc gctgaactgg 480

acggccaacc tcgtgctgcg cgcactgcgc atcgagccga aggacgaggt ggcctcctcc 540

tacacgctcg aggaggtgca gtcgatcgtg gccgagtcca cccgctcggg caccctggac 600

gatgagtccg gcgtgctgca ctcggccctc gagttctcgg accaccgggc cggggacgtg 660

atggtgccgc gggaacgggt cgtcaccgtc cccgagggga tcacgccgca cgacttcgag 720

tggaccgtgg gtcgcgtggg cttctcccgg ttcgtggtcg aggaccccga cggcggctac 780

accggctacc tgcacctgaa ggacgtcctc accgtggggc cgtcggggta cgacgagccg 840

atcccgctca cgcgcgtgcg gtcgctggcc aacgtgcggc tcgaggatga ggtcgaggac 900

gccctggcgc tcatgcagcg cacgggctcc cacctggccc gggtgatcac gcccgagggc 960

gagaccgcgg gcatcctctt cctcgaggac gtgctcgagg agctcgtcgg ggagatcaac 1020

gacgtgacgc agtcgccgcg tcggttccgg cccgcgtga 1059

<210> 2

<211> 471

<212> DNA

<213> 藤黄微球菌(Sig)

<400> 2

tcacgcctcc cgtgtgccgt ccaggcggcg gccggtcatc acgagcaggg cgacgccgat 60

gacggagcag acgatgaacg agtccgccac gttgaagatc gcgaaatgcg ggacggagat 120

catgtcgacc acgtggccgc gcccgaacgc cgggggccgg aacagccggt ccgtgaggtt 180

gccgagcacg ccgccggcga gcccgcccag cgccagggcc cacggcgtcg agcgcacgcg 240

ggcgatcccc acgagggcgg ccaccgccac cacggcttgg atgacggtga acacccaggt 300

gtggtcctcg ccgatggaga acgccgcgcc cgggttcagg atgtagtgcc agcgcagcac 360

cccggggatc accgcgacgg agtcccccag ctgcatcgtg ctctcgaccg cgtacttggt 420

cagctggtcg agggcgtagg ccagcaccgc cacgacgagg gcggtgagca c 471

<210> 3

<211> 825

<212> DNA

<213> 藤黄微球菌(Pol)

<400> 3

gtgacgacgc acaccagcac cgcccagcgc tcctccaagt accccacgac gatcggcatc 60

gacgtcgggg ggaccggcat gaagggcggc ctggtccgcc tcgggtcggg gccgaaggcg 120

ggcaccctgc gcggggaccg cttccgcatc cccaccccgc agccggccat gcccgagccc 180

gtggcggcga ccctggcggc catcaccgcc gagctcgacg ggcgcgagaa ggcgccgaag 240

ccctccgccc cgctcggcgt gtgcttcccc tcgatcgtca aggacggggt gtgcctgtcc 300

gcgaacaaca tcgaccacac gtggatcggc acggacctgc gcggcacgtt cgaggagcac 360

ctgcgccgcc ccgtcaccgt ggtcaacgac gccgacgccg ccggcctcgc ggaggcccgc 420

tacggagccg ggcggggcgt gcgcggcctg gtgcacgtga tcaccctcgg gaccggcatc 480

ggcggcgcga tgatccacga cggcatgctc gtcccgaact tcgaggtcgg ctcgctggag 540

ctcgacggcg tgatggccga gtcgcgggcc tccgcgaagg cccgggagcg cgatcagctc 600

agctgggccg agtacgccga gcgactgcag cgcttcttct cccacgtgga gcggatcttc 660

tcgcccgacc tgttcatcgt cggcggcggc atctccaagc ggccggacga ctacctgccg 720

ctgctgcgcc tgcgcacccc gatcgtcccg gcccagctgc agaacaacgc gggcatcgtg 780

ggcgccgccc tggccgcgca cggctcgctc gccgacggca actga 825

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(TCBS-1F)

<400> 4

gggcaccctg gacgatgagt 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(TCBS-1R)

<400> 5

cgaccacgaa ccgggagaa 19

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物(Tsig-2F)

<400> 6

ctggcactac atcctgaacc cg 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Tsig-2R)

<400> 7

gacggagcag acgatgaacg a 21

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(TPol-1F)

<400> 8

cggcacgttc gaggagca 18

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(TPol-1R)

<400> 9

cgcagcagcg gcaggtagt 19

Claims

1.可特异性鉴定出藤黄微球菌的靶基因，其特征在于：所述靶基因包括：CBS基因、Sig基因和Pol基因；所述CBS基因的序列如SEQ ID NO：1所示；所述Sig基因的序列如SEQ IDNO：2所示；所述Pol基因的序列如SEQ ID NO：3所示。

2.扩增权利要求1所述靶基因的引物对，其特征在于：扩增所述CBS基因的引物对序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；和扩增所述Sig基因的引物对序列如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示；和扩增所述Pol基因的引物对序列如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示。

3.一种检测藤黄微球菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中同时包括扩增CBS基因、Sig基因和Pol基因的引物对；所述CBS基因的序列如SEQ ID NO：1所示；所述Sig基因的序列如SEQ ID NO：2所示；所述Pol基因的序列如SEQ ID NO：3所示。

4.一种检测藤黄微球菌的方法，其特征在于：所述方法利用藤黄微球菌的CBS基因、Sig基因和Pol基因进行；所述CBS基因的序列如SEQ ID NO：1所示；所述Sig基因的序列如SEQID NO：2所示；所述Pol基因的序列如SEQ ID NO：3所示。

5.根据权利要求4所述的检测藤黄微球菌的方法，其特征在于：所述方法具体为：利用扩增各所述基因的引物对进行检测。