CN101200765A - 细菌革兰双检实时荧光定量pcr检测试剂盒及用途 - Google Patents
细菌革兰双检实时荧光定量pcr检测试剂盒及用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101200765A CN101200765A CNA2007101571857A CN200710157185A CN101200765A CN 101200765 A CN101200765 A CN 101200765A CN A2007101571857 A CNA2007101571857 A CN A2007101571857A CN 200710157185 A CN200710157185 A CN 200710157185A CN 101200765 A CN101200765 A CN 101200765A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bacteria
- positive
- gram
- negative
- quantitative pcr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 87
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 238000013102 re-test Methods 0.000 title claims description 19
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 38
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 13
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 8
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 7
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 claims description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 239000004141 Sodium laurylsulphate Substances 0.000 claims description 4
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 3
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 claims description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 3
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 claims description 3
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims description 3
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 claims description 3
- 239000008227 sterile water for injection Substances 0.000 claims description 3
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 claims description 2
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract description 4
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 abstract 2
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 abstract 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 abstract 2
- 230000014670 detection of bacterium Effects 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 5
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 4
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 4
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- 241000588923 Citrobacter Species 0.000 description 2
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 2
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 2
- 206010048612 Hydrothorax Diseases 0.000 description 2
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 2
- 201000008225 Klebsiella pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 2
- 208000031662 Noncommunicable disease Diseases 0.000 description 2
- 206010035717 Pneumonia klebsiella Diseases 0.000 description 2
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 241000190932 Rhodopseudomonas Species 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 2
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 2
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 238000009640 blood culture Methods 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 2
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 1
- 241000588624 Acinetobacter calcoaceticus Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000606125 Bacteroides Species 0.000 description 1
- 241000606124 Bacteroides fragilis Species 0.000 description 1
- 108010074051 C-Reactive Protein Proteins 0.000 description 1
- 102100032752 C-reactive protein Human genes 0.000 description 1
- 241000186427 Cutibacterium acnes Species 0.000 description 1
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 1
- 241000588697 Enterobacter cloacae Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 1
- 241000192041 Micrococcus Species 0.000 description 1
- 241000191938 Micrococcus luteus Species 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000588767 Proteus vulgaris Species 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 1
- 241000191984 Staphylococcus haemolyticus Species 0.000 description 1
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000003416 augmentation Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000012805 post-processing Methods 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 229940055019 propionibacterium acne Drugs 0.000 description 1
- 229940007042 proteus vulgaris Drugs 0.000 description 1
- 238000002407 reforming Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 229940037649 staphylococcus haemolyticus Drugs 0.000 description 1
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种革兰双检实时荧光定量PCR检测试剂盒，由定量PCR反应液1、革兰阳性标准品2、革兰阴性标准品3、阳性对照品4、阴性对照品5、细菌DNA抽提裂解液6、盒体8组成。盒体8设有容器孔，分别放置PCR反应液管、标准品、对照品、细菌DNA抽提裂解液。本发明试剂盒设计合理，运用实时荧光定量PCR技术，采用细菌通用引物和革兰阴、阳性双特异荧光探针，通过实时荧光定量，不仅进行细菌革兰阴、阳性菌分型，而且对检测的阴、阳性菌进行实时准确定量，可在检测细菌革兰阴、阳性菌DNA中应用。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及定量PCR检测试剂盒，具体涉及一种双探针实时荧光定量PCR检测细菌性感染患儿血液、脑脊液、胸水、腹水等样本中细菌革兰阴、阳性菌分型及实时定量的方法。
背景技术
败血症是指细菌进入血循环，并在其中生长繁殖、产生毒素而引起的全身性严重感染的疾病。儿童特别是新生儿由于自身抵抗力差、皮肤薄嫩、出生后脐部未愈合等均易患败血症。小儿败血症如果不能早期诊断，及时、彻底地治疗，可致化脓性脑膜炎发生，影响小儿智力发育，导致儿童伤残和死亡。儿童败血症缺乏特异性临床症状及早期可靠的实验室指标，早期诊断十分困难。目前已有多种实验室方法应用于儿童败血症的诊断中，如血培养、血常规、C反应蛋白、病灶分泌物培养及涂片、病原菌抗原检测以及限制性内切酶分析(RFLP)等方法。但是由于上述方法费时、阳性率低，易污染，且有些指标非特异性，难以对儿童败血症做出迅速、准确的判断。
随着分子生物学技术的飞速发展及其在医学研究中的广泛应用，特别是最近几年兴起的荧光定量PCR技术，该方法具有准确性高、重现性好等特点，已广泛用于基因表达研究、病原体检测、SNP分析及基因分型等诸多领域。该方法采用完全闭管检测，省去了对PCR产物后处理，避免了交叉污染，结果判断由计算机完成，简化了操作步骤，并加强了结果的可靠性。随着荧光定量技术、仪器以及材料科学的发展，荧光定量技术不仅仅在定量上发挥它的优势，而且运用TaqMan或TaqMan-MGB探针的5`末端标记上不同的荧光染料(FAM、HEX等)技术可以进行基因分型、基因突变检测和SNP分析等方面研究。因此，利用双(多)通道荧光定量PCR仪，进行实时细菌革兰阴、阳性菌分型、定量的双检测临床应用成为可能。
16SrRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列。16SrRNA编码基因以多拷贝形式存在于所有细菌染色体基因组中，每个细菌约含5～10个拷贝，这使得对该基因的检测具有敏感性。16SrRNA编码基因内部结构由可变区和保守区组成。保守区为所有细菌所共有，有“分子化石”之称。可根据保守区设计各种细菌的通用引物，也可根据可变区设计细菌的革兰阴、阳性特异分型探针，用于细菌革兰阴阳性分型，目前几乎所有病原菌的16SrRNA基因测序已完成。因此16SrRNA基因已成为较理想的细菌基因分类的靶序列，逐渐成为细菌鉴别、分类的金标准。
运用实时荧光定量PCR技术，采用通用引物和革兰阴、阳性双特异荧光探针，开发研制用于细菌革兰阴、阳性菌分型及定量双检测试剂盒。并通过对临床上疑似细菌性感染的患儿外周血等标本的检测，旨在为临床败血症及化脓性脑膜炎等细菌性感染疾病的早期病原体诊断提供依据。以便早期及时制定治疗方案，减少死亡率及后遗症。
发明内容
本发明的目的是提供一种细菌革兰双检实时荧光定量PCR检测试剂盒，包含：定量PCR反应液、标准品、对照品、细菌DNA抽提裂解液，其中定量PCR反应液单管分装，矩阵排列，标准品为革兰阳性和革兰阴性标准品，对照品为阳性和阴性对照品。
其中细菌DNA抽提裂解液含有10mmol/L Tri-HCl、pH 7.65mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)；定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、细菌通用引物、革兰阳性荧光探针、革兰阴性荧光探针、耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)。细菌DNA抽提裂解液和定量PCR反应液必须用0.22μm膜过滤预处理。
检测用引物分上游引物和下游引物：
上游引物序列为：5`-CAACGCGAAGAACCTTACC-3`
下游引物序列为：5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′。
革兰阳性探针为：5`-FAM-ACGACAACCATGCACCACCTG-TAMRA-3`
革兰阴性探针为：5`-HEX-CAACATTTCACAACACGAGCTG-TAMRA-3`
革兰阳性标准品序列为：
CAACGCGAAG AACCTTACCA AATCTTGACA TCCTTTGACA ACTCTAGAGA
TAGAGCCTTC CTCTTCGGGG GACAAAGTGA CAGGTGGTGC ATGGTTGTCG
TCAGCTCGTG TCGTGAGATG TTGGGTTAAG TCCCGCAACG AGCGCAACCC
TTAAGCTTAG TTGCCATCAT TAAGTTGGGC ACTCTAAGTT GACTGCCGGT
GACAAACCGG AGGAAGGTGG GGATGACGT
革兰阴性标准品序列为：
CAACGCGAAG AACCTTACCT GGTCTTGACA TCCACAGAAC TTTCCAGAGA
TGGATTGGTG CCTTCGGGAA CTGTGAGACA GGTGCTGCAT GGCTGTCGTC
AGCTCGTGTT GTGAAATGTT GGGTTAAGTC CCGCAACGAG CGCAACCCTT
ATCCTTTGTT GCCAGCGGTC CGGCCGGGAA CTCAAAGGAG ACTGCCAGTG
ATAAACTGGA GGAAGGTGGG GATGACGT
对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阴性对照为无菌注射用水样品，阳性对照为金葡萄球菌和大肠埃希菌灭活DNA样品。
本发明提供的定量试剂保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
本发明的另一个目的是提供所述的细菌革兰双检实时荧光定量PCR检测试剂盒在检测细菌革兰阴、阳性菌DNA中的应用。
本发明试剂盒使用方法：
每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。标准品用无菌去离子水稀释为1×102-1×109拷贝/ml。
细菌DNA提取：采集新鲜的全血1ml放置于含枸缘酸钠抗凝集液的无菌真空采血管中，混匀取全血50ul加等量的细菌DNA抽提裂解液置100℃煮沸10min，12000r/min离心5min，取5μl上清作为PCR模板。菌液、脑脊液、胸水、腹水等样本方法同上。
扩增检测：在双色(或以上)荧光定量PCR仪上进行，总体积50μl，其中45.0μl PCR反应液，5μl检测样品(提取产物、标准品、阳性或阴性对照)。反应条件：94℃5min预变性，94℃20sec、60℃60sec为一个循环，共循环40次。
荧光定量结果报告：①革兰阴、阳性探针各自CT值(threshold cycle，每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数)均等于40.0的标本为阴性，②革兰阴、阳性探针其中之一CT值≤35的标本，检测结果为该相应菌阳性；若双探针CT值均≤35，则判定为阴、阳性菌混合阳性。③CT值在35～40之间为灰值区域，重做后大于37值为阴性。根据所获得的标准曲线，计算待测标本各革兰阴、阳性菌量值(拷贝数/ml)。
本发明的有益之处是：运用实时荧光定量PCR技术，采用细菌通用引物和革兰阴、阳性双特异荧光探针，开发研制用于细菌革兰阴、阳性菌分型及定量双检测试剂盒。该发明是在检测通用细菌实时荧光定量PCR的基础，增添了细菌革兰分型的探针，比传统的细菌革兰染色方法更简便、快速和准确；同时我们通过实时荧光定量，不仅进行细菌革兰阴、阳性菌分型，而且对检测的阴、阳性菌进行实时准确定量，对临床上疑似细菌性感染的患儿提供早期明确诊断，区分革兰阴、阳性菌感染及感染的滴度数量水平，以便早期及时制定治疗方案，减少死亡率及后遗症。
附图说明
图1为本发明试剂盒结构示意图。
图2为革兰阳性标准品金色葡萄球菌片段序列。
图3为革兰阴性标准品大肠埃希菌片段序列。
图4为细菌革兰阳性标准品荧光定量PCR标准曲线。
图5为细菌革兰阴性标准品荧光定量PCR标准曲线。
具体实施方式
本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例1
参见图1，本发明提供的一种细菌革兰双检实时荧光定量PCR检测试剂盒，包含：定量PCR反应液1(单管分装)、革兰阳性标准品2、革兰阴性标准品3、阳性对照品4、阴性对照品5、细菌DNA抽提裂解液6、盒体8。也可以含操作说明书7。
其中细菌DNA抽提裂解液含有10mmol/L Tri-HCl、pH 7.65mmol/L EDTA、0.5％SDS；定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、细菌通用引物、革兰阳性荧光探针、革兰阴性荧光探针、耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)。细菌DNA抽提裂解液和定量PCR反应液必须用0.22μm膜过滤预处理。检测用引物分上游引物和下游引物：
上游引物序列为：5`-CAACGCGAAGAACCTTACC-3`
下游引物序列为：5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′。
革兰阳性探针为：5`-FAM-ACGACAACCATGCACCACCTG-TAMRA-3`
革兰阴性探针为：5`-HEX-CAACATTTCACAACACGAGCTG-TAMRA-3`
革兰阳性标准品序列为：
CAACGCGAAG AACCTTACCA AATCTTGACA TCCTTTGACA ACTCTAGAGA
TAGAGCCTTC CTCTTCGGGG GACAAAGTGA CAGGTGGTGC ATGGTTGTCG
TCAGCTCGTG TCGTGAGATG TTGGGTTAAG TCCCGCAACG AGCGCAACCC
TTAAGCTTAG TTGCCATCAT TAAGTTGGGC ACTCTAAGTT GACTGCCGGT
GACAAACCGG AGGAAGGTGG GGATGACGT
革兰阴性标准品序列为：
CAACGCGAAG AACCTTACCT GGTCTTGACA TCCACAGAAC TTTCCAGAGA
TGGATTGGTG CCTTCGGGAA CTGTGAGACA GGTGCTGCAT GGCTGTCGTC
AGCTCGTGTT GTGAAATGTT GGGTTAAGTC CCGCAACGAG CGCAACCCTT
ATCCTTTGTT GCCAGCGGTC CGGCCGGGAA CTCAAAGGAG ACTGCCAGTG
ATAAACTGGA GGAAGGTGGG GATGACGT
对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阴性对照为无菌注射用水样品，阳性对照为金葡萄球菌和大肠埃希菌灭活DNA样品。
本发明提供的定量试剂保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
实施例2 细菌革兰双检荧光定量PCR法检测临床常见细菌株
一、材料：
选取临床引起败血症和化脓性脑膜炎(化脑)的常见的标准菌株10种菌属12个菌株(革兰阳性菌6株，革兰阴性菌6株)和临床分离培养株17种菌属23个菌株(革兰阳性菌12株，革兰阴性菌11株)(参见表1)，上述标准菌株由大连宝生物技术公司提供；临床分离培养株由浙江省儿童医院细菌室及感染实验室提供。
二、引物及探针设计与合成：
从Genbank中筛选不同临床细菌的16S rRNA基因序列，应用MegAlign软件分析其基因序列，寻找不同细菌种属间的保守片段，分析生物进化树的规律，根据引物和探针的设计原则，在这些细菌保守区域筛选到一对通用引物和两条分别代表革兰阳性菌和革兰阴性菌的特异性分型探针。
上游引物序列为：5`-CAACGCGAAGAACCTTACC-3`
下游引物序列为：5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′均由上海生工公司合成。
革兰阳性探针为：5`-FAM-ACGACAACCATGCACCACCTG-TAMRA-3`
革兰阴性探针为：5`-HEX-CAACATTTCACAACACGAGCTG-TAMRA-3`均由大连宝生物技术公司合成。
三、检测标准品制备：
用上述引物扩增标准菌株金色葡萄球菌和大肠埃希菌，割胶回收PCR产物并经鉴定和纯化后即用克隆系统插入pGEM-T-Easy克隆载体，抽提重组克隆质粒，用载体引物M13R对重组的阳性克隆进行测序验证。测定浓度并换算成(拷贝数/体积)。
结果：经测序，上述设计标准品完全与预期相符，其中革兰阳性标准品片段序列为金色葡萄球菌，序列参见图2；革兰阴性标准品片段序列为大肠埃希菌，序列参见图3。
四、临床常见菌革兰双检荧光定量PCR实验：
对上述共35株标准菌和临床分离培养菌进行单管实时革兰阴、阳性菌双检荧光定量PCR检测，结果发现18株革兰阳性菌株经革兰阳性探针检测均为阳性，且检测的CT值在14～23之间，17株革兰阴性菌株经革兰阳性探针检测均为阴性；17株革兰阴性菌株经革兰阴性探针检测均为阳性，且检测的CT值在14～24之间，18株革兰阳性菌株经革兰阴性探针检测均为阴性。革兰阴、阳双探针之间未有交叉信号出现，具有很高的特异性(参见表1)。
表1 标准菌株和临床分离株细菌革兰双检测荧光定量PCR结果
| 菌属 | 菌种 | G+Probe CT±SD | G-Probe CT±SD |
| 标准菌株 | |||
| G+菌葡萄球菌属链球菌属芽胞杆菌属微球菌属G-菌埃希菌属克雷伯菌属肠杆菌属假单胞菌属志贺氏菌沙雷菌属 | 金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌溶血葡萄球菌肺炎链球菌枯草杆菌藤黄微球菌大肠埃希菌肺炎克雷伯氏菌产气肠杆菌绿脓杆菌鲍氏志贺氏菌粘质沙雷菌 | 16.97±0.4521.06±0.1920.17±0.9721.87±0.4516.28±1.0819.15±0.6740.00±040.00±040.00±040.00±040.00±040.00±0 | 40.00±040.00±040.00±040.00±040.00±040.00±014.92±0.1817.48±0.5816.12±0.7222.84±0.7216.87±0.1922.47±0.17 |
| 临床培养菌株 | |||
| G+菌葡萄球菌属链球菌属李斯特菌属 | 金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌溶血葡萄球菌人葡萄球菌腐生葡萄球菌肺炎链球菌溶血性链球菌无乳链球菌产单核李斯特菌 | 15.29±0.6720.19±0.7822.09±0.4922.45±0.9721.49±0.4620.69±0.8122.57±0.6717.24±0.2814.88+0.46 | 40.00±040.00±040.00±040.00±040.00±040.00±040.00±040.00±040.00±0 |
| 棒状杆菌属丙酸杆菌属分枝杆菌属G-菌埃希菌属克雷伯菌属肠杆菌属嗜血杆菌属奈必菌属拟杆菌属假单胞菌属变形杆菌属不动杆菌属枸橼酸杆菌属沙门菌属 | 类白喉棒状杆菌痤疮丙酸杆菌结核杆菌大肠埃希菌肺炎克雷伯氏菌阴沟肠杆菌流感嗜血杆菌脑膜炎球菌脆弱拟杆菌铜绿色假单胞菌普通变形杆菌醋酸钙不动杆菌费劳地枸橼酸杆菌鼠伤寒沙门菌 | 17.10±0.2418.99±0.2823.16±0.2540.00±040.00±040.00±040.00±040.00±040.00±040.00±040.00±040.00±040.00±040.00±0 | 40.00±040.00±040.00±016.02±0.5818.17±0.5622.98±0.2424.86±0.8423.17±0.1818.19±0.3416.87±0.5820.52±0.6418.29±0.4220.94±0.2822.58±0.61 |
| 备注：CT值小于40的为阳性，CT值40为阴性 | |||
实施例3 细菌革兰双检荧光定量PCR法检测败血症的应用
一、标本检测：
选取2005年1月～2007年1月，我院新生儿病房及NICU临床疑为细菌感染(均有细菌感染的易感因素及临床表现)的住院新生儿(年龄1d～28d，男325例，女275例)600例，该600例新生儿患儿的易感因素及临床表现主要有早产儿、败血症、肺炎、肠炎、发热、感染性休克等为主。选同期因非感染性疾病住院的新生儿30例标本作为对照。每例抽取静脉血各1～2ml分别送检血培养和细菌革兰双检荧光定量PCR基因检测。
二、临床样品检测结果
细菌革兰阴、阳性标准品检测结果参见图4、图5。
600例患儿血标本细菌革兰双检荧光定量PCR和血培养检测结果如下：
表2 细菌革兰双检荧光定量PCR(FQ-PCR)与血培养检测结果对照
| 血培养阳性 | 血培养阴性 | 合计 | |
| FQ-PCR阳性FQ-PCR阴性合计 | 32234 | 16550566 | 48552600 |
| x2＝9.39；p＜0.01. | |||
细菌革兰双检荧光定量PCR检测阳性率8.00％(48/600)，血培养阳性率5.67％(34/600)，前者明显高于后者，差异有统计学意义P＜0.01(参见表2)，且48份荧光定量为阳性的标本中有40份是革兰阳性菌感染，8份为革兰阴性菌感染。30例非感染性疾病患儿细菌革兰双检荧光定量PCR和血培养均为阴性。若以血培养作为对照，细菌革兰双检荧光定量PCR方法的诊断敏感性为94.12％，特异性为97.17％，正确诊断指数为0.913。
本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明涉及的序列
Claims (5)
1.细菌革兰双检实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征是由定量PCR反应液(1)、革兰阳性标准品(2)、革兰阴性标准品(3)、阳性对照品(4)、阴性对照品(5)、细菌DNA抽提裂解液(6)、盒体(8)组成，盒体(8)设有容器孔，分别放置PCR反应液管(1)、革兰阳性标准品(2)、革兰阴性标准品(3)、阳性对照品(4)、阴性对照品(5)、细菌DNA抽提裂解液(6)，PCR反应液(1)由单管分装，矩阵排列，其中定量PCR反应液(1)含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、细菌检测用上游引物、检测用下游引物、荧光探针、耐热DNA聚合酶，其中：
上游引物序列为：5`-CAACGCGAAGAACCTTACC-3`
下游引物序列为：5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′。
革兰阳性探针为：5`-FAM-ACGACAACCATGCACCACCTG-TAMRA-3`
革兰阴性探针为：5`-HEX-CAACATTTCACAACACGAGCTG-TAMRA-3`
革兰阳性标准品序列为：
CAACGCGAAG AACCTTACCA AATCTTGACA TCCTTTGACA ACTCTAGAGA
TAGAGCCTTC CTCTTCGGGG GACAAAGTGA CAGGTGGTGC ATGGTTGTCG
TCAGCTCGTG TCGTGAGATG TTGGGTTAAG TCCCGCAACG AGCGCAACCC
TTAAGCTTAG TTGCCATCAT TAAGTTGGGC ACTCTAAGTT GACTGCCGGT
GACAAACCGG AGGAAGGTGG GGATGACGT
革兰阴性标准品序列为：
CAACGCGAAG AACCTTACCT GGTCTTGACA TCCACAGAAC TTTCCAGAGA
TGGATTGGTG CCTTCGGGAA CTGTGAGACA GGTGCTGCAT GGCTGTCGTC
AGCTCGTGTT GTGAAATGTT GGGTTAAGTC CCGCAACGAG CGCAACCCTT
ATCCTTTGTT GCCAGCGGTC CGGCCGGGAA CTCAAAGGAG ACTGCCAGTG
ATAAACTGGA GGAAGGTGGG GATGACGT
其中细菌DNA抽提裂解液含有10mmol/L Tri-HCl、pH 7.6、5mmol/L乙二胺四乙酸二钠、0.5％十二烷基硫酸钠。
2.根据权利要求1所述的细菌革兰双检实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征是：所述的细菌DNA抽提裂解液(6)和定量PCR反应液(1)必须用0.22μm膜过滤预处理。
3.根据权利要求1所述的细菌革兰双检实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征是：阳性对照品(4)为金葡萄球菌和大肠埃希菌灭活DNA样品，阴性对照品(5)为无菌注射用水。
4.根据权利要求1所述的细菌革兰双检实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征是：试剂盒含操作说明书(7)。
5.根据权利要求1或4所述的细菌革兰双检实时荧光定量PCR检测试剂盒在检测细菌革兰阴、阳性菌DNA中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2007101571857A CN101200765B (zh) | 2007-11-27 | 2007-11-27 | 细菌革兰双检实时荧光定量pcr检测试剂盒及用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2007101571857A CN101200765B (zh) | 2007-11-27 | 2007-11-27 | 细菌革兰双检实时荧光定量pcr检测试剂盒及用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101200765A true CN101200765A (zh) | 2008-06-18 |
| CN101200765B CN101200765B (zh) | 2010-11-24 |
Family
ID=39516115
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2007101571857A Expired - Fee Related CN101200765B (zh) | 2007-11-27 | 2007-11-27 | 细菌革兰双检实时荧光定量pcr检测试剂盒及用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101200765B (zh) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102321740A (zh) * | 2011-08-03 | 2012-01-18 | 河北省健海生物芯片技术有限责任公司 | 一种感染细菌的鉴定技术和检测试剂盒 |
| CN103540685A (zh) * | 2013-09-11 | 2014-01-29 | 浙江大学 | 荧光定量PCR检测巨细胞病毒gH基因分型试剂盒及应用 |
| CN103789425A (zh) * | 2014-01-21 | 2014-05-14 | 浙江大学 | 革兰阴性菌实时荧光定量pcr检测试剂盒 |
| CN105349664A (zh) * | 2015-11-27 | 2016-02-24 | 首都医科大学宣武医院 | 检测中枢神经系统细菌性感染者脑脊液中病原菌的基因芯片及试剂盒 |
| CN109971870A (zh) * | 2019-03-11 | 2019-07-05 | 西南民族大学 | 一种多重pcr试剂盒及用其快速检测藤黄微球菌的方法 |
| CN110964841A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-04-07 | 宁波美康盛德医学检验所有限公司 | 检测败血病的分子信标探针、试剂盒及其检测方法 |
| CN113528684A (zh) * | 2021-08-04 | 2021-10-22 | 领航基因科技（杭州）有限公司 | 用于鉴别革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的数字pcr检测试剂盒和应用 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103789426A (zh) * | 2014-01-21 | 2014-05-14 | 浙江大学 | 革兰阳性菌实时荧光定量pcr检测试剂盒 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1450328A (zh) * | 2002-04-09 | 2003-10-22 | 海尔集团公司 | 液体搅拌式冷柜 |
| US7381547B2 (en) * | 2004-04-28 | 2008-06-03 | Tzam Diagnostics, Llc | Methods and compositions to detect bacteria using multiplex PCR |
-
2007
- 2007-11-27 CN CN2007101571857A patent/CN101200765B/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102321740A (zh) * | 2011-08-03 | 2012-01-18 | 河北省健海生物芯片技术有限责任公司 | 一种感染细菌的鉴定技术和检测试剂盒 |
| CN103540685A (zh) * | 2013-09-11 | 2014-01-29 | 浙江大学 | 荧光定量PCR检测巨细胞病毒gH基因分型试剂盒及应用 |
| CN103540685B (zh) * | 2013-09-11 | 2015-08-26 | 浙江大学 | 荧光定量PCR检测巨细胞病毒gH基因分型试剂盒及应用 |
| CN103789425A (zh) * | 2014-01-21 | 2014-05-14 | 浙江大学 | 革兰阴性菌实时荧光定量pcr检测试剂盒 |
| CN105349664A (zh) * | 2015-11-27 | 2016-02-24 | 首都医科大学宣武医院 | 检测中枢神经系统细菌性感染者脑脊液中病原菌的基因芯片及试剂盒 |
| CN109971870A (zh) * | 2019-03-11 | 2019-07-05 | 西南民族大学 | 一种多重pcr试剂盒及用其快速检测藤黄微球菌的方法 |
| CN109971870B (zh) * | 2019-03-11 | 2022-06-14 | 西南民族大学 | 一种多重pcr试剂盒及用其快速检测藤黄微球菌的方法 |
| CN110964841A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-04-07 | 宁波美康盛德医学检验所有限公司 | 检测败血病的分子信标探针、试剂盒及其检测方法 |
| CN113528684A (zh) * | 2021-08-04 | 2021-10-22 | 领航基因科技（杭州）有限公司 | 用于鉴别革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的数字pcr检测试剂盒和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101200765B (zh) | 2010-11-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101200765B (zh) | 细菌革兰双检实时荧光定量pcr检测试剂盒及用途 | |
| CN101144775B (zh) | 细菌实时荧光定量聚合酶链反应检测试剂盒 | |
| CN105112519A (zh) | 一种基于crispr的大肠杆菌o157:h7菌株检测试剂盒及检测方法 | |
| Logar et al. | Evaluation of combined high-efficiency DNA extraction and real-time PCR for detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in subclinically infected dairy cattle: comparison with faecal culture, milk real-time PCR and milk ELISA | |
| CN114898808B (zh) | 一种预测肺炎克雷伯菌对头孢吡肟敏感性的方法及系统 | |
| CN112501268A (zh) | 一种基于纳米孔测序的快速鉴别呼吸道微生物引物组、试剂盒及其应用 | |
| CN109554449B (zh) | 一种可同时检测气单胞菌7个毒力基因的多重pcr方法 | |
| CN107988405B (zh) | 一种印第安纳沙门氏菌pcr检测试剂盒及其非诊断性检测方法 | |
| CN107365869B (zh) | 利用环介导等温扩增技术检测食源性肺炎克雷伯菌的方法及引物 | |
| CN102676664B (zh) | 同时检测多种水产品致病菌的荧光定量pcr引物和探针及检测方法 | |
| CN107385077B (zh) | 用于检测鸡白痢沙门氏菌的特异性引物、含有该引物的试剂盒及其应用 | |
| Yang et al. | The application analysis of multiplex real-time polymerase chain reaction assays for detection of pathogenic bacterium in peritoneal dialysis-associated peritonitis | |
| CN106435007A (zh) | 一种荧光定量pcr检测猪丹毒杆菌的引物、探针、试剂盒及方法 | |
| CN201156030Y (zh) | 细菌革兰双检实时荧光定量pcr检测试剂盒 | |
| CN106636407A (zh) | 基于特异序列的沙门菌检测引物、试剂盒及检测方法 | |
| CN102433384B (zh) | 用于检测分枝杆菌的引物和pcr-dhplc试剂盒 | |
| CN201107259Y (zh) | 细菌实时荧光定量聚合酶链反应检测试剂盒 | |
| CN114196768B (zh) | 用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的特异性分子靶标及其快速检测方法 | |
| Al-Mossawy et al. | Determination of Brucella. abortus Biovars infected human in the middle and southern of iraq | |
| CN113373249B (zh) | 用于筛查黄杆菌属的分子靶标及其定量检测方法 | |
| Chaudhari et al. | Challenges in Characterization of Coagulase Negative Staphylococcus by Conventional Methods and Comparison with Molecular Diagnostic Modalities. | |
| CN114196767B (zh) | 特异性分子靶标及其检测金黄色葡萄球菌st型的方法 | |
| CN102373270B (zh) | 一种检测都柏林念珠菌的引物、探针及试剂盒 | |
| CN110184371B (zh) | 一种检测皮特不动杆菌的特异性引物及其方法和应用 | |
| CN103789426A (zh) | 革兰阳性菌实时荧光定量pcr检测试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20101124 Termination date: 20111127 |