CN201107259Y - 细菌实时荧光定量聚合酶链反应检测试剂盒 - Google Patents
细菌实时荧光定量聚合酶链反应检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN201107259Y CN201107259Y CNU2007201141591U CN200720114159U CN201107259Y CN 201107259 Y CN201107259 Y CN 201107259Y CN U2007201141591 U CNU2007201141591 U CN U2007201141591U CN 200720114159 U CN200720114159 U CN 200720114159U CN 201107259 Y CN201107259 Y CN 201107259Y
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bacteria
- pcr
- testing
- detection
- utility
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 38
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title abstract description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 29
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000012339 Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims description 13
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 9
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 claims description 8
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 12
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 7
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 abstract description 6
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 abstract description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 abstract description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 2
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 abstract 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 abstract 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 23
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 9
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 9
- 238000009640 blood culture Methods 0.000 description 9
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 7
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 3
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 3
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 206010048612 Hydrothorax Diseases 0.000 description 2
- 208000031662 Noncommunicable disease Diseases 0.000 description 2
- RCEAADKTGXTDOA-UHFFFAOYSA-N OS(O)(=O)=O.CCCCCCCCCCCC[Na] Chemical compound OS(O)(=O)=O.CCCCCCCCCCCC[Na] RCEAADKTGXTDOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 1
- 241001135518 Acinetobacter lwoffii Species 0.000 description 1
- 102000011767 Acute-Phase Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010062271 Acute-Phase Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000607528 Aeromonas hydrophila Species 0.000 description 1
- 244000034356 Aframomum angustifolium Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000580513 Citrobacter braakii Species 0.000 description 1
- 241000588919 Citrobacter freundii Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 241000607471 Edwardsiella tarda Species 0.000 description 1
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 241000588697 Enterobacter cloacae Species 0.000 description 1
- 241001468179 Enterococcus avium Species 0.000 description 1
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 1
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241000606788 Haemophilus haemolyticus Species 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 235000002710 Ilex cornuta Nutrition 0.000 description 1
- 241001310146 Ilex cornuta Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 description 1
- 241000588915 Klebsiella aerogenes Species 0.000 description 1
- 241000588749 Klebsiella oxytoca Species 0.000 description 1
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 1
- 241001293418 Mannheimia haemolytica Species 0.000 description 1
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 235000010326 Osmanthus heterophyllus Nutrition 0.000 description 1
- 241000606860 Pasteurella Species 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 244000110797 Polygonum persicaria Species 0.000 description 1
- 241000588770 Proteus mirabilis Species 0.000 description 1
- 241001472782 Proteus penneri Species 0.000 description 1
- 241000576783 Providencia alcalifaciens Species 0.000 description 1
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 241000607764 Shigella dysenteriae Species 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241001147687 Staphylococcus auricularis Species 0.000 description 1
- 241001147736 Staphylococcus capitis Species 0.000 description 1
- 241001147698 Staphylococcus cohnii Species 0.000 description 1
- 241000191984 Staphylococcus haemolyticus Species 0.000 description 1
- 241000192087 Staphylococcus hominis Species 0.000 description 1
- 241000191982 Staphylococcus hyicus Species 0.000 description 1
- 241000147121 Staphylococcus lentus Species 0.000 description 1
- 241001147691 Staphylococcus saprophyticus Species 0.000 description 1
- 241000192099 Staphylococcus schleiferi Species 0.000 description 1
- 241000191978 Staphylococcus simulans Species 0.000 description 1
- 241000327135 Staphylococcus warneri L37603 Species 0.000 description 1
- 241000191973 Staphylococcus xylosus Species 0.000 description 1
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 description 1
- 241001134658 Streptococcus mitis Species 0.000 description 1
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 description 1
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 1
- 241000194023 Streptococcus sanguinis Species 0.000 description 1
- 208000001871 Tachycardia Diseases 0.000 description 1
- 241000607447 Yersinia enterocolitica Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000003416 augmentation Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 208000035850 clinical syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012805 post-processing Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 238000002407 reforming Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000008227 sterile water for injection Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000006794 tachycardia Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本实用新型提供的细菌实时荧光定量聚合酶链反应检测试剂盒由PCR反应液1、标准品2、阳性对照品3、阴性对照品4、抽提裂解液5、操作说明书6、包装盒体7组成。盒体7设有容器孔，分别放置PCR反应液管1、标准品2、阳性对照品3、阴性对照品4、抽提裂解液5，PCR反应液管由单管分装，矩阵排列。本实用新型提供的试剂盒设计合理，有效地解决了以往PCR方法只能用于检测单一病原菌的问题，对常见的细菌感染进行通用检测，提高了细菌检测的通用性和敏感性，提高了区分细菌性和非细菌性的能力。检测时间短快速，检测方法特异、敏感、准确。
Description
技术领域
本实用新型属生物技术领域，涉及定量PCR检测试剂盒，具体涉及一种实时荧光定量PCR检测细菌性感染患儿血液、脑脊液、胸水、腹水等样本中细菌DNA的试剂盒。
背景技术
细菌16SrRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列。该基因具有以下两大特点：(1)多拷贝：16S rRNA编码基因以多拷贝形式存在于所有细菌染色体基因组中，每个细菌约含5～10个拷贝，这使得对该基因的检测具有敏感性。(2)多信息：16S rRNA编码基因内部结构由可变区和保守区组成。保守区为所有细菌所共有，有“分子化石”之称。可根据保守区设计各种细菌的通用引物和通用探针，用于临床常见细菌的通用检测。目前，几乎所有病原菌的16S rRNA基因测序完成。因此16S rRNA基因已成为较理想的临床细菌感染检测靶基因序列，逐渐成为细菌与其它病原体鉴别、分类的金标准。
实时荧光定量技术的基本原理：利用Taq酶的5′-3′外切酶核酸活性，在普通聚合酶链反应基础上，设计荧光双标记探针，分别标记上荧光报告基团(R)和淬灭基团(Q)。当这条探针保持完整时，R基团的荧光信号被Q基团抑制，一旦探针被切断，抑制作用消失，R基团的荧光信号就可以被检测到。该方法采用完全闭管检测，省去了对PCR产物后处理，避免了交叉污染，结果判断由计算机完成，简化了操作步骤，并增加了结果的可靠性。
败血症(Septicemia)是指病原菌及其毒素侵入血流所引起的临床综合症。病程中常有炎症介质的激活与释放，引起高热、寒颤、心动过速、呼吸急促、皮疹和神志改变等一系列临床症状，严重者可引起休克、DIC和多器官功能衰竭。即使给予适当的抗生素治疗，病死率仍较高。儿童特别是新生儿由于自身抵抗力差、皮肤薄嫩、出生后脐部未愈合等均易患败血症。儿童败血症如果不能早期判断，及时、彻底地治疗，可致化脓性脑膜炎发生，影响小儿智力发育，导致儿童伤残和死亡。
儿童败血症缺乏特异性临床症状及早期可靠的实验室指标，早期诊断十分困难。目前已有多种实验室方法应用于儿童败血症的诊断中，如血培养、血常规、急性时相蛋白如CRP，病灶分泌物培养及涂片，病原菌抗原检测如对流免疫电泳(CIE)，以及分子生物学检测如限制性内切酶分析(RFLP)、DNA探针等方法。荧光定量PCR法是近几年兴起的生物学技术，具有准确性高、重现性好等特点，已广泛用于基因表达研究、病原体检测、SNP分析等诸多领域，在检测与应用领域是目前的研究热点之一。
随着分子生物学技术的飞速发展及其在医学研究中的广泛应用，建立快速可靠的诊断儿童败血症和化脓性脑膜炎等细菌性感染疾病的新方法已成为可能并被尝试。
发明内容
本实用新型的目的是提供细菌实时荧光定量聚合酶链反应检测试剂盒，该试剂盒由PCR反应液、标准品、阳性对照品、阴性对照品、抽提裂解液、操作说明书、包装盒体组成，盒体设有容器孔，分别放置PCR反应液、标准品、阳性对照品、阴性对照品、抽提裂解液，PCR反应液管由单管分装，矩阵排列。
其中定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、细菌检测用上游引物、检测用下游引物、荧光探针、耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)组成。抽提裂解液含有10mmol/L Tri-HCl pH7.6 5mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)。
定量PCR反应液必须用0.22μm膜过滤预处理。
其中：
上游引物序列为： 5`-CAACGCGAAGAACCTTACC-3`
下游引物序列为： 5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′。
荧光探针序列为： 5′-FAM-TAAGTCCCGCAACGAGCGCAA-TAMRA-3′。
标准品序列为：
CAACGCGAAG AACCTTACCT GGTCTTGACA TCCACAGAAC TTTCCAGAGA
TGGATTGGTG CCTTCGGGAA CTGTGAGACA GGTGCTGCAT GGCTGTCGTC
AGCTCGTGTT GTGAAATGTT GGGTTAAGTC CCGCAACGAG CGCAACCCTT
ATCCTTTGTT GCCAGCGGTC CGGCCGGGAA CTCAAAGGAG ACTGCCAGTG
ATAAACTGGA GGAAGGTGGG GATGACGT
对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阴性对照为无菌注射用水样品，阳性对照为大肠埃希菌灭活DNA样品。
本定量试剂保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
本品选用临床常见菌16S rRNA基因高度保守的扩增靶区域，设计细菌通用引物和通用TaqMan荧光探针，利用实时荧光定量PCR技术，实时定量检测临床样本细菌DNA的应用。
本实用新型试剂盒使用方法：
每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。标准品用无菌去离子水稀释为1×102-1×109拷贝/ml。
细菌DNA提取：采集新鲜的全血1ml放置于含枸缘酸钠抗凝集液的无菌真空采血管中，混匀取全血50ul加等量的抽提裂解液(10mmol/L Tri-HCl pH7.6 5mmol/L EDTA，0.5％SDS)置100℃煮沸10min，12000r/min离心5min，取5μl上清作为PCR模板。菌液、脑脊液、胸水、腹水等样本方法同上。
扩增检测：在荧光定量PCR仪上进行，总体积50μl，其中45.0μl PCR反应液，5μl检测样品(提取产物、标准品、阳性或阴性对照)。反应条件：94℃5min预变性，94℃20sec、60℃60sec为一个循环，共循环40次。
荧光定量结果报告：①CT值(threshold cycle，每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数)等于40.0的标本为阴性，②CT值≤35的标本，检测结果为阳性，③CT值在35～40之间为灰值区域，重做后大于38值为阴性。根据所获得的标准曲线，计算得到各待测标本中细菌的量(拷贝数/ml)。
本实用新型的有益之处是：该试剂盒运用实时荧光定量PCR技术实现了对临床常见菌通用检测的目的。有效地解决了以往PCR方法只能用于检测单一病原菌的问题，对常见的细菌感染进行通用检测，提高了细菌检测的通用性和敏感性，提高了区分细菌性和非细菌性的能力。为细菌性感染的早期病原体检测提供依据。
附图说明
图1为本实用新型的结构示意图。
图2为大肠埃希菌标准品片段序列。
图3为细菌实时荧光定量PCR标准品检测。
图4为细菌实时荧光定量PCR标准曲线。
具体实施方式
本实用新型结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本实用新型范围。
实施例1
参见图1，本实用新型提供的细菌实时荧光定量聚合酶链反应检测试剂盒由PCR反应液1、标准品2、阳性对照品3、阴性对照品4、抽提裂解液5、操作说明书6、包装盒体7组成。盒体7设有容器孔，分别放置PCR反应液管1、标准品2、阳性对照品3、阴性对照品4、抽提裂解液5，PCR反应液管由单管分装，矩阵排列。
其中定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、细菌检测用上游引物、检测用下游引物、荧光探针、耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)组成。抽提裂解液含有10mmol/L Tri-HCl pH7.6 5mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)。
实施例2 细菌荧光定量PCR法检测临床常见分离株
一、材料：
临床常见细菌分离菌株金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和大肠埃希菌均由本实验室培养提供；pGEM-T-Easy克隆系统、Taq DNA聚合酶、dNTP等PCR相关试剂购自美国Promega公司，测序试剂、377型测序仪、PE-5700型定量PCR仪均为美国Perkin Elmer公司产品。
二、引物及探针设计与合成：
选择临床引起败血症和化脓性脑膜炎(化脑)的常见细菌22种菌属50个菌株，其中革兰阴阳性菌株各为25株(见表1)。应用MEGALIGN软件分析其16S rRNA基因序列，寻找不同细菌种属间的保守片段，分析生物进化树的规律，根据引物和探针的设计原则，在这些细菌保守区域筛选通用引物和通用探针，从中选择最佳一对组合。
上游引物序列为： 5`-CAACGCGAAGAACCTTACC-3`
下游引物序列为： 5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′ 均由上海生工公司合成。
荧光探针序列为：5′-FAM-TAAGTCCCGCAACGAGCGCAA-TAMRA-3′。由大连宝生物技术公司合成。
表1 临床引起败血症和化脓性脑膜炎(化脑)的常见细菌
| Genus | Speciesb | accessionno. | Genus | Speciesb | accessionno. |
| Gram-positive bacteria | Gram-negative bacteria | ||||
| Bacillus | B.subtilis | AB065370 | Acinetobacter | A.baumannii | X81660 |
| Enterococcus | E.avium | AJ301825 | A.lwoffii | U10875 | |
| E.faecalis | AJ276460 | Aeromonas | A.hydrophila | AM262157 | |
| E.faecium | AJ874342 | Citrobacter | C.braakii | AF025368 | |
| Listeria | L.monocy | AY946290 | C.freundii | AM184281 | |
| Staphylococcus | S.aureus | X68417 | Edwardsiella | E.tarda | DQ233654 |
| S.auricularis | D83358 | Enterobacter | E.aerogenes | AJ251468 | |
| S.capitis | AY030321 | E.cloacae | AJ251469 | ||
| S.cohnii | AJ717378 | Escherichia | E.coli | AF233451 | |
| S.epidermidis | L37605 | Haemophilus | H.influenzae | AF224306 | |
| S.haemolyticus | L37600 | H.haemolyticus | M75045 | ||
| S.hominis | AY030318 | Klebsiella | K.oxytoca | EF127829 | |
| S.hyicus | D83368 | K.pneumoniae | AF130981 | ||
| S.lentus | D83370 | Neisseria | N.meningitidis | AF059671 | |
| S.saprophyticus | D83371 | Pasteurella | P.haemolytica | M75080 | |
| S.schleiferi | D83372 | Proteus | P.mirabilis | AF008582 | |
| S.simulans | D83373 | P.penneri | AJ634474 | ||
| S.warneri | L37603 | P.vulgaris | AJ301683 | ||
| S.xylosus | D83374 | Providencia | P.alcalifaciens | AJ301684 | |
| Streptococcus | S.agalactiae | AB023574 | Pseudomonas | P.aeruginosa | AF094720 |
| S.mitis | AY005045 | P.fluorescens | AM410631 | ||
| S.mutans | AF139603 | Salmonella | S.paratyphiA | X80682 | |
| S.pneumoniae | AF003930 | Serratia | S.marcescens | EF035134 | |
| S.pyogenes | AB023575 | Shigella | S.dysenteriae | X96966 | |
| S.sanguis | AF003928 | Yersinia | Y.enterocolitica | AF366378 |
三、检测标准品制备：
用上述引物扩增标准菌株大肠埃希菌，PCR产物为228bp，PCR产物经电泳检测后即用克隆系统插入pGEM-T-Easy克隆载体，抽提重组克隆质粒，用载体引物M13R对重组的阳性克隆进行测序验证。测定浓度并换算成(拷贝数/体积)。
结果：经测序，上述设计标准品完全与预期相符，其中的标准品片段序列为大肠埃希菌，参见图2。
四、临床常见菌株梯度稀释对照试验：
从三种常见的临床分离株(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌)的培养基上用无菌棉签分别刮取少量菌斑，各自放于含有2ml的无菌水的试管中，用比浊仪配成0.5滴度的液体(相当于浓度为108 CFU/ml)。分别对该三种菌株依次进行10-1次、10-2次、10-3次、10-4次、10-5次方稀释，各取10-5次、10-4次、10-3次方稀释液5ul荧光定量和划平板细菌37℃隔夜培养，次日计数培养皿的菌落数。
表2平板菌落计数与荧光定量PCR检测结果对照
| 平板菌落计数(CFU/5ul) | 荧光定量CT值±SD | |
| 金黄色葡萄球菌10-5金黄色葡萄球菌10-4金黄色葡萄球菌10-3表皮葡萄球菌10-5表皮葡萄球菌10-4表皮葡萄球菌10-3大肠埃希菌10-5大肠埃希菌10-4大肠埃希菌10-3 | 376500329213836241 | 37.90±0.3433.98±0.7529.37±0.2638.17±0.2034.68±0.3430.79±0.8936.60±1.0132.76±0.3730.17±0.12 |
实施例3 细菌荧光定量PCR试剂盒检测应用
一、标本检测：
选取2003年12月～2005年12月，我院新生儿病房及NICU临床疑为细菌感染(均有细菌感染的易感因素及临床表现)的住院新生儿(年龄1d～28d，男420例，女410例，其中早产儿65例，其余为足月儿)830例，该830例新生儿患儿的易感因素及临床表现主要有早产儿、黄疸、肺炎、肠炎、发热、感染性休克等为主。选同期因非感染性疾病住院的新生儿30例标本作为对照。每例抽取静脉血各1～2ml分别送检血培养和细菌16SrRNA荧光定量PCR基因检测。
二、样品检测结果
标准品检测结果见图3。检测的标准曲线见图4。
830例患者血标本荧光定量PCR和血培养检测结果如下：
表3 16SrRNA基因荧光定量PCR(FQ-PCR)与血培养细菌检测结果对照
| 血培养阳性 | 血培养阴性 | 合计 | |
| FQ-PCR阳性FQ-PCR阴性合计 | 20020 | 23787810 | 43787830 |
| X2＝21.043 P＜0.01 | |||
细菌16SrRNA基因荧光定量PCR检测阳性率5.18％(43/830)，血培养阳性率2.41％(20/830)，前者明显高于后者，差异有统计学意义P＜0.01，且血培养阳性的20例标本荧光定量PCR检测均为阳性(表3)。30例非感染性疾病患儿荧光定量PCR检测及细菌培养均为阴性。若以血培养作为对照，细菌荧光定量PCR方法的诊断敏感性为100％，特异性为97.16％，正确诊断指数为0.972。
本实用新型是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本实用新型的上述内容后，本领域技术人员可以对本实用新型作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (1)
1.一种细菌实时荧光定量聚合酶链反应检测试剂盒，其特征是由PCR反应液(1)、标准品(2)、阳性对照品(3)、阴性对照品(4)、抽提裂解液(5)、操作说明书(6)、包装盒体(7)组成，包装盒体(7)设有容器孔，分别放置PCR反应液管(1)、标准品(2)、阳性对照品(3)、阴性对照品(4)、抽提裂解液(5)，PCR反应液(1)由单管分装，矩阵排列。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNU2007201141591U CN201107259Y (zh) | 2007-08-31 | 2007-08-31 | 细菌实时荧光定量聚合酶链反应检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNU2007201141591U CN201107259Y (zh) | 2007-08-31 | 2007-08-31 | 细菌实时荧光定量聚合酶链反应检测试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN201107259Y true CN201107259Y (zh) | 2008-08-27 |
Family
ID=39959068
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNU2007201141591U Expired - Fee Related CN201107259Y (zh) | 2007-08-31 | 2007-08-31 | 细菌实时荧光定量聚合酶链反应检测试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN201107259Y (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20220144506A (ko) * | 2021-04-20 | 2022-10-27 | 전북대학교산학협력단 | 16s rRNA 유전자의 특이서열을 이용한 세균 검출 방법 |
-
2007
- 2007-08-31 CN CNU2007201141591U patent/CN201107259Y/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20220144506A (ko) * | 2021-04-20 | 2022-10-27 | 전북대학교산학협력단 | 16s rRNA 유전자의 특이서열을 이용한 세균 검출 방법 |
| KR102524282B1 (ko) * | 2021-04-20 | 2023-04-24 | 전북대학교산학협력단 | 16s rRNA 유전자의 특이서열을 이용한 세균 검출 방법 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101144775B (zh) | 细菌实时荧光定量聚合酶链反应检测试剂盒 | |
| CN101200765B (zh) | 细菌革兰双检实时荧光定量pcr检测试剂盒及用途 | |
| CN102947467A (zh) | 铜绿假单胞菌血清分型检测方法和试剂盒以及用于该方法和试剂盒的寡核苷酸序列 | |
| Miellet et al. | Streptococcus pneumoniae carriage studies in adults: Importance, challenges, and key issues to consider when using quantitative PCR-based approaches | |
| CN102676664A (zh) | 同时检测多种水产品致病菌的荧光定量pcr引物和探针及检测方法 | |
| CN106434994A (zh) | 一种快速检测绵羊肺炎支原体的方法 | |
| Nandagopal et al. | Evaluation of a nested PCR targeting IS6110 of Mycobacterium tuberculosis for detection of the organism in the leukocyte fraction of blood samples | |
| Yang et al. | The application analysis of multiplex real-time polymerase chain reaction assays for detection of pathogenic bacterium in peritoneal dialysis-associated peritonitis | |
| CN201107259Y (zh) | 细菌实时荧光定量聚合酶链反应检测试剂盒 | |
| Ismail et al. | Routine Use of 16S rRNA Gene Sequencing for Diagnosis of Culture-Negative Bacterial Infections in Body Fluids Other than Blood: Benefits in a Limited Resource Hospital | |
| CN110129459B (zh) | 一种用于检测眼内液中5种革兰氏阳性细菌的lamp引物组合及应用 | |
| CN110157819B (zh) | 一种快速检测畜禽粪便中印第安纳沙门氏菌的lamp试剂盒 | |
| CN101736088A (zh) | 一种鸭感染里默氏杆菌病和大肠杆菌病的快速鉴别诊断方法 | |
| CN111020040A (zh) | 乳制品中致病菌多重荧光定量pcr检测引物组、试剂盒及其应用 | |
| CN111534611A (zh) | 用于检测产毒猪链球菌的荧光定量pcr方法及相应的试剂盒 | |
| CN114196767B (zh) | 特异性分子靶标及其检测金黄色葡萄球菌st型的方法 | |
| CN201156030Y (zh) | 细菌革兰双检实时荧光定量pcr检测试剂盒 | |
| CN114196768B (zh) | 用于鉴别铜绿假单胞菌血清群的特异性分子靶标及其快速检测方法 | |
| CN113373249B (zh) | 用于筛查黄杆菌属的分子靶标及其定量检测方法 | |
| RU2795987C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов и способ выявления ДНК возбудителя бруцеллеза | |
| CN110184371B (zh) | 一种检测皮特不动杆菌的特异性引物及其方法和应用 | |
| Thorat et al. | Molecular characterization of Brucella species detected from clinical samples of cattle and buffaloes | |
| CN110184368B (zh) | 一种检测towneri不动杆菌的特异性引物及方法和应用 | |
| CN102433384A (zh) | 用于检测分枝杆菌的引物和pcr-dhplc试剂盒 | |
| Saurabh et al. | Evaluation of Nested broad-range PCR for Pathogen Detection in Negative Blood Cultures |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20080827 Termination date: 20090930 |