CN103540685B - 荧光定量PCR检测巨细胞病毒gH基因分型试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的一种荧光定量PCR检测巨细胞病毒gH分型的试剂盒，由定量PCR反应液管、gH1型标准品管、gH2型标准品管、阳性对照品管、阴性对照品管、病毒DNA抽提裂解液管、操作说明书、盒体组成，盒体设有容器孔，PCR反应液由单管分装，矩阵排列。本发明运用实时荧光定量PCR技术，采用双特异荧光探针，实现了巨细胞病毒gH基因分型的快速鉴定，有效地解决了以往巢式PCR加限制性内切酶分析（RFLP）鉴定巨细胞病毒gH基因型方法繁琐的问题。为临床上巨细胞病毒gH基因型的分型提供了简便可靠的检测手段及实验依据。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及定量PCR检测试剂盒，具体涉及利用实时荧光定量PCR检测巨细胞病毒的包膜糖蛋白H基因（glycoprotein H, gH）分型的试剂盒。
背景技术
人巨细胞病毒( human cytomegalovirus, HCMV)感染在免疫功能低下人群尤其是幼儿、 AIDS 病人以及器官移植受者中可引起严重疾病, 甚至导致患者死亡。HCMV gH 基因来自ORF UL75,gH 糖蛋白为由742-743个氨基酸组成的单链结构,携带N-糖基,分子量86 KD。gH糖蛋白可以和gL蛋白、gO 蛋白形成gcIII复合体，gcIII复合体进一步表达于受感染的细胞膜表面。gH 糖蛋白表现出了较强的抗原性，也是诱导机体产生免疫应答的主要靶位点。1992年chou等最先提出了HCMV gH 基因 N末端存在核苷酸序列差异, 分析这些位点可将 HCMV临床分离株分为2个基因型（gH1和gH2）。同时，其通过序列比对提出了鉴别两个基因型的方法：利用巢式PCR法经两步PCR扩增出gH 基因两个分型的不同区域（288bp），之后利用Hha Ⅰ进行酶切分析，可以被HhaⅠ切开的为gH1型，不可以被HhaⅠ切开的为gH2型。此方法用于鉴别HCMV gH 基因分型一直被沿用至今。之后多个研究表明gH1分型与gH2分型的巨细胞病毒引起的疾病种类及某些疾病临床的严重程度有差异，可见巨细胞病毒的gH分型对临床疾病的诊治具有重要的指导意义。但此前的鉴别方法须经两步PCR扩增才能得到足够的产物，之后对此产物还需进行纯化回收（液体回收或凝胶电泳后割胶回收），回收后的产物还需利用HhaⅠ进行酶切反应，酶切反应后的产物须凝胶电泳后进行相关DNA条带的分析才能最终确定HCMV的具体gH基因的分型。此方法耗时耗力，且耗费成本，所以巨细胞病毒的gH分型仅停留在实验室的科研中，无法应用于临床常规检测。这就迫使我们寻找更简便快捷，且特异敏感的方法去满足临床检测和鉴定HCMV gH 基因分型的需求，为临床巨细胞病毒感染的诊治提供技术手段。
近几年兴起的荧光PCR技术具有准确性高，重复性好等特点，已广泛用于基因表达研究、病原体检测及基因分型等医学研究领域中。该方法完全闭管检测，避免了交叉污染，且结果判断由计算机完成，简化了操作步骤，加强了结果的可靠性。多种Taqman荧光探针的应用及荧光定量PCR仪的发展，使利用多通道荧光定量PCR仪进行实时巨细胞病毒gH分型的检测及鉴别成为可能。
本发明运用实时荧光PCR技术，采用巨细胞病毒通用引物和gH分型的特异荧光探针，开发研制用于巨细胞病毒gH基因快速分型的试剂盒。并通过对临床上的巨细胞病毒感染患儿的尿液标本，咽拭子标本，痰液标本等标本进行检测分型，旨在为临床上的巨细胞病毒进行快速准确的gH基因型分型的鉴定，同时为临床上不同gH型别的巨细胞病毒感染和疾病发生发展的关系提供实验手段及实验依据。
发明内容
本发明的目的是提供一种实时荧光定量PCR检测巨细胞病毒gH基因分型试剂盒，是一种双探针实时荧光定量PCR检测巨细胞病毒gH基因分型试剂盒，由定量PCR反应液、gH1型标准品、gH2型标准品、阳性对照品、阴性对照品、病毒DNA抽提裂解液、操作说明书、盒体组成，盒体设有容器孔，分别放置PCR反应液管、gH1型标准品管、gH2型标准品管、阳性对照品管、阴性对照品管、病毒DNA抽提裂解液管，定量PCR反应液管装有PCR缓冲液、Mgcl2、dNTPs、巨细胞病毒gH基因通用上游引物，巨细胞病毒gH基因通用下游游引物、荧光探针、Taq DNA聚合酶。其中：
上游引物序列为：5’-TGTTTTCACGCAGGAAGCGG-3’，
下游引物序列为：5’-TGGATCACGCCGCTGAACC-3’，
gH1型探针为：5’-FAM-CATCCGAAGCGCTGGACCCTCACG-BHQ1-3’，
gH2型探针为：5’-HEX-TATCCGAACCGCTGGACAAAGCG-BHQ1-3’。
gH1型标准品序列为：
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gH2型标准品序列为：
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病毒DNA抽提裂解液管装有10mmol/L Tri-HCL,pH 7.6 5mmol/LEDTA,0.5%SDS。
阳性对照品管装有巨细胞病毒AD169株和TOWNE株的灭活DNA样品，阴性对照品管装无菌注射用水。
本发明提供的定量试剂盒保存在-20℃，尽量减少反复冻融。
本发明试剂盒是将Taqman探针引入到HCMV的gH 基因分型中，在gH 基因两端的保守区设计引物，在gH 基因的分型位置设计两种探针，一种探针识别gH1分型的序列，另一种探针识别gH2分型。在一个反应管中，利用荧光定量PCR技术快速鉴定HCMV的gH 基因分型。通过对gH1型标准株AD169，gH2型标准株TOWNE及中国地区HCMV临床株的gH基因的序列进行分析，我们在gH1型和gH2型共同的两端保守区内设计了一对PCR的引物序列为：F 5’-TGTTTTCACGCAGGAAGCGG-3’，R 5’-TGGATCACGCCGCTGAACC-3’。在gH1型标准株及临床株的保守区而与gH2型不同的区域设计探针用于识别gH1型基因型的巨细胞病毒，其序列为5’-CATCCGAAGCGCTGGACCCTCACG-3’，其5’端用荧光基团FAM标记，3’端用猝灭基团BHQ1标记。在gH2型标准株及临床株的保守区而与gH1型不同的区域设计探针用于识别gH2型基因型的巨细胞病毒，其序列为5’-TATCCGAACCGCTGGACAAAGCG-3’，其5’端用荧光基团HEX标记，3’端用猝灭基团BHQ1标记。
本发明试剂盒使用方法：
每次检测均应设立阳性对照和阴性对照，标准品用无菌去离子水稀释为1×102-1×109拷贝/ml。
（1）HCMV病毒DNA提取：取巨细胞病毒感染儿童的尿液1mL于EP管中，12000r/min离心5min，弃去上清，加入40μL病毒DNA抽提裂解液,置于100℃煮沸10min，12000r/min离心5min，取5μl上清作为PCR模板。血清，脑脊液标本方法同上。
（2）扩增检测： 在双色或以上的荧光定量PCR仪上进行， PCR体系 共50μL，其中PCR定量反应液45μL，检测样品（提取产物，标准品，阳性对照，阴性对照）5μL。具体反应程序为94℃ 2min；循环中94℃ 15s，60℃ 45s，循环中的最后一步分别采集FAM通道荧光和VIC通道荧光，共循环40次。
（3）荧光定量结果分析：
a.双探针CT值均等于40，则为HCMV阴性标本；
b.gH1探针或gH2探针其中之一CT≤35，判定为相应的gH分型；
c.gH1探针和gH2探针CT值均≤35，则判定为混合分型；
d.CT值在35和40之间的，重做之后大于37的为阴性。
根据所获得的标准曲线，计算各待测样本的HCMV的滴度（拷贝数/ml）。
本发明的另一个目的是提供的双探针实时荧光PCR检测巨细胞病毒gH基因分型试剂盒在鉴别巨细胞病毒gH基因分型中的应用。
本发明运用实时荧光定量PCR技术，采用HCMV通用引物和gH1型和gH2型双特异荧光探针，开发研制出用于巨细胞病毒gH基因型分型的检测试剂盒。该发明利用荧光定量PCR技术，设计了gH基因型分型的特异探针，比传统的巢式PCR结合酶切鉴定的方法更加简便，快速和准确。为临床上巨细胞病毒gH分型的鉴定提供可靠的实验手段。
附图说明
图1是试剂盒结构示意图。
图2是标本检测结果图。
图3是标本分型后产物的测序图。
具体实施方式
本发明结合附图和具体实施例做进一步说明。应该理解，实施例仅用于说明目的，而不用于限制该发明的范围。
实施例1
参见图1, 一种实时荧光定量PCR检测巨细胞病毒gH基因分型试剂盒，由定量PCR反应液管1、gH1型标准品管2、gH2型标准品管3、阳性对照品管4、阴性对照品管5、病毒DNA抽提裂解液管6、操作说明书7、盒体8组成，盒体8设有容器孔，分别放置PCR反应液管1、gH1型标准品管2、gH2型标准品管3、阳性对照品管4、阴性对照品管5、病毒DNA抽提裂解液管6，PCR反应液由单管分装，矩阵排列，其中定量PCR反应液管1装有PCR缓冲液、Mgcl2、dNTPs、巨细胞病毒gH基因通用上游引物、巨细胞病毒gH基因通用下游游引物、荧光探针、Taq DNA聚合酶。其中：
上游引物序列为：5’-TGTTTTCACGCAGGAAGCGG-3’，
下游引物序列为：5’-TGGATCACGCCGCTGAACC-3’，
gH1型探针为：5’-FAM-CATCCGAAGCGCTGGACCCTCACG-BHQ1-3’，
gH2型探针为：5’-HEX-TATCCGAACCGCTGGACAAAGCG-BHQ1-3’。
gH1型标准品序列为：
tgttttcacgcaggaagcggatgggtctcccgtaggtgttgagtagtaggtgaaatgcgtgagggtccagcgcttcggatgcggcgtccgcgccatatcgttgcgaaggtaggtgactgaggaggtagacggtgaagacagtgaggtagggggggaggccgggccgcatagcgcggctgcgccgctgggttcagcggcgtgatcca。
gH2型标准品序列为：
tgttttcacgcaggaagcggatgggtctcccgtaggtgttgagcagtaggtgaaacgctttgtccagcggttcggatatggcttctgcgccatatcgtgacgaaagtaggtggctgaggagacagacggcgaggacgatgaggtaggaggggaggcctggccgcatagcgcggccgcgccgctgggttcagcggcgtgatcca。
病毒DNA抽提裂解液管6装有10mmol/L Tri-HCL,pH 7.6 5mmol/LEDTA,0.5%SDS。
阳性对照品管4装巨细胞病毒AD169株和TOWNE株的灭活DNA样品，阴性对照品管5装为无菌注射用水。本发明提供的定量试剂保存在-20℃，尽量减少反复冻融。
实施例2 双探针实时荧光定量PCR法检测gH1型标准株AD169和gH2型标准株TOWNE
一．材料： 标准株AD169(gH1)及TOWNE(gH2)均为本实验室保存。
二．引物和探针的设计与合成
从Genbank中调取AD169及TOWNE株的gH的基因序列，应用MegAlign软件分析其基因序列，在两gH分型病毒的保守区设计上下游引物，在两种病毒的不同区域（分型区）设计特异性的探针。
上游引物序列为：5’-TGTTTTCACGCAGGAAGCGG-3’
下游引物序列为：5’-TGGATCACGCCGCTGAACC-3’
gH1型探针为：5’-FAM-CATCCGAAGCGCTGGACCCTCACG-BHQ1-3’
gH2型探针为：5’-HEX-TATCCGAACCGCTGGACAAAGCG-BHQ1-3’
引物及探针均有大连宝生物技术公司合成。
三 标准株DNA的抽提
取标准株病毒上清液1mL于EP管中，12000r/min离心5min，弃去上清，加入40μL病毒DNA抽提裂解液置于100℃煮沸10min，12000r/min离心5min，取5μL上清作为PCR模板。
四 标准株的实时荧光PCR实验
对上述两种标准株AD169及TOWNE进行单管gH分型的荧光PCR检测，结果表明AD169株gH1型探针为阳性，gH2型探针为阴性。TOWNE株gH2型探针为阳性，gH1型探针为阴性。我们设计的分型探针无任何交叉信号出现，具有很高的特异性。具体CT值参见表1。
实施例3 双探针荧光定量PCR检测临床病毒株gH分型的应用
一 标本检测：
选取2013年3月1日-8月31日内的巨细胞病毒感染患儿的尿液标本88例，及30例未感染巨细胞病毒儿童的尿液为对照。每例取尿液1ml进行gH双探针分型的实时荧光定量PCR检测。
二 临床标本检测结果：
30例未感染巨细胞病毒儿童的尿液标本均未检测到荧光信号，巨细胞病毒感染为阴性。88例巨细胞病毒感染儿童的尿液标本均为巨细胞病毒感染阳性，其中为gH1型巨细胞病毒感染61例，gH2型巨细胞病毒感染26例，gH1型和gH2型混合感染1例。其中临床标本的gH分型的PCR扩增曲线参照图2。为了进一步验证结果的可靠性，我们随机选取了14例标本扩增后的产物进行了测序，结果证明产物均为对应分型的巨细胞病毒的gH基因（10例gH1型HCMV，4例gH2型HCMV），结果参照图3。双探针实时荧光定量PCR鉴别巨细胞病毒gH基因分型试剂盒不仅可以快速检测出巨细胞病毒感染的阳性标本，也可以对巨细胞病毒gH基因进行准确的分型。
本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 荧光定量PCR检测巨细胞病毒gH基因分型试剂盒及应用
<160> 6
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>巨细胞病毒gH基因上游通用引物
<400> 1
TGTTTTCACGCAGGAAGCGG 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>巨细胞病毒gH基因下游通用引物
<400> 2
TGGATCACGCCGCTGAACC 19
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gH1型巨细胞病毒分型探针
<400> 3
CATCCGAAGCGCTGGACCCTCACG 24
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gH2型巨细胞病毒分型探针
<400> 4
TATCCGAACCGCTGGACAAAGCG 23
<210> 5
<211> 206
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 根据巨细胞病毒gH基因序列设计的gH1型荧光定量检测的标准品
<400> 5
tgttttcacgcaggaagcggatgggtctcccgtaggtgttgagtagtaggtgaaatgcgtgagggtccagcgcttcggatgcggcgtccgcgccatatcgttgcgaaggtaggtgactgaggaggtagacggtgaagacagtgaggtagggggggaggccgggccgcatagcgcggctgcgccgctgggttcagcggcgtgatcca 206
<210> 6
<211> 203
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 根据巨细胞病毒gH基因序列设计的gH2型荧光定量检测的标准品
<400> 6
tgttttcacgcaggaagcggatgggtctcccgtaggtgttgagcagtaggtgaaacgctttgtccagcggttcggatatggcttctgcgccatatcgtgacgaaagtaggtggctgaggagacagacggcgaggacgatgaggtaggaggggaggcctggccgcatagcgcggccgcgccgctgggttcagcggcgtgatcca 203
Claims (3)
1.一种荧光定量PCR检测巨细胞病毒gH基因分型试剂盒，由定量PCR反应液管（1）、gH1型标准品管（2）、gH2型标准品管（3）、阳性对照品管（4）、阴性对照品管（5）、病毒DNA抽提裂解液管（6）、操作说明书（7）、盒体组成（8）组成，盒体(8)设有容器孔，分别放置PCR反应液管（1）、gH1型标准品管（2）、gH2型标准品管（3）、阳性对照品管（4）、阴性对照品管（5）、病毒DNA抽提裂解液管（6），定量PCR反应液管（1）由单管分装，矩阵排列，定量PCR反应液管（1）装有PCR缓冲液，MgCl2，dNTPs，巨细胞病毒gH基因通用上游引物，巨细胞病毒gH基因通用下游引物，荧光探针，Taq DNA聚合酶；其特征在于，
上游引物序列为：5’-TGTTTTCACGCAGGAAGCGG-3’，
下游引物序列为：5’-TGGATCACGCCGCTGAACC-3’，
gH1型探针为：5’-FAM-CATCCGAAGCGCTGGACCCTCACG-BHQ1-3’，
gH2型探针为：5’-HEX-TATCCGAACCGCTGGACAAAGCG-BHQ1-3’；
gH1型标准品序列为：
tgttttcacgcaggaagcggatgggtctcccgtaggtgttgagtagtaggtgaaatgcgtgagggtccagcgcttcggatgcggcgtccgcgccatatcgttgcgaaggtaggtgactgaggaggtagacggtgaagacagtgaggtagggggggaggccgggccgcatagcgcggctgcgccgctgggttcagcggcgtgatcca；
gH2型标准品序列为：
tgttttcacgcaggaagcggatgggtctcccgtaggtgttgagcagtaggtgaaacgctttgtccagcggttcggatatggcttctgcgccatatcgtgacgaaagtaggtggctgaggagacagacggcgaggacgatgaggtaggaggggaggcctggccgcatagcgcggccgcgccgctgggttcagcggcgtgatcca；
病毒DNA抽提裂解液管（6）装有10mmol/L Tri-HCL,pH 7.6 5mmol/LEDTA,0.5%SDS。
2.根据权利要求1所述的一种荧光定量PCR检测巨细胞病毒gH基因分型试剂盒，其特征在于，阳性对照品管（4）装有巨细胞病毒AD169株和TOWNE株的灭活DNA样品，阴性对照品管（5）装有无菌注射用水。
3.根据权利要求1所述一种荧光定量PCR检测巨细胞病毒gH基因分型试剂盒，其特征在于，试剂盒保存在-20℃，避免反复冻融。
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| Rapid Genotyping of Cytomegalovirus in Dried Blood Spots by Multiplex Real-Time PCR Assays Targeting the Envelope Glycoprotein gB and gH Genes;Jutte J. C. de Vries等;《Journal of Clinical Microbiology》;20120229;第50卷(第2期);232-237 * |
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