CN102876814B - 一种检测口蹄疫病毒的实时荧光rt-hda试剂盒及引物 - Google Patents
一种检测口蹄疫病毒的实时荧光rt-hda试剂盒及引物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测口蹄疫病毒的实时荧光RT-HDA试剂盒及引物。一组检测口蹄疫病毒的引物，为序列表SEQ ID No：1和序列表SEQ ID No：2所示的寡核苷酸序列。本发明的优点是：首次将新型恒温扩增技术HDA应用于口蹄疫病毒的检测中，与FMDV现有的检测方法相比：①HDA检测方法更快、更便捷，安全可靠。传统的病毒分离和血清学方法耗时较长，且存在生物安全危险性；HDA方法模仿体内天然的复制机制，安全性高，且反应快速，最多仅需2h即可完成检测；②与荧光PCR相比，程序设定更简单，不需要摸索退火温度等反应条件，从技术层面上讲更便于掌握和操作。且通过反应条件的优化，实时荧光RT-HDA方法最低可检测至10个拷贝/反应的病毒核酸。这项技术在口蹄疫病毒的监控和诊断中都具有极大的应用前景，是一种极具推广应用价值的诊断工具。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测口蹄疫病毒的实时荧光RT-HDA试剂盒及引物，属于检验检疫领域。
背景技术
口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth diseasevirus，FMDV）引起的急性热性高度接触性传染病，主要感染偶蹄兽，患病动物的口、舌、唇、蹄、乳房等部位发生水泡，破溃形成烂斑。人和非偶蹄动物也可感染本病，但症状较轻。由于猪、牛、羊等主要的家畜均可感染此病，并能形成全球大规模流行，所以世界动物卫生组织（OIE）和联合国粮农组织（FAO）将该病列为A类动物传染病。在我国，口蹄疫被列为一类动物传染病。历史上口蹄疫的暴发给世界畜牧业生产造成巨大的经济损失，也严重的影响了社会政治、经济的稳定发展，是名副其实的“世界政治经济病”。口蹄疫在世界的分布也很广，可在国际间相互传播形成世界范围内的大流行。至今几乎世界上所有的国家或地区历史上都曾经发生过口蹄疫。在17～19世纪，欧洲大陆曾多次发生和广泛流行本病。到20世纪80年代，大洋洲、北美洲已无口蹄疫疫情，欧洲国家的疫情也大大减少，而亚洲、非洲和南美洲各国则是口蹄疫的重疫区。近年来，口蹄疫在世界上主要流行于亚洲，其次是非洲、南美洲和欧洲。口蹄疫在我国流行历史由来已久，其特点是在一定地区一定时间接连不断发生。而且我国毗邻的很多周边国家和地区多为口蹄疫流行疫区，疫病呈周期性暴发，且反复不断。这些因素对我国造成严重威胁，发生口蹄疫大流行的可能性非常大。历年来我国政府和地方各防疫机构都非常关注口蹄疫的疫情动态，并高度重视口蹄疫的防制工作。随着加入WTO，我国从其他国家进口牛肉和猪肉等产品的批次和数量都急剧上升，所有这些都要求我们能够提高检验检疫技术水平，力促外贸工作的顺利进行并保证人畜及生产的安全。
口蹄疫病毒具有型多易变的特点，目前有7个血清主型，分别为O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和亚洲Ⅰ型。每一主型又分若干亚型，迄今为止已发现的亚型有65个，且仍可能在不同的地区出现新的变异株和新的亚型。我国口蹄疫的病毒型主要为O、A型和亚洲Ⅰ型。动物感染一种血清型的病毒后，不产生对其他型的免疫力，但同型的亚型之间有部分的交叉反应。目前口蹄疫的检测技术主要有病毒分离技术（包括细胞培养和动物接种两种方法）、血清学检测技术（包括病毒中和试验、间接血凝试验、乳胶凝集试验、免疫扩散试验、酶联免疫吸附试验、免疫荧光抗体试验、免疫荧光电子显微镜技术等）和分子生物学技术（包括聚合酶链式反应、核酸探针、核酸序列分析、电聚焦寡核苷酸指纹图谱法、基因芯片技术等）。实际检测中，对肉类食品中低含量的FMD病毒、隐性感染或持续带毒宿主进行检测的方法必须具备高敏感性、高特异性和高准确性，但传统的诊断方法不能满足这一要求。常规的PCR技术虽然提高了检测的灵敏度和特异性，但也有费时、易污染、扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等缺点。近几年发展起来的实时荧光定量RT-PCR将PCR与荧光检测相结合，具有操作简便、结果直观、敏感性高、特异性强、重复性好等优点，已逐渐成为病原体检测的重要方法。但是，荧光PCR仪造价不菲，仪器和试剂检测成本过高使得这一检测技术始终局限于条件比较好的实验室中，难以在基层推广应用。
近年来，分子诊断技术日新月异，产生了多种新型分子扩增技术，推动着分子诊断技术向操作简单、仪器要求不高的方向发展。其中，依赖解旋酶恒温基因扩增技术（Helicase-Dependent Isothermal Amplification，HDA）是2004年BioHelix的研究人员模拟动物体内DNA的复制机制发明的一种新的体外恒温扩增技术。该技术利用DNA双链解旋酶打开双链DNA，同时在单链结合蛋白（SSB）和DNA聚合酶的作用下，扩增靶片段，实现目的基因的体外扩增。此外，实时荧光定量检测病原技术是近些年来应用越来越广泛的一种检测方法。使用SyberGreen荧光染料，结合溶解曲线的分析，可对荧光PCR进行实时定量检测。若将荧光定量方法与HDA技术结合，建立实时荧光RT-HDA方法，则能将两种技术的优势发挥至最大。
实时荧光RT-HDA技术的优势：
1.HDA技术与普通PCR技术相比，具有很多优势。HDA技术的引物设计比较简单易学，由于是恒温扩增技术，不论检测何种病原均可使用同一种反应温度，因此，即可在同一条件下分管同时检测不同的病原，也可建立多重HDA方法同时检测多种病原，不需要特意将不同扩增片段的退火温度设计成一样。此外，由于体系中使用了耐高温的BstDNA扩增酶，使得HDA技术具有更高的特异性和敏感性。HDA技术与其他恒温扩增技术相比，是一种真正的恒温扩增方法，完全不需95℃变性，因而，该技术不需要PCR仪，操作简单方便，非常适合基层检测和现场快速诊断。
2.本发明使用EvaGreen作为实时定量HDA方法中的DNA结合染料。EvaGreen是一种可结合于双链DNA小沟中的荧光染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强，这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。该染料的诸多优点使它远胜于目前常用的SYBRGreen Ⅰ。除了有相似的光谱特性，EvaGreen有三个主要特点使它区别于SYBRGreen Ⅰ：①EvaGreen对PCR的抑制性远小于SYBRGreen Ⅰ，因此，使用EvaGreen进行的qPCR实验可以使用快速PCR步骤。同时，EvaGreen在实验中可以使用较高的浓度，从而获得远强于SYBRGreen Ⅰ的扩增信号。较高浓度的EvaGreen也消除了“染料重分布”的缺陷，使EvaGreen既可用于多重PCR，也可用于高分辨率（高清晰）熔解曲线分析（HRM）。②EvaGreen的稳定性极强。在正常的储存、操作和PCR过程中不会被破坏。在缓冲溶液中的染料可以安全的储存在室温或冰箱里，也可以反复冻融。与之相反，SYBRGreen Ⅰ不稳定而且降解后对PCR的抑制性更强。③EvaGreen降低了细胞膜透性，因而比SYBRGreen Ⅰ更加安全。独立实验室的测试结果显示，EvaGreen既没有诱变性也没有细胞毒性，更符合生物安全要求。
3.将EvaGreen荧光染料加入HDA反应体系，建立实时荧光HDA技术，利用S型扩增曲线结合溶解曲线分析，可对特定病原核酸进行检测。实时荧光HDA的反应程序设定简单、操作方便快捷，不仅进一步提高原有HDA方法的灵敏度，还能对检测过程进行实时监测，可在更短的时间内得知样本的检测结果。使用标准品建立标准曲线，还可对样品进行定量检测。
总之，与同类新型PCR技术相比，实时荧光HDA技术更简单高效，具有灵敏度高、特异性强、快速诊断、高通量、操作简单、重复性好、自动化程度高、易标准化操作和试验的生物安全性高等突出优点，灵敏度比普通PCR灵敏度高100倍以上，能够最大限度的避免交叉污染，是一种崭新的基因扩增方法，极具应用价值和市场前景。目前，国际上对于实时荧光HDA技术的研究尚处于起步阶段，国内外还没有关于实时荧光HDA检测动物病毒的研究。我们将首次建立起快速检测口蹄疫病毒的实时荧光HDA技术。该项研究成果将成为动物疫病分子诊断领域的突破性技术，是动物流感检疫技术体系的进一步完善和发展。HDA技术的建立将真正实现简单、便捷的临床和实验室诊断，适用于基层检疫，可全面提升口岸检疫的检测能力，缩短检疫时间，真正实现高通量检测，为我国口蹄疫的有效防制作出重大贡献。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一组作为引物使用的、检测口蹄疫病毒的寡核苷酸序列。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种特异、灵敏、高效的检测口蹄疫病毒的试剂盒。
为解决第一个技术问题，本发明采用以下技术方案：
一组检测口蹄疫病毒的引物，为序列表SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的寡核苷酸序列，详见表1。
表1.引物序列
| 名称 | 序列（5’-3’） | 序列表编号 |
| 引物I | ATCTATGCAGGTAGCCCCAACTGACAC | SEQ ID No.1 |
| 引物II | TGTCACCCCTCTAGACCTGGAAAGACC | SEQ ID No.2 |
注：胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）、腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）。
其中序列引物I和引物II分别为检测口蹄疫病毒的正义引物和反义引物。
为解决第二个技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种检测口蹄疫病毒的实时荧光RT-HDA试剂盒，保存于-20℃，由以下试剂组成：
（1）TriZol裂解液；
（2）RT-HDA反应液，其包括：1×HDA缓冲液、3.5mM MgSO4、40mM NaCl、0.21mM dNTP、100nM引物I、100nM引物II；
其中，1×HDA缓冲液由10×HDA缓冲液稀释制备而成，所述10×HDA缓冲液包括10mmol/L KCl、20mmol/L Tris-Cl（pH 8.8，25℃）；引物I的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，引物II的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；
（3）酶混合物，其包括：DNA解旋酶、Bst DNA扩增酶和反转录酶，其中，所述DNA解旋酶10μg，Bst DNA扩增酶1000U，反转录酶优选为ThermoScript反转录酶，100U；
（4）荧光染料：包括EvaGreen Dye和Rox Reference Dye；
（5）无RNA酶的灭菌纯化水；
（6）阴性对照：无核酸灭菌水；
（7）阳性对照：为体外转录的非感染性RNA片段。回收亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒Asia1/1/YZ/CHA/06株5’UTR基因的RT-PCR扩增产物，长度为1094bp，与pMD-T20载体（购自TAKARA公司）进行连接，转化TOP10感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒，命名为pMD-T20-FMDV-5U。以纯化的质粒为模板，将质粒线性化之后，用Promega公司的Ribo MAXTM Large ScaleRNA Production System-SP6试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNase除去其中的DNA模板再经TRIZOL提取RNA进行测定后，即得到制备口蹄疫病毒阳性对照品所需的RNA阳性对照品母液；
口蹄疫病毒亚洲Ⅰ型Asia1/1/YZ/CHA/06株5’UTR基因片段如序列表中SEQ IDNO：3所示。
本发明还提供了一种检测口蹄疫病毒的实时荧光RT-HDA方法，包括如下步骤：
1）提取样品RNA；
2）对提取的样品RNA进行实时荧光RT-HDA扩增：
引物序列为①5’-ATCTATGCAGGTAGCCCCAACTGACAC-3’
②5’-TGTCACCCCTCTAGACCTGGAAAGACC-3’
反应条件：
第一步：66℃，5s；65℃，1min55s（收集荧光）；40～60个循环；
第二步：溶解曲线分析，使用荧光PCR仪默认程序。
3）结果分析条件设定，读取检测结果。
阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。
①质控标准，阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。
②阳性对照的Ct值应≤35.0，并出现特定的S型扩增曲线，且溶解曲线出现单一峰值，并且单一峰在退火温度附近。如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。
③结果描述及判定
阳性：Ct值≤35.0，并出现特定的S型扩增曲线，且溶解曲线出现单一峰值，并且单一峰在退火温度附近，表示样本中存在口蹄疫病毒；
阴性：无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无口蹄疫病毒。
本发明中发明人以实时荧光RT-HDA对模板进行检测，验证了该方法的特异性。
本发明以通过对阳性对照提取RNA进行系列稀释的模板检测，开展了敏感性实验。实验结果显示，最低可以检测到10拷贝/反应的RNA模板量，具有较高的灵敏度。
用该方法对实验室采集保存的20份牛场OP液、10份可疑组织病料和2份口蹄疫病毒培养液进行检测。实验结果表明，该方法是一种特异、灵敏、高效的检测方法。这项技术在口蹄疫病毒的监控和诊断中都具有极大的应用前景，尤其对于基层养殖场或者实验条件不能满足检验检疫要求的地区或实验室。
本发明的优点是：首次将新型恒温扩增技术结合荧光染料方法建立的实时荧光RT-HDA应用于口蹄疫病毒的检测中，与FMDV现有的检测方法相比：①HDA检测方法更快、更便捷，安全可靠。传统的病毒分离和血清学方法耗时较长，且存在生物安全危险性；HDA方法模仿体内天然的复制机制，安全性高，且反应快速，最多仅需2h即可完成检测；②与荧光PCR相比，程序设定更简单，不需要摸索退火温度等反应条件，从技术层面上讲更便于掌握和操作。且通过反应条件的优化，实时荧光RT-HDA方法最低可检测至10个拷贝/反应的病毒核酸。该方法还对实验室采集保存的20份牛场OP液、10份可疑组织病料和2份口蹄疫病毒培养液进行检测，实验结果表明，FMDV实时荧光RT-HDA方法是一种特异、灵敏、高效的检测方法。这项技术在口蹄疫病毒的监控和诊断中都具有极大的应用前景，是一种极具推广应用价值的诊断工具。
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
附图说明
图1为FMDV实时荧光RT-HDA反应体系优化后，得到的扩增曲线图1A和溶解曲线分析图1B；其中，1：阳性对照；2：阴性对照；
图2为检测口蹄疫病毒的实时荧光RT-HDA检测试剂盒的特异性试验结果；其中，图2A为扩增曲线图，图2B为溶解曲线分析图；1：口蹄疫病毒亚洲Ⅰ型；2：口蹄疫病毒O型；3：蓝舌病病毒核酸；4：牛病毒性腹泻/粘膜病病毒核酸；5：牛鸡传染性鼻气管炎病毒；6：阴性对照；
图3为检测口蹄疫病毒的实时荧光RT-HDA检测试剂盒的灵敏性检测结果；其中，图3A为扩增曲线图，图3B为溶解曲线分析图；1～8：108-1.0拷贝/微升（依次作10倍梯度稀释）9：阴性对照。
具体实施方式
本发明所用口蹄疫病毒亚洲Ⅰ型、口蹄疫病毒O型、牛病毒性腹泻/粘膜病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和蓝舌病病毒，均为北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心保存。
实施例1：HDA引物的设计与合成
根据Genbank中登录的口蹄疫病毒基因序列，用DNAMAN软件进行比对分析，选择FMDV-5’UTR基因高度保守的区域，使用在线软件Primer3（http://frodo.wi.mit.edu/）进行引物设计，并结合Oligo6.0软件对引物进行分析评价，设计出针对口蹄疫病毒的通用型引物。引物序列同表1。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。
实施例2：口蹄疫病毒RNA的提取
使用RNA提取试剂提取口蹄疫病毒RNA。
具体操作如下：
①取n个1.5mL灭菌Eppendorf管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。
②每管加入600μL TRIZOL裂解液，然后分别加入待测样本、阴性对照和阳性对照各200μL，一份样本换用一个吸头；再加入200μL三氯甲烷，混匀器上震荡混匀5s。于4℃条件下，12000r/min离心15min。
③取与①中相同数量的1.5mL灭菌Eppendorf管，加入500μL异丙醇（-20℃预冷），对每个管进行编号。吸取5.3.2离心后各管中的上清液转移至相应的管中，上清液至少吸取500μL，注意不要吸出中间层，颠倒混匀。
④于4℃条件下，12000r/min离心15min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。加入600μL 75%乙醇，颠倒洗涤。
⑤于4℃条件下，12000r/min离心10min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。
⑥4000r/min离心10s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥3min。不宜过于干燥，以免RNA不溶。
⑦加入11μL DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增或放置于-70℃冰箱备用。
实施例3：实时荧光RT-HDA的建立
一、对引物浓度、MgSO4浓度和NaCl浓度分别进行了优化，建立了实时荧光RT-HDA的反应体系。
按照实施例2方法获得口蹄疫病毒RNA，模板浓度约为104拷贝/微升，进行实时荧光RT-HDA，优化反应体系。对各成分的优化范围见表2，反应体系见表3，所用引物序列见表1。
表2 FMDV RT-HDA反应体系中各成分的优化范围
| 成分名称 | 浓度范围 | 递增间隔 |
| 引物Ⅰ和引物Ⅱ（均为5μΜ） | 50～200nM | 25nM |
| MgSO4（100mM） | 3.0～4.5mM | 0.5mM |
| NaCl（500mM） | 20～50mM | 5mM |
表3 FMDV RT-HDA反应体系的优化
二、结果：
经过多次试验最终引物浓度确定为100nM；MgSO4浓度确定为3.5mM；NaCl浓度为40mM。
图1为实时荧光RT-HDA反应体系优化后，得到的口蹄疫病毒特异性扩增曲线和溶解曲线。
实施例4：一种检测口蹄疫病毒的实时荧光RT-HDA试剂盒及其使用
一、试剂盒的组成（保存于-20℃）
（1）TriZol裂解液：15ml/瓶×2；购自INVITROGEN公司
（2）RT-HDA反应液，750μL×1管，包括：1×HDA缓冲液、3.5mM MgSO4、40mMNaCl、0.21mM dNTP、100nM引物I、100nM引物II；
其中，1×HDA缓冲液由10×HDA缓冲液稀释制备而成，所述10×HDA缓冲液包括10mmol/L KCl、20mmol/L Tris-Cl（pH 8.8，25℃）；引物I的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，引物II的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；
（3）酶混合物，其包括：DNA解旋酶10μg，Bst DNA扩增酶1000U，反转录酶ThermoScript 100U；均购自New England Biolabs公司；
（4）荧光染料：EvaGreen Dye，购自Biotium公司；Rox Reference Dye，购自INVITROGEN公司；
（5）无RNA酶的灭菌纯化水，1mL×1管；
（6）阴性对照：1mL×1管：无核酸灭菌水；
（7）阳性对照：1mL×1管；为体外转录的非感染性RNA片段。回收亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒Asia1/1/YZ/CHA/06株5’UTR基因的RT-PCR扩增产物，长度为1094bp，与pMD-T20载体（购自TAKARA公司）进行连接，转化TOP10感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒，命名为pMD-T20-FMDV-5U。以纯化的质粒为模板，将质粒线性化之后，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System-SP6试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNase除去其中的DNA模板再经TRIZOL提取RNA进行测定后，即得到制备口蹄疫病毒阳性对照品所需的RNA阳性对照品母液。口蹄疫病毒株Asia1/1/YZ/CHA/06株5’UTR基因片段如序列表中SEQ ID NO：3所示。
二、试剂盒的使用
（1）提取样品的RNA，即模板RNA具体操作如下：
①取n个1.5mL灭菌Eppendorf管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。
②每管加入600μL TRIZOL裂解液，然后分别加入待测样本、阴性对照和阳性对照各200μL，一份样本换用一个吸头；再加入200μL三氯甲烷，混匀器上震荡混匀5s。于4℃条件下，12000r/min离心15min。
③取与①中相同数量的1.5mL灭菌Eppendorf管，加入500μL异丙醇（-20℃预冷），对每个管进行编号。吸取5.3.2离心后各管中的上清液转移至相应的管中，上清液至少吸取500μL，注意不要吸出中间层，颠倒混匀。
④于4℃条件下，12 000r/min离心15min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。加入600μL 75%乙醇，颠倒洗涤。
⑤于4℃条件下，12 000r/min离心10min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。
⑥4 000r/min离心10s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥3min。不宜过于干燥，以免RNA不溶。
⑦加入11μL DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2 000r/min离心5s，冰上保存备用。提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增或放置于-70℃冰箱备用。
（2）进行实时荧光RT-HDA反应，最适反应体系如表4：
表4 FMDV RT-HDA最佳反应体系
| RT-HDA各成分 | 需加入的体积 |
| 引物Ⅰ(5μΜ) | 1.0μl |
| 引物Ⅱ(5μM) | 1.0μl |
| 10×HAD缓冲液 | 5.0μl |
| MgSO4（100mM） | 1.75μl |
| NaCl（500mM） | 4.0μl |
| dNTP（3.0mM） | 3.5μl |
| 酶混合物 | 3.5μl |
| EvaGreen Dye（20×） | 0.5μl |
| ROX Reference Dye（50×） | 1.0μl |
| RNA模板 | 5.0μl |
| 补充DEPC水 | 总体积50μl |
（3）反应条件：
第一步：66℃，5s；65℃，1min55s（收集荧光）；40～60个循环；
第二步：溶解曲线分析，使用荧光PCR仪默认程序。
（4）结果描述及判定
阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。
①质控标准，阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。
②阳性对照的Ct值应≤35.0，并出现特定的S型扩增曲线，且溶解曲线出现单一峰值，并且单一峰在退火温度附近。如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。
③结果描述及判定
阳性：Ct值≤35.0，并出现特定的S型扩增曲线，且溶解曲线出现单一峰值，并且单一峰在退火温度附近，表示样本中存在口蹄疫病毒；
阴性：无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无口蹄疫病毒。
实施例5：一种检测口蹄疫病毒的实时荧光RT-HDA试剂盒的特异性试验
一、方法
提取亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒、O型口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒/粘膜病病毒、蓝舌病病毒和牛传染性鼻气管炎病毒（见表5）的RNA或DNA做为模板，用实施例4所建立的试剂盒和方法对提取的RNA进行荧光RT-HDA检测，以确定检测试剂盒的特异性。
表5 方法研究过程中应用到的毒株
| 病毒 | 来源 |
| 口蹄疫病毒type O | 本实验室保存 |
| 口蹄疫病毒type Aisa Ⅰ | 本实验室保存 |
| 牛病毒性腹泻病毒/粘膜病病毒 | 本实验室保存 |
| 牛传染性鼻气管炎病毒 | 本实验室保存 |
| 蓝舌病病毒 | 本实验室保存 |
二.结果
结果见图2。结果显示2株口蹄疫病毒均出现了特征性的扩增曲线和溶解曲线，其他3种反刍动物常见病毒结果均为阴性。由此证明实时荧光FMDV RT-HDA有较强的特异性。
实施例6：一种检测口蹄疫病毒的实时荧光RT-HDA试剂盒的敏感性试验
一.方法：
用实施例4所建立的试剂盒和方法对实施例4所述的阳性标准品进行实时荧光RT-HDA检测，以确定反应的灵敏度。提取阳性标准品RNA并稀释后，得到的RNA浓度分别为108，107，106，105，104，103，102，10，1.0拷贝/微升的溶液。
二.结果
对稀释的阳性标准品（108-1.0拷贝/微升）进行实时荧光RT-HDA检测，结果如图3所示。结果表明，实时荧光RT-HDA对系列梯度稀释的阳性标准品（从左至右分别为108-1.0拷贝/反应对应的结果）进行检测，在模板浓度为10拷贝/反应时，有特异性的扩增曲线和溶解曲线，1拷贝/反应的模板浓度时无扩增曲线和溶解曲线。故实时荧光RT-HDA对口蹄疫病毒最低可检测至10拷贝/反应。
实施例7：临床样品的检测
一.方法
参照国家标准GB/T 22915-2008《口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测方法》对实验室保存的临床样品进行检测。同时对采集的临床样品参照实例4的方法进行实时荧光RT-HDA检测。
二.结果
表6 使用RT-HDA和国标荧光RT-PCR方法对临床样本的检测结果汇总
实验结果表明，FMDV实时荧光RT-HDA方法是一种特异、灵敏、高效的检测方法。这项技术在临床疫病的监控和诊断中都具有极大的应用前景，尤其对于基层养殖场或者设备条件不能满足检验检疫要求的地区或实验室，是一种极具推广应用价值的诊断工具。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (4)
1.一组检测口蹄疫病毒的引物，其特征在于，该引物序列如序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：2所示，其中SEQ ID NO：1为检测口蹄疫病毒的引物I，SEQ ID NO：2为检测口蹄疫病毒的引物II。
2.一种检测口蹄疫病毒的实时荧光RT-HDA试剂盒，其特征在于，由以下组分组成：
（1）TriZol裂解液；
（2）RT-HDA反应液，其包括：HDA缓冲液、MgSO4、NaCl、dNTP、引物I、引物II；其中，所述引物I的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，引物II的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；
（3）酶混合物，其包括：DNA解旋酶，Bst DNA扩增酶和反转录酶；
（4）荧光染料：包括EvaGreenDye和Rox Reference Dye；
（5）无RNA酶的灭菌纯化水；
（6）阴性对照：无核酸灭菌水；
（7）阳性对照：为体外转录的非感染性RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的实时荧光RT-HDA试剂盒，其特征在于：所述反转录酶为ThermoScript反转录酶。
4.根据权利要求2所述的实时荧光RT-HDA试剂盒，其特征在于：所述RT- HDA反应液为1×HDA缓冲液、3.5mM MgSO4、40mM NaCl、0.21mM dNTP、100nM引物I和100nM引物II。
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| 单核细胞增生李斯特氏菌依赖解旋酶DNA恒温扩增检测方法的建立;王建广;《中国预防兽医学报》;20110228(第2期);131-132 * |
| 王建广.单核细胞增生李斯特氏菌依赖解旋酶DNA恒温扩增检测方法的建立.《中国预防兽医学报》.2011,(第2期),131-132. |
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