CN113584227A

CN113584227A - 一种鉴别非洲猪瘟基因缺失株的巢式pcr检测引物组及方法

Info

Publication number: CN113584227A
Application number: CN202110885516.9A
Authority: CN
Inventors: 刘国平; 张子薇; 陈少贤; 王钰; 曾攀
Original assignee: Yangtze University
Current assignee: Yangtze University
Priority date: 2021-08-03
Filing date: 2021-08-03
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2041-08-03
Also published as: CN113584227B; LU502017B1

Abstract

本发明提供了一种鉴别非洲猪瘟基因缺失株的巢式PCR检测引物组及方法，本发明针对pDP71L基因缺失株、DP96R基因缺失株、A276R基因缺失株和MGF360‑12L基因缺失株各设计一对外侧引物和一对内侧引物，该八对引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1～16所示。本发明利用外侧引物和内侧引物分别进行PCR扩增，第一次扩增加强PCR的特异性，第二次扩增加强PCR检测的敏感性，两轮PCR提高了PCR的特异性和灵敏性，该方法的灵敏性低至1个数量级，可检出极低载量的病毒。克服了普通PCR检测灵敏度低，特异性差等问题，与现有的间接免疫荧光、基因芯片等检测方法相比成本较低，适用监测范围广，同时便于样本阳性片段的及时测序。

Description

一种鉴别非洲猪瘟基因缺失株的巢式PCR检测引物组及方法

技术领域

本发明属于分子诊断技术领域，尤其涉及一种鉴别非洲猪瘟基因缺失株的巢式PCR检测引物组及方法。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swinefevervirus，ASFV)感染引起的，可引起急性出血热，导致猪的高发病率和死亡率的烈性传染病。非洲猪瘟病毒属于DNA病毒目，非洲猪瘟病毒科，非洲猪瘟病毒属成员，是一种具有20面体结构，直径为175～215nm，基因组全长170～190kb，含有151个开放阅读框，可编码150～200种蛋白，具有囊膜的双股线性DNA病毒。

目前在非洲猪瘟疫苗的研究中主要集中在灭活疫苗、弱毒疫苗、病毒活载体疫苗、核酸疫苗等。灭活疫苗指运用物理或化学方法去除病原活性，感染能力丧失，但仍具有抗原性。到目前为止，运用多种传统方法制备的ASFV灭活疫苗都不能对猪提供有效的免疫保护。弱毒疫苗以不同的毒株来源分为三种：天然致弱病毒株、传代致弱毒株以及重组致弱毒株。大量实验结果表明：天然致弱毒株及传代致弱毒株在生物安全方面仍存在问题。目前在我国研究者根据非洲猪瘟病毒在中国的流行株的基因型，开发了一系列的重组弱毒株疫苗。

由于当前对非洲猪瘟病毒基因缺失的疫苗的研究数据还不充分，其具体的免疫效果仍有待进一步的研究，在疫苗使用过程中需要对ASFV野毒株和基因缺失的疫苗株进行区分鉴定，从而实现对使用疫苗的有非洲猪瘟症状的猪群的感染源进行正确的鉴别。近年来，国内外学者对非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗建立了荧光抗体试验、普通PCR诊断、实时荧光定量PCR等技术进行检测。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鉴别非洲猪瘟基因缺失株的巢式PCR检测引物组及方法，该方法利用外侧引物和内侧引物分别进行两次PCR扩增，提高了PCR的特异性和灵敏性，灵敏性低至1个数量级，可检出极低载量的病毒。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种鉴别非洲猪瘟基因缺失株的巢式PCR检测引物组，针对pDP71L基因缺失株，外侧引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，内侧引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

针对DP96R基因缺失株，外侧引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，内侧引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；

针对A276R基因缺失株，外侧引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，内侧引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；

针对MGF360-12L基因缺失株，外侧引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14所示，内侧引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。

本发明提供了一种鉴别非洲猪瘟基因缺失株的巢式PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。

优选的，所述试剂盒还包括PCR扩增试剂。

优选的，所述PCR扩增试剂包括：5U/μL的TaKaRa Ex Taq，20mM的10×ExTaqBuffer，dNTP，外侧引物或内侧引物，模板。

优选的，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。

优选的，所述阳性对照品包含非洲猪瘟病毒pDP71L或非洲猪瘟病毒DP96R或非洲猪瘟病毒A276R或非洲猪瘟病毒MGF360-12L基因缺失株的质粒DNA。

本发明还提供了一种非疾病诊断目的的鉴别非洲猪瘟基因缺失株的巢式PCR检测方法，包括以下步骤：

S1.从样品中提取病毒核酸；

S2.以S1所述的病毒核酸为模板，用上述的外侧引物进行第一次PCR扩增反应获得扩增产物A；

S3.以S2所述的扩增产物A为模板，用上述的内侧引物进行第二次PCR扩增反应获得扩增产物B；

S4.将S3所述的扩增产物B进行琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统下观察结果，确定病毒类型。

优选的，所述第二次PCR扩增的特异性条带为：针对pDP71L基因缺失株的特异性条带片段为118bp；针对DP96R基因缺失株的特异性条带片段为174bp；针对A276R基因缺失株的特异性条带片段为228bp；针对MGF360-12L基因缺失株的特异性条带片段为187bp。

优选的，所述S2第一次PCR扩增反应条件包括：98℃预变性4-6min；98℃变性10s，55℃退火35s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸4min。

优选的，所述S3第二次PCR扩增反应条件包括：95℃预变性5min；98℃变性10s，57℃退火35s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸4min。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明利用设计的外侧引物和内侧引物分别进行两次PCR扩增，第一次扩增加强PCR的特异性，第二次扩增加强PCR检测的敏感性，二次扩增出现非特异性结合的概率极低，且该法的灵敏性低至1个数量级，可检出极低载量的病毒。

(2)本发明仅对非洲猪瘟病毒(ASFV)的DNA产生特异性的扩增反应，对猪圆环2型病毒病毒(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪圆环3型病毒病毒(PCV3)的核酸等均无扩增反应，具有特异性强的特点。

(3)本发明为我国非洲猪瘟病毒的临床检测提供了新手段，该试剂盒临床应用操作便捷，实用性强，能广泛地应用于环境样品、饲料原料、人员、食品以及猪只样品的预警监测、临床监控与鉴别诊断。

附图说明

图1为ASFVpDP71L基因缺失株巢式PCR外侧特异性试验结果。

图2为ASFVpDP71L基因缺失株巢式PCR内侧特异性试验结果。

图3为ASFV DP96R基因缺失株巢式PCR外侧特异性试验结果。

图4为ASFV DP96R基因缺失株巢式PCR内侧特异性试验结果。

图5为ASFVA276R基因缺失株巢式PCR外侧特异性试验结果。

图6为ASFVA276R基因缺失株巢式PCR内侧特异性试验结果。

图7为ASFV MGF360-12L基因缺失株巢式PCR外侧特异性试验结果。

图8为ASFV MGF360-12L基因缺失株株巢式PCR内侧特异性试验结果。

其中，图1-图8中，1：ASFV pDP71L基因缺失株或ASFV DP96R基因缺失株或ASFVA276R基因缺失株或ASFV MGF360-12L基因缺失株；2：猪圆环2型病毒(PCV2)；3：猪细小病毒(PPV)；4：猪伪狂犬病毒(PRV)；5：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)；6：猪流行性腹泻病毒(PEDV)；7：猪圆环3型病毒(PCV3)；8：阴性对照；9：试剂对照。

图9为ASFVpDP71L基因缺失株巢式PCR外侧引物敏感性试验结果。

图10为ASFVpDP71L基因缺失株巢式PCR内侧引物敏感性试验结果

图11为ASFV DP96R基因缺失株巢式PCR外侧引物敏感性试验结果。

图12为ASFV DP96R基因缺失株巢式PCR内侧引物敏感性试验结果。

图13为ASFVA276R基因缺失株巢式PCR外侧引物敏感性试验结果。

图14为ASFVA276R基因缺失株巢式PCR内侧引物敏感性试验结果。

图15为ASFV MGF360-12L基因缺失株巢式PCR外侧引物敏感性试验结果。

图16为ASFV MGF360-12L基因缺失株巢式PCR内侧引物敏感性试验结果。

其中，图9-图16中，M为DL2000 DNAMarker，1-11：模板拷贝数依次为1×10¹⁰、1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹、1、0.1；13：阴性对照；14：试剂对照；图10、12、14、16中1-13：分别以第一次PCR产物为相应模板。

图17为ASFV pDP71L基因缺失株巢氏PCR外侧引物抗干扰性检测的凝胶电泳图。

图18为ASFV pDP71L基因缺失株巢氏PCR内侧引物抗干扰性检测的凝胶电泳图。

图19为ASFV DP96R基因缺失株巢氏PCR外侧引物抗干扰性检测的凝胶电泳图。

图20为ASFV DP96RL基因缺失株巢氏PCR内侧引物抗干扰性检测的凝胶电泳图。

图21为ASFVA276R基因缺失株巢氏PCR外侧引物抗干扰性检测的凝胶电泳图。

图22为ASFVA276R基因缺失株巢氏PCR内侧引物抗干扰性检测的凝胶电泳图。

图23为ASFV MGF360-12L基因缺失株巢氏PCR外侧引物抗干扰性检测的凝胶电泳图。

图24为ASFV MGF360-12L基因缺失株巢氏PCR内侧引物抗干扰性检测的凝胶电泳图。

其中，图17-图24中，M为DL2000 DNAMarker，1-4：特异性试验所用基因组与非洲猪瘟pDP71L、DP96R、A276R和MGF360-12L基因缺失株分别混合；5：阴性对照；6：试剂对照。

图25为使用ASFV pDP71L基因缺失株巢氏PCR内侧引物检测样品的凝胶电泳图。

图26为使用DP96R基因缺失株巢氏PCR内侧引物检测样品的凝胶电泳图。

图27为使用A276R基因缺失株巢氏PCR内侧引物检测样品的凝胶电泳图。

图28为使用MGF360-12L基因缺失株巢氏PCR内侧引物检测样品的凝胶电泳图。。

其中，图25-图28中，M为DL2000 DNAMarker，编号1-50为样品，51为阴性对照；52分别依次为pPD71L片段对照或DP96R片段对照或A276R片段对照或MGF360-12L片段对照。

具体实施方式

在本发明中所述针对pDP71L基因缺失株的外侧引物为ASFV-pDP71L-F1/R1，内侧引物为ASFV-pDP71L-F2/R2；所述针对DP96R基因缺失株的外侧引物为ASFV-DP96R-F1/R1，内侧引物为ASFV-DP96R-F2/R2；所述针对A276R基因缺失株的外侧引物为ASFV-A276R-F1/R1，内侧引物为ASFV-A276R-F2/R2；所述针对MGF360-12L基因缺失株的外侧引物为ASFV-MGF360-12L-F1/R1，内侧引物为ASFV-MGF360-12L-F2/R2。

本发明提供了包括上述所述引物组的试剂盒。在本发明中所述试剂盒中含有外侧引物或内侧引物，所述外侧引物为ASFV-pDP71L-F1/R1或ASFV-DP96R-F1/R1或ASFV-A276R-F1/R1或ASFV-MGF360-12L-F1/R1，所述内侧引物为ASFV-pDP71L-F2/R2或ASFV-DP96R-F2/R2或ASFV-A276R-F2/R2或ASFV-MGF360-12L-F2/R2。

在本发明中，所述试剂盒还包括PCR扩增试剂。本发明中所述PCR扩增反应体系包括：TaKaRa Ex Taq(5U/μL)，10×Ex Taq Buffer(20mM)，dNTP，外侧引物或内侧引物，模板；所述TaKaRa Ex Taq(5U/μL)的用量优选为0.125μL，所述10×Ex TaqBuffer(20mM)用量优选为2.5μL，所述dNTP用量优选为2μL，所述外侧引物或内侧引物用量优选为1μL，所述模板优选为2μL；所述外侧引物为ASFV-pDP71L-F1/R1或ASFV-DP96R-F1/R1或ASFV-A276R-F1/R1或ASFV-MGF360-12L-F1/R1，所述内侧引物为ASFV-pDP71L-F2/R2或ASFV-DP96R-F2/R2或ASFV-A276R-F2/R2或ASFV-MGF360-12L-F2/R2。

在本发明中，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。本发明中所述阳性对照品包含非洲猪瘟病毒pDP71L或非洲猪瘟病毒DP96R或非洲猪瘟病毒A276R或非洲猪瘟病毒MGF360-12L基因缺失株的质粒DNA，所述阴性对照品优选为去离子水。

本发明还提供一种非疾病诊断目的的鉴别非洲猪瘟基因缺失株的巢式PCR检测方法，包括以下步骤：

S1.从样品中提取病毒核酸；

S2.以S1所述的病毒核酸为模板，用本发明所述的外侧引物进行第一次PCR扩增反应获得扩增产物A；

S3.以S2所述的扩增产物A为模板，用本发明所述的内侧引物进行第二次PCR扩增反应获得扩增产物B；

在本发明中，所述第一次PCR扩增的特异性条带为：针对pDP71L基因缺失株的特异性条带片段为206bp；针对DP96R基因缺失株的特异性条带片段为268bp；针对A276R基因缺失株的特异性条带片段为450bp；针对MGF360-12L基因缺失株的特异性条带片段为688bp。所述第二次PCR扩增的特异性条带为：针对pDP71L基因缺失株的特异性条带片段为118bp；针对DP96R基因缺失株的特异性条带片段为174bp；针对A276R基因缺失株的特异性条带片段为228bp；针对MGF360-12L基因缺失株的特异性条带片段为187bp。

在本发明中，所述第一次PCR扩增反应体系包括：0.125μL的TaKaRa Ex Taq(5U/μL)，2.5μL的10×Ex TaqBuffer(20mM)，2μL dNTP，1μL的外侧引物对，2μL的模板，补加去离子水至25μL；所述第一次PCR扩增模板为从样品中提取的病毒核酸。所述第二次PCR扩增反应体系包括：0.125μL的TaKaRa Ex Taq(5U/μL)，2.5μL的10×Ex Taq Buffer(20mM)，2μLdNTP，1μL的内侧引物对，2μL的模板，补加去离子水至25μL，所述第二次扩增模板为第一次PCR扩增的产物。

在本发明中，所述第一次PCR扩增反应条件包括：98℃预变性4-6min；98℃变性10s，55℃退火35s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸4min。所述第二次PCR扩增反应条件包括：95℃预变性5min；98℃变性10s，57℃退火35s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸4min。

在本发明中，所述确定病毒的判定标准见表1。

表1结果判定标准

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1引物设计

本实施例参考NCBI(美国国立生物信息中心)的GenBanK数据库中已公布的非洲猪瘟病毒(ASFV)的pDP71L、DP96R、A276R和MGF360-12L基因缺失株的基因高度保守且具有特异性区域，设计ASFV的pDP71L、DP96R、A276R和MGF360-12L基因缺失株特异性外侧引物和内侧引物。大量实验表明，不同的引物对PCR扩增的效果和灵敏度具有一定的影响。因此，本实施例中针对上述四种基本片段分别设计了两组引物，由此提供了一种鉴别ASFV基因缺失毒株的巢式PCR引物组，具体见如下表2。

表2四种ASFV缺失株扩增引物

实施例2 PCR检测方法

1.1实施例1中引物

1.2样品DNA提取

I组织样品中病毒DNA的提取：

A.取新鲜或刚解冻的组织去除血水和结缔组织，在冰浴上剪成小碎块。

B.将组织碎块移入预冷的匀浆器中，按10ml/g加入匀浆缓冲液(匀浆缓冲液：0.25mmol/L蔗糖、25mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)、25mmol/L NaCl和25mmol/LMgCl₂)混匀，制成匀浆液；

C.将匀浆液移入Ep管，5000r/min离心10min，弃上清液；

D.加10mmol/LPBS(pH7.4)悬起沉淀，每0.1g原始组织加1ml，5000r/min离心10min，弃上清液；

E.加裂解液(裂解液由50mmol/L Tris-HCl(pH8.3)、1mmol/L EDTA、0.5％Tween-20和200μg/ml蛋白酶K(选自TIANGEN，RT403-02)组成)悬起沉淀，每0.1g原始组织加1ml，55℃作用30-60min，然后于95℃，10min灭活蛋白酶K；6.1000r/min离心5min，取上清液做DNA模板，提取的DNA置-20℃保存备用或立即用于PCR扩增。

II体液中病毒DNA的提取：

A.在750μL全血中加入等量裂解缓冲液A(裂解缓冲液A：50mmol/LTris-HCl(pH7.4)、150mmol/L NaCl)，混匀，12000r/min离心30s，弃上清液。

B.用1.5mL裂解缓冲液A悬起沉淀，再重复离心1次，弃上清液。

C.用117μL裂解缓冲液B(裂解缓冲液B：50mmol/LTris-HCl(pH8.3)、1mmol/LEDTA、0.5％Tween-20)溶解沉淀，70℃作用5min，待冷却至55℃时加入3μL蛋白酶K，并保温1h消化细胞，95℃10min灭活蛋白酶K。

D.加入2mol/L的KCL溶液30μL，冰溶5min。

E.12000r/min离心5min，弃上清液做DNA模板，提取的DNA置-20℃保存备用或立即用于PCR扩增。

1.3阳性质粒

以GenBanK数据库中已公布的ASFV的pDP71L、DP96R、A276R和MGF360-12L基因缺失株基因全长加上两侧的部分序列送去上海生工合成基因，将阳性的质粒命名为pUC57-pDP71L、pUC57-DP96R、pUC57-A276R和pUC57-MGF360-12L。

1.4巢式PCR反应建立敏感性试验

将1.3中所得四种质粒pUC57-pDP71L、pUC57-DP96R、pUC57-A276R和pUC57-MGF360-12L稀释，测浓度分别为3.14×10¹⁰copice/μL、3.08×10¹⁰copice/μL、2.88×10¹⁰copice/μL和2.69×10¹⁰copice/μL，将4种质粒浓度均稀释为1×10¹⁰copice/μL作为模板。应用PCR仪，采用矩阵法筛选不同引物浓度组合，得到针对巢式PCR引物浓度和反应条件。

按照以下步骤进行巢式PCR：

S1.从样品中提取病毒核酸；

S2.以步骤S1中提取的核酸为模板，用权利要求1中所述的外侧引物进行第一次PCR扩增反应获得扩增产物；采用扩增体系包括0.125μL的TaKaRa Ex Taq(5U/μL)，2.5μL的10×Ex TaqBuffer(20mM)，2μLdNTP，1μL的外侧引物对，2μL的模板，补加去离子水至25μL；PCR扩增反应条件为：98℃预变性4-6min；98℃变性10s，55℃退火35s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸4min。

S3.以步骤S2中扩增产物为模板，用权利要求1所述的内侧引物进行第二次PCR扩增反应获得扩增产物B；采用扩增反应体系包括：0.125μL的TaKaRa Ex Taq(5U/μL)，2.5μL的10×Ex TaqBuffer(20mM)，2μLdNTP，1μL的内侧引物对，2μL的模板，补加去离子水至25μL；PCR扩增反应条件为：98℃预变性5min；98℃变性10s，57℃退火35s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸4min。

S4.将步骤S3中PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统下观察结果，确定病毒类型。

PCR扩增产物进行电泳鉴定：称取2g琼脂糖放入500mL锥形瓶中，加入1×TAE电泳缓冲液100mL，于微波炉中熔解，再加入10μL染色液(选自擎科生物TS-GelRed核酸凝胶染料，TSJ002)混匀。在电泳槽模内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待完全凝固后取出置于电泳槽中，将5μL PCR扩增产物点样于琼脂糖凝胶孔中，以100V电压于1×TAE电泳缓冲液中电泳，凝胶成像系统观察结果。

实施例3特异性试验

按照实施例2中1.4建立的巢式PCR检测方法对1：ASFV pDP71L、DP96R、A276R和MGF360-12L基因缺失株，2：猪圆环2型病毒病毒(PCV2)，3：猪细小病毒(PPV)，4：猪伪狂犬病毒(PRV)，5：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)，6：猪流行性腹泻病毒(PEDV)，7：猪圆环3型病毒病毒(PCV3)，8：阴性对照，9：试剂对照进行检测，结果见附图1-8所示。

从附图1-2中可以看出，对应1：ASFVpDP71L基因缺失株的泳道在对应的片段大小的位置能看到清晰的条带，而2：猪圆环2型病毒病毒(PCV2)；3：猪细小病毒(PPV)；4：猪伪狂犬病毒(PRV)；5：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)；6：猪流行性腹泻病毒(PEDV)；7：猪圆环3型病毒病毒(PCV3)；8：阴性对照；9：试剂对照，对应的泳道都没有显示出条带，说明该鉴定方法具有较好的特异性。

从附图3-4中可以看出，对应1：ASFV DP96R基因缺失株的泳道在对应的片段大小的位置能看到清晰的条带，而2：猪圆环2型病毒病毒(PCV2)；3：猪细小病毒(PPV)；4：猪伪狂犬病毒(PRV)；5：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)；6：猪流行性腹泻病毒(PEDV)；7：猪圆环3型病毒病毒(PCV3)；8：阴性对照；9：试剂对照，对应的泳道都没有显示出条带，说明该鉴定方法具有较好的特异性。

从附图5-6中可以看出，对应1：ASFVA276R基因缺失株的泳道在对应的片段大小的位置能看到清晰的条带，而2：猪圆环2型病毒病毒(PCV2)；3：猪细小病毒(PPV)；4：猪伪狂犬病毒(PRV)；5：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)；6：猪流行性腹泻病毒(PEDV)；7：猪圆环3型病毒病毒(PCV3)；8：阴性对照；9：试剂对照，对应的泳道都没有显示出条带，说明该鉴定方法具有较好的特异性。

从附图7-8中可以看出，对应1：ASFV MGF360-12L基因缺失株的泳道在对应的片段大小的位置能看到清晰的条带，而2：猪圆环2型病毒病毒(PCV2)；3：猪细小病毒(PPV)；4：猪伪狂犬病毒(PRV)；5：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)；6：猪流行性腹泻病毒(PEDV)；7：猪圆环3型病毒病毒(PCV3)；8：阴性对照(去离子水)；9：试剂对照，对应的泳道都没有显示出条带，说明该鉴定方法具有较好的特异性。

实施例4敏感性试验

将阳性模板pUC57-pDP71L、pUC57-DP96R、pUC57-A276R和pUC57-MGF360-12L进行10倍倍比稀释，稀释至第11个梯度。

非洲猪瘟pDP71L基因缺失株外侧引物PCR检测结果如附图9所示，泳道1至7可以看到清晰的条带，说明外侧引物PCR敏感性为1×10⁴copice/μL；内侧引物PCR检测结果如附图10所示，泳道1至11可以看到清晰的条带，说明内侧引物PCR敏感性为1copice/μL。

非洲猪瘟DP96R基因缺失株外侧引物PCR检测结果如附图11所示，泳道1至9可以看到清晰的条带，说明外侧引物PCR敏感性为1×10²copice/μL；内侧引物PCR检测结果如附图12所示，泳道1至11可以看到清晰的条带，说明内侧引物PCR敏感性为1copice/μL。

非洲猪瘟A276R基因缺失株外侧引物PCR检测结果如附图13所示，泳道1至6可以看到清晰的条带，说明外侧引物PCR敏感性为1×10⁵copice/μL；内侧引物PCR检测结果如附图14所示，泳道1至11可以看到清晰的条带，说明内侧引物PCR敏感性为1copice/μL。

非洲猪瘟MGF360-12L基因缺失株外侧引物PCR检测结果如附图15所示，泳道1至6可以看到清晰的条带，说明外侧引物PCR敏感性为1×10⁵copice/μL；内侧引物PCR检测结果如附图16所示，泳道1至11可以看到清晰的条带，说明内侧引物PCR敏感性为1copice/μL。

实施例5干扰性试验

对特异性试验中用到的基因组与非洲猪瘟pPD71L、DP96R、A276R和MGF360-12L缺失基因株取等量进行混合。用外侧引物和内侧引物分别进行PCR扩增，检验引物的抗干扰性，能否从混合基因组模板中扩增出目的条带。结果如附图17-24所示，泳道1至4均可以看到清晰的条带，说明引物抗干扰性强。

实施例6符合率试验

采集2021年1月至4月湖北某镇50份ASFV阳性样品，其中菜市场环境样20份、猪场返厂人员15份及车辆样15份，收集样本，依次编号为1-50，以实施例2中1.2记载的核酸提取步骤提取DNA。

使用非洲猪瘟pPD71L、DP96R、A276R和MGF360-12L基因缺失株的外侧引物进行第一次扩增，PCR扩增反应体系和扩增反应条件如实施例2中S2所述。

使用非洲猪瘟pPD71L、DP96R、A276R和MGF360-12L基因缺失株的内侧引物进行第二次扩增，PCR扩增反应体系和扩增反应条件如实施例2中S3所述。第二次PCR产物使用2％琼脂糖凝胶进行电泳检测如实施例2中S4所述。结果如图25-28所示，编号8为扩增到pPD71L和MGF360-12L片段，编号12扩增到A276R片段，编号17扩增到A276R和MGF360-12L片段，编号24扩增到MGF360-12L片段，编号47扩增到DP96R片段。根据附图25-28可知50份样品中1份样品为pPD71L和MGF360-12L双基因片段缺失，1份样品为MGF360-12L单基因片段缺失、1份样品为A276R和MGF360-12L双基因片段缺失、2份样品分别为DP96R、A276R基因片段缺失。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 长江大学

<120> 一种鉴别非洲猪瘟基因缺失株的巢式PCR检测引物组及方法

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atgggggggc ggcggcg 17

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

tccagtagct ttttttg 17

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gtatgggaag ccgacgaca 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gcaggagcac cgtggatag 19

<210> 5

<211> 14

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

aaaagagaaa ccag 14

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

ttaattattc ttctgga 17

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

gaaatcatct gtcgtgga 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

tttgtctgca ctggtcattt 20

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

tattcctgct cctctggc 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

tccgcgtctg tggattgt 18

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

agtagatgat gtgccgagta 20

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

acggagcagt tgaatacc 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

gagttaggtg ccaaggag 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

gatctatgat ttcagggt 18

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

tgaatacgtg gcggttaa 18

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

agcatggcct gattgatg 18

Claims

1.一种鉴别非洲猪瘟基因缺失株的巢式PCR检测引物组，其特征在于，针对pDP71L基因缺失株，外侧引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，内侧引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

针对MGF360-12L基因缺失株，外侧引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示，内侧引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。

2.一种鉴别非洲猪瘟基因缺失株的巢式PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR扩增试剂。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂包括：5U/μL的TaKaRaEx Taq，20mM的10×Ex Taq Buffer，dNTP，外侧引物或内侧引物，模板。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品包含非洲猪瘟病毒pDP71L或非洲猪瘟病毒DP96R或非洲猪瘟病毒A276R或非洲猪瘟病毒MGF360-12L基因缺失株的质粒DNA。

7.一种非疾病诊断目的的鉴别非洲猪瘟基因缺失株的巢式PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.从样品中提取病毒核酸；

S2.以S1所述的病毒核酸为模板，用权利要求1所述的外侧引物进行第一次PCR扩增反应获得扩增产物A；

S3.以S2所述的扩增产物A为模板，用权利要求1所述的内侧引物进行第二次PCR扩增反应获得扩增产物B；

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述第二次PCR扩增的特异性条带为：针对pDP71L基因缺失株的特异性条带片段为118bp；针对DP96R基因缺失株的特异性条带片段为174bp；针对A276R基因缺失株的特异性条带片段为228bp；针对MGF360-12L基因缺失株的特异性条带片段为187bp。

9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述S2第一次PCR扩增反应条件包括：98℃预变性4-6min；98℃变性10s，55℃退火35s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸4min。

10.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述S3第二次PCR扩增反应条件包括：95℃预变性5min；98℃变性10s，57℃退火35s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸4min。