CN111172321A - 鉴别非洲猪瘟感染与免疫的荧光pcr检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种鉴别诊断非洲猪瘟病毒感染与免疫的荧光定量PCR检测试剂、检测试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。本发明针对非洲猪瘟CD2v和荧光蛋白eGFP设计了特异的引物、探针。通过与P72基因联合组成ASFVP72/CD2v双重荧光PCR检测方法或ASFVP72/CD2v/eGFP三重荧光PCR检测方法可以检测非洲猪瘟感染，同时可以鉴别非洲猪瘟病毒野生株和CD2v基因缺失重组疫苗株，从而将感染动物同被免疫过的动物区分开来。本发明具有操作简便、灵敏度高、特异性强、重复性好等优点，为疫情检测及疫病防控提供了重要的监测手段。

Description

鉴别非洲猪瘟感染与免疫的荧光PCR检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种鉴别诊断非洲猪瘟病毒感染与免疫的荧光定量PCR检测试剂、检测试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine fever)是由非洲猪瘟病毒(African Swine fevervirus)感染家猪和各种野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等)引起的一种急性、出血性、烈性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物疫情。其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100％，临床表现为发热(达40～42℃)，心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀，淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血，非洲猪瘟临床症状与猪瘟症状相似，只能依靠实验室检测确诊。
该病于1921年在非洲的肯尼亚首次出现，2007年以来，非洲猪瘟在全球多个国家和地区发生、扩散和流行，2018年8月3日，中国确诊了首例非洲猪瘟疫情，截至目前中国已先后发生140多起疫情，给中国的生猪产业造成巨大经济损失，导致猪肉价格急剧攀升，中国的非洲猪瘟疫情防控形势也十分严峻。
非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，是一种包膜病毒，具有二十面体形态，该病毒主要在巨噬细胞的细胞质中复制，也是唯一由节肢动物传播的DNA病毒。非洲猪瘟病毒(ASFV)的基因组大小为170-190Kb，可以编码150-200种蛋白质，这些蛋白质的许多基因已被克隆和表达。其中P72蛋白是非洲猪瘟病毒的一种主要衣壳结构蛋白，占病毒粒子蛋白含量的32％，是一种非常保守的抗原性蛋白，对自然感染具有免疫原性。P72基因是目前最常用的基因分型靶序列，但各个亚型的P72基因序列高度同源，只有个别位点发生变异，因此，该基因同样也是建立ASFV快速核酸检测方法的理想靶序列。从ASFV报道至今已有近百年的历史，但ASFV具有庞大的基因组，可编码大量的蛋白质参与逃避宿主的防御系统，并且在现阶段对ASFV的保护性免疫仍然知之甚少，导致目前为止没有研发出有效的疫苗。但目前通过与自然弱毒株基因组序列的比较和分析等方法已经确认了几种基因与免疫抑制有关，包括CD2V、MGF、9GL等。这其中研究较多的是MGF和CD2v基因，已有研究者构建了MGF、CD2v单基因缺失和二者的双基因缺失重组病毒，动物安全性和免疫效果试验结果表明，MGF基因单缺失和MGF、CD2v双基因缺失毒株对免疫猪均具有良好的安全性和很好的攻毒保护效果。其中在基因缺失重组病毒的构建过程中采用了eGFP这类绿色荧光蛋白来进行功能定位，便于研究。eGFP、eYFP、eCFP等标签蛋白均为增强型荧光蛋白，可与目的蛋白一起在真核表达系统中融合表达，不用破碎组织细胞和不加任何底物，直接通过荧光显微镜就能在活细胞中发出绿色荧光，实时显示目的基因的表达情况，且荧光性质稳定，被誉为活细胞探针，广泛应用于基因表达调控、转基因功能研究、蛋白在细胞中的功能定位、迁移变化及药物筛选等方面。此外，上述荧光蛋白在转染细胞的确定、动态监测细胞间分子交流、免疫分析等方面具有广泛的应用。
鉴于中国当前的ASF疫情形势以及国外非洲猪瘟疫情净化根除的历史来看，疫苗防控是我国当前防控非洲猪瘟疫情最为有效迫切的方法，根据目前的研究进展，不久的将来便会有基因缺失疫苗上市启用，但是当这些基因缺失疫苗上市启用之后，又会带来新的ASFV防控困扰，如何能够准确的鉴定猪体内的抗体是由野毒株感染引起的还是疫苗株免疫引起的，将会成为ASFV防控工作的重中之重。
发明内容
为了满足上述需要，本发明针对非洲猪瘟病毒P72基因、CD2v基因和eGFP基因分别设计了荧光PCR引物和探针，建立了荧光PCR检测方法，为快速鉴别诊断ASFV感染与免疫提供了一种简便快速的定量方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种用于检测非洲猪瘟病毒(ASFV)感染的引物探针组，所述引物探针组包括针对CD2v基因的如下引物探针：
CD2vF：5’-ATTTCCCTTACCTAAACCGTGTCC-3’(SEQ ID NO：1)；
CD2vR：5’-AGTAGCGGGATACTAGGTAGTGG-3’(SEQ ID NO：2)；CD2vP：5’-Fluorophore-CCACCCAAACCATGTCCGCCACCC-Quencher-3’(SEQ ID NO：3)。
所述CD2vP引物探针的5’端标记报告荧光染料Fluorophore为HEX，3’端标记荧光淬灭基团Quencher为BHQ1，Eclipse或TAMRA等。
所述引物探针组能高灵敏度且特异性检测非洲猪瘟病毒(ASFV)感染。
第二方面，本发明提供了一种用于检测非洲猪瘟重组疫苗免疫或用于检测非洲猪瘟重组疫苗的引物探针组，所述非洲猪瘟重组疫苗含有eGFP基因，所述引物探针组包括针对eGFP基因的如下引物探针：
eGFPF：5’-CAGGAGCGCACCATCTTC-3’(SEQ ID NO：4)；
eGFPR：5’-AAGTCGATGCCCTTCAGC-3’(SEQ ID NO：5)；
eGFPP：5’-Fluorophore-CAAGGACGACGGCAACTACAAGACC-Quencher-3’(SEQ ID NO：6)。
所述eGFPP引物探针的5’端标记报告荧光染料Fluorophore为cy5，3’端标记荧光淬灭基团Quencher为BHQ2，Eclipse或TAMRA等。
所述引物探针组能高灵敏度且特异性检测非洲猪瘟重组疫苗免疫或检测非洲猪瘟重组疫苗。
第三方面，本发明提供了一种用于检测非洲猪瘟病毒感染或用于鉴别非洲猪瘟感染与非洲猪瘟疫苗免疫的引物探针组，所述引物探针组包含针对P72基因的引物探针；针对CD2v基因的引物探针和/或针对标签蛋白基因的引物探针；所述针对P72基因的引物探针包括正向引物、反向引物以及探针，所述正向引物、反向引物以及探针中的基因序列均采用P72基因内的基因序列；所述针对CD2v基因的引物探针组包括正向引物、反向引物以及探针，所述正向引物、反向引物以及探针中的基因序列均采用CD2v内的基因序列；所述针对标签蛋白基因的引物探针包括正向引物、反向引物以及探针，所述正向引物、反向引物以及探针中的基因序列均采用标签蛋白基因内的基因序列；优选地，所述标签蛋白基因为荧光蛋白基因，优选地，所述荧光蛋白基因为eGFP、eCFP或eYFP。
第四方面，本发明提供了一种用于定量检测非洲猪瘟病毒感染或用于鉴别非洲猪瘟感染与非洲猪瘟疫苗免疫的引物探针组，所述引物探针组包括：
(1)针对P72基因的如下引物探针：
ASFU：5’-ACATTTCCGTAACTGCTCATGG-3’(SEQ ID NO：7)；
ASFL：5’-CTCTTGCTCTGGATACGTTAATATG-3’(SEQ ID NO：8)；和ASFP：5’-Fluorophore-CCACTGGGTTGGTATTCCTCCCGTG-Quencher-3’(SEQ ID NO：9)；和
(2)针对CD2v基因的如下引物探针：
CD2vF：5’-ATTTCCCTTACCTAAACCGTGTCC-3’(SEQ ID NO：1)；
CD2vR：5’-AGTAGCGGGATACTAGGTAGTGG-3’(SEQ ID NO：2)；
CD2vP：5’-Fluorophore-CCACCCAAACCATGTCCGCCACCC-Quencher-3’
(SEQ ID NO：3)。
所述P72探针的5’端标记报告荧光染料Fluorophore为FAM，3’端标记荧光淬灭基团Quencher为Eclipse；所述CD2vP引物探针的5’端标记报告荧光染料Fluorophore为HEX，3’端标记荧光淬灭基团Quencher为BHQ1，Eclipse或TAMRA等。
所述引物探针组能够用于区分ASFV野生毒株感染还是疫苗免疫。如果检测样品FAM和HEX通道均有扩增曲线，则样品判定为野毒感染，如果检测样品FAM通道有扩增曲线，而HEX通道无扩增曲线，则样品判定为疫苗免疫。
因此，P72基因可以与CD2v基因组成ASFV双重荧光PCR检测方法用于ASFV感染与疫苗免疫的鉴别诊断。
第五方面，本发明提供了一种用于定量检测非洲猪瘟病毒感染或用于鉴别非洲猪瘟感染与非洲猪瘟疫苗免疫的引物探针组，所述引物探针组包括：
(1)针对P72基因的如下引物探针：
ASFU：5’-ACATTTCCGTAACTGCTCATGG-3’(SEQ ID NO：7)；
ASFL：5’-CTCTTGCTCTGGATACGTTAATATG-3’(SEQ ID NO：8)；和
ASFP：5’-Fluorophore-CCACTGGGTTGGTATTCCTCCCGTG-Quencher-3’(SEQ ID NO：9)；
(2)针对CD2v基因的如下引物探针：
CD2vF：5’-ATTTCCCTTACCTAAACCGTGTCC-3’(SEQ ID NO：1)；
CD2vR：5’-AGTAGCGGGATACTAGGTAGTGG-3’(SEQ ID NO：2)；
CD2vP：5’-Fluorophore-CCACCCAAACCATGTCCGCCACCC-Quencher-3’
(SEQ ID NO：3)；以及
(3)针对eGFP基因的如下引物探针：
eGFPF：5’-CAGGAGCGCACCATCTTC-3’(SEQ ID NO：4)
eGFPR：5’-AAGTCGATGCCCTTCAGC-3’(SEQ ID NO：5)
eGFPP：5’-Fluorophore-CAAGGACGACGGCAACTACAAGACC-Quencher-3’(SEQ ID NO：6)。
所述P72探针的5’端标记报告荧光染料Fluorophore为FAM，3’端标记荧光淬灭基团Quencher为Eclipse。所述CD2vP引物探针的5’端标记报告荧光染料Fluorophore为HEX，3’端标记荧光淬灭基团Quencher为BHQ1，Eclipse或TAMRA等。所述eGFPP引物探针的5’端标记报告荧光染料Fluorophore为cy5，3’端标记荧光淬灭基团Quencher为BHQ2，Eclipse或TAMRA等。
所述引物探针组能够用于区分ASFV野生毒株感染还是疫苗免疫，如果检测样品FAM和HEX通道均有扩增曲线，则样品判定为野毒感染，如果检测样品FAM和cy5通道有扩增曲线，而HEX通道无扩增曲线，则样品判定为疫苗免疫。
因此，P72基因也可以与CD2v和eGFP基因组成ASFV三重荧光PCR检测方法用于ASFV感染与免疫的鉴别诊断。
第六方面，本发明还提供了一种用于检测非洲猪瘟感染的PCR试剂盒，所述试剂盒包含第一方面至第五方面任一项的引物探针组。
第七方面，本发明还提供了一种用于鉴别非洲猪瘟感染与非洲猪瘟疫苗免疫的PCR试剂盒，所述试剂盒包含第三方面至第五方面任一项的引物探针组。
更进一步地，所述试剂盒的荧光PCR反应体系为：2×Ex Taq Mix for qPCR12.5μL，10μmol/L ASFU/ASFL各1μL，10μmol/L ASFP0.5μL，10μmol/L CD2vF/CD2vR各1μL，10μmol/LCD2vP0.5μL，加入1μL阳性DNA作为模板，加入灭菌水使反应体积为25μL。或者，所述试剂盒的荧光PCR反应体系为：2×ExTaq Mix for qPCR 12.5μL，10μmol/L ASFU/ASFL各1μL，10μmol/L ASFP0.5μL，10μmol/L CD2vF/CD2vR各1μL，10μmol/LCD2vP0.5μL，10μmol/LeGFPF/eGFPR各1μL，10μmol/LeGFPP0.5μL，加入1μL阳性DNA作为模板，加入灭菌水使反应体积为25μL。
更进一步地，所述试剂盒的PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃15s，57℃30s，此步采集荧光，同时采集FAM和HEX两个通道的荧光值，共进行40个循环。或者，所述试剂盒的PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃15s，57℃30s，此步采集荧光，同时采集FAM、HEX和cy5三个通道的荧光值，共进行40个循环。
在所述PCR反应体系中P72基因正向引物的浓度为0.4～0.8μM，P72基因反向引物的浓度为0.4～0.8μM，P72基因探针的浓度为0.08～0.8μM；和/或在所述PCR反应体系中CD2v基因正向引物的浓度为0.4～0.8μM，CD2v基因反向引物的浓度为0.4～0.8μM，CD2v基因探针的浓度为0.08～0.8μM；和/或在所述PCR反应体系中eGFP基因正向引物的浓度为0.4～0.8μM，eGFP基因反向引物的浓度为0.4～0.8μM，eGFP基因探针的浓度为0.08～0.8μM。
第八方面，本发明还提供了第三方面至第五方面任一方面的引物探针组在制备用于鉴别非洲猪瘟感染与疫苗免疫的试剂盒中的应用。
第九方面，本发明还提供了第一方面至第五方面任一方面的引物探针组在制备用于检测非洲猪瘟感染的试剂盒中的应用。
第十方面，本发明提供了用于检测非洲猪瘟病毒(ASFV)感染的方法，所述方法包括使用第一方面至第五方面任一方面的引物探针组或第六方面或第七方面的试剂盒对检测样品进行PCR的步骤。
第十一方面，本发明提供了用于鉴别非洲猪瘟感染与非洲猪瘟疫苗免疫的方法，所述方法包括使用第三方面至第五方面任一方面的引物探针组或第七方面的试剂盒对检测样品进行PCR的步骤。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明可以在ASFV基因缺失苗上市使用以后用于野毒感染和疫苗免疫的鉴别诊断，当猪体为野毒感染时，P72基因和CD2v基因均有扩增曲线，而当猪体为疫苗株免疫时，则P72基因和eGFP基因均有扩增曲线。本发明采用荧光定量PCR的方法，不但可以快速、简便的对猪体的感染情况进行确诊，还可以对病原进行定量分析。以ASFV核酸倍比稀释后制备标准品进行检测，其检测范围为44ng/μL到0.044ng/μL DNA。本发明设计的CD2v基因引物与探针可检测到0.044ng/μL DNA，灵敏度高。以ASFV重组疫苗毒核酸倍比稀释后制备标准品进行检测，其检测范围为23ng/μL到0.023ng/μL DNA。本发明设计的eGFP基因引物与探针可检测到0.023ng/μL DNA，灵敏度高。
本发明的非洲猪瘟病毒CD2v基因和eGFP基因的荧光定量PCR检测方法与猪圆环病毒2型、3型，猪细小病毒，猪伪狂犬病毒，虹彩病毒，痘病毒、口蹄疫均无交叉反应，具有良好的特异性。
本发明的ASFV P72/CD2v双重荧光定量PCR检测方法和ASFV P72/CD2v/eGFP三重荧光定量PCR检测方法能够快速鉴别诊断猪体是疫苗免疫还是野毒感染，对非洲猪瘟防控工作有重要的指导意义。
附图说明
图1为非洲猪瘟CD2v荧光PCR检测方法的扩增曲线图；
图2为非洲猪瘟CD2v荧光PCR检测方法的敏感性检测结果图；
图3为非洲猪瘟CD2v荧光PCR检测方法的特异性检测结果图；
图4为eGFP基因荧光PCR检测方法的扩增曲线图；
图5为eGFP基因荧光PCR检测方法的敏感性检测结果图；
图6为eGFP基因荧光PCR检测方法的特异性检测结果图；
图7为非洲猪瘟P72/CD2v双重荧光PCR检测方法的扩增曲线图；
图8为非洲猪瘟P72/CD2v双重荧光PCR检测方法检测样品的检测结果图。
图9为非洲猪瘟P72/CD2v/eGFP三重荧光PCR检测方法的扩增曲线图；
图10为非洲猪瘟P72/CD2v/eGFP三重荧光PCR检测方法检测样品的检测结果图；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
实施例1 CD2v基因荧光定量PCR检测方法的建立
1.材料与试剂：灭活ASFV细胞培养液由波兰国家兽医研究所提供；PCV3，PCV2，猪伪狂犬病毒，猪细小病毒，虹彩病毒，痘病毒，口蹄疫病毒DNA样品由中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所保存。Wizard Genomic DNA Purification Kit购自Promega公司，2×ExTaq Mix for qPCR(TaKaRa)购自北京六合通经贸有限公司。
2.灭活细胞培养液病毒DNA的提取
取100μL灭活ASFV细胞培养液按照Wizard Genomic DNA Purification Kit试剂盒说明书操作提取DNA，最后用50μl DNA溶解液溶解DNA，-20℃保存备用。
3.引物设计
根据GenBank中已发表的ASFV CD2v基因的序列(MK333180)，利用Beacon Design软件设计了一套荧光PCR引物和探针，具体的引物序列如下：CD2v基因引物探针如下：
CD2vF：5’-ATTTCCCTTACCTAAACCGTGTCC-3’
CD2vR：5’-AGTAGCGGGATACTAGGTAGTGG-3’
CD2vP：5’-HEX-CCACCCAAACCATGTCCGCCACCC-BHQ1-3’
引物均由北京六合华大生物技术有限公司合成，用灭菌双蒸水稀释至10μM，保存至-20℃备用。
4.CD2v基因荧光PCR检测方法的建立
以灭活ASFV基因组核酸为模板，同时设阴性对照，25μL的荧光PCR反应体系为：2×ExTaq Mix for qPCR 12.5μL，10μmol/L CD2vF/CD2vL各1μL，10μmol/LCD2vP0.5μL，加入1μL阳性DNA作为模板，加入灭菌水使反应体积为25μL。
荧光PCR扩增条件为：95℃预变性5min，95℃15s，57℃30s，此步采集荧光，采集HEX通道的荧光值，共进行40个循环。
反应完毕，分析HEX通道的扩增曲线图，记录Ct值。
结果判定：当阳性对照HEX通道存在扩增曲线，而阴性对照无扩增曲线时，试验成立。检测样品HEX通道存在扩增曲线判定为ASFV野毒感染阳性，HEX通道无扩增曲线判定样品为非ASFV野毒感染。
5.CD2v基因荧光PCR检测方法的敏感性检测
提取的ASFV灭活细胞培养液DNA，测定浓度为44ng/μL，10倍倍比稀释为4.4ng/μL，0.44ng/μL，0.044ng/μL，0.0044ng/μL，以CD2v基因荧光PCR方法检测上述倍比稀释的基因组核酸。检测完毕，分析HEX通道的扩增曲线图，记录Ct值，绘制标准曲线图。从图中可以看出，CD2v基因荧光PCR检测方法的敏感性较高，最低检测限可以达到0.044ng/μL。
6.CD2v基因荧光PCR检测方法的特异性检测
以CD2v基因荧光PCR方法检测PCV3，PCV2，猪伪狂犬病毒，猪细小病毒，虹彩病毒，痘病毒，口蹄疫病毒DNA样品，以灭活ASFV细胞毒DNA为阳性对照，同时设阴性对照。检测完毕，分析HEX通道的扩增曲线图，记录Ct值。从图中可以看出，除阳性有扩增外，其余对照病毒DNA以及阴性对照均无扩增，这表明，该CD2v基因的荧光PCR检测方法具有良好的特异性。
实施例2 eGFP基因荧光定量PCR检测方法的建立
1.材料与试剂：ASFV重组疫苗毒细胞培养液DNA由中国人民解放军军事医学科学院提供；PCV3，PCV2，猪伪狂犬病毒，猪细小病毒，虹彩病毒，痘病毒，口蹄疫病毒DNA样品由中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所保存。Wizard Genomic DNA Purification Kit购自Promega公司，2×ExTaq Mix for qPCR(TaKaRa)购自北京六合通经贸有限公司。
2.引物设计
根据eGFP基因的序列利用Beacon Design软件设计了一套荧光PCR引物和探针，具体的引物序列如下：
eGFPF：5’-CAGGAGCGCACCATCTTC-3’
eGFPR：5’-AAGTCGATGCCCTTCAGC-3’
eGFPP：5’-cy5-CAAGGACGACGGCAACTACAAGACC-BHQ2-3’。
引物均由北京六合华大生物技术有限公司合成，用灭菌双蒸水稀释至10μM，保存至-20℃备用。
3.eGFP基因荧光PCR检测方法的建立
以ASFV重组疫苗毒核酸为模板，同时设阴性对照，25μL的荧光PCR反应体系为：2×ExTaq Mix for qPCR 12.5μL，10μmol/LeGFPF/eGFPL各1μL，10μmol/LeGFPP0.5μL，加入1μL阳性DNA作为模板，加入灭菌水使反应体积为25μL。
荧光PCR扩增条件为：95℃预变性5min，95℃15s，57℃30s，此步采集荧光，采集HEX通道的荧光值，共进行40个循环。
反应完毕，分析cy5通道的扩增曲线图，记录Ct值。
结果判定：当阳性对照cy5通道存在扩增曲线，而阴性对照无扩增曲线时，试验成立。检测样品cy5通道存在扩增曲线判定为ASFV疫苗毒阳性，cy5通道无扩增曲线判定样品为非ASFV疫苗毒免疫。
4.eGFP基因荧光PCR检测方法的敏感性检测
提取的ASFV重组疫苗毒DNA，测定浓度为23ng/μL，10倍倍比稀释为2.3ng/μL，0.23ng/μL，0.023ng/μL，0.0023ng/μL，以eGFP基因荧光PCR方法检测上述倍比稀释的基因组核酸。检测完毕，分析cy5通道的扩增曲线图，记录Ct值，绘制标准曲线图。从图中可以看出，eGFP基因荧光PCR检测方法的敏感性较高，最低检测限可以达到0.023ng/μL。
5.eGFP基因荧光PCR检测方法的特异性检测
以eGFP基因荧光PCR方法检测PCV3，PCV2，猪伪狂犬病毒，猪细小病毒，虹彩病毒，痘病毒，口蹄疫病毒DNA样品，以ASFV重组疫苗毒核酸DNA为阳性对照，同时设阴性对照。检测完毕，分析cy5通道的扩增曲线图，记录Ct值。从图中可以看出，除阳性有扩增外，其余对照病毒DNA以及阴性对照均无扩增，这表明，该eGFP基因的荧光PCR检测方法具有良好的特异性。
实施例3 ASFV P72/CD2v双重荧光定量PCR检测方法的建立
1.材料与试剂：灭活ASFV细胞培养液由波兰国家兽医研究所提供，1,2,3,4号样品核酸DNA由中国人民解放军军事医学科学院提供。Wizard Genomic DNA Purification Kit购自Promega公司，2×ExTaq Mix for qPCR(TaKaRa)购自北京六合通经贸有限公司。
2.灭活ASFV细胞培养液DNA的提取
取100μL灭活ASFV细胞培养液按照Wizard Genomic DNA Purification Kit试剂盒说明书操作提取DNA，最后用50μl DNA溶解液溶解DNA，-20℃保存备用。
3.ASFV P72/CD2v双重荧光定量PCR检测方法的建立
P72基因的荧光PCR引物和探针直接采用申请人为中国检验检疫科学研究院，专利申请号为201710259976的专利中公布的引物序列，与CD2v基因的引物探针组成双重荧光PCR检测方法。
以灭活ASFV基因组核酸为阳性对照，同时设阴性对照，25μL的荧光PCR反应体系为：2×ExTaq Mix for qPCR 12.5μL，10μmol/L ASFU/ASFL各1μL，10μmol/L ASFP0.5μL，10μmol/L CD2vF/CD2vL各1μL，10μmol/LCD2vP0.5μL，加入1μL阳性DNA作为模板，加入灭菌水使反应体积为25μL。
荧光PCR扩增条件为：95℃预变性5min，95℃15s，57℃30s，此步采集荧光，同时采集FAM和HEX两个通道的荧光值，共进行40个循环。
反应完毕，分别分析FAM和HEX通道的扩增曲线图，记录Ct值。
4.样品检测
以灭活ASFV基因组核酸为阳性对照，同时设阴性对照，以ASFV P72/CD2v双重荧光定量PCR方法检测中国人民解放军军事医学科学院提供的1,2,3,4号样品核酸DNA。检测完毕，分别分析FAM和HEX通道的扩增曲线图，记录Ct值。结果表明，1,2,3,4号样品均为野毒感染。
结果判定：当阳性对照FAM和HEX通道均存在扩增曲线，而阴性对照均无扩增曲线时，试验成立。如果检测样品FAM和HEX通道均有扩增曲线，则样品判定为野毒感染，如果检测样品FAM通道有扩增曲线，而HEX通道无扩增曲线，则样品判定为ASFV疫苗免疫，如果检测样品FAM通道和HEX通道均无扩增曲线，则样品判定为ASFV核酸检测阴性，如果样品FAM通道无扩增曲线，而HEX通道有扩增曲线，则样品检测失败，需要重新复检。
实施例4 ASFV P72/CD2v/eGFP三重荧光定量PCR检测方法的建立
1.材料与试剂：ASFV重组疫苗毒DNA和1,2,3,4号样品DNA由中国人民解放军军事医学科学院提供。2×ExTaq Mix for qPCR(TaKaRa)购自北京六合通经贸有限公司。
2.ASFV P72/CD2v/eGFP三重荧光PCR检测方法的建立
以ASFV重组疫苗毒DNA为模板，同时设阴性对照，25μL的荧光PCR反应体系为：2×ExTaq Mix for qPCR 12.5μL，10μmol/L ASFU/ASFL各1μL，10μmol/L ASFP0.5μL，10μmol/LCD2vF/CD2vL各1μL，10μmol/LCD2vP0.5μL，10μmol/L eGFPF/eGFPR各1μL，10μmol/LeGFPP0.5μL，加入1μL阳性DNA作为模板，加入灭菌水使反应体积为25μL。
荧光PCR扩增条件为：95℃预变性5min，95℃15s，57℃30s，此步采集荧光，同时采集FAM、HEX和cy5三个通道的荧光值，共进行40个循环。
反应完毕，分别分析FAM、HEX和cy5通道的扩增曲线图，记录Ct值。
3.样品检测
以ASFV重组疫苗毒DNA为阳性对照，同时设阴性对照，以ASFV P72/CD2v/eGFP三重荧光定量PCR方法检测中国人民解放军军事医学科学院提供的1,2,3,4号样品。检测完毕，分别分析FAM、HEX和cy5通道的扩增曲线图，记录Ct值。结果表明，1,2,3,4号样品均为野毒感染。
结果判定：当阳性对照FAM和cy5通道均存在扩增曲线，而阴性对照均无扩增曲线时，试验成立。如果检测样品FAM和HEX通道均有扩增曲线，而cy5通道无扩增曲线，则样品判定为野毒感染，如果检测样品FAM和cy5通道有扩增曲线，而HEX通道无扩增曲线，则样品判定为ASFV疫苗免疫，如果检测样品FAM通道、HEX通道和cy5通道均无扩增曲线，则样品判定为ASFV核酸检测阴性，如果样品FAM通道无扩增曲线和/或cy5通道有扩增曲线，而HEX通道有扩增曲线，则样品检测失败，需要重新复检。
除eGFP基因外，eCFP、eYFP也可以利用Beacon Design软件设计荧光PCR引物和探针，与P72基因和CD2v基因组成上述类似的三重荧光PCR方法用于非洲猪瘟是否为野毒感染还是疫苗免疫的鉴别诊断。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国检验检疫科学研究院
<120> 鉴别非洲猪瘟感染与免疫的荧光PCR检测试剂盒
<130> RYP1910556.9
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 1
atttccctta cctaaaccgt gtcc 24
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 2
agtagcggga tactaggtag tgg 23
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 3
ccacccaaac catgtccgcc accc 24
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 4
caggagcgca ccatcttc 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 5
aagtcgatgc ccttcagc 18
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 6
caaggacgac ggcaactaca agacc 25
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 7
acatttccgt aactgctcat gg 22
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 8
ctcttgctct ggatacgtta atatg 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 9
ccactgggtt ggtattcctc ccgtg 25

Claims (10)

1.一种用于检测非洲猪瘟病毒感染的引物探针组，其特征在于所述引物探针组包括针对CD2v基因的如下引物探针：
CD2v基因正向引物：5’-ATTTCCCTTACCTAAACCGTGTCC-3’(SEQ ID NO：1)；
CD2v基因反向引物：5’-AGTAGCGGGATACTAGGTAGTGG-3’(SEQ ID NO：2)；
CD2v基因探针：5’-Fluorophore-CCACCCAAACCATGTCCGCCACCC-Quencher-3’(SEQ IDNO：3)，
优选地，所述CD2v探针的5’端标记报告荧光染料Fluorophore为HEX，3’端标记荧光淬灭基团Quencher为BHQ1，Eclipse或TAMRA。
2.一种用于检测非洲猪瘟重组疫苗免疫或用于检测非洲猪瘟重组疫苗的引物探针组，其特征在于所述非洲猪瘟重组疫苗含有eGFP基因，所述引物探针组包括针对eGFP基因的如下引物探针：
eGFP基因正向引物：5’-CAGGAGCGCACCATCTTC-3’(SEQ ID NO：4)；
eGFP基因反向引物：5’-AAGTCGATGCCCTTCAGC-3’(SEQ ID NO：5)；
eGFP基因探针：5’-Fluorophore-CAAGGACGACGGCAACTACAAGACC-Quencher-3’(SEQ IDNO：6)，
优选地，所述eGFP探针的5’端标记报告荧光染料Fluorophore为cy5，3’端标记荧光淬灭基团Quencher为BHQ2，Eclipse或TAMRA。
3.一种用于检测非洲猪瘟病毒感染或用于鉴别非洲猪瘟感染与非洲猪瘟疫苗免疫的引物探针组，其特征在于所述引物探针组包含针对P72基因的引物探针；针对CD2v基因的引物探针和/或针对标签蛋白基因的引物探针；所述针对P72基因的引物探针包括正向引物、反向引物以及探针，所述正向引物、反向引物以及探针中的基因序列均采用P72基因内的基因序列；所述针对CD2v基因的引物探针组包括正向引物、反向引物以及探针，所述正向引物、反向引物以及探针中的基因序列均采用CD2v内的基因序列；所述针对标签蛋白基因的引物探针包括正向引物、反向引物以及探针，所述正向引物、反向引物以及探针中的基因序列均采用标签蛋白基因内的基因序列；优选地，所述标签蛋白基因为荧光蛋白基因，优选地，所述荧光蛋白基因为eGFP、eCFP或eYFP。
4.一种用于定量检测非洲猪瘟病毒感染或用于鉴别非洲猪瘟感染与非洲猪瘟疫苗免疫的引物探针组，其特征在于所述引物探针组包括：
(1)针对P72基因的如下引物探针：
P72基因正向引物：5’-ACATTTCCGTAACTGCTCATGG-3’(SEQ ID NO：7)；
P72基因反向引物：5’-CTCTTGCTCTGGATACGTTAATATG-3’(SEQ ID NO：8)；
P72基因探针：5’-Fluorophore-CCACTGGGTTGGTATTCCTCCCGTG-Quencher-3’(SEQ IDNO：9)；和
(2)针对CD2v基因的如下引物探针：
CD2v基因正向引物：5’-ATTTCCCTTACCTAAACCGTGTCC-3’(SEQ ID NO：1)；
CD2v基因反向引物：5’-AGTAGCGGGATACTAGGTAGTGG-3’(SEQ ID NO：2)；
CD2v基因探针：5’-Fluorophore-CCACCCAAACCATGTCCGCCACCC-Quencher-3’(SEQ IDNO：3)，
优选地，所述P72探针的5’端标记报告荧光染料Fluorophore为FAM，3’端标记荧光淬灭基团Quencher为Eclipse；所述CD2v探针的5’端标记报告荧光染料Fluorophore为HEX，3’端标记荧光淬灭基团Quencher为BHQ1，Eclipse或TAMRA。
5.一种用于定量检测非洲猪瘟病毒感染或用于鉴别非洲猪瘟感染与非洲猪瘟疫苗免疫的引物探针组，其特征在于所述引物探针组包括：
(1)针对P72基因的如下引物探针：
P72基因正向引物：5’-ACATTTCCGTAACTGCTCATGG-3’(SEQ ID NO：7)；
P72基因反向引物：5’-CTCTTGCTCTGGATACGTTAATATG-3’(SEQ ID NO：8)；
P72基因探针：5’-Fluorophore-CCACTGGGTTGGTATTCCTCCCGTG-Quencher-3’(SEQ IDNO：9)
(2)针对CD2v基因的如下引物探针：
CD2v基因正向引物：5’-ATTTCCCTTACCTAAACCGTGTCC-3’(SEQ ID NO：1)；
CD2v基因反向引物：5’-AGTAGCGGGATACTAGGTAGTGG-3’(SEQ ID NO：2)；
CD2v基因探针：5’-Fluorophore-CCACCCAAACCATGTCCGCCACCC-Quencher-3’(SEQ IDNO：3)；以及
(3)针对eGFP基因的如下引物探针：
eGFP基因正向引物：5’-CAGGAGCGCACCATCTTC-3’(SEQ ID NO：4)；
eGFP基因反向引物：5’-AAGTCGATGCCCTTCAGC-3’(SEQ ID NO：5)；
eGFP基因探针：5’-Fluorophore-CAAGGACGACGGCAACTACAAGACC-Quencher-3’(SEQ IDNO：6)，
优选地，所述P72探针的5’端标记报告荧光染料Fluorophore为FAM，3’端标记荧光淬灭基团Quencher为Eclipse；所述CD2v探针的5’端标记报告荧光染料Fluorophore为HEX，3’端标记荧光淬灭基团Quencher为BHQ1，Eclipse或TAMRA；所述eGFP引物探针的5’端标记报告荧光染料Fluorophore为cy5，3’端标记荧光淬灭基团Quencher为BHQ2，Eclipse或TAMRA。
6.一种用于检测非洲猪瘟感染的PCR试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含权利要求1至权利要求5任一项的引物探针组。
7.一种用于鉴别非洲猪瘟感染与非洲猪瘟疫苗免疫的PCR试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含权利要求3至权利要求5任一项的引物探针组。
8.根据权利要求6或7的试剂盒，其特征在于在所述PCR反应体系中P72基因正向引物的浓度为0.4～0.8μM，P72基因反向引物的浓度为0.4～0.8μM，P72基因探针的浓度为0.08～0.8μM；和/或在所述PCR反应体系中CD2v基因正向引物的浓度为0.4～0.8μM，CD2v基因反向引物的浓度为0.4～0.8μM，CD2v基因探针的浓度为0.08～0.8μM；和/或在所述PCR反应体系中eGFP基因正向引物的浓度为0.4～0.8μM，eGFP基因反向引物的浓度为0.4～0.8μM，eGFP基因探针的浓度为0.08～0.8μM。
9.权利要求1至权利要求5任一项的引物探针组在制备用于检测非洲猪瘟感染的试剂盒中的应用。
10.权利要求3至权利要求5任一项的引物探针组在制备用于鉴别非洲猪瘟感染与非洲猪瘟疫苗免疫的试剂盒中的应用。
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