CN116004925A - 用于鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的三重荧光pcr引物探针组、试剂和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的三重荧光PCR引物探针组、试剂和方法，所述三重荧光PCR引物探针组包括第一引物对探针组、第二引物对探针组和第三引物对探针组。本发明提供的三重荧光PCR引物探针组在用于非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的鉴别中，三对引物对探针组同时添加时，其间没有相互干扰，能够高效检测扩增到对应的目的片段。同时，基于此，能够有效地实现非洲猪瘟病毒强毒、弱毒或者基因工程弱毒的鉴别性检测，对猪场进行对应的预防措施提供有效的指导依据。
Description
技术领域
本发明涉及非洲猪瘟病毒的鉴别性检测领域，具体地，涉及用于鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的三重荧光PCR引物探针组、试剂和方法。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的一种可以感染家猪和野猪的接触性动物传染病，所有品种的和年龄的猪都易感。二型非洲猪瘟是一种急性、烈性传染病，猪只发病率和死亡率最高可达100％。对全球养猪业带来严重的经济损失。目前对于非洲猪瘟尚未开发出有效的疫苗后治疗方案，针对非洲猪瘟的防御主要通过扑杀，但效果不理想。非洲猪瘟病毒靶细胞为肺泡巨噬细胞，而巨噬细胞是天然免疫系统中重要的免疫细胞，非洲猪瘟病毒的感染抑制天然免疫。除此之外，非洲猪瘟病毒具有庞大的基因组约170-193kb，包含了150-167个开放阅读框(ORF)，编码了150-200中病毒蛋白。目前对病毒编码的部分病毒蛋白功能具有较好的了解，但是仍有大部分的编码蛋白功能尚未研究。
1921年在肯尼首次发现非洲猪瘟，随后传入欧洲，亚洲等。在2018年8月传入我国，并在辽宁首次发生非洲猪疫情，随后传播至我国多个省份。由于非洲猪瘟在我国长期流行，出现天然突变或因基因缺失导致的病毒弱化，丢失部分基因特别是囊膜蛋白CD2v蛋白，以及部分MGF360或MGF505多基因家族等基因，这导致我国非洲猪瘟疫情变得更为复杂。因此对于ASFV的检测及防控至关重要。
目前非洲猪瘟的诊断方法主要包括红细胞吸附实验，直接免疫荧光实验、动物接种试验、ELISA、聚合酶链式反应等。其中红细胞吸附实验主要依据了ASFV囊膜蛋白CD2v和红细胞表面的CD58的特异性结合，但此方法敏感性差且操作复杂，直接免疫光和动物接种试验虽然可靠性较高，需要在生物安全防护三级实验室进行操作，ELISA和聚合酶链式反应虽然也可以检测，但ELISA检测需要猪只体内产生抗体，而在感染初期抗体水平低，不易检测，而常规聚合酶链式反应敏感性较差，且不易区分弱毒与野毒。虽然有荧光定量PCR检测病毒的方法，但不能区分缺失株与野毒。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的在于针对现有技术中对非洲猪瘟病毒野毒株和缺失株无法快速进行区分的问题，从而提供一种能够快速鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失型毒株，进而解决非洲猪瘟病毒弱化后难发觉等问题的用于鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的三重荧光PCR引物探针组、试剂和方法。
为了实现上述目的，本发明提供了一种用于鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的三重荧光PCR引物探针组，所述三重荧光PCR引物探针组包括第一引物对探针组、第二引物对探针组和第三引物对探针组；其中，
所述第一引物对探针组包括如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的第一引物对，以及如SEQ ID No:3所示的第一特异性探针；
所述第二引物对探针组包括如SEQ ID No:4和SEQ ID No:5所示的第二引物对，以及如SEQ ID No:6所示的第二特异性探针；
所述第三引物对探针组包括如SEQ ID No:7和SEQ ID No:8所示的第三引物对，以及如SEQ ID No:9所示的第三特异性探针。
优选地，所述第一特异性探针、所述第二特异性探针和所述第三特异性探针的5’端各自修饰有荧光报告基团；
所述第一特异性探针、所述第二特异性探针和所述第三特异性探针的3’端各自标记有荧光猝灭基团；
所述第一特异性探针上修饰的荧光报告基团为TAMRA，所述第二特异性探针上修饰的荧光报告基团为FAM，所述第三特异性探针上修饰的荧光报告基团为VIC。
本发明还提供了一种用于鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的三重荧光PCR检测试剂，所述三重荧光PCR检测试剂包括根据上述所述的三重荧光PCR引物探针组。
本发明还提供了一种用于鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的方法，采用根据上述所述的三重荧光PCR引物探针组，或，根据上述所述的三重荧光PCR检测试剂。
优选地，所述方法包括：获得待测样品的生物样本；采用三重荧光PCR引物探针组或三重荧光PCR检测试剂对生物样本进行荧光扩增；根据扩增结果判定待测样品的株型。
优选地，判定标准为：
当第一引物对探针组、第二引物对探针组和第三引物对探针组均对应表达，则待测样品为无基因缺失的野毒株；
当第一引物对探针组和第二引物对探针组对应表达，第三引物对探针组对应不表达，则待测样品为天然弱毒株；
当第一引物对探针组对应表达，第二引物对探针组和第三引物对探针组对应不表达，则待测样品为工程缺失株。
优选地，荧光扩增过程中的检测为定量检测。
优选地，定量检测具体包括：
S100、制备阳性标准样本；
S200、对制备的阳性标准样本按梯度进行稀释后，获得多梯度的参比样本；
S300、对得到的多个所述参比样本分别采用三重荧光PCR引物探针组或三重荧光PCR检测试剂进行荧光扩增，并测定对应的Ct值；
S400、以每个所述参比样本的病毒拷贝数为横坐标，以对应的Ct值为纵坐标，构建病毒拷贝数-Ct标准曲线；
S500、基于构建的病毒拷贝数-Ct标准曲线，根据待测样品中测得的Ct值对应获得待测样品的病毒拷贝数。
本发明提供的三重荧光PCR引物探针组在用于非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的鉴别中，三对引物对探针组同时添加时，其间没有相互干扰，能够高效检测扩增到对应的目的片段。同时，基于此，能够有效地实现非洲猪瘟病毒强毒、弱毒或者基因工程弱毒的鉴别性检测，对猪场进行对应的预防措施提供有效的指导依据。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1A是验证例1中进行扩增后的扩增曲线；
图1B是验证例1中对应得到的拷贝数-Ct值标准曲线；
图1C是验证例1中得到的灵敏度检测结果；
图2A是验证例2中进行扩增后的扩增曲线；
图2B是验证例2中对应得到的拷贝数-Ct值标准曲线；
图2C是验证例2中得到的灵敏度检测结果；
图3A是验证例3中进行扩增后的扩增曲线；
图3B是验证例3中对应得到的拷贝数-Ct值标准曲线；
图3C是验证例3中得到的灵敏度检测结果；
图4是验证例4中进行扩增后的扩增曲线；
图5是应用例中进行扩增后的扩增曲线。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
以下通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细的说明。这里的待测样品的生物样品的获得为采用“创凌生物”的广谱型DNA免核酸提取试剂(M-DNA01)进行提取。
制备例1、引物对探针组的制备：
人工合成如SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5、SEQ ID No:6、SEQ ID No:7、SEQ ID No:8、SEQ ID No:9所示的三组引物对探针组，其具体序列如下：
SEQ ID No:1：AAACGGCGCCCTCTAAGG；
SEQ ID No:2：GGCAGCTTCAAACGTTTCCT；
SEQ ID No:3：TTTGGTTGTCCCAGTCATATCCGTTGC；
SEQ ID No:4：ATACAAAGCTTGAGAGGAGCATCA；
SEQ ID No:5：CAGCCAGTGTTTGTCAATAGATGAA；
SEQ ID No:6：CCACCATAGGCCACAATATTTCAAAATGC；
SEQ ID No:7：TGTCAGCATGATGACACCACTT；
SEQ ID No:8：GTTGTGTTGAGGGACGCATGTAGT；
SEQ ID No:9：CATACATGAACCATCTCCCAGAGAACCA。
其中，SEQ ID No:1-SEQ ID No:3(第一引物对探针组)用于扩增非洲猪瘟病毒的B646L基因；SEQ ID No:4-SEQ ID No:6(第二引物对探针组)用于扩增非洲猪瘟病毒的MGF-360-13L基因；SEQ ID No:7-SEQ ID No:9(第三引物对探针组)用于扩增非洲猪瘟病毒的EP402R基因。
制备例2、阳性标准样品的制备：
根据GenBank中记载的非洲猪瘟病毒的B646L序列、MGF-360-13L序列和EP402R序列分别进行人工合成，获得对应的合成片段；借助DNA技术将合成片段各自与pUC57克隆载体连接构建重组质粒，对应获得质粒pB646L、pMGF-360-13L和pEP402R三种质粒；将得到的重组质粒分别转化DH5α感受态细胞后，将转化后的感受态细胞进行培养，待长出单菌落后，挑取出单菌进行扩增后提取，获得对应的阳性标准质粒，根据DNA分子量将所获得的质粒pB646L、MGF-360-13L、和EP402R分别进行稀释至1.96×1012copies/mL、2.4×1012copies/mL和2.4×1012copies/mL对所获得的的质粒进行。其中，对获得的阳性标准质粒进行进一步的梯度稀释，以获得浓度呈梯度递增的阳性参比质粒。
验证例1、第一引物对探针组的验证：
按照以下条件构建扩增体系：
PCR总体系为25μL：第一特异性探针(浓度为10μmol/L)0.5μL；第一引物对中的正向引物和反向引物(浓度各自为10μmol/L)各0.5μL；ROX参比染料0.5μL；制备例2中获得的含有B646L序列的阳性标准质粒5μL，余量为ddH2O。
PCR扩增条件为：预变性温度95℃，30s；变性温度95℃，5s，退火和延伸温度60℃，30s，40个循环。
对制备例2中获得的阳性参比质粒按照浓度梯度逐次按照上述方式进行扩增，并在实时定量扩增仪上观察扩增结果。其扩增曲线如图1A所示，即ASFV B646L扩增曲线；对应得到的标准曲线如图1B所示，即ASFV B646L标准曲线，R2＝0.999，Eff％＝103.729，Error＝0.02；灵敏度检测结果如图1C所示，即ASFV B646L灵敏度检测图。
可以看出，病毒的拷贝数与Ct值呈线性关系，其检测灵敏度为1.96×103copies/mL，标准曲线的相关系数R2＝0.992，Eff％＝98.719，Error＝0.071。
验证例2、第二引物对探针组的验证：
按照验证例1的方法进行操作，不同的是，采用第二引物对和第二特异性探针，阳性标准质粒为含有MGF-360-13L序列的阳性参比质粒，其扩增曲线如图2A所示，即ASFVMGF-360-13L扩增曲线；对应得到的标准曲线如图2B所示，即ASFV MGF-360-13L标准曲线R2＝0.999，Eff％＝101.286，Error＝0.017，灵敏度检测结果如图2C所示，即ASFV B646L灵敏度检测。
可以看出，病毒的拷贝数与Ct值呈线性关系，其检测灵敏度为2.4×103copies/mL，标准曲线的相关系数R2＝0.999，Eff％＝99.797，Error＝0.019。
验证例3、第三引物对探针组的验证：
按照验证例1的方法进行操作，不同的是，采用第三引物对和第三特异性探针，阳性标准质粒为含有EP402R序列的阳性参比质粒，其扩增曲线如图3A所示，即ASFV EP402R扩增曲线；对应得到的标准曲线如图3B所示，即ASFV EP402R标准曲线R2＝0.999，Eff％＝101.286，Error＝0.029灵敏度检测结果如图3C所示，即ASFV EP402R灵敏度检测。
可以看出，病毒的拷贝数与Ct值呈线性关系，其检测灵敏度为2.4×103copies/mL，标准曲线的相关系数R2＝0.999，Eff％＝101.286，Error＝0.029。
验证例4、三重荧光PCR引物探针组的验证：
按照验证例1的方法进行操作，不同的是，采用三重荧光PCR引物探针组，阳性标准质粒为含有B646L序列、MGF-360-13L序列和EP402R序列的混合阳性参比质粒，其扩增曲线如图4所示，即ASFV三重探针扩增曲线，可以看出，相较于每种单独的阳性标准质粒的扩增曲线，三者之间无明显的干扰。
应用例、三重荧光PCR引物探针组特异性验证：
按照验证例4的方法进行操作，不同的是，以含有B646L序列、MGF-360-13L序列和EP402R序列的混合质粒为阳性对照，检测对分别患有猪细小病毒(PPI)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒(PCV)的个样本，进行探针组的特异性检测。其扩增曲线如图5所示，可以看出探针组只在阳性对照中检测到信号。对猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PrV)、猪细小病毒(porcine parvovirus infection，PPI)和猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)核酸没有检测到信号，因此，进一步证明了在实际检测中具有较好的特异性。
在实际应用过程中，若扩增了B646L基因，则说明此个体感染了ASFV，若没有检测到EP402R基因，则可能为工程缺失株或者天然缺失株，当MGF360-13L基因检测到时，则说明此毒株为天然弱毒株，若MGF360-13L基因也未检测到说明，此毒株可能为工程缺失株，经此三条引物可以确定毒株是否为天然弱化或基因工程毒株。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (8)
1.一种用于鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的三重荧光PCR引物探针组，其特征在于，所述三重荧光PCR引物探针组包括第一引物对探针组、第二引物对探针组和第三引物对探针组；其中，
所述第一引物对探针组包括如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的第一引物对，以及如SEQ ID No:3所示的第一特异性探针；
所述第二引物对探针组包括如SEQ ID No:4和SEQ ID No:5所示的第二引物对，以及如SEQ ID No:6所示的第二特异性探针；
所述第三引物对探针组包括如SEQ ID No:7和SEQ ID No:8所示的第三引物对，以及如SEQ ID No:9所示的第三特异性探针。
2.根据权利要求1所述的三重荧光PCR引物探针组，其特征在于，所述第一特异性探针、所述第二特异性探针和所述第三特异性探针的5’端各自修饰有荧光报告基团；
所述第一特异性探针、所述第二特异性探针和所述第三特异性探针的3’端各自标记有荧光猝灭基团；
所述第一特异性探针上修饰的荧光报告基团为TAMRA，所述第二特异性探针上修饰的荧光报告基团为FAM，所述第三特异性探针上修饰的荧光报告基团为VIC。
3.一种用于鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的三重荧光PCR检测试剂，其特征在于，所述三重荧光PCR检测试剂包括根据权利要求1或2所述的三重荧光PCR引物探针组。
4.一种用于鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的方法，其特征在于，采用根据权利要求1或2所述的三重荧光PCR引物探针组，或，根据权利要求3所述的三重荧光PCR检测试剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括：获得待测样品的生物样本；采用三重荧光PCR引物探针组或三重荧光PCR检测试剂对生物样本进行荧光扩增；根据扩增结果判定待测样品的株型。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，判定标准为：
当第一引物对探针组、第二引物对探针组和第三引物对探针组均对应表达，则待测样品为无基因缺失的野毒株；
当第一引物对探针组和第二引物对探针组对应表达，第三引物对探针组对应不表达，则待测样品为天然弱毒株；
当第一引物对探针组对应表达，第二引物对探针组和第三引物对探针组对应不表达，则待测样品为工程缺失株。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，荧光扩增过程中的检测为定量检测。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，定量检测具体包括：
S100、制备阳性标准样本；
S200、对制备的阳性标准样本按梯度进行稀释后，获得多梯度的参比样本；
S300、对得到的多个所述参比样本分别采用三重荧光PCR引物探针组或三重荧光PCR检测试剂进行荧光扩增，并测定对应的Ct值；
S400、以每个所述参比样本的病毒拷贝数为横坐标，以对应的Ct值为纵坐标，构建病毒拷贝数-Ct标准曲线；
S500、基于构建的病毒拷贝数-Ct标准曲线，根据待测样品中测得的Ct值对应获得待测样品的病毒拷贝数。
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| CN116814862A (zh) * | 2023-08-09 | 2023-09-29 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 非洲猪瘟基因i型强毒、i型弱毒和ii型病毒鉴别检测 |
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| CN116814862A (zh) * | 2023-08-09 | 2023-09-29 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 非洲猪瘟基因i型强毒、i型弱毒和ii型病毒鉴别检测 |
| CN116814862B (zh) * | 2023-08-09 | 2024-01-26 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 非洲猪瘟基因i型强毒、i型弱毒和ii型病毒鉴别检测 |
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