CN116144834A - 一种非洲猪瘟病毒鉴别检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种特异性强、敏感性高、重复性好，可以快速、高效鉴别II型非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株与II型非洲猪瘟病毒流行株的双重qPCR方法，对其临床应用提供了有效的技术支持。

Description

一种非洲猪瘟病毒鉴别检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及非洲猪瘟病毒的鉴别和检测。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒引起猪的一种急性、热性、出血性和高度接触性传染病，所有品种和年龄的猪均可感染，发病率和死亡率可高达100％，世界动物卫生组织(WOAH)将其列为法定报告动物疫病，中国也将其列为一类动物疫病。由于尚无有效的治疗药物和疫苗投入使用，疫情发生后，仅能依靠扑杀、消毒等基础措施进行防控，到目前为止扑杀生猪超过119.66万头，给中国生猪养殖业和国民经济带来巨大冲击。面对非洲猪瘟带来的威胁与挑战，除建立高水平的生物安全体系之外，开发出安全高效的非洲猪瘟疫苗对该病的防控具有重要作用。ASFV是非洲猪瘟科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，病毒粒子呈二十面体对称，直径约为200nm，病毒基因组为170-193kb，具有151-167个开放阅读框(Open reading frame,ORF)。与其它的核质大DNA病毒(nucleocytoplasmiclarge DNA viruses,NCLDV)一样，ASFV编码许多蛋白质，这些蛋白质除了专门用于病毒组装的结构蛋白外，还参与逃避宿主防御机制，诸如I型干扰素和细胞凋亡途径等。随着对ASFV基因功能的不断探索，研究人员发现当敲除其某些毒力基因、多基因家族及免疫逃逸相关基因后，可显著降低病毒毒力或增加宿主的免疫应答，以此构建的基因缺失疫苗可以对强毒感染提供良好的免疫保护。其中美国构建的II型非洲猪瘟I177L基因缺失株在越南上市。对我国非洲猪瘟的监测造成巨大的压力，因此急需开发针对该疫苗株将来临床应用时配套的鉴别诊断方法。

ASFV常用的诊断方法包括病原学诊断、血清学诊断和分子生物学诊断。病原学诊断可靠性高，但费时费力，需要高级别生物安全实验室，不适于大规模检测；血清学检测方法操作简便，其中酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)^[20-22]和间接免疫荧光抗体试验(indirect fluorescent antibody assay，IFA)是最常用的检测方法；分子生物学诊断方法的准确性、灵敏度和特异性都较高，其中聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)因其高通量、易操作、耗时短等优点，成为是国际贸易中OIE指定的ASFV检测方法。

实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR，qPCR)方法将光谱技术引入到PCR反应中，通过荧光信号积累实时定量监测特异性扩增产物总量，较常规PCR方法具有更高的特异性和敏感性。研究人员以ASFV的P72等保守基因为靶标设计引物和探针建立的TaqManqPCR能准确、高效的特异性鉴别ASFV。此外，Felicity J Haines、史喜菊等人还进一步建立了同时鉴别ASFV与CSFV、PCV2、PRRSV等多种病毒的感染的双重或多重qPCR检测方法，可以一步快速、准确地鉴别检测不同病原体。

目前，在CN 113718058 A公开了一种区分检测CD2v基因缺失株、MGF基因缺失株以及CD2v基因和MGF基因缺失株的PCR检测方法、试剂盒；在CN 112646934 B中公开了一种鉴别B646L、EGFP和mCherry基因的多重荧光qPCR检测方法、试剂盒；大多是根据ASFV P72基因设计的，无法区分II型ASFV野毒感染和I177L基因缺失株免疫。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种快速、准确区分II型非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株与II型非洲猪瘟病毒流行株的鉴别检测方法。

第一方面，本发明提供一组灵敏度和特异性较高的双重荧光定量PCR特异性引物。

所述双重荧光定量PCR特异性引物是用于鉴别检测II型非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株与II型非洲猪瘟病毒流行株。

本发明引物设计根据GenBank中登录的非洲猪瘟CN/HLJ/18基因组序列(MK333180.1)和HLJ/18-ΔI177L候选疫苗株的基因缺失策略，利用Primer premier 5.0软件选择P72基因(GenBank No.22220311)、I177L(GenBank No.41902005)基因区域分别设计的2对引物。

进一步的，所述II型非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株与II型非洲猪瘟病毒流行株双重荧光定量PCR特异性引物组包括检测P72基因的上游引物a和下游引物a，检测I177L基因的上游引物b和下游引物b。

进一步的，所述P72基因的上游引物a和下游引物a核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；所述I177L基因的上游引物b和下游引物b核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQID No.4。

第二方面，本发明还提供一组检测II型非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株与II型非洲猪瘟病毒流行株的特异性荧光探针组。

进一步的，所述II型非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株与II型非洲猪瘟病毒流行株的特异性荧光探针组分别是检测探针c和检测探针d；

所述探针c的核苷酸序列如SEQ ID No.5；探针d的核苷酸序列如SEQ ID No.6。

优选的，所述特异性荧光探针的荧光基团选自用FAM和/或ROX；所述特异性荧光探针的淬灭基团选自BHQ1和/或BHQ2。

在一种实施例中，选用FAM和ROX 2种5'修饰基团，其波长处于不同的光谱范围，相互干扰少，具有明显的区分效果和信号强度。

通过采用上述的引物组和检测探针组进行II型非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株与II型非洲猪瘟病毒流行株的鉴别时，对模板DNA的扩增效率更高，有利于得到敏感性更高、最低检测限更低的检测结果，从而使得检测结果更加准确。

第三方面，本发明提供一种区分II型非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株与II型非洲猪瘟病毒流行株双重荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括P72基因的上游引物a和下游引物a，I177L基因的上游引物b和下游引物b，检测探针组c和d，进一步所述试剂盒中还包括DNA提取试剂、荧光定量PCR扩增试剂、阳性对照和阴性对照。

第四方面，本发明提供一种上述试剂盒的应用，采用如下的技术方案：一种上述试剂盒的应用，所述试剂盒用于II型非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株与II型非洲猪瘟病毒流行株感染的鉴别检测。

第五方面，本发明还提供一种II型非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株与II型非洲猪瘟病毒流行株双重荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：

S01、提取待检测核酸，得到核酸样品；

S02、准备PCR反应体系溶液，其中加入引物组为SEQ ID No.1，SEQ ID No.2和SEQID No.3和SEQ ID No.4；加入探针组为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6。

S03、进行PCR反应；

S06、对实验结果进行判定分析。

S07、实验结果分析。

Ct值为38定为判定检测结果阳性与阴性的临界值；当Ct值≤38，判探针相对应的基因为阳性；Ct值＞38，判为阴性；

当对敏感性要求更高时，可将阳性CT判定值提高至40；

当对稳定性要求更高时，可将阳性CT判定值降低至35。

本发明的有益效果：

1、本发明建立了一种特异性强、敏感性高、重复性好，可以快速、高效鉴别II型非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株与II型非洲猪瘟病毒流行株的双重qPCR方法。提供了配套的能区分疫苗免疫与野毒感染动物的鉴别检测方法，对其临床应用提供了有效的技术支持。

2.、本发明的专用试剂盒经济实惠，仅需一次qPCR扩增即可鉴别出两个基因，节约了检测成本和时间。

附图说明

图1I177L、P72基因标准曲线双重qPCR标准曲线

图2双重qPCR的特异性试验

图3双重qPCR的敏感性试验

具体实施方式

本实施例所使用毒株：非洲猪瘟病毒基因缺失弱毒株HLJ/18-ΔI177L株为中国农业科学院哈尔滨兽医研究所完全按照美国I177L基因缺失株相关报道进行构建，与I177L序列完全相同。此外，实施例中所使用的其他毒株：非洲猪瘟强毒CN/HLJ/18株、猪痘病毒Kasza株(Suipoxvirus,SPV)、猪伪狂犬病毒HeN1株(Pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒2型LG株(Porcine circovirus type 2,PCV2)、猪细小病毒HB株(Porcine parvovirus,PPV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and syndrome virus,PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus,TGEV)和猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus,PEDV)，均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究制鉴定和保管。

本实施例所使用II型非洲猪瘟病毒流行株ASFV I177L基因与美国的G07毒株序列一样，因此本研究采用中国流行株构建的I177L基因缺失株进行替代。

本文实施例中，在靶点选择上，选择P72基因保守区域作为扩增目的基因之一，用于区分ASFV与其它病毒；其次选择HLJ/18-ΔI177L缺失的I177L基因为靶标，以确定毒株是否缺失相关基因，最终达到一个反应区分两种毒株的目的，从而能从分子水平鉴定HLJ/18-ΔI177L与野毒株。

本实施例中所使用阳性质粒标准品pMD-18T-P72和Pblue-P72由本实验室构建。DNA/RNA提取试剂盒购自TIANGEN公司；HiScriptⅡ反转录酶、荧光定量PCR扩增用酶AceQqPCR Probe Master Mix均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司FluorescentQuantitative PCR Instrument(QuantStudio 5)实时荧光PCR仪为美国ABI公司产品。

如本文所述“双重荧光定量PCR”，它是在同一qPCR反应体系里加上两组引物和探针，同时扩增并检测两个个核酸片段的qPCR反应，是一种快速准确的检测方法。本发明综合利用多重qPCR的优势，利用2组引物和探针分别扩增非洲猪瘟病毒P72和I177L基因，特异性强，灵敏度高，可重复性好。

实施例1引物和探针的设计

根据GenBank中登录的非洲猪瘟CN/HLJ/18基因组序列(MK333180.1)和HLJ/18-ΔI177L候选疫苗株的基因缺失策略，利用Primer premier 5.0软件选择P72基因(GenBankNo.22220311)、I177L(GenBank No.41902005)基因区域分别设计2对引物及探针(表1)。HPLC级引物及探针均由吉林省库美生物工程有限公司合成。用无RNA酶的PCR级水将引物/探针干粉进行溶解，制备贮存引物/探针浓度为100μM，工作浓度为10μM。双重qPCR引物及探针序列如表1所示；

表1双重qPCR引物及探针序列

实施例2qPCR方法的建立

在成功建立单重qPCR检测体系的基础上，通过改变引物与探针的浓度以达到最佳扩增效率，进而建立双重qPCR检测体系。对混合质粒标准品进行梯度稀释，使得三种质粒浓度分别为1×10⁰～1×10⁶拷贝/μL、1×10⁰～1×10⁶拷贝/μL，并作为模板进行qPCR检测，每个浓度做3个重复。以Ct值为y轴，基因拷贝数为x轴，制作标准曲线。

对双重qPCR体系进行优化后最终确定反应体系为20μL：2×AceQ qPCR ProbeMaster Mix 10μL；两对上、下游引物(10μM)各0.3μL，探针(10μM)各0.2μL；模板6μL；用ddH₂O补足至20μL；同时设置阴性对照。

反应程序为：95℃5min；95℃10s，60℃30s，共40个循环；每个循环结束时收集荧光信号。

将混合质粒标准品10倍倍比稀释，使得两种种质粒浓度均为1×10⁰～1×10⁶拷贝/μL，经qPCR扩增，建立的标准曲线结果显示三种质粒的浓度在1×100拷贝/μL～1×106拷贝/μL范围内时，同一稀释度的3次重复的Ct值(Ct值≤38)无明显差异，且质粒稀释度均与其Ct值具有良好的线性关系。I177L基因(ROX通道)标准曲线相关系数R2为0.998，标准曲线方程为Y＝-3.239X+40.054，扩增效率为103.577％。P72基因(FAM通道)标准曲线相关系数R2为0.999，标准曲线方程为Y＝-3.465X+42.138，扩增效率为94.368％。(图1)。表明建立的双重qPCR方法能够用于上述两种基因的相对定量检测。

实施例3特异性试验

用DNA/RNA提取试剂盒提取CN/HLJ/18、HLJ/18-ΔI117L株以及SPV、PRV、PCV、PPV、CSFV、PRRSV、TGEV、PEDV的核酸作为模板，利用建立的双重qPCR进行扩增，同时以去离子水为阴性对照，评估该检测方法的特异性。

特异性试验结果显示，除CN/HLJ/18、HLJ/18-Δ177L外，其余病毒及阴性对照检测结果均为阴性，其中CN/HLJ/18可同时检到I177L和P72两种基因，HLJ/18-Δ177L只能检到P72基因(图2)，表明该检测方法在能有效区分CN/HLJ/18与HLJ/18-Δ177L的基础上，对于猪的其他易感病毒的核酸均检测不到上述两种基因，证明该双重qPCR方法特异性良好。

实施例4敏感性试验

将混合质粒标准品(pMD-18T-P72和Pblue-I117L)10倍倍比稀释(1×10⁶～1×10⁰拷贝/μL)后，利用建立的双重qPCR扩增，同时设去离子水为阴性对照，确定该方法对质粒标准品的检测下限。此外，将CN/HLJ/18株、HLJ/18-Δ177L核酸作10倍倍比稀释(CN/HLJ/18株105.11～100.11TCID50/ml；HLJ/18-Δ177L株106.93～101.93TCID50/ml)后，利用优化后的双重qPCR扩增，确定该方法对病毒滴度的检测下限。

敏感性试验结果显示，对分别含有ASFV的P72和I177L基因的混合阳性质粒标准品的最低检测下限大约为6拷贝/反应；CN/HLJ/2018株的最低检测下限达到102.11TCID50/ml，对HLJ/18-Δ177L株的最低检测下限达到101.93TCID50/ml。表明本实验所建立方法具有良好的敏感性。如图2、图3所示。

实施例5重复性试验

选取同一批4个经10倍倍比稀释(1×10⁶～1×10³拷贝/μL)的质粒标准品作为模板，应用建立的方法进行组内重复试验，其中每浓度重复3次；在3个不同时间，对上述4个不同浓度的质粒标准品进行组间重复试验，每个浓度重复3次。根据Ct值计算组内、组间变异系数，评估该方法的重复性。

本实施例中选取10倍梯度稀释均为1×10³～1×10⁶拷贝/μL的P72和I177L两种基因混合质粒标准品作为模板进行双重qPCR。组内重复连续做3次，组间重复是在3个不同的时间分别做3次，每次做3个重复。

试验结果显示：I177L基因的组内和组间变异系数分别为0.22％～1.02％和0.66～0.94％；P72基因的组内和组间变异系数分别为0.40％～0.83％和0.39％～10.6％；重复性试验结果如表2所示，该方法组内、组间变异系数均小于2％，具有较好的重复性。因此，基于TaqMan探针的双重qPCR检测方法具有较好的重复性。

表2双重qPCR的重复性试验

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Claims (8)

1.一组灵敏度和特异性较高的双重荧光定量PCR特异性引物，所述双重荧光定量PCR特异性引物是用于鉴别检测II型非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株与II型非洲猪瘟病毒流行株，其中特异性引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～2和SEQ ID NO.3～4所示。

2.一组检测检测II型非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株与II型非洲猪瘟病毒流行株的特异性荧光探针，其特征在于所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示。

3.一种II型非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株与II型非洲猪瘟病毒流行株的双重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述引物和/或权利要求2所述探针。

4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括探针法荧光定量PCR预混液、阳性对照和阴性对照的一种或几种。

5.权利要求1所述引物和/或权利要求2所述探针在制备检测II型非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株与II型非洲猪瘟病毒流行株试剂盒中的应用。

6.一种II型非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株与II型非洲猪瘟病毒流行株双重荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：

S01、提取待检测核酸，得到核酸样品；

S02、准备PCR反应体系溶液，其中加入的引物组为SEQ ID NO.1～2和SEQ ID NO.3～4；探针组为SEQ ID NO.5～6；

S03、进行PCR反应；

S04、对实验结果进行判定分析；

S05、实验结果分析；

Ct值为38定为判定检测结果阳性与阴性的临界值；当Ct值≤38，判探针相对应的基因为阳性；Ct值＞38，判为阴性。

7.如权利要求6所述的方法，当对敏感性要求更高时，可将阳性CT判定值提高至40。

8.如权利要求6所述的方法，当对稳定性要求更高时，可将阳性CT判定值降低至35。

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