JP4463592B2 - 酢酸耐性乳酸菌検出用核酸 - Google Patents
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醸協1985 Vol 80 No,10 710〜714 醸協2000 Vol 95 No,1 39〜45 食品工業 1998 Vol 41 No,20 25〜34
(a)配列番号1で示される塩基配列の一部であって、当該塩基配列の20番目から36番目を含む17〜36の連続した塩基配列、若しくはその相補配列、又は当該塩基配列に対して90%以上の配列同一性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(b)配列番号2で示される塩基配列の一部であって、当該塩基配列の36番目から20番目を含む17〜36の連続した塩基配列、若しくはその相補配列、又は当該塩基配列に対して90%以上の配列同一性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(a)配列番号1で示される塩基配列の一部であって、当該塩基配列の20番目から36番目を含む17〜36の連続した塩基配列、若しくはその相補配列、又は当該塩基配列に対して90%以上の配列同一性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(b)配列番号2で示される塩基配列の一部であって、当該塩基配列の36番目から20番目を含む17〜36の連続した塩基配列、若しくはその相補配列、又は当該塩基配列に対して90%以上の配列同一性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
本発明のオリゴヌクレオチドは、DNA自動合成機等を用いて化学合成することにより、又はラクトバチルス・フラクチボランスの遺伝子から酵素的に切り出すことにより調製できるが、大量且つ安価に一定品質のオリゴヌクレオチドを得られる点から化学合成により調製するのが好ましい。
また、塩基配列の同一性については、Lipman-Pearson法 (Science, 227, 1435, 1985) によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win(ソフトウェア開発製)のホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いて、パラメーターであるUnit size to compare(ktup)を2として解析を行うことにより算出される。
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列に対して90%以上の配列同一性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとしては、その配列同一性が95%以上であるのが好ましく、さらには97%以上の配列同一性を有する塩基配列が好ましく、これらには、配列番号1で示される塩基配列において20番目から36番目を含む17〜36の連続した塩基配列若しくはその相補配列に1又は数個、好ましくは1又は2個、より好ましくは1個の塩基の欠失、挿入あるいは置換といった変異や、修飾された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドも包含される。
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列に対して90%以上の配列同一性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとしては、その配列同一性が95%以上であるのが好ましく、さらには97%以上の配列同一性を有する塩基配列が好ましく、これらには、配列番号2で示される塩基配列において36番目から20番目を含む17〜36の連続した塩基配列若しくはその相補配列に1又は数個、好ましくは1又は2個、より好ましくは1個の塩基の欠失、挿入あるいは置換といった変異や、修飾された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドも包含される。
すなわち、本発明オリゴヌクレオチドを核酸プローブとして用い、公知の方法(FISH法、ドットプロット法、サザンプロット法、ノーザンプロット法等)により、ラクトバチルス・フラクチボランスを検出すること、或いは、本発明オリゴヌクレオチドを核酸プライマーとしてDNAポリメラーゼ等により伸長反応させてラクトバチルス・フラクチボランスを検出すること、により試料中のラクトバチルス・フラクチボランスを検出・同定、定量することができる。
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、固相担体に結合させて捕捉プローブとして用いることもできる。この場合、捕捉プローブと、標識核酸プローブの組み合わせでサンドイッチアッセイを行ってもよいし、標的核酸を標識して捕捉することでもよい。
尚、かかる標識の検出手段としては、検出プローブが放射性同位元素で標識されている場合にはオートラジオグラフィー等、蛍光物質で標識されている場合には蛍光顕微鏡等、化学発光物質で標識されている場合には感光フィルムを用いた解析やCCDカメラを用いたデジタル解析等が挙げられる。
15mL用の無菌チューブに4%PFA9mL・菌液(×106以上)3mLを添加した。3H以上4℃で保存した後、遠心機(HITACHI CF16RX)で4000rpmで10分間遠心を行った。上澄み液を廃棄後、1×PBSで再懸濁してもう一度4000rpmで10分間遠心した。上澄み廃棄後に1×PBS:エタノール=1:1にしたものを添加したものをサンプルとした。疎水性コートスライドガラスに1ウェルに付きサンプル3μLを添加した。46℃で乾燥させた後、50・80・98%(v/v)各3分間エタノール脱水して自然乾燥した。各ウェルに50μg/mLリゾチーム20μL添加して30℃20minで反応させた。その後、自然乾燥し、ハイブリダイゼーションバッファー(0.9M塩化ナトリウム・0.01%w/vSDS・20mMトリス塩酸・20 w/vホルムアミド)8μL・本発明プローブ(Cy3)(配列番号3及び6)30ngを添加し、46℃で2H保存した。ウォシングバッファー(塩化ナトリウム180mM・0.01%w/vSDS・20mMトリス塩酸・5mM EDTA)で20分間洗浄して自然乾燥した。DAPIを含んだ褪色防止剤を加え、カバーグラスをかぶせてコーティングして蛍光顕微鏡(オリンパスAX−70・フィルター U−DMcy3)で観察した。その結果、Lactobacillus fructivoransを検出できた。
MRS+0.5%塩酸及び酢酸の寒天培地・30℃で定常期まで培養し、集菌後、Dneasy TissueKit(qiagen)でそれぞれの菌体より全DNAを取得した。DNA量0.05μg/μL、このDNA 1μLとし、本発明プライマー(20pg/μL)ペアー1μL(フォワードプライマー(配列番号3):0.5μL+リバースプライマー(配列番号6):0.5μL)・Pre Mix Taq(Ex Taq Version)(宝バイオ)を13μLと無菌蒸留水(DNA/RNA Free)10μLを0.2mL用チューブ(エッペンドルフ社)に接種、25μLのPCR反応溶液に調整した後、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーDICE(宝バイオ)で増幅反応を行った。反応条件は、2ステップPCR条件では95℃、10分間後→95℃・30秒間→68℃・45秒間のサイクルを30サイクル行なった後、68℃10分間反応させた。3ステップのPCR条件では95℃、10分間後→95℃・30秒間→55℃・30秒間→72℃・45秒間の合成反応のサイクルを30サイクル→72℃10分間反応させた。対照実験として、ゲノムDNAを含まない反応系と他種の乳酸菌(5種類)Lactobacillus.paracasei、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus breves、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus fermentamでもPCRを同様に行った。PCR反応終了後、PCR反応液から10μLを分取し、3 %アガロースゲルで電気泳動を行い、エチジウムブロマイドでDNAを染色後、増幅されたDNAを確認した。Lactobacillus fructivoransの遺伝子を含む反応では400〜500bp程度の塩基の増幅が確認されターゲット細菌を含んだサンプルを選抜できた。対照実験からはDNA断片の増幅は認められなかった。
Claims (6)
- 下記の(a)及び(b)の少なくとも1で示されるラクトバチルス・フラクチボランス検出用核酸プローブ
(a)配列番号3で示される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチド
(b)配列番号6で示される塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチド
又は
下記の(a)及び(b)からなるラクトバチルス・フラクチボランス検出用核酸プライマーセット
(a)配列番号3で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(b)配列番号6で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。 - 請求項1に記載の核酸プローブを標識化し、得られた標識核酸プローブを試料中のDNA又はRNAと交雑させ、交雑した結合体の標識を測定することを特徴とする試料中のラクトバチルス・フラクチボランスの検出法。
- 請求項1に記載のプライマーセット又は該プライマーセットを標識化した標識プライマーセットを試料中のDNA又はRNAと交雑させ、プライマー伸長させ、得られたプライマー伸長物を測定することを特徴とする試料中のラクトバチルス・フラクチボランスの検出法。
- PCR反応によりプライマー伸長を行うものである請求項3記載のラクトバチルス・フラクチボランスの検出法。
- 請求項1に記載の核酸プローブを標識化した標識核酸プローブを含有する試料中のラクトバチルス・フラクチボランスの検出キット。
- 請求項1に記載のプライマーセット又は該プライマーセットを標識化した標識プライマーセットを含有する試料中のラクトバチルス・フラクチボランスの検出キット。
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