JP2019201626A - 細菌の検査方法、細菌の検査用マイクロアレイ、細菌の検査用キット、細菌の検査用プローブセット、及び細菌の検査用プライマーセット - Google Patents
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Abstract
【課題】 細菌の存在を確認する検査において、現存するリステリア属菌を精度高く特異的に検出することを可能とする。【解決手段】 試料中における細菌の存在を検査する方法であって、対象となる細菌は、以下の（１）〜（１０）に記載のリステリア属菌から選ばれ、（１）Listeria floridensis、（２）Listeria weihenstephanensis、（３）Listeria cornellensis、（４）Listeria riparia、（５）Listeria grandensis、（６）Listeria booriae、（７）Listeria newyorkensis、（８）Listeria aquatica、（９）Listeria fleischmannii、（１０）Listeria marthii、前記方法は、（ａ）ｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic spacer）領域の増幅用プライマーセットを含む反応液を調製する調製工程、及び、（ｂ）調製工程により得られた反応液を使用して、試料に含まれる対象となる細菌の核酸を増幅する増幅工程を含む細菌の検査方法とする。【選択図】 なし
Description
本発明は、食品製造施設などにおいて問題視される、リステリア属菌を対象とする検査技術に関する。
リステリア属菌は、現在、全１７菌種の存在が確認されており、このうちリステリア モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）が食中毒の病原菌種である。リステリア モノサイトゲネスを原因とした食中毒は、妊婦や新生児、高齢者、及び免疫システムが弱った人などにおいて発症し易く、米国では近年、毎年１，６００人程度が罹患し、約２６０が死亡していることが報告されている。
リステリア属菌の検出手法としては、ＶＩＤＡＳ（登録商標、ビオメリュー）法が知られている。しかしながら、例えばリステリア ロコゥティエ（Listeria rocourtiae）をこの手法に供試すると、リステリア モノサイトゲネスと識別されて、誤判定になるという問題があった。
このようなことから、リステリア属菌における全１７菌種を正確に識別することが望ましいが、そのような検査キットはこれまで存在していなかった。
このようなことから、リステリア属菌における全１７菌種を正確に識別することが望ましいが、そのような検査キットはこれまで存在していなかった。
Dmitriy Volokhov. et al., Identification of Listeria Species by Microarray-Based Assaay. J.Clin.Microbiol., 40, 12, (2002),4720-4728
Jun Wang. et al., Rapid identification of Listeria species and screening for variants by melting curve and high-resoulution melting curve analyses of the intergenic spacer region of the rRNA gene. Can.J. Microbiolo. 56: (2010),676-682
ここで、リステリア属菌の検出手法に関する先行文献としては、特許文献１に記載の微生物の多重検出方法を挙げることができる。この方法によれば、食品中のリステリア モノサイトゲネスを含む２種以上の異なる特性の微生物を、一定の条件下で検出することが可能となっている。
しかしながら、この方法では、リステリア属菌における全１７菌種を正確に識別することはできなかった。
しかしながら、この方法では、リステリア属菌における全１７菌種を正確に識別することはできなかった。
また、非特許文献１には、検査対象の遺伝子領域をｉａｐとして、リステリア グレイ（Listeria grayi）、リステリア イノキュア（Listeria innocua）、リステリア イバノビ（Listeria ivanovii）、リステリア モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、リステリア シリゲリ（Listeria seeligeri）、リステリア ウェルシメリ（Listeria welshimeri）の６菌種を検出する手法が記載されている。
また、非特許文献２には、検査対象の遺伝子領域をＩＧＳとして、上記と同じ６菌種を検出する手法が記載されている。
しかしながら、これらのいずれの文献にも、リステリア属菌における全１７菌種を検出する手法については、記載されていない。
また、非特許文献２には、検査対象の遺伝子領域をＩＧＳとして、上記と同じ６菌種を検出する手法が記載されている。
しかしながら、これらのいずれの文献にも、リステリア属菌における全１７菌種を検出する手法については、記載されていない。
さらに、リステリア属菌における全１７菌種のうち、リステリア フロリデンシス（Listeria floridensis）、リステリア ウェヘンステップハネンシス（Listeria weihenstephanensis）、リステリア コーネレンシス（Listeria cornellensis）、リステリア リパリア（Listeria riparia）、リステリア グランデンシス（Listeria grandensis）、リステリア ボオリアエ（Listeria booriae）、リステリア ニュヨークネンシス （Listeria newyorkensis）、リステリア アクアティカ（Listeria aquatica）、リステリア フレッシュマンニ（Listeria fleischmannii）、リステリア マルティ（Listeria marthii）の１０菌種については、これまで検出することができなかった。
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、リステリア属菌における全１７菌種を正確に識別することが可能な細菌の検査方法、細菌の検査用マイクロアレイ、細菌の検査用キット、細菌の検査用プローブセット、及び細菌の検査用プライマーセットの提供を目的とする。
上記目的を達成するため、本発明の細菌の検査方法は、試料中における細菌の存在を検査する方法であって、対象となる細菌は、以下の（１）〜（１０）に記載のリステリア属菌から選ばれ、（１）リステリア フロリデンシス（Listeria floridensis）、（２）リステリア ウェヘンステップハネンシス（Listeria weihenstephanensis）、（３）リステリア コーネレンシス（Listeria cornellensis）、（４）リステリア リパリア（Listeria riparia）、（５）リステリア グランデンシス（Listeria grandensis）、（６）リステリア ボオリアエ（Listeria booriae）、（７）リステリア ニュヨークネンシス （Listeria newyorkensis）、（８）リステリア アクアティカ（Listeria aquatica）、（９）リステリア フレッシュマンニ（Listeria fleischmannii）、（１０）リステリア マルティ（Listeria marthii）、前記方法は、（ａ）ｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic spacer）領域の増幅用プライマーセットを含む反応液を調製する調製工程、及び、（ｂ）前記調製工程により得られた反応液を使用して、前記試料に含まれる前記対象となる細菌の核酸を増幅する増幅工程を含む方法としてある。
また、本発明の細菌の検査用マイクロアレイは、試料中における細菌の存在を検出する細菌の検査用マイクロアレイであって、上記の（１）〜（１０）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic spacer）領域から選択された配列番号３２〜４３、４７に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかが固定化された構成としてある。
また、本発明の細菌の検査用キットは、試料中における細菌の存在を検出する細菌の検査用キットであって、上記の（１）〜（１０）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic spacer）領域から選択された配列番号３２〜４３、４７に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかが固定化されたマイクロアレイと、前記プローブとハイブリダイゼーション（相補的結合）をする核酸を増幅するための配列番号１６、１７に示す塩基配列のプライマーからなるプライマーセットとを含む構成としてある。
また、本発明の細菌の検査用プローブセットは、試料中における細菌の存在を検査する細菌の検査用プローブセットであって、上記の（１）〜（１０）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic spacer）領域から選択された配列番号３２〜４３、４７に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかからなる構成としてある。
また、本発明の細菌の検査用プライマーセットは、試料中における細菌の存在を検査する細菌の検査用プライマーセットであって、上記の（１）〜（１０）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic spacer）領域から選択された配列番号３２〜４３、４７に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかとハイブリダイゼーションをする核酸を増幅するための配列番号１６、１７に示す塩基配列のプライマーからなる構成としてある。
本発明によれば、リステリア属菌における全１７菌種を正確に識別することが可能となる。
以下、本発明の細菌の検査方法、細菌の検査用マイクロアレイ、細菌の検査用キット、細菌の検査用プローブセット、及び細菌の検査用プライマーセットの一実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の本実施形態及び後述する実施例の具体的な内容に限定されるものではない。
本実施形態の細菌の検査方法は、試料中における細菌の存在を検査する方法であって、対象となる細菌は、以下の（１）〜（１０）に記載のリステリア属菌から選ばれ、
（１）リステリア フロリデンシス（Listeria floridensis）、
（２）リステリア ウェヘンステップハネンシス（Listeria weihenstephanensis）、
（３）リステリア コーネレンシス（Listeria cornellensis）、
（４）リステリア リパリア（Listeria riparia）、
（５）リステリア グランデンシス（Listeria grandensis）、
（６）リステリア ボオリアエ（Listeria booriae）、
（７）リステリア ニュヨークネンシス （Listeria newyorkensis）、
（８）リステリア アクアティカ（Listeria aquatica）、
（９）リステリア フレッシュマンニ（Listeria fleischmannii）、
（１０）リステリア マルティ（Listeria marthii）、
この方法は、
（ａ）ｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic spacer）領域の増幅用プライマーセットを含む反応液を調製する調製工程、及び、
（ｂ）前記調製工程により得られた反応液を使用して、前記試料に含まれる前記対象となる細菌の核酸を増幅する増幅工程を含むことを特徴とする。
（１）リステリア フロリデンシス（Listeria floridensis）、
（２）リステリア ウェヘンステップハネンシス（Listeria weihenstephanensis）、
（３）リステリア コーネレンシス（Listeria cornellensis）、
（４）リステリア リパリア（Listeria riparia）、
（５）リステリア グランデンシス（Listeria grandensis）、
（６）リステリア ボオリアエ（Listeria booriae）、
（７）リステリア ニュヨークネンシス （Listeria newyorkensis）、
（８）リステリア アクアティカ（Listeria aquatica）、
（９）リステリア フレッシュマンニ（Listeria fleischmannii）、
（１０）リステリア マルティ（Listeria marthii）、
この方法は、
（ａ）ｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic spacer）領域の増幅用プライマーセットを含む反応液を調製する調製工程、及び、
（ｂ）前記調製工程により得られた反応液を使用して、前記試料に含まれる前記対象となる細菌の核酸を増幅する増幅工程を含むことを特徴とする。
また、対象となる細菌には、さらに以下の（１１）〜（１７）に記載のリステリア属菌から選ばれる細菌が含まれることが好ましい。
（１１）リステリア グレイ（Listeria grayi）
（１２）リステリア イノキュア（Listeria innocua）
（１３）リステリア イバノビ（Listeria ivanovii）
（１４）リステリア モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）
（１５）リステリア ロコゥティエ（Listeria rocourtiae）
（１６）リステリア シリゲリ（Listeria seeligeri）
（１７）リステリア ウェルシメリ（Listeria welshimeri）
（１１）リステリア グレイ（Listeria grayi）
（１２）リステリア イノキュア（Listeria innocua）
（１３）リステリア イバノビ（Listeria ivanovii）
（１４）リステリア モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）
（１５）リステリア ロコゥティエ（Listeria rocourtiae）
（１６）リステリア シリゲリ（Listeria seeligeri）
（１７）リステリア ウェルシメリ（Listeria welshimeri）
上記（１）〜（１０）の１０種類の対象菌のゲノム配列は、本願の出願時点のＤＤＢＪ（DNA Data Bank of Japan）において未報告となっていた。このため、本実施形態の細菌の検査方法、細菌の検査用マイクロアレイ、細菌の検査用キット、細菌の検査用プローブセット、及び細菌の検査用プライマーセットについて開発を行うにあたり、まずこれら１０菌種のＩＧＳ（intergenic spacer）領域の解析を行った。
ＩＧＳ領域は、ｒＲＮＡ遺伝子の１６ＳｒＲＮＡと２３ＳｒＲＮＡの間に存在する領域であり、この領域内の種特異的配列が存在すると推定した領域について、塩基配列を解析した。
ＩＧＳ領域は、ｒＲＮＡ遺伝子の１６ＳｒＲＮＡと２３ＳｒＲＮＡの間に存在する領域であり、この領域内の種特異的配列が存在すると推定した領域について、塩基配列を解析した。
具体的には、図１に示す配列番号１、２に示すプライマーセットを用いて、上記１０菌種のＩＧＳ領域を解析した。なお、同図において、「Ｆ／Ｒ」は、Ｆがフォワードプライマーを、Ｒがリバースプライマーを示す。
その結果得られた塩基配列を図２、３に示す。図２には、リステリア フロリデンシス、リステリア ウェヘンステップハネンシス、リステリア コーネレンシス、リステリア リパリア、リステリア グランデンシスのＩＧＳ領域における塩基配列（順に配列番号３〜７）が示されている。また、図３には、リステリア ボオリアエ、リステリア ニュヨークネンシス、リステリア アクアティカ、リステリア フレッシュマンニ、リステリア マルティのＩＧＳ領域における塩基配列（順に配列番号８〜１２）が示されている。
また、リステリア マルティについては、より有効なプローブを見いだすために、ＩＧＳ領域を再度解析して、図２３に示す塩基配列（配列番号４６）を得た。
また、図示しないが、リステリア グレイ、リステリア イノキュア、リステリア イバノビ、リステリア モノサイトゲネス、リステリア ロコゥティエ、リステリア シリゲリ、リステリア ウェルシメリのＩＧＳ領域における塩基配列をＤＤＢＪから取得した。
そして、これら１７種類のリステリア属菌のＩＧＳ領域における塩基配列を比較して、本実施形態の細菌の検査用プローブセット及び細菌の検査用プライマーセットの設計箇所を決定した。
そして、これら１７種類のリステリア属菌のＩＧＳ領域における塩基配列を比較して、本実施形態の細菌の検査用プローブセット及び細菌の検査用プライマーセットの設計箇所を決定した。
具体的には、上記の調製工程において調製される反応液に含まれるｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic spacer）領域の増幅用プライマーセットは、図７の配列番号１６に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号１７に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとからなる。
また、上記の増幅工程により増幅された核酸とハイブリダイゼーションを行う、ｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic spacer）領域から選択されたプローブセットは、図８の配列番号１８〜３１に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるプローブと図９の配列番号３２〜４３に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるプローブとからなる群から選択された少なくともいずれかからなる。
なお、ＰＣＲ反応によるＤＮＡの増幅が適切に行えたか否かを判定するために用いるインターナルコントロールとしてのプラスミドを検出するためのプローブが、図９の配列番号４５に示されている。
なお、ＰＣＲ反応によるＤＮＡの増幅が適切に行えたか否かを判定するために用いるインターナルコントロールとしてのプラスミドを検出するためのプローブが、図９の配列番号４５に示されている。
また、リステリア マルティについては、より有効なプローブとして、図２３の配列番号４７に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるものを設計した。
すなわち、上記の増幅工程により増幅された核酸とハイブリダイゼーションを行う、ｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic spacer）領域から選択されたプローブセットは、配列番号１８〜３１に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるプローブと配列番号３２〜４３、４７に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるプローブとからなる群から選択された少なくともいずれかからなるものとすることも好ましい。
すなわち、上記の増幅工程により増幅された核酸とハイブリダイゼーションを行う、ｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic spacer）領域から選択されたプローブセットは、配列番号１８〜３１に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるプローブと配列番号３２〜４３、４７に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるプローブとからなる群から選択された少なくともいずれかからなるものとすることも好ましい。
また、上記の反応液には、リステリア属菌の細胞から抽出されたゲノムＤＮＡが含まれる。ゲノムＤＮＡの抽出は、キットによる方法やＤＮＡ抽出装置を用いる方法など、一般的な手法により行うことができる。
そして、上記の増幅工程において、抽出したゲノムＤＮＡにおける標的領域の増幅が行われる。すなわち、ゲノムＤＮＡにおける標的領域を含むＤＮＡ断片が増幅される。この標的領域の増幅方法は、特に限定されないが、ＰＣＲ法を好適に用いることができる。ＰＣＲ装置としては、一般的なサーマルサイクラーなどを用いることができる。
本実施形態では、例えば以下のような反応条件でＰＣＲを行うことにより、ゲノムＤＮＡにおける標的領域を好適に増幅させることができる。
（ａ）９５℃ １５分、（ｂ）９４℃（ＤＮＡ変性工程） １分、（ｃ）６０℃（アニーリング工程） １分、（ｄ）７２℃（ＤＮＡ合成工程） １分（（ｂ）〜（ｄ）を３５サイクル）、（ｅ）７２℃ １０分
（ａ）９５℃ １５分、（ｂ）９４℃（ＤＮＡ変性工程） １分、（ｃ）６０℃（アニーリング工程） １分、（ｄ）７２℃（ＤＮＡ合成工程） １分（（ｂ）〜（ｄ）を３５サイクル）、（ｅ）７２℃ １０分
ＰＣＲ用反応液としては、例えば以下の組成からなるものを使用することが好ましい。
すなわち、核酸合成基質（ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（dCTP、dATP、dTTP、dGTP））、プライマーセット、核酸合成酵素（ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなど）、検体のゲノムＤＮＡ、緩衝液、及び残りの成分として滅菌水を含むＰＣＲ反応液を好適に使用することができる。
すなわち、核酸合成基質（ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（dCTP、dATP、dTTP、dGTP））、プライマーセット、核酸合成酵素（ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなど）、検体のゲノムＤＮＡ、緩衝液、及び残りの成分として滅菌水を含むＰＣＲ反応液を好適に使用することができる。
本実施形態において、ハイブリダイゼーションは、以下のように行うことができる。
すなわち、上記の増幅工程により得られた増幅産物を本実施形態の細菌の検査用マイクロアレイに滴下し、これに配置されたプローブにハイブリダイゼーションをした増幅産物の標識を検出することで、増幅産物の有無を確認する。これによって、検査対象の環境中に存在しているリステリア属菌を特定することができる。
すなわち、上記の増幅工程により得られた増幅産物を本実施形態の細菌の検査用マイクロアレイに滴下し、これに配置されたプローブにハイブリダイゼーションをした増幅産物の標識を検出することで、増幅産物の有無を確認する。これによって、検査対象の環境中に存在しているリステリア属菌を特定することができる。
標識の検出は、蛍光スキャニング装置など一般的な標識検出装置を用いて行うことができ、例えば東洋製罐グループエンジリアリング株式会社のGENOGATE(R) readerを用いて、増幅産物の蛍光強度を測定することにより行うことができる。測定結果は、Ｓ／Ｎ比値（Signal to Noise ratio）として得ることが好ましい。Ｓ／Ｎ比値にもとづいて、測定結果が陽性であるか陰性であるかを精度高く判定することができるためである。
後述する実施例で用いたマイクロアレイの場合、Ｓ／Ｎ比値が３．０以上の場合に、陽性と判定することができる。本明細書中に記載のＳ／Ｎ比値は、（メディアン蛍光強度値−バックグラウンド値）÷バックグラウンド値にて算出される。なお、標識としては蛍光に限定されず、その他のものを用いることもできる。
後述する実施例で用いたマイクロアレイの場合、Ｓ／Ｎ比値が３．０以上の場合に、陽性と判定することができる。本明細書中に記載のＳ／Ｎ比値は、（メディアン蛍光強度値−バックグラウンド値）÷バックグラウンド値にて算出される。なお、標識としては蛍光に限定されず、その他のものを用いることもできる。
また、本実施形態の細菌の検査用マイクロアレイは、試料中における細菌の存在を検査するものであり、上記の（１）〜（１０）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic spacer）領域から選択された配列番号３２〜４３、４７に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかが固定化されたことを特徴とする。
また、本実施形態の細菌の検査用マイクロアレイは、さらに上記の（１１）〜（１７）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic spacer）領域から選択された配列番号１８〜３１に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかが固定化されたものとすることが好ましい。
さらに、本実施形態の細菌の検査用マイクロアレイは、配列番号１８〜４３、４７に示す塩基配列を有するプローブの全部又は一部を固定化したものとすることができる。
また、本実施形態の細菌の検査用マイクロアレイは、さらに上記の（１１）〜（１７）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic spacer）領域から選択された配列番号１８〜３１に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかが固定化されたものとすることが好ましい。
さらに、本実施形態の細菌の検査用マイクロアレイは、配列番号１８〜４３、４７に示す塩基配列を有するプローブの全部又は一部を固定化したものとすることができる。
また、本実施形態の細菌の検査用マイクロアレイは、配列番号１８〜４３、４７に示す塩基配列を有するプローブを用いて、既存の一般的な方法で製造することができる。
例えば、このマイクロアレイとして、貼り付け型のＤＮＡチップを作成する場合は、ＤＮＡスポッターによりプローブをガラス基板上に固定化して、各プローブに対応するスポットを形成することにより作成することができる。また、合成型ＤＮＡチップを作成する場合は、光リソグラフィ技術により、ガラス基板上で上記配列を備えた一本鎖オリゴＤＮＡを合成することにより作成することができる。さらに、基板はガラス製に限定されず、プラスチック基板やシリコンウエハー等を用いることもできる。また、基板の形状は平板状のものに限定されず、様々な立体形状のものとすることもでき、その表面に化学反応が可能となるように官能基を導入したものなどを用いることもできる。
例えば、このマイクロアレイとして、貼り付け型のＤＮＡチップを作成する場合は、ＤＮＡスポッターによりプローブをガラス基板上に固定化して、各プローブに対応するスポットを形成することにより作成することができる。また、合成型ＤＮＡチップを作成する場合は、光リソグラフィ技術により、ガラス基板上で上記配列を備えた一本鎖オリゴＤＮＡを合成することにより作成することができる。さらに、基板はガラス製に限定されず、プラスチック基板やシリコンウエハー等を用いることもできる。また、基板の形状は平板状のものに限定されず、様々な立体形状のものとすることもでき、その表面に化学反応が可能となるように官能基を導入したものなどを用いることもできる。
また、本実施形態の細菌の検査用キットは、試料中における細菌の存在を検査するものであり、上記の（１）〜（１０）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic spacer）領域から選択された配列番号３２〜４３、４７に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかが固定化されたマイクロアレイと、マイクロアレイに固定化されたプローブとハイブリダイゼーションをする核酸を増幅するための配列番号１６、１７に示す塩基配列のプライマーからなるプライマーセットとを含むことを特徴とする。
また、本実施形態の細菌の検査用キットは、さらに上記の（１１）〜（１７）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic spacer）領域から選択された配列番号１８〜３１に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかが固定化されたものとすることが好ましい。
また、本実施形態の細菌の検査用キットは、さらに上記の（１１）〜（１７）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic spacer）領域から選択された配列番号１８〜３１に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかが固定化されたものとすることが好ましい。
また、本実施形態の細菌の検査用プローブセットは、試料中における細菌の存在を検査するものであり、上記の（１）〜（１０）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic spacer）領域から選択された配列番号３２〜４３、４７に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかからなることを特徴とする。
また、本実施形態の細菌の検査用プローブセットは、さらに上記の（１１）〜（１７）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic spacer）領域から選択された配列番号１８〜３１に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかを含むことが好ましい。
また、本実施形態の細菌の検査用プローブセットは、さらに上記の（１１）〜（１７）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic spacer）領域から選択された配列番号１８〜３１に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかを含むことが好ましい。
また、本実施形態の細菌の検査用プライマーセットは、試料中における細菌の存在を検査するものであり、上記の（１）〜（１０）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic spacer）領域から選択された配列番号３２〜４３、４７に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかとハイブリダイゼーションをする核酸を増幅するための配列番号１６、１７に示す塩基配列のプライマーからなることを特徴とする。
さらに、上記のプローブセットを、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のプローブの少なくともいずれか、これらの二以上、又はこれらの全てを含むものとすることも好ましい。
（Ａ）配列番号１８〜４３、４７に示す塩基配列からなる各プローブ
（Ｂ）上記（Ａ）の各プローブの塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する各プローブ
（Ａ）配列番号１８〜４３、４７に示す塩基配列からなる各プローブ
（Ｂ）上記（Ａ）の各プローブの塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する各プローブ
本実施形態の細菌の検査用プローブセットは、いずれも２１〜３６塩基の長さであり、一般的なＤＮＡ合成装置により合成できる。後述する実施例で用いた配列番号１８〜４３、４７に示す塩基配列からなるプローブは、いずれもＤＮＡ合成装置により合成したものを使用した。
また、本実施形態の細菌の検査用プライマーセットも、１９〜２２塩基の長さであり、実施例でＰＣＲに用いた配列番号１６、１７に示す塩基配列からなるプライマーは、ＤＮＡ合成装置により合成したものを使用した。また、実施例でＰＣＲに用いた配列番号１、２に示す塩基配列からなるプライマーについても、ＤＮＡ合成装置により合成したものを使用した。
また、本実施形態の細菌の検査用プライマーセットも、１９〜２２塩基の長さであり、実施例でＰＣＲに用いた配列番号１６、１７に示す塩基配列からなるプライマーは、ＤＮＡ合成装置により合成したものを使用した。また、実施例でＰＣＲに用いた配列番号１、２に示す塩基配列からなるプライマーについても、ＤＮＡ合成装置により合成したものを使用した。
本実施形態における配列番号１８〜４３、４７に示す塩基配列からなるプローブは、当該配列そのものに限定されず、配列番号１８〜４３、４７に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されたプローブを用いることができる。また、配列番号１８〜４３、４７に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブを用いることもできる。また、これらのプローブや、配列番号１８〜４３、４７に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブを用いることもできる。
なお、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、配列番号１８〜４３、４７に示す塩基配列からなるＤＮＡに対して高い相同性（相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡが、配列番号１８〜４３、４７に示す塩基配列からなるＤＮＡとそれぞれ相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ハイブリダイズする条件が挙げられる。通常、完全ハイブリッドの溶解温度（Ｔｍ）より約５℃〜約３０℃、好ましくは約１０℃〜約２５℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特に11.45節「Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ」に記載されている条件等を使用することができる。
以上説明した本実施形態の細菌の検査方法、細菌の検査用マイクロアレイ、細菌の検査用キット、細菌の検査用プローブセット、及び細菌の検査用プライマーセットによれば、これまでは検査できなかった上記の（１）〜（１０）のリステリア属菌を含む全１７種類のリステリア属菌をそれぞれ特異的に正確に識別することが可能である。
以下、本発明の実施形態に係る細菌の検査方法、細菌の検査用マイクロアレイ、細菌の検査用キット、細菌の検査用プローブセット、及び細菌の検査用プライマーセットを開発ために行った実験、及びこれらの効果を確認するために行った試験について、具体的に説明する。
［実験１］
本実施形態の細菌の検査方法等において対象となる上記の（１）〜（１０）に記載のリステリア属菌のゲノム配列は、本願の出願時点のＤＤＢＪ（DNA Data Bank of Japan）において未報告となっていた。
このため、まずこれら１０菌種のＩＧＳ（intergenic spacer）領域の解析を行った。
本実施形態の細菌の検査方法等において対象となる上記の（１）〜（１０）に記載のリステリア属菌のゲノム配列は、本願の出願時点のＤＤＢＪ（DNA Data Bank of Japan）において未報告となっていた。
このため、まずこれら１０菌種のＩＧＳ（intergenic spacer）領域の解析を行った。
対象菌の菌株としては、ＤＳＭ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen）から入手した以下のものを使用した。
（１）リステリア フロリデンシス（DSM 26687）
（２）リステリア ウェヘンステップハネンシス（DSM 24698）
（３）リステリア コーネレンシス（DSM 26689）
（４）リステリア リパリア（DSM 26685）
（５）リステリア グランデンシス（DSM 26688）
（６）リステリア ボオリアエ（DSM 28860）
（７）リステリア ニュヨークネンシス（DSM 28861）
（８）リステリア アクアティカ（DSM 26686）
（９）リステリア フレッシュマンニ（DSM 25003）
（１０）リステリア マルティ（DSM 23813）
（１）リステリア フロリデンシス（DSM 26687）
（２）リステリア ウェヘンステップハネンシス（DSM 24698）
（３）リステリア コーネレンシス（DSM 26689）
（４）リステリア リパリア（DSM 26685）
（５）リステリア グランデンシス（DSM 26688）
（６）リステリア ボオリアエ（DSM 28860）
（７）リステリア ニュヨークネンシス（DSM 28861）
（８）リステリア アクアティカ（DSM 26686）
（９）リステリア フレッシュマンニ（DSM 25003）
（１０）リステリア マルティ（DSM 23813）
これらのリステリア属菌を菌株毎に個別に培養した。培養は、Ｂｒａｉｎ ＨｅａｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎ（Ｄｉｆｃｏ社製）を用いて、３７℃で、１〜２日間静置させて行った。
次いで、ＤＮＡ抽出キットであるＲＢＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｍｉｎｉ（RBC Bioscience社製） の説明書に沿って、リステリア属菌のゲノムＤＮＡを抽出した。
次いで、ＤＮＡ抽出キットであるＲＢＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｍｉｎｉ（RBC Bioscience社製） の説明書に沿って、リステリア属菌のゲノムＤＮＡを抽出した。
ＰＣＲ用反応液は、一律に、リステリア属菌のＤＮＡのＩＧＳ領域を増幅させるための配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットが含まれるものを使用した。これらのプライマーは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社により合成した。
ＰＣＲ用反応液としては、菌株毎に、次の組成のものを２０μｌ作成した。
１．PCR buffer (QIAGEN社製) 2.0μl
２．dNTP mix (Cat No.BR0600503, biotechrabbit社製) 0.4μl
３．10μMフォワードプライマー(配列番号１） 0.2μl
４．10μMリバースプライマー(配列番号２) 0.2μl
５．HotStarTaq DNA Polymerase(Cat No.203203, QIAGEN社製) 0.1μl
６．Template DNA（10ng/μl） 2.0μl
７．滅菌水（全体が20.0μlになるまで加水）
１．PCR buffer (QIAGEN社製) 2.0μl
２．dNTP mix (Cat No.BR0600503, biotechrabbit社製) 0.4μl
３．10μMフォワードプライマー(配列番号１） 0.2μl
４．10μMリバースプライマー(配列番号２) 0.2μl
５．HotStarTaq DNA Polymerase(Cat No.203203, QIAGEN社製) 0.1μl
６．Template DNA（10ng/μl） 2.0μl
７．滅菌水（全体が20.0μlになるまで加水）
上記各ＰＣＲ用反応液を使用して、核酸増幅装置（Master cycler ep、Eppendorf社）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃ １５分
（b）９４℃ １分
（c）６０℃ １分
（d）７２℃ １分（（b）〜（d）を３５サイクル）
（e）７２℃ １０分
（a）９５℃ １５分
（b）９４℃ １分
（c）６０℃ １分
（d）７２℃ １分（（b）〜（d）を３５サイクル）
（e）７２℃ １０分
次に、ＰＣＲ法による増幅産物の電気泳動を、電気泳動装置（MupidexU、株式会社ミューピッド）を用いて行った。増幅産物の検出器としては、ゲル撮影装置（SCOPE WD、株式会社オプティマ）を使用した。
次に、増幅産物の切り出しと精製を行った。このとき、切り出し／ＤＮＡ精製用キットのHiYield Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit（RBC Bioscience社）を使用した。
次に、増幅産物の切り出しと精製を行った。このとき、切り出し／ＤＮＡ精製用キットのHiYield Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit（RBC Bioscience社）を使用した。
さらに、精製したＤＮＡをＤＮＡシークエンス反応装置（Big Dye(R) X terminator、Thermo Fisher Scientific社)を用いて、シークエンスした。そして、シークエンス後に精製し、ＤＮＡシークエンサー（3130xl Genetic Analyzer, 3730xl DNA Analyzer、Thermo Fisher Scientific社）により泳動、解析を行った。これらのシークエンス及び泳動、解析は、株式会社ファスマックにより行った。その結果、得られた塩基配列を図２、図３、及び図２３に示す。
図２には、（１）リステリア フロリデンシス、（２）リステリア ウェヘンステップハネンシス、（３）リステリア コーネレンシス、（４）リステリア リパリア、（５）リステリア グランデンシスのＩＧＳ領域における塩基配列（順に配列番号３〜７）が示されている。
また、図３には、（６）リステリア ボオリアエ、（７）リステリア ニュヨークネンシス、（８）リステリア アクアティカ、（９）リステリア フレッシュマンニ、（１０）リステリア マルティのＩＧＳ領域における塩基配列（順に配列番号８〜１２）が示されている。
さらに、図２３には、（１０）リステリア マルティのＩＧＳ領域における塩基配列（配列番号４６）が示されている。
これらの塩基配列などにもとづいて、本実施形態の細菌の検査用プローブセット、及び細菌の検査用プライマーセットの設計を行った。
また、図３には、（６）リステリア ボオリアエ、（７）リステリア ニュヨークネンシス、（８）リステリア アクアティカ、（９）リステリア フレッシュマンニ、（１０）リステリア マルティのＩＧＳ領域における塩基配列（順に配列番号８〜１２）が示されている。
さらに、図２３には、（１０）リステリア マルティのＩＧＳ領域における塩基配列（配列番号４６）が示されている。
これらの塩基配列などにもとづいて、本実施形態の細菌の検査用プローブセット、及び細菌の検査用プライマーセットの設計を行った。
［試験１］
本実施形態の細菌の検査方法、細菌の検査用マイクロアレイ、細菌の検査用キット、細菌の検査用プローブセット、及び細菌の検査用プライマーセットの効果を確認するための試験を行った。
本実施形態の細菌の検査用プローブセットは、全１７種類のリステリア属菌のＩＧＳ領域を比較して、特異性の高い領域を特定することにより、設計した。本試験では、これらのプローブセットの特異性（包含性）の検証を行った。
本実施形態の細菌の検査方法、細菌の検査用マイクロアレイ、細菌の検査用キット、細菌の検査用プローブセット、及び細菌の検査用プライマーセットの効果を確認するための試験を行った。
本実施形態の細菌の検査用プローブセットは、全１７種類のリステリア属菌のＩＧＳ領域を比較して、特異性の高い領域を特定することにより、設計した。本試験では、これらのプローブセットの特異性（包含性）の検証を行った。
対象菌の菌株としては、図４、５に示すように、以下のものを使用した。これらは、それぞれ次の機関から入手した。
ATCC: American Type Culture Collection
NCTC: National Collection of Type Cultures
DSM: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
GTC: 岐阜大学
RIMD: 大阪大学微生物病研究所
ATCC: American Type Culture Collection
NCTC: National Collection of Type Cultures
DSM: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
GTC: 岐阜大学
RIMD: 大阪大学微生物病研究所
・サンプル番号１〜６：リステリア グレイ Listeria grayi 順にATCC 25401、ATCC 700545、ATCC 19120、ATCC 25400、ATCC 25403、ATCC 19120
・サンプル番号７〜８：リステリア イノキュア Listeria innocua 順にATCC 33090、NCTC 11288
・サンプル番号９〜１０：リステリア イバノビ 順にListeria ivanovii subsp. ivanovii ATCC 19119、Listeria ivanovii subsp. londoniensis ATCC BAA-139
・サンプル番号１１〜２２：リステリア モノサイトゲネス Listeria monocytogenes 順にATCC 7644、SLR 2249、ATCC 19112、ATCC 19111、ATCC 15313、ATCC 19115、ATCC 13932、NCTC 10890、ATCC BAA-751、ATCC 19114、ATCC 19118、NCTC 11994
・サンプル番号２３：リステリア ロコゥティエ Listeria rocourtiae DSM 22097
・サンプル番号２４〜２７：リステリア シリゲリ Listeria seeligeri 順にATCC 51334、ATCC 35967、ATCC 51335、ATCC 35967（サンプル番号２５と２７は同一菌株）
・サンプル番号２８〜３１：リステリア ウェルシメリ Listeria welshimeri 順にATCC 43549、ATCC 49591、DSM 15452、ATCC 35897
・サンプル番号７〜８：リステリア イノキュア Listeria innocua 順にATCC 33090、NCTC 11288
・サンプル番号９〜１０：リステリア イバノビ 順にListeria ivanovii subsp. ivanovii ATCC 19119、Listeria ivanovii subsp. londoniensis ATCC BAA-139
・サンプル番号１１〜２２：リステリア モノサイトゲネス Listeria monocytogenes 順にATCC 7644、SLR 2249、ATCC 19112、ATCC 19111、ATCC 15313、ATCC 19115、ATCC 13932、NCTC 10890、ATCC BAA-751、ATCC 19114、ATCC 19118、NCTC 11994
・サンプル番号２３：リステリア ロコゥティエ Listeria rocourtiae DSM 22097
・サンプル番号２４〜２７：リステリア シリゲリ Listeria seeligeri 順にATCC 51334、ATCC 35967、ATCC 51335、ATCC 35967（サンプル番号２５と２７は同一菌株）
・サンプル番号２８〜３１：リステリア ウェルシメリ Listeria welshimeri 順にATCC 43549、ATCC 49591、DSM 15452、ATCC 35897
・サンプル番号３２：リステリア フロリデンシス Listeria floridensis DSM 26687
・サンプル番号３３〜３４：リステリア ウェヘンステップハネンシス Listeria weihenstephanensis 順にDSM 24698、DSM 24699
・サンプル番号３５：リステリア コーネレンシス Listeria cornellensis DSM 26689
・サンプル番号３６：リステリア リパリア Listeria riparia DSM 26685
・サンプル番号３７：リステリア グランデンシス Listeria grandensis DSM 26688
・サンプル番号３８：リステリア ボオリアエ Listeria booriae DSM 28860
・サンプル番号３９：リステリア ニュヨークネンシス Listeria newyorkensis DSM 28861
・サンプル番号４０：リステリア アクアティカ Listeria aquatica DSM 26686
・サンプル番号４１：リステリア フレッシュマンニ Listeria fleischmannii subsp. fleischmannii DSM 25003
・サンプル番号４２：リステリア マルティ Listeria marthii DSM 23813
・サンプル番号４３：ネガティブコントロール（Templateの代わりに、滅菌水を添加）
・サンプル番号３３〜３４：リステリア ウェヘンステップハネンシス Listeria weihenstephanensis 順にDSM 24698、DSM 24699
・サンプル番号３５：リステリア コーネレンシス Listeria cornellensis DSM 26689
・サンプル番号３６：リステリア リパリア Listeria riparia DSM 26685
・サンプル番号３７：リステリア グランデンシス Listeria grandensis DSM 26688
・サンプル番号３８：リステリア ボオリアエ Listeria booriae DSM 28860
・サンプル番号３９：リステリア ニュヨークネンシス Listeria newyorkensis DSM 28861
・サンプル番号４０：リステリア アクアティカ Listeria aquatica DSM 26686
・サンプル番号４１：リステリア フレッシュマンニ Listeria fleischmannii subsp. fleischmannii DSM 25003
・サンプル番号４２：リステリア マルティ Listeria marthii DSM 23813
・サンプル番号４３：ネガティブコントロール（Templateの代わりに、滅菌水を添加）
これらのリステリア属菌を菌株毎に個別に培養した。培養は、Ｂｒａｉｎ ＨｅａｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎ（Ｄｉｆｃｏ社製）を用いて、３７℃で、１〜２日間静置させて行った。
次いで、ＤＮＡ抽出キットであるＲＢＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｍｉｎｉ（RBC Bioscience社製） の説明書に沿って、リステリア属菌のゲノムＤＮＡを抽出した。
次いで、ＤＮＡ抽出キットであるＲＢＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｍｉｎｉ（RBC Bioscience社製） の説明書に沿って、リステリア属菌のゲノムＤＮＡを抽出した。
ＰＣＲ用反応液は、一律に、リステリア属菌のＤＮＡのＩＧＳ領域を増幅させるための配列番号１６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１７に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットが含まれるものを使用した。
また、ＰＣＲ反応によるＤＮＡの増幅が適切に行えたか否かを判定するために、インターナルコントロールを使用した。インターナルコントロールとしては、プラスミドのＤＮＡを使用し、配列番号１３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットにより、配列番号１５に示す塩基配列からなる対象ＤＮＡの増幅を行った。
これらのプライマーは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社により合成した。また、プラスミドの対象ＤＮＡは、株式会社ファスマックにより合成した。
また、ＰＣＲ反応によるＤＮＡの増幅が適切に行えたか否かを判定するために、インターナルコントロールを使用した。インターナルコントロールとしては、プラスミドのＤＮＡを使用し、配列番号１３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットにより、配列番号１５に示す塩基配列からなる対象ＤＮＡの増幅を行った。
これらのプライマーは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社により合成した。また、プラスミドの対象ＤＮＡは、株式会社ファスマックにより合成した。
ＰＣＲ用反応液としては、菌株毎に、次の組成のものを２０μｌ作成した。
１．PCR buffer (QIAGEN社製) 2.0μl
２．dNTP mix (Cat No.BR0600503, biotechrabbit社製) 0.4μl
３．10μMフォワードプライマー(配列番号１６） 1.0μl
４．10μMリバースプライマー(配列番号１７) 0.1μl
５．10μM ＩＣ用フォワードプライマー(配列番号１３） 0.5μl
６．1μM ＩＣ用リバースプライマー(配列番号１４) 1.0μl
７．100pg/μl プラスミド溶液(配列番号１５) 1.0μl
８．HotStarTaq DNA Polymerase(Cat No.203203, QIAGEN社製) 0.1μl
９．Template DNA（10ng/ＰＣＲ用反応液） 2.0μl
１０．滅菌水（全体が20.0μlになるまで加水）
１．PCR buffer (QIAGEN社製) 2.0μl
２．dNTP mix (Cat No.BR0600503, biotechrabbit社製) 0.4μl
３．10μMフォワードプライマー(配列番号１６） 1.0μl
４．10μMリバースプライマー(配列番号１７) 0.1μl
５．10μM ＩＣ用フォワードプライマー(配列番号１３） 0.5μl
６．1μM ＩＣ用リバースプライマー(配列番号１４) 1.0μl
７．100pg/μl プラスミド溶液(配列番号１５) 1.0μl
８．HotStarTaq DNA Polymerase(Cat No.203203, QIAGEN社製) 0.1μl
９．Template DNA（10ng/ＰＣＲ用反応液） 2.0μl
１０．滅菌水（全体が20.0μlになるまで加水）
上記各ＰＣＲ用反応液を使用して、核酸増幅装置（Master cycler ep、Eppendorf社）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃ １５分
（b）９４℃ １分
（c）６０℃ １分
（d）７２℃ １分（（b）〜（d）を３５サイクル）
（e）７２℃ １０分
（a）９５℃ １５分
（b）９４℃ １分
（c）６０℃ １分
（d）７２℃ １分（（b）〜（d）を３５サイクル）
（e）７２℃ １０分
リステリア属菌の検査用マイクロアレイとしては、ＤＮＡチップ（東洋製罐グループホールディングス会社製）を用い、図８、９に示す、配列番号１８〜４５のプローブを配置したものを使用した。各プローブは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社により合成したものを使用した。また、各プローブの基板への固定化は、ＤＮＡスポッターにより行った。
配列番号１８は、リステリア属を検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号１９は、リステリア グレイを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号２０〜２１は、リステリア イノキュアを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号２２〜２３は、リステリア イバノビを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号２４〜２５は、リステリア モノサイトゲネスを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号２６〜２８は、リステリア ロコゥティエを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号２９は、リステリア シリゲリを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号３０〜３１は、リステリア ウェルシメリを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。
配列番号３２〜３３は、リステリア フロリデンシスを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号３４は、リステリア ウェヘンステップハネンシスを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号３５は、リステリア コーネレンシスを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号３６は、リステリア リパリアを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号３７は、リステリア グランデンシスを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号３８〜３９は、リステリア ボオリアエを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号４０〜４１は、リステリア ニュヨークネンシスを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号４２は、リステリア アクアティカを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号４３は、リステリア フレッシュマンニを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号４４は、リステリア マルティを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号４５は、プラスミドを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。
ハイブリダイゼーション用の反応液は、以下のように調製した。
ハイブリダイゼーション用バッファー2μLと増幅産物4μLをＤＮＡチップのカバー上で混合した。バッファー組成は、3×SSC/0.3%Tween20、及び20nM Cy5標識オリゴヌクレオチドである。
そして、このカバーをＤＮＡチップに被せ、ハイブリダイゼーションの条件を４５℃／１時間として、ハイブリダイザー（Dako社）内でハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション用バッファー2μLと増幅産物4μLをＤＮＡチップのカバー上で混合した。バッファー組成は、3×SSC/0.3%Tween20、及び20nM Cy5標識オリゴヌクレオチドである。
そして、このカバーをＤＮＡチップに被せ、ハイブリダイゼーションの条件を４５℃／１時間として、ハイブリダイザー（Dako社）内でハイブリダイゼーションを行った。
次に、ＤＮＡチップを洗浄液（0.5×SSC/0.2%SDS、0.5×SSC）を用いて、ハイブリダイゼーションをしなかったＰＣＲ産物を洗い流した。
そして、標識検出装置（GENOGATE(R) reader 、東洋製罐グループエンジリアリング株式会社)を用いて、ＤＮＡチップに配置された各プローブにおける蛍光強度（プローブに結合した増幅産物の蛍光強度）を測定して、各プローブにおけるＳ／Ｎ比値（（メディアン蛍光強度値−バックグラウンド値）÷バックグラウンド値）を取得した。その結果を図１０〜図１５に示す。これらの図において、検出対象とするリステリア属菌に対応するプローブセットのうちのいずれかについて、Ｓ／Ｎ比値が陽性の場合に、当該リステリア属菌が検出されたと判定した。また、これらの図において、陽性のＳ／Ｎ比値を太枠で示している。
そして、標識検出装置（GENOGATE(R) reader 、東洋製罐グループエンジリアリング株式会社)を用いて、ＤＮＡチップに配置された各プローブにおける蛍光強度（プローブに結合した増幅産物の蛍光強度）を測定して、各プローブにおけるＳ／Ｎ比値（（メディアン蛍光強度値−バックグラウンド値）÷バックグラウンド値）を取得した。その結果を図１０〜図１５に示す。これらの図において、検出対象とするリステリア属菌に対応するプローブセットのうちのいずれかについて、Ｓ／Ｎ比値が陽性の場合に、当該リステリア属菌が検出されたと判定した。また、これらの図において、陽性のＳ／Ｎ比値を太枠で示している。
これらの図に示されるように、配列番号１８に示すプローブは、１７種類の全てのリステリア属菌について、陽性を示している。また、配列番号１９〜４３に示すプローブは、それぞれの検出対象であるリステリア属菌を検出できていることがわかる。
このように、本実施形態の細菌の検査用プローブセットは、リステリア マルティを検出するための配列番号４４を除き、優れた特異性（包含性）を示すことが明らかとなった。
そこで、リステリア マルティについては、新たに配列番号４７に示すプローブを開発した。そして、このプローブを含めて本実施形態の特異性（包含性）を確認するために、後述する試験４を行った。
このように、本実施形態の細菌の検査用プローブセットは、リステリア マルティを検出するための配列番号４４を除き、優れた特異性（包含性）を示すことが明らかとなった。
そこで、リステリア マルティについては、新たに配列番号４７に示すプローブを開発した。そして、このプローブを含めて本実施形態の特異性（包含性）を確認するために、後述する試験４を行った。
［試験２］
本試験では、これらの本実施形態の細菌の検査用プローブセットの特異性（排他性）の検証を行った。
対象菌の菌株としては、図１６に示すように、以下のものを使用した。
本試験では、これらの本実施形態の細菌の検査用プローブセットの特異性（排他性）の検証を行った。
対象菌の菌株としては、図１６に示すように、以下のものを使用した。
・サンプル番号４４：黄色ブドウ球菌 Staphylococcus aureus GTC DY 0073
・サンプル番号４５：大腸菌 Escherichia coli RIMD 0509516
・サンプル番号４６：赤痢菌 Shigella dysenteriae GTC 00100
・サンプル番号４７：ナグビブリオ Vibrio mimicus RIMD 2218001
・サンプル番号４５：大腸菌 Escherichia coli RIMD 0509516
・サンプル番号４６：赤痢菌 Shigella dysenteriae GTC 00100
・サンプル番号４７：ナグビブリオ Vibrio mimicus RIMD 2218001
・サンプル番号４８〜５８：サルモネラ 順にSalmonella enterica subsp salamae GTC 1731、Salmonella enterica subsp enterica serovar Arizonae GTC 1732、Salmonella enterica subsp enterica serovar Cerro GTC 2554、Salmonella enterica subsp enterica serovar Landau GTC 2614、Salmonalla enterica subsp enterica serovar Arizonae GTC 3820、Salmonalla enterica subsp enterica serovar Enteritidis GTC 3838、Salmonella enterica subsp enterica serovar Aberdeen GTC 12694、Salmonella enterica subsp enterica serovar Kentucky GTC 12786、Salmonella enterica subsp enterica serovar Essen GTC 12814、Salmonella enterica subsp enterica va Newport GTC 12819、Salmonella enterica subsp enterica serovar Niarembe GTC 12820
・サンプル番号５９：ネガティブコントロール（Templateの代わりに、滅菌水を添加）
・サンプル番号５９：ネガティブコントロール（Templateの代わりに、滅菌水を添加）
これらの菌を菌株毎に個別に培養した。培養は、Ｂｒａｉｎ ＨｅａｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎ（Ｄｉｆｃｏ社製）もしくは１．０％塩化ナトリウム加普通ブイヨン培地（日水製薬製）を用いて、３７℃で、１〜２日間静置させて行った。
次いで、ＤＮＡ抽出キットであるＲＢＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｍｉｎｉ（RBC Bioscience社製） の説明書に沿って、これらの菌のゲノムＤＮＡを抽出した。
次いで、ＤＮＡ抽出キットであるＲＢＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｍｉｎｉ（RBC Bioscience社製） の説明書に沿って、これらの菌のゲノムＤＮＡを抽出した。
ＰＣＲ用反応液は、試験１と同様に、リステリア属菌のＤＮＡのＩＧＳ領域を増幅させるための配列番号１６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１７に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットが含まれるものを使用した。
また、ＰＣＲ反応によるＤＮＡの増幅が適切に行えたか否かを判定するために、インターナルコントロールを使用した。インターナルコントロールとしては、プラスミドのＤＮＡを使用し、配列番号１３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットにより、配列番号１５に示す塩基配列からなる対象ＤＮＡの増幅を行った。
これらのプライマーは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社により合成した。また、プラスミドの対象ＤＮＡは、株式会社ファスマックにより合成した。
また、ＰＣＲ反応によるＤＮＡの増幅が適切に行えたか否かを判定するために、インターナルコントロールを使用した。インターナルコントロールとしては、プラスミドのＤＮＡを使用し、配列番号１３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットにより、配列番号１５に示す塩基配列からなる対象ＤＮＡの増幅を行った。
これらのプライマーは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社により合成した。また、プラスミドの対象ＤＮＡは、株式会社ファスマックにより合成した。
ＰＣＲ用反応液としては、菌株毎に、次の組成のものを２０μｌ作成した。
１．PCR buffer (QIAGEN社製) 2.0μl
２．dNTP mix (Cat No.BR0600503, biotechrabbit社製) 0.4μl
３．10μMフォワードプライマー(配列番号１６） 1.0μl
４．10μMリバースプライマー(配列番号１７) 0.1μl
５．10μM ＩＣ用フォワードプライマー(配列番号１３） 0.5μl
６．1μM ＩＣ用リバースプライマー(配列番号１４) 1.0μl
７．100pg/μl プラスミド溶液(配列番号１５) 1.0μl
８．HotStarTaq DNA Polymerase(Cat No.203203, QIAGEN社製) 0.1μl
９．Template DNA（10ng/ＰＣＲ用反応液） 2.0μl
１０．滅菌水（全体が20.0μlになるまで加水）
１．PCR buffer (QIAGEN社製) 2.0μl
２．dNTP mix (Cat No.BR0600503, biotechrabbit社製) 0.4μl
３．10μMフォワードプライマー(配列番号１６） 1.0μl
４．10μMリバースプライマー(配列番号１７) 0.1μl
５．10μM ＩＣ用フォワードプライマー(配列番号１３） 0.5μl
６．1μM ＩＣ用リバースプライマー(配列番号１４) 1.0μl
７．100pg/μl プラスミド溶液(配列番号１５) 1.0μl
８．HotStarTaq DNA Polymerase(Cat No.203203, QIAGEN社製) 0.1μl
９．Template DNA（10ng/ＰＣＲ用反応液） 2.0μl
１０．滅菌水（全体が20.0μlになるまで加水）
上記各ＰＣＲ用反応液を使用して、核酸増幅装置（Master cycler ep、Eppendorf社）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃ １５分
（b）９４℃ １分
（c）６０℃ １分
（d）７２℃ １分（（b）〜（d）を３５サイクル）
（e）７２℃ １０分
（a）９５℃ １５分
（b）９４℃ １分
（c）６０℃ １分
（d）７２℃ １分（（b）〜（d）を３５サイクル）
（e）７２℃ １０分
検査用マイクロアレイとしては、試験１と同様に、ＤＮＡチップ（東洋製罐グループホールディングス会社製）を用い、図８、９に示す、配列番号１８〜４５のプローブを配置したものを使用した。各プローブは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社により合成したものを使用した。また、各プローブの基板への固定化は、ＤＮＡスポッターにより行った。
ハイブリダイゼーション用の反応液は、試験１と同様に、以下のように調製した。
ハイブリダイゼーション用バッファー2μLと増幅産物4μLをＤＮＡチップのカバー上で混合した。バッファー組成は、3×SSC/0.3%Tween20、及び20nM Cy5標識オリゴヌクレオチドである。
そして、このカバーをＤＮＡチップに被せ、ハイブリダイゼーションの条件を４５℃／１時間として、ハイブリダイザー（Dako社）内でハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション用バッファー2μLと増幅産物4μLをＤＮＡチップのカバー上で混合した。バッファー組成は、3×SSC/0.3%Tween20、及び20nM Cy5標識オリゴヌクレオチドである。
そして、このカバーをＤＮＡチップに被せ、ハイブリダイゼーションの条件を４５℃／１時間として、ハイブリダイザー（Dako社）内でハイブリダイゼーションを行った。
次に、ＤＮＡチップを洗浄液（0.5×SSC/0.2%SDS、0.5×SSC）を用いて、ハイブリダイゼーションをしなかったＰＣＲ産物を洗い流した。
そして、標識検出装置（GENOGATE(R) reader 、東洋製罐グループエンジリアリング株式会社)を用いて、ＤＮＡチップに配置された各プローブにおける蛍光強度（プローブに結合した増幅産物の蛍光強度）を測定して、各プローブにおけるＳ／Ｎ比値（（メディアン蛍光強度値−バックグラウンド値）÷バックグラウンド値）を取得した。その結果を図１７〜図１８に示す。これらの図において、陽性のＳ／Ｎ比値を太枠で示している。
そして、標識検出装置（GENOGATE(R) reader 、東洋製罐グループエンジリアリング株式会社)を用いて、ＤＮＡチップに配置された各プローブにおける蛍光強度（プローブに結合した増幅産物の蛍光強度）を測定して、各プローブにおけるＳ／Ｎ比値（（メディアン蛍光強度値−バックグラウンド値）÷バックグラウンド値）を取得した。その結果を図１７〜図１８に示す。これらの図において、陽性のＳ／Ｎ比値を太枠で示している。
これらの図に示されるように、配列番号４５に示すインターナルコントロール用のプローブは、サンプル番号４４〜５９に示す全てのサンプルについて、陽性を示している。
一方、その他のプローブは、サンプル番号４４〜５８の全ての細菌について、陰性を示しており、偽陽性は示されていない。
このように、本実施形態の細菌の検査用プローブセットは、優れた特異性（排他性）を示すことが明らかとなった。
一方、その他のプローブは、サンプル番号４４〜５８の全ての細菌について、陰性を示しており、偽陽性は示されていない。
このように、本実施形態の細菌の検査用プローブセットは、優れた特異性（排他性）を示すことが明らかとなった。
［試験３］
本試験では、複数のリステリア属菌を混合したサンプルを用いて、本実施形態の細菌の検査用プローブセットによる特異性（同時検出）についての検証を行った。
本試験では、複数のリステリア属菌を混合したサンプルを用いて、本実施形態の細菌の検査用プローブセットによる特異性（同時検出）についての検証を行った。
対象菌の菌株としては、図１９、２０に示すように、以下のものをサンプル番号ごとに組み合わせて使用した。サンプル番号６０〜６５は、インターナルコントロールとしてプラスミドを添加しなかったものであり、サンプル番号６６〜７１は、インターナルコントロールを添加したものである。
・リステリア グレイ Listeria grayi ATCC 19120
・リステリア イノキュア Listeria innocua NCTC 11288
・リステリア イバノビ Listeria ivanovii subsp. ivanovii ATCC 19119
・リステリア モノサイトゲネス Listeria monocytogenes NCTC 11994
・リステリア ロコゥティエ Listeria rocourtiae DSM 22097
・リステリア シリゲリ Listeria seeligeri ATCC 35967
・リステリア ウェルシメリ Listeria welshimeri ATCC 35897
・リステリア イノキュア Listeria innocua NCTC 11288
・リステリア イバノビ Listeria ivanovii subsp. ivanovii ATCC 19119
・リステリア モノサイトゲネス Listeria monocytogenes NCTC 11994
・リステリア ロコゥティエ Listeria rocourtiae DSM 22097
・リステリア シリゲリ Listeria seeligeri ATCC 35967
・リステリア ウェルシメリ Listeria welshimeri ATCC 35897
・リステリア フロリデンシス Listeria floridensis DSM 26687
・リステリア ウェヘンステップハネンシス Listeria weihenstephanensis DSM 24698
・リステリア コーネレンシス Listeria cornellensis DSM 26689
・リステリア リパリア Listeria riparia DSM 26685
・リステリア グランデンシス Listeria grandensis DSM 26688
・リステリア ボオリアエ Listeria booriae DSM 28860
・リステリア ニュヨークネンシス Listeria newyorkensis DSM 28861
・リステリア アクアティカ Listeria aquatica DSM 26686
・リステリア フレッシュマンニ Listeria fleischmannii subsp. fleischmannii DSM 25003
・リステリア マルティ Listeria marthii DSM 23813
・リステリア ウェヘンステップハネンシス Listeria weihenstephanensis DSM 24698
・リステリア コーネレンシス Listeria cornellensis DSM 26689
・リステリア リパリア Listeria riparia DSM 26685
・リステリア グランデンシス Listeria grandensis DSM 26688
・リステリア ボオリアエ Listeria booriae DSM 28860
・リステリア ニュヨークネンシス Listeria newyorkensis DSM 28861
・リステリア アクアティカ Listeria aquatica DSM 26686
・リステリア フレッシュマンニ Listeria fleischmannii subsp. fleischmannii DSM 25003
・リステリア マルティ Listeria marthii DSM 23813
・サンプル番号６０、６１：リステリア ボオリアエ、リステリア ニュヨークネンシス、リステリア フレッシュマンニ
・サンプル番号６２：リステリア フロリデンシス、リステリア ウェヘンステップハネンシス、リステリア コーネレンシス、リステリア リパリア、リステリア グランデンシス、リステリア ボオリアエ、リステリア ニュヨークネンシス、リステリア アクアティカ、リステリア フレッシュマンニ
・サンプル番号６３：サンプル番号６２のものに、リステリア マルティを加えたもの
・サンプル番号６４：全１７種類のリステリア属菌からリステリア マルティを除いたもの
・サンプル番号６５：全１７種類のリステリア属菌
・サンプル番号６６〜７１は、それぞれサンプル番号６０〜６５と同じ菌株を含み、インターナルコントロールを含むものである。
・サンプル番号６２：リステリア フロリデンシス、リステリア ウェヘンステップハネンシス、リステリア コーネレンシス、リステリア リパリア、リステリア グランデンシス、リステリア ボオリアエ、リステリア ニュヨークネンシス、リステリア アクアティカ、リステリア フレッシュマンニ
・サンプル番号６３：サンプル番号６２のものに、リステリア マルティを加えたもの
・サンプル番号６４：全１７種類のリステリア属菌からリステリア マルティを除いたもの
・サンプル番号６５：全１７種類のリステリア属菌
・サンプル番号６６〜７１は、それぞれサンプル番号６０〜６５と同じ菌株を含み、インターナルコントロールを含むものである。
これらのリステリア属菌を菌株毎に個別に培養した。培養は、Ｂｒａｉｎ ＨｅａｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎ（Ｄｉｆｃｏ社製）を用いて、３７℃で、１〜２日間静置させて行った。
次いで、ＤＮＡ抽出キットであるＲＢＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｍｉｎｉ（RBC Bioscience社製） の説明書に沿って、リステリア属菌のゲノムＤＮＡを抽出した。
次いで、ＤＮＡ抽出キットであるＲＢＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｍｉｎｉ（RBC Bioscience社製） の説明書に沿って、リステリア属菌のゲノムＤＮＡを抽出した。
ＰＣＲ用反応液は、試験１と同様に、リステリア属菌のＤＮＡのＩＧＳ領域を増幅させるための配列番号１６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１７に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットが含まれるものを使用した。
また、サンプル番号６６〜７１では、ＰＣＲ反応によるＤＮＡの増幅が適切に行えたか否かを判定するために、インターナルコントロールを使用した。インターナルコントロールとしては、プラスミドのＤＮＡを使用し、配列番号１３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットにより、配列番号１５に示す塩基配列からなる対象ＤＮＡの増幅を行った。
これらのプライマーは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社により合成した。また、プラスミドの対象ＤＮＡは、株式会社ファスマックにより合成した。
また、サンプル番号６６〜７１では、ＰＣＲ反応によるＤＮＡの増幅が適切に行えたか否かを判定するために、インターナルコントロールを使用した。インターナルコントロールとしては、プラスミドのＤＮＡを使用し、配列番号１３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットにより、配列番号１５に示す塩基配列からなる対象ＤＮＡの増幅を行った。
これらのプライマーは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社により合成した。また、プラスミドの対象ＤＮＡは、株式会社ファスマックにより合成した。
ＰＣＲ用反応液としては、サンプル番号毎に、次の組成のものを２０μｌ作成した。
１．PCR buffer (QIAGEN社製) 2.0μl
２．dNTP mix (Cat No.BR0600503, biotechrabbit社製) 0.4μl
３．10μMフォワードプライマー(配列番号１６） 1.0μl
４．10μMリバースプライマー(配列番号１７) 0.1μl
５．10μM ＩＣ用フォワードプライマー(配列番号１３） 0.5μl
６．1μM ＩＣ用リバースプライマー(配列番号１４) 1.0μl
７．100pg/μl プラスミド溶液(配列番号１５) 1.0μl
８．HotStarTaq DNA Polymerase(Cat No.203203, QIAGEN社製) 0.1μl
９．Template DNA（10ng/ＰＣＲ用反応液） 2.0μl
１０．滅菌水（全体が20.0μlになるまで加水）
Template DNAは、サンプル番号６０、６６では、各菌株10ng/ＰＣＲ用反応液とし、サンプル番号６１〜６５、６７〜７１では、各菌株1ng/ＰＣＲ用反応液とした。
１．PCR buffer (QIAGEN社製) 2.0μl
２．dNTP mix (Cat No.BR0600503, biotechrabbit社製) 0.4μl
３．10μMフォワードプライマー(配列番号１６） 1.0μl
４．10μMリバースプライマー(配列番号１７) 0.1μl
５．10μM ＩＣ用フォワードプライマー(配列番号１３） 0.5μl
６．1μM ＩＣ用リバースプライマー(配列番号１４) 1.0μl
７．100pg/μl プラスミド溶液(配列番号１５) 1.0μl
８．HotStarTaq DNA Polymerase(Cat No.203203, QIAGEN社製) 0.1μl
９．Template DNA（10ng/ＰＣＲ用反応液） 2.0μl
１０．滅菌水（全体が20.0μlになるまで加水）
Template DNAは、サンプル番号６０、６６では、各菌株10ng/ＰＣＲ用反応液とし、サンプル番号６１〜６５、６７〜７１では、各菌株1ng/ＰＣＲ用反応液とした。
上記各ＰＣＲ用反応液を使用して、核酸増幅装置（Master cycler ep、Eppendorf社）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃ １５分
（b）９４℃ １分
（c）６０℃ １分
（d）７２℃ １分（（b）〜（d）を３５サイクル）
（e）７２℃ １０分
（a）９５℃ １５分
（b）９４℃ １分
（c）６０℃ １分
（d）７２℃ １分（（b）〜（d）を３５サイクル）
（e）７２℃ １０分
リステリア属菌の検査用マイクロアレイとしては、試験１と同様に、ＤＮＡチップ（東洋製罐グループホールディングス会社製）を用い、図８、９に示す、配列番号１８〜４５のプローブを配置したものを使用した。各プローブは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社により合成したものを使用した。また、各プローブの基板への固定化は、ＤＮＡスポッターにより行った。
ハイブリダイゼーション用の反応液は、試験１と同様に、以下のように調製した。
ハイブリダイゼーション用バッファー2μLと増幅産物4μLをＤＮＡチップのカバー上で混合した。バッファー組成は、3×SSC/0.3%Tween20、及び20nM Cy5標識オリゴヌクレオチドである。
そして、このカバーをＤＮＡチップに被せ、ハイブリダイゼーションの条件を４５℃／１時間として、ハイブリダイザー（Dako社）内でハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション用バッファー2μLと増幅産物4μLをＤＮＡチップのカバー上で混合した。バッファー組成は、3×SSC/0.3%Tween20、及び20nM Cy5標識オリゴヌクレオチドである。
そして、このカバーをＤＮＡチップに被せ、ハイブリダイゼーションの条件を４５℃／１時間として、ハイブリダイザー（Dako社）内でハイブリダイゼーションを行った。
次に、ＤＮＡチップを洗浄液（0.5×SSC/0.2%SDS、0.5×SSC）を用いて、ハイブリダイゼーションをしなかったＰＣＲ産物を洗い流した。
そして、標識検出装置（GENOGATE(R) reader 、東洋製罐グループエンジリアリング株式会社)を用いて、ＤＮＡチップに配置された各プローブにおける蛍光強度（プローブに結合した増幅産物の蛍光強度）を測定して、各プローブにおけるＳ／Ｎ比値（（メディアン蛍光強度値−バックグラウンド値）÷バックグラウンド値）を取得した。その結果を図２１〜図２２に示す。これらの図において、検出対象とするリステリア属菌に対応するプローブセットのうちのいずれかについて、Ｓ／Ｎ比値が陽性の場合に、当該リステリア属菌が検出されたと判定した。また、これらの図において、陽性のＳ／Ｎ比値を太枠で示している。
そして、標識検出装置（GENOGATE(R) reader 、東洋製罐グループエンジリアリング株式会社)を用いて、ＤＮＡチップに配置された各プローブにおける蛍光強度（プローブに結合した増幅産物の蛍光強度）を測定して、各プローブにおけるＳ／Ｎ比値（（メディアン蛍光強度値−バックグラウンド値）÷バックグラウンド値）を取得した。その結果を図２１〜図２２に示す。これらの図において、検出対象とするリステリア属菌に対応するプローブセットのうちのいずれかについて、Ｓ／Ｎ比値が陽性の場合に、当該リステリア属菌が検出されたと判定した。また、これらの図において、陽性のＳ／Ｎ比値を太枠で示している。
これらの図に示されるように、サンプル番号６０〜６２、６４、６６〜６８、７０では、全てのリステリア属菌が同時に検出できていることがわかる。
サンプル番号６３、６５、６９、７１については、リステリア マルティが同時に検出できなかったが、その他のリステリア属菌は全て同時に検出できており、本実施形態の細菌の検査用プローブセットは、同時検出においても概ね優れた特異性を示すことが明らかとなった。
サンプル番号６３、６５、６９、７１については、リステリア マルティが同時に検出できなかったが、その他のリステリア属菌は全て同時に検出できており、本実施形態の細菌の検査用プローブセットは、同時検出においても概ね優れた特異性を示すことが明らかとなった。
［試験４］
リステリア マルティを検出するための新たな配列番号４７に示すプローブを含めて、本実施形態の細菌の検査方法、細菌の検査用マイクロアレイ、細菌の検査用キット、細菌の検査用プローブセット、及び細菌の検査用プライマーセットの特異性（包含性）を確認するための試験を試験１と同様にして行った。
リステリア マルティを検出するための新たな配列番号４７に示すプローブを含めて、本実施形態の細菌の検査方法、細菌の検査用マイクロアレイ、細菌の検査用キット、細菌の検査用プローブセット、及び細菌の検査用プライマーセットの特異性（包含性）を確認するための試験を試験１と同様にして行った。
すなわち、対象菌の菌株として試験１と同じものを使用して、試験１におけるサンプル番号１〜４３と同じサンプルをそれぞれサンプル番号１ａ〜４３ａとして準備して、試験１と同様に培養した。
そして、得られたリステリア属菌から抽出したゲノムＤＮＡを用いて、試験１と同様にして、ＰＣＲを行った。
そして、得られたリステリア属菌から抽出したゲノムＤＮＡを用いて、試験１と同様にして、ＰＣＲを行った。
リステリア属菌の検査用マイクロアレイとしては、試験１のプローブに加えて、リステリア マルティを検出対象とする配列番号４７のプローブを配置したＤＮＡチップを使用した。
そして、ハイブリダイゼーションを行って、各プローブにおける蛍光強度を測定した。その結果を図２４〜図２９に示す。
そして、ハイブリダイゼーションを行って、各プローブにおける蛍光強度を測定した。その結果を図２４〜図２９に示す。
これらの図に示されるように、配列番号１８に示すプローブは、１７種類の全てのリステリア属菌について、陽性を示している。また、配列番号１９〜４３、４７に示すプローブは、それぞれの検出対象であるリステリア属菌を検出できていることがわかる。
このように、本実施形態の細菌の検査用プローブセットは、優れた特異性（包含性）を示すことが明らかとなった。
このように、本実施形態の細菌の検査用プローブセットは、優れた特異性（包含性）を示すことが明らかとなった。
［試験５］
リステリア マルティを検出するための新たな配列番号４７に示すプローブを含めて、本実施形態の細菌の検査方法、細菌の検査用マイクロアレイ、細菌の検査用キット、細菌の検査用プローブセット、及び細菌の検査用プライマーセットの特異性（排他性）を検証するための試験を試験２と同様にして行った。
リステリア マルティを検出するための新たな配列番号４７に示すプローブを含めて、本実施形態の細菌の検査方法、細菌の検査用マイクロアレイ、細菌の検査用キット、細菌の検査用プローブセット、及び細菌の検査用プライマーセットの特異性（排他性）を検証するための試験を試験２と同様にして行った。
すなわち、対象菌の菌株として試験２と同じものを使用して、試験２におけるサンプル番号４４〜５９と同じサンプルをそれぞれサンプル番号４４ａ〜５９ａとして準備して、試験２と同様に培養した。
そして、得られたリステリア属菌から抽出したゲノムＤＮＡを用いて、試験２と同様にして、ＰＣＲを行った。
そして、得られたリステリア属菌から抽出したゲノムＤＮＡを用いて、試験２と同様にして、ＰＣＲを行った。
リステリア属菌の検査用マイクロアレイとしては、試験２のプローブに加えて、リステリア マルティを検出対象とする配列番号４７のプローブを配置したＤＮＡチップを使用した。
そして、ハイブリダイゼーションを行って、各プローブにおける蛍光強度を測定した。その結果を図３０〜図３１に示す。
そして、ハイブリダイゼーションを行って、各プローブにおける蛍光強度を測定した。その結果を図３０〜図３１に示す。
これらの図に示されるように、配列番号４５に示すインターナルコントロール用のプローブは、サンプル番号４４ａ〜５９ａに示す全てのサンプルについて、陽性を示している。
一方、その他のプローブは、サンプル番号４４ａ〜５８ａの全ての細菌について、陰性を示しており、偽陽性は示されていない。
このように、本実施形態の細菌の検査用プローブセットは、優れた特異性（排他性）を示すことが明らかとなった。
一方、その他のプローブは、サンプル番号４４ａ〜５８ａの全ての細菌について、陰性を示しており、偽陽性は示されていない。
このように、本実施形態の細菌の検査用プローブセットは、優れた特異性（排他性）を示すことが明らかとなった。
［試験６］
リステリア マルティを検出するための新たな配列番号４７に示すプローブを含めて、本実施形態の細菌の検査方法、細菌の検査用マイクロアレイ、細菌の検査用キット、細菌の検査用プローブセット、及び細菌の検査用プライマーセットによる特異性（同時検出）を検証するための試験を試験３と同様にして行った。
リステリア マルティを検出するための新たな配列番号４７に示すプローブを含めて、本実施形態の細菌の検査方法、細菌の検査用マイクロアレイ、細菌の検査用キット、細菌の検査用プローブセット、及び細菌の検査用プライマーセットによる特異性（同時検出）を検証するための試験を試験３と同様にして行った。
すなわち、対象菌の菌株として試験３と同じものを使用して、試験３におけるサンプル番号６３、６５、６９、７１と同じサンプルをそれぞれサンプル番号６３ａ、６５ａ、６９ａ、７１ａとして準備して、試験３と同様に培養した。また、ネガティブコントロール（Templateの代わりに、滅菌水を添加）として、サンプル番号７２ａ、７３ａを準備した。サンプル番号７２ａは、インターナルコントロールとしてプラスミドを添加しなかったものであり、サンプル番号７３ａは、インターナルコントロールを添加したものである。
そして、得られたリステリア属菌から抽出したゲノムＤＮＡを用いて、試験３と同様にして、ＰＣＲを行った。
そして、得られたリステリア属菌から抽出したゲノムＤＮＡを用いて、試験３と同様にして、ＰＣＲを行った。
リステリア属菌の検査用マイクロアレイとしては、試験３のプローブに加えて、リステリア マルティを検出対象とする配列番号４７のプローブを配置したＤＮＡチップを使用した。
そして、ハイブリダイゼーションを行って、各プローブにおける蛍光強度を測定した。その結果を図３２〜図３３に示す。
そして、ハイブリダイゼーションを行って、各プローブにおける蛍光強度を測定した。その結果を図３２〜図３３に示す。
これらの図に示されるように、サンプル番号６３ａ、６５ａ、６９ａ、７１ａでは、リステリア マルティを検出するための配列番号４４を除いて、全てのリステリア属菌が同時に検出できていることがわかる。そして、リステリア マルティについては、配列番号４７のプローブにより、同時に検出できていることがわかる。
このように、本実施形態の細菌の検査用プローブセットによれば、同時検出においても優れた特異性を示すことが明らかとなった。
このように、本実施形態の細菌の検査用プローブセットによれば、同時検出においても優れた特異性を示すことが明らかとなった。
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、本実施形態の細菌の検査用マイクロアレイに配置するプローブは、１種類につき１スポットずつに限定されるものではなく、それぞれのプローブを複数スポットずつ配置しても良い。また、本実施形態の検出対象であるリステリア属菌以外の細菌等を検出するためのその他のプローブが、本実施形態におけるプローブと共にマイクロアレイに配置されていても良く、適宜変更することが可能である。
例えば、本実施形態の細菌の検査用マイクロアレイに配置するプローブは、１種類につき１スポットずつに限定されるものではなく、それぞれのプローブを複数スポットずつ配置しても良い。また、本実施形態の検出対象であるリステリア属菌以外の細菌等を検出するためのその他のプローブが、本実施形態におけるプローブと共にマイクロアレイに配置されていても良く、適宜変更することが可能である。
本発明は、環境検査、食品検査等において、リステリア属菌を特異的かつ多重に検出する場合に好適に利用することが可能である。
Claims (11)
- 試料中における細菌の存在を検査する方法であって、対象となる細菌は、以下の（１）〜（１０）に記載のリステリア属菌から選ばれ、
（１）リステリア フロリデンシス（Listeria floridensis）、
（２）リステリア ウェヘンステップハネンシス（Listeria weihenstephanensis）、
（３）リステリア コーネレンシス（Listeria cornellensis）、
（４）リステリア リパリア（Listeria riparia）、
（５）リステリア グランデンシス（Listeria grandensis）、
（６）リステリア ボオリアエ（Listeria booriae）、
（７）リステリア ニュヨークネンシス （Listeria newyorkensis）、
（８）リステリア アクアティカ（Listeria aquatica）、
（９）リステリア フレッシュマンニ（Listeria fleischmannii）、
（１０）リステリア マルティ（Listeria marthii）、
前記方法は、
（ａ）ｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic spacer）領域の増幅用プライマーセットを含む反応液を調製する調製工程、及び、
（ｂ）前記調製工程により得られた反応液を使用して、前記試料に含まれる前記対象となる細菌の核酸を増幅する増幅工程、を含む
ことを特徴とする細菌の検査方法。 - 前記対象となる細菌には、さらに以下の（１１）〜（１７）に記載のリステリア属菌から選ばれる細菌が含まれることを特徴とする請求項１記載の細菌の検査方法。
（１１）リステリア グレイ（Listeria grayi）
（１２）リステリア イノキュア（Listeria innocua）
（１３）リステリア イバノビ（Listeria ivanovii）
（１４）リステリア モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）
（１５）リステリア ロコゥティエ（Listeria rocourtiae）
（１６）リステリア シリゲリ（Listeria seeligeri）
（１７）リステリア ウェルシメリ（Listeria welshimeri） - 前記反応液に含まれる前記プライマーセットは、配列番号１６、１７に示す塩基配列のプライマーからなることを特徴とする請求項１又は２記載の細菌の検査方法。
- ｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic spacer）領域から選択された配列番号１８〜４３、４７に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかと、前記増幅工程により増幅された核酸とのハイブリダイゼーションにより、前記対象となる細菌の存在を検査することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細菌の検査方法。
- 試料中における細菌の存在を検査する細菌の検査用マイクロアレイであって、以下の（１）〜（１０）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic spacer）領域から選択された配列番号３２〜４３、４７に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかが固定化された
ことを特徴とする細菌の検査用マイクロアレイ。
（１）リステリア フロリデンシス（Listeria floridensis）
（２）リステリア ウェヘンステップハネンシス（Listeria weihenstephanensis）
（３）リステリア コーネレンシス（Listeria cornellensis）
（４）リステリア リパリア（Listeria riparia）
（５）リステリア グランデンシス（Listeria grandensis）
（６）リステリア ボオリアエ（Listeria booriae）
（７）リステリア ニュヨークネンシス （Listeria newyorkensis）
（８）リステリア アクアティカ（Listeria aquatica）
（９）リステリア フレッシュマンニ（Listeria fleischmannii）
（１０）リステリア マルティ（Listeria marthii） - さらに以下の（１１）〜（１７）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic spacer）領域から選択された配列番号１８〜３１に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかが固定化されたことを特徴とする請求項５記載の細菌の検査用マイクロアレイ。
（１１）リステリア グレイ（Listeria grayi）
（１２）リステリア イノキュア（Listeria innocua）
（１３）リステリア イバノビ（Listeria ivanovii）
（１４）リステリア モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）
（１５）リステリア ロコゥティエ（Listeria rocourtiae）
（１６）リステリア シリゲリ（Listeria seeligeri）
（１７）リステリア ウェルシメリ（Listeria welshimeri） - 試料中における細菌の存在を検査する細菌の検査用キットであって、以下の（１）〜（１０）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic spacer）領域から選択された配列番号３２〜４３、４７に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかが固定化されたマイクロアレイと、
前記プローブとハイブリダイゼーションをする核酸を増幅するための配列番号１６、１７に示す塩基配列のプライマーからなるプライマーセットと、を含む
ことを特徴とする細菌の検査用キット。
（１）リステリア フロリデンシス（Listeria floridensis）
（２）リステリア ウェヘンステップハネンシス（Listeria weihenstephanensis）
（３）リステリア コーネレンシス（Listeria cornellensis）
（４）リステリア リパリア（Listeria riparia）
（５）リステリア グランデンシス（Listeria grandensis）
（６）リステリア ボオリアエ（Listeria booriae）
（７）リステリア ニュヨークネンシス （Listeria newyorkensis）
（８）リステリア アクアティカ（Listeria aquatica）
（９）リステリア フレッシュマンニ（Listeria fleischmannii）
（１０）リステリア マルティ（Listeria marthii） - さらに以下の（１１）〜（１７）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic spacer）領域から選択された配列番号１８〜３１に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかが固定化された前記マイクロアレイを含むことを特徴とする請求項７記載の細菌の検査用キット。
（１１）リステリア グレイ（Listeria grayi）
（１２）リステリア イノキュア（Listeria innocua）
（１３）リステリア イバノビ（Listeria ivanovii）
（１４）リステリア モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）
（１５）リステリア ロコゥティエ（Listeria rocourtiae）
（１６）リステリア シリゲリ（Listeria seeligeri）
（１７）リステリア ウェルシメリ（Listeria welshimeri） - 試料中における細菌の存在を検査する細菌の検査用プローブセットであって、以下の（１）〜（１０）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic spacer）領域から選択された配列番号３２〜４３、４７に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかからなる
ことを特徴とする細菌の検査用プローブセット。
（１）リステリア フロリデンシス（Listeria floridensis）
（２）リステリア ウェヘンステップハネンシス（Listeria weihenstephanensis）
（３）リステリア コーネレンシス（Listeria cornellensis）
（４）リステリア リパリア（Listeria riparia）
（５）リステリア グランデンシス（Listeria grandensis）
（６）リステリア ボオリアエ（Listeria booriae）
（７）リステリア ニュヨークネンシス （Listeria newyorkensis）
（８）リステリア アクアティカ（Listeria aquatica）
（９）リステリア フレッシュマンニ（Listeria fleischmannii）
（１０）リステリア マルティ（Listeria marthii） - さらに以下の（１１）〜（１７）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic spacer）領域から選択された配列番号１８〜３１に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかを含むことを特徴とする請求項９記載の細菌の検査用プローブセット。
（１１）リステリア グレイ（Listeria grayi）
（１２）リステリア イノキュア（Listeria innocua）
（１３）リステリア イバノビ（Listeria ivanovii）
（１４）リステリア モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）
（１５）リステリア ロコゥティエ（Listeria rocourtiae）
（１６）リステリア シリゲリ（Listeria seeligeri）
（１７）リステリア ウェルシメリ（Listeria welshimeri） - 試料中における細菌の存在を検査する細菌の検査用プライマーセットであって、以下の（１）〜（１０）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic spacer）領域から選択された配列番号３２〜４３、４７に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかとハイブリダイゼーションをする核酸を増幅するための配列番号１６、１７に示す塩基配列のプライマーからなる
ことを特徴とする細菌の検査用プライマーセット。
（１）リステリア フロリデンシス（Listeria floridensis）
（２）リステリア ウェヘンステップハネンシス（Listeria weihenstephanensis）
（３）リステリア コーネレンシス（Listeria cornellensis）
（４）リステリア リパリア（Listeria riparia）
（５）リステリア グランデンシス（Listeria grandensis）
（６）リステリア ボオリアエ（Listeria booriae）
（７）リステリア ニュヨークネンシス （Listeria newyorkensis）
（８）リステリア アクアティカ（Listeria aquatica）
（９）リステリア フレッシュマンニ（Listeria fleischmannii）
（１０）リステリア マルティ（Listeria marthii）
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Non-Patent Citations (4)
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| GRAHAM TA ET AL.: "Inter- and Intraspecies Comparison of the 16S-23S rRNA Operon Intergenic Spacer Regions of Six Liste", INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, vol. 47, no. 3, JPN6019025089, 1997, pages 863 - 869, XP055654389, ISSN: 0004964477, DOI: 10.1099/00207713-47-3-863 * |
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