CN101812530A - 一种核酸测序方法 - Google Patents
一种核酸测序方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101812530A CN101812530A CN 201010161889 CN201010161889A CN101812530A CN 101812530 A CN101812530 A CN 101812530A CN 201010161889 CN201010161889 CN 201010161889 CN 201010161889 A CN201010161889 A CN 201010161889A CN 101812530 A CN101812530 A CN 101812530A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pcr amplification
- nucleic acid
- amplification product
- minutes
- order
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Abstract
一种核酸测序方法,包括:1)目的核酸片段进行PCR扩增;2)对步骤1)所得到的PCR扩增产物进行纯化;3)对步骤2)所得到的纯化后的PCR扩增产物进行测序PCR扩增;4)对步骤3)所得到的测序PCR扩增产物进行纯化,其具体实现方式是:4.1)将测序PCR扩增产物全量、磁珠8~12ul、85%酒精40~50ul充分混匀后置于空磁力架上2~10分钟;4.2)弃掉上清液;4.3)加入80~200u185%酒精进行清洗,并弃掉上清液;4.4)空气中干燥1~10分钟;5)上机读取序列分析结果,其具体实现方式是:加入15~25ul 0.1mM EDTA后导入测序读板中,上机读取结果。本发明提供了一种可大幅降低成本、测序结果稳定、质量高、所需基因组DNA量少的核酸测序方法。
Description
技术领域
本发明属分子生物学领域,尤其涉及一种核酸测序方法。
背景技术
在分子生物学研究中,DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础,被广泛应用于人类基因组测序、人类遗传病、传染病和癌证的临床诊断、生物工程药物的筛选、动植物杂交育种、动物亲子鉴定和性别鉴定、植物疾病诊断、法医鉴定等方面。美国ABI公司生产的系列核酸序列分析仪(DNA测序仪)由于实现了全部操作自动化,包括自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等,以及结果的高准确性,目前是市场上最受客户欢迎并被广泛应用的用于核酸序列分析的仪器。该仪器采用的是sanger双脱氧链终止法原理、采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳,应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddntp(标记终止物法),通过单引物PCR(聚合酶链式反应)测序反应,生成的PCR产物则是相差1个碱基的3′末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物,使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳,从而避免了泳道间迁移率差异的影响,大大提高了测序的精确度。该测序方法目前已经被标准化,主要由以下几步组成:①目的片段PCR扩增②PCR扩增产物的纯化③利用纯化的PCR产物进行测序PCR扩增④测序PCR产物纯化⑤上机读取序列分析结果。由于操作全部自动化、DNA产物需被荧光物质标示等特点,目前,测序成本相对来说较昂贵,虽然随着高通量DNA测序仪的被开发和使用,测序成本有所降低,但市场上客户的实际要求主要还是中、低通量样本的序列分析(比如对受检者的DNA样本进行基因检测,在较短的时间内就得出具序列分析报告,因此,很难在短时间内收集到大量样本进行测序),因此,降低中、低通量检测样本的测序成本是生物技术产业面临的主要问题之一。
发明内容
为了解决背景技术中存在的上述技术问题,本发明提供了一种可大幅降低成本、测序结果稳定、质量高、所需基因组DNA量少的核酸测序方法。
本发明的技术解决方案是:本发明提供了一种核酸测序方法,其特殊之处在于:所述核酸测序方法包括以下步骤:
1)目的核酸片段进行PCR扩增;
2)对步骤1)所得到的PCR扩增产物进行纯化;
3)对步骤2)所得到的纯化后的PCR扩增产物进行测序PCR扩增;
4)对步骤3)所得到的测序PCR扩增产物进行纯化,其具体实现方式是:
4.1)将测序PCR扩增产物全量、磁珠8~12ul、85%酒精40~50ul充分混匀后置于空磁力架上2~10分钟;
4.2)弃掉上清液;
4.3)加入80~200ul85%酒精进行清洗,并弃掉上清液;
4.4)空气中干燥1~10分钟;
5)上机读取序列分析结果,其具体实现方式是:加入15~25ul 0.1mM EDTA后导入测序读板中,上机读取结果。
上述步骤4.1)中测序PCR扩增产物全量、磁珠9~11ul、85%酒精40~45ul充分混匀后置于空磁力架上2~5分钟。
上述步骤4.1)中测序PCR扩增产物全量、磁珠10ul、85%酒精42ul充分混匀后置于空磁力架上3分钟。
上述磁珠是CleanSEQ磁珠;所述磁力架是SPRI96磁力架。
上述步骤2)的具体实现方式是:对步骤1)所得到的PCR扩增产物以虾碱酶加碱性磷酸酶进行纯化,其具体实现方式是:
取PCR扩增产物全量、虾碱酶加碱性磷酸酶0.125-0.5ul、ddH2O 1.5ul充分混匀后离心,虾碱酶加碱性磷酸酶作用反应条件:37℃30分钟;80℃15分钟;15℃储存。
上述步骤2)中虾碱酶与碱性磷酸酶的比例为1∶3。
上述步骤1)的具体实现方式是:
1.1)取DNA1-20ng、正向扩增引物2.5pmol、反向扩增引物2.5pmol、HotStartTaq MasterMix 5ul、ddH2O 3.9ul充分混匀后离心;
1.2)将步骤1.1)所得到的混合液进行PCR反应,PCR反应条件:95℃15分钟;95℃30秒、50-60℃30秒、72℃1分钟,35循环;72℃3分钟;15℃储存。
本发明的优点是:本发明所提供的核酸测序方法经过对现有技术的不断优化,采用磁珠法纯化测序PCR产物,操作简便,操作时间短,纯化后产物可直接上机,读取测序结果,测序信号比采用醋酸钠/乙醇法纯化法强,测序结果质量好;同时以虾碱酶加碱性磷酸酶替代Centri-SepTM Columns纯化PCR扩增产物,操作简单,不需换管操作,对于中低通量测序,可大大降低实验成本,所需基因组DNA量少,测序结果稳定、质量高,特别适合中、低通量样本的序列分析,操作简便。
附图说明
图1为利用本发明所提供的测序方法进行核酸测序的测序图谱。
具体实施方式
本发明提供了一种核酸测序方法,该方法包括以下步骤:
1)目的核酸片段进行PCR扩增,其具体实现方式是:
1.1)取基因组DNA1-20ng(1ul)、正向扩增引物2.5pmol(0.05ul)、反向扩增引物2.5pmol(0.05ul)、HotStart Taq MasterMix 5ul、ddH2O 3.9ul充分混匀后离心;
1.2)将步骤1.1)所得到的混合液进行PCR反应,PCR反应条件:95℃15分钟;95℃30秒、50-60℃30秒、72℃1分钟,35循环;72℃3分钟;15℃储存。
与现有技术不同的是,本发明在步骤一中做了改进,传统的测序方法目的片段PCR扩增步骤一般使用基因组DNA100-500ng进行反应,使用HotStart试剂盒进行PCR扩增,通过优化实验条件,所用基因组DNA的量可在1-20ng之间,大大降低了遗传资源DNA的用量。
2)对步骤1)所得到的PCR扩增产物进行纯化,对步骤1)所得到的PCR扩增产物以虾碱酶加碱性磷酸酶进行纯化,其具体实现方式是:
取PCR扩增产物全量、虾碱酶加碱性磷酸酶0.125-0.5ul、ddH2O 1.5ul充分混匀后离心,虾碱酶加碱性磷酸酶作用反应条件:37℃30分钟;80℃15分钟;15℃储存。
这里,本发明也进行了改进,传统的测序方法在PCR扩增产物的纯化时,采用的是Centri-SepTM Columns进行纯化,需要换管操作并离心,容易损失PCR产物;以虾碱酶加碱性磷酸酶替代Centri-SepTM Columns纯化PCR扩增产物,操作简单,不需换管操作方便操作。
3)对步骤2)所得到的纯化后的PCR扩增产物进行测序PCR扩增;
4)对步骤3)所得到的测序PCR扩增产物进行纯化,其具体实现方式是:
4.1)将测序PCR扩增产物全量、CleanSEQ磁珠8~12ul、85%酒精40~50ul充分混匀后置于SPRI96空磁力架上2~10分钟;(CleanSEQ磁珠及SPRI96空磁力架为Beckman公司产品)还可以是测序PCR扩增产物全量、CleanSEQ磁珠9~11ul、85%酒精40~45ul充分混匀后置于SPRI96空磁力架上2~5分钟;最好是测序PCR扩增产物全量、CleanSEQ磁珠10ul、85%酒精42ul充分混匀后置于SPRI96空磁力架上3分钟。原则上说,各种磁珠及相配套的磁力架应该各公司的产品都行,只不过用Beckman公司产品摸的实验条件。
4.2)弃掉上清液;
4.3)加入80~200ul85%酒精进行清洗,并弃掉上清液;
4.4)空气中干燥1~10分钟;
传统的测序方法中,PCR产物纯化采用的是BigDye Xterminator purificationkit,成本贵,采用醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物,操作复杂,测序结果信号较弱,杂峰交易出现,本发明采用磁珠法纯化测序PCR产物,操作简便,操作时间短,纯化后产物可直接上机,读取测序结果,测序信号比采用醋酸钠/乙醇法纯化法强,测序结果质量好;测序成本比采用BigDye Xterminator purificationkit便宜,对于中低通量测序,一个反应成本降低3元人民币。
5)上机读取序列分析结果,其具体实现方式是:加入15~25ul 0.1mM EDTA后导入测序读板中,上机读取结果。
参见图1,目前,采用的方法已经对近一万个样本进行测序,测序结果稳定、质量高,特别适合中、低通量样本的序列分析。
Claims (7)
1.一种核酸测序方法,其特征在于:所述核酸测序方法包括以下步骤:
1)目的核酸片段进行PCR扩增;
2)对步骤1)所得到的PCR扩增产物进行纯化;
3)对步骤2)所得到的纯化后的PCR扩增产物进行测序PCR扩增;
4)对步骤3)所得到的测序PCR扩增产物进行纯化,其具体实现方式是:
4.1)将测序PCR扩增产物全量、磁珠8~12ul、85%酒精40~50ul充分混匀后置于空磁力架上2~10分钟;
4.2)弃掉上清液;
4.3)加入80~200ul85%酒精进行清洗,并弃掉上清液;
4.4)空气中干燥1~10分钟;
5)上机读取序列分析结果,其具体实现方式是:加入15~25ul 0.1mM EDTA后导入测序读板中,上机读取结果。
2.根据权利要求1所述的核酸测序方法,其特征在于:所述步骤4.1)中测序PCR扩增产物全量、磁珠9~11ul、85%酒精40~45ul充分混匀后置于空磁力架上2~5分钟。
3.根据权利要求2所述的核酸测序方法,其特征在于:所述步骤4.1)中测序PCR扩增产物全量、磁珠10ul、85%酒精42ul充分混匀后置于空磁力架上3分钟。
4.根据权利要求1或2或3所述的核酸测序方法,其特征在于:所述磁珠是CleanSEQ磁珠;所述磁力架是SPRI96磁力架。
5.根据权利要求4所述的核酸测序方法,其特征在于:所述步骤2)的具体实现方式是:对步骤1)所得到的PCR扩增产物以虾碱酶加碱性磷酸酶进行纯化,其具体实现方式是:
取PCR扩增产物全量、虾碱酶加碱性磷酸酶0.125-0.5ul、ddH2O 1.5ul充分混匀后离心,虾碱酶加碱性磷酸酶作用反应条件:37℃30分钟;80℃15分钟;15℃储存。
6.根据权利要求5所述的核酸测序方法,其特征在于:所述步骤2)中虾碱酶与碱性磷酸酶的比例为1∶3。
7.根据权利要求6所述的核酸测序方法,其特征在于:所述步骤1)的具体实现方式是:
1.1)取DNA1-20ng、正向扩增引物2.5pmol、反向扩增引物2.5pmol、HotStartTaq MasterMix 5ul、ddH2O 3.9ul充分混匀后离心;
1.2)将步骤1.1)所得到的混合液进行PCR反应,PCR反应条件:95℃15分钟;95℃30秒、50-60℃30秒、72℃1分钟,35循环;72℃3分钟;15℃储存。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 201010161889 CN101812530A (zh) | 2010-05-04 | 2010-05-04 | 一种核酸测序方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 201010161889 CN101812530A (zh) | 2010-05-04 | 2010-05-04 | 一种核酸测序方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101812530A true CN101812530A (zh) | 2010-08-25 |
Family
ID=42619897
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 201010161889 Pending CN101812530A (zh) | 2010-05-04 | 2010-05-04 | 一种核酸测序方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101812530A (zh) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103484552A (zh) * | 2013-10-09 | 2014-01-01 | 武汉康录生物技术有限公司 | 一种简化的Sanger法基因测序方法 |
CN104293771A (zh) * | 2014-10-29 | 2015-01-21 | 北京大学 | 一种高通量的简便快速的测序产物磁珠纯化方法 |
CN104419760A (zh) * | 2013-09-07 | 2015-03-18 | 上海毕欧桥生物科技有限公司 | 一种应用于核酸序列分析中的样品纯化方法 |
CN105861645A (zh) * | 2011-04-08 | 2016-08-17 | 生命科技股份有限公司 | 用于合成测序中的相保护试剂流排序 |
CN106575322A (zh) * | 2014-06-26 | 2017-04-19 | 10X基因组学有限公司 | 核酸序列装配的方法和系统 |
-
2010
- 2010-05-04 CN CN 201010161889 patent/CN101812530A/zh active Pending
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
《Blood Cells, Molecules, and Diseases》 20031231 Jedlickova et al. Possible primary familial and congenital polycythemia locus at 7q22.1-7q22.2. 327-331 1-7 , 2 * |
《Int.J.Cancer》 20071231 Chen et al. Evidence for heritable predisposition to epigenetic silencing of MLH1. 1684-1688 1-7 , 2 * |
《Molecular Vision》 20060227 Aldave et al. Unilateral lattice corneal dystrophy associated with the novel His572del mutation in the TGFBI gene. 142-146 1-7 , 2 * |
《QIAGEN News》 20021231 Missel et al. Reducing PCR optimization and costs with QuantiTect™ SYBR(R) Green PCR Kits on the LightCycler(R) System. 1-7 , 2 * |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105861645A (zh) * | 2011-04-08 | 2016-08-17 | 生命科技股份有限公司 | 用于合成测序中的相保护试剂流排序 |
CN105861645B (zh) * | 2011-04-08 | 2020-02-21 | 生命科技股份有限公司 | 用于合成测序中的相保护试剂流排序 |
CN104419760A (zh) * | 2013-09-07 | 2015-03-18 | 上海毕欧桥生物科技有限公司 | 一种应用于核酸序列分析中的样品纯化方法 |
CN103484552A (zh) * | 2013-10-09 | 2014-01-01 | 武汉康录生物技术有限公司 | 一种简化的Sanger法基因测序方法 |
CN106575322A (zh) * | 2014-06-26 | 2017-04-19 | 10X基因组学有限公司 | 核酸序列装配的方法和系统 |
CN106575322B (zh) * | 2014-06-26 | 2019-06-18 | 10X基因组学有限公司 | 核酸序列装配的方法和系统 |
CN104293771A (zh) * | 2014-10-29 | 2015-01-21 | 北京大学 | 一种高通量的简便快速的测序产物磁珠纯化方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Wang et al. | Past, present and future applications of flow cytometry in aquatic microbiology | |
CN102634586B (zh) | 一种两核苷酸实时合成dna解码测序方法 | |
CA2895945C (en) | Target capture system | |
CN111154754B (zh) | 分析dna样品的探针集合和使用所述探针集合的方法 | |
WO2016066070A1 (zh) | 具有增强鉴别能力的y染色体str基因座荧光标记复合扩增试剂盒及其应用 | |
CN101812530A (zh) | 一种核酸测序方法 | |
EP2837695A1 (en) | Nucleic acid quantification method, detection probe, detection probe set, and nucleic acid detection method | |
CN110484655B (zh) | 副流感病毒全基因组二代测序的检测方法 | |
CN111206121A (zh) | 一种用于检测新型冠状病毒orflab和S基因的试剂盒 | |
CN111088380A (zh) | 布鲁氏菌lf-rpa检测引物和探针及检测试剂盒 | |
CN112391483A (zh) | 用于恒温扩增检测鼠疫杆菌的核酸序列、试剂盒及方法和应用 | |
TWI495727B (zh) | 微型電化學多重即時定量聚合酶連鎖反應(pcr)系統 | |
CN101629214A (zh) | 手足口病相关病毒平行检测液相芯片及其制备方法与应用 | |
CN106434866A (zh) | 一种3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法 | |
CN107937579A (zh) | 一种用于检测血培养瓶中临床常见病原菌的产品和方法 | |
CN114686601B (zh) | 一种用于检测中华绒螯蟹血蓝蛋白基因表达的特异性探针及应用 | |
CN102994650A (zh) | 一种基于毛细电泳的致脑炎病毒多重基因检测方法 | |
CN115747361A (zh) | 检测海豚链球菌的实时荧光mira和mira-lfd引物组及检测方法 | |
CN106319091B (zh) | 一种快速区分犬瘟病毒、犬细小病毒和狂犬病毒的多重荧光免疫分析方法及试剂盒 | |
CN102146467A (zh) | 检测鼠疫耶尔森氏菌的试剂及荧光定量pcr检测鼠疫耶尔森氏菌的方法 | |
CN112626215B (zh) | Aml预后相关基因表达检测试剂盒 | |
CN110938675B (zh) | siRNA定向自组装量子点生物传感器及其检测方法和应用 | |
CN114196779A (zh) | 基于靶向测序的病原微生物检测方法及试剂盒 | |
CN101691613B (zh) | 一种利用lamp检测溶珊瑚弧菌的引物组、快速诊断试剂盒及检测方法 | |
CN212111148U (zh) | 高效能mRNA标记侦测试剂组结构 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20100825 |