CN108118087A - 一种用于检测松材线虫的等温扩增试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种用于检测松材线虫的等温扩增试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出一种用于检测松材线虫的等温扩增试剂盒及其检测方法，属于松材线虫检测领域，能在一个小时内完成松材线虫核酸的提取、扩增、显色检测，在检测到单条松材线虫的同时有效区分松材线虫和拟松材线虫。该用于检测松材线虫的等温扩增试剂盒包括SEA扩增引物、2×SEA reaction Mix和10×SEA比色染料，其中，所述SEA扩增引物包括如SEQ ID No.1所示的上游引物和如SEQ ID No.2所示的下游引物。本发明能够应用于松材线虫的快速检测中。

Description

一种用于检测松材线虫的等温扩增试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于松材线虫的检测领域，尤其涉及一种用于检测松材线虫的等温扩增试剂盒及其检测方法。
背景技术
松材线虫(Bursaphe lenchus xylophilus)引起的松树萎蔫病是松林主要的病害之一，1982年，松材线虫病传入我国，仅短短的30多年，疫区范围扩大到江苏、浙江、安徽、福建、江西、山东、湖北、湖南、广东、广西、四川、重庆、贵州、云南等17个省区市，造成经济损失上千亿元，严重威胁着我国松林生态系统和经济财产安全，因此，建立一种灵敏、快速、简便的松材线虫检测方法对松材线虫的防治极为重要。
因病原体松材线虫与低致病性的拟松材线虫及其近缘种之间在形态学上很难区分，用形态学方法上容易造成误判、漏判，所以形态学鉴定的方法逐渐被淘汰。近年来，随着分子生物学的发展，特异性引物PCR、实时荧光定量PCR等分子诊断方法被应用到松材线虫的检测上，提高了松材线虫检测的准确性。但依然存在很多缺点，如耗时长、操作繁琐、需要昂贵的热循环仪器，而且很多需要开盖检测容易造成污染，需要在专门的实验室中操作。因此建立一种快速、简单、无污染，可快速检测线虫的技术意义重大。
发明内容
本发明提出一种用于检测松材线虫的等温扩增试剂盒及其检测方法，该等温扩增试剂盒具有灵敏度高、特异性好、操作简单、耗时短等特点，能够在一个小时内完成松材线虫核酸的提取、扩增、显色等检测，为松材线虫的快速检测提供一种实际可行的方法。
为了解决上述技术问题，本发明的一方面提供了一种用于检测松材线虫的等温扩增试剂盒，包括SEA扩增引物、2×SEA reaction Mix和10×SEA比色染料，其中，所述SEA扩增引物包括如SEQ ID No.1所示的上游引物和如SEQ ID No.2所示的下游引物。
本发明的另一方面提供了一种检测松材线虫的方法，包括以下步骤：
1)采用热裂解法从待检测样品中提取松材线虫基因组DNA；
2)以提取的含有松材线虫基因组DNA的裂解液作为扩增模板，加入如权利要求1所述的等温扩增试剂盒中的组分建立SEA反应体系并进行等温扩增；
3)根据扩增产物的颜色变化，判断待检测样品中是否存在松材线虫。
作为优选，步骤1)具体为：
取松材线虫悬浮液4.5μl加入到0.5ml的Eppendorf管中，然后加入5μl 2×-8×标准浓度WLB液,并向管中加入0.5μl的20×液相RNase去除剂，最后在80-99℃处理2-20min，得到松材线虫的裂解液作为扩增模板。
作为优选，步骤1)具体为：
取松材线虫悬浮液4.5μl加入到0.5ml的Eppendorf管中，然后加入5μl WLB液,并向管中加入0.5μl的20×液相RNase去除剂，最后在95℃处理5min，得到松材线虫的裂解液作为扩增模板。
作为优选，所述SEA反应体系以恒定62-66℃的温度反应40-60分钟。
作为优选，所述SEA反应体系以恒定63℃的温度反应50分钟。
作为优选，所述WLB液包含125mmol/L KCI、25mmol/L Tirs-Cl、3.75mmol/LMgCl2、2.5mmol/L DTT和质量分数1.125％的Tween 20。
作为优选，步骤2)中等温扩增具体为：取5μL 2×SEA Reaction Mix、1μl 10×SEA比色染料、1.5μl 10μM上游引物和1.5μl 10μM下游引物、1μl扩增模板，然后进行实时荧光扩增。
作为优选，所述实时荧光扩增的检测条件为：荧光扫描间隔为1min，激发波长为497nm，检测波长为520nm。
作为优选，所述颜色变化肉眼可视，反应结束阴性结果呈浅黄色，阳性结果呈红色。
作为优选，所述方法可检测到松材线虫的单一线虫，且松材线虫基因组DNA的检出限为最多400fg。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
1、本发明所提供的松材线虫的快速检测方法采用的等温扩增方法是变性泡介导的链交换扩增反应(SEA)，其依赖的是一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在一特定温度下可快速、特异地扩增靶序列。与现有的线虫基因组DNA提取常用方法(传统蛋白酶K法)相比，本发明采用热裂解法可以在5min释放足够模板来启动SEA反应，同时，所采用的等温扩增试剂盒使用的是一种特殊的核酸显色染料，在SEA反应进行前加入，反应后结果可直接用肉眼观察，无需设备而且不会开盖产生污染。
2、本发明所提供的用于检测的等温扩增试剂盒具有灵敏度高、特异性好、操作简单、耗时短等特点，能在一个小时内完成松材线核酸的提取、扩增、显色检测，在检测到单条松材线虫的同时有效区分松材线虫和拟松材线虫，为松材线虫的快速检测提供一种实际可行的方法。
3、本发明所提供的方法整个过程所需的唯一设备为一廉价的金属浴，无需昂贵仪器、方便携带，有利于在偏远地区的恶劣条件下方便使用。
附图说明
图1为本发明实施例2所提供的SEA反应体系实时荧光检测图；
图2为本发明实施例2所提供的松材线虫特异性检测图，其中，图2A为荧光检测图，图2B为比色图；
图3为本发明实施例3所提供的实际样品荧光检测图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对用于检测松材线虫的等温扩增试剂盒及其检测方法进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1.1样本
实验中松材线虫样本来源有2种，一种是本课题实验室繁殖保存的松材线虫样本(由南京林业大学赠予)，另一种是从青岛松材线虫疫区病木上分离并经鉴定为松材线虫繁殖保存的样本。
1.2试剂
Taq PCR master mix(北京全式金生物技术有限公司)。使用的寡核苷酸(表1)由软件设计(NUPACK http://www.nupack.org/)和生工生物技术合成(上海，中国)。SEA检测试剂由青岛耐德生物科技有限公司(中国)购买。所有的化学剂的生工生物科技购买(上海，中国)。
1.3方法
1.3.1松材线虫核酸的提取优化
采用热裂解法提取松材线虫的核酸，快速释放核酸，具体为：
取线虫悬浮液4.5μl加入到0.5ml的Eppendorf管中，然后加入5μl WLB液(含125mmol/L KCI、25mmol/L Tirs-Cl、3.75mmol/L MgCl2、2.5mmol/L DTT和质量分数1.125％的Tween 20),并向管中加入0.5μl的20×液相RNase去除剂(购自北京索莱宝)，最后在95℃处理5min，直接取线虫裂解液作为扩增模板。
这里需要说明的是，该优化步骤中对最佳的裂解时间以及最佳的裂解液进行了优化，具体为：
1)使用同一份线虫悬浮液混匀分装三份分别热裂解2min、5min、10min、15min、20min，然后分别取2μl裂解液当作模板进行实时荧光定量PCR扩增，并以扩增的CT值反应DNA释放的量，即线虫裂解的程度作为考核指标，最终确定最佳的裂解时间为5分钟。
2)分别使用裂解液、裂解液加入蛋白酶K、不加裂解液三种情况进行热裂解，同样用裂解液当作模板进行实时荧光定量PCR扩增，来确定最佳的裂解液。最终确定最佳的条件为使用裂解液。
1.3.2 SEA扩增引物的设计
松材线虫检测引物的设计需要区分弱致病的拟松材线虫，根据文献记载，松材线虫的rDNA上的ITS区，28s区可以区分松材线虫和拟松材线虫，由于SEA同时具有RNA和DNA的能力，因此，选择松材线虫的28s rDNA做为SEA鉴定的目的序列。在Genbank获取松材线虫和拟松材线虫28s rDNA序列进行比对设计SEA引物，用以区分松材线虫和拟松材线虫。所用寡核苷酸如表1所示。
表1 本实施例所用寡核苷酸序列表
1.3.3松材线虫SEA反应体系及结果可视检测
根据SEA等温扩增试剂盒的说明，SEA实时荧光定量扩增体系总体积为10μl:2×SEA Reaction Mix的体积为5μl，10μmol/ml上、下游引物各1.5μl，1μl 10×SEA比色染料，1μl 10-11M扩增模板，反应在CFX96TM实时荧光定量PCR检测仪上进行实时荧光检测，荧光扫描间隔为1min，激发波长为497nm，检测波长为520nm。所述SEA反应体系以恒定63℃的温度反应50分钟，可以检测到单一线虫。进一步，SEA反应体系将荧光染料Eva Green换成SEA比色染料，因此SEA扩增结果肉眼可视，反应结束后阴性成浅黄色，阳性结果成红色。
这里需要说明的是，该优化步骤中对SEA反应体系进行了优化，具体为：
使用扩增模板终浓度为10-11M，SEA荧光定量扩增体系把反应温度分别设为61℃，63℃，65℃进行反应温度优化，来确定最佳反应温度。同样使用扩增模板终浓度为10-11M，引物终浓度分别为1×10-6M，1.5×10-6M，2×10-6M进行SEA等温扩增，确定最佳引物浓度。最终确定最佳的反应温度为63℃，最佳引物浓度为1×10-6M。
实施例2
为了确定实施例1所提供的方法可靠、稳定，以下对其检测灵敏性以及特异性进行了验证。
1.1SEA反应体材线虫灵敏性
将松材线虫基因组DNA以十倍梯度稀释后，依次加入SEA反应体系进行实时荧光检测。结果如图1所示，扩增体系含40pg、4pg、400fg松材线虫基因组DNA的SEA反应荧光曲线，NTC为空白对照。从图1可见，400fg的基因组DNA可以被检测到，说明SEA足够的灵敏度来检测松材线虫。
1.2SEA反应体材线虫特异性
拟松材线虫具有弱致病性在形态上和松材线虫相似度很高，用传统显微镜观察的方法很难区分，采用SEA对松材线虫进行快速特异性检测实验，分别用浓度为10-11M松材线虫和拟松材线虫的28s rDNA片段当做SEA反应模板序列见表1，进行SEA扩增反应。结果如图2所示，荧光图图2A中只有松材线虫呈现阳性结果，与比色图2B结果一致。
实施例3
实际样品检测与应用
为了进一步验证所提供方法的可行性，用松材线虫实际样品进行简单热处理后评估该方法的灵敏度。将10条成年松材线虫加入到5μL WLB中，然后加入0.5μl 20×液相RNase去除剂后加水补齐到10μl，95℃5分钟处理后，分别取2μl，1μl，0.5μl裂解液作为模板。从图3中可以看出，所测样品能在40分钟内诱导荧光信号的增加，而NTC不能。0.5μL的裂解物可达1/2个松材线虫也可以被检测到。实验证明该方法可以有效检测到单一线虫。
序列表
<110> 青岛大学
<120> 一种用于检测松材线虫的等温扩增试剂盒及其检测方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agccttctgg gcgcgt 16
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cggcaatgca caaacacca 19

Claims (10)

1.一种用于检测松材线虫的等温扩增试剂盒，其特征在于，包括SEA扩增引物、2×SEAreaction Mix和10×SEA比色染料，其中，所述SEA扩增引物包括如SEQ ID No.1所示的上游引物和如SEQ ID No.2所示的下游引物。
2.一种检测松材线虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)采用热裂解法从待检测样品中提取松材线虫基因组DNA；
2)以提取的含有松材线虫基因组DNA的裂解液作为扩增模板，加入如权利要求1所述的等温扩增试剂盒中的组分建立SEA反应体系并进行等温扩增；
3)根据扩增产物的颜色变化，判断待检测样品中是否存在松材线虫。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)具体为：
取松材线虫悬浮液4.5μl加入到0.5ml的Eppendorf管中，然后加入5μl 2×-8×标准浓度WLB液,并向管中加入0.5μl的20×液相RNase去除剂，最后在80-99℃处理2-20min，得到松材线虫的裂解液作为扩增模板。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)具体为：
取松材线虫悬浮液4.5μl加入到0.5ml的Eppendorf管中，然后加入5μl2×标准浓度WLB液,并向管中加入0.5μl的20×液相RNase去除剂，最后在95℃处理5min，得到松材线虫的裂解液作为扩增模板。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述SEA反应体系以恒定62-66℃的温度反应40-60分钟。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述SEA反应体系以恒定63℃的温度反应50分钟。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述WLB液包含125mmol/L KCI、25mmol/LTirs-Cl、3.75mmol/L MgCl2、2.5mmol/L DTT和质量分数1.125％的Tween 20。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中等温扩增具体为：取5μL 2×SEAreaction Mix、1μl 10×SEA比色染料、1.5μl 10μM上游引物和1.5μl 10μM下游引物、1μl扩增模板，然后进行实时荧光扩增。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述实时荧光扩增的检测条件为：荧光扫描间隔为1min，激发波长为497nm，检测波长为520nm。
10.根据权利要求2-9任一项所述的方法，其特征在于，所述方法可检测到松材线虫的单一线虫，且松材线虫基因组DNA的检出限为最多400fg。
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