CN112458187A - 一种检测松材线虫的hda等温扩增试剂检测方法 - Google Patents
一种检测松材线虫的hda等温扩增试剂检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112458187A CN112458187A CN202011459471.0A CN202011459471A CN112458187A CN 112458187 A CN112458187 A CN 112458187A CN 202011459471 A CN202011459471 A CN 202011459471A CN 112458187 A CN112458187 A CN 112458187A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- reagent
- pine wood
- isothermal amplification
- kit
- detecting
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 241000243771 Bursaphelenchus xylophilus Species 0.000 title claims abstract description 28
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 15
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 8
- 241000243770 Bursaphelenchus Species 0.000 claims abstract description 7
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims 1
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 abstract description 11
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 abstract description 10
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 abstract description 10
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 4
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 abstract 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 108091060592 XDNA Proteins 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005360 mashing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种检测松材线虫的HDA等温扩增试剂盒及检测方法，该试剂盒主要由以下几种试剂组成：试剂A：松材线虫组织裂解液；试剂B：HDA等温扩增缓冲液，其中含有特定引物BxHDAF及BxHDAR；试剂C：HDA等温扩增反应酶液，其中含有解旋酶。扩增产物经电泳检测，出现目标电泳条带即可确定检测样本中有松材线虫存在，所说的目标电泳条带是指97bp处。使用本试剂盒，按本发明所提供的方法，可快速、灵敏、准确地检测并判断松材中线虫是否为松材线虫。
Description
技术领域
本发明涉及一种原生动物基因组核酸诊断试剂盒，尤其涉及一种松材线虫基因诊断试剂盒及检测方法。
背景技术
松材线虫病，又称松树萎蔫病，是由松材线虫引起的具有毁灭性的森林病害，属我国重大外来入侵种，已被我国列入对内、对外的森林植物检疫对象，该病自1982年传入我国以来，扩散蔓延迅速，目前全国已有14省(市、区)发生，面积达7.7万hm2，导致大量松树枯死，对我国的松林资源、自然景观和生态环境造成严重破坏，造成了严重的经济和生态损失，该病的显著特征是，被侵染的松树针叶失绿，并逐渐黄萎枯死变成红褐色，最终全株迅速枯萎死亡，但针叶可长时间内不脱落，有时直至第二年夏季才脱落，从针叶开始变色至全株死亡，平均只有30天左右，病树大多在9月至10月上、中旬死亡。
松材线虫在我国尚未得到有效控制，目前疫区仍在不断扩大之中，虽然目前已经有荧光定量PCR等技术可在标准参考实验室用于检测松材线虫，但是各地野保及林业基层部门仍然急需一套适用于基层部门的松材线虫快速检测技术，因此我们提出一种松材线虫基因诊断试剂盒及检测方法，用于解决这个问题。
发明内容
(一)解决的技术问题
本发明的目的是填补现有技术的空白，提供一种松材线虫基因诊断试剂盒及检测方法。
(二)技术方案
一种松材线虫基因诊断试剂盒(简称本试剂盒)
本试剂盒主要由以下几种试剂组成：
试剂A：松材线虫组织裂解液，为2.5mmol/L DTT、1.125％Tween20、0.025％Gelatin缓冲液；
试剂B：HDA等温扩增缓冲液，其中含有特定引物BxHDAR及BxHDAF；其序列为：
BxHDAR 5′-CAAAGCCCAAGAGCGCAATATGCATTC-3′；
BxHDAF 5′-GGGTCGATGAAGAACGCAGTGAATTGC-3′。
试剂C：HDA等温扩增反应酶液，其中含有大肠杆菌解旋酶Ⅱ(UvrD)解旋酶及BstDNA Polymerase。
试剂D液：阳性对照，为松材线虫阳性DNA模板。
试剂C与试剂D中分别所含的特定引物BxHDAR和BxHDAF，应有足够的含量，—般应不少于8pM。
与现有技术相比，本发明提供了一种检测松材线虫的HDA等温扩增试剂检测方法，具备以下有益效果：
1、该检测松材线虫的HDA等温扩增试剂检测方法，能快速、灵敏、准确地检测出松树是否携带松材线虫，且已经用本发明对松树是否被松材线虫感染进行检测，得出有效、可靠的检测结果。
2、该检测松材线虫的HDA等温扩增试剂检测方法，适用于检测松材线虫。
附图说明
图1为PCR产物电泳结果图；图1中1、2、3依次为200bp ladder DNA分子量Marker、阳性对照和等温扩增产物。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
为实现上述过程简单和检测结果明显的目的，本发明提供如下技术方案：一种检测松材线虫的HDA等温扩增试剂盒及检测方法，该试剂盒主要由以下几种试剂组成：试剂A：松材线虫组织裂解液；试剂B：HDA等温扩增缓冲液，其中含有特定引物BxHDAF及BxHDAR；试剂C：HDA等温扩增反应酶液，其中含有解旋酶。扩增产物经电泳检测，出现目标电泳条带即可确定检测样本中有松材线虫存在，所说的目标电泳条带是指97bp处。
已经用本发明对松树是否被松材线虫感染进行检测，得出有效、可靠的检测结果。
本试剂盒的使用方法如下：
①松材线虫的组织裂解
待检松材线虫单条或多条加入100μ1试剂A在冰上混匀，捣碎匀浆；55℃静置15分钟。
②松材线虫等温扩增
取2μ1组织裂解液；加入含试剂C的反应管，在PCR仪或者恒温水浴锅中进行以下反应：
68℃ 90分钟；
反应结束后取10μ1加2μl 6×DNA加样缓冲液(含溴酚蓝)混匀后在2％琼脂糖凝胶进行电泳，确定扩增产物。如出现约97bp的反应产物，说明待检样品携带松材线虫。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 保绿丰（湖北）生物科技有限公司
武汉市林业工作站
<120> 一种检测松材线虫的HDA等温扩增试剂检测方法
<130> 2020.06.16
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaagcccaag agcgcaatat gcattc 26
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggtcgatga agaacgcagt gaattgc 27
Claims (3)
1.一种检测松材线虫的试剂盒，其特征在于：该试剂盒由以下几种试剂组成：
试剂A：松材线虫组织裂解液，为2.5mmol/L DTT、1.125％Tween20、0.025％Gelatin缓冲液；
试剂B：HDA等温扩增缓冲液，其中含有特定引物BxHDAF及BxHDAR；其序列为：
BxHDAF 5′-GGGTCGATGAAGAACGCAGTGAATTGC-3′；
BxHDAR 5′-CAAAGCCCAAGAGCGCAATATGCATTC-3′；
试剂C：HDA等温扩增反应酶液，其中含有解旋酶。
试剂D液：阳性对照，为Bx阳性DNA模板。
2.根据权利要求1所述的检测松材线虫试剂盒，其特征在于：所述试剂B中含有的松材线虫等温扩增缓冲液每管组成为：
5μ110×等温扩增缓冲液，
2μ1100mM MgSO4，
4μ110mM NaCl，
3.5μ110mM dNTP Mixture，
1μ110pM BxHDAR,
1μ110pM BxHDAF。
3.根据据权利要求1所述的检测松材线虫试剂盒，其特征在于：所述试剂D中HDA等温扩增反应酶混合液每管组成为
2U大肠杆菌解旋酶Ⅱ(UvrD)解旋酶；
Bst DNA Polymerase。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011459471.0A CN112458187A (zh) | 2020-12-11 | 2020-12-11 | 一种检测松材线虫的hda等温扩增试剂检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011459471.0A CN112458187A (zh) | 2020-12-11 | 2020-12-11 | 一种检测松材线虫的hda等温扩增试剂检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112458187A true CN112458187A (zh) | 2021-03-09 |
Family
ID=74803726
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011459471.0A Pending CN112458187A (zh) | 2020-12-11 | 2020-12-11 | 一种检测松材线虫的hda等温扩增试剂检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112458187A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1529164A (zh) * | 2003-10-21 | 2004-09-15 | 南京农业大学 | 松材线虫检测试剂盒及其检测方法 |
| CN108118087A (zh) * | 2018-01-31 | 2018-06-05 | 青岛大学 | 一种用于检测松材线虫的等温扩增试剂盒及其检测方法 |
| CN111826448A (zh) * | 2019-04-15 | 2020-10-27 | 南京林业大学 | 用于松材线虫鉴定的引物对探针组合产品、试剂盒及方法 |
-
2020
- 2020-12-11 CN CN202011459471.0A patent/CN112458187A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1529164A (zh) * | 2003-10-21 | 2004-09-15 | 南京农业大学 | 松材线虫检测试剂盒及其检测方法 |
| CN108118087A (zh) * | 2018-01-31 | 2018-06-05 | 青岛大学 | 一种用于检测松材线虫的等温扩增试剂盒及其检测方法 |
| CN111826448A (zh) * | 2019-04-15 | 2020-10-27 | 南京林业大学 | 用于松材线虫鉴定的引物对探针组合产品、试剂盒及方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 王熊: "松材线虫的核酸快速检测研究", 中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑, no. 2018, 15 December 2018 (2018-12-15), pages 16 - 17 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108676844B (zh) | 一种双酶放大汞离子生物传感器的构建 | |
| CN110195121A (zh) | 一种检测耐甲氧西林金葡菌的cpa引物及试剂盒和检测方法 | |
| CN111635959A (zh) | 一种Fluoxapiprolin抗性基因型G700V辣椒疫霉的LAMP引物及应用 | |
| CN107988426A (zh) | 对虾桃拉病毒（tsv）的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
| CN107287354B (zh) | 一种环介导等温扩增法检测对虾白斑综合症病毒的方法 | |
| CN114875174B (zh) | 一种快速鉴别毒红菇的lamp引物组、试剂盒及检测方法 | |
| CN107177700A (zh) | 一种检测黄瓜花叶病毒的lamp引物组、试剂盒及检测方法 | |
| CN111850134A (zh) | 一种虹鳟鱼特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用 | |
| CN105986044B (zh) | 禽流感病毒核酸通用快速检测方法 | |
| CN107236788B (zh) | 一种非诊断目的的检测幽门螺杆菌基因及药物代谢型的Miseq测序方法 | |
| CN107022615B (zh) | 用于检测松材线虫的lamp引物组、试剂盒及检测方法 | |
| KR20190136647A (ko) | 디지털 ｐｃｒ을 이용한 알렉산드리움 속의 검출 및 절대 정량화 방법 | |
| CN108315473A (zh) | 一种用于水稻稻曲病病菌lamp快速检测的引物组合物及其应用 | |
| CN112458187A (zh) | 一种检测松材线虫的hda等温扩增试剂检测方法 | |
| WO2023087791A1 (zh) | 一种识别黄绿卷毛菇原产地的dna条形码、引物组及应用 | |
| CN113832259A (zh) | 一种新型冠状病毒快速检测试剂盒及其应用 | |
| CN108148917B (zh) | 一种检测高致病性副溶血弧菌的lamp-lfd的引物和探针及其应用 | |
| CN111662996A (zh) | 一种引物组及其在基于微流控芯片用于快速检测向日葵黑茎病菌的应用 | |
| CN112458211A (zh) | 一种蓝舌病病毒血清型鉴定的一步法rt-pcr试剂盒和方法 | |
| CN116064824B (zh) | 一种虹鳟耐高温snp分子标记及其应用 | |
| CN110904242A (zh) | 一种引物组合物及其在鉴定宽体金线蛭中的应用 | |
| CN108754021A (zh) | 一种鸭乙型肝炎病毒的环介导等温扩增检测试剂 | |
| CN117965759B (zh) | 一种用于鉴定梅花鹿及马鹿鹿茸的lamp引物组、方法及应用 | |
| Ruiz-Padilla et al. | Determination of the Mycovirome of a Necrotrophic Fungus | |
| CN114317796B (zh) | 一种用于检测固执腐霉的lamp引物组合物及其检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |